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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DISSERTAÇÃO DE MESTRADO IRIDÓIDES GLICOSILADOS DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA (MILL.) N.E. BROWN (VERBENACEAE): OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E BIOATIVIDADE JOSE GUEDES DE SENA FILHO RECIFE, 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
IRIDÓIDES GLICOSILADOS DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA (MILL.) N.E.
BROWN (VERBENACEAE): OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E
BIOATIVIDADE
JOSE GUEDES DE SENA FILHO
RECIFE, 2007
José Guedes de Sena Filho
IRIDÓIDES GLICOSILADOS DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA (MILL.) N.E.
BROWN (VERBENACEAE): OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E
BIOATIVIDADE
Orientador: Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier
Recife-PE, 2007
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, do Departamento de Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas na Área de Química de Produtos Naturais.
Sena Filho, José Guedes de
Iridóides glicosilados das raízes de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Verbenaceae): obtenção, caracterização e bioatividade / José Guedes de Sena Filho. – Recife : O Autor, 2007.
61 folhas : il., fig., tab., gráf. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2007. Inclui bibliografia e apêndice. 1. Iridóides glicosilados – Lippia alba. 2. Iridóides
glicosilados – Bioatividade. I. Título.
615.322 CDU (2.ed.) UFPE 615.321 CDD (22.ed.) CCS2007-07
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITOR
Amaro Henrique Pessoa Lins
VICE-REITOR
Gilson Edmar Gonçalves e Silva
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Celso Pinto de Melo
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
José Thadeu Pinheiro
VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Jane Sheila Higino
VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Samuel Daniel de Sousa
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Pedro José Rolim Neto
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Beate Saegesser Santos
A minha esposa Veruschka Esther
Leal Maranhão Guedes de Sena
Dedico
“One of the great achievements of chemistry has been to show that
all the matter in the world, be it a lump of rock, a glass of water,
an ostrich feather, or a tree, is built from no more than a hundred
or so simple substances called chemical elements”
Peter Atkins
AGRADECIMENTOS
A Deus, em primeiro lugar, por ter me dado a oportunidade de realizar este
trabalho.
A minha mãe Eronides Apolinário pelo intenso apoio em todos os sentidos, ao
meu Pai José Guedes de Sena e aos meus irmãos Victor e Danillo Apolinário.
Ao significado da palavra Orientar, agradeço de forma honrosa ao meu
orientador Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier por tudo.
Aos tios que me apoiaram nessa caminhada, principalmente Tio Romildo, Tia
Penha, Tia Iraíde, Tio Zé Canela (i.m.), Tio Arimatéia, Tia Aparecida, Tia Lurdes
(i.m.) e aos primos: Deise, Romeu, Flávia, Júlio, Neto, Camilla e Juliana Apolinário,
Nathalie Sena.
AOS AMIGOS
Ademário, Clébio, Cristiane, Elis, Elis Pena, Evani Araújo, Flávio Valadares,
Janaína, Jaqueline, Jovita Braga, Teógenes, Karina Randau, Késia Pontual, Laurimar,
Luciana Ramos, Marcos e Vandessa.
À Hildegard Wehner pela longa amizade e colaboração na língua germânica.
A Daniel Uchôa, da Universidade do Ceará.
À Drª. Jennifer Duringer da Oregon State Universtity-USA.
AOS PROFESSORES
Prof. Dra. Ivone Antônia de Souza; Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho;
Prof. Dr. Raimundo Brás Filho; Prof. Dra.Valdênia Costa
INSTITUIÇÕES
Universidade Federal de Pernambuco - UFPE
Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária – IPA
Universidade Federal da Paraíba – UFPB
Universidade Federal do Ceará - UFCE
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF
Oregon State University - USA
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES,
A todos que contribuíram para conclusão deste trabalho OBRIGADO!
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE GRÁFICOS
RESUMO
ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO
15
2. OBJETIVOS
22
2.1. GERAL
22
2.2. ESPECÍFICOS
22
3.0 CAPÍTULO I: ESTUDO FITOQUIMICO DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA
23
3.1 MATERIAL VEGETAL
23
3.2 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS
23
3.3 DROGAS E REAGENTES UTILIZADOS
24
3.4 EQUIPAMENTOS
25
3.5 OUTROS
26
3.6 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA (Perfil Fitoquímico)
26
3.6.1 Metodologia Utilizada
26
3.6.2 Resultados do Perfil Fitoquímico
28
3.7 CARACTERIZAÇÃO DOS TERPENOS NAS FOLHAS E RAÍZES
28
3.7.1 Análise Cromatográfica (CG/EM)
28
3.7.2 Identificação dos Compostos Químicos
28
3.7.3 Resultados dos terpenos pelo cromatógrafo a gás
28
3.7.3.1 Análise da Quimiotipia 31
3.7.3.2 Análise das raízes
33
3.8 EXTRAÇÃO E ISOLAMENTO METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
34
3.9 ANÁLISE ESPECTROMÉTRICA DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS
37
3.9.1 Estrutura do Composto Lp1, Lp2 e Lp3
37
4.0 CAPÍTULO II: AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50 DO EAQ
40
4.1 METODOLOGIA
40
4.2 RESULTADOS
41
4.2.1 Avaliação da Toxicidade Aguda e Determinação da DL50 do EAQ
41
5.0 CAPITULO III: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA
46
5.1 MATERIAIS E MÉTODOS
46
5.1.1 Microorganismos Utilizados
46
5.1.2 Técnica de Difusão em poços
46
5.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO
46
6.0 CAPITULO IV: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E IMUNOREGULADORA
49
6.1 INTRODUÇÃO
49
6.2 METODOLOGIA
49
6.2.1 Animais
49
6.2.2 Edema de pata induzido por carragenina
50
6.2.3 Tratamento dos animais
50
6.2.4 Procedimentos para Preparação dos produtos de peroxidação do iridóide
50
6.2.5 Obtenção de sobrenadantes de culturas de células de baço para dosagem de citocinas e óxido nítrico
51
6.2.6 Ensaios para dosagem de citocinas e óxido nítrico
52
6.3 RESULTADOS
54
7.0 CONCLUSÃO
55
8.0 REFERÊNCIAS 56
LISTA DE ABREVIATURAS
(-) – Negativo (+) – Positivo ATCC- American Type Culture Collection 2D – Segunda dimensão AcOEt – Acetato de etila AcOH – Ácido acético CCD – Cromatografia em camada delgada DL50 - dose letal para 50% dos animais EEA – Extrato Acetato de Etila ELISA- Enzyme linked Immunosorbent Assay (ensaio imunoenzimático) EME – Extrato Metanólico CG/EM – cromatógrafo a Gás acoplado com espectro de massa HE – Extrato Hexânico IL- citocinas i.p. – via intraperitoneal IPA – Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária min. – Minuto Me2CO – Acetona MeOH – Metanol RMN – Ressonância magnética nuclear 1H – RMN de hidrogênio 13C – RMN de Carbono 13 s – singleto d – dubleto m – multipleto dl – dubleto longo DMSO-d6 – Dimetilsulfóxido deuterado COSY – Correlated Spectroscopy HMBC – Heteronuclear Multi Bond Correlation HMQC – Heteronuclear Multi Quantun Correlation DEPT – Distortionless Enhacement Polarization Transfer MH- Müller Hinton MIC – Concentração Inibitória Mínima NO- Óxido Nítrico NT- Não testadas ppm – partes por milhão p/v – peso/volume Rf – Fator de Retenção seg. – segundo ss – erro padrão U.V. – Ultravioleta v.o. - Via Oral v/v – volume/volume P< - Intervalo de Confiança uma – Unidade de Massa Atomica PBS- Phosphate buffered saline ( solução tamponada com fosfato) PBST- Solução de Salina tamponada com fosfato a 0,05% de Tween 20 SAB- Soro albumina bovina OBSERVAÇÃO: As abreviaturas utilizadas neste trabalho e que não constam desta relação, encontram-se descritas como convenções adotadas
LISTA DE TABELAS TABELA 1: CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS PARA O SCREENING FITOQUÍMICO .......... 27 TABELA 2: TERPENÓIDES CARACTERIZADOS DAS FOLHAS DE LIPPIA ALBA ATRAVÉS DE
GC-MS.......................................................................................................................................... 30 TABELA 3:TERPENÓIDES CARACTERIZADOS DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA ATRAVÉS DO
GC-MS.......................................................................................................................................... 31 TABLE 4: HMQC E HMBC DO THEVIRIDOSÍDEO ISOLADO....................................................... 38 TABELA 5: HMBC DO GARDOSÍDEO E MUSSAENOSÍDEO ISOLADO...................................... 39 TABELA 6: EFEITOS TOXICOLÓGICOS RELACIONADOS ÀS DOSES ADMINISTRADAS NA
FASE PRELIMINAR DA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50........................................................................................................................................ 42
TABELA 7: EFEITOS TOXICOLÓGICOS RELACIONADOS ÀS DOSES ADMINISTRADAS NA
FASE DEFINITIVA DA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50. ............................................................................................................................................. 43
TABELA 8: RELAÇÃO LETALIDADE E DOSE ADMINISTRADA NA FASE PRELIMINAR DA
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50. .......................... 44 TABLE 9: RELAÇÃO LETALIDADE E DOSE ADMINISTRADA NA FASE DEFINITIVA DA
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50. .......................... 44 TABELA 10: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS ACETATO DE ETILA,
METANOL E ÁGUA DE L. ALBA .............................................................................................. 47 TABELA 11:CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (MIC) EXIBIDA PELOS EXTRATOS
EEA E EME.................................................................................................................................. 48
Lista de Figuras
FIGURA 1: IRIDODIAL E IRIDOMIMERCINA................................................................................. 15 FIGURA 2 - ESTRUTURA DO PLUMIERÍDEO................................................................................ 16 FIGURA 3 - ORGANOGRAMA REPRESENTANDO AS DIVISÕES DOS IRIDÓIDES EM
RELAÇÃO AO NÚMERO DE ÁTOMOS DE CARBONO. ....................................................... 16 FIGURE 4 - ESTRUTURA DA NEPETALACTONA (I) E DO NEPETALACTOL (II).................... 17 FIGURA 5 - INFLORESCÊNCIAS DE LIPPIA ALBA (MILL.) N.E. BROWN.................................. 18 FIGURA 6 - INFLORESCÊNCIA JOVEM E INFLORESCÊNCIA ADULTA COM BRÁCTEAS EM
LIPPIA ALBA................................................................................................................................ 19 FIGURA 7 - HABITAT DA LIPPIA ALBA .......................................................................................... 20 FIGURA 8 - REPRODUÇÃO DAS PARTES AÉREAS DE LIPPIA ALBA (MILL.) N. E. BROWN.21 FIGURA 9 - ORGANOGRAMA DO MÉTODO EXTRATIVO........................................................... 24 FIGURA 10 - PRINCIPAIS CONSTITUINTES VOLÁTEIS DAS FOLHAS DA ESPÉCIE EM
ESTUDO....................................................................................................................................... 32 FIGURA 11- PRINCIPAIS CONSTITUINTES VOLÁTEIS DAS RAÍZES DA ESPÉCIE EM
ESTUDO....................................................................................................................................... 33 FIGURA 12: CROMATOGRAMAS DE FRAÇÕES DA COLUNA EM SÍLICA, UTILIZANDO
ACOET E MEOH (80:20) COMO ELUENTE............................................................................. 35 FIGURA 13:CROMATOGRAMA CONTENDO OS 3 IRIDÓIDES ISOLADOS ............................... 36 FIGURA 14: THEVIRIDOSÍDEO (I) E PADRÃO DE RHAMNOSE E GALACTOSE (II) ............... 36 FIGURA 15 - ESTRUTURA QUÍMICA DO THEVIRIDOSÍDEO (I) ................................................. 38 FIGURA 16 - ESTRUTURA QUÍMICA DO GARDOSÍDEO (II) E MUSSAENOSÍDEO (III)
RESPECTIVAMENTE................................................................................................................. 39 FIGURA 17: CURVA DOSE-RESPOSTA DA TOXICIDADE DO EXTRATO AQUOSO DE LIPPIA
ALBA (MILL.) N.E. BROWN. ..................................................................................................... 45 FIGURA 18: TRATAMENTO COM O METAPERIODATO: O PONTO 1 THEVIRIDOSIDEO
ISOLADO, O PONTO 2 CORRESPONDE A FRAÇÃO ACETÔNICA E O PONTO 3 A FRAÇÃO AQUOSA DA COLUNA EM CARVÃO ATIVADO.....................................................................................................................................51
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1: ENSAIO DE TESTE IN VIVO, ATRAVÉS DE EDEMA DE PATA DE RATO, POR
CARRAGENINA 1 % IP, COM P< 0,05 QUANDO COMPARADOS AO GRUPO CONTROLE. ................................................................................................................................ 53
RESUMO
O presente trabalho tem como foco a obtenção, caracterização e determinação da
bioatividade dos iridóides glicosilados presentes nas raízes de Lippia alba (Mill.) N.
