Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento ... · •1986 – Willadsen: nascimento...

Mariana Härter Remião

Mestranda PPGB- UFPEL

Universidade Federal de Pelotas

Centro de Desenvolvimento Tecnológico

Graduação em Biotecnologia

Disciplina de Transgênese Animal

Professor Vinicius Farias Camp0s

Novembro de 2013

Clonagem:

• O termo vem da palavra grega Klón, que significa broto vegetal.

• O termo ‘clone’ foi criado pelo botânico Webber em 1903: uma população de moléculas, células ou organismos originadas de uma matriz comum, sendo estas, idênticas à célula que lhes deu origem.

• Mecanismo de propagação que ocorre naturalmente em plantas e bactérias.

Clonagem em Biotecnologia:

• Clonagem Molecular;

• Clonagem Celular;

• Clonagem de Organismos;

Breve histórico sobre a clonagem:

• Final de 1880 – Hans Driesh (ouriço do mar)

• 1914 - Hans Spemman (Triturus taeniatus)

• 1938 transferiu núcleos de células de gástrulas de salamandra para citoplasma de oócitos enucleados.

• 1952- Robert William Briggs e Thomas Joseph King transferiram núcleos de blástulas de embriões de Rana pipiens em ovos enucleados.

Embriões com anormalidades

• 1962 - John Gurdon : usou células intestinais adultos totalmente diferenciados para clonar rãs Sul-Africanas adultas ( Xenopus laevis);

• 1963 - Tong Dizhou: clonou uma carpa, publicando suas descobertas em uma revista científica chinesa de forma obscura.

• 1981 - Illmenesee & Hoppe: primeiro rato clonado de células de massa celular interna (ICM). Seu trabalho não foi repetido por outros pesquisadores e sofreu ceticismo grave.

• 1983 - McGrath & Solter: demonstraram a viabilidade da troca pronuclear entre zigotos de rato, mostrando também que citoplastos derivados de zigotos em estagio inicial não tinham capacidade para manter o desenvolvimento, os dados confirmaram mais tarde por Prather et al 1987.

• 1984 - "The cloning of mammals, by simple nuclear transfer, is biologically impossible” (Revista Science).

• 1986 – Willadsen: nascimento de descendentes viáveis derivadas de transferência nuclear de blastômeros ovinos em estágio inicial de pré-implantação produzidos in vivo, utilizando oócitos maturados em estágio de metáfase como citoplastos destinatários.

• 1987 - Robl et al : Confirmou a técnica de transferência nuclear em bovinos, demonstrando a reprodutibilidade do processo, quando se utiliza células doadoras totipotentes ou multipotentes.

• 1996 – Campbell et. al.: utilização de células embrionárias cultivadas como doadores nucleares, resultando em prole viva.

• 1997 – Ian Wilmut et. al.: nascimento de ovelha clonada utilizando células somáticas a partir da glândula mamária de uma ovelha de 6 anos de idade como doadora nuclear utilizando o procedimento de transferência nuclear de células somáticas (TNCS).

• 1997 - Ryuzo Yanagimachi et. al.: camundongo;

• 1998 - Cibelli et. al.: bovinos oriundos de fibroblastos fetais;

• 1998 - Kato et. al.: bovinos oriundos de células somáticas adultas.

1998 – 1ª vaca de célula de indivíduo adulto no Instituto de Pesquisa do Gado de Ishikawa.

2002 – A gatinha CC, 10 clone de um animal de estimação. Ela nascera após 188 tentativas na A & M University do Texas.

2000 – 1os suínos clonados de célula somática na Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia (EUA).

2003 – 1º eqüino clonado, a mula Idaho Gem na Universidade de Idaho em Moscou.

2005 – Snuppy, 1º cão clonado na Universidade Nacional de Seul, Coréia do Sul.

2002 – 10 coelho clonado na Agronomy Research Institute na França.

Brasil

2001 – Vitória, clone de embrião, feita pela Embrapa de Brasília. Morreu em 2011.

2002 – Penta, de célula somática de Nelore adulta, na UNESP.

2003 – Lenda, criada na Embrapa Brasília, 1º clone brasileiro de um animal que já havia morrido.

Brasil

2008 – Catarina, primeiro clone de bovino do sul do país, na UDESC, parceria entre UDESC, UFRGS eUSP.

