UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE · enantiomérica de linalol, carvona e limoneno em óleos...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Isolamento, caracterização, quantificação e avaliação da pureza

enantiomérica de linalol, carvona e limoneno em óleos essenciais

de espécies aromáticas

GIVANILDO BATISTA DA SILVA

SÃO CRISTÓVÃO – SE

2011

Isolamento, caracterização, quantificação e avaliação da pureza

enantiomérica de linalol, carvona e limoneno em óleos essenciais

de espécies aromáticas

GIVANILDO BATISTA DA SILVA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Química da

Universidade Federal de Sergipe, como

um dos requisitos para obtenção do título

de Mestre em Química.

Orientador: Prof. Dr. Péricles Barreto Alves

Co-orientador: Prof. Dr. Emmanoel Vilaça Costa

SÃO CRISTÓVÃO – SE

2011

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

S586i

Silva, Givanildo Batista da Isolamento, caracterização, quantificação e avaliação da

pureza enantiomérica de linalol, carvona e limoneno em óleos essenciais de espécies aromáticas / Givanildo Batista da Silva. – São Cristóvão, 2011.

119 f. ; il.

Dissertação (Mestrado em Química) – Programa de Pós- Graduação em Química, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe, 2011.

Orientador: Prof. Dr. Péricles Barreto Alves. Co-orientador: Prof. Dr. Emmanoel Vilaça Costa.

1. Processos químicos. 2. Monoterpenos. 3. Óleos essenciais. 4. Análise cromatográfica. I. Título.

CDU 54:665.54

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho

Ao meu pai, Paulo Batista (in memoriam),

pelos ensinamentos de honestidade e por

seu caráter, os quais contribuíram na

formação de minha personalidade.

À minha querida mãe, Gisélia Santos,

por me apoiar em todos os momentos de

minha vida e pelo exemplo de mulher

batalhadora.

Aos meus irmãos, sobrinhos, cunhados,

primos e tios, pelo companheirismo e

incentivo durante essa jornada.

À minha esposa Lilian e a nossa

princesinha Larissa Gabriella, por

compreenderem os dias, as noites e as

madrugadas dedicados a este projeto.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por guiar meus passos e me erguer para concluir mais uma etapa.

Aos meus sogros, Sr. Jairton e D. Maria José, pela amizade, conselhos, acolhimento e suporte

durante essa caminhada.

Aos meus amigos, em especial, Gláucia (in memoriam), Éverton, Rosana, Lídia, Jefferson,

João, Edilson e Adriana, sem vocês essa caminhada seria com certeza mais árdua.

Aos amigos de todos os momentos, Alex Cardoso, Marta Santos, Marcos Dias, Elisdete Maria

(Elis), Rangel Bonfim, Joelma Oliveira (Joelminha), Cleonides Batista (Boneca), Cristiane

Batista (Nane), Roberto Batista (Betinho) e Tereza Cristina (Tequinha), vocês foram os

responsáveis pela continuidade desta conquista, muito obrigado pelo apoio e incentivo nos

momentos difíceis.

À minha irmã, Lourdes (Nininha), pelo incentivo aos estudos.

À colega, Profa. Luciana Costa por sua contribuição na elaboração do abstract do trabalho.

Ao meu grandioso orientador Prof. Dr. Péricles Barreto Alves pela paciência e compreensão

nessa última etapa e por suas contribuições na minha formação acadêmica e pessoal.

Ao Prof. Dr. Emmanoel Vilaça Costa, pela co-orientação no desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank e seus alunos Saymo Santos Fontes e Magna Galvão

Peixoto do Departamento de Engenharia Agronômica pela parceria na aquisição das espécies

vegetais.

Ao Prof. Dr. Paulo Cesar de Lima Nogueira, pelas valiosas contribuições no exame de

qualificação do Mestrado em Química.

Ao Prof. Dr. Sandro Navickiene, pelas valiosas contribuições no exame de qualificação e na

defesa do Mestrado em Química.

Ao Prof. Dr. José Guilherme S. Maia da Faculdade de Engenharia Química da Universidade

Federal do Pará, por ter cedido à amostra de óleo essencial de pau-rosa (Aniba rosaeodora

Ducke) e pelas valiosas contribuições neste projeto.

Aos professores do Departamento de Química da Universidade Federal de Sergipe (DQI/UFS)

que contribuíram na minha formação acadêmica.

Ao Prof. Dr. Andersson Barisson do Departamento de Química da Universidade Federal do

Paraná (DQ/UFPR) pela realização das análises de RMN de 1H e

13C.

Às Profas. Dras. Helen Treichel e Natália Paroul da Universidade Regional Integrada do

Campus de Erechim/RS por terem gentilmente fornecido amostra de óleo essencial.

Ao Coord. de Qualidade Paulo Lima da Companhia de Bebidas das Américas - Filial/SE

(AmBev/SE) por permitir a utilização do equipamento para as análises de índice de refração.

À Secretaria de Estado da Educação do Estado de Sergipe (SEED/SE) pelo afastamento

concedido para a realização do curso de Mestrado em Química.

À equipe diretiva e aos alunos do Colégio Estadual Luiz Alves de Oliveira pelo incentivo para

a realização do curso de Mestrado em Química.

À equipe diretiva da Escola Municipal Pres. Tancredo Neves pelas valiosas contribuições na

minha formação inicial.

Aos colegas da Companhia de Bebidas das Américas – Filial Sergipe (AmBev/SE) pelo apoio

e incentivo para a realização do curso de Mestrado em Química.

Aos colegas dos laboratórios de LPPN e LABORGANICS (DQI/UFS), Silvia, Rafaely, Paulo,

Romário, José Eraldo, Lívia, Charlene, Thanany, Daiane e Paula, e aos os colegas do

mestrado, Hugo Cesar, Paloma Prata, Darlisson de Alexandria, Alan Diego, Wesley Faria,

Adriano Aquino, Edenilson Niculau, Givanilton Brito, Valéria Santana, Cristiane Campos,

José Carlos, Sérgio, Manoel e Adailton pelo companheirismo em muitos momentos da

jornada acadêmica.

Ao CNPq pelo auxílio financeiro.

SUMÁRIO

Página

LISTA DE FIGURAS......................................................................................................... i

LISTA DE TABELAS........................................................................................................ iii

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS................................................................... iv

RESUMO............................................................................................................................. vi

ABSTRACT........................................................................................................................ vii

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 1

1.1. Óleos essenciais............................................................................................................. 1

1.1.1. Origem biossintética................................................................................................... 1

1.1.2. Aspectos de produção e econômicos.......................................................................... 3

2. REVISÃO DA LITERATURA..................................................................................... 5

2.1. O fenômeno da quiralidade........................................................................................... 5

2.1.1. Quiralidade na atividade biológica............................................................................. 6

2.1.2. Quiralidade na distinção de odor de compostos dos óleos essenciais........................ 6

2.2. Técnica Cromatográfica e Espectroscópica................................................................... 8

2.2.1. Cromatografia gasosa e coluna enantiosseletiva........................................................ 8

2.2.2. Cromatografia em camada delgada............................................................................ 9

2.2.3. Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e

13C............................... 10

2.3. Métodos de quantificação.............................................................................................. 11

2.3.1. Normalização de área................................................................................................. 11

2.3.2. Padrão interno............................................................................................................. 12

2.3.3. Adição de padrão........................................................................................................ 12

2.3.4. Padrão externo............................................................................................................ 13

2.4. Monoterpenos quirais estudados................................................................................... 13

2.4.1. Linalol......................................................................................................................... 13

2.4.2. Carvona....................................................................................................................... 15

2.4.3. Limoneno.................................................................................................................... 16

2.5. Separação enantiosseletiva dos monoterpenos linalol, carvona e limoneno................. 17

2.6. Espécies aromáticas destacadas neste estudo................................................................ 18

2.6.1. Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (erva-cidreira)......................................................... 18

2.6.1.1. Aspecto botânico de L. alba.................................................................................... 18

2.6.1.2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. alba..................................................... 19

2.6.2. Ocimum basilicum L. (manjericão)............................................................................ 21

2.6.2.1. Aspecto botânico de O. basilicum.......................................................................... 21

2.6.2.2. Aspectos químicos e farmacológicos de O. basilicum............................................ 23

2.6.3. Pelargonium graveolens L’Herit (gerânio)................................................................ 24

2.6.3.1. Aspecto botânico de P. graveolens......................................................................... 24

2.6.3.2. Aspectos químicos e farmacológicos de P. graveolens........................................... 25

2.6.4. Aniba rosaeodora Ducke (pau-rosa).......................................................................... 27

2.6.4.1. Aspecto botânico de A. rosaeodora......................................................................... 27

2.6.4.2. Aspectos químicos e farmacológicos de A. rosaeodora.......................................... 28

2.6.5. Cinnamomum camphora Nees e Eberm var. linaloolifera Fujita (Ho-Sho).............. 30

2.6.5.1. Aspecto botânico de C. camphora........................................................................... 30

2.6.5.2. Aspectos químicos e farmacológicos de C. camphora............................................ 32

2.6.6. Coriandrum sativum L. (coentro)............................................................................... 33

2.6.6.1. Aspecto botânico de C. sativum.............................................................................. 33

2.6.6.2. Aspectos químicos e farmacológicos de C. sativum............................................... 34

3. OBJETIVOS................................................................................................................... 36

3.1. Objetivo geral................................................................................................................ 36

3.2. Objetivos específicos..................................................................................................... 36

4. PARTE EXPERIMENTAL........................................................................................... 37

4.1. Padrões, solventes e reagentes....................................................................................... 37

4.2. Materiais e equipamentos.............................................................................................. 37

4.3. Amostras vegetais: origem, coleta e identificação botânica.......................................... 38

4.4. Extração dos óleos essenciais........................................................................................ 39

4.5. Condições de análise cromatográfica e identificação dos constituintes químicos dos

óleos essenciais..................................................................................................................... 41

4.5.1 Condições cromatográficas por CG-EM..................................................................... 41

4.5.2. Preparo da solução de óleo essencial para análise por CG-EM................................. 42

4.6. Condições de análise cromatográfica e avaliação da estereoquímica de linalol,

carvona e limoneno nos óleos essenciais.............................................................................. 42

4.6.1. Condições cromatográficas por CG-DIC................................................................... 42

4.6.2 Determinação da ordem de eluição dos enantiômeros de linalol................................ 43

4.6.3. Determinação da pureza enantiomérica do linalol nos óleos essenciais.................... 43

4.6.3.1. Análise individual dos óleos essenciais................................................................... 43

4.6.3.2. Análise da mistura de óleos essenciais com padrões de linalol............................... 43

4.6.4. Determinação da ordem de eluição e da pureza enantiomérica da carvona e

limoneno e no óleo essencial de L. alba............................................................................... 44

4.6.4.1. Determinação da ordem de eluição e da pureza enantiomérica da carvona e

limoneno e no óleo essencial de L. alba............................................................................... 44

4.6.4.2. Preparo e análise individual do óleo essencial de L. alba, do padrão de carvona e

do padrão de limoneno......................................................................................................... 44

4.7. Isolamento e caracterização do enantiômero de linalol do óleo essencial de L. alba... 44

4.7.1. Preparação manual da placa com adsorvente de sílica gel......................................... 45

4.7.2. Isolamento e purificação do linalol por cromatografia em camada delgada (CCD).. 45

4.7.3. Elucidação estrutural e análise organoléptica do linalol isolado de L. alba............... 46

4.7.3.1. Análises cromatográficas por CG-EM e CG-DIC................................................... 46

4.7.3.2. Análise de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e

13C e Rotação Óptica............ 46

4.7.3.3. Análise de índice de refração.................................................................................. 46

4.7.3.4. Ensaios organolépticos de aspecto, cor e odor........................................................ 47

4.8. Obtenção de curvas analíticas para quantificação de linalol, carvona e limoneno nos

óleos essenciais, utilizando o método de padrão interno...................................................... 47

4.8.1. Preparo e análise das soluções dos padrões de linalol, carvona e limoneno para a

obtenção das curvas analíticas.............................................................................................. 47

4.9. Preparo e análise das soluções de óleos essenciais para quantificação do linalol,

carvona e limoneno............................................................................................................... 48

4.10. Análise quantitativa da carvona e do limoneno no OE de L. alba (quimiotipo

carvona-limoneno)................................................................................................................ 48

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................... 50

5.1. Identificação dos componentes químicos das espécies L. alba, O. basilicum, P.

graveolens, A. rosaeodora, C. camphora e C. sativum........................................................ 50

5.2. Avaliação da estereoquímica do linalol nos óleos essenciais das espécies L. alba, O.

basilicum, P. graveolens, A. rosaeodora, C. camphora e C. sativum.................................. 60

5.3. Avaliação da estereoquímica da carvona e do limoneno no óleo essencial da espécie

L. alba do quimiotipo carvona-limoneno............................................................................. 62

5.4. Análise comparativa dos óleos essenciais das espécies estudadas................................ 66

5.5. Caracterização do linalol isolado do óleo essencial de L. alba por CCD...................... 67

5.5.1. Análise qualitativa do óleo essencial de L. alba em CCDA....................................... 67

5.5.2. Isolamento e purificação do linalol do óleo essencial de L. alba por CCDP............. 68

5.5.3. Análise da identificação do linalol isolado por CG-EM............................................ 70

5.5.4. Avaliação da estereoquímica do linalol isolado por CG-DIC.................................... 72

5.5.5. Avaliação da rotação óptica e do índice de refração do linalol isolado..................... 72

5.5.6. Avaliação de aspecto, cor e odor do linalol isolado................................................... 72

5.5.7. Elucidação estrutural do composto isolado de L. alba por RMN............................... 73

6.6. Quantificação do linalol, carvona e limoneno nos óleos essenciais das espécies L.

alba, O. basilicum, P. graveolens, A. rosaeodora, C. camphora e C. sativum.................... 76

5.6.1. Parâmetros de validação do método do padrão interno.............................................. 82

5.6.1.1. Linearidade e faixa de trabalho............................................................................... 82

5.6.1.2. Sensibilidade............................................................................................................ 84

5.6.1.3. Limite de detecção e limite de quantificação.......................................................... 84

6. CONCLUSÃO................................................................................................................. 86

7. PERSPECTIVAS DO TRABALHO............................................................................. 87

8. REFERÊNCIAS............................................................................................................. 88

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1. Unidade básica para a formação de terpenóides................................................. 1

Figura 2. Estruturas de monoterpenos e sesquiterpenos de ocorrência em óleos

essenciais............................................................................................................................. 2

Figura 3. Representação espacial das imagens especulares de isômeros ópticos.............. 5

Figura 4. Estrutural dos isômeros ópticos da Talidomida.................................................. 6

Figura 5. Estruturas das macromoléculas , e -ciclodextrinas..................................... 9

Figura 6. Estruturas enantioméricas do linalol.................................................................. 14

Figura 7. Estruturas enantioméricas da carvona................................................................ 15

Figura 8. Estruturas enantioméricas do limoneno.............................................................. 16

Figura 9. Foto de erva-cidreira (Lippia alba (Mill.) N. E. Brown)................................... 18

Figura 10. Foto de manjericão (Ocimum basilicum L.). ................................................... 22

Figura 11. Foto de gerânio (Pelargonium graveolens L’Herit). ....................................... 25

Figura 12. Foto de pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke). ................................................. 28

Figura 13. Foto de Ho-sho (Cinnamomum camphora Nees e Eberm var. linaloolifera

Fujita). ................................................................................................................................ 31

Figura 14. Fotos de coentro (Coriandrum sativum L.) das folhas (A) e sementes (B)...... 33

Figura 15. Sistema de hidrodestilação em série com aparelho do tipo Clevenger............ 40

Figura 16. Cromatógrafo a gás acoplado ao espectrômetro de massas.............................. 41

Figura 17. Cromatógrafo a gás com detector de ionização em chama.............................. 42

Figura 18. Sistema de filtração a vácuo (A) e evaporador rotatório (B)............................ 45

Figura 19. Cromatograma dos íons totais e estruturas dos constituintes majoritários do

óleo essencial de L. alba do quimiotipo linalol-1,8-cineol................................................. 53


óleo essencial de L. alba do quimiotipo carvona-limoneno............................................... 54


óleo essencial de O. basilicum............................................................................................ 55


óleo essencial de P. graveolens.......................................................................................... 56


óleo essencial de A. rosaeodora.......................................................................................... 57

i


óleo essencial de C. camphora............................................................................................ 58


óleo essencial de C. sativum............................................................................................... 58

Figura 26. Cromatogramas obtidos por CG-DIC da separação enantiomérica do padrão

comercial de linalol racêmico (A), do padrão comercial de (R)-(-)-linalol (B) e da

separação enantiomérica da co-injeção dos padrões de linalol racêmico e

(R)-(-)-linalol (C)................................................................................................................ 61

Figura 27. Cromatogramas obtidos por CG-DIC do óleo essencial de L. alba

(quimiotipo carvona-limoneno) (i), do padrão comercial (R)-(-)-carvona (ii) e da co-

injeção do padrão (R)-(-)-carvona e óleo essencial de L. alba (iii)..................................... 63

Figura 28. Cromatogramas obtidos por CG-DIC do óleo essencial de L. alba

(quimiotipo carvona-limoneno) (a), do padrão comercial (R)-(+)-limoneno (b) e da co-

injeção do padrão (R)-(+)-limoneno e óleo essencial de L. alba (c)................................... 64

Figura 29. Cromatoplaca em CCDA do padrão comercial de 1,8-cineol (1), do padrão

comercial de linalol (2) e do óleo essencial de L. alba (3)................................................ 67

Figura 30. Separação dos componentes do óleo essencial de L. alba por CCDP: (i) 1,8-

Cineol; (ii) Linalol; (iii) Outros compostos........................................................................ 68

Figura 31. Cromatoplaca em CCDA do linalol isolado de L. alba por CCDP (L1) e do

padrão comercial (L2)......................................................................................................... 69

Figura 32. Espectros de massas do composto linalol isolado do óleo essencial de L.

alba por CCDP (A) e do linalol padrão comercial (B)....................................................... 71

Figura 33. Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) do (S)-(+)-linalol isolado de L.

alba...................................................................................................................................... 75

Figura 34. Espectros de RMN de 13

C e DEPT 135 (100 MHz, CDCl3) do (S)-(+)-linalol

isolado de L. alba................................................................................................................ 75

Figura 35. Estruturas dos padrões internos utilizados no método analítico...................... 76

Figura 36. Curva analítica do (R)-(-)-linalol obtida pelo método do padrão interno,

apresentando a regressão linear e a equação da reta........................................................... 77

Figura 37. Curva analítica do (S)-(+)-linalol obtida pelo método do padrão interno,


Figura 38. Curva analítica do (R)-(-)-carvona obtida pelo método do padrão interno,


Figura 39. Curva analítica do (R)-(+)-limoneno obtida pelo método do padrão interno,


ii

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1. Propriedades odoríferas dos enantiômeros de carvona, limoneno e linalol.......... 7

Tabela 2. Denominação da forma enantiomérica e racêmica e propriedade óptica do

linalol...................................................................................................................................... 14

Tabela 3. Caracterização química dos quimiotipos de L. alba.............................................. 19

Tabela 4. Caracterização química dos quimiotipos de O. basilicum.................................... 22

Tabela 5. Identificação botânica das amostras vegetais estudadas....................................... 39

Tabela 6. Massa do material vegetal utilizada na extração e rendimento do óleo essencial. 40

Tabela 7. Concentração das soluções de trabalho utilizadas para obtenção das curvas

analíticas................................................................................................................................. 47

Tabela 8. Composição química dos óleos essenciais das espécies vegetais em estudo........ 50

Tabela 9. Distribuição enantiomérica de linalol em padrões comerciais e óleos essenciais. 62

Tabela 10. Distribuição enantiomérica de carvona e limoneno em padrão comercial e no

óleo essencial L. alba (quimiotipo carvona-limoneno).......................................................... 65

Tabela 11. Resultados do isolamento e purificação do linalol de L. alba............................. 69

Tabela 12. Propriedades do (S)-(+)-linalol isolado............................................................... 73

Tabela 13. Dados espectroscópicos de RMN de 1H e

13C do linalol da literatura, do

padrão comercial e do linalol isolado..................................................................................... 74

Tabela 14. Parâmetros da curva analítica do (R)-(-)-linalol com padrão interno

(β-citronelal)........................................................................................................................... 77

Tabela 15. Parâmetros da curva analítica do (S)-(+)-linalol com padrão interno

(β-citronelal)........................................................................................................................... 78

Tabela 16. Parâmetros da curva analítica do (R)-(-)-carvona com padrão interno

( -terpineno)........................................................................................................................... 79

Tabela 17. Parâmetros da curva analítica do (R)-(+)-limoneno com padrão interno

( -terpineno)........................................................................................................................... 80

Tabela 18. Dados da análise quantitativa do linalol nos óleos essenciais............................. 81

Tabela 19. Dados da análise quantitativa da carvona e do limoneno no óleo essencial....... 81

Tabela 20. Faixa de trabalho, equação da reta e coeficiente de correlação das curvas

analíticas................................................................................................................................. 82

Tabela 21. Parâmetros estatísticos do coeficiente de variação.............................................. 83

Tabela 22. Análise estatística para determinação do LD e LQ............................................. 85

iii

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS

[α]D Rotação óptica

Δ Deslocamento químico

Índice de refração

r2 Coeficiente de correlação

ABIHPEC Associação Brasileira da Indústria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosméticos

AmBev Companhia de Bebidas das Américas

AcOEt Acetato de etila

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ASE Herbário da Universidade Federal de Sergipe

CD Ciclodextrina

CCD Cromatografia em camada delgada

CCDA Cromatografia em camada delgada analítica

CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa

CDCl3 Clorofórmio deuterado

CHCl3 Clorofórmio

COSY “Correlation Spectroscopy”

CG-DIC Cromatografia gasosa acoplada a detector de ionização por chama

CG-EM Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

CGMD-EM Cromatografia gasosa multidimensional acoplada à espectrometria de Massas

CV Coeficiente de variação

D Dubleto

Dd Duplo dubleto

d.i Diâmetro interno

DCM Diclorometano

DEPT “Distortionless enhancement by polarization transfer”

DG-SANCO European Commission Health & Consumer Protection Directorate-General

EU União Européia

EUA Estados Unidos da América

FL Fator de linearidade

FLm Média aritmética dos fatores de linearidade

iv

HD Hidrodestilação

HUCS Herbário do Museu de História Natural da Universidade de Caxias do Sul

Hz Hertz

IB Instituto de Biotecnologia

INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial

IR Índice de retenção

ISSO ”International Standard Organization”

J Constante de acoplamento

CL Concentração letal

LD

LQ

M

Limite de detecção

Limite de quantificação

Multipleto

MHz MegaHertz

HSQC “Heteronuclear Sigle Quantum Coherence”

OEs Óleos essenciais

Q Quarteto

Rf Fator de retardamento ou retenção

RMN 13

C Ressonância magnética nuclear de carbono 13

RMN 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênios singleto

S Singleto

T Tripleto

Tq Triplo quinteto

TMS Tetrametilsilano

UCS Universidade Caxias do Sul do Rio Grande do Sul

UNCTAD United Nations Conference on Trade and Development

URI Universidade Regional Integrada do Rio Grande do Sul

v

RESUMO

Este estudo envolveu isolamento, caracterização, quantificação e avaliação da pureza

enantiomérica do linalol nos óleos essenciais das espécies aromáticas Lippia alba (Mill.) N.