E. Brown, bem como a averiguação da quimiotipia da espécie em estudo. Trata-se de
uma planta com marcante aplicação na medicina tradicional de nosso país onde é
conhecida por “erva-cidreira”, “chá-do-tabuleiro”, “erva-cidreira-de-arbusto”,
“alecrim-selvagem”, “cidreira-brava” entre outros. De suas raízes foram isolados e
caracterizados 3 iridóides: theviridosídeo, mussaenosídeo e gardosídeo, sendo o
primeiro e o segundo descritos pela primeira vez nas raízes e o terceiro pela primeira
vez no gênero. A quimiotipia foi definida como citralífera (19,08%), contudo a
presença de cis-verbenol, também em razoável concentração (9,73%), induz a se
pensar como uma nova variante para esse quimiotipo. Em adição, a análise dos
terpenos menores das raízes (CG/EM) revelou a existência de: limoneno, carvona, o
éster metílico do ácido hexadecanóico e patchoulano, ainda sem registros literários. O
extrato aquoso (EAQ) não apresentou atividade antimicrobiana. A DL50 encontrada
foi de 1156,25 mg.kg-1, onde foi observada intensas contorções abdominais, excreção
fecal e movimento estereotipado. O extrato acetato de etila (EEA) e o extrato
metanólico (EME) apresentaram resultados discretos contra os microorganismos:
Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e
Klebsiella pneumonia (ATCC 10031). O EAQ e o theviridosídeo foram observados
no teste de carragenina a 1%, onde apresentou dados estatisticamente significativos
com 77,90% (p<0,05) de inibição, quando comparado com o controle.
Preliminarmente, a capacidade imunorreguladora de tais iridóides e produtos de sua
peroxidação foi testada pela estimulação, in vitro, de células esplênicas murinas. Na
dose de 100 μg/mL, estes compostos não foram capazes induzir a produção de IL-2,
IFN-γ, IL-4, IL-10 ou óxido nítrico por estas células linfóides.
Palavras-chave: Lippia alba, Verbenaceae, iridóides glicosilados, quimiotipos,
ABSTRACT The present work focuses the isolation, characterization and bioactivity, of iridoids
glucosides from the roots of Lippia alba (Mill.) N. E. Brown, as well as the chemotype
evaluation. It’s a notable plant in the traditional medicine in our country, where it is
known as “erva-cidreira”, “chá-do-tabuleiro”, “erva-cidreira-de-arbusto”, “alecrim-
selvagem”, “cidreira-brava” and others. It was isolated and characterized 3 iridoids:
theviridoside, mussaenoside e gardoside from the roots of such plant. The fists two are
being described in the literature, for the first time in the roots, the third one for the first
time in the Lippia genus. The chemotype was defined as “citralífera” due to major
compound found citral (19.08%), therefore the presence of cis-verbenol in high
concentration (9.73%) could be associated in a new derivate of this chemotype. In
addition, the analyses of the minor terpenes from the roots (GC/MS) afford the existence
of: limonene, carvone, 9-hexadecenoic acid methyl ester, and patchoulene, without
literature data base. The Aqueous Extract (EAQ) did not present antimicrobial activity.
The LD50 was 1156 mg/kg, moreover were observed fecal excretion, abdomens
contortions and others. The ethyl acetate (EEA) and methanolic extract (EME) were
modest against the microorganism tested: Staphylococcus aureus (ATCC 6538P),
Staphylococcus aureus (ATCC 6538) and Klebsiella pneumonia (ATCC 10031). The
EAQ and theviridoside were tested by carrageenan – induced rats paw edema, in which
presented 77.90% (p<0.05) of inhibition comparable with the control. The immunologic
evaluation in vitro front of 4 cytokines (IL-4, IL-10, IFN-g and IL-2) and nitric oxide
were tested in theviridoside and its periodate oxidation product. Any stimulation of those
cytokines weren’t observed in both substances, by linphoids cell.
Key words: Lippia alba, Verbenaceae, iridoids glucoside, chemotype
15
1 INTRODUÇÃO
Iridóides glicosilados são produtos do metabolismo secundário de alguns
grupos vegetais e suas agliconas monoterpênicas são invariavelmente oxigenadas, com
uma característica fusão do anel ciclopentapirano (COSSY, 1989; HARBORNE, 1998).
Eles derivam formalmente do iridoidial, substância que ao lado da iridomirmecina (Figura
1) foram pela primeira vez descritos no final do século XIX na secreção de defesa da
formiga australiana Iridomyrmex detectus. Somente a partir de 1958, com os trabalhos de
O. Halpern e H. Schmid sobre a estrutura do plumierídio (Figura 2), foi que o esqueleto
molecular dos iridóides começou a ser mais compreendido (El-NAGGAR, 1980).
Figura 1: Iridodial e Iridomirmecina
Originalmente este grupo de substâncias era chamado de pseudoindican, uma
alusão ao glicosídeo precursor do índigo e existente em alguns representantes de
Indigofera (Fabaceae). De fato sob a influência de ácidos ou enzimas agliconas de
iridóides sofrem condensações originando derivados coloridos (El-NAGGAR, 1980;
HEGNAUER, 1973).
Di-aldeído Enol-hemiacetálico iridomirmecina
16
O
O O
O
O
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
CH3
CH3H
H
H
H
Figura 2 - Estrutura do plumierídeo
De acordo com número de átomos de Carbono a estrutura fundamental dos
iridóides pode ser dividida em C10-iridóides, C9-iridoides e C8 iridóides. O
organograma da Figura 3 resume as principais divisões estruturais dos iridóides
(SANTOS, 2001).
Figura 3 - Organograma representando as divisões dos iridóides em relação ao número de átomos de
carbono.
Iridóides
C-10 iridóides
C-9 iridóides (perda do C-10 ou
do C-11)
C-8 (perda do C-10 e do
C-11)
8-β-C-iridóides
8-α-C-iridóides
(8-epi-série)
17
Iridóides, por serem amargos ou venenosos, desempenham no vegetal um
papel de proteção contra predadores, principalmente herbívoros (HEGNAUER,
KOOIMAN, 1978). Algumas aplicabilidades foram descobertas com iridóides como, por
exemplo: a nepetalactona (Figura 4) nos Estados Unidos encontrou duas aplicações, a
primeira no desenvolvimento de brinquedos para gatos domésticos (Felix catus) a
segunda incorporada à isca para a caça ao puma (Felix concolor). Encontradas na
Lamiaceae Nepeta cataria L.∗ (BEAUPIN, 1978), algumas agliconas de iridóides têm se
mostrado importantes agentes de sinalização sensoriais para diversas espécies de insetos,
como por exemplo, o feromônio de atração sexual de Megoura viciae, inseto onde os
machos liberam para atração das fêmeas uma mistura de Nepetalactona e Nepetalactol∗∗
(DAWSON et al., 1987).
O
O
CH3
CH3
I
O
CH3
CH3 OH
II Figura 4 - Estrutura da Nepetalactona (I) e do Nepetalactol (II)
Inúmeras publicações demonstram as propriedades biológicas presente nos
iridóides como: antiviral, antimicrobiana, antitumoral, hemodinâmica, colerética,
vasocontrictora, hepatoprotetora e antiinflamatória. (TAKEDA et al., 1980; ISHIGURO
et al., 1988; HOUGHTON et al., 1989; BRESCHI et al., 1992; RECIO et al., 1994;
KAPADIA et al., 1996; BERMEJO et al., 2002).
Nos vegetais os iridóides apresentam uma pronunciada distribuição em
angiospermas notadamente nas Lamiaceae, Verbenaceae, Scrophulariaceae e
Plantaginaceae (HARBORNE, 1998). Sendo não raro, utilizados como marcadores
taxonômicos a níveis de gênero e subgênero (RIMPLER & SAUERBIER, 1986). Dentre
as Verbenaceae brasileiras, a Lippia alba também conhecida como Lippia geminata HBK
ou Lantana alba Mill. (PIO CORREA, 1984), de há muito tem merecido destaque na
∗ Nepeta cataria (Lamiaceae), conhecida na Europa como ervas dos gatos, produz alto teor de nepetalactona (70-90%) em seus óleos essenciais. Nos Estados Unidos e Canadá é conhecida como Catnip. ∗∗ Esse ferohormônio sexual age sinergicamente, pois em ensaios com os compostos isolados não foi demostrada nenhuma atividade.
