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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA,

NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

BIOPROSPECÇÃO DE METABÓLITOS BIOATIVOS

PRODUZIDOS POR FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS

A ANGIOSPERMAS PRESENTES NA ANTÁRTICA

Iara Furtado Santiago

Ouro Preto

2011

Iara Furtado Santiago

Bioprospecção de metabólitos bioativos produzidos por fungos

endofíticos associados a angiospermas presentes na Antártica

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação

em Biotecnologia, Núcleo de Pesquisa em Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como

requisito parcial à obtenção do título de Mestre em

Biotecnologia.

Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a

Processos

Linha de pesquisa: Bioprospecção de fungos

Orientador: Luiz Henrique Rosa

Co-orientador: Carlos Augusto Rosa

Ouro Preto, Minas Gerais

2011

Catalogação: [email protected]

S235B SANTIAGO, IARA FURTADO.

Bioprospecção de metabólitos bioativos produzidos por fungos endofíticos associados a angiospermas presentes na Antártica [manuscrito] / Iara Furtado Santiago - 2011.

x, 98f.: il., color; graf.; tabs.; mapas. Orientador: Prof. Dr. Luiz Henrique Rosa. Co-orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a Processos e

ao Tratamento de Doenças.

1. Bioprospecção - Teses. 2. Fungos - Teses. 3. Angiospermas - Teses. 4. Metabólitos - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.

CDU: 582.28:582.5/.9(292.3)

mailto:[email protected]

Colaboradores:

Dr. Carlos Leomar Zani

Dr. Tânia Maria de Almeida Alves

Laboratório de Química de Produtos Naturais. Centro de Pesquisas René Rachou –

FIOCRUZ/MG

Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da UFOP

i

AGRADECIMENTOS

Chega ao fim de mais uma etapa... Etapa conquistada através de muitos incentivos, sorrisos,

lágrimas, conselhos, palavras e até mesmo “puxões de orelha”.

Obrigada a Deus pois sem ele nada disto seria possível; a minha família que é tudo aquilo de

mais importante na minha vida... apesar de muitas vezes eles acharem e falarem que eu acho

os fungos mais importantes, rsrs!!!

Aqueles anjinhos que lá de cima continuam a me guiar... vô Jarino, vó Glorinha, vó Lilica e

vó Helena;

Aos meus pais que acreditaram e aceitaram... mesmo que as vezes sem entender o porque das

minhas escolhas. Tenho vocês com exemplos de persistência e coragem de encarar o novo;

Aos meus tios “pais”, tia Simone e tio Zé Rubens que sempre me acolheram e estiveram ao

meu lado com muito carinho; aquele que busca entender dos meus assuntos e pesquisas só pra

me alegrar, né tio Petrus!! Por todos aqueles sorrisos da tia Marly, pelo orgulho do tio Marco

as minhas conquistas e orações da tia Cici;

Aos meus irmãos Ivo, Iran e João Pedro pela amizade e momentos de descontração quando

tudo parecia perdido;

Ao orientador, chefe e amigo Luiz Henrique Rosa agradeço o exemplo, paciência, confiança e

crescimento profissional. Foram longas as conversas, desabafos, desesperos e alegrias;

Ao Carlos Augusto Rosa pela co-orientação, ensinamentos e por acreditar no meu trabalho;

Aos amigos do laboratório de Ouro Preto é muito bom recordar dos bons momentos

compartilhados. A turma é MARA!!!


ii

Aos amigos do laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras que me acolheram e

fazem com que os dias nas bancadas sejam ainda melhores. Um agradecimento especial a

galerinha dos fungos filamentosos que muito me ensinaram trocando conhecimento e

engrandecendo os trabalhos do grupo;

Ao Carlos Zani e a Tânia Alves pela colaboração e por me “abrigar” no LQPN. Aos amigos e

“tias” que lá conquistei um obrigada muito carinhoso;

Ao CNPq pela bolsa de mestrado concedida. A FAPEMIG pelo apoio financeiro;

Aos amigos de Ouro Preto que estiveram presentes em momentos de alegria e tristeza me

acolhendo com um “montinho”... né Banda Podre! A turma da graduação que mesmo distante

e cheios de outros compromissos não esqueceram a amiga e é claro aos “irmãos” da Kzona

que são sempre presentes;

Obrigada a todos aqueles que de alguma forma ajudaram, estiveram ao meu lado e torceram

para que este dia chegasse. Hoje vejo que tudo valeu a pena e que se pudesse voltar atrás faria

tudo de novo, talvez mais cautelosa e segura mas não deixaria de fazer!!!

Este projeto faz parte das atividades do projeto API 403 ‘MIDIAPI Microbial Diversity of

Terrestrial and Maritime ecosystems in Antarctic Peninsula’ sob a coordenação da DraVivian

H. Pellizari, o qual contribui com os projetos MERGE (Microbiological and Ecological

Responses to Global Environmental Changes in Polar Regions), CAML (Census of Antarctic

Marine Life) e SCARMarBIN (SCAR-Marine Biodiversity Information Network).


iii

RESUMO

Apesar das relações ecológicas, evolutiva e do potencial biotecnológico de muitos

microrganismos, pouco se conhece da micota presente no continente Antártico. Desta forma,

este trabalho teve como objetivo detectar a presença de metabólitos bioativos produzidas por

fungos endofíticos associados as angiospermas antárticas Deschampsia antarctica Desv.

(Poaceae) e Colobanthus quitensis quitensis (Kunth) Bartl. (Caryophyllaceae). Dos 564

isolados de fungos endofíticos, 251 foram obtidos de C. quitensis e 313 de D. antarctica.

Estes fungos foram cultivados em Agar Batata Dextrosado por 15 dias a 15°C para obtenção

dos extratos brutos. Os 477 extratos obtidos foram avaliados quanto a proliferação celular das

linhagens de células tumorais humanas MCF-7 (glândula mamária), UACC-62 (melanoma) e

TK-10 (renal); e de formas amastigota de Leishmania amazonensis e Trypanosoma cruzi.

Após a triagem, seis extratos foram ativos sobre a proliferação de pelo menos uma das

linhagens de células tumorais. Destes, quatro extratos apresentaram inibição sobre MCF-7,

um sobre TK-10 e um sobre UACC-62. Nenhum extrato foi ativo para duas ou mais linhagens

de células tumorais, sugerindo uma seletividade dos extratos testados. Vinte sete extratos

obtidos de fungos associados a D. antarctica foram ativos contra L. amazonensis. Nenhum

extrato foi capaz de inibir o crescimento de T. cruzi. Todos os isolados ativos foram

identificados por meio do sequenciamento da região espaçadora transcrita interna (ITS) do

gene do rRNA. Os seguintes gêneros foram identificados: Alternaria, Cadophora, Helgardia,

Microdochium, Phaeosphaeria, Oculimacula e Ypsilina. Os extratos de dois isolados de

Microdochium phragmitis (UFMGCB 2479 e UFMGCB 2656) apresentaram os menores

valores de CI50 (8 e 12,5 µg/mL, respectivamente) sobre as linhagens de células tumorais. Os

extratos dos táxons UFMGCB 2672 (não identificado) e Phaeosphaeria sp. UFMGCB 2669

foram ativos sobre L. amazonensis com valores de CI50 de 0,2 e 0,4 µg/mL, respectivamente.

Os resultados obtidos neste estudo contribuem para o conhecimento do potencial

biotecnológico da micota endofítica associadas a plantas endêmicas do ecossistema antártico.

Estes fungos podem representar uma fonte promissora de metabólitos protótipos para o

desenvolvimento de novas drogas, em especial contra doenças negligenciadas.


iv

ABSTRACT

Despite the ecological and evolutionary relationships and biotechnological potential of many

microorganisms, little is known about this mycota from the Antarctic continent. Since, this

study aimed to detect the presence of bioactive metabolites produced by endophytic fungi

associated with the antarctic angiosperms Deschampsia antarctica Desv. (Poaceae) and

Colobanthus quitensis quitensis (Kunth) Bartl. (Caryophyllaceae). From 564 isolates of

endophytic fungi, 251 were obtained from C. quitensis and 313 from D. antarctica. These

fungi were grown on potato dextrose agar for 15 days at 15oC to obtain crude extracts. The

477 extracts were evaluated for cellular proliferation of tumor cell lines MCF-7 (mammary

gland), UACC-62 (melanoma cells) and TK-10 (renal cells) and amastigote Leishmania

amazonensis and Trypanosoma cruzi. After screening, six extracts were active on the

proliferation of at least one tumor cell line. Of these, four extracts showed inhibition of MCF-

7, one showed inhibition of TK-10 and one of UACC-62. No extract was active for two or

more tumor cell lines, suggesting a selectivity of the extracts. Twenty seven extracts of fungi

associated with D. antarctica were active against L. amazonensis. No extract was able to

inhibit the growth of T. cruzi. All isolates were identified by sequencing the internal

transcribed spacer (ITS) region of rRNA gene. The following genera were identified:

Alternaria, Cadophora, Helgardia, Microdochium, Phaeosphaeria, Oculimacula and

Ypsilina. The extracts of two isolates of Microdochium phragmitis (UFMGCB 2479 and

UFMGCB 2656) had the lowest IC50 values (8 and 12,5 µg/mL, respectively) on the tumor

cell lines. The extracts of the unidentified taxa UFMGCB 2672 and of Phaeosphaeria sp.

UFMGCB 2669 were active against L. amazonensis with IC50 values of 0,2 e 0,4 µg/mL,

respectively. The results of this study contribute to the knowledge of the biotechnological

potential of endophytic mycota associated with endemic plants of the Antarctic ecosystem.

These fungi may represent a promising source of metabolites prototypes for the development

of new drugs, especially against neglected diseases.


v

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS....................................................................................................vi

LISTA DE FIGURAS..........................................................................................................................................viii

LISTA DE TABELAS............................................................................................................................................ix

1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................................... 1

2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................................. 3 2.1 BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS....................................................................................... 3 2.2 DOENÇAS NEGLIGENCIADAS ............................................................................................................ 7

2.2.1 Doença global - Câncer............................................................................................................10 2.3 ANGIOSPERMAS ANTÁRTICAS: RESERVATÓRIO DE MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS ..........................11

3 OBJETIVOS..............................................................................................................................................14 3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................................................14 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................................................................14

4 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................................................15 4.1 ÁREA DE COLETA...........................................................................................................................15 4.2 COLETAS DAS ANGIOSPERMAS ANTÁRTICAS ...................................................................................15 4.3 ISOLAMENTO E PRESERVAÇÃO DOS FUNGOS ....................................................................................17 4.4 CULTIVO DOS FUNGOS E PREPARO DOS EXTRATOS ...........................................................................17

4.4.1 Fungos Filamentosos................................................................................................................17 4.4.2 Leveduras.................................................................................................................................18

4.5 PREPARO DOS EXTRATOS VEGETAIS ................................................................................................18 4.6 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA ....................................................................................18

4.6.1 Ensaio com células tumorais.....................................................................................................19 4.6.2 Ensaio contra formas amastigotas de Leishmania amazonensis .................................................19 4.6.3 Ensaio com Trypanosoma cruzi.................................................................................................20

4.7 DETERMINAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIO A 50% (CI50) DOS EXTRATOS ATIVOS ....................20 4.8 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS..........................................................................................................20

4.8.1 Extração do DNA total..............................................................................................................21 4.8.2 Obtenção dos amplicons ...........................................................................................................21 4.8.3 Purificação dos amplicons ........................................................................................................22 4.8.4 Reação de sequenciamento .......................................................................................................22 4.8.5 Precipitação da reação de sequenciamento...............................................................................23 4.8.6 Análise computacional das sequências ......................................................................................23

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................................................25 5.1 COLETA E ISOLAMENTO DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS ................................................................................25 5.2 CULTIVO DOS FUNGOS E OBTENÇÃO DOS EXTRATOS ETANÓLICOS ...........................................................26 5.4 ATIVIDADES BIOLÓGICAS......................................................................................................................27 5.5 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS ATIVOS.....................................................................................................31 5.5 DETERMINAÇÃO DE CI50 DOS EXTRATOS ATIVOS ...................................................................................43

6 CONCLUSÕES ..........................................................................................................................................48

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................................................49

8 ANEXOS.............................................................................................................................................................62


vi

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

BDA: Ágar dextrose batata

BHCB: Herbário do Departamento de Botânica da UFMG

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

CI: Concentração Inibitória

CI50: Concentração Inibitória a 50%

cm: centímetro

CO: Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl. (Caryophyllaceae)

CPRG: cloro-phenol red beta-D-galactopyranoside

CTAB: Brometo de cetil trimetilamonio

DE: Deschampsia antarctica Desv. (Poaceae)