E. Brown (quimiotipo linalol-1,8-cineol), Ocimum basilicum L, Pelargonium graveolens

L’Herit, Cinnamomum camphora Nees e Eberm var. linaloolifera Fujita, Aniba rosaeodora

Ducke e Coriandrum sativum L. e da carvona e do limoneno no óleo essencial de Lippia alba

(Mill.) N. E. Brown (quimiotipo carvona-limoneno). A quantificação dos monoterpenos foi

realizada por CG-DIC pelo método do padrão interno. As curvas analíticas para a

quantificação foram lineares no intervalo de 1,0 a 10,0 mg mL-1

e apresentaram valores

adequados de coeficientes de correlação (0,996 a 0,999). O linalol foi encontrado com 91,38%

(m/m) no óleo essencial de A. rosaeodora, 84,00% em C. camphora, 79,25% em L. alba,

79,00% em C. sativum, 73,33% em O. basilicum e 13,60% em P. graveolens. A carvona

apresentou 58,13% e o limoneno 31,71% (m/m) no óleo essencial de L. alba (quimiotipo

carvona-limoneno). As análises de purezas enantioméricas realizadas por CG-DIC, utilizando

uma coluna com fase enantiosseletiva (β-ciclodextrina) e a co-injeção com padrões

comerciais, revelaram a presença do enantiômero (S)-(+)-linalol em L. alba e do (R)-(-)-

linalol em O. basilicum e em C. camphora. As duas formas enantioméricas do linalol foram

encontradas nas espécies P. graveolens, A. rosaeodora e C. sativum. Na espécie L. alba

(quimiotipo carvona-limoneno) foi observada uma única forma enantiomérica (R)-(-)-carvona

e o limoneno apresentou as formas enantioméricas (S)-(-)-limoneno e (R)-(+)-limoneno com

predominância desta última. O linalol foi isolado do óleo essencial de L. alba por CCD e

submetido à análise por CG-EM, CG-DIC, RMN de 1H e

13C e [α]D, as quais elucidaram sua

estrutura e estereoquímica. O (S)-(+)-linalol isolado de L. alba (> 99%) foi utilizado na

obtenção da curva analítica. Esse isolamento foi necessário devido à indisponibilidade em

adquirir o (S)-(+)-linalol comercialmente puro.

Palavras-chave: pureza enantiomérica, quantificação, espécies aromáticas, óleo essencial,

linalol, carvona, limoneno.

vi

ABSTRACT

This study involved the isolation, characterization, quantification and evaluation of the

enantiomeric purity of linalool in the essential oil of aromatic species Lippia alba (Mill.) NE

Brown (chemotype linalol-1,8-cineole), Ocimum basilicum L., Pelargonium graveolens

L'Herit, Cinnamomum camphora Nees and Eberm var. linaloolifera Fujita, Aniba rosaeodora

Ducke and Coriandrum sativum L., and carvone and limonene in the essential of Lippia alba

(chemotype carvone-limonene). The quantification of monoterpenes was performed by GC-

FID method for the internal standard. The analytical curves for quantification were linear in

the range 1.0 to 10.0 mg mL-1 and showed appropriate values of correlation coefficients

(0.996 to 0.999). The linalool was found with 91.38% (w/w) in essential oil of A. rosaeodora,

84.00% in C. camphora, 79.25% in L. alba, 79.00% in C. sativum, 73.33% in O. basilicum

and 13.60% in P. graveolens. The carvone showed 58.13% and limonene showed 31.71%

(w/w) of essential oil of L. alba. The enantiomeric purity analysis performed by GC-FID,

using a column with enantioselective phase (β-cyclodextrin) and co-injection with

commercial patterns, revealed the presence of the enantiomer (S)-(+)-linalool in L. alba and

(R)-(-)-linalool in O. basilicum and C. camphora. The two enantiomeric forms of linalool

were found in the P. graveolens, A. rosaeodora and C. sativum species. In the L. alba species

(chemotype carvone-limonene) was observed a single enantiomeric form (R)-(-)-carvone and

limonene showed the enantiomeric forms (S)-(-)-limonene and (R)-(+)-limonene, with

predominance of the latter. The linalool was isolated from the essential oil of L. alba by TLC

and subjected to analysis of GC-MS, GC-FID, 1H and 13C NMR and [α]D, which elucidated

its structure and stereochemistry. The (S)-(+)-linalool isolated from L. alba (> 99%) was used

to obtain the analytical curve. This isolation was necessary due to unavailability of acquire the

(S)-(+)-linalool commercially pure.

Key words: enantiomeric purity, quantification, aromatic species, essential oil, linalool,

carvone, limonene.

vii

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 Óleos essenciais

1.1.1 Origem biossintética

Os vegetais produzem grande variedade de compostos orgânicos que parecem não ter

função direta no seu crescimento e desenvolvimento. Tais substâncias são conhecidas como

metabólitos secundários, produtos secundários ou produtos naturais. Enquanto que os

metabólitos primários (aminoácidos, nucleotídeos, açúcares e lipídios) são encontrados em

todo o reino vegetal, os metabólitos secundários apresentam distribuição restrita a algumas

famílias, gêneros e até mesmo em espécies (DEWICK, 2009; KUMAR & CHOPRA, 2005;

TAIZ & ZEIGER, 2009). A distribuição dos produtos secundários nos vegetais é influenciada

por fatores genéticos e ambientais como luz, temperatura, tipo de solo, nutrientes, água entre

outros (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).

A ISO (International Standard Organization) define óleos essenciais ou óleos voláteis

como sendo produtos extraídos de partes de plantas através de destilação por arraste de vapor

d’água, bem como os produtos obtidos por prensagem dos pericarpos de frutos cítricos

(SIMÕES et al., 2007). Esses produtos obtidos dos metabólitos secundários apresentam-se em

misturas de compostos com diferentes concentrações, constituídos principalmente por

derivados de fenilpropanóides e/ou terpenóides, com predominância deste último. O termo

terpenóides é empregado para designar todas as substâncias cuja origem biossintética deriva

de unidades de isopreno (Figura 1), composto com cinco átomos carbonos. Os terpenóides

mais frequentes em óleos essenciais são membros das classes dos monoterpenos e

sesquiterpenos, compostos que apresentam em suas estruturas uma e duas unidades de

isopreno, respectivamente (Figura 2) (GOUNARIS, 2010; SARKER et al., 2006; SIMÕES et

al., 2007).

isopreno

Figura 1. Unidade básica para a formação de terpenóides.

2

Figura 2. Estruturas de monoterpenos e sesquiterpenos de ocorrência em óleos essenciais.

A maioria dos óleos essenciais possui aroma agradável e intenso, solúvel em solventes

apolares. Embora seja insolúvel em água, pode conferir odor às soluções aquosas, que são

chamadas de hidrolatos, e que os tornam uma fonte importante de aromatizantes em

perfumaria e especiarias. Além do mais, as essências ou óleos essenciais apresentam

atividades farmacológicas, como antisséptica, antiinflamatória, antimicrobiana entre outras,

linalol limoneno

OHO

carvona

geraniol

OH

nerol

OH

O

geranial neral

O

-pineno -pineno

-cariofileno

O

óxido de linalol

O

OH

H

germacreno D-humuleno

OH

-eudesmol1,8-cineol

3

por esse motivo são utilizados na medicina popular e na fabricação de medicamentos

(SIMÕES et al., 2007).

1.1.2 Aspectos de produção e econômicos

Os óleos essenciais são uma rica e importante fonte de compostos, tais como: linalol,

carvona, limoneno, citral, citronelal, eugenol, mentol e safrol, os quais podem ser

comercializados na sua forma bruta ou beneficiada. No Brasil, os óleos essenciais extraídos

pela prensagem do pericarpo de frutos cítricos dominam o mercado de exportação

(ANTUNES, 2005; BIZZO et al., 2009; OHASHI & ROSA, 2004). Dentre os principais

componentes dos óleos cítricos, tem-se o (R)-(+)-limoneno do óleo essencial de laranja, que

foi responsável por 86% da exportação no período de janeiro de 2005 a outubro de 2008. O

valor comercial desse produto variou de US$ 2 a 20/Kg, podendo alcançar o valor de US$

50/Kg. Nesse mesmo período, os enantiômeros da carvona, (R)-(-)-carvona e (S)-(+)-

carvona), foram mais valorizados do que o limoneno, com valores que oscilaram de US$ 200

a 500/Kg. O mercado brasileiro de carvona foi de aproximadamente 350 t/ano, para uso

principalmente em pastas de dente (ANTUNES, 2005; BIZZO et al., 2009).

Os óleos essenciais extraídos das folhas de Ho-Sho (Cinnamomum camphora L.) e das

sementes de coentro (Coriandrum sativum L.) estão entre os principais óleos essenciais

comercializados mundialmente (BIZZO et al., 2009). Os óleos essências dessas espécies têm

o álcool linalol como constituinte majoritário (FRIZZO et al., 2000; ÖZEK et. al., 2010). Esse

álcool também é o principal constituinte (78 a 93%) do óleo essencial extraído da madeira de

pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke), árvore de origem brasileira que na década de 60

dominou o mercado de óleo essencial, com exportação que chegou a 500 t anuais, mas foi

progressivamente reduzida com a produção do linalol sintético e com a comercialização do

óleo essencial de Ho-Sho. A escassez da árvore de pau-rosa também foi um dos motivos da

diminuição da exportação do óleo essencial. Nos anos de 2005 a 2008 o óleo essencial de pau-

rosa foi comercializado entre US$ 50 e 100/Kg, com importação principalmente para os

Estados Unidos América (EUA) e para a União Européia (UE) (BIZZO et al., 2009; MAIA et

al., 2007).

A indústria brasileira de cosméticos é a principal responsável pelo volume de

produção e consumo de óleos essenciais no Brasil. O faturamento com esse comércio passou

de 4,9 bilhões de reais em 1996 para 21,7 bilhões de reais em 2008, com isso, tornou-se a

4

terceira maior indústria cosmética do mundo, atrás apenas de EUA e Japão (FERRAZ et al.,

2009). Em 2010 o mercado de perfumes, cosméticos e produtos de higiene foi de R$ 27,3

bilhões. A estimativa para o ano de 2015 será de aproximadamente R$ 50 bilhões (ABIHPEC,

2011). Em termo de produção de óleo essencial o Brasil tem lugar de destaque ao lado de

Índia, China e Indonésia, que são considerados os grandes produtores mundiais (FAPESP,

2010).

Para atender a demanda por óleos essenciais ricos em linalol, a Associação Brasileira

de Produtores de Óleos Essenciais distribuiram mudas de manjericão (Ocimum basilicum L.)

para os produtores de OEs, multiplicadas pela técnica de micropropagação (FAPESP, 2010).

Outra alternativa utilizada para aumentar o teor de linalol em manjericão e erva-cidreira

[Lippia alba (Mill) N. E. Br.] é a realização de melhoramento genético nessas plantas. Essa

técnica é realizada por meio da fecundação ou auto-fecundação nas espécies vegetais e

permite aumentar a produtividade de forma sustentável e ecologicamente equilibrada, como

também a padronização de princípios ativos. (BLANK et al., 2007; SIMÕES et al., 2007).

Os produtos oriundos de fontes naturais, como por exemplos os óleos essenciais, são

muito requisitados pelos consumidores das industriais de cosméticos, perfumes, farmacêuticas

entre outras. Para garantir à autenticidade desses produtos o teor e a composição química são

geralmente avaliados. Outro parâmetro imprescindível é a análise da pureza enantiomérica de

compostos quirais (BUTLER et al., 2004; LIBERTO et al., 2008).

Neste trabalho, os óleos essenciais investigados foram obtidos das espécies aromáticas

Lippia alba (Mill) N. E. Br (quimiotipo linalol-1,8-cineol e quimiotipo carvona-limoneno),

Ocimum basilicum L. (quimiotipo linalol), Pelargonium graveolens L’Herit, Aniba

rosaeodora Ducke, Cinnamomum camphora Nees e Eberm var. linaloolifera Fujita e

Coriandrum sativum L. e analisados por CG-EM, CG-DIC, CCD, RMN de 1H e

12C. Os

compostos monoterpênicos quirais estudados dos óleos essenciais das espécies supracitadas

foram linalol, carvona e limoneno. Para uma maior confiabilidade da quantificação dos

componentes foi utilizado o método do padrão interno. A pureza enantiomérica dos

compostos quirais foi determinada por CG-DIC utilizando uma coluna cromatográfica

derivada de β-CD.

5

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 O fenômeno da quiralidade

A quiralidade está presente em muitas moléculas orgânicas, inclusive nos compostos

dos óleos essenciais. Esse fenômeno ocorre quando o átomo de carbono está ligado a quatro

diferentes grupos funcionais. Carbonos desse tipo são chamados de assimétricos ou quirais e

as molécular são ditas moléculas quirais. Os enantiômeros são moléculas quirais que possuem

imagens especulares umas das outras (Figua 3), mas que não se sobrepõem. Esses isômeros

ópticos apresentam diferentes aromas, sabor, toxicidade e atividade biológica. Mas,

apresentam propriedades físicas idênticas, excetuando a direção do desvio da luz plano

polarizada (atividade óptica). Se o desvio da luz polarizada é para a direita, são chamados

dextrógiros representado por (d) ou (+); se o giro é para esquerda são chamados de levógiros

(l) ou (-). Também pode ser denotado pela ordem decrescente de prioridade do número

atômico do(s) átomo(s) ligado(s) ao carbono quiral. Se a configuração é no sentido horário em

torno do carbono, é designado como (R); se a configuração é anti-horária, é indicado por (S).

Essa última notação (R, S) é comumente utilizada para estabelecer a configuração absoluta

dos enantiômeros e foi desenvolvida por Can-Ingold-Prelog (Robert S. Can, Christopher

Ingold e Vladimir Prelog) (ELIEL & WILEN, 1994; McMURRY, 2005; TABACHI et al.,

2004).

Figura 3. Representação espacial das imagens especulares de

isômeros ópticos. Fonte: adaptado de Alhanati (2010).

6

2.1.1 Quiralidade na atividade biológica

A quiralidade e a atividade biológica possuem uma estreita afinidade, pois

comportamentos distintos são observados quando compostos quirais interagem com os seres

vivos. Os enantiômeros de drogas quirais são frequentemente caracterizados por diferentes

atividades farmacológicas e têm sido largamente desenvolvidos pela indústria farmacêutica.

As misturas racêmicas somente são utilizadas em medicamentos após estudos minuciosos de

ensaios clínicos e toxicológicos dessa mistura, como também de seus enantiômeros

isoladamente (BARREIRO et al., 1997; LEFFINGWELL, 2003). Esses testes evitam uma

nova ocorrência de um dos casos mais intrigante no uso de droga racêmica, que foi o

medicamento Talidomida, utilizado na década de 60 pelas mulheres grávidas como

tranquilizante, estimulador do sono e enjoos matinais, mas que foi banido pela indústria

farmacêutica após a constatação de efeitos adversos causados por um de seus isômeros

ópticos (Figura 4). (BARREIRO et al., 1997; SILVEIRA et al., 2001).

Figura 4. Estruturas dos isômeros ópticos da Talidomida.

2.1.2 Quiralidade na distinção de odor de compostos dos óleos essenciais

Os pesquisadores têm investigado sistematicamente a configuração absoluta dos

odorantes naturais empregados em perfumarias, alimentos e bebidas, a fim de estabelecer uma

correlação entre a cultivar ou origem geográfica e o excesso enantiomérico dos compostos

nesses aromas (BRENNA et al., 2003). O excesso enantiomérico refere-se ao percentual em

que um dos enantiômeros apresenta atividade óptica em uma mistura de dois enantioméricos.

O enantiômero em maior proporção (determinado a partir da área ou % de área do pico

NH

O

O N

O

O

(S)-(-)-T alidomida (R)-(+)-T alidomida

NH

O

O N

O

O

Teratogênico Sedativo e hipotônico

7

cromatográfico) terá seu excesso enantiomérico determinado de acordo com a equação abaixo

(SUPELCO, 1998).

Excesso enantiomérico =

A pureza enantiomérica é o percentual de cada enantiômero na mistura racêmica [(%)

do enantiômero 1 e (%) do enantiômero 2]. A mistura racêmica ou racemato é normalmente

denotada por (±) ou (dl) e geralmente representa uma proporção equivalente dos enantiômeros

(50:50) e por essa razão não existe atividade óptica, ou seja, não há desvio na direção da luz

plano polarizada, mas isso não significa que a mistura não apresente atividade biológica

(SUPELCO, 1998).

A percepção enantiosseletiva dos odorantes quirais foi publicada por Ohloff em 1961,

em que se verificou que o (+)- -citronelol tinha um odor típico de citronela, enquanto o (-)- -

citronelol era típico de gerânio (RIENÄCKER & OHLOFF, 1961 apud BRENNA et al.,

2003; LEFFINGWELL, 2010). As propriedades odoríferas dos enantiômeros carvona,

limoneno e linalol estão relatadas na Tabela 1.

Tabela 1. Propriedades odoríferas dos enantiômeros de carvona, limoneno e linalol.

Composto Enantiômero Descrição do odor * Limiar de odor

(ppb) **

Carvona (4R)-(-) Hortelã doce; ervas frescas 2,0

(4S)-(+) Alcavária (odor de cominho) 85,0

Limoneno (4R)-(+) Laranja; cítricos frescos 200,0

(4S)-(-) Limão; similar à terebentina 500,0

Linalol (3R)-(-) Lavanda; flores frescas 0,8

(3S)-(+) Herbáceo; doce; notas cítricas 7,4

*(BRENNA et al., 2003; KOPPENHOEFER et al., 1994; LASKA & TEUBNER, 1999; LEFFINGWELL,

2010; SUGAWARA et al., 2000). **(LEFFINGWELL, 2010).

(%) enantiômero 1 – (%) enantiômero 2

(%) enantiômero 1 + (%) enantiômero 2 x 100

8

2.2 Técnica Cromatográfica e Espectroscópica

2.2.1 Cromatografia gasosa e coluna enantiosseletiva

A cromatografia é um método físico-químico de separação e está fundamentada na

migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes

interações entre duas fases imiscíveis, móvel e estacionária. A grande variedade de

combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e

de grande aplicação (COLLINS et al., 2006).

A cromatografia gasosa (CG) é uma técnica amplamente utilizada para separar

substâncias orgânicas voláteis e semi-voláteis. Compostos encontrados nos óleos essenciais

são facilmente resolvidos por CG, mediante o uso de colunas com fases estacionárias

apropriadas. A detecção mais frequente dos componentes pode ser feita por duas técnicas: a

espectrometria de massa (EM), que é uma ferramenta poderosa para identificar estruturas de

compostos desconhecidos, mas é ineficiente para distinguir enantiômeros sem o uso de

colunas enantiosseletivas, isso porque esses isômeros ópticos têm espectros de massas

idênticos; e o detector de ionização em chama (DIC), que é um detector quase universal,

altamente sensível e robusto e normalmente utilizado na análise quantitativa de óleos

essenciais (COLLINS et al., 2006; LIBERTO et al., 2008).

Os óleos essenciais são conhecidos por serem misturas complexas de compostos

voláteis e a indústria trabalha intensamente para o estabelecimento de normas que indiquem

um perfil químico preferencial para cada tipo de produto. Em decorrência disso, o

aperfeiçoamento de colunas cromatográficas enantiosseletivas é realizado com a finalidade de

contribuir para a elucidação da composição química dos óleos essenciais, uma vez que a

pureza enantiomérica de princípios opticamente ativos é um importante indicador de

autenticidade, origem geográfica, biogênese e qualidade dos óleos essenciais (BUTLER et al.,

2004; CASABIANCA et al., 1998; LIBERTO et al., 2008).

As colunas enantiosseletivas frequentemente utilizadas são constituídas por derivados

de ciclodextrinas. Essas colunas interagem diferentemente com os enantiômeros de uma

mistura racêmica e possibilitam uma melhor resolução dos picos cromatográficos

(TABACCHI et al., 1997; SUPELCO et al., 1998). O mecanismo de separação dos picos está

baseado na formação de complexo de inclusão entre o soluto quiral e a ciclodextrina, devido à

9

inclusão da parte hidrofilica da molécula quiral na cavidade hidrofílica da ciclodextrina e

interação dos grupos hidroxilas da ciclodextrina, ou com os grupos introduzidos por derivação

(COLLINS et al., 2006). As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos formados por

moléculas de D-glicose unidas através de ligações glicosídicas α(1-4), obtidas a partir da

degradação enzimática do amido. As CDs mais conhecidas são as α, β e γ-ciclodextrinas

(Figura 5), constituídas por 6, 7 e 8 unidades de glicose, respectivamente, que adotam a

conformação de cadeira (BRITTO et al., 2004).