18
medicina tradicional, onde é conhecida vulgarmente conhecida como erva-cidreira, chá
do tabuleiro, erva-cidreira de arbusto, alecrim-selvagem, cidreira-brava, falsa-melissa,
cidreira-carmelita, salva-do-Brasil, salvia, salva-brava, salsa-limão etc. (BRAGA, 1976;
MATOS, 1996). Empregando-se infusos ou decoctos de suas folhas para o tratamento de
desordens gastrintestinais, disenterias, febre, tosse, asma e como tranqüilizante
(LORENZI, 2002; VALE, 1999).
Como outras espécies de Lippia, trata-se de um planta arbustiva chegando a
atingir até 3 m de altura (STASHENKO, 2004), possue caule e ramos primários, longos,
quadrangulares, ascendentes, pubescentes, folhas pecioladas, alternas ou opostas; flores
pequenas; cálice curto pubescente e bipartido; corola violácea com lábio inferior maior
que superior; fruto são drupas globosas de cor róseo-arroxeada; sementes pequenas de
distribuição pantropical (CAMARGO, 1998; LORENZI, 2002). As inflorescências em
Lippia são complexas, do tipo politélico (Figuras 5 e 6). São espigas bracteoladas,
cilíndricas e na maioria das espécies capituliformes, como ocorre na espécie em estudo.
Figura 5 - Inflorescências de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown. ( Foto: Jose Guedes de Sena
Filho, 2006)
As flores são desprovidas de bractéolas. As brácteas geralmente são planas e
dispostas em várias séries (Figuras 7 e 8). Na secção Goniostachyum são côncavas e
imbricado-decusadas, às vezes, soldadas entre si. Na maioria dos casos são verdes e
menores que as flores, enquanto na secção Rhodolippia são rosadas e maior que as flores
(DE ROMERO, 1998).
19
Figura 6 - Inflorescência jovem e inflorescência adulta com brácteas em Lippia alba. (Foto:
Jose Guedes de Sena Filho, 2006)
Uma grande diversidade tem sido observada na composição dos óleos essenciais
de L. alba, dependendo da parte da planta, o estágio de desenvolvimento, localização
geográfica, característica de solo, clima e outras condições (ALEA, 1996; STASHENKO,
2004). O conteúdo de seus óleos essenciais é bem diversificado ocorrendo, no entanto,
uma certa constância e teor mais pronunciado de alguns compostos presentes, sugerindo-
se a existencia de alguns quimiotipos, separados por seus elementos predominantes: 1,8-
cineol, carvona, diidrocarvona, terpineno, limoneno, citral, cânfora, d,l-limoneno,
piperitona, β-cariofileno e linalol (TAVARES, 2005).
A atividade antiulcerogênica do extrato aquoso das partes aéreas da L. alba
resultou em uma inibição de 76,98%, com intervalo de confiança de 97% (p < 0,01), mas
não modificou o pH gástrico e acidez total, onde a ranitidina utilizada como padrão reduz
significativamente estes parâmetros (PASCUAL, 2001).
Revisando a literatura pertinente, observamos que predominantemente as partes
aéreas sempre foram muito empregadas seja do ponto vista da utilização popular seja do
ponto de vista de estudo científicos. Havendo uma grande vacância no tocante as raízes.
20
Figura 7 - Habitat da Lippia alba. (Foto: Jose Guedes de Sena Filho, 2006)
21
Figura 8 - Reprodução das partes aéreas de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown, Onde A: aspecto geral
do ramo florido; B: folha; C: botão floral; D: inflorescência; E: brácteas adultas; F: corola.
22
2. OBJETIVOS
2.1 GERAL
Efetuar o estudo fitoquímico das raízes Lippia alba (Mill.) N.E. Brown, bem
como a bioatividade de extratos obtidos com solventes de polaridades diferentes e de
moléculas isoladas.
2.2 ESPECÍFICOS
Efetuar uma prospecção fitoquímica de extratos (diferentes polaridades) da raiz,
evidenciando os principais grupos de substâncias presentes;
Determinar a quimiotipia da espécie em estudo. Extrair, isolar e purificar
metabólitos secundários das raízes espécie em estudo;
Caracterizar estruturalmente os metabólitos secundários isolados;
Averiguar a toxicidade aguda, através do teste de efeitos gerais e determinar a
DL50 do resíduo de extrato bruto aquoso das raízes do vegetal;
Avaliar a atividade antimicrobiana de extratos brutos de diversas polaridas das
raízes de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown.
Avaliar a atividade antiinflamatória do extrato bruto aquoso das raízes de Lippia
alba e de componentes majoritário na referida espécie.
Analisar a estimulação das citocinas (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN) através de ELISA e
Óxido nítrico (NO) pelo método Griess em células esplênicas murinas.
23
3. CAPÍTULO I
ESTUDO FITOQUÍMICO DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA
3.1 MATERIAL VEGETAL
Os materiais vegetais utilizados nos estudos farmacoquímicos (folhas e raízes de
Lippia alba) foram coletados em janeiro de 2005, no município de Timbaúba, Zona da
Mata Norte (7º35’S; 35º22’W), Estado de Pernambuco, de exemplares em plena
floração.
Após a coleta, parte do material foi destinada à preparação da exsicata,
identificada pela Profa. Dra. Rita de Cássia Pereira curadoura do herbário Dárdano de
Andrade Lima, da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária – IPA, onde um
exemplar encontra-se depositado sob o número 70003.
3.2 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS
Raízes trituradas (62,76 g), foram submetidas a extração por maceração 48 h com
aumento progressivo de polaridade, empregando-se n-Hexâno (HE), Acetato de Etila
(EEA), Metanol (EME) e Água destilada (EAQ), obtendo-se os respectivos extratos e
rendimentos HE (1,6%), EEA (1,44%), EME (2,24%) e EAQ (3,22%). Os Solventes
foram eliminados a vácuo (Figura 9).
24
Figura 9 - Organograma do método extrativo
3.3 DROGAS E REAGENTES UTILIZADOS
♦ Ácido gálico P.A. (MERCK)
♦ β - Amirina P.A. (MERCK)
♦ β - Sitosterol P.A. (MERCK)
♦ Glicose (MERCK)
♦ Galactose (MERCK)
♦ Rhamnose (MERCK)
♦ Acetato de etila P.A. (MERCK)
♦ Acetona P.A. (REAGEN)
♦ Ácido acético P.A. (MERCK)
♦ Ácido clorídrico P.A. (REAGEN)
♦ Ácido fórmico P.A. (MERCK)
♦ Ácido sulfúrico P.A. (MERCK)
♦ Água destilada P.A. (MERCK)
DESPRESADO
25
♦ N-Hexano P.A (MERCK)
♦ Propanol P. A. (MERCK)
♦ Anidrido acético P.A. (MERCK)
♦ Anisaldeído (FLUKA)
♦ Benzeno P.A. (MERCK)
♦ Butanol P.A. (MERCK)
♦ Cloreto de 2,3,5, trifeniltetrazólio P.A. (MERCK)
♦ Clorofórmio P.A. (MERCK)
♦ D (+) – glicose P.A. (MERCK)
♦ Difenil Boriloxietilamina P.A. (FLUKA)
♦ Éter P.A. (MERCK)
♦ Formol P.A. (MERCK)
♦ Metanol P.A. (MERCK);
♦ Saponina (MERCK)
♦ Tampão fosfato pH = 5 P.A. (MERCK);
♦ Tolueno P.A. (MERCK);
♦ Vanilina P.A. (CARLO ERBA);
♦ Metaperiodato de Sódio (MERCK)
♦ (-) catequina
3.4 EQUIPAMENTOS
♦ Balança eletrônica semi-analítica GEHAKA mod. BG 1000;
♦ Balança analítica GEHAKA mod.
♦ Bomba de vácuo;
♦ Câmara fotográfica Nikon Coolpix 7900;
♦ Câmara fotográfica Nikon SLR D50
♦ Câmara Ultra-violeta (250 - 365 nm) CHOMATO VUE;
♦ Espectrofotômetro de ressonância BRUKER (DRX 500) 13C RMN (125 MHz);
♦ Espectrofotômetro de ressonância Varian Unity Plus 300 13C RMN (75 MHz);
♦ Espectrofotômetro de ressonância BRUKER (DRX 500) 1HRMN (500 MHz);
26
♦ Espectrofotômetro de ressonância Varian Unity Plus 300 1H RMN (300MHz);
♦ Estufa Precision Thelco Model 18;
♦ Multiprocessador ARNO;
♦ Rotavapor BUCHI INSTRUMENTS 5060 – CV.
3.5 OUTROS
♦ Borrifadores para revelação em CCD;
♦ Colunas cromatográficas;
♦ Cubas cromatográficas para CCD;
♦ Filmagem digital (Nikon Coolpix 7900);
♦ Gel de sílica 70 – 230 Mesch MERCK;
♦ Placas cromatográficas MERCK Art. 015533;
♦ Sephadex LH-20, Pharmacia Chemicals;
♦ Tubos de ensaio;
♦ Capilares de 5 e 10 µL
3.6 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA (Perfil Fitoquímico) 3.6.1 Metodologia Utilizada
Aplicaram-se alíquotas de 10 μL de EEA, EME e EAQ em diversas placas
cromatográficas prontas de gel de sílica (Merck-Alemanha, art. 105554), empregando-se
para obtenção dos cromatogramas diferentes fases móveis e reagentes adequados à
caracterização das classes de substâncias a serem pesquisadas (ver Tabela 1). Esta
prospecção fitoquímica coloca em evidência os principais tipos de metabólitos
secundários: alcalóides, terpenóides (monoterpenóides, sesquiterpenóides, diterpenóides,
triterpenóides, esteróides, iridóides e saponósidos), polifenóis (cumarinas, derivados
cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos, flavonóides, proantocianidinas e taninos gálicos) e
açúcares redutores.