DMSO: Dimetilsulfóxido

DNA: Ácido desoxirribonucléico

dNTP: Desoxirribonucleotídeos fosfatados

EACF: Estação Antártica Comandante Ferraz

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

EUA: Estados Unidos da América

g: grama

g/L: grama por litro

GPS: Global Positioning System

GYMP: glicose, extrato de levedura, extrato de malte, Na2PO4

h: Hora

H2O: água

HCl: Ácido clorídrico

IARC: International Agency for Research on Cancer

ICB: Instituto de Ciências Biológicas

INCA : Instituto Nacional de Câncer

IRR/FIOCRUZ: Instituto René Rachou/Fundação Oswaldo Cruz

ITS: Região transcrita interna

LT: Leishmaniose Tegumentar

LV: Leishmaniose Visceral


vii

KH2PO4: Dihidrogenofosfato de potássio

KNO3: nitrato de potássio

LBEM: Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular

LQPN: Laboratório de Química de Produtos Naturais

m: metro

M: molar

MCF-7: Célula de adenocarcinoma de mama humano

MgCl2: cloreto de magnésio

MgSO4: Sulfato de magnésio

mg: miligrama

mg/mL: miligrama/mililitro

min: Minuto

mL: Mililitro

mm: Milímetro

mM: Milimolar

mol/L : mol por litro

MTT: Brometo Tiazolil Azul de Tetrazólico

μg: Micrograma

μg/mL: micrograma/mililitro

μl: Microlitro

Na2HPO4: dihidrogenofosfato de sódio

NaCl: Cloreto de sódio

NCBI: National Center for Biotechnology Information

NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards

NCI: National Cancer Institute

ng: nanograma

nm: Nanômetro

OMS: Organização Mundial de Saúde

PCR: Reação em cadeia da polimerase

PEG: polietilenoglicol

pH: potencial hidrogeniônico

p.p.m: partes por milhão

pmol: Pico mol


viii

p/v: peso por volume

rDNA: DNA ribossomal

rRNA: RNA ribossomal

r.p.m.: Rotações por minuto

s: Segundo

S: sul

SDS: Dodecil sulfato de sódio

TBE: Tris borato

TK-10: Célula de câncer renal

U: Unidade

UACC-62: Célula de melanoma

UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais

UFMGCB : Coleção de Microrganismos e Células da Universidade Federal de Minas

Gerais

UFOP: Universidade Federal de Ouro Preto

V: Volts

W: oeste

% : por cento

ºC: graus Celsius


ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1:. Desenho esquemático com a hipótese sobre o antagonismo balanceado entre

hospedeiro e endofítico (SCHULZ & BOYLE, 2005)..................................................... 5

Figura 2:. Estrutura química do Taxol (STROBEL, 2003)..................................................... 6

Figura 3:. Estrutura química da podofilotoxina (STROBEL, 2003). ...................................... 6

Figura 4:. Estrutura química da altenusina (COTA et al., 2008)............................................. 7

Figura 5:. A- Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl. (Caryophyllaceae) e B- Deschampsia

antarctica Desv. (Poaceae). ......................................................................................... 13

Figura 6:. Mapa da Baía do Almirantado, Ilha Rei George, Antártica, indicando os locais e o

transecto onde foram coletadas as amostras vegetais. Bp = Botany point (62°05'S,

58°19'W); Up = Ullman point (62°05'S, 58°20'W); Br = Refúgio Brasileiro II (62°04'S,

58°25'W); Mp = Estação Antártica Peruana Macchu Picchu (62°07'S, 58°23'W); Hp =

Hennequin point (62°05'S, 58°24'W); e Dp = Demay point (62°12'S, 58°19'W) (Simões

et al., 2004 com modificações). As distâncias entre os pontos de coleta foram 2 km (Bp a

Up), 4 km (Up a Br), 4 km (Br a Mp), 5 km (Mp a Hp), e 10,5 km (Hp a Dp)............... 16

Figura 7:. Fungos endofíticos isolados de Deschampsia antarctica Desv. e Colobanthus

quitensis (Kunth) Bartl. presentes na Antártica. ............................................................ 26

Figura 8:. Análise filogenética entre os fungos filamentosos obtidos de Deschampsia

antarctica Desv. e as sequências de fungos mais próximos retiradas do GenBank. A

árvore foi construída com base nas sequências do gene do rRNA (ITS1-5.8S-ITS2). A

árvore foi construída utilizando a sequência do fungo Trametes versicolor [AF042324]

como grupo externo...................................................................................................... 43


x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1:. Número de casos de Leishmaniose Visceral e Leishmaniose Tegumentar em

diferentes regiões do Brasil entre os anos de 2005 a 2009............................................... 9

Tabela 2:. Número de casos de Doença de Chagas nas regiões do Brasil de 2005 a 2009..... 10

Tabela 3:. Estimativa para o ano 2010 de número de casos novos por câncer, em homens e

mulheres....................................................................................................................... 11

Tabela 4:. Extratos dos isolados de fungos endofíticos com atividades biológicas ≥60%,

contra células tumorais humanas e ≥70% contra formas amastigotas de Leishmania

amazonensis e Trypanosoma cruzi, quando testado a concentração de 20 µg/mL.......... 29

Tabela 5:. Cinco melhores sequências alinhadas no BLAST de fungos endofíticos bioativos

de Deschampsia antarctica Desv. e Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl., com substrato

e origem de cada sequência. ......................................................................................... 33

Tabela 6:. Valores de CI50 (μg/mL) dos extratos de fungos endofíticos bioativos................. 46


1

1 INTRODUÇÃO

Cada vez mais, em todo mundo, verifica-se a necessidade da descoberta e

desenvolvimento de novas drogas para utilização na clínica, pecuária e agricultura. Isto

ocorre, principalmente, devido a alta incidência de doenças que não possuem tratamentos e/ou

cura satisfatória em humanos e animais e doenças em vegetais de interesse econômico, o que

aumenta a importância de realização de estudos de bioprospecção de novas fontes de

moléculas bioativas (STROBEL & DAISY, 2003). Enfermidades como o câncer,

leishmaniose e doença de Chagas representam grandes problemas de saúde pública e

acometem pessoas de países desenvolvidos e em desenvolvimento. É grande o impacto sócio-

econômico negativo causado por estas doenças em países em desenvolvimento,

principalmente sobre populações de baixa renda (MRAZEK & MOSSIALOS, 2003). Além

disso, nas últimas décadas pouco incentivo foi dado para a pesquisas por novos fármacos

capazes de controlar doenças negligenciadas.

Os microrganismos, em especial os fungos, têm representado fonte promissora de

substâncias para uso terapêutico. Entre os grupos microbiano, diferentes estudos demonstram

que metabólitos bioativos produzidos por fungos representam importantes fontes para o

desenvolvimento de diferentes medicamentos (STROBEL, 2003; FERRARA, 2006; TAN &

ZOU, 2006). Os fungos endofíticos, microrganismos encontrados em diferentes espécies

vegetais e que habitam seus hospedeiros assintomaticamente sem lhe causar dano aparente,

foram relativamente pouco estudados como potenciais fontes de novos produtos naturais úteis

na medicina, agricultura, pecuária e indústria (STROBEL & DAISY, 2003), os quais vem

demonstrando a capacidade de produzir metabólitos com atividades antiparasitária,

antibacteriana, antifúngica, antitumoral, antioxidante, imunossupresora, entre outras (TAN &

ZOU, 2001; STROBEL, 2003; STROBEL & DAISY, 2003; FERRARA, 2006; COTA et al.,

2008a,b). Estima-se que existam cerca de 300 mil espécies de plantas no planeta e que cada

planta pode ser hospedeira de um ou mais fungos endofíticos, o que aumenta a chance de

obtenção de táxons capazes de produzir metabólitos bioativos. Diferentes estratégias podem

ser adotadas para pesquisa e utilização biotecnológica de fungos produtores de substâncias

bioativas, as quais se destacam a seleção de plantas endêmicas e presentes em ambientes

inexplorados (STROBEL, 2003).

Isolada dos demais continentes por correntes marinhas e pela distância, a Antártica

apresenta-se como um ambiente que se caracteriza por extremos de clima e habitats. Nos


2

ecossistemas Antárticos podem ocorrer grandes variações de temperatura, salinidade,

dessecação, escassez de nutrientes, alta incidência de radiação ultravioleta alternada com

longos períodos de ausência de luz, mudanças climáticas acentuadas e descontínuas; além dos

ciclos de congelamento e degelo, que influenciam a distribuição das massas de água no

Oceano Austral e geram alterações locais de clima (WYN-WILLIAMS, 1996; VINCENT,

2000; CLARKE, 2003). Nestas condições, poucas plantas são capazes de sobreviver; entre

elas se destacam as espécies Deschampsia antarctica Desv. (Poaceae) e Colobanthus

quitensis (Kunth) Bartl. (Caryophyllaceae) que representam as duas únicas angiospermas

adaptadas às condições extremófilas da Antártica (PARNIKOZA et al., 2007). Em estudos

prévios do nosso grupo de pesquisa, as comunidades de fungos endofíticos associados a D.

antarctica (ROSA et al., 2009) e C. quitensis (ROSA et al., 2010) foram determinadas e

diferentes táxons caracterizados; entre eles se destacam isolados adaptados as condições

extremas da Antártica, endêmicos e possíveis novas espécies, os quais podem ser

considerados fontes inéditas para o estudo de bioprospecção de moléculas bioativas protótipos

para o desenvolvimento de novas drogas.


3

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Bioprospecção de fungos endofíticos

Os fungos constituem um grande grupo de microrganismos encontrados, virtualmente,

em todos os nichos ecológicos (ALEXOPOULOS et al. 1996). Os habitas, substratos

ocupados e as funções desenvolvidas são amplamente diversificados nos ecossistemas. Nos

últimos anos o número de trabalhos realizados com objetivo de conhecer a riqueza de espécies

de fungos de regiões tropicais, temperadas e polares vem aumentando, bem como o estudo de

sua diversidade genética e, consequentemente, utilização em processos biotecnológicos. Sabe-

se que algumas funções desenvolvidas pelos fungos no ecossistema podem gerar aplicações

biotecnológicas tais como a decomposição de matéria orgânica, acúmulo de substâncias

tóxicas, alteração da permeabilidade do solo e das trocas iônicas, produção de biomassa

(alimentos ou ração), maturação de alimentos, fermentação, produção de imunossupresores e

antibióticos (CHRISTENSEN, 1989).

A utilização de produtos terapêuticos de origem antimicrobiana teve início com a

descoberta penicilina (PEARCE, 1997; CRAGG & NEWMAN, 2005), a qual devido a

eficácia despertou o interesse na busca de outros microrganismos produtores de substâncias

bioativas (BUTLER & BUSS, 2006). De acordo com Strobel & Dayse (2003), novas espécies

e/ou endêmicas de microrganismos são comumente associadas à obtenção de novas moléculas

bioativas, as quais têm sido fonte de moléculas bioativas modelos utilizadas para o

desenvolvimento de novos fármacos (TAN & ZOU, 2001; STROBEL & DAISY, 2003).

O termo endofítico foi utilizado pela primeira vez em 1866 por Bary (AZEVEDO,

1999). A partir da descoberta dos organismos endofíticos, vários pesquisadores definiram os

organismos endofíticos de diferentes modos (STROBEL & DAISY, 2003;

SURYANARAYANAN et al. 2009). São conhecidos como organismos endofíticos, protistas

(PETERS, 1991), insetos (FELLER,1995), bactérias (KOBAYASCHI & PALUMBO, 2000) e

fungos (STONE et al., 2000), os quais passam parte ou todo os seus ciclos de vida

colonizando, assintomáticamente, os espaços inter ou intracelulares de tecidos vivos de um

vegetal hospedeiro, sem causar sintomas aparentes (TAN & ZOU, 2001; STROBEL &

DAISY, 2003; SCHULZ & BOYLE, 2005; SURYANARAYANAN et al., 2009). Os

endofíticos já foram encontrados em tecidos vegetais fossilizados de angiospermas e


4

gimnospermas (GUNATILAKA, 2005). Desse modo, supõe-se que diversas interações podem

ter sido estabelecidas ao longo dos anos, incluindo-se relações especificas entre o endofítico e

hospedeiro (TAN & ZOU, 2001; STROBEL & DAISY, 2003).

Alguns estudos demonstram as diversas funções ecológicas relacionadas aos

endofíticos tais como a decomposição de tecidos vegetais mortos (KUMARESAN &

SURYANARAYANAN, 2002; HYDE & SOYTONG, 2008; OSES et al., 2008), proteção do

hospedeiro contra doenças (ARNOLD et al., 2003), atividade repelente contra insetos

(AKELLO et al., 2007), aumento da tolerância a estresse abiótico (REDMAN et al., 2002;

BAE et al., 2009), produção de fito hormônios, toxinas e outras substâncias de interesse

biotecnológico, como enzimas e metabólitos bioativos. Em contrapartida, os endofíticos

podem receber proteção e nutrientes dos seus respectivos hospedeiros (PETRINI et al., 1992;

STROBEL & DAISY, 2003; KOGEL et al., 2006; WEBER et al, 2007). Algumas hipóteses

procuram explicar a relação simbiótica endofítico - hospedeiro; a distinção entre patógenos e

mutualistas ainda não é clara e pode variar entre populações e comunidades sob determinadas

condições (GUNATILAKA, 2005; KOGEL et al., 2006; WEBER et al, 2007). De acordo com

Schulz & Boyle (2005), a colonização assintomática resulta de uma relação antagônica

balanceada (Figura 2), onde ocorre um equilíbrio entre a patogenicidade e a resposta de defesa

do hospedeiro. Desse modo a variabilidade dessa interação dependeria não só da adaptação ao

hospedeiro, mas também de fatores de patogenicidade do endofítico, em resposta a defesa do

hospedeiro e as condições ambientais.