Figura 5. Estruturas das macromoléculas , e -ciclodextrinas.

A cromatografia gasosa multidimensional (CGMD) também vem sendo utilizada para

resolver sobreposição de picos causada pela cromatografia gasosa com separação

enantiosseletiva direta (BONACORSI et al., 2011). Nesse sistema, cada pico elui na primeira

dimensão (coluna apolar convencional), e depois da separação de outros componentes da

matriz, o(s) componente(s) desse pico é (são) transferido(s), parcialmente ou totalmente, para

a segunda dimensão (coluna enantiosseletiva). (BÖHME et al., 2010; PEDROSO et al., 2009;

RUBIOLO et al., 2010).

2.2.2 Cromatografia em camada delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de separação por adsorção,

em que o grau de partição relativa das substâncias ocorre entre uma fase líquida móvel

(eluente) e uma fase sólida estacionária (adsorvente), que geralmente é sílica gel ou óxido de

alumínio. O fator de retardamento (Rf) é o principal parâmetro para avaliar o grau de

separação dos componentes na camada de adsorvente. O Rf é determinado pela razão entre a

distância percorrida pelo analito e a distância percorrida pela fase móvel. Os valores ideais de

10

Rf são encontrados na faixa de 0,3 a 0,7 (COLLINS et al., 2006; DEGANI et al., 1998;

VOGEL, 2008).

A CCD é um método simples, rápido, visual e econômico, e por essa razão é

frequentemente utilizada para estabelecer se dois compostos são idênticos; verificar a pureza

de um composto; determinar o número de componentes em uma mistura; determinar o

solvente apropriado para separação em uma coluna cromatográfica; monitorar a separação de

uma mistura em uma coluna cromatográfica; acompanhar o progresso de uma reação. A CCD

pode ser usada em escala analítica (CCDA) e preparativa (CCDP) (COLLINS et al., 2006;

DEGANI et al., 1998; VOGEL, 2008).

A escolha da fase móvel não é tarefa simples. No entanto, uma vez que as fases

estacionárias mais usadas são extremamente polares, não devem ser utilizados solventes

pouco polares, que não removeriam os compostos do ponto de aplicação, nem solventes muito

polares, capazes de arrastar os componentes da amostra até o topo da placa. Em vista disso,

melhores resultados são obtidos com misturas de solventes, de modo a se obter uma

polaridade média em relação à polaridade dos componentes da amostra (COLLINS et al.,

2006; DEGANI et al., 1998; VOGEL, 2008).

Como a maioria dos compostos orgânicos é incolor, faz-se necessária a utilização de

um processo de revelação para que se possa analisar o resultado por CCD. Um dos processos

consiste na oxidação dos compostos sobre a placa por meio da pulverização da camada de

adsorvente com uma solução de um reagente apropriado, geralmente um oxidante orgânico,

que produz uma coloração característica para cada tipo de composto após o aquecimento da

placa. Um desses reagentes é a solução de anisaldeído sulfúrico (COLLINS et al., 2006;

DEGANI et al., 1998; VOGEL, 2008).

2.2.3 Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e

13C

A Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e

13C é uma das

técnicas mais potentes para a elucidação estrutural de compostos. Os espectros de ressonância

são obtidos quando a amostra é submetida em um campo magnético externo, de forma que

determinados núcleos que apresentam um momento magnético nuclear, como núcleos com

números de massa ímpar (1H e

13C), podem entrar em ressonância com a radiofrequência

aplicada (SILVERSTEIN et al., 2007).

11

Os espectros de 13

C possibilitam determinar o número de carbonos e seus

deslocamentos químicos. Com a técnica DEPT 135º é possível determinar os carbonos

primários, secundários, terciários e quaternários. Os espectros de HSQC permitem o

estabelecimento da correlação dos carbonos com seus respectivos hidrogênios. Os hidrogênios

vizinhos são determinados a partir da análise dos experimentos COSY (H-H). As

conectividades entre hidrogênios e carbonos a longa distância (HMBC) e a proximidade

espacial entre hidrogênios (ROESY) são determinados pelos experimentos de correlação

(BARROS, 2008; CHAAR, 2000; SILVERSTEIN et al., 2007).

2.3 Métodos de quantificação

A quantificação dos componentes de óleos essenciais, utilizando a técnica de

cromatografia gasosa, pode ser realizada pelos métodos de normalização de área, padrão

interno, adição de padrão e padrão externo.

2.3.1 Normalização de área

No método da normalização da área, obtém-se a composição da mistura pela

expressão da área de cada pico como porcentagem da área total dos picos do cromatograma.

Esse método é denominado de semiquantificação, isso porque o DIC não apresenta a mesma

resposta para todos os compostos presentes no óleo essencial e pode ocorrer uma

superestimação dos teores de hidrocarboneto terpênicos em relação a outros compostos

oxigenados, tendo em vista que esse detector apresenta uma maior sensibilidade a

hidrocarbonetos. A pouca confiabilidade nas análises quantitativas dos componentes químicos

dos óleos essenciais utilizando o DIC deve-se ao fato de os sinais obtidos por esse detector

não dependerem apenas da concentração, mas também das estruturas químicas e da

composição elementar dos compostos orgânicos (BICCHI, et al., 2008; CICHETTI et al.,

2008).

A aplicação deste método requer alguns cuidados, tais como: os componentes da

amostra devem ser separados e identificados; o detector deve responder linearmente para os

compostos da amostra; não deve ocorrer perda de amostra por causa da discriminação no

injetor, na absorção da coluna ou por interação química (BICCHI et al., 2008; VOGEL,

2008).

12

2.3.2 Padrão interno

A área e altura dos picos cromatográficos são afetadas pela quantidade de amostra e,

também, pelas flutuações de vazão do gás de arraste e pelas temperaturas da coluna e do

detector, isto é, por alterações nos fatores que influenciam a sensibilidade e a resposta do

detector. O efeito dessas variações pode ser eliminado pelo uso da técnica do padrão interno,

na qual se adiciona uma quantidade conhecida de uma substância de referência (padrão

interno) à amostra a ser analisada, antes da injeção na coluna. A substância que será utilizada

como padrão interno deve possuir algumas características: ser quimicamente ou fisicamente

similar ao analito; apresentar-se altamente puro; não reagir com nenhum dos componentes da

amostra; não interferir no sinal do analito; não fazer parte da composição da amostra de

interesse (BICCHI et al., 2008; RIBANI et al., 2004; SKOOG et al., 2006; VOGEL, 2008).

Se o padrão interno for eficiente, este método é, provavelmente, o mais preciso para a

cromatografia em fase gasosa, pois reduz os erros sistemáticos, que são evitados ou cujas

magnitudes podem ser determinadas. Os erros mais importantes são os erros operacionais, os

erros devidos aos equipamentos ou aos reagentes e os erros inerentes ao método empregado

(VOGEL, 2008). A quantificação do analito na amostra de interesse será determinada por

meio da equação da reta obtida da curva analítica, onde o eixo y é a razão entre as respostas

do sinal do analito e do padrão interno e o eixo x a concentração do analito nos padrões.

(SKOOG et al., 2006; VOGEL, 2008).

2.3.3 Adição de padrão

O método de adição de padrão será utilizado quando for difícil ou impossível fazer

uma cópia da amostra em estudo e quando não se consegue obter um padrão interno

adequado. Em geral a amostra é fortificada com uma solução padrão contendo o analito. No

método de adição de padrão de um único ponto duas porções da amostra são tomadas. Uma

porção é medida como de costume e na outra porção é adicionada uma quantidade da solução

padrão. As respostas para as duas porções são então empregadas para calcular a concentração

desconhecida. Assumindo uma relação linear entre a resposta e a concentração do analito.

Pode-se realizar a adições múltiplas para verificar se existe uma relação linear entre a resposta

e a concentração do analito. Uma desvantagem desse método é o tempo extra requerido para

se fazer as adições e medidas (SKOOG et al., 2006).

13

2.3.4 Padrão externo

Nesse método um padrão é preparado separadamente da amostra. Enquanto que no

método do padrão interno um padrão é adicionado à amostra. Padrões externos são

empregados para se calibrar instrumentos e procedimentos, quando não há efeitos

interferentes advindos dos componentes da matriz presente na solução do analito. No método

do padrão externo é construída uma curva analítica preparada por uma série de padrões

contendo o analito em concentrações conhecidas, normalmente três ou mais soluções são

utilizadas em um processo de calibração, onde se verifica a linearidade de resposta para o

componente de interesse na faixa de concentração conhecida. A concentração de uma amostra

desconhecida será determinada a partir da equação da reta gerada na curva analítica

(HOLLER et al., 2009).

2.4 Monoterpenos quirais estudados

Neste estudo foram destacados os monoterpenos linalol, carvona e limoneno.

2.4.1 Linalol

O linalol está registrado no Chemical Abstract Service (CAS) sob No. 78-76-6, com o

nome científico de 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol. É um álcool insaturado monoterpênico de

fórmula molecular C8H10O, a qual apresenta uma coloração amarelo pálido, ponto de ebulição

198ºC, índice de refração entre 1,4600 e 1,4630 (20ºC), solubilidade em água de 683,7 mg L-1

(25ºC) (LAPCZYNSKI et al., 2008a; 2008b; LETIZIA et al., 2003).

Esse álcool é encontrado naturalmente como componente majoritário nos óleos

essenciais de muitas espécies de plantas aromáticas, entre as quais se destacam L. alba, O.

basilicum, A. rosaeodora, C. camphora e C. sativum, espécies em que os teor de linalol é

superior a 70% no óleo do essencial. Devido à presença de um centro quiral alguns vegetais

podem biossintetizá-lo na forma de enantiômero (S)-(+)-linalol ou (R)-(-)-linalol (Figura 6) e

ainda na sua forma racêmica (KAMATOU & VILJOEN, 2008; LAPCZYNSKI et al., 2008a;

2008b; LETIZIA et al., 2003; SUGAWARA et al., 2000). Na Tabela 2 encontram-se a

denominação e a propriedade óptica ([ ]25

D) das formas isoméricas do linalol.

14

Figura 6. Estruturas enantioméricas do linalol.

Tabela 2. Denominação da forma enantiomérica e racêmica e propriedade óptica

do linalol.*

Forma isomérica Sinônimo [ ]25

D

(±)-linalol -linalol; linalol racêmico; linalol 0,0º

(3S)-(+)-linalol coriandrol; (+)-linalol; d-linalol; S-linalol +17,1º

(3R)-(-)-linalol licareol; (-)-linalol; l-linalol; R-linalol -15,1º

*(KAMATOU & VILJOEN, 2008; LAPCZYNSKI et al., 2008a; 2008b; LETIZIA et al., 2003;

SUGAWARA et al., 2000).

O linalol é largamente utilizado na indústria de alimentos, cosméticos e perfumes e faz

parte da lista de substâncias classe “A” do Conselho Europeu (COE No. 61), por causa de sua

importância como matéria-prima para síntese de compostos de alto valor agregado (LETIZIA

et al., 2003). Esse monoterpeno é uma das substâncias responsável pelo aroma e sabor de

vinhos (PEDERSEN et al., 2003). O enantiômero (S)-(+)-linalol (excesso enantiomérico de

45,0%) é um dos responsáveis pelo aroma de grãos de café (BONNLÄNDER et al., 2006). As

atividades biológicas e propriedades farmacológicas são relatadas para os óleos essenciais

contendo linalol e também para o composto puro (HORVÁTH et al., 2010; KAMATOU &

VILJOEN, 2008; LAPCZYNSKI et al., 2008a; 2008b; LETIZIA et al., 2003; PEANA et al.,

2002; 2003). A atividade de repelência dos óleos essenciais rico em linalol também foi

comprovada contra o mosquito Aedes aegypti (MÜLLER et al., 2009).

OH OH

(R)-(-)-linalol (S)-(+)-linalol

15

2.4.2 Carvona

A carvona está registrada no CAS sob No. 99-49-0, com o nome de 2-metil-5-(1-

metiletenil)-2-ciclohexen-1-ona. É uma cetona insaturada monoterpênica de fórmula

molecular C10H14O e massa de 150,21 g mol-1

, a qual apresenta coloração amarelo pálido e

odor penetrante. A solubilidade em água de 79,0 mg L-1

(20 °C). Devido à presença de um

centro quiral alguns vegetais podem biossintetizá-lo na forma de enantiômero (R)-(-)-carvona

(d-carvona) ou (S)-(+)-carvona (l-carvona) (Figura 7) e ainda na sua forma racêmica (carvona

ou carvol). Vários estudos foram realizados a respeito das propriedades farmacológicas e

efeitos toxicológicos da carvona (CHAN, 1990; DG-SANCO, 2008).

Figura 7. Estruturas enantioméricas da carvona

A carvona é utilizada em fragrância de perfume, sabão e bebidas. O enantiômero d-

carvona é um dos constituintes majoritários das espécies Lippia alba (Mill) N. E. Brown

(quimiotipo carvona-limoneno), Mentha spicata L. e Poiretia latifolia Vogel (BIZZO et al.,

2009; PORTO et al., 2010, TAVARES et al., 2005). O óleo essencial de Mentha spicata é um

dos mais comercializado mundialmente (BIZZO et al., 2009). O enantiômeros (S)-(+)-

carvona é geralmente obtido pela extração e purificação do óleo das sementes de alcavaria

(Carum carvi L.) e o (R)-(-)-carvona do óleo de hortelã (Mentha ssp) (BOUWMEESTER et

al., 1998; RANI & AKHILA, 1998 apud PORTO et al., 2010).

(R)-(-)-carvona (S)-(+)-carvona

O

H

O

H

16

2.4.3 Limoneno

O limoneno está registrado no CAS sob o No. 138-86-3 como o nome de 1-metil-4-

isopropenilciclohex-1-eno. É um hidrocarboneto monoterpênico (C10H16) e por apresentar um

centro quiral muitas espécies de plantas podem biossintetizá-lo nas formas de seus

enantiômeros (Figura 8) e na forma racêmica. O (R)-(+)-limoneno é denominado de d-

limoneno, o (S)-(-)-limoneno é chamado de l-limoneno e o (±)-limoneno é conhecido como

diterpeno. O d-limoneno é encontrado em espécies de Citrus ssp, Lippia e Artemia. O (R)-(+)-

limoneno é o principal constituinte do óleo essencial de laranja. O l-limoneno é encontrado

principalmente no óleo essencial das espécies de Pinus e Mentha ssp (ERASTO & VILJOEN,

2008).

Figura 8. Estruturas enantioméricas do limoneno.

Nos vegetais o limoneno é o precursor da rota biossintética de vários monoterpenos

monocíclicos, como a carvona, carveol, 1,8-cineol e -terpineol. As indústrias utilizam o

limoneno para síntese de vários compostos de aromas. As propriedades bioquímicas e

farmacológicas do limoneno puro e presente em óleos essenciais são frequentemente

investigadas (ERASTO & VILJOEN, 2008; JUNIOR et al., 2007; VALE et al., 2009).

O limoneno também é o principal produto obtido do beneficiamento de óleos

essenciais no Brasil. Suas principais aplicações são para produtos de limpeza e como solvente.

O composto (4R)-(+)-limoneno, purificado do óleo essencial de laranja [Citrus sinensis (L.)

Osbeck], é utilizado como aditivo de sabor e fragrância em perfumes, bebidas, detergentes e

sabão (BIZZO et al., 2009; ERASTO & VILJOEN, 2008). O enantiômero (4R)-(+)-limoneno

foi encontrado com pureza enantiomérica superior a 99% em aromas de algumas espécies de

Citrus (Citrus aurantium, C. limon, C. paradise, C. reticulata e C. sinensis) (PALACIOS et

H

(R)-(+)-limoneno

H

(S)-(-)-limoneno

17

al., 2009). Em C. aurantium subsp. bergamia, syn. C. bergamia Risso et Poiteau, esse

enantiômero foi encontrado com 98% de pureza enantiomérica (MELLIOU et al., 2009).

2.5 Separação enantiosseletiva dos monoterpenos linalol, carvona e limoneno

Em estudo recente, Böhme e colaboradores (2010) avaliaram possíveis adulterações ou

falsificações de óleos essenciais comerciais utilizados em alimentos e oriundos das plantas

bergamota, lavanda, hortelã-pimenta e óleo de rosa. A distribuição enantiomérica dos

compostos quirais dessas espécies foi primordial para comprovar a autenticidade dos óleos

essencias. Os enantiômeros de linalol e limoneno foram bastante resolvidos em coluna capilar

de β-ciclodextrina derivatizada.

Liberto e colaboradores (2008) também utilizaram coluna com fase β-CD derivatizada na

separação de enantiomérica de compostos quirais dos óleos essenciais de bergamota, limão,

lavanda e de outras espécies. Os enantiômeros dos compostos linalol, carvona e limoneno

presentes nesses óleos essenciais foram adequadamente resolvidos. Esse tipo de coluna

também foi utilizada por Vidari e colaboradores (1999) na resolução de estereoisômero de

óxidos de linalol.

Lewinsohn e colaboradores (2001) utilizaram coluna de β-CD alquilada para resolver a

mistura racêmica do linalol e conseguiram ótima separação dos picos cromatográficos.

A ordem de eluição dos enantiômeros depende da fase estacionária utilizada, por

exemplos enantiômeros de limoneno, linalol e carvona em colunas de fases estacionárias

derivadas de β-CD ocorrem a eluição primeiro do enantiômero (S)-(-)-limoneno, (R)-(-)-

linalol e (R)-(-)-carvona. Enquanto que em coluna com fase -CD ocorre a enantioreversão do

linalol e da carvona, ou seja, o enantiômero (R)-(-)-carvona elui depois do (S)-(+)-carvona e o

(R)-(-)-linalol eluirá depois do (S)-(+)-linalol. Os enantiômeros do limoneno são resolvidos

em colunas de α-CD e β-CD, mas não são separados em -CD. Os enantiômeros de linalol e

carvona apresentam melhor resolução em coluna β-CD (ÖZEK et al., 2010; SIMIONATTO,

2004; SUPELCO, 1998; TABACCHI et al., 1997).

18

2.6 Espécies aromáticas destacadas neste estudo

2.6.1 Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (erva-cidreira)

2.6.1.1 Aspecto botânico de L. alba

O gênero Lippia pertence à família Verbenaceae, a qual compreende

aproximadamente 36 gêneros e 1000 espécies em todo o mundo. No território brasileiro

ocorrem 16 gêneros e cerca de 250 espécies. A espécie nativa do Brasil, Lippia alba (Figura

9), é um subarbusto de morfologia variável, alcançando até um metro e meio de altura, as

folhas são inteiras, opostas, de bordos serreados e ápice agudo de 3 a 6 cm de comprimento.

Essa espécie também pode ser encontrada no México e na América do Norte (JOLY, 2002;

UNCTAD, 2005; OLIVEIRA, 2006; LORENZI & MATOS; SOUZA & LORENZI, 2008).

Figura 9. Foto de erva-cidreira (Lippia alba (Mill.) N. E. Brown). UFS – São Cristóvão/SE.

Autor: Givanildo B. da Silva (2010).

19

Alguns nomes popularmente são designados à espécie L. alba, como por exemplo:

erva-cidreira, chá-de-tabuleiro, cidrila, alecrim-selvagem, alecrim-do-campo, cidreira-brava,

cidreira-carmelitana, salva-limão e salva-do-brasil. O amplo emprego desta planta na

medicina popular é motivo suficiente para sua escolha como tema de estudos químicos,

farmacológicos e clínicos visando sua validação como medicamento. Além disso, justifica-se

a elucidação e fixação dos quimiotipos em ocorrência no Brasil, através de estudos

fitotécnicos apoiados por análises químicas de seu óleo essencial e ensaios farmacológicos

direcionados para cada tipo de atividade (LORENZI & MATOS, 2008).

2.6.1.2 Aspectos químicos e farmacológicos de L. alba

As variações qualitativas e quantitativas dos principais constituintes do óleo essencial

de L. alba são motivos para classificá-la em sete quimiotipos ou raças químicas com alguns

subtipos (Tabela 3). Os quimiotipos são espécies botanicamente idênticas, mas com

diferenciação química entre elas. A classificação dos quimiotipos de L. alba é estabelecida

com base na composição e na rota biossintética dos diferentes óleos essenciais

(HENNEBELLE et al., 2006).

Tabela 3. Caracterização química dos quimiotipos de L. alba*.

Quimiotipo Subtipo Compostos principais

I

Ia citral (geranial + neral)

Ib linalol

Ic citral e linalol

Id (E)-cariofileno e citral

II - tagenona (ocimenona + mircenona)

III

IIIa carvona e limoneno

IIIb diidrocarvona, piperitona ou lipiona

IV - mirceno

V - -terpineno

VI - cânfora e 1,8-cineol

VII - estragol

*Referência: HENNEBELLE et al., 2006.

Os monoterpenos linalol, carvona e limoneno são frequentemente encontrados nos óleos

essenciais de diversas espécies do gênero Lippia (PASCUAL et al., 2001a).

20

O óleo essencial extraído das partes aéreas de erva-cidreira [Lippia alba (Mill.) N. E.

Brown] cultivada no Uruguai e classificada como quimiotipo I (linalol) apresentou como

constituintes principais linalol (55,3%), germacreno D (6,0%), -elemeno (4,0%), germacreno

B (3,1%) e limoneno (2,9%). A análise enantiosseletiva, utilizando coluna cromatográfica

com fase -ciclodextrina ( -CD) derivatizada, revelou que os monoterpenos quirais linalol e

limoneno foram encontrados com excesso enantiomérico de 99,2% de (S)-(+)-linalol e 90,8%

de (R)-(+)-limoneno, respectivamente (LORENZO et al., 2001).