27
Tabela 1: Condições Cromatográficas para o Screening Fitoquímico
Alcalóides A
Monoterpenos,
Sesquiterpenos e diterpenos B
Triterpenos / esteróides C
Iridóides A
Saponinas A
Açúcares D
Cumarinas E
Ácido gálico A
Flavonóides A
Fenilpropanoglicosídeos A
Proantocianidinas condensadas, A
leucoantocianidinas
Taninos gálicos A
Dragendorff
Vanilina sulfúrica
Lieberman / Burchard
Vanilina sulfúrica
Anisaldeído
2,3,5 Trifeniltetrazólio
(cloreto)
UV
Alumén de ferro 1%
Difenil borinato de 2
aminoetila
Difenil borinato de 2
aminoetila
Vanilina clorídrica
Alumén de ferro 1%
(WAGNER & BLADT,
1996)
(WAGNER & BLADT,
1996)
(HARBORNE, 1998)
(WAGNER & BLADT,
1996)
(WAGNER & BLADT,
1996)
(WALLENFELS, 1950)
(WAGNER & BLADT,
1996)
(STIASY, 1911)
(MARKHAN, 1982)
(NEU, 1956)
(WAGNER & BLADT,
1996)
(ROBERTSON , 1955)
(STIASY, 1911)
A-AcOEt – HCOOH – AcOH – H2O (100 : 11 : 11 : 26 v/v)
B-Benzeno – AcOEt (97: 3 v/v)
C- EtOAc – HCOOH – AcOH – H2O (100 : 0,5 : 0,5 : 0,5 v/v)
D- n-BuOH-Me2CO-Tampão fosfato pH = 5,0 (40 : 50 : 10 v/v)
E- Et2O-tolueno-AcOH 10 % (50 : 50 : 50 v/v)
28
3.6.2 Resultados do Perfil Fitoquímico
Foi detectada a presença de terpenos, iridóides, fenilpropanoglicosídeos e
açúcares, em contrapartida não foi evidenciada a presença de cumarinas, acido gálico,
proantocianidinas, leucoantocianidinas, saponinas, flavonóides e alcalóides.
3.7 CARACTERIZAÇÃO DOS TERPENOS NAS FOLHAS E RAÍZES
Alíquotas de 100 mg dos extratos hexânicos das folhas e das raízes foram
caracterizadas por cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrômetro de massas
(CG/EM), a fim de determinar a quimiotipia da referida espécie, bem como averiguar os
terpenos encontrados nas raízes e folhas, através do Perfil Fitoquímico (Tabela 2).
3.7.1 Análise Cromatográfica (CG/EM)
O resíduo do extrato hexânico das folhas (0,5 g) e raízes (0,5 g) foram
reconstituídos com 0,5 mL de diclorometano e passada através de uma siringa-filtro de
teflon (13 mm 0.22 micron) antes da injeção no cromatógrafo. A análise foi realizada
utilizando-se um aparelho Perkin Elmer AutoSystem XL GS, equipado com uma auto-
amostra e com um injetor split-splitless, acoplado com uma coluna capilar PE-5MS em
sílica fundida, contendo 5% de difenil e 95% de dimetilpolisiloxano (30 m x 0,25 mm),
empregando-se a seguinte programação: 60 ºC durante 5.00 min, 60-280 ºC por 4 ºC/min,
usando-se Hélio como gás carreador (0.8 ml/min). A temperatura do injetor foi de 220 ºC.
As amostras (2 µl) foram injetadas usando um injetor PSSI na razão de Split (1:10). As
condições do MS foram desenvolvidas através de um TurboMass Perkin Elmer com um
espectrômetro de massa atualizado. A temperatura de interface foi de 200 ºC, fonte de ion
70 eV, faixa de scaner de 1.6 scans/seg e a faixa de massas de 50 a 400 uma.
3.7.2 Identificação dos Compostos Químicos
Dados qualitativos foram obtidos utilizando um TurboMass 5.1 com um
programa de software (Perkin Elmer) e uma bilbioteca (Wiley NIST/EPA/NIH Mass
29
Spectral) como base de dados 2005. Identificação dos componentes químicos foi efetuada
pelo computador e correlacionada com a base de dados do espectro do banco de dados.
3.7.3 Resultados dos terpenos pelo cromatógrafo a gás
A Tabela 2 descreve os terpenos encontrados nas folhas da espécie em estudo,
enquanto a Tabela 3 os terpenos encontrados nas raízes.
30
Tabela 2: Terpenóides caracterizados das folhas de Lippia alba através de CG-EM
Tempo de
retenção
Índice de Kovats*
Estimado
Composto Área Porcentagem (%)
3.157 915 ciclogeraniolano 238915 0.138467
3.388 903 1,2,4-trimetil ciclohexano 278460 0.161386
5.772 1020 mesitileno 2662729 1.543227
6.003 1006 o-etil tolueno 472776 0.274005
6.307 1013 psi-limoneno 1508642 0.874358
6.454 1020 hemimelliteno 5817182 3.371441
7.567 1018 d-limoneno 3715700 2.153493
7.693 1079 butilciclohexano 2933456 1.700131
8.491 1445 propionato de carveol 2700555 1.56515
10.644 1085 cis-sabinol 1416061 0.820701
11.988 1133 dureno 1833460 1.062611
15.012 937 Isocamphano 213770 0.123894
15.757 1136 cis-verbenol 16791648 9.731869
15.957 1190 carvol, carvone 6895926 3.996644
16.293 1228 Cis-geraniol 578270 0.335146
17.049 1174 citral 32923910 19.08158
20.535 1342 acido nérico 930532 0.539305
23.779 1339 β-cubebeno 296619 0.17191
24.903 1440 β-farneseno 180309 0.104501
24.987 1386 (+)-Aromadendreno 386393 0.22394
25.879 1515 germacreno D 4180741 2.423015
26.184 1469 β-Eudesmeno, β-Selinino 628726 0.364388
26.488 1461 Τ-Gurjuneno 325378 0.188578
26.646 1440 α-Muuroleno 174458 0.10111
26.940 1560 Limoneno-6-ol, pivalato 477670 0.276841
27.192 1228 cis-geraniol 95164 0.055154
27.297 1344 α -cubeneno 588533 0.341094
27.423 1435 γ-cadineno 117872 0.068315
29.848 1507 Óxido de cariofileno 1097148 0.63587
32.589 1380 ledano 64021 0.037104
36.285 1393 patchouleno 281121 0.162928
37.818 4160 spheroidenona 145685 0.084434
* Valores são estimados utilizados da: Wiley NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library 2005.
31
Tabela 3:Terpenóides Caracterizados das raízes de Lippia alba através do CG-EM
Tempo de Retenção
Índice de
Kovats*
Composto área Porcentagem (%)
5.540 1296 benzene, (3,3-dimethyl-4-pentenyl)- 140384 0.717405
5.771 1020 psi-cumeno 272563 1.39288
6.464 1020 hemimeliteno, hemelitol 1288059 6.582376
7.577 1018 limoneno 134412 0.686886
9.142 1119 2-etil-p-xilene 326641 1.669236
9.236 1119 Benzene, 1-etil-2,4-dimetil- 671770 3.43295
9.467 1119 4-etil-m-xileno 947028 4.839603
10.129 1320 farnesano 4444221 22.71133
10.423 2184 retinal 93778 0.479234
10.549 1141 cumeno, m-ethyl 240292 1.227966
11.999 1133 dureno, durol 2678960 13.69031
14.334 1141 p-etil cumeno 102147 0.522002
15.480 1393 patchoulano 1552932 7.935958
15.964 1190 carvol, carvone 1902528 9.722501
16.301 1256 p-mentha-1(7),8(10)-dien-9-ol 141161 0.721376
42.098 1886 éster metílico do
ácido hexadecanóico
3421235 17.48356
* Valores são estimados utilizados da: Wiley NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library 2005.
3.7.3.1 Análise da Quimiotipia
De acordo com os resultados encontrados no CG-EM, os principais
constituintes voláteis das folhas do vegetal em estudo foram: citral, cis-verbenol, carvona
e gemacrene D (Figura 10). De acordo com Matos et al. (1996), foi possível separar os
óleos voláteis de Lippia alba em 3 tipos, sendo o primeiro, caracterizado por teores
elevados de citral e mirceno, o segundo por altos teores de citral e limoneno e o terceiro
tipo por altos teores de carvona e limoneno. Os resultados apresentados nessa análise
encontram-se fora desses 3 tipos, enquanto Julião et al. (2003), classificou de acordo com
o grupo majoritário. Sendo os possíveis por ele apresentado: 1,8-cineol, carvona,
diidrocarvona, g-terpineno, limoneno, citral, cânfora, d,l-limoneno, piperitona, β-
32
cariofileno e linalol, sendo assim a quimiotipia desse vegetal em estudo pode ser
considerada citralífera, ou podendo ser enquadrada como uma variância desse quimiotipo
devido ao segundo grupo majoritário: cis verbenol (9,73%) Figura 10.
O
CH3 CH3
CH3
H
O
CH2
CH3
CH3 OH
CH3
CH3
CH3
CH2
CH3
CH3
CH3 Figura 10 - Principais constituintes voláteis das folhas da espécie em estudo
Citral (19,08%)
Carvona (3,99%) cis-verbenol (9,73%)
Gemacreno D (2,42%)
33
3.7.3.2 Análise das raízes
A pequena aromaticidade das substâncias presentes nas raízes, já expressa o
discreto índices de componentes voláteis em relação às folhas, não constatamos na
literatura nenhuma análise dos componentes voláteis das raízes do vegetal em estudo
Figura 11.
CH3
CH3
CH3
CH3
O
CH2
CH3
CH3
CH2CH3
CH3
Figura 11- Principais constituintes voláteis das raízes da espécie em estudo
Patchoulano
Carvona
Limoneno
34
3.8 EXTRAÇÃO E ISOLAMENTO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
Raízes (308 g) foram extraídas exaustivamente sob infusão metanólica (2 L)
por 12 h, fornecendo 6,98 g de resíduo esverdeado. Uma alíquota deste (2,5 g) foi
dissolvida em MeOH, acrescentado-se o dobro de gel de sílica Merck pra coluna (Gel de
Sílica 60 para coluna cromatográfica), e após eliminação do solvente a vácuo (40 °C) a
mistura foi cromatografada em coluna utilizando-se gel de sílica (Gel de Sílica 60 para
coluna cromatográfica). Sendo esta iniciada com AcOEt como fase móvel, aumentando a
polaridade gradativamente até AcOEt : MeOH. (4 : 1), obtendo-se 132 frações (25 mL)
(Figura 12). Todas as frações foram monitoradas por cromatografia em camada delgada
(placas prontas de gel de sílica Merck, Art. 105553). As frações 60-77 (figuras 12),
contendo duas subtâncias, codificadas como Lp2 e Lp3 foram reunidas e após eliminação
do solvente forneceram 15 mg. As frações 95-110 foram concentradas e
recromatografadas em Sephadex LH-20 (Pharmacia Chemicals) empregando-se EtOH
como fase móvel, obtendo-se 20 frações. As frações 13-18 apresentaram uma única
substância quando analisadas por cromatografia em camada delgada (CCD), após
concentração a vácuo apresentou material cristalino de etanol (55 mg) sendo codificada
como Lp 1.∗
∗ As frações oriundas das colunas cromatográficas foram sempre monitoradas por CCD nas seguintes condições: fase estacionária (placas prontas de gel de sílica Merck, art. 105553; fase móvel: AcOEt – HCOOH – AcOH – H2O (100 : 11 : 11 : 26, v:v).