5

Figura 1:. Desenho esquemático com a hipótese sobre o antagonismo balanceado entre

hospedeiro e endofítico (SCHULZ & BOYLE, 2005).

De acordo com Strobel & Dayse (2003), os fungos são os microrganismos endofíticos

isolados com maior frequência. A composição e a freqüência dos fungos endofíticos podem

variar de acordo com diferentes fatores tais como: umidade ambiental, distribuição geográfica

do vegetal, posição relativa da planta (sua altura em relação ao solo), idade e parte da planta e

disposição na folha, dentre outros (PETRINI et al., 1992; CARROL, 1995; RODRIGUES &

PETRINI, 1997; SAIKKONEN et al., 1998; STROBEL, 2003). Os táxons de fungos

endofíticos incluem espécies dos filos Zygomycota, Chytridiomycota, Ascomycota e

Basidiomycota (HUANG et al., 2001; SURYANARAYANAN et al., 2005; GUNATILAKA,

2005). Contudo, a maioria dos fungos endofíticos são Ascomycota e seus anamorfos

(ARNOLD et al., 2000; HUANG et al., 2001). A descoberta que o fungo endofítico

Taxomyces andreanae Strobel, isolado do vegetal Taxus brevifolia (Taxaceae), produz o

diterpeno paclitaxel (Figura 1), um dos agentes anticâncer mais utilizado na clínica

atualmente, tem potencializado os estudos de fungos endofíticos como fonte de substâncias

bioativas (STIERLE et al., 1995; SUFFNESS, 1995; KNIGTH et al., 2003).


6

Figura 2:. Estrutura química do Taxol (STROBEL, 2003)

Segundo Strobel (2003), muitas propriedades bioativas atribuídas as plantas

hospedeira podem, na realidade, serem decorrentes da produção de moléculas bioativas

sintetizadas por microrganismos endofíticos. Como exemplo, pode-se citar a espécie vegetal

Kennedia nigriscans (Lindl.), utilizada pelas tribos aborígenes australianas para o tratamento

de feridas, cortes e infecções. Muitas propriedades cicatrizantes atribuídas à K. nigriscans

eram, na realidade, decorrentes da produção de peptídeos com ação antibacteriana sintetizados

pelo endofítico Streptomyces NRRL 30562. Outro exemplo de substância bioativa extraída de

plantas e produzida por fungos endofíticos é a podofilotoxina (Figura 3), sintetizada por

espécies vegetais do gênero Podophyllum, a qual apresenta atividades antitumoral, antiviral,

antibacteriana e imunoestimulante. Recentemente, foi relatado que o fungo endofítico

Trametes hirsuta (Wulfen), obtido da espécie vegetal Podophyllum hexandrum

(Berberidaceae), também é capaz de sintetizar podofilotoxina e outras lignanas bioativas com

propriedades antitumoral e antioxidante (PURI et al., 2006).

Figura 3:. Estrutura química da podofilotoxina (STROBEL, 2003).


7

Além da existência de alguns metabólitos secundários com atividades antimicrobianas

e citotóxica por fungos endofíticos, já foi obtida substância com atividade inibitória sobre a

enzima Tripanotiona Redutase (TryR). A TryR evita o estresse oxidativo dos parasitas da

leishmaniose e doença de Chagas e é reconhecida como um alvo para a busca de drogas

leishmanicidas e tripanosomicidas. A altenusina (Figura 4), isolada do fungo endofítico

Alternaria sp. UFMGCB 55, obtido da planta Trixis vauthieri DC (Asteraceae) foi capaz de

inibir 99% da atividade da TryR (COTA et al., 2008).

Figura 4:. Estrutura química da altenusina (COTA et al., 2008).

Para organismos que vivem em condições extremas são necessárias diferentes

adaptações morfo-fisiológicas para a sobrevivência, as quais ocorrem por meio da síntese de

diferentes moléculas, que variam de simples ou até complexos metabólitos secundários

(WILSON & BRIMBLE, 2009). Estas moléculas podem ser empregadas diretamente como

fármacos, ou mesmo modificadas de modo a se obter uma nova molécula com propriedades

desejadas. Mesmo quando estas moléculas bioativas não apresentam a atividade esperada, ela

pode servir como protótipo para o desenvolvimento de novas moléculas, o que evidencia

ainda a importância do estudo de microrganismos como fonte de novas drogas.

2.2 Doenças negligenciadas

As doenças negligenciadas são aquelas que, apesar do processo do conhecimento e do

desenvolvimento de novas drogas e de recursos terapêuticos e de diagnóstico, ainda não

dispõem de tratamentos eficazes ou adequados e afetam milhares de pessoas por todo mundo

(MRAZEK & MOSSIALOS, 2003; MOREL, 2006). Em sua maioria são doenças tropicais

(tais como leishmaniose, malária, doença de Chagas, dengue, dentre outras) que acometem

populações pobres de países menos desenvolvidos (MRAZEK & MOSSIALOS, 2003). O


8

número de mortes e o impacto de algumas destas doenças em várias regiões do mundo tem

sido observado nos últimos anos.

A leishmaniose é uma doença infecciosa zoonótica que afeta homens e animais, sendo

as leishmanias protozoários intra celulares obrigatórios (WHO, 2010). A leishmaniose

prevalece em quatro continentes (Ásia, Europa, África e América), e são endêmicas em 88

países, dos quais 72 são países em desenvolvimento (RATH et al., 2003, WHO, 2010). Os

principais hospedeiros das diferentes espécies de Leishmania são os mamíferos, incluindo a

população humana, onde a transmissão ocorre pela picada da fêmea do inseto Lutzomia

longipalpis. O ciclo evolutivo dessas espécies é caracterizado por apresentar duas formas: a

amastigota (obrigatoriamente intracelular em vertebrados), e a forma promastigota (presente

no tubo digestivo dos vetores invertebrados). Os parasitas permanecem dentro de seus vetores

como promastigotas extracelulares (SAHA et al., 2006) e após a picada do flebotomíneo,

vetor, as formas promastigotas invadem os macrófagos do indivíduo infectado e se

diferenciam e replicam como forma amastigota (JOCHIM & TEIXEIRA, 2009). A

leishmaniose apresenta duas formas clínicas (tegumentar e viceral) que estão associadas a

diversos sinais, sintomas e graus de severidade (ANVISA, 2004; REITHINGER, 2007) e

representa a segunda doença de maior importância publica causada por protozoário;

responsável por altos índices de mortalidade nas regiões endêmicas (RATH et al., 2003,

ROCHA et al., 2003). Diversas drogas são administradas para controlar a leishmaniose tais

como a anfotericina B e o antimonial pentavalente, mas na maioria das vezes apresentam

efeitos colaterais adversos, comprometendo o tratamento do paciente (OUELLETTE et al.,

2004). O Ministério da Saúde relata a incidência de cerca de 35 mil casos de Leishmaniose

Visceral (LV) no período entre 2003 e 2009; já a Leishmaniose Tegumentar (LT) apresenta

média anual de cerca de 26 mil casos registrados no período de 1988 a 2009. As regiões

Nordeste (47,5% dos casos de LV em 2009) e a região Norte (37,3% de LT dos casos

registrados) apresentam os níveis mais críticos da doença (Tabela 1 - MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2010).


9

Tabela 1:. Número de casos de Leishmaniose Visceral e Leishmaniose Tegumentar em

diferentes regiões do Brasil entre os anos de 2005 a 2009. 2005 2006 2007 2008 2009

Regiões LV LT LV LT LV LT LV LT LV LT

Norte 660 10.679 684 8.833 847 9.890 815 8.680 709 8.272

Nordeste 2.011 8.112 1.982 6.169 1.741 5.925 1.739 6.003 1.754 6.910

Sudeste 656 2.809 704 2.868 679 1.898 723 1.592 641 1.605

Sul 3 541 3 573 3 514 0 630 8 464

Centro- Oeste 261 4.388 277 3.852 331 3.095 322 3.005 275 4.492

Brasil 3.597 26.685 3.651 22.397 3.604 21.407 3.852 19.992 3.693 21.824

Fonte: Sinan/SVS/MS

A doença de Chagas ou tripanossomíase americana é causada pelo Trypanosoma cruzi,

parasita da ordem dos Kinetoplastida. É uma doença que ocorre em países da América Latina

(18 países nas regiões da América do Sul e da América Central) (BARRET, 2003; MAYA et

al., 2006; WHO, 2010). A doença de Chagas afeta aproximadamente 16-18 milhões de

pessoas, principalmente na América Latina, onde cerca de 25% da população encontra-se em

risco de contrair a doença (GÜRTLER et al., 2003). Desde 1909, muitas substâncias naturais

e sintéticas foram avaliadas e utilizadas por apresentar atividade tripanocida mas nenhum

fármaco foi eficiente para o tratamento da doença. Os medicamentos usados atualmente no

tratamento, nifurtimox e o benzonidazol, que em muitos casos apresentam efeitos adversos e

podem causar toxicidade sistêmica (MAYA et al., 2006).

No Brasil, atualmente predominam os casos crônicos de doença de Chagas decorrentes

de infecções adquiridas no passado. No entanto, nos últimos anos, a ocorrência da doença tem

sido mais observada nos estados da Amazônia Legal (Tabela 2), com ocorrência de casos

isolados em outros estados (BA, CE, PI, SC, SP) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).


10

Tabela 2:. Número de casos de Doença de Chagas nas regiões do Brasil de 2005 a 2009.

Regiões 2005 2006 2007 2008 2009 2010*

Norte 10 88 157 124 248 61

Nordeste 2 24 3 7 2 1

Sudeste 0 3 0 0 0 0

Sul 24 0 0 0 0 0

Centro-Oeste 0 1 1 0 0 0

Brasil 36 116 161 131 250 62

Fonte: SVS/MS. *Até 02/10/2010 - Dados preliminares sujeito a revisão

2.2.1 Doença global - Câncer

O câncer é um dos principais problemas de saúde no mundo, com mais de 10 milhões

de novos casos diagnosticados e cerca de seis milhões de mortes estimadas no ano de 2000

(Parkin, 2001; Parkin et al., 2001). Desde 1990 a incidência e mortalidade causada por câncer

aumentaram cerca de 20% e os quatro casos mais freqüentes são de pulmão, mama, coloretal

e estômago (Parkin et al., 2001). Em 2007 o câncer de mama foi a segunda principal causa de

morte por câncer em mulheres no Estados Unidos (JEMAL et al., 2007). O câncer de mama é

a neoplasia maligna mais incidente no sexo feminino. Já em 2008, a International Agency for

Research on Cancer/Organização Mundial de Saúde (IARC/OMS) estimou que ocorreria 12,4

milhões de novos casos e 7,6 milhões de óbitos por câncer no mundo. Sendo o câncer de

pulmão, mama e cólon e reto os mais incidentes. Para América Central e do Sul estimou-se

em 2008 cerca de um milhão de novos casos e 589 mil mortes (WORLD CANCER REPORT,

2008). Segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA), do Ministério da Saúde (Tabela 3), o

Brasil registra cerca de 470 mil novos casos e 135 mil mortes por ano. (INCA 2010).


11

Tabela 3:. Estimativa para o ano 2010 de número de casos novos por câncer, em homens e

mulheres.

Neoplasia Maligna

Masculino Feminino Total

Próstata 52.350 - 52.350

Mama Feminina - 49.240 49.240

Traqueia, Brônquio e Pulmão 17.800 9.830 27.630

Cólon e Reto 13.310 14.800 28.110

Estômago 13.820 7.680 21.500

Colo do Útero - 18.430 18.430

Cavidade Oral 10.330 3.790 14.120

Esôfago 7.890 2.740 10.630

Leucemias 5.240 4.340 9.580

Pele Melanoma 2.960 2.970 5.930

Pele não Melanoma 53.410 60.440 113.850

Outras Localizações 59.130 78.770 137.900

Todas as Neoplasias 236.240 253.030 489.270

Fonte: Instituto Nacional de Câncer - INCA/MS

2.3 Angiospermas antárticas: reservatório de microrganismos endofíticos

O continente Antártico apresenta condições climáticas extremas e constitui um dos

ambientes mais inóspitos do planeta (KOSTADINOVA et al., 2009). Muitas das comunidades

microbianas presentes neste continente desenvolveram adaptações o que possibilitaram a sua

permanência em condições extremófilas. As baixas temperaturas, que induzem a formação de

cristais de gelo no ambiente intracelular, provocam a redução da disponibilidade de água,

fator limitante para as comunidades microbiológicas presentes em regiões polares

(GUNDECIMERMAN et al., 2003). Tais condições ambientais são encontradas na Antártica

e resultam em fatores limitantes para o metabolismo, crescimento (COWAN & TOW, 2004) e

biodegradação microbiana (GOCHEVA et al., 2006), além disto, estes fatores atuando sobre

os organismos podem possibilitar a descoberta de novas vias metabólicas e,

consequentemente, novos metabólitos (OARGA, 2009).