Siani e colaboradores (2002) estudaram a reprodutibilidade de acessos de L. alba

propagados vegetativamente para diferentes cidades do Brasil. Nesse estudo os óleos

essenciais extraídos das folhas dos acessos de L. alba (quimiotipo linalol) apresentaram teores

de linalol na faixa de 54% a 89%. A co-injeção do óleo essencial com padrões comerciais de

linalol [(±)-linalol e (R)-(-)-linalol] e o uso de CG-DIC com coluna -CD derivatizada

mostraram que o linalol apresentou 100% de pureza enantiomérica do enantiômero (S)-(+)-

linalol nos acessos estudados. Em estudo realizado por Lupe (2007) também foi encontrado

apenas o enantiômero (S)-(+)-linalol no óleo essencial da espécie L. alba.

Silva e colaboradores (2006) identificaram no sul da Bahia a espécie L. alba do

quimiotipo I (citral) com teor de citral no óleo essencial variando de 70,6 a 79%. Nesse estudo

também foi avaliada o metabólito secundário produzido por L. alba nas quatro estações do

ano, e constataram que no período da primavera houve um maior rendimento do óleo

essencial e no período do verão um maior número de compostos formados.

Nogueira e colaboradores (2007) também avaliaram o efeito sazonal sobre a atividade

biológica e composição dos óleos essenciais de L. alba, cultivada no oeste do Paraná. Os

experimentos demonstraram maiores rendimentos de óleo essencial na primavera e no verão,

0,54% e 0,58%, respectivamente. Os principais componentes nessas estações foram trans-

dihidrocarvona (52,2% no verão e 61,3% na primavera), citral (15,0% e 11,8%). Estes óleos

essenciais apresentaram atividade antimicrobiana.

Aguiar e colaboradores (2009) comprovaram atividades antimicrobiana e antifúngica dos

extratos brutos de L. alba obtidos das raízes, caules e folhas de plantas cultivadas de forma

padronizada para a produção de fitoterápicos. Essas mesmas atividades foram comprovadas

por Mesa-Arango e colaboradores (2009) utilizando óleos essenciais das folhas de L. alba do

21

quimiotipo citral (teor de 54,1%) e do quimiotipo carvona (teor de 25,3% ), cultivados na

Colômbia.

Atividade ansiolítica de óleos essenciais de três quimiotipos de L. alba: citral, -mirceno e

limoneno; citral e limoneno; carvona e limoneno foi comprovada em camundongos por Vale e

colaboradores (1999).

A Infusão das folhas de L. alba, cultivada na Guatemala, apresentou atividade

antiulcerogênica em ratos. Esse estudo foi realizado por Pascual e colaboradores (2001b), no

qual foram induzidas lesões gástricas provocadas por indometacina e a análise das secreções

gástricas evidenciaram resultados positivos para o uso da infusão das folhas de L. alba no

tratamento das lesões.

2.6.2 Ocimum basilicum L. (manjericão)

2.6.2.1 Aspecto botânico de O. basilicum

O gênero Ocimum pertence à família Lamiaceae, a qual compreende 300 gêneros com

7500 espécies. No Brasil, ocorrem 28 gêneros e 350 espécies. A espécie O. basilicum é uma

planta nativa da Ásia tropical e introduzida no Brasil pela colônia italiana. É conhecida

popularmente como alfavaca, alfavaca-doce, basilicão, manjericão, manjericão-doce e

remédio-de-vaqueiro (LORENZI & MATOS; SOUZA & LORENZI, 2008).

O manjericão (Figura 10) é um subarbusto aromático, anual, ereto e muito ramificado,

cultivado em quase todo território brasileiro em hortas domésticas para uso em condimento e

medicinal. O chá é considerado estimulante digestivo, antiespasmódico gástrico e galactógeno

(LORENZI & MATOS, 2008).

De acordo com o aroma o manjericão pode ser classificado em doce, limão, cinamato

ou canela, cânfora, anis e cravo. As diferentes composições químicas dos óleos essenciais

podem caracterizar o manjericão em três tipos: 1) Europeu, Francês ou doce; 2) Egípcio,

Reunião ou Comoro e 3) Bulgário, Java ou cinamato de metila e eugenol. O óleo essencial do

tipo Europeu é o mais valorizado do mercado, cujos principais constituintes são o linalol e

metil chavicol (CHARLES & SIMON, 1990 e SIMON, 1985 apud BLANK et al., 2004).

22

Figura 10. Foto de manjericão (Ocimum basilicum L.). UFS – São Cristóvão/SE. Autor:

Givanildo B. da Silva (2010).

Estudo realizado com acessos de manjericão oriundos de várias partes do mundo

revelou a presença de sete quimiotipos (Tabela 4).

Tabela 4. Caracterização química dos quimiotipos

de O. basilicum*.

Quimiotipo Compostos principais

I linalol

II eugenol

III metil chavicol

IV metil chavicol e linalol

V metil eugenol e linalol

VI metil cinamato e linalol

VII bergamoteno

*Referência: ZHELJAZKOV et al., 2008.

23

2.6.2.2 Aspectos químicos e farmacológicos de O. basilicum

Em cultivar de Ocimum basilicum do quimiotipo linalol, Fatope e colaboradores

(2008) identificaram esse componente com teor de 49 a 73% nas folhas e 55 a 86% nas flores.

A rotação óptica do linalol das folhas e flores apresentou [ D] de -15,0 e -16,0,

respectivamente. Esses resultados comprovam a presença do enantiômero (R)-(-)-linalol com

100% de pureza enantiomérica na espécie O. basilicum encontrado por Lupe e colaboradores

(2007).

Zheljazkov e colaboradores (2008) avaliaram os genótipos e fenótipos de manjericão

(O. basilicum), oriundos de várias partes do mundo e cultivados em Mississipi; o rendimento

do óleo essencial variou de 0,07 a 1,92% e o teor de (R)-(-)-linalol foi encontrado entre 0,26%

e 73,2%.

A atividade antiparasitária do óleo essencial de O. basilicum cultivado no Campus

Rural da Universidade Federal de Sergipe (UFS), foi comprovada por Almeida e

colaboradores (2007). Nesse estudo, os constituintes principais do óleo essencial (linalol com

69,33% e eugenol com 10,85%) foram capazes de eliminar 80% de Giardia lamblia em 120

horas, enquanto que eugenol purificado eliminou 70% e o linalol, também puro, eliminou

totalmente os parasitas.

Alguns parâmetros, tais como: horário de colheita, tempo e temperatura de secagem

das folhas e das inflorescências para a extração do óleo essencial da espécie O. basilicum

cultivada no Campus Rural da UFS foram avaliados por Carvalho-Filho e colaboradores

(2006), sendo que ficou constatado que o melhor resultado foi obtido quando a colheita das

amostras vegetais foi realizada no período da manhã e a temperatura da estufa para a secagem

das folhas e inflorescência para a extração do óleo essencial foi de 40ºC. O tempo ideal para

a secagem em estufa das folhas foi obtido no quinto dia e das inflorescências no décimo dia.

Esses parâmetros possibilitaram obter o linalol com 86,80% nas folhas e com 90,25% nas

inflorescências. Silva e colaboradores (2003) já tinham relatado a influência do horário de

colheita e Soares e colaboradores (2007) encontraram variações no rendimento do óleo

essencial e do teor de linalol dessa espécie em diferentes temperaturas e velocidades do ar

para a secagem.

24

O melhoramento genético realizado em O. basilicum cultivados no Campus Rural da

UFS mostrou-se significativamente promissor no tocante ao teor de linalol e rendimento de

óleo essencial referente aos genótipos do banco de germoplasma da espécie de Ocimum da

UFS (BLANK et al., 2004). A atividade citotóxica de óleos essenciais oriundo desses acessos

constituídos principalmente por linalol (10,2% a 72,7%), metil chavicol (1,4% a 35,9%),

geraniol (0,5 a 46,3%), metil eugenol (0,9 a 16,8%) e -muurolol (1,9 a 13,9%) foi

significativa em Artemia salina (LC50 de 41,04 a 73,95 g mL-1

). No entanto, pouca ou

nenhuma atividade tripanocida e leishmanicida foi observada em Tripanossoma cruzi e

Leishmania tarentolae. A atividade inibitória encontrada foi entre 0 e 21,2% (ALVES et al.,

2007).

2.6.3 Pelargonium graveolens L’Herit (gerânio)

2.6.3.1 Aspecto botânico de P. graveolens

O gênero Pelargonium pertence à família Geraniaceae, a qual compreende em torno

de 11 gêneros e 800 espécies. O Pelargonium é nativo do sul da África e constitui um gênero

de mais de 250 espécies de ervas e pequenos arbustos. No Brasil, é bastante adaptado ao

clima das regiões sul e sudeste. É popularmente conhecido como gerânio e malva cheirosa

(Figura 11), é uma planta arbustiva perfumada de até 1 metro de altura (MAY et al, 2006;

RANA et al., 2002; SOUZA & LORENZI, 2008).

Além do valor ornamental, a importância do gerânio reside na extração de seus

compostos voláteis. O óleo essencial é extraído das flores frescas, caules e folhas deste

arbusto perene e apresenta como constituintes: geraniol, borneol, citronelol, linalol entre

outros de menor quantidade. O teor de geraniol é que determina o valor comercial. O óleo

essencial de gerânio apresenta em média, 65-78% de geraniol e 45-78% de citronelol, sendo

observadas variações desses teores de acordo com a variedade em cultivo. São bastante

utilizados na aromaterapia e nas indústrias de perfumarias e cosméticos (GUPTA et al., 2001;

MAY et al., 2006; RANA et al., 2002). O linalol é encontrado com aproximadamente 11,0%

no óleo essencial de P. graveolens (NICULAU, 2011).

25

Figura 11. Foto de gerânio (Pelargonium graveolens L’Herit). UFS – São Cristóvão/SE.

Autor: Edenilson S. Niculau (2011).

2.6.3.2 Aspectos químicos e farmacológicos P. graveolens

Rajeswara Rao e colaboradores (2000) avaliaram os genótipos de gerânio

(Pelargonium graveolens) denominados de (I) Algeriano, (II) Bourbo e (III) Kelkar ou

Egípcio e encontraram variações consideráveis na composição química de seus óleos

essenciais. Os compostos principais encontrados no genótipo I foram citronelol (43,8%),

formiato de citronelila (20,4%), isomentona (6,8%) e (E)-cariofileno (2,6%); no genótipo II

encontraram 10-epi- -eudesmol (4,6%), formiato de geranila (3,6%), tiglato de geranila

(2,9%), α-muroleno (1,3%), terpinen-4-ol (1,3%) e β-bourboneno (1,2%); no genótipo III

foram caracterizados o geraniol (38,6%), linalol (7,6%), acetato de geranila + ácido gerânico

(5,2%), β-feniletilbutirato (4,6%), 6,9-guaiadieno (2,3%) e α-humuleno (1,5%).

Em estudo recente Niculau (2011) comparou os métodos de hidrodestilação e de

headspace dinâmico para a extração dos compostos voláteis das folhas de gerânio (P.

graveolens) cultivadas na Fazenda Experimental Campus Rural da UFS e encontrou variação

26

na composição química e no teor dos constituintes. A hidrodestilação foi o método mais

eficiente na extração de linalol (11,19%) e formiato de citronelila (9,24%). Na extração por

headspace dinâmico utilizando Porapak Q como adsorvente os compostos que tiveram maior

percentual foram geraniol (38,26%), citronelol (28,06%), e tiglato de geranila (8,21%),

enquanto que o headspace dinâmico utilizando turfa in natura como adsorvente apresentou

isomentona (3,59%), 6,9-guaiadieno (16,89%) e -muuroleno (6,64%).

Gomes e colaboradores (2007) realizaram a extração do óleo das folhas de gerânio

empregando o método de extração por fluido supercrítico e os compostos encontrados em

maiores teores foram citronelol (24,8%), formato de citronelila (10,2%), 6,9-guaiadieno

(8,8%), geraniol (8,5%), formato de geralila (7,90%) e isomentona (3,5%). O linalol foi

encontrado com apenas 0,1%. Nesse estudo também foi realizada a extração do óleo essencial

por hidrodestilação e o teor de linalol encontrado nesse método foi de 4,4%. Os demais

compostos sofreram pouca variação no teor.

Gauvin e colaboradores (2004) investigaram duas cultivares de gerânio (Pelargonium cv.

Rosé e Pelargonium sp.) e encontraram diferenças na composição química e no aroma dos

óleos essenciais. Os compostos citronelol (21.9%), geraniol (18.3%), linalol (16.0%), formato

de citronelila (11.6%) e isomentona (7.6%) foram os compostos majoritários da cultivar

Pelagonium. cv. Rosé. O odor do óleo essencial de Pelagonium. cv. Rosé foi caracterizado

como nota dominante róseo, mas também foi identificada uma nota cítrica com um sutil odor

remanescente de limão e menta. A cultivar Pelargonium sp. apresentou uma composição

totalmente diferente de Pelagonium. cv. Rosé. Os compostos principais do óleo essencial de

Pelargonium sp. foram p-cimeno (35,8%), -felandreno (13,0%), -felandreno (5,2%), -

terpineno (3,9%) e limoneno (3,2%). O odor predominante foi caracterizado como nota cítrica

acompanhado por um forte efeito picante, quase pungente, conferindo ao óleo um caráter

bastante incomum, mas ainda assim atraente.

Badu e colaboradores (2005) encontraram nas folhas de gerânio do genótipo Kelkar

(Pelargonium sp.) um teor elevado de citronelol (40,19%) e linalol (15,89%) e baixo teor de

geraniol (11,55%) ao empregar a destilação a vapor, em uma planta piloto, para a extração do

óleo essencial. Nesse estudo também foi realizada a análise do índice de refração ( ) e da

rotação óptica ([ ]D) do óleo essencial. O valores encontrados de e [α]D foram 1,4785 e –

9º4’, respectivamente. A rotação com sinal negativo indica, provavelmente, que os

27

monoterpenos citronelol e linalol estejam em excesso enantiomérico de sua forma

levorrotatória (l) no óleo essencial da espécie estudada. Rajeswara Rao (2002) utilizou o

método convencional de extração (hidrodestilação) para extrair o óleo essencial das folhas do

mesmo genótipo de gerânio (Kelkar) e encontrou um aumento no teor de geraniol (28,0%) e

diminuição no teor do citronelol (24,4%) e linalol (13,3%).

Elmann e colaboradores (2010) comprovaram os efeitos anti-neuroinflamatórios no

óleo essencial de gerânio (P. graveolens) em células da microglia. O óleo foi constituído

principalmente por citronelol, formato de citronelila, linalol, geraniol, isomentona e mentona.

Nesse estudo o óleo foi capaz de inibir a produção de NO e a ação de enzimas pró-

inflamatórias. Em estudo recente Cavar e colaborador (2012) comprovaram a atividade

antioxidante do óleo essencial e do extrato aquoso de P. graveolens e sugeriram que essas

amostras poderão ser utilizadas como suplemento alimentar.

2.6.4 Aniba rosaeodora Ducke (pau-rosa)

2.6.4.1 Aspecto botânico de A. rosaeodora

O gênero Aniba pertence à família Lauraceae, a qual inclui cerca de 50 gêneros e 2500

espécies, sendo que no Brasil ocorrem 22 gêneros e cerca de 400 espécies. A espécie A.

rosaeodora é uma árvore de grande porte, podendo atingir 30 m de altura e 2 m de diâmetro.

O tronco é retilíneo e ramificado no ápice, formando uma copa pequena e as cascas são

pardo–amareladas ou pardo-avermelhadas com 6 a 25 cm de comprimento e 2,5 a 10 cm de

largura (LORENZI & SOUZA, 2008; MARQUES, 2001; OHASHI & ROSA, 2004).

A árvore de A. rosaeodora (Figura 12) é popularmente conhecida como pau-rosa, pau-

rosa-mulatinho, pau-rosa-itaúba e pau-rosa-imbaúba. Essa espécie ocorre no Brasil (desde o

Amapá e estende-se pelos estados do Pará e do Amazonas), Guiana Francesa, Suriname,

Guiana, Venezuela, Peru, Colômbia e Equador (OHASHI & ROSA, 2004).

O óleo essencial de pau-rosa apresenta um valor comercial agregado devido ao

elevado teor de linalol (74-96%). As indústrias de cosméticos e perfumaria fina da Europa e

dos Estados Unidos da América têm uma forte apreciação pelo óleo essencial de pau-rosa. O

Brasil é o único produtor de pau-rosa, cuja exploração da madeira da árvore para a extração

de óleos essenciais começou em 1929, mas vem sendo progressivamente reduzida com a

28

escassez da árvore (BIZZO et al., 2009; GOTTLIEB & KUBITZKI, 1981; MAIA, et al.,

2007).

Figura 12. Foto de pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke). Reserva Florestal

Ducke – Manaus/AM. Fonte: CHAAR (2000).

2.6.4.2 Aspectos químicos e farmacológicos A. rosaeodora

Lupe (2007) realizou estudo da composição química do óleo essencial e da

estereoquímica do linalol nos óleos essenciais extraídos das folhas e madeira de pau-rosa

(Aniba rosaeodora Ducke). Os constituintes principais das folhas foram linalol (77,5%), cis-

óxido de linalila (7,7%), trans-óxido de linalila (5,6%) e 3,7-dimetil-1,5-octadien-3,7-diol

(5,5%), No óleo essencial da madeira o linalol foi encontrado com 86,5%, cis-óxido de

linalila com 4,9%, trans-óxido de linalila com 4,6% e o -terpineol com 4,4%. A avaliação da

29

estereoquímica revelou que tanto no óleo essencial das folhas quanto da madeira existiu uma

mistura das formas enantioméricas do linalol (( )-linalol), mas em diferente distribuição. Nas

folhas a pureza enantiomérica foi de 20% para o enantiômero (R)-(-)-linalol e 80% para (S)-

(+)-linalol; e na madeira foi 40% de (R)-(-)-linalol e 60% para (S)-(+)-linalol.

Alcântara e colaboradores (2010) determinaram a composição química do óleo

essencial extraído dos caules da árvore do pau-rosa (A. rosaeodora). Os constituintes foram

identificados por CG-EM e quantificados por CG-DIC pelo método da normalização de área

do pico. Os compostos principais foram o monoterpeno linalol com 86,0%, seguido de óxido

de cariofileno (2,8%), cis-óxido de linalol (1,3%), trans-óxido de linalol (1,4%), -cadinol

(1,2%), -cariofileno (1,0%), -copaeno (0,90%) e -copaeno (0,9%).

Maia e colaboradores (2007) constataram que o baixo teor de linalol nas folhas da

árvore do pau-rosa plantada no Campus de Pesquisa Científica do Museu Emílio Goeldi em

Belém/PA ocorreu nos meses de março (68,0%) e abril (74,48%) e que nas demais estações

do ano o teor de linalol foi superior a 80%, atingindo 96,1% em dezembro. Nesse estudo

também foi avaliada a composição dos óleos essenciais obtidos das folhas de árvores Aniba

rosaeodora morfologicamente diferentes. As árvores foram denominadas de pau-rosa

preciosa, pau-rosa tachi, pau-rosa itaúba e pau-rosa imbaúba. Os resultados revelaram uma

considerável variação no rendimento do óleo essencial e na composição e no teor dos

constituintes das árvores.

Em estudo recente Cunha (2011) avaliou o efeito sazonal sobre o rendimento do óleo

essencial obtido das folhas da árvore de pau-rosa (Aniba duckei Kostermans) cultivada na

reserva florestal Adolfo Ducke no Estado de Manaus. Os resultados mostraram que o mês de

abril é o período que apresentou melhor rendimento do óleo (1,84%). O teor de linalol nesse

período apresentou valor médio de 62,4%, sendo que no mês de setembro o linalol foi

encontrado com teor médio 76,69%. De acordo esse autor a quantidade relativa de linalol nas

folhas é maior antes do que depois do período de floração da árvore, que ocorre nos meses de

novembro a maio.

Chaar (2000) otimizou o tempo da hidrodestilação do óleo essencial das folhas e

galhos de pau-rosa e encontrou o melhor resultado em 3,5 h de extração. Nas folhas o

rendimento do óleo essencial foi de 1,5% e teor de linalol de 72,3% e para os galhos o

30

rendimento do óleo foi 1,3% com teor 78,1% de linalol. A quantificação do linalol foi

realizada pelo método de padrão externo.

Silva e colaboradores (2003) utilizaram uma coluna cromatográfica de fase contendo o

polímero poliuretano (POLYH4-MD), sintetizado de um poliol derivado do óleo de mamona

e de um pré-polímero (4,4 difenilmetanodiisocianato), para a quantificação do linalol no óleo

essencial das folhas e galhos de pau-rosa. A quantificação do linalol foi realizada pelo método

do padrão externo e a curva analítica utilizada para a quantificação apresentou coeficiente de

correlação de 0,9990. O resultado encontrado para o linalol no óleo essencial das folhas foi

54,5% e nos galhos 55,2%. A coluna utilizada nesse trabalho apresentou um bom desempenho

e com isso, mostrou-se promissora no uso alternativo para os estudos qualitativos e

quantitativos de óleos essenciais.

