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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA

ESTUDO DA INTERNALIZAÇÃO DE CANAIS PARA

SÓDIO DEPENDENTES DE VOLTAGEM UTILIZANDO

TITYUSTOXINA FLUORESCENTE

Mariele Oliveira de Andrade

Belo Horizonte

2009

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Mariele Oliveira de Andrade, 2009 ii

Mariele Oliveira de Andrade

ESTUDO DA INTERNALIZAÇÃO DE CANAIS PARA SÓDIO DEPENDENTES DE VOLTAGEM UTILIZANDO TITYUSTOXINA FLUORESCENTE

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e Farmacologia, ICB - UFMG, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. André Ricardo Massensini

Belo Horizonte 2009

Mariele Oliveira de Andrade, 2009 iii

APOIO FINANCEIRO

Este trabalho foi realizado com o auxílio das seguintes instituições:

• Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

• Programa de Núcleos de Excelência (PRONEX)

• Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

• Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)

• Pró-Reitoria de Pesquisa da UFMG (PRPq)

• Programa Institutos do Milênio 2005-2008. Instituto do Milênio para o

Desenvolvimento de Fármacos Baseados em Toxinas Peptídicas.

Mariele Oliveira de Andrade, 2009 iv

Ao meu pai.

Mariele Oliveira de Andrade, 2009 v

Toda coincidência

Tende a que se entenda

E toda lenda

Quer chegar aqui

A ciência não se aprende

A ciência apreende

A ciência em si

Se toda estrela cadente

Cai pra fazer sentido

E todo mito

Quer ter carne aqui

A ciência não se ensina

A ciência insemina

A ciência em si

Se o que se pode ver, ouvir, pegar, medir, pesar

Do avião a jato ao jaboti

Desperta o que ainda não, não se pôde pensar

Do sono eterno ao eterno devir

Como a órbita da terra abraça o vácuo devagar

Para alcançar o que já estava aqui

Se a crença quer se materializar

Tanto quanto a experiência quer se abstrair

A ciência não avança

A ciência alcança

A ciência em si

Arnaldo Antunes

Mariele Oliveira de Andrade, 2009 vi

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador André Ricardo Massensini pela paciência com uma iniciante na

pesquisa, pela confiança e apoio e por transmitir tranqüilidade nos momentos mais

difíceis da jornada.

Ao professor Marco Antônio Máximo Prado por ter permitido a realização de

grande parte do trabalho em seu laboratório.

Aos professores Márcio, Tasso, Maria Carolina, Grace, Juliana e Miguel pelos

conselhos e apoio.

À Doutora Vilma Regina Martins por ter gentilmente fornecido as células SN56

para a realização dos experimentos.

Aos colegas e professores do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de

Medicina Molecular (INCT-MM) Laboratório de Neurociência -Faculdade de Medicina-

pela acolhida durante a fase final dos meus experimentos.

À Fabi, por ter guiado meus passos no laboratório de Neurofarmacologia com

muito carinho e paciência.

À Lú, grande amiga e companheira de longa data e de todos os momentos.

À Gioconda, cuja amizade foi um grande e inesperado presente.

Às eternas amigas Dani, Maira e Su, pelos risos, choros, desabafos e conselhos.

À Pat e Maura, exemplos de dedicação e competência.

Aos amigos do NNC: Daniel, Flávio, Hércules e Fumega, pra quem sempre me

senti à vontade para pedir ajuda e conselhos. Ao Dan também sou grata pelas

controvérsias, longas conversas e intermináveis debates a respeito da vida.

Á minha irmã Marina cuja presença mais próxima me faz mais feliz.

Mariele Oliveira de Andrade, 2009 vii

Á minha irmã Mariana, cuja distância nos aproximou ainda mais, nos tornando

grandes amigas.

Á minha mãe Icleia, a quem sou eternamente grata por seu amor e por seu

esforço sem medidas para me propocionar sempre o melhor.

À vida, que me torna ávida de querer ir longe, para ficar mais perto.