2012 – Brisa, de uma raça bovina em extinção, pelo grupo de pesquisa da UDESC, liderado pelo professor Alceu Mezzalira. Ambas por Handmade.

Brasil

2013 – Labareda, 1º clone de uma fêmea Girolando no Brasil.

2012 - clonagem do cavalo da raça mangalarga Turbante JO, morto em 1998. 1º eqüino clonado no Brasil.

2013 - primeira fêmea registrada da raça Holandesa.

Canadá

2000- Starbuck II clonado de touro já morto, 1º bovino clonado do Canadá, 1º clone canadense de célula somática, feito por brasileiros.

Vilceu Bordignon Lawrence C. Smith

Canadá

2007 – Primeiros clones de suínos do Canadá, pelo professor Vilceu Bordignon.

Clonagem a partir de células somáticas

• Multiplicação de animais de mérito genético superior;

• Multiplicação de animais transgênicos;

• Recuperação de espécies em perigo de extinção;

Humanos...

• Terapia celular e regenerativa;

• Ferramenta para o estudo de função de genes, imprinting genômico,

reprogramação genômica, doenças genéticas, terapia gênica, podendo estas

serem estendidas à compreensão de doenças, disfunções e terapias voltadas

a humanos.

Clonagem em humanos... • 1998 - A empresa americana Advanced Cell Technology dá seu primeiro susto na

comunidade científica ao anunciar que, em 1996, introduzira DNA humano em um óvulo de vaca sem núcleo. O embrião resultante foi destruído.

• 2001 - A Academia Nacional de Ciências dos EUA promove uma audiência com os três mais notórios defensores da clonagem humana para fins reprodutivos: os médicos Severino Antinori e Panos Zavos e a química Brigitte Boisselier, diretora da Clonaid, dizem que o primeiro clone humano não vai demorar muito a nascer.

• A empresa Advanced Cell Technology desencadeia uma gigantesca polêmica ao anunciar que produzira embriões humanos a partir de clonagem. A empresa diz que não tem intenção de usar a técnica para fins reprodutivos e, sim, para cura de doenças.

• 2002 – Uma pesquisadora chinesa respeitada - Lu Guangxiu, Escola de Medicina de Xiangya - diz ter produzido dezenas de embriões humanos por clonagem desde 1999.

• Severino Antinori diz em uma conferência médica que uma mulher estava na oitava semana de gestação de um clone.

• Em uma reação a este anúncio, a empresa Clonaid diz já ter implantado no útero várias mulheres embriões produzidos a partir de clonagem e meses depois anuncia o nascimento - até hoje não comprovado - de uma menina chamada Eva, o primeiro clone humano.

• 2003 - Cientistas da Advanced Cell Technology anunciam que conseguiram repetir a produção de embriões humanos por clonagem e que eles alcançaram o estágio de 16 células.

• 2004 - O especialista em fertilização Panos Zavos anuncia que implantou um embrião humano produzido por clonagem no útero de uma mulher. A experiência não resultou em gravidez.

• Cientistas sul-coreanos anunciam que produziram uma linhagem de células-tronco pluripotentes a partir de dezenas de embriões produzidos a partir de clonagem.

• 2005 - Cientistas da Universidade Nacional de Seul anunciam a obtenção de várias linhagens de células-tronco, a partir de clonagem. As linhagens pertencem a nove pacientes - homens, mulheres e crianças.

Clonagem em humanos...

Procedimentos de clonagem:

• Transferência nuclear de célula somática (TNCS)

• Handmade cloning (HMC)

Transferência nuclear de célula

somática (TNCS)

Etapas:

1. Coleta, seleção e maturação dos oócitos;

Oócito imaturo Oócito maturo


somática (TNCS)

2. Enucleação ou remoção da cromatina dos oócitos receptores;

a) Remoção das células do cumulus (Hialuronidase);

b) Seleção dos oócitos;

c) Exposição à soluções desestabilizadoras de citoesqueleto (Citocalasina B).


somática (TNCS)


somática (TNCS)

3. Preparação das células doadoras de núcleo;

▫ Cultivo de células:

Tipo de célula

Pronase

Tripsina

• Cultivo celular para obtenção de transgênico a partir de TNCS

Animal transgênico doador de células

Células transfectadas no cultivo celular

Transgênico

Não Transgênico

TNCS

TNCS

Em transgênese:

Transfecção de DNA em células • Eletroporação

• Lipofecção

• Vetores virais

• Nanotransfecção

Seleção das células transformadas • Genes de seleção

• PCR


somática (TNCS)

4. Transferência das células doadoras de núcleo e fusão destas com

os oócitos receptores;

Transferência da célula para o oócito


somática (TNCS)

Fusão:

• Impulsos elétricos;

• Liposomas;

• Etilenoglicol;

• Vírus Sendai inativado.