A atividade larvicida do óleo essencial da espécie vegetal Aniba duckei e dos padrões

de linalol foram testadas contra o mosquito Aedes aegypti. O óleo extraído das folhas de pau-

rosa apresentou rendimento de 1,93% (m/m). O linalol quantificado pelo método de padrão

externo apresentou 89,34%. O valor da concentração letal (CL50) para o óleo essencial das

folhas de pau-rosa foi de 250,61 (± 2,20) μg mL-1

e dos padrões (±)-linalol e (R)-(-)-linalol

foram 279,89 (± 2,20) μg mL-1

e 346,73 (± 2,14) μg mL-1

, respectivamente. A atividade do

óleo de pau-rosa mostrou um melhor desempenho do que o seu componente majoritário, (±)-

linalol, esse fato foi atribuído à presença dos componentes minoritários, tais como: -

terpineol (3,06%), cis-óxido de linalol (1,94%), trans-óxido de linalol (1,86%), 1,8-cineol

(1,07%), -copaeno (0,89%), -patchuleno (0,77%), -cariofileno (0,55%) e limoneno

(0,52%), como também do sinergismo entre estes constituintes. Sendo assim, o óleo essencial

da espécie vegetal Aniba duckei Kostermans poderá ser usado como larvicida em possíveis

locais de crescimento de larvas do mosquito Aedes aegypti (TELES, 2009).

2.6.5 Cinnamomum camphora Nees e Eberm var. linaloolifera Fujita (Ho-Sho)

2.6.5.1 Aspecto botânico de C. camphora

O gênero Cinnamomum pertence à família Lauraceae. A espécie C. camphora é uma

árvore nativa da China, Formosa e Japão e popularmente conhecida como Ho-Sho e Hon-Sho.

Essa árvore (Figura 13) pode atingir de 10 a 12 m de altura. No Brasil, foi introduzido nas

31

regiões sul e sudeste há mais de um século para uso medicinal e na arborização da cidade

(FRIZZO et al., 2000; LORENZI & SOUZA, 2003).

Figura 13. Foto de Ho-sho (Cinnamomum camphora Nees e Eberm var. Linaloolifera

Fujita). Estação Experimental do Instituto de Biotecnologia da Universidade de Caixas

do Sul (IB-UCS). Fonte: FILLIPIS, F. M. (2001).

As duas variedades de C. camphora (Ho-sho e Hon-sho) são morfologicamente

similares, mas apresentam diferente composição dos óleos essenciais e tem sido bastante

explorada comercialmente. Hon: verdadeiro, Ho: fragrante e Sho: árvore. O Hon-sho (C.

camphora Nees & Eberm.) também é chamada de canforeira por conter a cânfora como

componente principal e o Ho-sho (C. camphora Nees e Eberm var. linaloolifera fujita) tem o

linalol com elevado teor. O óleo essencial extraído das folhas de Ho-sho apresenta entre 80 e

90% de linalol. A cânfora foi encontrada com teor 68% no óleo essencial das folhas de Hon-

sho, sendo utilizado na produção comercial de cânfora (FILLIPIS, 2001; FRIZZO et al.,

2000; LORENZI & SOUZA, 2003; STEFFANI et al., 2006).

32

2.6.5.2 Aspectos químicos e farmacológicos C. camphora

Frizzo e colaboradores (2000) avaliaram os óleos essenciais de duas variedades da

árvore canforeira o Ho-Sho (Cinnamomum camphora Nees & Eberm var. linaloolifera Fujita)

e Hon-Sho (Cinnamomum camphora Nees & Eberm) cultivadas em canteiros experimentais

do Instituto de Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul (IB/UCS). Os óleos essenciais

obtidos das folhas e ramos de plantas jovens apresentaram rendimento de 0,84% (m/m) para o

Ho-Sho e 0,72% (m/m) para Hon-Sho. A composição do óleo foi determinada por CG-EM e

os constituintes principais do Ho-Sho foram linalol (95,29%), (E)-β-ocimeno (0,48%), β-

cariofileno (0,46%), cânfora (0,40%) e α-terpineol (0,37%) e do Hon-Sho foram cânfora

(68,03%), linalol (8,92%), limoneno (3,59%), α-pineno (3,15%) e β-mirceno (1,90%).

Em estudo recente, Cansian e colaboradores (2010) avaliaram a atividade antioxidante

e antimicrobiana do óleo essencial obtido das folhas de Ho-Sho plantada na área experimental

do IB/UCS. A análise da composição química do óleo essencial por CG-EM indicou que o

linalol foi o composto majoritário com 91,98% e os compostos minoritários foram óxido de

cariofileno (2,11%), trans-óxido de linalol (1,51%), β-cariofileno (1,43%), cis-óxido de

linalol (1,36%), cânfora (1,11%). O óleo essencial não apresentou atividade antioxidante, mas

se mostrou um eficaz agente antimicrobiano e futuramente pode ser usado no tratamento de

doenças infecciosas causadas por microrganismos, principalmente Staphylococcus aureus e

Staphylococcus epidermidis, associados a infecções de pele.

Ho e colaboradores (2009) testaram a atividade antioxidante e antifúngica dos óleos

essenciais obtidos das folhas, flores e galhos da árvore de Ho-Sho, cultivadas no Instituto de

Pesquisa Florestal de Taiwan/China. O linalol foi encontrado nas folhas, flores e galhos com

teores médios de 87%, 72% e 40%, respectivamente. A baixa concentração do linalol no óleo

essencial dos galhos foi devido à presença da cânfora (33,5%) e do eugenol (3,6%). Os três

óleos testados apresentaram uma ótima inibição dos fungos utilizados nesse estudo, entre eles

se destacam o Phaeolus schweintzii e Laetiporus sulphureus. A atividade antioxidante

também não foi comprovada nesse estudo.

Parou e colaboradores (2010) sintetizaram o acetato de linalila por meio da reação de

esterificação enzimática do linalol presente no óleo essencial das folhas de Ho-Sho (C.

camphora). O teor de linalol no óleo essencial foi 95,29%. A cinética da reação revelou que o

33

linalol no óleo essencial de Ho-Sho ofereceu melhor conversão quando comparado com o

linalol comercial.

O monoterpeno linalol está presente em uma única forma enantiomérica [(R)-(-)-

linalol] no óleo essencial da espécie Cinnamomum camphora Nees & Eberm Var.

linaloolifera Fujita (OHASHI et al., 1997 apud SIANI et al., 2002; YOSHIDA, 1969 e LU et

al., 1985 apud HO et al., 2009). Em outras espécies do gênero Cinnamomum esse álcool

apresenta diferente distribuição enantiomérica, como exemplo na espécie Cinnamomum

tamala Nees et Eberm o linalol apresenta somente o enantiômero (S)-(+)-linalol

(CHANOTIYA & YADAY, 2010) e em Cinnamomum tamala (Buch.-Ham.) T.Nees &

C.H.Eberm. esse composto é encontrado em uma mistura de seus enantiômeros, com pureza

enantiomérica de 9,0% para (S)-(+)-linalol e 91,0% de (R)-(-)-linalol (ÖZEK et al., 2010).

2.6.6 Coriandrum sativum L. (coentro)

2.6.6.1 Aspecto botânico de C. sativum

O gênero Coriandrum pertence à família Apiaceae ou Umbelliferae, a qual

compreende aproximadamente 400 gêneros e 4000 espécies. No Brasil, ocorrem 8 gêneros e

cerca de 100 espécies. Essas espécies são muito cultivadas no Brasil para uso condimentar e

alimentício. A espécie Coriandrum sativum é popularmente conhecida no Brasil como

coentro (Figura 14) e nos Estados Unidas e nos países de língua espanhola essa erva é

denominada de cilantro. Outro nome para esta espécie é coriandro (POTTER, 1996; SOUZA

& LORENZI, 2008).

Figura 14. Fotos de coentro (Coriandrum sativum L.) - folhas (A) e sementes (B).

UFS – São Cristóvão/SE. Autor: Givanildo B. da Silva (2010).

B A

34

As folhas verdes e imaturas de C. sativum são bastante usadas como ervas frescas na

culinária da China, Sudeste da Ásia, Índia e nas Américas. Os principais compostos presentes

no óleo essencial das folhas foram (E)-2-tridecanal (15,6%), (E)-2-tetradecenal (12,7%); (E)-

2-decenal (12,1%) e decanal (9,2%) (POTTER, 1996).

Os frutos de C. sativum possuem odor aromático, agradável e sabor condimentado. O

óleo essencial obtido das sementes de coentro é utilizado como flavorizantes em alimentos,

perfumes e cosméticos. O composto principal do óleo essencial é o álcool linalol, em que

pode ser encontrado com teor superior a 60%. (ANVISA, 2003; POTTER, 1996,

SMALLFIELD et al., 2001; ZOUBIRI & BAALIOUAMER, 2010).

2.6.6.2 Aspectos químicos e farmacológicos de C. sativum

O óleo essencial obtido das sementes de coentro (Coriandrum sativum L.) possui o

linalol como constituinte majoritário (MSAADA et al., 2007; PANDE et al., 2010;

ZHELJAZKOV et al., 2008). Em contrapartida, no óleo essencial das folhas de coentro esse

álcool não é encontrado ou apresenta-se em quantidade ínfima. Os compostos principais do

óleo essencial das folhas de C. sativum geralmente são derivados de aldeídos com dez e dose

carbonos (FAN & SOKORAL, 2002; POTTER, 1996; SMALLFIELD et al., 1994).

Estudo realizado por Özek e colaboradores (2010) encontrou o linalol no óleo

essencial das sementes C. sativum com teor de 73,7%. A análise da pureza enantiomérica

desse composto revelou a presença das duas formas enantiomérica, sendo 83,9% de (S)-(+)-

linalol e 16,1% para o (R)-(+)-linalol.

A quantificação de linalol e de outros compostos do óleo essencial das sementes

frescas de coentro realizadas por CG-DIC pelo método da normalização de área do pico (%)

apresentou como constituintes majoritários linalol (73,11%), seguido de p-menta-1,4-dien-7-

ol (6,51%), -pineno (3,41%) e acetato de nerila (3,22%) (ZOUBIRI & BAALIOUAMER,

2010).

O óleo essencial obtido das folhas de coentro apresentou baixo teor de linalol (0,32%),

sendo que os constituintes principais foram (E)-2-decenal (15,90%), decanal (14,30%), (E)-2-

decen-1-ol (14,20%), n-decanol (13,60%) (MATASYOH et al., 2009). Em estudo realizado

por Fan e colaborador (2002) também foi encontrado o linalol com apenas 2,13%. Os

35

compostos majoritários do óleo essencial foram decanal (51,51%), (E)-2-decenal (31,61%) e

(E)-2-dodecenal (4,94%).

Potter (1996) não identificou o linalol nos óleos essenciais obtidos das folhas frescas

de coentro (C. sativum) coletas em cinco estágios de crescimento. Os compostos principais

foram (E)-2-tridecanal (15,6%), (E)-2-tetradecenal (12,7%); (E)-2-decenal (12,1%), decanal

(9,25%), 2-decen-1-ol (8,18%) e dodecanal (4,96%).

As atividades antimicrobianas foram relatadas para os óleos essenciais de C. sativum

(BAKKALI et al., 2008; MATASYOH et al., 2009; PANDE et al., 2010; ZOUBIRI &

BAALIOUAMER, 2010). O óleo essencial também é um agente inseticida (PALACIOS et

al., 2009). E estudo recente comprovou a atividade antioxidante (NEFFATI et al., 2011).

36

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Isolar, caracterizar, quantificar e avaliar a pureza enantiomérica dos compostos

monoterpênicos linalol, carvona e limoneno em óleos essenciais das espécies aromáticas L.

alba, O. basilicum, P. graveolens, A. rosaeodora, C. camphora e C. sativum.

3.2 Objetivos específicos

Determinar a composição química dos óleos essenciais das espécies L. alba, O. basilicum,

C. camphora, C. sativum, A. rosaeodora e P. graveolens;

Avaliar a pureza enantiomérica do linalol, carvona e limoneno no óleo essencial das

espécies em estudo por CG-DIC, utilizando uma coluna com fase estacionária

enantiosseletiva contendo β-CD;

Isolar por CCDP o enantiômero (S)-(+)-linalol, presente no óleo essencial de L. alba do

quimiotipo linalol;

Caracterizar o linalol isolado por RMN de 1H,

13C; CG-EM; CG-DIC e determinar a

atividade óptica ([α]D) e o índice de refração ( );

Quantificar linalol, carvona e limoneno nos óleos essenciais das espécies em estudo por

CG-DIC, utilizando o método do padrão interno.

37

4 PARTE EXPERIMENTAL

4.1 Padrões, solventes e reagentes

(±)-linalol (Sigma-Aldrich, 97%)

(R)-(-)-linalol (Sigma-Aldrich, 95%)

1,8-cineol (Sigma-Aldrich, pureza, 97%)

(R)-(-)-carvona (Sigma-Aldrich, 97%)

(R)-(+)-limoneno (Sigma-Aldrich, 95%)

(S)-(-)- -citronelal (Sigma-Aldrich, 99%)

-terpineno (Sigma-Aldrich, 97%)

Acetato de etila (Tedia Company, 99%)

Hexano (Tedia Company, 99%)

Diclorometano (Tedia Company, 99%)

Reagente de anisaldeído sulfúrico (0,5 mL de anisaldeído, 10,0 mL de ácido acético

glacial, 85,0 mL de metanol e 5,0 mL de ácido sulfúrico).

4.2 Materiais de laboratório e equipamentos

Placas de vidro transparente e liso (diâmetro 20 x 20 cm com 0,3 mm de espessura)

Cuba de vidro (26 cm x 26 cm x 10 cm);

Béquer de vidro (200,0 mL)

Proveta de vidro (100,0 mL)

Balão volumétrico (1,0 e 10,0 mL)

Frasco erlenmeyer de vidro (250,0 mL)

Frascos de vidro âmbar (5,0 mL; 25,0 mL)

Tubos capilares

Papel filtro

Papel alumínio

Pinça metálica

Micropipeta (10,0 a 100,0 L; 100,0 a 1000,0 L)

Micro-seringa (10,0 L)

Adsorvente sílica gel 60 para CCD preparativa com UV 254 (Macherey-Nagel;

Alemanha)

38

Cromatofolha para CCD analítica com 0,20 mm de sílica gel 60 em alumínio (Macherey-

Nagel; Alemanha)

Secador com aquecimento

Evaporador rotatório

Sistema de hidrodestilação (Clévenger)

Estufa de secagem com circulação de ar da marca Marconi (MA-037/18)

Sistema para filtração a vácuo

Balança analítica (Denver Instrument, modelo APX200, com precisão de 10-4

g unidades)

Cromatógrafo a gás com detector de ionização em chama (CG-DIC) modelo 17A

(Shimadzu, Quioto, Japão)

Cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro de massas (CG-EM) modelo QP 5050A

(Shimadzu, Quioto, Japão) equipado com autoinjetor modelo AOC-20i

Refratômetro digital modelo RFM 340 (Bellingt Stanley)

Polarímetro automático (Rudolph Research Autopol III)

Espectrômetro de RMN (Brucker ARX-200, Avance 400)

4.3 Amostras vegetais: origem, coleta e identificação botânica

As plantas erva-cidreira (L. alba), manjericão (O. basilicum) e gerânio (P. graveolens)

foram cultivadas na Fazenda Experimental do Campus Rural da Universidade Federal de

Sergipe (UFS), localizada no município de São Cristóvão/SE (latitude 11º 00’ S e longitude

37º 12’ W); sementes de coentro (C. sativum) foram adquiridas no Mercado Municipal de

Aracaju/SE; óleo essencial de Ho-Sho (C. camphora) foi gentilmente fornecido pela Profa.

Dra. Helen Treichel da Universidade Regional Integrada (URI) do Campus de Erechim/RS;

óleo essencial de pau-rosa (A. rosaeodora) foi gentilmente cedido pelo Prof. Dr. José

Guilherme S. Maia da Universidade Federal do Pará (UFPA).

As partes aéreas das espécies cultivadas no Campus Rural da UFS foram coletadas em

meados de abril de 2010 no período da manhã. As espécies foram identificadas pela botânica

Profa. Dra. Ana Paula do Nascimento Prata, do Departamento de Biologia da UFS. Exsicata

de cada espécie foi depositada no Herbário da Universidade Federal de Sergipe (ASE); a

espécie C. camphora possui uma exsicata depositada no Herbário do Museu de História

Natural da Universidade de Caxias do Sul (HUCS); a espécie A. Rosaeodora apresenta uma

exsicata depositada no Herbário João Murça Pires (MG) localizado no Museu Paraense

Emílio Goeldi na cidade de Belém/PA; a espécie C. sativum, adquirida em mercado

39

municipal, não apresentou informação de herbário e nem número de registro de exsicata. Na

Tabela 5 estão apresentados os registros das espécies identificadas e catalogadas.

Tabela 5. Identificação botânica das amostras vegetais

estudadas.

Espécie Acesso Nº de registro

no herbário

L. alba LA-22* ASE 13.476

L. alba LA-57**

ASE 13.469

O. basilicum A-2718 ASE 13.162

P. graveolens PEL-001 ASE 14.844

C. camphora NL HUCS 12.891

A. rosaeodora NL MG 17.710

C. sativum NL NL

NL = não localizado. * = L. alba do quimiotipo linalol-1,8-cineol.

**

= L. alba do quimiotipo carvona-limoneno.

4.4 Extração dos óleos essenciais

As folhas das espécies cultivadas no Campus Rural da UFS foram colocadas para secagem

em estufa com circulação de ar a 39ºC 1ºC durante cinco dias (ALVES et al., 2010;

CARVALHO-FILHO et al., 2006) e as sementes de coentro (C. sativum), adquiridas secas,

foram trituradas. Para a extração de cada óleo essencial foi medida a massa seca do material

vegetal (Tabela 6) e transferida para um balão de 3000 mL de capacidade com

aproximadamente 1500 mL de água destilada. Em seguida, foi submetida à hidrodestilação

em aparelho tipo Clevenger (Figura 15) por 2 horas. O óleo essencial obtido foi separado da

solução aquosa (hidrolato) por decantação, seco com Na2SO4 anidro, filtrado e armazenado

em frascos de vidro âmbar e estocados em freezer até a análise por CG-EM, CG-DIC e CCD.

Estes procedimentos foram executados em triplicata no Laboratório de Fitotecnia do

Departamento de Agronomia da UFS. O rendimento das extrações (Tabela 6) foi calculado

com base na relação entre volume do óleo essencial e peso da massa seca do material vegetal,

e expresso em porcentagem (% v/p).

40

O óleo essencial do Ho-Sho (C. camphora) foi obtido por hidrodestilação a partir das

folhas da planta cultivada na área experimental do Instituto de Biotecnologia da Universidade

de Caxias do Sul/RS (IB/UCS), das quais foram cedidas aproximadamente 25,0 g para o

presente estudo. O óleo essencial do pau-rosa (A. rosaeodora) foi extraído por hidrodestilação

a partir de pequenos galhos da copa da árvore plantada no Parque Zoobotânico do Museu

Paraense Emílio Goeldi em Belém/PA, das quais foram cedidas cerca de 5,0 g para o presente

estudo.

Tabela 6. Massa do material vegetal utilizada na extração e rendimento do óleo essencial.

Espécie Parte vegetal Massa seca

(g) Rendimento

(% v/p)

L. alba (LA22) Folhas 75,0 1,40

L. alba (LA57) Folhas 75,0 2,62

O. basilicum Folhas 75,0 1,36

P. graveolens Folhas 200,0 0,96

C. sativum Sementes 100,0 2,01

C. camphora# Folhas - -

A. rosaeodora# Galhos - -

# = óleos essenciais não extraídos neste estudo.

Figura 15. Sistema de hidrodestilação em série com aparelho do tipo Clevenger.

UFS – São Cristóvão/SE. Autor: Givanildo B. da Silva (2010).

41

4.5 Condições de análise cromatográfica e identificação dos constituintes químicos dos

óleos essenciais

4.5.1 Condições cromatográficas por CG-EM

As condições cromatográficas do CG-EM com autoinjetor (Figura 16) foram as

seguintes: foi utilizada uma coluna capilar de sílica fundida da J&W Scientific, DB-5MS (5%

fenil-95% metilpolisiloxano) com 30 m x 0,25 mm d.i. com 0,25 m de espessura de filme; o

gás de arraste foi o hélio (99,999%) com vazão de 1,2 mL min-1

; a temperatura do forno foi

programada mantendo-se a 50 °C por 1,5 min, seguido de um aumento a 4 °C min-1

até atingir

200 °C, depois a 10,0 °C min-1

até 250 °C e foi finalizada com uma isoterma de 5,0 min a 250

ºC; a temperatura do injetor foi de 250 °C e do detector foi de 280 °C; o volume inserido pelo

autoinjetor foi de 0,5 µL; a razão do split foi de 1:20; os espectros de massas foram obtidos

por ionização elétrons com energia de 70 eV, velocidade de varredura de 0,50 scan s-1

na

faixa de m/z 40 a 500 Da.

Os constituintes químicos dos óleos essenciais foram identificados por meio da

comparação de seus espectros de massas com espectros existentes na literatura (ADAMS,

2007) e no banco de dados (NIST05, NIST21, NIST107 e WILEY8) do instrumento. Os

índices de retenção relativos (IRR) dos constituintes foram determinados utilizando uma série

homóloga de n-alcanos (C9-C19) injetados nas mesmas condições cromatográficas das

amostras, utilizando a equação de Van den Dool e Kratz (1963) e comparados com índices de

retenção da literatura (ADAMS, 2007).

Figura 16. Cromatógrafo a gás acoplado ao espectrômetro de massas.

DQI/UFS – São Cristóvão/SE. Autor: Givanildo B. da Silva (2010).

42

4.5.2 Preparo da solução de óleo essencial para análise por CG-EM

Em frascos de vidro âmbar foram pesados, separadamente, 10,0 mg do óleo essencial

das espécies L. alba (LA22 e LA57), O. basilicum, P. graveolens, A. rosaeodora, C.

camphora e C. sativum. A amostra foi diluída em 1,0 mL de acetato de etila (AcOEt),

homogeneizada e uma alíquota de 0,5 L foi analisada por CG-EM. O ensaio para cada

espécie foi realizado em triplicata.