O continente Antártico é caracterizado pelo isolamento geográfico e climático e a

maior parte possui pouca ou nenhuma influência antrópica (BRUNATI et al., 2009). A


12

Antártica oferece condições exclusivas para estudar microrganismos isolados

geograficamente de outras comunidades microbianas do planeta em escala de tempo e

evolução; além disso, as diferenças na estabilidade e pressão seletiva entre os ambientes

Antárticos são fatores que influenciam o grau de endemismo e adaptação dos microrganismos

presentes na Antártica (VICENTE, 2000).

A maioria das espécies microbianas encontradas na Antártica são de distribuição

cosmopolita, mas recentemente, têm se relatado novos habitats) e proposto a presença de

microrganismos endêmicos. A colonização microbiana na Antártica ocorre na maioria das

vezes a partir das correntes oceânicas, atmosféricas e animais migratórios (COWAN & TOW,

2004). Segundo Ruisi et al. (2007), a maioria dos fungos descritos para Antártica são

cosmopolitas, sendo estes transportados por esporos, e adaptados e capaz de crescer e se

reproduzir em baixas temperaturas. Atualmente, ambientes extremos como os encontrados na

Antártica tem sido alvo de estudos sobre os mecanismos biológicos de adaptação e tolerância

às condições extremas e sua utilização em processos biotecnológicos (TANG et al, 1997,

BIONDI et al., 2008, MARINELLI et al, 2004; BRUNATI et al., 2009; ROJA et al., 2009).

Segundo Parnikoza et al. (2007), existe no continente Antártico apenas duas plantas

vasculares (angiospermas): Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl. (Caryophyllaceae) e

Deschampsia antarctica Desv. (Poaceae) (Figura 6). Segundo Lewis Smith (1994) a

população de ambas espécies tem aumentado ao longo da Península Antártica no últimos 30

anos, possivelmente devido ao aquecimento global (GROBE et al.,1997). O período de

germinação destas plantas ocorre a partir de novembro (KIRK 1994) e são geralmente

cobertas por neve a partir de abril, desconhece-se se as folhas sobrevivem ao inverno antártico

(LEWIS SMITH, 2003). Wouw et al.(2008), em estudo para determinar relações e padrões de

diversidade de espécies vegetais na Antártica, observou que o fluxo gênico não ocorre em

longa distância, o que limita espécies presentes na Antártica e sugere que estas representem

ecotipos antárticos.


13

Figura 5:. A- Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl. (Caryophyllaceae) e B- Deschampsia

antarctica Desv. (Poaceae).

Deschampsia antarctica, uma planta altamente tolerante ao congelamento (BRAVO et

al., 2001), é uma das duas plantas vasculares adaptadas ao ambiente antártico (KAPPEN

1999). Alguns estudos vêm demonstrando o potencial de D. antarctica em estudos de

bioprospecção. Cuadra et al. (2005) avaliaram atividade biológica de plantas da Patagônia, e

entre os extratos etanólicos estudados, o de D. antarctica apresentou alta toxicidade a larvas

do crustáceo Branchipus stagnalis (L.), do qual foi obtido duas flavonas ativas contra a larva

do crustáceo. Não foi verificado nenhum estudo envolvendo aplicações biotecnológicas de C.

quitensis.

Alguns estudos filogenéticos (WOUW et al.,2008), fisiológicos (ALBERDI et al.,

2002), adaptação do frio (BRAVO et al., 2005; CONCHA et al., 2005; GIANOLI et al., 2004;

GIDEKEL et al., 2003) e de diversidade microbiana (FRENOT et al.,2005; ROSA et al.,2009;

ROSA et al., 2010; ROSADO et al., 2010; UPSON et al.,2008) foram realizados utilizando as

angiospermas da Antártica. Entretanto, pelo nosso conhecimento não foi verificado a

existência de nenhum trabalho envolvendo aplicações biotecnológicas de microrganismos

endofíticos associados a D. antarctica e C. quitensis, o que faz com que este seja um assunto

ainda a ser explorado.

A B


14

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Contribuir para o conhecimento do potencial biotecnológico da micota endofítica

associada a duas angiospermas presentes na Antártica e avaliar estes microrganismos como

fonte de metabólitos bioativos úteis para o desenvolvimento de novas drogas, em especial

contra células tumorais humanas e parasitas dos gêneros Leishmania e Trypanosoma.

3.2 Objetivos específicos

• Isolar fungos endofíticos associados de Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl. e

Deschampsia antarctica Desv. presentes na Península Antártica;

• Depositar todos os isolados de fungos endofíticos obtidos em uma coleção de cultura de

microrganismos para preservação ex-situ da biodiversidade fúngica da Antártica;

• Cultivar todos os fungos endofíticos obtidos, preparar seus extratos brutos e deposita-los

em uma coleção de extratos;

• Testar todos os extratos em ensaios biológicos utilizando:

a. Três linhagens de células tumorais humanas

b. Formas amastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis

c. Formas amastigotas de Trypanosoma cruzi

• Determinar a Concentração Inibitória a 50% (CI50) dos extratos ativos;

• Identificar os fungos cujos extratos apresentaram atividade biológica por meio de

metodologia e técnicas moleculares.


15

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Área de coleta

A Baía do Almirantado está localizada no Arquipélado Shetland do Sul, sendo a maior

Baía da Ilha Rei George, com uma área de aproximadamente 131 Km2. A localização das

áreas de coleta foram determinadas por coordenadas geográficas obtidas por meio do Global

Positioning System (GPS). Os seis pontos de coleta foram Botany point (62º05’S e 58º19’W),

Refúgio Brasileiro II (62º04’S e 58º25’W), Hennequin point (62º07’S e 58º23’W), Ullman

point (62º04’S e 58º21’W), Estação Peruana Macchu Picchu (62º07’S 58º 28’W) e Demay

point (62º12’S e 58º19’W) (Figura 6).

4.2 Coletas das angiospermas Antárticas

Neste trabalho foi realizada a coleta de Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl.

(Caryophyllaceae) e Deschampsia antarctica Desv. (Poaceae) durante o verão austral no mês

de fevereiro de 2008. Para realização das coletas foram aprovadas as devidas licenças junto ao

Ministério do Meio Ambiente e Marinha do Brasil. Em ambas as coletas, foram amostrados

três fragmentos de folha de 60 indivíduos de C. quitensis e 60 indivíduos de D. antarctica.

Três folhas aparentemente saudáveis de cada indivíduo foram amostradas, armazenadas em

sacos plásticos e processadas no Laboratório de Química e Microbiologia da Estação

Antártica Comandante Ferraz (EACF). Uma exsicata representativa de cada planta em cada

ponto de coleta encontra-se depositada no herbário BHCB da UFMG.


16

Figura 6:. Mapa da Baía do Almirantado, Ilha Rei George, Antártica, indicando os locais e o

transecto onde foram coletadas as amostras vegetais. Bp = Botany point (62°05'S, 58°19'W);

Up = Ullman point (62°05'S, 58°20'W); Br = Refúgio Brasileiro II (62°04'S, 58°25'W); Mp =

Estação Antártica Peruana Macchu Picchu (62°07'S, 58°23'W); Hp = Hennequin point

(62°05'S, 58°24'W); e Dp = Demay point (62°12'S, 58°19'W) (Simões et al., 2004 com

modificações). As distâncias entre os pontos de coleta foram 2 km (Bp a Up), 4 km (Up a

Br), 4 km (Br a Mp), 5 km (Mp a Hp), e 10,5 km (Hp a Dp).


17

4.3 Isolamento e preservação dos fungos

As folhas coletadas foram inicialmente limpas com 2% de detergente neutro Extran

(Merck/EUA) e enxaguados com água destilada esterilizada. Três fragmentos de cada folha

foram retirados com auxílio de pinça e tesoura esterilizadas e imersos em álcool 70% (1

minuto), hipoclorito de sódio 2% (3 minutos) e água destilada esterilizada (2 minutos). Após

desinfecção superficial, os fragmentos foram transferidos para placas de Petri contendo Agar

Batata Dextrosado (BDA/Difco) suplementado com 100 μg/mL de cloranfenicol

(Sigma/EUA) para inibir o crescimento de bactérias contaminantes. Alíquotas da água

destilada esterilizada utilizada ao final do processo de desinfecção foram plaqueadas em meio

BDA para avaliar se o processo de desinfecção foi bem sucedido e assegurar que somente os

fungos endofíticos seriam isolados. As placas foram incubadas a 15-18ºC por um período de

até 60 dias e os isolados foram purificados em novas placa de Petri contendo meio BDA.

Os isolados de fungos filamentosos obtidos foram preservados em duplicata em

glicerol 30% a –80ºC e as leveduras obtidas conservadas em caldo GYMP (glicose 2%,

extrato de levedura 0,5%, extrato de malte 1% Na2PO4 0,2%) com 20% de glicerol a -80ºC.

Todos os isolados obtidos durante o estudo foram depositados na Coleção de Microrganismos

e Células do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais.

4.4 Cultivo dos fungos e preparo dos extratos

4.4.1 Fungos Filamentosos

Os fungos filamentosos obtidos foram cultivados em placas de Petri contendo meio

BDA a 15-18ºC. Após 15 dias de crescimento todo o meio de cultura e crescimento micelial

de cada fungo endofítico foi macerado e transferido para tubo cônico de 50 mL. Para a

obtenção dos extratos brutos, foi adicionado 25 mL de etanol P.A (Vetec) em cada tubo

contendo o meio de cultura com o crescimento fúngico. Os tubos foram incubados por 48

horas ao abrigo da luz e o sobrenadante de cada transferido para frascos de 30 mL e tubos de

1,5 mL. Todos os extratos obtidos foram secos em concentrador a vácuo (Savant) com

temperatura inferior a 35ºC e em seguida solubilizados em dimetisulfóxido (DMSO), a uma

concentração de 20 mg/mL e mantidos a -20ºC até utilização no ensaios biológicos.


18

4.4.2 Leveduras

As leveduras foram previamente crescidas em placas de Petri contendo Agar

Sabouraud a 15ºC, e transferidas para tubos contendo 3 mL de caldo GYMP e incubados a

15ºC por até 5 dias. Para obtenção dos extratos foram utilizadas microplacas de 24 poços

contendo em cada poço 1 mL de meio Agar Sabouraud. Em cada poço foram inoculados 50

μL do caldo GYMP com o crescimento das leveduras em duplicata e incubadas a 15ºC por 15

dias. Após o período de incubação, o meio de cultura com crescimento das leveduras foi

macerado com auxilio de um pistilo esterilizado e adicionado 1,5 mL de etanol PA em cada

poço. Todas as microplacas foram incubadas por 48 horas e o sobrenadante de cada poço foi

transferido para tubos novos de 1,5 mL. Os extratos obtidos foram secos em centrífuga a

vácuo (Savant) com temperatura inferior a 35ºC e em seguida solubilizados em DMSO, a uma

concentração de 20 mg/mL e mantidos a -20ºC até utilização nos ensaios biológicos. Todos os

extratos obtidos (fungos filamentosos e leveduras) foram depositados na Extratoteca do

Laboratório de Química de Produtos Naturais do CPqRR/FIOCRUZ para futuros estudos de

bioprospecção.

4.5 Preparo dos extratos vegetais

As folhas de C. quitensis e D. antarctica foram coletadas aleatoriamente dos seis

pontos de coleta, macerados e inoculados em tubos cônicos de 50 mL com 25 mL de etanol.

Os tubos foram mantidos ao abrigo da luz e, após 15 dias, o sobrenadante foi filtrado e

transferido para frascos de cintilação. Todos os extratos brutos obtidos foram secos em

centrifuga a vácuo (Savant) com temperaturas inferior a 35ºC, solubilizados em DMSO, a um

concentração de 20 mg/mL para realização de ensaios biológicos.

4.6 Determinação da atividade biológica

A determinação da atividade biológica dos extratos fúngicos e vegetais foi realizada

por método colorimétrico utilizando os seguintes alvos: três linhagens de célula tumoral,

amastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e forma parasitária de Trypanosoma

cruzi. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.