35
Figura 12: Cromatogramas de frações da coluna em Sílica, utilizando AcOEt e MeOH (80:20) como
eluente.
59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69
70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81
88 89 90 91 92 93 94 95
Lp1
Lp3
Lp2
36
Figura 13 - Cromatograma contendo os 3 iridóides isolados
Figura 14: Theviridoside (1) e padrão de rhamnose e galactose (2)
1 2
Mussaenosídeo
Gardosídeo
Theviridosídeo
37
3.9 ANÁLISE ESPECTROMÉTRICA DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS
3.9.1 Estrutura do Composto Lp1, Lp2 e Lp3
As estruturas dos compostos foram elucidadas, verificando-se suas
caracteristicas cromatográficas e parâmetros espectrais descritos na literatura,
(Phytochemistry v. 30, p. 2401, 1991; Journal of Natural Products v. 48, n.6, p. 957-961,
1985) notadamente os espectros de 1D: 13C-RMN (125 MHz, Bruker DRX-500
espectrômetro), 1H-RMN (500 MHz, Bruker DRX-500 espectrômetro) e 2D: COSY,
HMBC, HMQC, (Tabela 4 e 5), correspondentes as substâncias: Theviridosídeo (I),
Gardosídeo (II) e Mussaenosídeo (III), aqui codificadas como LP1, LP2 e LP3
respectivamente.
A primeira evidencia de que essas substâncias, tratavam-se de iridóides
glicosilados foi a obtenção de cromatogramas com manchas de coloração característica,
quando reveladas com vanilina sulfúrica (HARBONE, 1998) e valores de Rf
correspondentes a substâncias polares (Figura 13). A definição de que se tratavam de
glicosídeos foi efetuada analisando-se um cromatograma de Lp1 (substância disponível
em maior quantidade), procedendo-se a revelação com metaperiodato de sódio –
benzindina (DRYHURST, 1970), reagente que caracteriza essencialmente açúcares
redutores e não redutores, ou polióis contendo hidroxilas vicinais (Figura 14).
38
6'
5' 4'
3'2'
1'10
98
7
6
5
43
21
O
HO O
OH
HO
HOOH
OHOH
O OMe11
Figura 15 - Estrutura química do Theviridosídeo (I)
Table 4: HMQC e HMBC do Theviridosídeo isolado em DMSO-d6 a 500 MHz
HMQC HMBC δC δH 2JCH 3JCH
C 4 114.05 - H-3 HO-5 5 74.75 - HO-5; H-9 H-1; H-3 8 141.50 - H-9 H-1; HO-10 11 165.97 - H-3; MeO-11 CH 1 95.90 5.29 (d, 6.3) H-9 H-1’; H-3 3 153.66 7.41 (s) 7 124.07 5.60 (dl) H-9 9 56.03 2.77 (dl, 6.3) HO-5; H-7
CH2 6 45.32 2.69 (sl) HO-5 10 59.29 4.07 (dl, 14.7)
3.92 (dl, 14.7) HO-10
GLICOSE
MeO-11 50.85 3.65 (s) HO-5 - 4.65 (s) HO-10 - 4.75 (t, 5.4) CH-1’ 98.26 4.46 (d, 7.8) H-1; HO-2’ CH-2’ 73.13 2.98 (m) HO-2’; H-3’ HO-3’ CH-3’ 76.25 3.17 (m) H-2’; HO-3’ HO-2’; HO-4’ CH-4’ 69.95 3.06 (m) H-3’ CH-5’ 77.31 3.11 (m) H-4’ HO-4’ CH2-6’ 60.91 3.66 (m)
3.43 (m) HO-6’ H-4’
HO-2’ - 5.11 (d, 4.7) HO-3’ - 4.90 (d, 5.1) HO-4’ - 4.90 (d, 5.1) HO-6’ - 4.51 (t, 5.9)
39
O
OH
O
HOOH
OHOH
COOHH
HO
H2C
O
OH
O
HOOH
OHOH
COOCH3HH
H
HOH3C
Figura 16 - Estrutura química do Gardosídeo (II) e Mussaenosídeo (III)
Tabela 5: HMBC do Gardosídeo e Mussaenosídeo Isolado
Gardoside Mussaenoside δC δΗ δC δΗ
C 4 110.00 - 111.46 5 - - - 8 151.93 - 78.14 11 166.70 - 166.74 CH 1 94.55 5.37 (d, 4.2) 93.54 5.33 (d, 4.5) 3 151.68 7.39 (d, 1.0) 150.25 7.35 (s) 5 29.63 3.10 30.33 3.02 (m) 7 71.43 4.20 - - 9 43.27 2.90 50.47 2.05 (dd, 9.1, 4.5)
CH2 6 29.31 29.31 2.14 (m), 1.29 (m) 7 39.43 1.59 (m), 1.53 (m) 10 110.98 5.24 (sl), 5.20 (s) - -
CH3 10 - - 24.36 1.18 (s)
MeO-11 50.94 3.64 (s) 50.85 3.62 (s) GLICOSE
HO-5 - - - - HO-8 - - - 4.63 (s)
1’ 99.29 98.05 4.48 (d, 7.8) 2’ 73.07 73.11 2.94 (m) 3’ 76.70 76.70 3.14 (m) 4’ 70.07 70.07 3.01 (m) 5’ 77.31 77.30 3.14 (m) 6’ 61.12 61.16 3.68 (m)
3.42 (m) HO-2’ - 4.98 - 4.98 HO-3’ - 4.96 - 4.96 HO-4’ - 4.93 - 4.93 HO-6’ - 4.48 - 4.48
40
4 CAPÍTULO II
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50 DO EAQ 4.1 METODOLOGIA
A avaliação dos efeitos gerais da toxicidade aguda e a determinação da DL50
foram realizadas segundo a metodologia preconizada por Karber e Behrens (1964).
Utilizou-se fêmeas de camundongos albinos Swiss (Mus musculus), com
aproximadamente 60 dias de nascidas e peso entre 25 e 35 g, divididas em grupos de seis
animais (previamente marcadas e pesadas). Os animais foram mantidos em gaiolas de
polipropileno, em condições controladas de iluminação (ciclo 12 horas claro/escuro) e
temperatura de 25 + 2oC, permanecendo sem alimento por um período de 12 horas antes
do experimento e recebendo água ad libitum.
O EAQ, isento de solvente, foi solubilizado em solução fisiológica 0,9% de
NaCl (p/v). O ensaio foi efetuado em duas fases: uma preliminar e outra definitiva. Na
fase preliminar, administraram-se doses crescentes de EAQ para definir a dose mais
elevada isenta de letalidade (D1) e a menor dose capaz de determinar a morte em 100%
dos animais (D2). Os dados obtidos na fase preliminar permitiram delinear a fase
definitiva. Nesta, os animais receberam doses compreendidas entre D1 e D2, seguindo
progressão geométrica de razão 1,2 com o objetivo de se determinar a DL50 (dose letal
para 50% dos animais), todos permaneceram sob observação durante 48 horas.
A administração de EAQ por via intraperitoneal, teve como parâmetros
observados: sinais tóxicos de caráter geral, efeitos sobre a deambulação, reações
comportamentais, alterações da freqüência respiratória, número de óbitos. O grupo
controle recebeu o veículo utilizado na dissolução da substância testada. A partir dos
dados encontrados nas fases preliminar e definitiva, calculou-se a DL50, empregando-se a
fórmula:
41
DL50 = Df - ∑(a . b)
n
Onde:
Df = dose mínima capaz de matar todos os animais
a = diferença entre duas doses consecutivas administradas
b = média de animais mortos entre duas doses consecutivas
n = número de camundongos por lote
4.2 RESULTADOS
4.2.1 Avaliação da Toxicidade Aguda e Determinação da DL50 do EAQ
Nas tabelas 6 e 7 estão relacionadas às doses que apresentaram efeitos mais
significativos durante as fases preliminar e definitiva, respectivamente. As tabelas 8 e 9
demonstram a correlação entre letalidade e dose administrada nestas fases.
42
Tabela 6: Efeitos toxicológicos relacionados às doses administradas na fase preliminar da avaliação
da toxicidade aguda e determinação da DL50.
Ação/Parâmetros 500 (D1) 750 1625 (D2) 1750
Estimulantes ↑ Freqüência respiratória +++ +++ +++ +++ Agitação ++ +++ +++ +++ Piloereção + +++ +++ - Exoftalmia - +++ - ++ Movimentos
estereotipados ++ ++ ++ ++
Movimentos circulares ++ ++ +++ +++ Movimentos de vibrissas ++ +++ - +++ Convulsão clônica - + - ++ Convulsão - - - - Tremores finos/grosseiros + ++ +++ +++ Ereção de cauda +++ +++ +++ +++ Postura de ataque + + ++ + Saltos - - - - Irritabilidade - - - - Levantamento de trem
posterior - - - -
Arrastamento de trem posterior
- - - -
Depressores Abaixamento de trem
posterior +++ + ++ -
Dispnéia - + - - Sonolência - ++ + - ↓Freqüência respiratória + ++ +++ + Prostração - - + + Alteração de marcha - + ++ -
Outros Excreção fecal +++ ++ + ++ Contorções abdominais +++ +++ +++ ++ Reação de fuga +++ +++ +++ +++ Espasmos ++ +++ +++ +++ Elevação de trem anterior +++ - - - Diarréia - - - - Refluxo + ++ - - Palidez - ++ + - Distensão abdominal - - - - Agressividade + + ++ + Diurese + ++ + + Irritação da conjuntiva - - - +++ Espasticidade - ++ - - Cianose - + - + Edema de focinho ++ + - +++ Petéquias - ++ +++ -
Doses (mg.kg-1)
43
- = sem efeito + = efeito leve ++ = efeito moderado +++ = efeito acentuado
Tabela 7: Efeitos toxicológicos relacionados às doses administradas na fase definitiva da avaliação da
toxicidade aguda e determinação da DL50.