4.6 Condições de análise cromatográfica e avaliação da estereoquímica de linalol,

carvona e limoneno nos óleos essenciais

4.6.1 Condições cromatográficas por CG-DIC

As condições cromatográficas do CG-DIC (Figura 17) foram as seguintes: coluna

capilar enantiosseletiva de -CD da Agilent (30 m x 0,25 mm d.i, 0,25 m de espessura de

filme). O gás hélio (99,999% de pureza) foi usado como gás de arraste com vazão de 1,09 mL

min-1

e velocidade linear de 27,3 cm s-1

. Foi empregado gás hidrogênio de alta pureza como

combustível da chama do detector DIC, com pressão de 55 KPa, e ar sintético como agente

oxidante, com pressão de 30 KPa. Como gás auxiliar foi empregado nitrogênio de alta pureza

na pressão de 30 KPa. A vazão total dos gases foi igual a 96 mL min-1

e pressão de 96 KPa. A

temperatura do forno foi programada da seguinte forma: 50°C por 1,0 min, seguido de 10 °C

min-1

até 80°C, então a 1,0°C min-1

até 110°C, em seguida a 14,0°C min-1

até 180°C e foi

finalizada com uma isoterma de 4,0 min a 180 ºC. A temperatura do injetor foi fixada em

200ºC e a do detector em 280°C.

Figura 17. Cromatógrafo a gás com detector de ionização em chama.

DQI/UFS – São Cristóvão/SE. Autor: Givanildo B. da Silva (2010).

43

4.6.2 Determinação da ordem de eluição dos enantiômeros de linalol

Para a definição da sequencia em que os enantiômeros do linalol eluem por meio da

coluna com fase -ciclodextrina foram preparadas em balões volumétricos soluções do padrão

de (±)-linalol (10,0 mg mL-1

em AcOEt) e do padrão de (R)-(-)-linalol (5,0 mg mL-1

em

AcOEt). Em paralelo, foram preparadas soluções da mistura de 100 L da solução de (±)-

linalol com a solução de (R)-(-)-linalol, preparadas anteriormente. Primeiramente, foi

realizada a análise da solução do padrão (±)-linalol no CG-DIC, injetando uma alíquota de 0,4

L da solução com auxílio de uma microseringa. Após a análise do linalol racêmico, foi

analisada a solução do padrão (R)-(-)-linalol. Em seguida, foi analisada a solução obtida da

mistura dos padrões, injetando 0,4 L dessa mistura no CG-DIC. As análises cromatográficas

de cada solução foram realizadas em triplicata.

4.6.3 Determinação da pureza enantiomérica do linalol nos óleos essenciais

Para a avaliação da pureza enantiomérica do linalol foram preparadas e analisadas

soluções de óleos essenciais de L. alba, O. basilicum, C. camphora, A. rosaeodora, C.

sativum e P. graveolens. Também foram analisadas a co-injeção de óleo essencial com

padrões de linalol.

4.6.3.1 Análise individual dos óleos essenciais

Em frasco de vidro âmbar foram pesados, separadamente, 5,0 mg de óleos essenciais

das espécies L. alba (quimiotipo linalol-1,8-cineol), O. basilicum e C. camphora e 10,0 mg

dos óleos essenciais de A. rosaeodora, C. sativum e P. graveolens. Cada amostra foi diluída

em 1,0 mL de AcOEt e uma alíquota de 0,4 L foi analisado por CG-DIC. A análise de cada

solução de óleo essencial foi realizada em triplicata.

4.6.3.2 Análise da mistura de óleos essenciais com padrões de linalol

Em frasco de vidro âmbar foram misturados 100 L da solução do óleo essencial

(preparada no item 4.6.3.1) com 100 L da solução do padrão (R)-(-)-linalol (preparada no

item 4.6.2). Em seguida, cada mistura [óleo essencial e padrão (R)-(-)-linalol] foi analisada

por CG-DIC, injetando uma alíquota de 0,4 L da mistura. A análise de co-injeção do óleo

44

essencial também foi realizada com a solução do padrão (±)-linalol (preparada no item 4.6.2).

Os ensaios foram realizados em triplicata.

4.6.4 Determinação da ordem de eluição e da pureza enantiomérica da carvona e

limoneno e no óleo essencial de L. alba

Para determinar a ordem de eluição dos enantiômeros da carvona e do limoneno foram

preparadas e analisadas soluções de óleo essencial de L. alba (quimiotipo carvona-limoneno),

de padrão de (R)-(-)-carvona e de padrão (R)-(+)-limoneno. Também foi analisada a co-

injeção do óleo essencial com padrão de carvona e do óleo essencial com padrão de limoneno.

4.6.4.1 Preparo e análise individual do óleo essencial de L. alba, do padrão de carvona e

do padrão de limoneno

Foram preparadas soluções do padrão (R)-(-)-carvona (5,0 mg / 1,0 mL em AcOEt), do

padrão (R)-(+)-limoneno (5,0 mg / 1,0 mL em AcOEt) e do OE L. alba do quimiotipo

carvona-limoneno (5,0 mg / 1,0 mL em AcOEt). Cada solução foi analisada individualmente

no CG-DIC, injetando uma alíquota de 0,4 L com auxílio de uma micro-seringa.

4.6.4.2 Preparo e análise das misturas do óleo essencial de L. alba com padrão de

carvona e com padrão de limoneno

Foram misturados 100 L da solução de óleo essencial de L. alba com 100 L do

padrão de (R)-(-)-carvona (preparadas no item 4.6.4.1) e analisada por CG-DIC, injetando

uma alíquota de 0,4 L da mistura. Também foi analisada a mistura de 100 L da solução de

óleo essencial de L. alba com 100 L do padrão de (R)-(+)-limoneno (preparadas no item

4.6.4.1). Os ensaios foram realizados em triplicata.

4.7 Isolamento e caracterização do enantiômero de linalol do óleo essencial de L. alba

A análise preliminar em cromatografia em camada delgada (CCD) analítica utilizando

uma cromatofolha de sílica gel em alumínio foi realizada para a otimização da fase móvel e

para a determinação do fator de retenção (Rf) do linalol. Também foram utilizados os padrões

comerciais de linalol e de 1,8-cineol para a comparação e confirmação dos Rf destes

compostos no óleo essencial de L. alba. O isolamento foi realizado em CCDP com placas de

sílica gel pré-preparadas manualmente.

45

4.7.1 Preparação manual da placa com adsorvente de sílica gel

Em frasco erlenmeyer de 250,0 mL foram pesados 30,0 g de sílica gel e adicionado 85,0

mL de água destilada. Em seguida, foi vedada a boca do frasco com rolha de cortiça e

realizada agitação manual. A suspensão obtida foi transferida uniformemente para a superfície

de uma placa de vidro e colocada para secagem ao ar livre sobre uma superfície plana e

protegida contra umidade e poeira, durante 48 horas. A placa foi ativada em estufa à 110ºC

por 30 minutos, antes de sua utilização.

4.7.2 Isolamento e purificação do linalol por cromatografia em camada delgada (CCD)

Em frasco de vidro âmbar foram pesados aproximadamente 220,0 mg do óleo essencial de

L. alba e diluído em 200 L de diclorometano (DCM). Em seguida, foram aplicadas a 2,0 cm

da parte inferior da camada de adsorvente da placa. Logo após, a placa foi colocada em uma

cuba de vidro contendo 250 mL da fase móvel (hexano e AcOEt, 9:1). Após o

desenvolvimento, foi revelada em anisaldeído sulfúrico uma pequena área na parte vertical da

placa. Em seguida, a região (área não revelada em anisaldeído) onde estava presente o

composto linalol na camada de adsorvente foi delineada e transferida para um erlenmeyer. A

extração do composto da camada de sílica foi feita com a mistura dos solventes DCM e

AcOEt (9:1, v/v), filtrado à vácuo e concentrado em evaporador rotatório (Figura 18). Logo

após, o composto isolado foi recolhido em frasco âmbar, previamente pesado, e removido

parte do solvente em suave corrente N2. Em seguida, o frasco com o linalol isolado foi pesado

e armazenado em freezer para análises por CG-EM, CG-DIC, RMN de 1H e

13C, [α]D, e

organolépticas.

Figura 18. Sistema de filtração a vácuo (A) e evaporador rotatório (B). DQI/UFS –

São Cristóvão/SE. Autor: Givanildo B. da Silva (2010).

A B

46

4.7.3 Elucidação estrutural e análise organoléptica do linalol isolado de L. alba

4.7.3.1 Análises cromatográficas por CG-EM e CG-DIC

Foram realizadas análises qualitativas em CG-EM e estereoquímica em CG-DIC,

conforme as metodologias apresentadas nos itens 4.3 e 4.4.

4.7.3.2 Análise de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e

13C e Rotação Óptica

Para a realização das análises de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e

13C e

rotação óptica [ D], foram encaminhadas amostras do linalol isolado e do padrão comercial

((R)-(-)-linalol) para o Professor Andersson Barison, do Departamento de Química, da

Universidade Federal do Paraná (DQ/UFPR).

Os espectros de RMN de 1H e

13C do linalol isolado e do padrão comercial foram

obtidos a 400 MHz para hidrogênio e 100 MHz para DEPT 135 e 13

C. Para a obtenção dos

espectros uma massa de 15,0 mg de cada composto (linalol isolado e comercial) foi

solubilizada em clorofórmio deuterado (CDCl3). O composto tetrametilsilano (TMS) foi

utilizado como padrão de referência interno e os deslocamentos químicos ( ) dados em ppm.

Amostra de 15,0 mg do composto isolado e dos padrões de linalol (R-linalol e linalol

racêmico), medidos em frasco de vidro âmbar, foi encaminhada para análises no

Departamento de Química da UFPR. As medidas de rotação óptica ([α]25

D) foram realizadas

em polarímetro automático à temperatura ambiente. Foi utilizado clorofórmio (CHCl3) como

solvente.

4.7.3.3 Análise de índice de refração

A determinação do índice de refração ( ) foi realizada na Companhia de Bebidas das

Américas (AmBev), unidade localizada em Estância/SE. O aparelho utilizado foi um

refratômetro digital. Aproximadamente 20,0 mg do linalol isolado foram colocadas sobre o

prisma do aparelho e realizada a leitura à 20ºC. Os ensaios foram feitos em triplicata.

47

4.7.3.4 Ensaios organolépticos de aspecto, cor e odor

Foram realizadas as análises de aspecto, cor e odor do linalol isolado de L. alba. O

aspecto foi determinado por meio do método visual, sendo avaliada a transparência e a

limpidez da amostra. A coloração também foi realizada pelo método visual, em que alíquotas

do linalol isolado foram transferidas para um frasco de vidro transparente e visualizada em luz

branca. O odor foi determinado por meio de análise olfativa, em que alíquotas do composto

foram colocadas em papel de filtro.

4.8 Obtenção de curvas analíticas para quantificação de linalol, carvona e limoneno nos

óleos essenciais, utilizando o método de padrão interno.

4.8.1 Preparo e análise das soluções dos padrões de linalol, carvona e limoneno para a

obtenção das curvas analíticas

Foram transferidos 100,0 mg de cada padrão para balão volumétrico de 10,0 mL e

completado o volume com AcOEt, obtendo-se a solução estoque. Em seguida, foram

preparadas soluções de trabalho (Tabela 7), mediante a adição de alíquotas da solução estoque

para balões volumétricos de 1,0 mL de capacidade. O volume da solução do padrão de linalol

foi completado com solução de 5,0 mg mL-1

de (S)-(-)- -citronelal (padrão interno) em AcEOt

e as soluções de trabalho da carvona e do limoneno foram completadas com soluções de 4,5

mg mL-1

de -terpineno (padrão interno) em AcEOt. Após a homogeneização, foi injetado 0,4

L da solução de trabalho no CG-DIC, sob as condições cromatográficas apresentadas no

subitem 4.4.1. A análise de cada solução de trabalho foi feita em triplicata.

Tabela 7. Concentração das soluções de trabalho utilizadas para obtenção

das curvas analíticas.

Solução de trabalho (mg mL-1

)*

(R)-(-)-linalol (S)-(-)-linalol (R)-(-)-carvona (R)-(+)-limoneno

6,6 6,2 6,0 6,0

5,4 5,4 5,0 5,0

4,4 4,4 4,0 4,0

2,8 3,0 3,0 3,0

1,4 1,5 1,0 1,0

* = soluções preparadas a partir da solução estoque do padrão (10,0 mg mL-1

).

48

4.9 Preparo e análise das soluções de óleos essenciais para quantificação do linalol,

carvona e limoneno

Em balão volumétrico de 1,0 mL de capacidade foram pesados, separadamente, 8,0 mg de

óleos essenciais das espécies L. alba (quimiotipo linalol-1,8-cineol), A. rosaeodora, C.

camphora; 6,0 mg de óleos essenciais das espécies O. basilicum e C. sativum; 25,0 mg de OE

da espécie P. graveolens. O volume da solução do padrão de linalol foi completado com

solução de 5,0 mg mL-1

de (S)-(-)- -citronelal (padrão interno) em AcEOt e as soluções de

trabalho da carvona e do limoneno foram completadas com soluções de 4,5 mg mL-1

de -

terpineno (padrão interno) em AcEOt. Após a homogeneização, foi injetado 0,4 L da solução

de trabalho no CG-DIC, sob as condições cromatográficas apresentadas no subitem 4.6.1. A

análise de cada solução de trabalho foi feita em triplicata.

4.9.1 Análise quantitativa da carvona e do limoneno no OE de L. alba (quimiotipo

carvona-limoneno)

Em balão volumétrico de 1,0 mL de capacidade foram medidos 7,5 mg de OE da

espécie L. alba (quimiotipo carvona-limoneno). O volume de cada balão foi completado com

solução de AcOEt, contendo 4,5 mg mL-1

do padrão interno ( -terpineno). Após a

homogeneização, injetou-se 0,4 L da solução no sistema CG-DIC, sob as condições

cromatográficas do subitem 4.6.1. A análise da solução de OE foi feita em triplicata.

49

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Identificação dos componentes químicos das espécies L. alba, O. basilicum, P.

graveolens, A. rosaeodora, C. camphora e C. sativum

A identificação dos componentes químicos presentes nos óleos essenciais das espécies L.

alba, O. basilicum, P. graveolens, A. rosaeodora, C. camphora e C. sativum foi realizada por

meio da comparação entre os espectros de massas dos componentes e os espectros do banco

de dados do equipamento e da literatura (ADAMS, 2007). O índice de retenção relativo (IRR)

de cada composto também foi comparado com o índice de retenção da literatura (IRlit).

Com a avaliação supracitada, foi possível verificar que o linalol foi o componente

majoritário, em percentual por área, nas espécies estudadas, excetuando P. graveolens e L.

alba do quimiotipo carvona-limoneno. No óleo essencial da espécie L. alba (quimiotipo

linalol-1,8-cineol), o linalol e o 1,8-cineol apresentaram teores de 81,91% e 6,65%,

respectivamente; em L. alba (quimiotipo carvona-limoneno) o linalol foi encontrado em

apenas 0,64%, sendo carvona (61,41%) e limoneno (32,68%), componentes majoritários no

óleo essencial; os constituintes principais do óleo essencial de O. basilicum foram o linalol

com 76,64%, seguido de geraniol (11,82%) e 1,8 cineol (5,19%); o óleo essencial de P.

graveolens apresentou uma diversidade de compostos, sendo que os principais foram geraniol

(28,18%), citronelol (21,49%) e linalol (14,34%); A. rosaeodora foi a espécie com maior teor

de linalol (92,29%) no óleo essencial, acompanhado de cis-óxido de linalol (2,40%) e trans-

óxido de linalol (2,23%); no óleo essencial de C. camphora o teor de linalol foi de 86,59%,

seguido de cis-óxido de linalol (3,16%) e trans-óxido de linalol (3,12%), a cânfora foi

encontrada com teor de 0,75%; os componentes principais do óleo essencial de C. sativum

foram linalol (81,00%), cânfora (4,44%), -terpineno (3,04%) e -pineno (2,96%).

Na Tabela 8 estão apresentados os constituintes dos óleos essenciais analisados por CG-

EM e nas Figuras 19 a 25, são representados os perfis cromatográficos e as estruturas dos

principais constituintes químicos dos óleos essenciais.

50

Tabela 8. Composição química dos óleos essenciais das espécies vegetais em estudo.

Nº

Pico Compostos IRR IR-lit

% área do pico (média desvio padrão)*

La-22 La-57 Ob Pg Ar Cc Cs

1 Tricicleno 925 926 - 0,13 - - - - -

2 α-Pineno 931 932 - - - 0,12 - - 2,96

3 Canfeno 947 954 - - - - - - 0,46

4 Sabineno 971 975 0,89 - 0,17 - - - -

5 -Pineno 976 979 - - 0,39 - - - -

6 Mirceno 988 990 0,33 0,55 - - - - 0,59

7 O-Cimeno 1023 1026 - - - - - - 1,09

8 Limoneno 1028 1029 - 32,68 0,32 - - 0,30 - 1,59

9 1,8-Cineol 1031 1031 6,65 - 5,19 - 0,62 - -

10 (E)- -Ocimeno 1045 1050 0,64 0,47 - - - - -

11 -Terpineno 1057 1059 - - - - - - 3,04

12 cis-Óxido de linalol 1069 1072 - - - - 2,40 3,16 -

13 trans-Óxido de linalol 1085 1086 - - - - 2,23 3,12 -

14 Linalol 1100 1096 81,91 0,42 76,64 14,34 92,29 86,59 81,00

15 cis-Óxido de rosa 1109 1106 - - - 0,42 - - -

16 Cânfora 1146 1146 - - - - - 0,75 4,44

17 iso-Mentona 1164 1158 - - - 1,44 - - -

18 n.i 1169 n.i - - - - - 0,26 -

19 n.i 1171 n.i - - - - - - 0,75

20 n.i 1188 n.i - - - - - 1,30 -

21 α-Terpineol 1193 1188 0,49 - 0,60 0,97 1,39 - -

22 n.i 1201 n.i 0,56 - - - - - -

23 n.i 1208 n.i 1,20 - - - - - -

24 n.i 1210 n.i 0,75 - - - - - -

25 n.i 1218 n.i - - - - - 0,50 -

51

26 Formato de linalila 1224 1214 - - - 0,40 - - -

27 Citronelol 1227 1223 - - - 21,49 - - -

28 Neral 1237 1235 - - - 0,54 - - -

29 Carvona 1244 1243 - 61,41 - - - - -

30 Geraniol 1251 1252 - - 11,82 28,19 - - 2,91

31 Piperitona 1253 1252 - 0,55 - - - - -

32 Geranial 1267 1264 0,90 - - 0,92 - - -

33 Formato de citronelila 1272 1271 - - - 9,70 - - -

34 Acetato de bornila 1284 1288 - - 0,21 - - - -

35 Formato de geranila 1297 1298 - - - 3,95 - - -

36 n.i 1306 n.i - - - 0,32 - - -

37 Piperitenona 1337 1343 - 0,85 - - - - -

38 n.i 1355 n.i - - - - - 3,64 -

39 α-Copaeno 1373 1376 - - - - 0,32 - -

40 Acetato de geranila 1378 1379 - - 1,47 0,37 - - 1,15

41 -Bourboneno 1383 1388 - 0,26 - 0,36 - - -

42 -Elemeno 1388 1389 0,34 - - 0,32 - - -

43 ( -Cariofileno 1418 1419 1,55 0,26 - 1,99 - - -

44 α-(E)-Bergamoteno 1432 1434 - - 1,14 - - - -

45 α-Guaieno 1434 1437 - - - 0,39 - - -

46 -Guaiadieno 1440 1442 - - - 5,39 - - -

47 α-neo-Cloveno 1448 1452 - - - 0,44 - - -

48 α-Humuleno 1454 1452 - - - 0,53 - - -

49 Propanoato de geranila 1468 1476 - - - 0,63 - - -

50 -Muuroleno 1479 1479 1,68 1,85 - - - - -

51 Germacreno D 1480 1485 - - 0,45 1,19 - - -

52 -Selineno 1483 1492 - - - 0,36 - - -

53 n.i 1486 n.i - - - - 0,45 - -

54 -Cadineno 1511 1513 - - 0,37 0,45 - - -

55 Butanoato de Citronelila 1524 1530 - - - 0,49 - - -

56 Butanoato de geranila 1555 1562 - - - 1,48 - - -

57 (E)-nerolidol 1561 1563 1,05 0,32 - - - - -

continuação “Tabela 8”

52

La-22 = L. alba do quimiotipo linalol-1,8-cineol. La-57 = L. alba do quimiotipo carvona-limoneno. Ob = O. basilicum. Pg = P. graveolens. Ar = A. rosaeodora. Cc = C. camphora.

Cs = C. sativum. IRR = Índice de retenção relativo. IR-lit = Índice de retenção da literatura (ADAMS, 2007). n.i = não identificado. * = Análise em CG-EM (condições ver item 4.6.1).

58 n.i 1579 n.i - - - 0,61 - - -

59 Tiglato de 2-fenil etil 1583 1584 - - - 0,58 - - -

60 Óxido de cariofileno 1581 1583 1,06 - - - - 0,67 -

61 epi-α-Cadinol 1642 1640 - - 1,55 - - - -

62 α-Eudesmol 1653 1653 - 0,25 - - - - -

63 α-Cadinol 1656 1654 - - - 0,21 - - -

64 Tiglato de geranila 1695 1696 - - - 1,40 - - -

Hidrocarbonetos monoterpênicos 1,86 33,83 0,56 0,12 0,30 - 9,73

Monoterpenos oxigenados 89,95 63,23 94,25 68,71 98,93 93,62 88,35

Hidrocarbonetos sesquiterpênicos 3,57 2,37 1,96 11,42 0,32 - -

Sesquiterpenos oxigenados 2,11 0,57 1,55 0,21 - 0,67 -

Ésteres - - 1,68 18,60 - - 1,15

Total 97,49 100 100 99,06 99,55 94,29 99,23

continuação “Tabela 8”

53

Figura 19. Cromatograma dos íons totais e estruturas dos constituintes majoritários do óleo essencial de L. alba do quimiotipo linalol-1,8-cineol.