Mariele Oliveira de Andrade, 2009 viii

SUMÁRIO

APOIO FINANCEIRO ................................................................................................................... III

AGRADECIMENTOS ................................................................................................................... VI

SUMÁRIO ............................................................................................................................... VIII

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................................... IX

LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................................ X

RESUMO .................................................................................................................................... XI

ABSTRACT ................................................................................................................................ XII

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1 1.1 CANAIS PARA SÓDIO DEPENDENTES DE VOLTAGEM ............................................................. 3 1.2 TITYUSTOXINA ........................................................................................................................ 7 1.3 INTERAÇÃO ENTRE CSDVS E NEUROTOXINAS ......................................................................... 8 1.3.1 Interação entre CSDVs e Tityustoxina .......................................................................... 10

1.4 A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS .......................................... 11

2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 13 2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................................. 14 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................................... 14

3 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 15 3.1 TITYUSTOXINA ...................................................................................................................... 16 3.2 MARCAÇÃO DA TOXINA ....................................................................................................... 16 3.3 CULTURA DE CÉLULAS .......................................................................................................... 17 3.4 ESPECIFICIDADE DA LIGAÇÃO DA TSTX‐AF488 AOS CSDVS ..................................................... 18 3.5 INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 EM CÉLULAS SN56 .............................................. 18 3.6 ATIVIDADE DA TSTX E A INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 ....................................... 19 3.7 DEPENDÊNCIA DO CA2+ NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 ................................. 19 3.8 INFLUXO DE SÓDIO ATRAVÈS DOS CSDVS E A INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 ..... 19 3.9 ATIVIDADE DA MEMBRANA E A INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 .......................... 20 3.10 AQUISIÇÃO DE IMAGENS ................................................................................................. 20 3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................................................... 20

4 RESULTADOS .................................................................................................................... 22 4.1 ESPECIFICIDADE DA LIGAÇÃO DA TSTX‐AF488 AOS CSDVS ..................................................... 23 4.2 INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 ............................................................................ 26 4.3 DEPENDENCIA DA TEMPERATURA DO MEIO NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 30 4.4 DEPENDÊNCIA DA ATIVIDADE DA TSTX PARA A INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 .. 30 4.5 DEPENDÊNCIA DO CA2+ NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 ................................. 34 4.6 DEPENDÊNCIA DO INFLUXO DE SÓDIO NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 ......... 36 4.7 DEPENDÊNCIA DA ATIVIDADE DA MEMBRANA NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 39

5 DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 41

6 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 48

7 BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................... 50

Mariele Oliveira de Andrade, 2009 ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: ESTRUTURA DOS CSDVS. ........................................................................................................... 5

FIGURA 2: SÍTIOS DE LIGAÇÃO DE NEUROTOXINAS EM CSDVS DE MAMÍFEROS. .................................................. 10

FIGURA 3: COMPETIÇÃO ENTRE TSTX E TSTX‐AF488. ................................................................................... 24

FIGURA 4: COMPETIÇÃO ENTRE BSA E TSTXAF488. ..................................................................................... 25

FIGURA 5: INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 EM DIFERENTES INTERVALOS DE TEMPO. ........................... 28

FIGURA 6: AUTOFLUORESCÊNCIA DAS CÉLULAS SN56. ................................................................................. 29

FIGURA 7: INIBIÇÃO DA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 COM A DIMINUIÇÃO DA TEMPERATURA. ........... 32

FIGURA 8: INIBIÇÃO DA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488 COM A DESNATURAÇÃO DA TOXINA. ................ 33

FIGURA 9: PARTICIPAÇÃO DO CÁLCIO EXTRACELULAR NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488. .................... 35

FIGURA 10: PARTICIPAÇÃO DO INFLUXO DE ÍONS SÓDIO NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTX‐AF488. ................ 37

FIGURA 11: INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVS‐TSTXAF488 COM A SUBSTITUIÇÃO DO SÓDIO POR COLINA. ................... 38

FIGURA 12: PARTICIPAÇÃO CONCOMITANTE DO INFLUXO DE SÓDIO E DO CÁLCIO EXTRACELULAR NA INTERNALIZAÇÃO

DOS CSDVS‐TSTXAF488. ............................................................................................................... 40