Eletroporador


somática (TNCS)

5. Ativação dos oócitos receptores;

• Permitir que os oócitos completem o processo meiótico;

In vivo... In vitro...

Sptz libera sinal para degradação de MPF; Liberação de ondas de cálcio.

Soluções contendo cálcio; Etanol; Ionóforos; Cloreto de estrôncio; Impulsos elétricos; Inibidores de síntese protéica e enzimas quinases.

• 15µM de ionomicina • 10mM de cloreto de estrôncio (SrCl2) • 7,5µg/mL de citocalasina B (CtB), • 10µg/mL de cicloheximida

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Exemplo de protocolo de ativação


somática (TNCS) 6. Cultivo e transferência dos embriões reconstituídos para fêmeas

receptoras.

Handmade cloning (HMC)

1. Coleta, seleção e maturação dos oócitos;

2. Enucleação ou remoção da cromatina dos

oócitos receptores;

3. Preparação das células doadoras de núcleo;

4. Transferência das células doadoras de núcleo

e fusão destas com os oócitos receptores;

5. Ativação dos oócitos receptores;

6. Cultivo e transferência dos embriões

reconstituídos para fêmeas receptoras.

Difere da TNCS

Handmade cloning (HMC)

• Oócitos desnudados;

• Zona pelúcida parcialmente removida (pronase);

Handmade cloning

• Bipartição do oócito maturado;

• Seleção das metades sem a cromatina (corante fluorescente genômico).

• Duas metades de oócitos próximas à célula doadora de núcleo – Fusão;

• Ativação partenogenética, cultivo, e transferência de embrião.

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Handmade cloning

Problemas relacionados à clonagem

• Alta taxa de falhas;

• Saúde frágil e morte prematura;

• Problemas de desenvolvimento;

• Diferenças nos comprimentos dos telômeros;

• Anormalidades genéticas.

Problemas de reprogramação epigenética e ciclo celular

Ciclo celular e clonagem

Coordenação do ciclo celular entre as células

• Evitar incompatibilidade entre núcleo e citoplasma;

• Favorecer a reprogramação dos núcleos.

Fase S

Fase G0 ou G1

Oócito ativado

Oócito em MII

Ciclo celular e clonagem

Benefícios de usar oócitos em MII:

• Aumento do diâmetro nuclear nos embriões reconstruídos;

• Remodelagem de proteínas do envelope nuclear;

• Tempo necessário para modificar a atividade de transcrição e

replicação da cromatina;

• Reprogramação da forma somática da H1.

Reprogramação epigenética

Epigenética: Modificações no genoma que não alteram sequência de DNA, mas sim, atuam mudando a acessibilidade da cromatina para regulação transcricional.

• Metilação do DNA

• Modificação nas histonas


• Reconduzir o núcleo da célula somática ao estágio de zigoto – remoção de fatores epigenéticos;

• Histonas H1 – regulação da atividade nuclear;

▫ Ciclo celular e enzimas quinases


Estratégias:

Oct4, Sox2, KLF4, e c-myc (OSKM)

Moléculas usadas para Reprogramação

Epigenética

• Proteases;

• Inibidores de metilação de DNA;

• Inibidores de desacetilação de histona;

• Inibidores de histona metiltransferase;

• Inibidores de enzimas quinases.

Efeito da diferenciação e bagagem

genética das células doadoras

Telômeros

Clones:

• Ovinos – Telômeros mais curtos;

• Bovinos e camundongos – Telômeros restabelecidos ou maiores.

Conclusões e Perspectivas

• Progressos em diversas áreas;

• Redução dos custos de reprodução de animais OGM;

• Baixa eficiência;

• Resultados devem ser mais previsíveis e repetitivos;

• Necessários mais avanços na remodelagem do núcleo.

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