19

4.6.1 Ensaio com células tumorais

Para a realização do ensaio com células tumorais, três linhagens tumorais humana

foram escolhidas: MCF-7 (glândula mamária), UACC-62 (melanoma) e TK-10 (renal)

(MONKS et al., 1991). De acordo com dados do NCI (National Cancer Institute), estas

linhagens são capazes de detectar 95% dos extratos que contém substâncias antitumorais. Os

procedimentos utilizados nos ensaios com as três linhagens foram os mesmos, exceto o

número de células adicionado em cada poço devido particularidades de cada linhagem. As

suspensões celulares foram diluídas de acordo com a linhagem de modo que 100 µL, foi

colocado em cada poço de uma placa de 96 poços, estes continham 100.000 células TK-10,

100.000 células UACC-62 e 150.000 células MCF-7. Os inóculos foram incubados por 24

horas a 37ºC para estabilização celular. Em seguida foi adicionado as células os extratos numa

concentração de 200 μg/mL e as placas foram incubadas por 48 horas em atmosfera de CO2 e

100% de umidade. A quantificação da multiplicação celular foi medida pelo método

colorimétrico empregando sulfarrodamina B. Este corante se liga aos aminoácidos básicos das

proteínas das células e é utilizado para quantificar a proliferação celular. Os extratos que

foram capazes de inibir a multiplicação celular em pelo menos 60% foram selecionados como

ativos. Os testes foram realizados em triplicatas e com controles positivos utilizou-se

Etoposide, droga anticâncer.

4.6.2 Ensaio contra formas amastigotas de Leishmania amazonensis

A atividade leishmanicida foi avaliada utilizando culturas axênicas da forma

amastigota de Leishmania (Leishmania) amazonensis, pertencentes ao banco de cepas da

Coleção de Leishmania do Centro de Referência em Tipagem de Leishmania do Instituto

Oswaldo Cruz. Os ensaios foram realizados em triplicata e foi baseado no protocolo proposto

por Callahan et al. (1997) com algumas modificações. Formas amastigotas foram adicionadas

a cada poço de uma microplaca de 96 poços, sendo 90 μL de cultura na concentração de 1x108

parasitas/mL e 10 μL dos extratos fúngicos numa concentração de 200 μg/mL. Após as placas

foram incubadas em estufa a 32ºC por 72 horas. A atividade dos extratos testados foi medida

pelo método colorimétrico do MTT (metil tiazol - Sigma/USA) 5 mg/mL. A absorbância dos

poços foi comparada com a absorbância do controle positivo, sem droga, e controle negativo

com a droga utilizada em tratamentos de Leishmaniose, a anfotericina B, na concentração de


20

0,2 μg/mL. Foram considerados ativos extratos capazes de inibir a proliferação das formas

amastigotas em 70%.

4.6.3 Ensaio com Trypanosoma cruzi

Os extratos foram testados por meio do ensaio colorimétrico desenvolvido por

Buckner et al. (1996), com modificações (Oliveira et al., 2006). Este ensaio utiliza uma cepa

de Trypanosoma cruzi (Tulahuen) transformada para expressar beta-galactosidase, enzima

que é capaz de catalisar uma reação colorimétrica quando o cloro-phenol red beta-D-

galactopyranoside (CPRG) é utilizado como substrato. Para a triagem dos extratos, o ensaio

foi realizado utilizando células infectadas com parasitas e extratos fúngicos numa

concentração de 20 µg/mL. Os resultados foram expressos na comparação da absorbância dos

poços inoculados com os poços controle, utilizados células não infectadas, células infectadas

não tratadas, benzonidazol a 1 µg/mL (3,81 µM) (controle positivo) e DMSO diluído em meio

a uma concentração final de 1% (controle negativo).

4.7 Determinação de Concentração Inibitório a 50% (CI50) dos extratos ativos

A determinação da IC50 dos extratos fúngicos ativos seguiram os protocolos dos

ensaios biológicos acima. Os extratos ativos contra as formas amastigotas de L. amazonensis

foram adicionados ao meio contendo 108 parasitos/mL em diferentes concentrações de 100 a

0,2 μg/mL para cálculo da Concentração Inibitória a 50% (CI50) em comparação a droga

controle, anfotericina B. Já os extratos ativos as linhagens tumorais foram testados utilizando

de etoposideo como droga controle em comparação aos extratos ativos inoculados em

concentrações de 100 a 0,2 µg/mL para cálculo da CI50.

4.8 Identificação dos fungos

Todos os isolados que tiveram seu extrato bruto ativo foram selecionados para

identificação molecular por meio de sequenciamento da região espaçadora transcrita interna

(ITS1-5.8S- ITS2) do RNA ribossomal.


21

4.8.1 Extração do DNA total

A extração do DNA total foi realizada de acordo com Rosa et al. (2009). Os fungos

filamentosos foram crescidos por sete dias em ágar Sabouraud e fragmentos de micélio foram

colocados em tubos de 1,5 mL acrescidos de 400 μL de tampão de lise (Tris-HCL -

trishidroximetilaminometano 0,05 M, EDTA – ácido etilenodiamino tetraacético 0,005 M,

NaCL 0,1M e SDS – sódio dodecil sulfato 1%) e deixado a – 20ºC por aproximadamente 10

minutos. O micélio foi macerado com auxílio de um pistilo e foram acrescidos 5 μL de

Proteinase K (50 μg/mL). Após homogeneização, o tubo foi colocado por 30 minutos a 60ºC

em banho seco. Após esta etapa, foram adicionados 162 μL de CTAB de Hoog (Tris 2M,

NaCl 8,2%, EDTA 2M e CTAB 0,2%), seguido de homogeneização em vortex e incubação

por 10 minutos a 65ºC. Em seguida, foram acrescentados 570 μL da mistura clorfórmio/álcool

isoamílico (24:1). Após homogeneização, o tubo foi incubado por 30 minutos em gelo. Em

seguida, o conteúdo foi centrifugado a 13.200 rpm por 10 minutos e o sobrenadante foi

transferido para um novo tudo de 1,5 mL, e acrescentado 10% do volume de uma solução de

acetato de sódio 3M. O tubo foi vertido para homogeneização, incubado a 0ºC por 30 minutos

e centrifugado a 13.200 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo

tubo, onde foi adicionado 50% do volume de isopropanol e centrifugado a 13.200 rpm por 5

minutos. O sobrenadante foi desprezado por inversão. A seguir, foram adicionados 200 μL de

etanol (Merck) 70% e a suspensão foi gentilmente homogeneizada. Após este procedimento, a

amostra foi centrifugada a 13.200 rpm por 5 minutos e o sobrenadante desprezado por

inversão, seguido de nova homogeneização com etanol 70% e centrifugação. A amostra foi

seca em temperatura ambiente, para evaporação do excesso de etanol, e 50 μL de Tris-EDTA

(Tris-HCL 0,01M e EDTA 0,001M) foram adicionados e a mesma foi incubada a 65ºC por 60

minutos para hidratação do DNA. As amostras foram armazenadas em freezer a -20ºC.

4.8.2 Obtenção dos amplicons

Os iniciadores ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’-

TCCTCCGCTTGATATGC-3’) foram utilizados para amplificação das regiões ITS do rDNA,

conforme descrito por White et al. (1990). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi

realizada em um volume final de 50 μL contendo 2 μL de DNA, 1 μL de cada iniciador ITS1

e ITS4 10 μmol-1 (MWG Biotech), 5 μL de tampão de PCR 5X (Fermentas), 2 μL de MgCl2

25mM, 2 μL de dNTP 10 mM, 0,3 μL de TaqDNA polimerase 5U (Fermentas) e o volume


22

final completado com água destilada estéril. As reações de PCR foram realizadas utilizando o

termociclador PCR (Biosystems). O programa consistiu de uma desnaturação inicial a 94ºC

por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 1 minuto de desnaturação a 94ºC, 1 minuto da

anelamento a 55ºC e 1 minuto de extensão a 72ºC, e uma extensão final por 5 minutos a 72ºC.

Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão

TBE 0,5X, eluídos,em tampão de corrida 6X e Gel Red, durante aproximadamente 30 minutos

a 120V. Os géis foram visualizados sob luz ultravioleta e fotografados pelo sistema de foto-

documentação de gel (Vilber Lourmat, France).

4.8.3 Purificação dos amplicons

Os amplicons gerados pela reação de PCR foram purificados utilizando-se

polietilenoglicol (PEG). Ao produto de PCR foi adicionado igual volume de solução de

polietilenoglicol 20% em NaCl 2,5M, que foi mantido em banho-maria à 37ºC por 15

minutos. O tubo foi centrifugado a 13.500 rpm por 15 minutos e o sobrenadante foi retirado e

descartado. A seguir, foram adicionados 125 μL de etanol 70% resfriado a 4ºC. O tubo foi

centrifugado a 13.500 r.p.m. por 5 minutos e o etanol foi retirado. O tubo fio deixado à

temperatura ambiente para evaporação de todo o excesso de etanol. Foram adicionados 10 μL

de água deionizada estéril e o conteúdo do tubo foi homogenizado em vórtex por 15

segundos. Em seguida, o tubo foi incubado em banho- maria a 37ºC por 60 minutos. O

produto obtido foi dosado em NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies) para ser

utilizado na reação de sequenciamento.

4.8.4 Reação de sequenciamento

O sequenciamento foi realizado utilizando o Kit DYEnamicTM (Amersham

Biosciences, USA) em combinação com o sistema de sequenciamento automatizado

MegaBACETM 1000, no Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular (LBEM-

UFMG). Para a reação de sequenciamento foram utilizados 100-150 ng do DNA purificado,

os reagentes presentes no kit e iniciadores. A reação de PCR foi realizada em um volume final

de 10 μL contendo 4 μL do pré-mix (presente no kit de sequenciamento) e 1 μL do iniciador

(5 μmol-1), completando-se o volume final com água deionizada estéril. O programa consistiu

de 36 ciclos de uma desnaturação inicial a 95ºC por 25 minutos, seguido por 15 segundos de


23

anelamento a 50ºC e 3 minutos de extensão a 60ºC. Em seguida, os produtos da reação foram

transferidos para uma placa de sequenciamento de 96 poços para serem precipitados.

4.8.5 Precipitação da reação de sequenciamento

Para precipitação das reações de sequenciamento, 1 μL de acetato de amônio 7,5 M foi

adicionado em cada poço da placa de 96 poços. A solução de acetato de amônio foi

dispensada na parede lateral dos poços e a placa levemente batida sobre a bancada para que as

gotas do acetato de amônio se misturassem à reação. Em seguida, foram adicionados 28 μL de

etanol absoluto (Merck/EUA). A placa foi submetida à agitação em vórtex e incubada por 20

minutos à temperatura ambiente, protegida da luz. Após período de incubação, a placa foi

centrifugada por 45 minutos a 4000 rpm. O sobrenadante foi descartado virando-se a palca

sobre um papel absorvente. Em seguida, foram adicionados 150 μL de etanol 70%

(Merck/EUA). A placa foi novamente centrifugada por 15 minutos a 4000 rpm e o

sobrenadante foi então descartado. Para remoção do excesso de etanol, a placa foi invertida

sobre um papel absorvente, e submetida a um pulso em centrifuga a 900 rpm durante 1

segundo. Em seguida a placa foi mantida em repouso durante 20 minutos, protegida da luz,

para evaporação do etanol. O DNA das amostras precipitado em cada poço da placa foi então

ressuspendido em 10 μL de Loading buffer (presente no kit de sequenciamento). A placa foi

submetida à aitaçao em vórtex por 2 minutos, centrifugada por 1 segundo a 900 rpm e

armazenada a 4ºC, protegida da luz, até injeção das amostras no sistema automatizado

MegaBACETM 1000.

4.8.6 Análise computacional das sequências

As seqüências de DNA foram analisadas, comparando com as seqüências de cultura

tipo depositadas no GenBank, utilizando o programa BLASTn (Basic Local Alignment Search

Tool - versão 2.215 do BLAST 2.0) disponível no portal NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) desenvolvido pelo Nacional Center For Biotechnology

(ALTSCHUL et al., 1997). Os isolados que apresentaram as sequências analisadas com

similaridade ≥98% em relação às sequências já depositadas no GenBank, foram considerados

como pertencentes à mesma espécie ou gênero; já aqueles que apresentaram sequências com

similaridade ≤97%, foram considerados como pertencentes ao mesmo gênero; para sequências

com identidade <93% os isolados foram identificados como espécies desconhecidas ou

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/


24

identificados em família, classe, ordem (ROSA et al., 2010). As sequências do táxons

identificados em nível de classe, ordem, família, gênero ou outros níveis hierárquicos foram

submetidos a análises filogenéticas para determinção de suas proximidades filogenéticas, por

meio do alinhamento dos fragmentos da região ITS1-5.8S-ITS2 do gene do rDNA, utilizando-

se as sequências que possuíam acima de 300 pb. Os isolados que apresentaram sequências

≤300 pb foram considerados como não identificados. A análise filogenética foi conduzida a

partir da comparação das sequências dos fungos endofíticos e as sequências mais próximas

depositadas no GenBank utilizando-se o programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics

Analysis) versão 4 (TAMURA et al., 2007). As árvores filogenéticas foram construídas

utilizando o algorítimo de Neighbor-joining com bootstrap de 1.000 repetições.


25

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Coleta e isolamento dos fungos endofíticos

Ao final da amostragem nos seis pontos de coleta foram obtidos 360 fragmentos de

folhas (total de 180 de C. quitensis e 180 de D. antarctica) e obtidos 564 isolados de fungos

endofíticos (438 isolados de fungos filamentosos e 126 leveduras). Destes, 251 obtidos de C.

quitensis (162 fungos filamentosos e 89 leveduras) e 313 de D. antarctica (276 fungos

filamentosos e 37 leveduras) (Figura 7). A quantidade de isolados de fungos endofíticos

obtidos pode variar de acordo com os ecossistemas onde se encontra as plantas hospedeiras.