Mariele Oliveira de Andrade, 2009 x

LISTA DE ABREVIATURAS

AF488 Alexa fluor™ 488

BSA Soro albumina bovina (bovine serum albumin)

CSDVs Canais para sódio dependentes de voltagem

DMEM “Dulbecco´s Modified Eagle Medium”

EGTA Ácido etileno glicol-bis (βaminoetil éter) N,N,N’,N’- tetracético

GABA Ácido gama-aminobutírico

IFM Interleucina, fenilalanina, metionina

KRH Krebs ringer hepes

Nav Isoforma do canal de sódio

PM Peso molecular

S Segmento

TiTX - γ Toxina gama

TsTX Tityustoxina

TTX Tetrodotoxina

[Ca2+]i Concentração intracelular de cálcio

[Na+]i Concentração intracelular de sódio

Mariele Oliveira de Andrade, 2009 xi

RESUMO

Os canais para sódio dependentes de voltagem (CSDVs) exercem papel fundamental na

geração e propagação do potencial de ação em células excitáveis e também são

importantes para modulação sináptica. O estudo da internalização dos CSDVs pode

auxiliar a compreensão dos mecanismos de regulação da expressão e atividade destes

canais. O presente estudo investigou a internalização dos CSDVs em células SN56,

utilizando como ferramenta a tityustoxina (TsTX) marcada com Alexa Fluor 488 (AF488),

uma sonda fluorescente. A ação específica desta toxina em CSDVs permite sua

utilização como marcador e agente despolarizante. A marcação intracelular observada

revelou a internalização dos CSDVs pela ligação da TsTX-AF488 em células SN56. A

marcação intracelular foi detectada após 5 minutos de incubação e não houve diferença

significativa nos tempos subseqüentes até o período de 60 minutos de incubação com a

toxina marcada. Foi possível detectar diminuição significativa da marcação intracelular

quando as células foram incubadas com TsTX-AF488 à 4C, quando a toxina foi

desnaturada e finalmente quando a incubação da TsTX- AF488 ocorreu com adição de

TTX (tetrodotoxina) na ausência de cálcio. Os resultados mostram a internalização da

TsTX-AF488, sugerindo a internalização dos CSDVs. Este processo parece depender do

metabolismo celular, do estado de ativação do canal e do cálcio extracelular.

Mariele Oliveira de Andrade, 2009 xii

ABSTRACT

Voltage-dependent sodium channels (VDSC) play an essential role in the generation and

propagation of action potential in excitable cells. They are also important in the synaptic

modulation. The study of VDSC internalization may help the comprehension of the

mechanisms that regulate the expression and activity of these channels. The present

study investigated the internalization of VDSC in SN56 cells using tityustoxin labeled with

Alexa Fluor 488 (TsTX-AF488) as a tool. The specific action of this toxin in VDSC allows

its use as a marker and depolarizing agent. The intracellular staining observed has

revealed the internalization of VDSC bound to TsTX-AF488 in SN56 cells. The intracellular

staining was detected after five minutes of incubation and there was no relevant

difference in the subsequent time gaps until sixty minutes. It was possible to detect

significant decrease in the intracellular staining when the cells where incubated with

TsTX- AF488 at 4°C; when the toxin was denaturated and finally when the incubation of

TsTX- AF488 happened with the addition of TTX (tetrodotoxin) in the absence of calcium.

The results demonstrate the internalization of TsTX- AF488, suggesting the internalization

of CSDVs. This process seems to depend on the cellular metabolism, the state of

channel activation, and extracellular calcium.