Doses (mg.kg-1) Ação/Parâmetros 750 1000 1250 1375 1500
Estimulantes
↑ Freqüência respiratória +++ +++ +++ +++ +++ Agitação +++ +++ +++ +++ +++ Piloereção + +++ +++ +++ ++ Exoftalmia ++ + +++ ++ +++ Movimentos
estereotipados +++ +++ +++ +++ +++
Movimentos circulares +++ +++ +++ +++ +++ Movimentos de vibrissas +++ +++ +++ +++ +++ Convulsão clônica - - ++ + - Convulsão - - - + - Tremores finos/grosseiros +++ +++ +++ +++ ++ Ereção de cauda +++ +++ +++ +++ +++ Postura de ataque + ++ ++ + ++ Saltos + + - - + Irritabilidade - - - - + Levantamento de trem
posterior - - - - -
Arrastamento de trem posterior
- - - + ++
Depressores Abaixamento de trem
posterior ++ - ++ ++ -
Dispnéia + + - +++ ++ Sonolência +++ - - ++ - ↓Freqüência respiratória - +++ - - ++ Prostração - + - - ++ Alteração de marcha - + ++ - -
Outros Excreção fecal + ++ + ++ + Contorções abdominais ++ +++ +++ +++ +++ Reação de fuga +++ +++ +++ +++ +++ Espasmos ++ + +++ ++ ++ Elevação de trem anterior - - - - - Diarréia ++ + - + - Refluxo + - - - + Palidez ++ ++ - + - Distensão abdominal - +++ + - - Agressividade +++ +++ + + ++ Diurese +++ - + - - Irritação da conjuntiva - - - +++ - Espasticidade ++ - - ++ -
44
Cianose - - - - - Edema de focinho - - - + + Petéquias - - - - -
- = sem efeito + = efeito leve ++ = efeito moderado +++ = efeito acentuado
Tabela 8: Relação letalidade e dose administrada na fase preliminar da avaliação da toxicidade aguda
e determinação da DL50.
Doses (mg.kg-1) Mortes até 48 horas
500 0/6
750 1/6
1625 6/6
1750 6/6
Table 9: Relação letalidade e dose administrada na fase definitiva da avaliação da toxicidade aguda e
determinação da DL50.
Doses (mg.kg-1) Mortes até 48 horas
750 1/6
1000 2/6
1250 3/6
1375 5/6
1500 5/6
45
Com uma DL50 calculada em 1156,25 mg.kg-1 de peso do animal, a curva
dose-resposta foi construída a partir dos resultados provenientes do ensaio realizado,
utilizando-se as seguintes doses: 500; 750; 1000; 1250; 1375; 1500 e 1625 mg.kg-1 de
peso do animal. A figura 17 correspondente à curva dose-resposta mostra que doses
acima de 1625 mg.kg-1 foram capazes de matar 100% dos animais.
2,698
2,875
3,000
3,096
3,176
3,210
0102030405060708090
100110
2,600 2,700 2,800 2,900 3,000 3,100 3,200 3,300
Log da Dose
Leta
lidad
e (%
)
Figura 17 - Curva dose-resposta da toxicidade do extrato aquoso de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown.
46
5 CAPÍTULO III
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA
5.1 MATERIAIS E METODOS
5.1.1 Microorganismos Utilizados
Sete espécies de microorganismos de coleção internacional foram analizadas:
Escherichia coli (ATCC 9723), Klebsiella pneumonia (ATCC 10031), Staphylococcus
aureus (ATCC 6538), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Enterococus faecalis
(ATCC 33186), Salmonela sp (ATCC 8387) e Pseudomona aeruginosa (ATCC14502).
5.1.2 Técnica de Difusão em poços
As culturas dos microorganismos foram crescidas em meio agar Müller Hinton
(MH) a 37 ºC. Depois de 18 h de crescimento, cada microorganismo foi dissolvido em
uma solução estéril NaCl 0,9%, até uma concentração de 0,5 na escala de MacFarland,
foram inoculadas na superfície do agar (MH) placas (100 µL). A metodologia utilizada
foi técnica de difusão em poços (IEVEN, 1979; CAETANO, 2002). As placas foram
incubadas a 37 ºC por 24 h, durante esse período, as zonas de inibição dos crescimentos
foram medidas.
Tetraciclina foi utilizada com padrão positivo (1 mg/mL). Todas as determinações
foram realizadas em duplicatas.
5.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO
47
Os extratos EEA e EME apresentaram uma discreta atividade contra
Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e Klebsiella
pneumonia (ATCC 10031) os resultados encontram-se na tabela 10. A concentração
inibitória mínima obtiveram valores em uma faixa de 0.5-2 mg/mL (tabela 11). O EEA
apresentou-se como o melhor resulto o de 0,5 mg/mL contra Staphylococcus aureus
(ATCC 6538).
Em adição, o EAQ não apresentou nenhuma atividade, além disso, a
Cromatografia em Camada Delgada (CCD) deste extrato apresentou a presença dos
iridóides retirando a hipótese de atividade destes compostos. Por outro lado identificou-se
a presença de Terpenóides no EEA, ratificando a atividade dessas moléculas através de
ALEA et al., 1996.
Tabela 10: Atividade Antimicrobiana dos Extratos Acetato de Etila, Metanol e Água de L. alba
Extratos (mg/Ml) Controle positivo
Microorganismos
EEA EME EAQ Tetraciclina 50 100 50 100 50 100
Escherichia coli (ATCC
9723)
-
-
-
-
-
-
25
Klebsiella pneumonia
(ATCC 10031)
-
12
-
-
-
-
25
Staphylococcus aureus (ATCC
6538)
11
13
-
12
-
-
25
Staphylococcus aureus (ATCC
6538P)
12
13
-
13
-
-
25
Enterococcus faecalis (ATCC
33186)
-
-
-
-
-
-
28
Salmonela sp
(ATCC 8387)
-
-
-
-
-
-
23
Pseudomona aeruginosa
(ATCC14502)
NT
NT
NT
NT
- - 19
Diâmetro de zona (mm), (-) negativo; NT: não testadas
48
Tabela 11:Concentração Inibitória Mínima (MIC) exibida pelos extratos EEA e EME.
Microorganismos MIC (mg/mL) EAA EME
Klebsiella pneumonia (ATCC 10031)
>2 >2
Staphylococcus aureus (ATCC 6538)
0,5 2
Staphylococcus aureus (ATCC 6538P)
1 >2
49
6 CAPÍTULO IV
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E IMUNORREGULADORA 6.1 INTRODUÇÃO
O processo inflamatório envolve uma série de eventos caracterizado-se por
inúmeros estímulos (agente infeccioso, isquemia, interação antigeno-anticorpo, injuria
fisica, etc.). A resposta inflamatória ocorre em três fases distintas, cada uma mediada por
mecanismos diferentes. A primeira chamada de fase aguda (fase I) - caracterizada pela
vasodilatação local e aumento na permeabilidade dos capilares, a segunda sub-aguda (fase
II) - caracterizada pela infiltração de leucócitos e células fagocitárias e a terceira crônica
(fase III) – onde ocorre degeneração tissular e fibrose. (ROBERTS & MORROW, 2002).
Ciclooxigenases (enzima contitutiva COX-1 e Indutiva COX-2) e 5-
Lipoxigenase (5-LOX) estão envolvidas no metabolismo oxidativo do ácido araquidonico
(AA), resultando em importantes produtos biosintéticos como as prostaglandinas (PGs),
prostaciclinas (PCs), tromboxanos (TXs) e leucotrienos (LTs). Todos esses metabólitos
do AA são mediadores da inflamação ( BENITO, 2000)
A Imunologia é o estudo da imunidade desde os eventos celulares e
moleculares que ocorrem após o organismos encontrar microorganismos ou moléculas
estranhas. As citocinas são proteinas produzidas em reposta aos micróbios e a outros
antígenos, as mesmas estimulam diversas respostas célulares envolvidas na imunidade e
na inflamação (ABBAS et al., 2002).
6.2 METODOLOGIA
6.2.1 Animais
50
Foram utilizados ratos Wistar, Rattus norvegicus, com três meses de idade,
de ambos os sexos, provenientes do Biotério do Departamento de Antibióticos da
Universidade Federal de Pernambuco. Camundongos Balb/c machos com 8 semanas de
idade, provenientes do Biotério do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami.
Os animais receberam água e ração ad libitum e foram mantidos em
condições controles (ciclo 12 h claro/escuro) e temperatura (25 ± 2 °C).
6.2.2 Edema de pata induzido por carragenina
O edema foi induzido de acordo com o modelo descrito por Winter e cols.
1962. A inflamação aguda foi obtida por administração subplantar de 0,1 mL de solucão
de carragenina (0,1% p/v) na pata posterior esquerda. O volume (mL) do edema induzido
foi medido com auxílio de um pletismômetro (Ugo Basile Italia Modelo 7150). A
medicão foi realizada no momento anterior à indução e trinta minutos depois. Após a
adminstração das drogas, o volume da pata de cada animal continuou sendo medido em
intervalos constantes de uma hora por um período de seis horas.
6.2.3 Tratamento dos animais
Cinco grupos de RATOS animais (n=5/5 machos) foram privados de ração
por doze horas, em seguida tratados por via intraperitonial com 200 mg/kg do EAQ e 100
mg/kg do theviridosídeo isolado previamente. As doses foram estabelecidas com base na
DL50 do extrato. Os grupos controle e padrão receberam solução fisiológica (0,9%) e
indometacina (10 mg/kg, IP).
6.2.4 Procedimentos para Preparação dos produtos de peroxidação do iridóide
O procedimento empregado foi aquele adotado por Ishiguro et al. (1988),
compreendendo o tratamento do iridóide glicosilado com quantidade estequiométrica de
metaperiodato de sódio a temperatura ambiente, durante 1 h com agitação constante,
sendo a reação monitorada por CCD. O produto da reação foi passada através de uma
51
coluna de carvão ativo, eluindo-se inicialmente com água, para remoção do iodato, logo
após acetona, para obtenção do produto peroxidado (Figura 18).
Figura 18: Tratamento com o Metaperiodato: o ponto 1 theviridosideo isolado, o ponto 2 corresponde
a fração acetônica e o ponto 3 a fração aquosa da coluna em carvão ativado
6.2.5 Obtenção de sobrenadantes de culturas de células de baço para dosagem de
citocinas e óxido nítrico
Os baços dos camundongos Balb/c foram retirados com o auxílio de
homogeneizador estéril, as suspensões celulares foram preparadas em meio de cultura
RPMI 1640 (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.,USA). Estas foram centrifugadas a 1500
rpm por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante desprezados. As hemácias, presentes no
sedimento celular, foram lisadas com água Milli-Q estéril num volume de 1 mL/baço e
imediatamente foi adicionado RPMI em excesso. As suspensões celulares foram mantidas
em repouso no gelo, por 5 minutos, para deposição dos grumos. Após este período, as
células foram trasferidas para outro tubo e, após centrifugação, ressuspendidas em
RPMI-S. A contagem das células e o teste de viabilidade foram realizados utilizando o
corante Azul de Trypan. As células foram distribuídas em placas de 24 poços, numa
concentração de 5 x 106 células/mL e estimuladas com Con A (5 μg/poço), LP1 e LP1
modificada na concentração de 100 μg/poço por 72 horas, em estufa de CO2 umidificada.
52
Após a incubação, as células foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos a 4 °C e os
sobrenadantes coletados, aliquotados e congelados a -20 °C, para posterior dosagem das
citocinas e NO.