Diferentes trabalhos publicados, referente a distribuição de fungos, vêm mostrando que a

diversidade de endofíticos diminui em direção as regiões polares do planeta. De três espécies

vegetais coletadas na floresta boreal e em ecossistema de tundra no Canadá foram isolados

558 de fungos endofíticos (HIGGINS et al., 2007). Estudos voltados para caracterização da

comunidade fúngica presente na Antártica indicam que a quantidade de isolados obtidos pode

variar de acordo com o substrato escolhido. Arenz & Blanchette (2011) obtiveram 455

isolados de fungos em amostras de solo da Antártica; por outro lado, Rosa et al. (2009)

obtiveram apenas 26 isolados de fungos endofíticos associados a D. antarctica. No presente

estudo, a quantidade de isolados fúngicos obtidos foi próxima a encontrada em estudos de

endofíticos de regiões temperadas.


26

Figura 7:. Frequência (%) de fungos endofíticos isolados de Deschampsia antarctica Desv. e

Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl. presentes na Antártica.

5.2 Cultivo dos fungos e obtenção dos extratos etanólicos

No presente trabalho foram produzidos 472 extratos a partir do crescimento dos

fungos endofíticos (438 de fungos filamentosos e 34 das leveduras). Além disso, foram

produzidos extrato das folhas das duas plantas hospedeiras dos fungos endofíticos. Noventa e

dois isolados de leveduras não apresentaram crescimento após o isolamento e por isso seus

extratos não puderam ser produzidos. O estresse abiótico, os nutrientes fornecidos pelo meio

de cultura, o pH do mesmo e a viabilidade celular podem ser alguns dos fatores que

desencadearam a morte destas leveduras.

Diferentes técnicas de cultivo e produção obtenção de extratos microbianos já foram

descritas, as quais constituem etapas importantes para detecção de metabólitos bioativos em

estudos de bioprospecção. Entre estas etapas destacam-se o tipo de meio de cultura utilizado

e o processo fermentativo utilizado (cultivos em condições de fermentação líquida e sólida).

Ezra & Strobel (2003) avaliaram diferentes meios de cultura com o objetivo de verificar

variações na produção de metabólitos antimicrobianos produzidas pelo fungo endofítico

Muscodor albus Worapong, Strobel & W.M. Hess. Segundo estes autores, o meio de cultura

BDA foi o substrato que permitiu M. albus produzir elevados níveis de metabólitos bioativos,

Freq

uenc

iade

isol

ados

(%)

Colobanthus quitensis Deschampsia antarctica TOTAL

Filamentosos Leveduras

Freq

uenc

iade

isol

ados

(%)

Colobanthus quitensis Deschampsia antarctica TOTAL

Filamentosos Leveduras


27

quando comparado ao outros meios testados. Desta forma, o meio de cultura BDA foi

utilizado para o cultivo dos fungos endofíticos associados as angiospermas antárticas. Por

outro lado, a obtenção dos metabólitos bioativos pode ser realizada utilizando técnicas de

fermentação em meio líquido ou meio sólido. A extração utilizando o meio líquido permite

um maior controle das condições de cultivo, tais como pH, umidade, temperatura e

quantidade de nutrientes disponível, entre outros (ROBINSON et al., 2001); já a extração de

metabólitos a partir de meios de culturas sólidos possui a vantagem da maior facilidade na

recuperação do produto (metabólitos produzidos), aumento da produtividade e maior

rendimento. Além disso, diferentes solventes são utilizados para extração de metabólitos

secundários de fungos, tais como acetato de etila (ROSA et al., 2003; PHONGPAICHIT et al.,

2006), diclorometano (SETTE et al., 2006; MACÍAS- RUBALCAVA et al., 2010), metanol

(BRUNATI et al., 2009; VAZ et al., 2009), hexano (MUTHUVELAN & RAJA, 2008) e

etanol (GAMBOA et al., 2001).

No presente trabalho foi utilizado o etanol como solvente para obtenção dos extratos

dos fungos endofíticos de C. quitensis e D. antarctica, devido à sua polaridade e afinidade por

moléculas de baixa massa molecular (metabólitos secundários). Alem disto, este solvente

penetra de forma satisfatória nos meios de cultura sólidos (VIZCAINO et al., 2005) e possui

baixa toxicidade quando comparado ao metanol. Após os processos de cultivo e produção dos

extratos, foi obtido rendimento de 0,82 a 15,8 mg de extrato, quantidade suficiente para

realização de todos os ensaios de triagem e CI50 sobre as células tumorais humanas e formas

amastigotas de L. amazonesis e contra T. cruzi.

5.4 Atividades biológicas

Todos os 474 extratos produzidos (189 obtidos de C. quitensis, 284 de D. antarctica e

dois extratos de folha de cada uma das plantas) foram avaliados a uma concentração de 20

µg/mL nos ensaios biológicos selecionados. Dentre os extratos avaliados, 33 (7%) foram

ativos contra pelo menos um dos alvos testados. Todos os extratos ativos foram produzidos

por fungos filamentosos. Nenhum extrato produzido pelas leveduras apresentou atividade

biológica. Em todas as áreas coletas obtivemos isolados com atividade biológica.

Trabalhos de triagem utilizando fungos de ambientes tropicais como fonte de

metabólitos bioativos mostram que a porcentagem de atividade pode variar de 10 a 40%

(ROSA et al., 2003; HUANG et al., 2008; VAZ et al., 2009). Poucos trabalhos de


28

bioprospecção foram realizados até o momento utilizando microrganismos obtidos de

ecossistemas da Antártica. Entre estes estudos, Brunati et al. (2009) obtiveram 29% de

atividade microbiana a partir de fungos filamentosos coletados em lagos antárticos e

Gonçalves (2011) obteve 128 isolados de fungos filamentosos, dos quais 24% foram capazes

de produzir extratos bioativos. Apesar da porcentagem de extratos ativos produzidos pelos

fungos endofíticos associados as angiospermas antárticas ter sido menor em comparação com

os resultados de Brunati et al. (2009) e Gonçalves (2011), a mesma se encontra próximo a

faixa limite exibida em outros trabalhos de bioprospecção de isolados fúngicos.

Dos 33 extratos ativos, cinco foram capazes de inibir a proliferação de duas das

linhagens de células tumorais humanas (quatro ativos sobre a linhagem MCF-7 e um sobre

TK-10) (Tabela 6). A atividade citotóxica sobre as células tumorais foi mais acentuada para

os extratos produzidos pelos endofíticos obtidos de C. quitensis. Apenas o isolado UFMGCB

2661, obtido de D. antarctica, foi capaz de inibir o crescimento da linhagem tumoral TK-10.

Os 27 extratos que apresentaram atividade leishmanicida foram obtidos dos fungos

endofíticos associados a D. antarctica. Nenhum extrato foi capaz de inibir o crescimento das

formas amastigotas de T. cruzi. Dos quatro extratos obtidos das folhas das plantas

amostradas,dois de C. quitensis e dois de D. antarctica, nenhum foi ativo para os alvos

testados (Tabela 4).


29

Tabela 4:. Extratos dos isolados de fungos endofíticos com atividades biológicas ≥60%, contra células tumorais humanas e ≥70% contra formas amastigotas de Leishmania amazonensis e Trypanosoma cruzi, quando testado a concentração de 20 µg/mL. Planta Hospedeira Isolado

aUFMGCB

bMCF-7 cTK-10 dUACC-62 Morte de eLA (%) Morte de fTC (%)

Deschampsia antarctica 2301 6 13 0 72g 0

2508 1 11 9 94 9

2564 0 19 1 91 4

2673 14 29 1 89 0

2569 0 17 5 94 9

2630 7 26 4 90 4

2682 2 15 5 94 0

2272 0 19 0 70 0

2515 0 0 0 94 0

2518 0 32 6 94 3

2528 5 8 2 91 5

2560 0 0 3 94 2

2649 0 31 1 89 4

2650 9 24 0 82 0

2667 0 42 6 93 0

2669 0 10 3 74 0

2632 0 17 5 91 9

2567 12 24 1 83 3


30

2661 0 60 3 44 6

2256 0 6 0 70 0

2629 13 13 1 94 7

2653 14 26 2 93 2

2659 0 32 5 93 1

2666 0 25 6 84 1

2670 2 38 2 82 0

2672 3 34 0 86 0

2687 2 32 0 89 0

2697 6 24 1 93 3

Colobanthus quitensis 2455 82 43 11 33 8.5

2290 62 25 27 8 8

2479 77 53 18 40 4

2656 61 30 4 34 0

2794 0 20 75 47 0

Drogas controles etoposídeo 44,5 80 83 - -

anfotericina B - - - 71 -

benzonidazol - - - - 73 aUFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais. bMCF-7 = glândula mamária, cUACC-62 =

melanoma, dTK-10 = renal, eLA = Leishmania amazonensis, fTC = Trypanossoma cruzi. gEm negrito estão marcados os valores de atividade dos

extratos acima da linha de corte estabelecida.


31

Entre os seis extratos ativos contra as células tumorais, foi observado um grau de

seletividade quanto a atividade testada. Quatro extratos (UFMGCB 2455, UFMGCB 2290,

UFMGCB 2479 e UFMGCB 2656) apresentaram efeito apenas contra a linhagem MCF-7. O

extrato do fungo UFMGCB 2661 foi ativo apenas contra a linhagem TK-10. O extrato do

isoladoUFMGCB 2794 foi ativo apenas contra a linhagem UACC-62. Estes seis extratos não

apresentaram atividade (porcentagem de inibição ≤ 47%) sobre as formas amastigotas de L.

amazonensis e T. cruzi. Por outro lado, os 27 extratos que exibiram atividade leishmanicida

não foram ativos contra as três linhagens de células tumorais e formas amastigotas de T. cruzi.

Vinte cinco dos extratos com atividade leishmanicida apresentaram porcentagem de inibição

acima do valor exibido pela anfotericina B (71%). A seletividade exibida por estes extratos os

tornam bons candidatos para o isolamento dos metabólitos com atividade citotóxica e

leishmanicida observada.

5.5 Identificação dos fungos ativos

Os fungos bioativos foram identificados por meio do sequenciamento da região ITS do

gene do RNA ribossomal. Dez isolados de fungos bioativos não apresentaram amplicons com

concentração suficiente ou, após seqüenciamento, não apresentram sequências com boa

qualidade para identificação molecular. Estes isolados não identificados foram nomeados

como Fungos endofíticos sp. 2 a sp. 11. As sequências de nucleotídeos dos isolados de fungos

produtores de extratos bioativos foram alinhadas utilizando o algoritmo BLASTn e as cinco

sequências mais próximas depositadas no GenBank foram analisadas (Tabela 5). Além disso,

as sequências dos fungos bioativos foram submetidas a análises para inferências filogenéticas

em relação aos táxons mais próximos.

Adams et al. (2006) descreve que o filo que apresenta maior freqüência de isolados na

Antártica é Ascomycota e seus anamorfos, seguidos por Basidiomycota e Zygomycota. No

presente estudo, todos os fungos identificados pertencem ao filo Ascomycota e estão

distribuídos em quatro classes de fungos: Leotiomycetes, Dothiodeomycetes, Sordariomycetes

e Hyphomycetes, sendo as duas primeiras mais dominante nos isolados identificados. Em

estudo de fungos filamentosos isolados de lagos antárticos foi observado a presença destas

classes, sendo também a maioria dos isolados pertencentes as classes Leotiomycetes e

Dothiodeomycetes (GONÇALVES, 2011).


32

De acordo com Bérdy (2005), metabólitos produzidos por fungos filamentosos são

principalmente obtidos de isolados pertencentes ao filo Ascomycota e seus anamorfos,

apresentando um total de 6.400 de um total de 8.600 metabólitos fúngicos conhecidos. Os

táxons identificados neste estudo foram incluídos nos gêneros: Alternaria Nees, Cadophora

Lagerb. & Melin, Davidiella Crous & U. Braun, Helgardia Crous & W. Gams, Herpotrichia

Fuckel, Microdochium Syd., Oculimacula Crous & W. Gams, Phaeosphaeria I. Miyake e

Ypsilina J. Webster, Descals & Marvanová (Tabela 5).