Para condições cromatográficas de análises, ver item 4.5.

5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

4.50 TIC

9

4

14

10 6

23 42 43 57 50 60 32 24

21 22

O

1,8-cineol

(9)

linalol

OH

(14)

(x10,000,000)

54

Figura 20. Cromatograma dos íons totais e estruturas dos constituintes majoritários do óleo essencial de L. alba do quimiotipo carvona-

limoneno. Para condições cromatográficas de análises, ver item 4.5.

5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

(x10,000,000) TIC

1 6

8

14

29

37 31 50 57 62 41 10 43

O

carvona

(29)

linalol

OH

(14)limoneno

(8)

55

Figura 21. Cromatograma dos íons totais e estruturas dos constituintes majoritários do óleo essencial de O. basilicum. Para condições

cromatográficas de análises, ver item 4.5.

5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

(x10,000,000) TIC

5

9

4

14

21

30

34 40 44 61 54 51

O

1,8-cineol

(9)

linalol

OH

(14)

geraniol

OH

(30)

1.75

56

Figura 22. Cromatograma dos íons totais e estruturas dos constituintes majoritários do óleo essencial de P. graveolens. Para condições


5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0

(x10,000,000) TIC

2

14

15 17 21

27

1

26

30

28 32

33

35

36 40

41

42 43

45

46

48 51 47

49

52

54

55 64 63

59 58

56

citronelol

OH

(27)

geraniol

OH

(30)

linalol

OH

(14)

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

57

Figura 23. Cromatograma dos íons totais e estruturas dos constituintes majoritários do óleo essencial de A. rosaeodora. Para condições


5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25 TIC 14

8 9 12

13

21 39 53

linalol

OH

(14)óxido de linalol

O

OH

trans(12) (13)cis

(x10,000,000)

58

Figura 24. Cromatograma dos íons totais e estruturas dos constituintes majoritários do óleo essencial de C. camphora. Para condições


5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0

0.25

0.50

0.75

1.00 (x10,000,000) TIC

12

13

14

16

18

20

8 38

25

60

Ocânfora

(16)

linalol

OH

(14)óxido de linalol

O

OH

trans(12) (13)cis

59

Figura 25. Cromatograma dos íons totais e estruturas dos constituintes majoritários do óleo essencial de C. sativum. Para condições


5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

TIC

2

6 3 7 8 11

14

16

19 30

40

-pineno

(2)

-terpineno

(11)

Ocânfora

(16)

linalol

OH

(14)

(x10,000,000)

60

5.2 Avaliação da estereoquímica do linalol nos óleos essenciais das espécies L. alba, O.

basilicum, P. graveolens, A. rosaeodora, C. camphora e C. sativum

O uso da cromatografia a gás com detector de ionização por chama e a coluna de fase

estacionária enantiosseletiva (β-CD) contribuíram para a determinação da ordem de eluição

dos enantiômeros do linalol e da estereoquímica desse álcool monoterpênico nos óleos

essenciais das espécies vegetais estudadas.

A ordem de eluição dos enantiômeros do linalol foi determinada por meio de análises

individuais e co-injeção dos padrões comerciais (R)-(-)-linalol e (±)-linalol (Figura 26) e por

meio da sobreposição dos picos cromatográficos. O enantiômero (R)-(-)-linalol foi o primeiro

a eluir com tempo de retenção de 22,3 min. Em seguida, eluiu o enantiômero (S)-(+)-linalol

em 22,6 min.

Após a confirmação da sequência de eluição e dos tempos de retenção dos enantiômeros

do linalol, foi possível determinar a pureza e o excesso enantiomérico do linalol nos óleos

essenciais (Tabela 9). As espécies L. alba e O. basilicum, ambas cultivadas no Campus Rural

da UFS, apresentaram 100% de excesso enantiomérico, relativo aos isômeros (S)-(+)-linalol e

(R)-(-)-linalol, respectivamente. Enquanto que na espécie P. graveolens, também cultivada

nesta área, foi encontrada uma mistura desses enantiômeros, com pureza de 48,89% de (R)-(-

)-linalol e 51,11% de (S)-(+)-linalol; o óleo essencial da madeira de pau-rosa (A. rosaeodora),

oriundo da região norte do Brasil, também possui os dois enantiômeros, sendo pureza de

50,48% para o (R)-(-)-linalol e 49,52% de (S)-(+)-linalol; os dois enantiômeros do linalol

também foram encontrados no óleo essencial das sementes de coentro (C. sativum), mas com

predominância do (S)-(+)-linalol (excesso enantiomérico de 76,08%). O (R)-(-)-linalol foi

encontrado enantiomericamente puro no óleo essencial de Ho-Sho (C. camphora), espécie

cultivada na região sul do Brasil. Também foi realizada a análise dos padrões comerciais de

linalol: o composto racêmico apresentou pureza de 49,17% para o (R)-(-)-linalol e 50,83% de

(S)-(+)-linalol, enquanto que o padrão (R)-(-)-linalol foi encontrado com 100% de pureza

enantiomérica.

61

Figura 26. Cromatogramas obtidos por CG-DIC da separação enantiomérica do padrão

comercial de linalol racêmico (A), do padrão comercial de (R)-(-)-linalol (B) e da separação

enantiomérica da co-injeção dos padrões de linalol racêmico e (R)-(-)-linalol (C). Para

condições de análise ver item 4.6.2.

A

B

C

62

Tabela 9. Distribuição enantiomérica de linalol em padrões comerciais e óleos essenciais.

Padrão comercial /

óleo essencial

(%) pureza enantiomérica

(média desvio padrão) (c)

Excesso enantiomérico

(%) (3R)-(-)-linalol (3S)-(+)-linalol

(R)-(-)-linalol (a)

100 - 100 (R)

(±)-linalol (a)

49,17 50,83 1,66 (S)

L. alba (b)

- 100 100 (S)

C. camphora (b)

100 100 (R)

O. basilicum (b)

100 - 100 (R)

A. rosaeodora (b)

50,48 0,17 49,52 0,17 1,06 (R)

P. graveolens (b)

48,89 0,16 51,11 0,16 2,13 (S)

C. sativum (b)

11,96 0,27 88,04 0,27 76,08 (S)

(a) Padrão comercial;

(b) Óleo essencial extraído por hidrodestilação;

(c) Análise em CG-DIC (para condições de

análise ver item 4.6.3). (R) = (3R)-(-)-linalol; (S) = (3S)-(+)-linalol.

5.3 Avaliação da estereoquímica da carvona e do limoneno no óleo essencial da espécie

L. alba do quimiotipo carvona-limoneno

Os enantiômeros da carvona e do limoneno tiveram a sequencia de eluição determinada

com apenas um padrão comercial de seus enantiômeros ((R)-(-)-carvona e (R)-(+)-limoneno)

e com informações da literatura (TABACCHI et al., 1997; LIBERTO et al., 2008;

BONNACORSI et al., 2011). De acordo com esses autores, em colunas com fase estacionária

recheada de -CD, o enantiômero (R)-(-)-carvona elui antes do (S)-(+)-carvona, já o

enantiômero (R)-(+)-limoneno elui depois do (S)-(-)-limoneno.

As análises individuais dos padrões e do óleo essencial de L. alba, assim como a co-

injeção deste (padrão e óleo essencial) (Figura 27 e 28), foram essenciais para estabelecer a

estereoquímica da carvona e do limoneno da espécie vegetal estudada. O padrão comercial

(R)-(-)-carvona apresentou tempo de retenção de 28,8 min e o padrão (R)-(+)-limoneno em

14,5 min. Esses enantiômeros tiveram tempos de retenção similares aos tempos de retenção

dos compostos do óleo essencial de L. alba (28,8 min para (R)-(-)-carvona e 14,5 min para o

(R)-(+)-limoneno). O enantiômero (S)-(-)-limoneno apresentou tempo de retenção de 14,3

63

min. A co-injeção de padrões com óleo essencial de L. alba ratificou a presença desses

enantiômeros.

Figura 27. Cromatogramas obtidos por CG-DIC do óleo essencial de L. alba (quimiotipo

carvona-limoneno) (i), do padrão comercial (R)-(-)-carvona (ii) e da co-injeção do padrão (R)-

(-)-carvona e óleo essencial de L. alba (iii). Para condições de análise ver item 4.6.4.

i

ii

iii

64

Figura 28. Cromatogramas obtidos por CG-DIC do óleo essencial de L. alba (quimiotipo

carvona-limoneno) (a), do padrão comercial (R)-(+)-limoneno (b) e da co-injeção do padrão

(R)-(+)-limoneno e óleo essencial de L. alba (c). Para condições de análise ver item 4.6.4.

a

b

c

65

Após a confirmação da ordem de eluição e dos tempos de retenção dos enantiômeros da

carvona e do limoneno, foram determinados a pureza e o excesso enantiomérico destes

monoterpenos no óleo essencial (Tabela 10). Com esse resultado foi possível revelar que a

espécie L. alba (quimiotipo carvona-limoneno) apresenta apenas o enantiômero (R)-(-)-

carvona (100% de excesso enantiomérico), mas possui os dois enantiômeros do limoneno,

com predominância do (R)-(+)-limoneno (97,52% de excesso enantiomérico).

Tabela 10. Distribuição enantiomérica de carvona e limoneno em padrão comercial e no óleo

essencial L. alba (quimiotipo carvona-limoneno).

Padrão comercial/

óleo essencial

(%) Pureza enantiomérica (média desvio padrão)c

Carvona Limoneno

(4R)-(-) (4S)-(+) (4R)-(+) (4S)-(-)

Carvonaa 100

-

100

-

-

-

- -

Limonenoa 100 -

L. albab 98,76 0,03 1,24 0,03

a Padrão comercial;

b óleo essencial extraído por hidrodestilação;

c análise em CG-DIC (para condições

cromatográficas de análise ver item 4.6.4.1)

A determinação da estereoquímica de linalol, carvona e limoneno nos óleos essenciais

somente foi possível devido às diferentes interações desses isômeros ópticos com a fase

estacionária constituída de -CD, como também à otimização realizada na programação de

temperatura da coluna e no preparo de soluções de óleos essenciais e padrões, sendo que a

concentração do analito na coluna foi inferior a 3,0 g. Esse fato ocorre por causa da

instabilidade da fase estacionária ( -CD), quando exposta a temperatura elevada (acima de

250ºC) e a concentração maior do que 5,0 g do analito na coluna. Com isso, a seletividade

da fase estacionária é comprometida e as misturas racêmicas não serão resolvidas

(TABACCHI et al., 1997; SUPELCO, 1998).

66

5.4 Análise comparativa dos óleos essenciais das espécies estudadas

A análise comparativa dos óleos essenciais foi realizada entre as espécies cultivadas no

Campus Rural da UFS (L. alba, O. basilicum e P. graveolens) e as espécies cultivadas em

outras regiões do Brasil e que apresentaram elevado teor de linalol (A. rosaeodora, C.

camphora e C. sativum).

Na espécie A. rosaeodora (pau-rosa) o aroma agradável de cheiro de lavanda se deve à

presença dos enantiômeros de linalol em proporção equivalente (pureza enantiomérica de

50,48% para o (3R)-(-)-linalol e 49,52% de (3S)-(+)-linalol). Apesar da presença desses

enantiômeros em P. graveolens em proporção semelhante [48,89% de (3R)-(-)-linalol e

51,11% de (3S)-(+)-linalol], o odor de lavanda não foi predominante nessa espécie devido à

baixa concentração de linalol (13,6%), enquanto que em O. basilicum o forte aroma floral é

devido à única presença do enantiômero (3R)-(-)-linalol. O odor do óleo essencial de C.

camphora (Ho-Sho) foi caracterizado como floral com tom canfórico, devido à presença

apenas do enantiômero (3R)-(-)-linalol com teor de 84,00% e da cânfora com 0,75%. O cheiro

cítrico foi característico de L. alba devido à única presença do (3S)-(+)-linalol. A espécie C.

sativum (sementes de coentro) apresentou os dois enantiômeros com pureza enantiomérica de

11,96% para (3R)-(-)-linalol e 88,04% para (3S)-(+)-linalol, o elevado excesso enantiomérico

do (3S)-(+)-linalol caracterizou o aroma mais cítrico do que floral e a presença da cânfora

com teor de 4,40% também o tornou com odor canfórico.

67

5.5 Caracterização do linalol isolado do óleo essencial de L. alba por CCD

5.5.1 Análise qualitativa do óleo essencial de L. alba em CCDA

A análise preliminar do óleo essencial de L. alba em cromatografia de camada delgada

analítica (CCDA) possibilitou encontrar a proporção e o tipo de eluente da fase móvel

utilizada na cromatografia de camada delgada preparativa (CCDP). Com a revelação da placa

utilizando o reagente anisaldeído sulfúrico seguido de aquecimento foi possível determinar os

valores dos fatores de retardamento (Rfs) dos componentes do óleo essencial. A revelação da

placa indicou a presença de quatro manchas referentes aos componentes do óleo essencial de

L. alba (Figura 29), duas manchas dos constituintes principais (linalol e 1,8-cineol),

confirmados com uso de padrões comerciais: a mancha de coloração esverdeada bastante

intensa (Rf ~ 0,42), referente ao linalol, e a mancha azulada (Rf ~ 0,56) referente ao composto

1,8-cineol. Outras duas manchas (Rfs ~ 0,38 e 0,62) foram provenientes da mistura dos demais

compostos (sabineno, mirceno, (E)- -ocimeno, -terpineol, geranial, -elemeno, (E)-

cariofileno, -muuroleno, (E)-nerolidol e óxido de cariofileno) do óleo essencial.

Figura 29. Cromatoplaca em CCDA do padrão comercial de 1,8-cineol (1), do padrão

comercial de linalol (2) e do óleo essencial de L. alba (3). Condições de análise: fase móvel =

hexano e AcOEt, (9:1); fase estacionária = sílica de gel 60 F254; revelação = reagente de

anisaldeído sulfúrico seguido de aquecimento.

1 2 3

1,8-Cineol (Rf ~ 0,56)

Linalol (Rf ~0,42)

Outros compostos (Rf ~ 0,38)

Outros compostos (Rf ~ 0,62)

68

5.5.2 Isolamento e purificação do linalol do óleo essencial de L. alba por CCDP

Para confirmar a presença dos compostos na camada do adsorvente foi realizada uma

pequena revelação na lateral da placa (Figura 30), pois o composto de interesse (linalol) não

apresentava fluorescência quando exposto à luz UV a 254 nm. A análise em CG-EM dos

componentes das três manchas isoladas e purificadas do óleo essencial da espécie L. alba por

CCDP foi realizada em uma única etapa. Essa avaliação permitiu observar que o método foi

capaz de isolar o linalol com pureza superior a 99%. A pureza do linalol isolado também foi

constatada em CCDA e comparada com o padrão comercial de linalol (Figura 31). O

composto 1,8-cineol foi encontrado com 84% de pureza e a mancha mais inferior (Rf ~ 0,38)

apresentou uma diversidade de compostos presente no óleo essencial.

A separação e a purificação do linalol do óleo essencial de L. alba foram realizadas em

sucessivas vezes e obtiveram rendimento médio de 70,76% ± 6,93% (m/m) e massa total

isolada de 904,7 mg (Tabela 11).

Figura 30. Separação dos componentes do óleo essencial de L. alba por

CCDP: (i) 1,8-Cineol; (ii) Linalol; (iii) Outros compostos. Condições de análise: fase móvel =

hexano e AcOEt, (9:1); fase estacionária = sílica de gel 60 F254.

i

ii

iii

69

Figura 31. Cromatoplaca em CCDA do linalol isolado de L. alba por

CCDP (L1) e do padrão comercial (L2). Condições de análise: fase móvel = hexano e AcOEt,

(9:1); fase estacionária = sílica de gel 60 F254; revelação = reagente de anisaldeído sulfúrico

seguido de aquecimento.

Tabela 11. Resultados do isolamento e purificação do linalol de L. alba.

Massa de óleo

essencial (mg) Massa de linalol

isolado (mg) Rendimento

(%) Teor

(%)*

220,00 166,10 75,50 100,00

220,00 129,60 58,91 99,48

220,00 152,90 69,50 99,79

220,00 162,70 73,95 99,67

200,00 136,50 68,25 99,50

200,00 156,90 78,45 100,00

Média 150,63 70,76 99,74

Desvio padrão 14,63 6,93 0,23

* = análise realizada por CG-EM (para condições cromatográficas ver item 4.6.1).

L1 L2

70

5.5.3 Análise da identificação do linalol isolado por CG-EM

A análise em CG-EM do linalol isolado apresentou tempo de retenção de 12,6 min,

índice de retenção experimental de 1100 e índice de retenção na literatura de 1096 (ADAMS,

2007). O espectro de massas obtido por ionização por elétrons (EM-IE) com energia de 70

eV, revelou o pico do íon molecular em m/z 154 [M+], esse pico não é tão visível no espectro

de massas por causa da presença da hidroxila na molécula, esse fato ocorre frequentemente

em moléculas de álcool terciário, devido a rápida eliminação de uma molécula de H2O,

gerando o íon m/z 136 [M – 18] (SILVERSTEIN et al., 2007). Outros sinais característicos do

linalol foram encontrados em m/z 121 [M – 18 – 15] é corresponde a perda de água e grupo

metila. Os demais picos são em m/z 107, m/z 93, m/z 80, m/z 71, m/z 55 e m/z 41 (Figura 32-

A). As intensidades dos sinais do linalol isolado foram similares aos sinais do espectro de

massas do padrão comercial de linalol (Figura 32-B). A comparação com espectros do banco

de dados da biblioteca do instrumento (Wiley8) ratifica a estrutura do linalol isolado. Mas a

determinação de sua estereoquímica somente foi possível em análises por CG-DIC e

polarimétrica.

71

Figura 32. Espectros de massas do composto linalol isolado do óleo essencial de L. alba por CCDP (A) e do linalol padrão comercial (B).

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

0

50

100

%

41

93 71 55

80 79 121

94 136 107 51 65 122 134 154 148

B

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

0

50

100

%

41

71

93

55

80 67

121 92 83 136 107 59 111 45 103 127 134 154

A OH

72

5.5.4 Avaliação da estereoquímica do linalol isolado por CG-DIC

A estereoquímica do linalol isolado óleo essencial de L. alba foi determinada por meio

de análise individual do composto e da sua co-injeção com padrões comerciais de linalol [(R)-

(-)-linalol e (±)-linalol], utilizando o sistema CG-DIC com coluna de fase estacionária

enantiosseletiva. O tempo de retenção do linalol isolado foi similar ao segundo pico

cromatográfico a eluir do padrão comercial do linalol racêmico. Foi observado um aumento

de área correspondente ao segundo pico a eluir da co-injeção do linalol isolado com o linalol

racêmico e a análise da mistura do linalol isolado com o (R)-(-)-linalol foi evidenciado a

formação de dois picos. Esses dados comprovaram que o linalol isolado é

predominantemente do enantiômero (S)-(+)-linalol com 100% de pureza enantiomérica. O

resultado corroborou os relatos na literatura para esse enantiômero na espécie vegetal

estudada (SIANI et al., 2002; LUPE, 2007).

5.5.5 Avaliação da rotação óptica e do índice de refração do linalol isolado

A atividade óptica ([ ]D) e o índice de refração ( ) apresentaram valores de +13,6 e

1,4626, respectivamente. O valor de [ ]D corroborou os dados obtidos com a co-injeção do

linalol isolado com padrões comerciais, os quais foram analisados por GC-DIC, e com as

informações da literatura para o enantiômero (S)-(+)-linalol encontrado em L. alba (SIANI et

al., 2002; LUPE, 2007). O valor do também está de acordo com a literatura (1,4600 a

1,4630) (SUGAWARA et al., 2000, LETIZIA et al., 2003) e valida a pureza do composto

isolado.

5.5.6 Avaliação de aspecto, cor e odor do linalol isolado

Os ensaios organolépticos são procedimentos utilizados para avaliar as características

de um produto, detectáveis pelos órgãos dos sentidos (BRASIL, 2007). As análises de aspecto

e cor do linalol isolado, avaliadas pelo método visual, apresentaram similaridades com as

amostras dos padrões comerciais ((R)-(-)-linalol e (±)-linalol). O odor do linalol isolado

corroborou as informações mencionadas na literatura referente ao (S)-(+)-linalol

(SUGAWARA et al., 2000; BRENNA et al., 2003). Na Tabela 12 são mostrados os

resultados dos ensaios organolépticos do linalol isolado.

73

Tabela 12. Propriedades organolépticas do

(S)-(+)-linalol isolado.

Propriedade Resultado

Cor Amarelo claro

Aparência Límpida

Odor Cítrico, folha seca

5.5.7 Elucidação estrutural do composto isolado de L. alba por RMN

As análises dos espectros de RMN de 1H e

13C do composto isolado (linalol) e do

padrão comercial de linalol foram comparadas com os dados da literatura (BARROS, 2008;

CHAAR, 2000; FATOPE et al., 2008; SILVERSTEIN et al., 2007).

Pela análise do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) do composto isolado

(Figura 33) foi observado a presença de três sinais de grupos metílicos, sendo um em 1,28

(3H, s), e dois em 1,60 (3H, s) e 1,68 (3H, d, J = 1,3 Hz) sobre ligação dupla, quatro sinais

de hidrogênios ligados a carbono sp2, sendo um em 5,13 (1H, tquinteto, J = 7,1 e 1,3 Hz, H-

6) típico de hidrogênio olefínico, um em 5,91 (1H, dd, J = 17,3 e 10,7 Hz, H-2)

característico de hidrogênio vinílico, e dois em 5,21 (1H dd, J = 17,3 e 1,3 Hz, H-1a) e

5,06 (1H dd, J = 10,7 e 1,3 Hz, H-1b) típicos de hidrogênios de grupo metileno terminal, e

dois sinais em 1,58 (2H, m) e 2,05 (2H, m) típicos de grupos metilenos de carbono sp3.