6.2.6 Ensaios para dosagem de citocinas e óxido nítrico
Placas de Elisa (Costar Cambridge, MA, USA) foram sensibilizadas com 50
μL/poços de anticorpo monoclonal de captura diluído em tampão carbonato pH 9,6,
incubadas por 3 horas à temperatura ambiente e bloqueadas com 150 μL/poços de uma
solução de PBST + 1% de soro albumina bovina (SAB-Sigma Chemical, St; Louis, Mo).
Após o bloqueio, as placas foram lavadas 3 vezes em PBS + 0,05% de tween 20 (PBST)
e, em seguida, adicionos 50 μL/poços de meio RPMI + 2% nas duas primeiras fileiras,
onde foram diluídas, na razão 1:2, os padrões de IL-2, IFN-γ, IL-10 eIL-4. Nas fileiras
seguintes, as amostras foram distribuídas e diluídas. As placas foram incubadas por 18
horas, a 4 °C; após a incubação, foram lavadas 3 vezes em PBST e 50 μL/poços do
segundo anticorpo diluído em PBST + 0,1% de SAB foram adicionados, seguido de
incubação por 1 hora, à temperatura ambiente. Foram feitas mais 3 lavagens em PBST e
75 μL/poços do conjugado enzimático diluído em PBST + 0,1% de SAB, foram
adicionados às placas. Em seguida, elas foram incubadas por 1 hora. A reação foi
revelada, após novo ciclo de lavagens, com 100 μL/poços do substrato contendo ácido
cítrico 0,1M, fosfato de sódio 0,2M, água destilada, cromógeno ABTS (-2,2 azino-bis(3-
ethylbenzethiazoline-6 sulfonic acid) Sigma) e água oxigenada 30% (Sigma). A reação
foi bloqueada com ácido cítrico 0,2M e a leitura feita em leitor de ELISA (Dynatech MR
5000) a 410 nm.
Para dosagem de IL-2, as placas foram sensibilizadas com 4 ng/mL do
anticorpo monoclonal anti-IL-2 (1 A 12) e o 2° anticorpo monoclonal biotinilado anti-IL-
2 (5H4) a 2 μg/ mL foi adicionado, após a incubação das amostras e padrão.
Para dosagem de IFN-γ, o primeiro anticorpo monoclonal anti-IFN- γ (XMG
1.2) foi utilizado na concentração de 4 μg/mL e o 2° anticorpo monoclonal biotinilado
(AN18) na concentração de 2 μg/mL.
Para dosagens de IL-10, o primeiro anticorpo monoclonal anti-IL-10 (C252-2
A5) foi utilizado na concentração de 8 μg/mL e o 2° anticorpo monoclonal biotinilado
(SXC-1) na concentração de 0,5 μg/mL.
53
As curvas padrão usadas para calcular as quantidades das citocinas foram
obtidas com concentração de 0,44 a 14 ng de IL-2 recombinante/mL; 0,78 a 25 ng de
IFN-γ recombinante/mL e 0,156 a 5 ng de IL-10 recombinate/mL.
Para dosagem de óxido nítrico foi utilizado o método colorimétrico de Griess,
mede indiretamente a produção de NO pela determinação de nitrito acumulado no
sobrenadante de cultura. Limiar de sensibilidade do teste 1,56 μM/mL.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1 2 3 4 5 6
Tempo (h)
Vol
ume
do E
dem
a (m
L)
controle Theviridosídeo (100 mg/kg) Extrato Aquoso (200 mg/kg)
Gráfico 1 - Ensaio de teste in vivo, através de edema de pata de rato, por carragenina 1% IP, com
p< 0,05 quando comparados ao grupo controle.
54
6.3 RESULTADOS
O theviridosídeo (100 mg/kg) apresentou atividade anti-edematogênica
estatisticamente significativa, entre 5 e 6 horas nas condições utilizadas, administrado
posteriormente ao agente flogístico com 77, 90% de inibição com um intervalo de 95% de
confiança (cf. Gráfico 1).
Na dose de 100 µg/mL, nem o theviridoside nem seu derivado peroxidado foram
capazes de estimular as citocinas (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN), bem como o Óxido Nítrico.
55
7 CONCLUSÃO
Das raízes de L. alba forneceram 3 iridóides (theviridosídeo, mussaenosídeo e
gardosídeo), que foram caracterizados por bases químicas, estudos espectroscópicos e
comparação com dados da literatura. O theviridosídeo e o mussaenosídeo são aqui
descrito pela primeira vez nas raízes da espécie e o gardosídeo ainda inédito no gênero.
A quimiotipia do vegetal em estudo pode ser considerada citralífera de acordo
com Julião et al., 2003, porém devido a considerável quantidade de cis-verbenol, como
segundo grupo majoritário, induz a se pensar em uma nova variante para esse quimiotipo.
Devido à pequena aromaticidade das raízes, os compostos voláteis
apresentaram-se discretos em relação aos das folhas, porém não foi observado em
nenhuma base de dados os compostos voláteis das raízes de Lippia alba. Carvona, éster
metílico do ácido hexadecanóico, patchoulano e limoneno foram os compostos
evidenciados nas raízes.
Quanto a toxicidade do EAQ apresentou-se moderadamente tóxico, com uma
DL50 de 1156,25 mg/kg. Os animais apresentaram durante o ensaio intensas contorções
abdominais, excreção fecal, movimentos circulares, piloerecao, movimento estereotipado,
ereção de cauda e espasmos.
O extrato aquoso não apresentou atividade frente os microorganismos
testados.
O theviridosídeo apresentou uma atividade antiinflamatória de 77,90%
através de Indução do Edema de pata de rato por carragenina 1% com intervalo de
confiança de 95% (p < 0,05).
O teste in vitro de estimulação das citocinas (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN- γ). Na
dose de 100 µg/mL, nem o theviridoside nem seu derivado peroxidado foram capazes de
estimular as citocinas, bem como o Óxido Nítrico (NO). Mediadores (prostaglandinas,
leucotrienos e tromboxanos), estão possivelmente envolvidos com as atividades
constatadas.
56
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Apêndice 1 Artigos publicados/submetidos
Distribution of Iridoid Glucosides in Plants from the Lippia (Verbenaceae) Genus: An investigation of Lippia alba (Mill.) N.E. Brown José G. Sena Filho a*, Jennifer M. Duringer b, Daniel E. A. Uchoac, Haroudo S. Xavier a; Jose. M. Barbosa Filhod, and Raimundo Braz Filhoe
aUniversidade Federal de Pernambuco, Av. prof. Arthur de Sá s/n, cidade universitária, 50740-521 - Recife-PE, Brazil. bDepartment of Environmental & Molecular Toxicology, 139 Oak Creek Building, Oregon State University, Corvallis, OR 97331, USA.. cUniversidade Federal do Ceará, 60541970 - Fortaleza-CE, Brazil. dUniversidade Federal da Paraíba, Caixa Postal 5009, 58051-970 - João Pessoa-PB, Brazil. eUniversidade Estadual do Norte Fluminense, 28015-620 - Campos - RJ, Brazil. [email protected] Received: XX, 2006; Accepted: XX, 2006
The distribution of iridoid glucosides in plants from the Lippia genus (Verbenaceae) are described. In the present work, theviridoside, mussaenoside and gardoside were isolated from the roots of Lippia alba and were confirmed by NMR (1H and 13C). This information was combined with previous work on eight other Lippia species (obtained through a literature review) to give a thorough accounting of the iridoid glucosides currently found in this genus. There are few reports on characterization of these compounds in Lippia species; therefore, this work provides new information on this topic. Moreover, the finding of novel iridoids in Lippia alba further promotes the use of iridoids as taxonomic markers for distinguishing plants at the genera and subgenera levels of the Lippia genus. Keywords: Lippia, Lippia alba, mussaenoside, gardoside, theviridoside. The iridoid glucosides represent a class of highly oxygenated monoterpenes characterized by a cis-fused cyclopentapyran ring system. The location and the stereochemistry of the oxygen functionality in iridoids are very diverse [1]. Iridoids have a relatively discrete distribution in advanced angiosperm plant families, such as the Lamiaceae, Plantaginaceae, Scrophulariaceae and Verbenaceae families [2]. The Verbenaceae family consists of about 100 genera and 2600 species, of pantropical distribution; only a limited number of species occur in temperate regions. The largest genera are Clerodendrum (400 species), Verbena (250 species), Vitex (250 species), Lippia (200 species), Premma (200 species), and Lantana (150 species) [3]. Briquet [4], divided the Verbanaceae
family into 7 subfamilies: Verbenoideae, Chloanthoideae, Viticoideae, Caryopteridoideae, Symphoremoideae, Stilboideae, and Avicennioideae. The last three subfamilies are sometimes segregated as separate families [5,6]. The subfamily Verbenoideae is divided by Troncoso [7] into six tribes: Verbeneae, Lantaneae, Priveae, Petreae, Citharexyleae and Casselieae, according to the features of the ovaries and fruits. Since iridoids have, in some cases, proven to be useful taxonomic markers at the genera and subgenera levels [8], we examined the distribution of iridoids in the Lippia genus through literature references. Lippia alba (Mill.) N. E. Brown, also known as Lippia geminata HBK or Lantana alba (Mill), is a
2006 Vol. 0 No. 0 1 - 3
Natural Product Communications NPC
shrub about 3 m tall that belongs to the Verbenaceae family [9]. In Brazilian traditional medicine, it is commonly known as Erva-Cidreira, Chá do Tabuleiro and Salsa Limão [10,11]. Its leaves are employed as an infusion or decoction to treat gastric illnesses, diarrhea, fever, asthma, cough and as a tranquillizing remedy [12]. We found only a few reports on the occurrence of iridoids in plants of the Lippia genus, the results of which are reported in Table 1. Table 1. Iridoids Isolated from Lippia Specimens.