33

Tabela 5:. Cinco melhores sequências alinhadas no BLAST de fungos endofíticos bioativos de Deschampsia antarctica Desv. e Colobanthus quitensis

(Kunth) Bartl., com substrato e origem de cada sequência. Fungo Endofítico

(UFMGCB*)

Identidade

(%)

Descrição dos melhores alinhamentos

[no. de acesso no GenBank]

Substrato e origem Referência Identificação final**

2569 96 Fungo não cultivável [EU516862] Solo coberto de neve, Áustria Não publicado Cadophora luteo-olivacea

95 Cadophora luteo-olivacea [FJ486276] Indeterminado Não publicado

94 C. malorum [AB190402] Indeterminado Não publicado

94 C. malorum [GU212434] Refúgio de madeira, Antártica Blanchette et al. (2010)

95 C. luteo-olivacea [GU212374] Refúgio de madeira, Antártica Blanchette et al. (2010)

2564 88 Alternaria sp. [EU747137] Folhas de Deschampsia antarctica,

Antártica

Rosa et al. (2009) Alternaria sp. 3

88 Alternaria sp. [EU747136] Folhas de D. antarctica, Antártica Rosa et al. (2009)




2508 95 Alternaria sp. [EU747153] Folhas de D. antarctica, Antártica Rosa et al. (2009) Alternaria sp. 2








http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/307548396?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=4&RID=K8EYK05Y01S

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/189485950?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=K92NRJAM011

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/189485938?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=K94F3SY201N



34








2272 98 Phaeosphaeria herpotrichoides

[FJ911873]

Talo da alga Adenocystis

utricularis, Antártica

Loque et al. (2010) Phaeosphaeria herpotrichoides

98 Fungo sp. [FJ911889] Folhas de Colobanthus quitensis,

Antártica

Rosa et al. (2010)

98 Ascomycetes não cultivável [AM901930] Resíduo de poeira de casa,

Finlândia

Pitkaranta et al. (2007)

98 Fungo não cultivável [FJ237155] Sacos de solo alpino coberto de

neve, Áustria

Não publicado


Finlândia


2518 92 Phaeosphaeria sp. [EU747142] Folhas de D. antarctica, Antártica Rosa et al. (2009) Phaeosphaeria sp.

92 Phaeosphaeria sp. [FJ911893] Folhas de C. quitensis, Antártica Rosa et al. (2010)

93 Phaeosphaeria dennisiana [AF439478] Fungos fitopatógenos associados a

Minuartia sedoides, Suíça

Camara et al. (2002)

90 Phaeosphaeria sp. [EU747151] Folhas de D. antarctica, Antártica Rosa et al. (2009)




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/189485933?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=K95743UK011




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/189485939?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=K9J85G4301N


35

2528 92 Phaeosphaeria sp. [EU747142] Folhas de D. antarctica, Antártica Rosa et al. (2009) Phaeosphaeria sp. 3

91 Phaeosphaeria sp. [FJ911893] Folhas de D. antarctica, Antártica Rosa et al. (2009)

93 P. dennisiana [AF439478] Fungos fitopatógenos associados a















89 Phaeosphaeriaceae não cultivável

[EF635691]

Solo alpino, Áustria Oberkofler et al. (2008)



89 Phaeosphaeria sp. [FJ911893] Folha de C. quitensis, Antártica Rosa et al. (2010)



89 Phaeosphaeria padellana [AF439496] Fungos fitopatógenos associados a Camara et al. (2002)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/241914495?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=R1P4EE0D01N







http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/157367838?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=4&RID=R1PMR0P701S

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/241914495?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=R1PXT0CU01S


36

M. sedoides, Suíça



95 Uncultured Phaeosphaeriaceae

[EF635691]




M. sedoides, Suíça




93 Phaeosphaeriaceae não cultivável

[EF635691]




2630 94 Helgardia sp. [AM262430] Endofítico de Dactylis glomerata,

Espanha

Não publicado Helgardia sp.


Finlândia


92 Ypsilina graminea [GQ411306] Água de riacho, Portugal Seena et al. (2010)

92 Volucrispora não cultivável [EU516740] Solo coberto pela neve, Áustria Não publicado

92 Y. graminea [GQ411305] Água de riacho, Portugal Seena et al. (2010)

2632 85 Y. graminea [GQ411306] Água de riacho, Portugal Seena et al. (2010) Ypsilina graminea

85 Volucrispora não cultivável Solo coberto pela neve, Áustria Não publicado






http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/95136111?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=KB93BVHB01S

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/300249549?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=5&RID=KB93BVHB01S

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/300249550?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=KBKH4REN01N


37

[EU516740]

85 V. graminea [AJ748690] Rizosfera de Triticum aestivum,

Inglaterra

Não publicado

Y. graminea [GQ411305] Água de riacho, Portugal Seena et al. (2010)

Y. graminea [GQ411304] Água de riacho, Portugal Seena et al. (2010)

2682 94 Fungo sp. [HQ602655] Espinhos de Pinus Monticola,

Estados Unidos

Não publicado Herpotrichia juniperi

94 Ascomycota sp. [FN178473] Raíz de D. antarctica, Antártica Upson et al. (2009)

94 Sarcosomataceae não cultivável

[EF635708]

Solo descoberto nos Alpes, Áustria Oberkofler et al. (2008)

94 Fungo sp. [HM123708] Decompositor de folha Pinus

arizonica, Estados Unidos

U'ren et al. (2010)

94 Fungo sp. [HM123613] Decompositor de folha P.arizonica,

Estados Unidos

U'ren et al. (2010)

2567 93 Fungo endofítico [GU581208] Folhas de Calamagrostis purpurea,

Noruega

Não publicado Oculimacula sp.

93 Fungo não cultivável [EU516862] Solo coberto de neve, Áustria Não publicado

93 Oculimacula yallundae [AY713294] Folha com mancha de Pyrenopeziza

brassicae, Polônia

Karolewski et al. (2006)

93 O. acuformis [AY266146] Indeterminado Não publicado

93 Helgardia aestiva [AY266145] Indeterminado Não publicado

2661 92 Fungo sp. [FJ911881] Folha de C. quitensis, Antártica Rosa et al. (2010) Fungo endofítico sp.

91 Fungo endofítico [EU747157] Folha de D. antarctica, Antártica Rosa et al. (2009)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/109254790?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=3&RID=KBKH4REN01N

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/224028008?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=KBN1NG3V014

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/157367855?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=3&RID=KBN1NG3V014

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/291220199?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=KBPWRWXU011



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/189485954?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=KBVZB09001N


38

91 Tetracladium não cultivável [GU055598] Solos agrícolas, Áustria Klaubauf et al. (2010)

91 Fungo não cultivável [FJ237072] Solo coberto pela neve, Áustria Não publicado

91 Fungo sp. [FJ911897] Folhas de C. quitensis, Antártica Rosa et al. (2010)

*UFMGCB = Coleção de Microrganismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais. **Identificação final após análise fiologenética em

comparação com os táxons mais próximos.




39

Alguns do táxons de fungos endofíticos obtidos das angiospermas antárticas

apresentaram sequências próximas a fungos obtidos na Antártica e ecossistemas temperados

ou frios (Tabela 5). Muitas teorias têm sido propostas como possíveis mecanismos utilizados

pelos fungos para sobreviver em regiões polares e ambientes frio. Robinson (2001) relatou

que os fungos que vivem tanto no Ártico ou na Antártica, utilizam diferentes mecanismos

fisiológicos para sobreviver nestes ambientes frios, como acumulando trealose e outros

açúcares crioprotetores. Outros autores sugerem que existam modificações celulares na

membrana (ONOFRI et al., 1999), produção e secreção de proteínas anticongelantes

(SNINDER et al., 2000), adaptações bioquímicas (FENICE et al., 1998) e adaptações

morfológicas, como a latência dos esporos no período de congelamento (MARSHALL 1998;

ROBINSON 2001), hifas escuras devido à produção de melanina (ONOFRI et al., 2004). No

presente trabalho, obtivemos espécies que são amplamente descritas em ambientes Antártico,

sugerindo que estes microrganimos estejam adaptados às condições de estresse destes

ambientes frios.

Os isolados UFMGCB 2301, 2508, 2564 e 2673 apresentaram sequências de

nucleotídeos com identidade entre 88 e 96% e proximidade filogenética em relação a

sequências de diferentes táxons de Alternaria (Figura 8a). Estes isolados foram identificados

como Alternaria sp. 1, Alternaria sp. 2, Alternaria sp. 3 e Alternaria sp. 4. Alternaria é um

gênero anamorfo de distribuição cosmopolita, algumas espécies deste gênero são isoladas

como endofíticos e já foram encontradas colonizando assintomaticamente várias plantas,

como caules de Gossypium (WANG et al.,2007); casca, folha e raiz de Aegle marmelos

(GOND et al.,2007); folhas de plantas medicinais (LI et al., 2005); cactos

(SURYANARAYANAN et al., 2005), entre outros.

A sequência do isolado UFMGCB 2569 apresentou 96% de identidade em relação a

sequência do fungo não cultivável (número de acesso EU516862 no GenBank). Entretanto,

esta sequência também foi 95 e 94% semelhante a Cadophora luteo-olivacea (FJ486276) e

Cadophora malorum (AB190402 e GU212434). A partir da análise filogenética comparativa

entre sequência do isolado UFMGCB 2669 e sequências de espécies mais próximas

depositadas no GenBank, foi verificada uma diferença de cinco nucleotídeos (1%) em relação

a fungo não cultivável (EU516862) e 13 (2,6%) em relação a sequência de nucleotídeos de

Cadophora luteo-olivacea (FJ486276) (Figura 8b); e este isolado foi identificado como C.

luteo-olivacea. O gênero Cadophora é amplamente encontrado em estudos de fungos

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/307548396?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=4&RID=K8EYK05Y01S


40

associados a madeira em decomposição na Antártica (BLANCHETTE et al., 2004; ARENZ et

al.,2006; DUNCAN et al.,2006; ARENZ & BLANCHETTE, 2009; BLANCHETTE et al.,

2010).

As sequências dos isolados UFMGCB 2515, 2518, 2528, 2560, 2649, 2650, 2667 e

2669 apresentaram identidades de 90 a 94% em relação a sequências de diferentes espécies de

Phaeosphaeria depositadas no GenBank. As sequências destes isolados foram submetidos a

análise de proximidade filogenética em relação as espécies mais próximas depositadas no

GenBank e apresentram diferenças de 13 (2,6%) a 70 (14%) nucleotídeos com diferentes

táxons de Phaeosphaeria (Figura 8c). Estes isolados foram identificados como Phaeosphaeria

sp. 1, sp. 2 sp. 3, sp. 4, sp. 5, sp. 6, sp. 7 e sp. 8 (Figura 8c). A sequência do isolado

UFMGCB 2272 apresentou 98% de similaridade em relação a sequência da espécie algícola

Phaeosphaeria herpotrichoides (FJ911873), isolada do talo da macroalga Adenocystis

utricularis coletada na Península Antártica (LOQUE et al., 2010), sendo portanto identificado

como pertencente a esta espécie. Na Antártica, Onofri et al. (1999), Connell et al. (2006) e

Fell et al. (2006) isolaram espécies de Phaeosphaeria a partir de amostras de solo e madeira

(ARENZ et al., 2006).

O isolado UFMGCB 2630 apresentou sequência com 94% de identidade em

comparação com as sequências dos táxons Helgardia sp. (AM262430) e Ascomiceto não

cultivável (AM901839). Após análise das sequencias, o isolado UFMGCB 2630 apresentou

23 (5%) nucleotídeos de diferença em relação a Helgardia sp. (AM262430) (Figura 8d),

sendo este isolado identificado como Helgardia sp. Espécies do gênero Helgardia já foram

descritas com patógenos de cereais (CROUS et al., 2006) e endofíticas de Dactylis glomerata

(Poaceae) (MÁRQUEZ et al. 2007).

A sequência do isolado UFMGCB 2567 apresentou 93% identidade com sequências

de dois fungos não identificados, bem como espécies do gênero Oculimacula. Este isolado

apresentou 14 (3%) nucleotídeos de diferença com a sequência Oculimacula acuformis

AY266146) e foi identificado como Oculimacula sp. (Figura 8d). Upson et al. (2009)

encontraram O. yallundae associado a raiz de D. antarctica. Além disso, a espécie O.

yallundae já havia sido isolada de folhas de Brassica napus (Brassicaceae) na Nova Zelândia,

sugerindo que este fungo esta adaptado a ambientes frio.

A sequência do isolado UFMGCB 2682 apresentou 94% de identidade com diferentes

sequências de fungos não identificados e quando comparada filogeneticamente apresentou

três (0,6%) nucleotídeos diferentes em relação as sequências de Fungal sp. (HQ6002655 e

http://en.wikipedia.org/wiki/Poaceae

http://en.wikipedia.org/wiki/Brassicaceae


41

FJ911896) e de Herpotrichia juniperi (FJ839639). Desta forma, pela proximidade

filogenética, este isolado foi identificado como H. juniperi. Lilja et al. (2010) identificaram H.

juniperi como fitopatógeno e causadora de doença em árvores na Finlândia (LILJA et at.,

2010). O isolado UFMGCB 2661 apresentou sequência com 92% de identidade com

sequência de Fungal sp. UFMGCB 2603 (FJ911881) e 91% com diferentes táxons de fungos

não cultiváveis. Após análise filogenética em relação a proximidade em relação a estes fungos

não identificados, a sequência do isolado UFMGCB 2661 variou de 23 (5%) nucleotídeos

(Figura 8d). Este isolado foi portanto identificado como Fungo endofítico sp.