Pela análise dos espectros de espectro de RMN de 13

C e DEPT 135 (100 MHz, CDCl3)

do composto isolado (Figura 34) foi observado a presença de sinais para dez carbonos, sendo

três metilas (CH3) em 17,7, 25,7 e 27,8, três metilenos (CH2) em 22,7, 42,0 e

111,6, dois metinos (CH) em 124,3 e 145,0 e dois quaternários (C0) em 73,4 e 131,9.

Comparação com os dados da literatura (Tabela 13) permitiram concluir que se trata do

monoterpeno oxigenado linalol.

74

Tabela 13. Dados espectroscópicos de RMN de 1H e

13C do linalol da literatura, do padrão

comercial e do linalol isolado a.

a Experimento realizado a 400 MHz para

1H e 100 MHz para

13C em CDCl3, utilizando o TMS como padrão

interno. b Barros (2008).

c (R)-(-)-linalol comercial.

d (S)-(+)-linalol de L. alba; ( ) Deslocamento químico em

ppm.

Estrutura do

linalol isolado Átomo

Literatura b

Padrão c Linalol isolado

d

13C

13C

1H (mult., J em Hz)

1 111,6 111,6 111,6

5,21 (dd, 1,3, 17,3, H-1a)

5,06 (dd, 1.3, 10,7, H-1b)

2 145,0 145,0 145,0 5,91 (dd, 10,7, 17,3)

3 73,4 73,4 73,4 -

4 42,0 42,0 42,0 1,58 (m)

5 22,7 22,8 22,8 2,05 (m)

6 124,3 124,3 124,3 5,13 (tq, 7,1 e 1,3)

7 131,8 131,9 131,9 -

8 17,6 17,7 17,7 1,60 (s1)

9 25,6 25,7 25,7 1,68 (3H, d, J = 1,3)

10 27,8 27,8 27,8 1,28 (s)

8

OH

1

23

4

5

6

7

10

9

75

Figura 33. Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) do (S)-(+)-linalol isolado de L. alba.

Figura 34. Espectros de RMN de 13

C e DEPT 135 (100 MHz, CDCl3) do (S)-(+)-linalol

isolado de L. alba.

ppm (t1)0.01.02.03.04.05.06.07.0

7.2

65

7

5.9

49

2

5.9

22

3

5.9

05

9

5.8

79

0

5.2

38

9

5.2

35

6

5.1

95

6

5.1

92

3

5.1

48

7

5.1

45

3

5.1

41

8

5.1

38

3

5.1

34

6

5.1

30

8

5.1

27

4

5.1

23

9

5.1

20

4

5.1

17

0

5.1

13

1

5.1

09

4

5.1

05

9

5.1

02

4

5.0

99

0

5.0

78

6

5.0

75

4

5.0

51

8

5.0

48

5

2.1

01

3

2.0

82

5

2.0

65

6

2.0

43

8

2.0

23

6

2.0

04

1

1.9

84

0

1.9

66

0

1.9

48

3

1.6

83

5

1.6

80

8

1.6

30

8

1.6

12

7

1.6

04

6

1.5

96

8

1.5

80

3

1.5

72

5

1.5

65

6

1.5

55

8

1.5

46

6

1.5

40

2

1.5

30

2

1.5

22

6

1.2

80

3

0.0

00

0

1.0

0

1.0

61

.01

1.0

3

2.2

0

3.1

96

.41

3.2

1

ppm (t1)0255075100125150175200

14

5.0

3

13

1.9

5

12

4.3

1

11

1.6

8

77

.34

77

.02

76

.70

73

.49

42

.06

27

.88

25

.70

22

.81

17

.70

0.0

00

00

8

OH

1

23

4

5

6

7

10

9

8

OH

1

23

4

5

6

7

10

9

76

5.6 Quantificação do linalol, carvona e limoneno nos óleos essenciais das espécies L. alba,

O. basilicum, P. graveolens, A. rosaeodora, C. camphora e C. sativum

Os componentes dos óleos essenciais frequentemente são quantificados por meio do

percentual relativo das áreas dos picos cromatográficos (método da normalização) que pode

ser utilizado para comparação quantitativa do perfil cromatográfico, mas em algumas

aplicações esse método não é suficiente para satisfazer todos os requisitos para óleos

essenciais, principalmente quando se trata de adulterações ou falsificações de produtos

comerciais, visto que a resposta do DIC não é tão precisa para quantificação de compostos

oxigenados. O método de padronização (interna e externa) minimiza erros do equipamento e

do procedimento analítico (BICCHI et al., 2008; RUBIOLO et al., 2010).

Os padrões de referência interna (PIs) são importantes para o desempenho do método

analítico. Neste estudo, foram usados no método de padrão interno os compostos β-citronelal

e -terpineno. Esses compostos foram selecionados por possuírem elevado grau de pureza, por

pertencerem à classe dos monoterpenos (Figura 35) e apresentarem picos separados dos

analitos investigados e dos demais compostos das matrizes.

Figura 35. Estruturas dos padrões internos utilizados no método analítico.

A quantificação de linalol, carvona e limoneno presentes nos óleos essenciais das espécies

vegetais estudadas foi feita pelo método do padrão interno. As curvas analíticas dos padrões

de linalol, carvona e limoneno foram obtidas, plotando-se valores da razão entre a área do

padrão do analito pela área do padrão interno versus a concentração do padrão do analito

(Figuras 36, 37, 38 e 39). Os dados de áreas obtidos de cada padrão do analito e do padrão

interno estão apresentados nas Tabelas 14, 15, 16 e 17.

-terpineno

O

H

(S)-(-)- -citronelal

77

Figura 36. Curva analítica do (R)-(-)-linalol obtida pelo método do padrão interno,

apresentando a regressão linear e a equação da reta.

Tabela 14. Parâmetros da curva analítica do (R)-(-)-linalol com padrão interno ( -citronelal).

Concentração

(R)-(-)-linalol

(mg mL-1

)

Área média

(R)-(-)-linalol

Área média

-citronelal a

Razão de área

[(R)-(-)-linalol / -citronelal]

1,40 11862,37 37327,10 0,32

2,80 23397,40 37551,63 0,62

4,40 37130,00 37250,10 0,99

5,20 42123,70 35804,67 1,18

5,60 42429,03 32789,37 1,29

6,60 53361,93 34314,40 1,55

10,00 85142,80 36825,45 2,31 a Padrão interno (5,0 mg mL

-1).

y = 0,2344x - 0,0221

r² = 0,9990

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

2,8

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0

Razã

o d

e áre

as

[(R

)-(-

)-li

nalo

l /

-cit

ron

elal]

Concentração de (R)-(-)-linalol (mg mL-1)

78

Figura 37. Curva analítica do (S)-(+)-linalol obtida pelo método do padrão interno,


Tabela 15. Parâmetros da curva analítica do (S)-(+)-linalol com padrão interno ( -citronelal).

Concentração

(S)-(+)-linalol

(mg mL-1

)

Área média

(S)-(+)-linalol

Área média

-citronelal a

Razão de área

[(S)-(+)-linalol / -citronelal]

1,50 9416,47 35109,50 0,27

3,00 23363,77 41618,60 0,56

4,40 31118,13 36822,10 0,84

4,80 38081,37 38964,13 0,98

5,40 36408,50 33006,47 1,10

6,20 45707,77 35652,17 1,28


-1)

y = 0,2340x - 0,1401

r² = 0,9965

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

2,8

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0

Razã

o d

e áre

as

[(S

)-(+

)-li

nalo

l /

-cit

ron

elal]

Concentração de (S)-(+)-linalol (mg mL-1)

79

Figura 38. Curva analítica do (R)-(-)-carvona obtida pelo método do padrão interno,


Tabela 16. Parâmetros da curva analítica do (R)-(-)-carvona com padrão interno ( -

terpineno).

Concentração

(R)-(-)-carvona

(mg mL-1

)

Área média

(R)-(-)-carvona

Área média

-terpineno a

Razão de área

[(R)-(-)-carvona / -terpineno]

1,00 7344,90 46310,47 0,16

2,00 14370,63 46243,60 0,31

3,00 19505,50 44491,73 0,44

4,00 29547,37 46998,80 0,63

5,00 37517,57 46329,97 0,81

6,00 45174,60 44956,53 1,01


-1)

y = 0,1651x - 0,0211

r² = 0,9979

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0

Razã

o d

e áre

as

[(R

)-(-

)-ca

rvon

a /

-t

erp

inen

o]

Concentração de (R)-(-)-carvona (mg mL-1)

80

Figura 39. Curva analítica do (R)-(+)-limoneno obtida pelo método do padrão interno,


Tabela 17. Parâmetros da curva analítica do (R)-(+)-limoneno com padrão interno ( -

terpineno).

a Padrão interno (4,5 mg mL

-1).

y = 0,1660x + 0,0200

r² = 0,9997

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0

Razã

o d

e áre

as

[(R

)-(+

)-li

mon

eno /

-t

erp

inen

o]

Concentração de (R)-(+)-limoneno (mg mL-1)

Concentração

(R)-(+)-limoneno

(mg mL-1

)

Área média

(R)-(+)-limoneno

Área média

-terpineno a

Razão de área

[(R)-(+)-limoneno / -terpineno]

1,00 7514,07 43597,23 0,17

2,00 15875,90 45174,13 0,35

3,00 22760,48 42935,80 0,53

4,00 31426,67 45377,53 0,69

5,00 38679,83 45463,83 0,85

6,00 46044,60 45449,17 1,01

10,00 76538,87 45669,00 1,68

81

O método analítico permitiu quantificar o linalol nos óleos essenciais das espécies L. alba

(quimiotipo linalol), O. basilicum, P. graveolens, A. rosaeodora, C. camphora e C. sativum,

utilizando as equações da reta geradas nas curvas analíticas da Figura 36 e 37. A carvona e o

limoneno presentes no óleo essencial de L. alba (quimiotipo carvona-limoneno) foram

quantificados pela equação da reta das curva analítica das Figuras 38 e 39, respectivamente.

Os resultados obtidos estão expressos nas Tabelas 18 e 19.

Tabela 18. Dados da análise quantitativa do linalol nos óleos essenciais.

Óleo essencial Massa de óleo

essencial (mg)

Concentração de linalol

(mg mL-1

)* (%) m/m* (%) Área do

pico**

A. rosaeodora 8,0 7,31 ± 0,05 91,38 92,18

C. camphora 8,0 6,72 ± 0,02 84,00 84,86

L. alba 8,0 6,34 ± 0,03 79,25 80,98

C. sativum 6,0 4,74 ± 0,05 79,00 79,60

O. basilicum 6,0 4,40 ± 0,02 73,33 75,44

P. graveolens 25,0 3,40 ± 0,03 13,60 14,22

*concentração determinada pelo método do padrão interno (condições de análises ver item 4.9). **concentração

determinada pelo método de normalização de áreas (condições de análise ver item 4.6.3.1).

Tabela 19. Dados da análise quantitativa da carvona e do limoneno no óleo essencial.

Óleo

essencial

Massa de

óleo essencial

(mg) Composto

Concentração

(mg mL-1

)* (%) m/m* (%) Área do

pico**

L. alba# 7,5

Carvona 4,36 ± 0,06 58,13 58,60

Limoneno 2,38 ± 0,04 31,71 31,90

*concentração determinada pelo método do padrão interno (condições de análises ver item 4.9). **concentração

determinada pelo método de normalização de áreas (condições de análise ver item 4.6.3.1). #L. alba do

quimiotipo carvona-limoneno

Apesar de pouca variação encontrada nos teores dos monoterpenos (linalol, carvona e

limoneno) analisados por CG-DIC por meio diferentes métodos analíticos (padronização

interna e normalização de áreas) o método de padronização interna apresenta uma maior

confiabilidade na quantificação de componentes dos óleos essenciais (BICCHI et al., 2008).

82

5.6.1 Parâmetros de validação do método de quantificação

5.6.1.1 Linearidade e faixa de trabalho

A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados diretamente

proporcionais à substância de interesse, dentro de uma determinada faixa de aplicação

(RIBANI et al., 2004; VOGEL, 2008). Neste estudo, a faixa de aplicação foi estabelecida

entre 1,0 e 10,0 mg mL-1

(Tabela 20). A concentração máxima (10,0 mg mL-1

) foi

determinada levando em consideração que melhores resoluções de misturas racêmicas são

encontradas quando a quantidade do analito em coluna cromatográficas de fase de β-CD é

inferior a 5,0 μg (TABACCHI et al., 1998). Em 10,0 mg mL-1

a presença do analito na coluna

foi de 4,0 μg (injeção de 0,4 μL da solução do analito no CG-DIC). A partir da solução de

10,0 mg mL-1

foram preparadas as demais soluções de trabalho. A concentração mínima de

1,0 mg mL-1

foi a concentração capaz de ser quantificada por CG-DIC. Os analitos de

interesse nesse estudo (linalol, carvona e limoneno) presentes nos óleos essenciais

apresentaram concentrações na faixa de 2,0 a 8,0 mg mL-1

.

O coeficiente de correlação (r2) e a inclinação da reta são parâmetros importantes para

se observar a linearidade de curvas analíticas. A ANVISA recomenda um coeficiente de

correlação (r2) igual a 0,99, já para o INMETRO é aceitável valor de r

2 acima de 0,90. Quanto

mais próximo de 1 maior será a probabilidade de existir uma relação linear definida (RIBANI

et al., 2004; VOGEL, 2008). Neste estudo, as curvas analíticas obtidas para a quantificação

dos monoterpenos apresentaram relação de linearidade entre razão de área analito/padrão

interno e a concentração do analito e os valores encontrados de r2 foram superiores a 0,996

(Tabela 20), o que indica uma dispersão aceitável dos pontos das curvas.

Tabela 20. Faixa de trabalho, equação da reta e coeficiente de correlação das curvas

analíticas.

Composto Faixa de trabalho

(mg mL-1

) Equação da reta* r

2**

(S)-(+)-linalol 1,5 a 10,0 y = 0,2340x - 0,1401 0,9965

(R)-(-)-linalol 1,5 a 10,0 y = 0,2344x - 0,0221 0,9990

(R)-(-)-carvona 1,0 a 10,0 y = 0,1651x - 0,0211 0,9979

(R)-(+)-limoneno 1,0 a 10,0 y = 0,1660x + 0,020 0,9997

*y = razão de área (analito/padrão interno), x = concentração do analito. **coeficiente de correlação.

83

A equação da reta referente ao padrão (R)-(-)-linalol foi utilizada para os cálculos de

concentração do linalol nos óleos essenciais por ter apresentado maior valor de r2

(0,9990) em

comparação com o padrão (S)-(+)-linalol em que o valor de r2 foi 0,9965 e também por

possuir menor valor percentual do coeficiente de variação (CV%) (Tabela 21), calculado de

acordo com as equações 1 e 2. A curva analítica mais linear foi a que apresentou o CV (%)

menor ou igual a 2 % (LEITE, 2002). Neste estudo, a solução padrão de (R)-(-)-linalol

apresentou CV (%) de 1,8%, enquanto que o (S)-(+)-linalol foi encontrado 7,5% o que ratifica

melhor linearidade para o (R)-(-)-linalol.

Tabela 21. Parâmetros estatísticos do coeficiente de variação.

Padrão s FLm CV (%)

(R)-(-)-linalol 0,004 0,229 1,8

(S)-(+)-linalol 0,015 0,200 7,5

Equação 1. FL = razão entre a área do padrão de linalol e do padrão interno ( -citronelal)

concentração da solução do padrão de linalol (mg mL-1

)

Equação 2. CV (%) = s.100

FLm

Onde: CV = coeficiente de variação

s = desvio padrão dos fatores de linearidade

FL = fator de linearidade

FLm = média aritmética dos fatores de linearidade

84

5.6.1.2 Sensibilidade

A sensibilidade de um instrumento ou método é uma medida da habilidade em

discriminar pequenas diferenças na concentração do analito. A inclinação da reta é um dos

dispositivos que limitam a sensibilidade. Isto significa que pequenas variações na

concentração geram maiores variações no sinal analítico medido (áreas dos picos

cromatográficos), ou seja, quanto maior o coeficiente angular e mais inclinada à curva

analítica mais sensível é o método. O método utilizado neste trabalho foi bastante sensível,

visto que as curvas analíticas apresentaram-se bastante inclinadas. O detector de ionização em

chama (DIC) foi utilizado por ser um detector quase universal, altamente sensível e robusto.

Além disso, é frequentemente utilizado em análises quantitativas de óleos essenciais por

demonstrar uma boa sensibilidade para a quantificação de compostos voláteis em diversas

matrizes (BICCHI et al., 2008; RUBIOLO et al., 2010; VOGEL, 2008).

5.6.1.3 Limite de detecção e limite de quantificação

O limite de detecção (LD) do método representa a menor concentração da substância

em estudo que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada utilizando um

determinado procedimento experimental, enquanto que o limite de quantificação (LQ)

representa a menor concentração ou massa da substância em exame que pode ser medida,

utilizando um determinado procedimento experimental (INMETRO, 2003; RIBANI et al.,

2004). No presente estudo, o LD e o LQ foram determinados com base nos parâmetros

obtidos das curvas analíticas (Tabela 22) construídas pelo método do padrão interno por meio

de uma série de três diluições do padrão (R)-(-)-linalol próximo ao limite de detecção. Os

valores de LD e LQ foram calculados utilizando as equações indicadas abaixo. Os números

3,3 e 10 fazem parte da fórmula e referem-se à relação sinal-ruído (BICCHI et al., 2009;

RIBANI et al., 2004).

LD = 3,3 x

LQ = 10 x

desvio padrão do coeficiente linear

valor médio do coeficiente angular

desvio padrão do coeficiente linear

valor médio do coeficiente angular

85

Os valores encontrados para o limite de detecção e quantificação do linalol foram 0,03 e

0,10 mg mL-1

, respectivamente.

Tabela 22. Análise estatística para determinação do LD e LQ.

*curvas obtidas em triplicata na faixa de trabalho de 0,5 a 1,5 mg mL-1

.

Curvas

analíticas*

Coeficiente

linear

Coeficiente

angular

Coeficiente de

correlação (r2)

1 0,0820 4,0550 0,9997

2 0,0025 4,4559 0,9976

3 0,0622 4,1159 0,9988

Média 0,0489 4,2089 0,9987

Desvio padrão 0,0414 0,2160 0,0011

86

6 CONCLUSÃO

Este estudo de investigação da pureza enantiomérica de linalol nos óleos essenciais em

espécies vegetais cultivadas na Fazenda Experimental do Campus Rural da UFS revelou a

presença dos enantiômeros (3S)-(+)-linalol em L. alba (erva-cidreira) e (3R)-(-)-linalol em O.

basilicum (manjericão). Na espécie P. graveolens (gerânio) foi encontrada as duas formas

enantioméricas, com pureza enantiomérica de 48,89% para o (3R)-(-)-linalol e 51,11% para

(3S)-(+)-linalol.

A avaliação da estereoquímica dos compostos carvona e limoneno no óleo essencial da

espécie L. alba (quimiotipo carvona-limoneno), também cultivada no Campus Rural da UFS,

apresentou somente um dos enantiômeros da carvona ((3R)-(-)-carvona) e os dois

enantiômeros do limoneno com 98,76% de pureza enantiomérica de (3R)-(+)-limoneno e

1,24% para o (3S)-(-)-limoneno.

O óleo essencial de pau-rosa (A. rosaeodora) apresentou as duas formas enantioméricas

do linalol com pureza enantiomérica de 50,48% de (3R)-(-)-linalol e 49,52% de (3S)-(+)-

linalol. O óleo essencial obtido das sementes de coentro (C. sativum) também apresentou os

dois enantiômeros, mas com excesso enantiomérico 76,08% para o (3S)-(+)-linalol. No óleo

essencial de Ho-Sho (C. camphora), o (3R)-(-)-linalol foi encontrado com 100% de pureza

enantiomérica.

O uso da CG-DIC com coluna enantiosseletiva ( -CD) foi essencial para a realização da

investigação da pureza enantiomérica de linalol, carvona e limoneno nos óleos essenciais,

pois a resolução das misturas racêmicas somente foi possível devido as diferentes interações

dos isômeros ópticos com a fase estacionária quiral.

A indisponibilidade comercial do padrão (3S)-(+)-linalol enantiomericamente puro, nos

impulsionou a realizar o seu isolamento do óleo essencial de L. alba (quimiotipo linalol) por

meio da CCDP. Essa técnica de separação foi utilizada devido a sua simplicidade, além de

baixo consumo de solventes, menor dispêndio de tempo e fácil manuseio da aparelhagem.

Como um dos objetivos deste trabalho foi quantificar os componentes quirais (linalol,

carvona e limoneno) dos óleos essenciais, optou-se por realizar a análise quantitativa pelo

método de padrão interno.

87

7 PERSPECTIVAS DO TRABALHO

Investigar a pureza enantiomérica e quantificar por CG-DIC utilizando o método do

padrão interno e/ou padrão externo os compostos β-citronelol, β-citronelal, cânfora,

canfeno, α-pineno, β-pineno, cis- e trans-óxido de linalol, mentol, iso-mentona entre

outros, desde que sejam majoritários, que estão presentes em óleos essenciais de espécies

vegetais cultivadas no Campus Rural da UFS.

Comparar a eficiência dos métodos de extração por hidrodestilação e por headspace sobre

a distribuição enantiomérica dos compostos carvona, limoneno, linalol entre outros

presentes nos óleos essenciais das espécies L. alba, O. basilicum, P. graveolens entre

outras cultivadas no Campus Rural da UFS.

Isolar os constituintes majoritários dos óleos essências de espécies vegetais cultivadas no

Campus Rural da UFS por cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) e

encaminhar para a avaliação de atividades farmacológicas.

88

8 REFERÊNCIAS

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