(1) Species (2) Isolated substances* (3) Reference (4) Lippia
alba (5) Theveside-Na(1) (6) Theviridoside (2)
(7) Mussaenoside (14) (8) Gardoside (13)
(9) Shanzhiside methyl esther (15)
(10) [14] (11) [14], This
work (12) This work (13) This work
(14) [15] (15) Lippia
angustifolia
(16) Theveside-Na(1) (17) Theviridoside (2)
(18) [14] (19) [14]
(20) Lippia arechavaletae
(21) Theveside-Na(1) (22) Theviridoside (2)
(23) [14] (24) [14]
(25) Lippia graveolens
(26) Caryoptosidic acid (3) (27) 6’-O-p-coumaroyl
derivatives (4) (28) 6’-O-caffeoyl
derivatives(5) (29) Secologanin (6)
(30) Secoxyloganin (7) (31) Dimethylsecologanoside
(8) Loganic acid (9) (32) Loganin (10)
(33) 8-epi-loganic acid (11) (34) Carioptoside (12)
(35) [13] (36) [13] (37) [13] (38) [13] (39) [13] (40) [13] (41) [13] (42) [13] (43) [13] (44) [13]
(45) Lippia javanica
(46) Theveside-Na (1) (47) Theviridoside (2)
(48) [8] (49) [8]
(50) Lippia micromera
(51) Dihydrotheveside (52) Mussaenoside (14)
(53) Barth 1979 in
[8] (54) Barth
1979 in [8]
(55) Lippia ramboi
(56) Theveside-Na(1) (57) Theviridoside (2)
(58) [14] (59) [14]
(60) Lippia thymoides
(61) Theviridoside (2) (62) [14]
(63) Lippia turbinata
(64)
(65) Theveside-Na (1) (66) Theviridoside (2)
(67) [8] (68) [8]
*Refers to compounds as seen in Figure 1 Rastrelli et al. [13], investigated the leaves of Lippia graveolens from Guatemala and found 10 iridoid and secoiridoid glucosides. The minor constituents were secologanin (6), secoxyloganin (7), dimethylsecologanoside (8), loganic acid (9), loganin (10), 8-epi-loganic acid (11) and carioptoside (12)
(see Figure 1 for chemical structures). Major constituents were the novel iridoids glucoside, caryoptosidic acid (3), and its 6’-O-p-coumaroyl (4) and 6’-O-caffeoyl (5) derivatives. Barth [8] isolated dihydrotheveside and mussaenoside (14) from Lippia micromera Schau. Rimpler and Sauerbier [8] isolated theveside-Na (1) and theviridoside (2) from Lippia javanica and Lippia turbinata. Von Poser et al.[14], identified theveside-Na (1) and theveridoside (2) in Lippia alba, Lippia angustifolia, Lippia arechavaletae, Lippia ramboi, Lippia thymoides using TLC with comparison of authentic samples. Table 2: HMQC and HMBC spectra of theviridoside found in the roots of Lippia alba.
HMQC HMBC δC δH 2JCH 3JCH
C 4 114.05 - H-3 HO-5 5 74.75 - HO-5; H-9 H-1; H-3 8 141.50 - H-9 H-1; HO-10
11 165.97 - H-3; MeO-11 CH 1 95.90 5.29 (d, 6.3) H-9 H-1’; H-3 3 153.66 7.41 (s) 7 124.07 5.60 (dl) H-9 9 56.03 2.77 (dl, 6.3) HO-5; H-&
CH2 6 45.32 2.69 (sl) HO-5
10 59.29 4.07 (dl, 14.7) HO-10 MeO-11 50.85 3.65 (s)
HO-5 - 4.65 (s) HO-10 - 4.75 (t, 5.4) CH-1’ 98.26 4.46 (d, 7.8) H-1; HO-2’ CH-2’ 73.13 2.98 (m) HO-2’; H-3’ HO-3’ CH-3’ 76.25 3.17 (m) H-2’; HO-3’ HO-2’; HO-4’ CH-4’ 69.95 3.06 (m) H-3’ CH-5’ 77.31 3.11 (m) H-4’ HO-4’ CH2-6’ 60.91 3.66 (m)
3.43 (m) HO-6’ H-4’
HO-2’ - 5.11 (d, 4.7) HO-3’ - 4.90 (d, 5.1) HO-4’ - 4.90 (d, 5.1) HO-6’ - 4.51 (t, 5.9)
Table 3. HMBC spectra of gardoside and mussaenoside found in the roots of Lippia alba.
Gardoside Mussaenoside DMSO δC δΗ δC δΗ
C 4 110.00 - 111.46 5 - - - 8 151.93 - 78.14
11 166.70 - 166.74 CH 1 94.55 5.37 (d, 4.2) 93.54 5.33 (d, 4.5) 3 151.68 7.39 (d, 1.0) 150.25 7.35 (s) 5 29.63 3.10 30.33 3.02 (m) 7 71.43 4.20 - - 9 43.27 2.90 50.47 2.05 (dd, 9.1, 4.5)
CH2 6 29.31 29.31 2.14 (m), 1.29 (m) 7 38.82 39.43 1.59 (m), 1.53 (m)
10 110.98 5.24 (sl), 5.20 (s) - - CH3 10 - - 24.36 1.18 (s)
MeO-11 50.94 3.64 (s) 50.85 3.62 (s) HO-5 - - - - HO-8 - - - 4.63 (s)
1’ 99.29 98.05 4.48 (d, 7.8) 2’ 73.07 73.11 2.94 (m)
3’ 76.70 76.70 3.14 (m) 4’ 70.07 70.07 3.01 (m) 5’ 77.31 77.30 3.14 (m) 6’ 61.12 61.16 3.68 (m) 3.42 (m)
HO-2’ - 4.98 - 4.98 HO-3’ - 4.96 - 4.96 HO-4’ - 4.93 - 4.93 HO-6’ - 4.48 - 4.48
6'
5' 4'
3'2'
1'10
98
7
6
5
43
21
O
HO OH
O
HOOH
OHOH
O OR2
R1
11
6'
5' 4'
3'2'
1'
10
987
6
5
43
21
O
HO O
O
HOOH
OHOR
COOH
HO
11
R= C CH CH
O
32
OH
9 8
7
65
4
1'' '' ''
'' ''
''
'' ''
''
1 R1 = OH R2 = Na 2 R1 = OH R2 = CH3 3 R=H 4
R= C CH CH
O
OH
OH
O
COOCH3R
O_Glu
O
COOR
O_Glu
HO
O
COOH
O_Glu
HO
5 6 R=CHO 9 R=H 11
7 R=COOH 10 R=CH3 8 R=COOCH3
O
COOH
O_Glu
HO
HO
O
OH
O
HOOH
OHOH
COOHH
HO
H2C
O
OH
O
HOOH
OHOH
COOCH3HH
H
HOH3C
O
OH
O
HOOH
OHOH
COOHH
HO
HHO
12 13 14 15
Figure 1. Iridoid glucosides found in species of the Lippia genus. (1 = theveside-Na, 2 = theviridoside, 3 = caryoptosidic acid, 4 = 6’-o-p-coumaroyl derivatives , 5 = 6’-o-caffeoyl derivatives , 6 = secologanin, 7 = secoxyloganin , 8 = dimethylsecologanoside , 9 = loganic acid , 10 = loganin , 11 = 8-epi-loganic acid, 12 = carioptoside, 13 = gardoside, 14 =mussaenoside and 15= shanzhiside methyl esther ). Barbosa et. al. [15] isolated shanzhiside methyl ester (15) from the leaves of Lippia alba. Our research group isolated theviridoside (2), mussaenoside (14) and gardoside (13) from the roots of Lippia alba (Mill.) N. E. Brown. To our knowledge, the last two have not been described in the literature before and hence represent new iridoids found in Lippia species. Their structure and stereochemistry were elucidated by means of NMR (1H and 13C) spectral data analysis (Tables 2 and 3). In summary, a total of fifteen different iridoids have been found in plants from the Lippia genus when both the literature and the present studies are combined. In addition, mussaenoside (14) and gardoside (13) represent two new iridoids not previously identified in plants from the Lippia genus. This finding further supports the use of iridoids as
taxonomic markers for distinguishing plants at the genera and subgenera levels of the Lippia genus. Experimental
Plant material: The plant specimens (Lippia alba) were collected in Timbaúba (7º35’S; 35º22’W), State of Pernambuco, Brazil in January 2005. Plants were identified by Prof. Dr. Haroudo Sátiro Xavier. A voucher specimen was deposited under nº 70003 at the Herbarium Dárdano de Andrade Lima, in Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuaria (IPA)-Pernambuco State -Brazil. Extraction and Isolation: The powdered, dried roots (300 g) were exhaustively extracted with hexane (4.8 g), ethyl acetate (4.3 g) and methanol (6.8 g) in a Soxhlet apparatus. Part of the methanol extract (3 g) was partitioned between butanol and water to afford a
butanol soluble portion which was chromatographed on a Sephadex LH-20 column using ethanol as the eluent. Fractions (10 mL) were collected (total of 126) and checked by TLC (silica gel plates in ethyl acetate, formic acid, acetic acid and water (100:11:11:26, v:v)). Novel iridoids were isolated from the fractions and subjected to NMR analysis as follows: fractions 60-68 (30 mg) for mussaenosid (14), 70-73 (8 mg) for gardoside (13), and 88-100 (40 mg) for theviridoside (2). NMR Analysis: 1H-NMR, 13C-NMR, 1H-1H COSY, DEPT, HMQC and HMBC spectra were recorded on
a Bruker DRX-500 spectrometer (1H 500MHz and 13C 125 MHz) using TMS as the internal standard for both nuclei. Samples were dissolved in DMSO for analysis. Acknowledgments – The authors wish to express their sincere thanks to the College of Pharmacy at the University of Illinois, U.S.A., for helping with the computer-aided NAPRALERT and CAPES/Brazil for financial support.
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Apêndice 2 Dados espectrais Cromatograma gasoso das folhas de Lippia alba
Cromatograma gasoso das folhas de Lippia alba
Time 3.0-32.5 minutes
, 27-Jun-2006 + 12:42:28
3.75 5.75 7.75 9.75 11.75 13.75 15.75 17.75 19.75 21.75 23.75 25.75 27.75 29.75 31.75Time0
100
%
brazil062706eaves Scan EI+ TIC
1.00e8
5.53
4.11
3.61
4.84
7.57
8.49
7.69
8.77
9.00
9.23
14.2110.64 11.99
11.22
13.36
12.69
15.46
25.88
23.34
20.53
18.5219.87
21.86
22.0724.99
29.86
29.2527.30
28.09
30.2332.45
Time 32.5-65.3 minutes
, 27-Jun-2006 + 12:42:28
33.90 38.90 43.90 48.90 53.90 58.90 63.90Time0
100
%
brazil062706eaves Scan EI+ TIC
1.00e8
49.20
44.79
40.04
39.67
33.79 38.5936.75
43.68
42.5441.79
48.32
45.81 48.17
51.51
49.87
52.18
52.94
54.45
55.3056.86
59.54
62.14
60.58 62.88
Cromatograma gasoso das Raízes de Lippia alba
Cromatograma gasoso das Raízes de Lippia alba
Time 3.0-32.5 minutes
, 23-Jun-2006 + 17:12:42
3.75 5.75 7.75 9.75 11.75 13.75 15.75 17.75 19.75 21.75 23.75 25.75 27.75 29.75 31.75Time0
100
%
brazil062306roots Scan EI+ TIC
1.00e8
10.12
6.46
3.455.77
3.87
7.28 9.478.49
8.27
14.2212.00
10.79
13.37
22.8115.95
15.48
18.53
18.04
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