(a)

Alternaria oregonensis [FJ266478] Lewia infectoria [AY154691] Alternaria triticina [GU594743] Alternaria metachromatica [AY762946] Lewia ethzedia [AY278833] Lewia hordeicola [AJ867479]

Alternaria sp. [EU747137] UFMGCB 2564

UFMGCB 2508 UFMGCB 2673

UFMGCB 2301 Chalastospora obclavata [FJ839616]

Alternaria alternata CBS 916.96 [FJ196306]

Acroconidiella sp. [FJ914709] Pleosporales sp. [HQ649942] Embellisia phragmospora [FJ357314] Monodictys sp. [FJ914710]

Tetracladium setigerum [HQ647302] Trametes versicolor [AF042324]

61

55

86

66

79

72

53 72

0,1


42

(b)

(c)

Cadophora luteo-olivacea [FJ486276] Fungal sp. [FJ235941] Cadophora malorum [GU212434] Phialophora sp. [FJ946482] UFMGCB 2569 Uncultured fungus [EU516862] Cadophora fastigiata [AY787724] Trametes versicolor [AF042324]

60

72

53

63

0,2

Phaeosphaeria dennisiana [AF439478] UFMGCB 2560 Phaeosphaeria sp. [EU747142] Phaeosphaeria oreochloae [AF439494] Phaeosphaeria alpina [AF439471]


Phaeosphaeria herpotrichoides [FJ911873] Phaeosphaeria oryzae [AF250833]


UFMGCB 2649 UFMGCB 2669 Phaeosphaeria padellana [AF439496]

Phaeosphaeria vagans [AF439508] Trametes versicolor [AF042324]

79

61

61

65

99

76

99

0,2


43

(d)

Figura 8:. Análise filogenética entre os fungos filamentosos obtidos de Deschampsia

antarctica Desv. e as sequências de fungos mais próximos retiradas do GenBank. A árvore foi

construída com base nas sequências do gene do rRNA (ITS1-5.8S-ITS2). A árvore foi

construída utilizando a sequência do fungo Trametes versicolor [AF042324] como grupo

externo.

5.5 Determinação de CI50 dos extratos ativos

Todos os extratos ativos dos fungos endofíticos foram avaliados em concentrações de

0,2 a 100 µg/mL para o cálculo e determinação da CI50, os quais exibiram valores que

variaram de 0,2 a 20 µg/mL (Tabela 6). Os extratos dos táxons endofíticos identificados

como Alternaria sp. apresentaram valores de CI50 entre 3,2 e 20 µg/mL contra L.

amazonensis. O táxon Alternaria sp. UFMGCB 2673 produziu o extrato com o menor valor

de CI50 (3,2 µg/mL). Espécies de Alternaria já foram descritas como produtoras de diferentes

UFMGCB 2630 Phialophora mustea [AB190404] Helgardia aestiva [AY266145] Oculimacula acuformis [AY266146] Ypsilina graminea [GQ411306] Helgardia sp. [AM262430] Rhynchosporium commune [HM627492] Helgardia anguioides [AY266144]

UFMGCB 2567 Ascomycota sp. [FN178473] Herpotrichia juniperi [FJ904492]

UFMGCB 2682 Fungal sp. [HQ602655]

UFMGCB 2661 Fungal sp. [FJ911881]

Endophytic fungus [EU747157] Trametes versicolor [AF042324]

98

98

69

0,1


44

metabólitos bioativos. Espécies de Alternaria têm sido caracterizadas quanto a atividade

antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Candida albicans (CHRISTOPHERSEN et

al.,1999; FERNANDES et al.,2009; VAZ et al.,2009). Espécies deste gênero tem sido

relatadas como produtoras de taxol, substância anticancerígena utilizada em diversos

tratamentos (STROBEL et al. 1996; VURRO et al. 1998). Li et al. (2005) isolaram fungos

endofíticos isolados de plantas medicinais chinesas e obtiveram 33% de isolados de

Alternaria sp. com atividade contra fungos patogênicos e/ou célula causadora de tumor

gástrico. Além disso, substâncias com atividades biológicas produzidas por Alternaria tem

sido isoladas e identificadas. Cota et al. (2008) isolaram a altenusina, substância com

atividade contra enzima tripanotioma redutase, de um isolado de Alternaria sp. obtido da

planta Trixis vauthieri DC (Asteraceae). Estes autores detectaram valores de CI50 de 0,3 a 4,3

µM para esta substância. Dois metabólitos, altechromona A e herbarin A, foram isolados a

partir Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire, com atividade antimicrobiana (GU et al.,

2009).

O extrato do fungo Cadophora luteo-olivacea UFMGCB 2569 apresentou CI50 de 20

µg/mL contra L. amazonensis. O gênero Cadophora representa um dos Ascomycota

responsáveis pela decomposição de matéria orgânica em ambientes Antárticos (DUNCAN et

al.,2006; ARENZ & BLANCHETTE, 2009; BLANCHETTE et al., 2010). Cadophora luteo-

olivacea foi relatada como um fitopatógeno de Kiwi (PRODI et al., 2005), mas já foi obtido

como endofítico de plantas medicinais na China (CHEN et al., 2010). Na Antártica, esta

espécie foi frequentemente encontrada em madeira em decomposição (BLANCHETTE et al.,

2010), em amostra de solo (ARENZ et al., 2006; ARENZ & BLANCHETTE 2011),

associados a musgos (TOSI et al., 2002) e de folhas de Colobanthus quitensis (ROSA et al.

2010).

O extrato de Davidiella tassiana UFMGCB 2455 apresentou atividade citotóxica

seletiva contra a linhagem MCF-7, com valor de CI50 de 20 µg/mL. Davidiella tassiana já foi

descrita como endofítico de diferentes plantas como: Pinus halepensis (Pinaceae)

(BOTELLA & DIEZ 2010), Colobanthus quitensis (ROSA et al., 2010), Dactylis glomerata

(Poaceae) (MARQUEZ, 2007) e Coffea arabica (Rubiaceae) (SETTE et al., 2006).

Entretanto, não foram encontrados relatos de atividade biológicas produzidas por espécies de

Davidiella.

Os extratos obtidos de dois isolados de Microdochium phragmitis e um isolado de

Microdochium sp. obtidos de folhas de C. quitensis (UFMGCB 2479, 2656 e 2290,


45

respectivamente) apresentaram atividade citotóxica seletiva, com valores de CI50 entre 8 a 17

µg/mL, sobre a linhagem MCF-7 [valores estes abaixo do valor do etoposideo (16 µg/mL)].

Márquez et al. (2010) obtiveram espécies de Microdochium como endofíticas de Holcus

lanatus (Poaceae) e bambu (MORAKOTKARN et al. 2007). Zhang et al. (2008) obtiveram

quatro substâncias, três novos derivados de isocumarina e uma monocerina, bioativas de

Microdochium bolleyi [espécie endofítica associada a Fagonia cretica (Zygophyllaceae)],

com atividades antifúngica, antibacteriana e antialgal.

Dez extratos produzidos por táxons do gênero Phaeosphaeria mostraram atividade

leishmanicida seletiva com valores de CI50 de 0,4 a 55 µg/mL. Entre os táxons de

Phaeosphaeria, o isolado UFMGCB 2669 se destacou por apresentar CI50 de 0,4 µg/mL,

valor próximo ao obtido para a anfotericina B. Espécies do gênero Phaeosphaeria foram

descritas por Zhang et al. (2008) como produtoras de metabólitos com atividade

antimicrobiana frente a Streptococcus pneumoniae e Candida albicans. Pittayakhajonwut et

al. (2008) isolaram 11 metabólitos bioativos de espécies de Phaeosphaeria, que tiveram

atividades antibacteriana (contra Mycobacterium tuberculosis) e citóxica (contra células

tumorais renais, de pele, mama e pulmão.

Os isolados UFMGCB 2653, UFMGCB 2672 e UFMGCB 2687, fungos endofíticos

não identificados obtidos de D. antarctica, apresentaram atividade leishmanicida seletiva com

valores de CI50 entre 0,2 a 20 µg/mL. Estes isolados não puderam ser identificados pelos

métodos moleculares utilizados neste estudo até o momento. Novas metodologias moleculares

e a caracterização das estruturas de reprodução assexuada serão posteriormente utilizadas para

a correta identificação destes isolados.

http://es.wikipedia.org/wiki/Zygophyllaceae


46

Tabela 6:. Valores de CI50 (μg/mL) dos extratos de fungos endofíticos bioativos.

Isolado de fungo endofítico aUFMGCB bUACC-62 cMCF-7 dTK-10 Morte de eLA

Alternaria sp. 1 2301 ntf nt nt 20

Alternaria sp. 2 2508 nt nt nt 20

Alternaria sp. 3 2564 nt nt nt 12,5

Alternaria sp. 4 2673 nt nt nt 3,2

Cadophora luteo-olivacea 2569 nt nt nt 20

Davidiella tassiana 2455 nt 20 nt nt

Helgardia sp. 2630 nt nt nt 3,4

Herpotrichia sp. 2682 nt nt nt 3,5

Ypsilina graminea 2632 nt nt nt 20

Microdochium sp. 2290 nt 17 nt nt

Microdochium phragmitis 2479 nt 8 nt nt

Microdochium phragmitis 2656 nt 12,5 nt nt

Oculimacula sp. 2567 nt nt nt 1,6

Phaeosphaeria herpotrichoides 2272 nt nt nt 20

Phaeosphaeria sp. 1 2515 nt nt nt 20


Phaeosphaeria sp. 3 2528 nt nt nt 1,95


47



Phaeosphaeria sp.6 2650 nt nt nt 5


Phaeosphaeria sp. 8 2669 nt nt nt 0,4

Fungo endofítico sp. 1 2653 nt nt nt 20 gFungo endofítico sp. 2 2661 nt nt 20 nt gFungo endofítico sp. 3 2256 nt nt nt 20 gFungo endofítico sp. 4 2629 nt nt nt 16,5 gFungo endofítico sp. 5 2659 nt nt nt 25,1 gFungo endofítico sp. 6 2666 nt nt nt 9,26 gFungo endofítico sp. 7 2670 nt nt nt 3,27 gFungo endofítico sp. 8 2672 nt nt nt 0,2 gFungo endofítico sp. 9 2687 nt nt nt 9,6 gFungo endofítico sp. 10 2697 nt nt nt 1,5 gFungo endofítico sp. 11 2794 20 nt nt nt

Drogas controles etoposideo 16 16 16 nt

anfotericina B nt nt nt 0,2 aUFMGCB = Coleção de Microrganismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais. bMCF-7 = glândula mamária, cUACC-62 = melanoma, dTK-10 = renal, eLA = Leishmania amazonensis, fnt = não testado. gFungos não identificados que não foram obtidos amplicons para seqüenciamento.


48

6 CONCLUSÕES

Nos últimos anos, alguns estudos vêm demonstrando a importância ecológica, evolutiva e

biotecnológica dos fungos endofíticos associados a plantas de diferentes ecossistemas do

planeta. Entretanto, poucos dados foram gerados referentes a diversidade e aplicações

biotecnológicas do fungos presentes nas condições extremas da Antártica. O isolamento de

564 fungos endofíticos associados as angiospemas presntes na Antártica indica que estas

plantas representam um reservatório promissor e reforça a importância de estudos que visem a

caracterização de microrganismos presentes em ambientes extremos.

Os extratos de nove gêneros de fungos associados as angiospermas antárticas

apresentaram-se ativos contra os alvos testados: Alternaria, Cadophora, Davidiella,

Helgardia, Herpotrichia, Microdochium, Oculimacula, Phaeosphaeria e Ypsilina. Este

resultado sugere a capacidade de produção de moléculas bioativas promissoras, as quais

podem representar protótipos para o desenvovimento de drogas citotóxicas e antiparasitárias.

Os isolados do gênero Microdochium apresentaram atividade citotóxica seletiva,

indicando que estes isolados possam representar fungos promissores quanto a produção de

moléculas antitumorais; por outro lado, o Phaeosphaeria sp. UFMGCB 2669 apresentou o

melhor valor de CI50 sobre as formas amastigotas de L. amazonensis. Estes resultados indicam

que estes fungos são bons candidatos para estudos fermentativos e de fracionamento químico

para o isolamento da(s) substância(s) citotóxicas e leishmanicidas.

Por fim, os resultados obtidos neste projeto indicam qua a micobiota endofítica das duas

únicas angiospermas que habitam a Antártica (C. quitensis e D. antarctica) constitui uma

fonte promissora de metabólitos bioativos. Em paralelo, este trabalho abre novas perspectivas

de estudo de outras organismos da Antártica (tais como espécies de musgos, macroalgas e

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8 ANEXOS Seguem os artigos gerados a partir do projeto de mestrado:

• Endophytic fungi community associated with the dicotyledonous plant Colobanthus

quitensis (Kunth) Bartl. (Caryophyllaceae) in Antarctica.

• Leishmanicidal and antitumoral activities of endophytic fungi associated with the Antarctic angiosperms Deschampsia antarctica Desv. and Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl.

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