Mariele Oliveira de Andrade, 2009 1

1 INTRODUÇÃO


O estudo da distribuição dos canais para sódio dependentes de voltagem

(CSDVs) em células vivas é relevante para a compreensão da excitabilidade celular. A

microscopia confocal é capaz de determinar a distribuição deste tipo de canais em

membranas inteiras e em organelas citoplasmáticas de amostras vivas. A tityustoxina

(TsTX) se liga especificamente aos CSDVs, se tornando uma ferramenta importante no

estudo destes canais. Por prolongar o período de atividade do canal, seu efeito

despolarizante possibilita sua utilização como marcador dos canais através da

conjugação com uma sonda fluorescente. O emprego de toxinas como ferramentas para

o estudo dos CSDVs tem sido descrito em estudos anteriores (Dargent and Couraud

1990; Dargent, Jullien et al. 1995; Paillart, Boudier et al. 1996). Além disso, as técnicas

existentes que podem ser utilizadas para o estudo da localização dos CSDVs

apresentam limitações para tal finalidade. A técnica de imunofluorescência, assim como

a autoradiografia associada à microscopia eletrônica não permitem o estudo em tempo

real da distribuição dos CSDVs por exigir fixação da amostra. A utilização da “green

fluorescent protein” não permite a avaliação de canais próprios da célula, uma vez que é

necessária a transfecção do canal conjugado à proteína fluorescente. A técnica de

“patch clamp” permite o monitoramento da atividade do canal em determinadas regiões

da membrana plasmática, mas não possibilita o seu monitoramento em toda extensão da

membrana integralmente. A utilização da TsTX permite o estudo não invasivo e em

tempo real da distribuição dos canais para sódio, constituindo uma dupla ferramenta:

marcador e agente celular despolarizante. Portanto, o conhecimento da interação da

TsTX com os CSDVs, através da microscopia confocal, apresenta grande relevância no

estudo funcional da localização destes canais em células excitáveis.


1.1 CANAIS PARA SÓDIO DEPENDENTES DE VOLTAGEM

A excitabilidade celular e a propagação do impulso elétrico dependem da

regulação da expressão e da função dos canais iônicos dependentes de voltagem na

membrana celular (Armstrong and Hille 1998).

Os canais para sódio dependentes de voltagem (CSDVs) são responsáveis pela

geração e propagação dos potenciais de ação. Eles se abrem e se fecham rapidamente

em resposta a mudança no potencial de membrana. Através da técnica de “voltage-

clamp”, Hodgkin e Huxley demonstraram, pela primeira vez, as três chaves que

posteriormente caracterizaram os canais para sódio: ativação sensível à voltagem,

rápida inativação e condutância iônica seletiva (Hodgkin and Huxley 1952).

Os canais para sódio foram os primeiros canais dependentes de voltagem a

serem clonados e seqüenciados. O primeiro estudo a respeito, mostrou que RNAm

transcrito a partir de cDNA clonado direciona a formação de CSDVs funcionais em

oócitos de Xenopus (Noda, Ikeda et al. 1986). Nove genes que codificam as

subunidades alfa já foram funcionalmente expressos. Suas isoformas apresentam

aproximadamente 75% de aminoácidos homólogos e podem ser diferenciadas pelos

diferentes padrões de desenvolvimento, de localização nos sistemas nervoso,

esquelético e cardíaco e também por sua sensibilidade à tetrodotoxina (Gellens, George

et al. 1992). As isoformas predominantes no SNC são Nav 1.1, 1.2, 1.3 e 1.6. A

expressão da isoforma Nav 1.1 começa a aumentar após o nascimento e atinge níveis

mais altos no colículo e ponte do cérebro adulto. Já a isoforma Nav 1.2 é expressa

durante o desenvolvimento intra-uterino humano, com níveis mais altos no córtex,

hipocampo e mesencéfalo. A isoforma Nav 1.3 atinge expressão máxima próxima ao

nascimento, com decréscimo ao longo da vida adulta. Por último, a expressão da

isoforma Nav 1.6 não se difere de forma significativa nas estruturas cerebrais (Whitaker,


Faull et al. 2001). A sua distribuição é variável não somente ao nível celular, mas

também subcelular. A isoforma Nav 1.2 tem localização predominantemente axonal,

indicando sua participação na propagação do potencial de ação. Ao contrário, as

isoformas Nav 1.1, 1.3 e 1.6 se distribuem ao longo dos corpos e dendritos, indicando

sua participação na integração sináptica (Whitaker, Faull et al. 2001). As isoformas

expressas no SNC são inibidas por concentrações nanomolares de tetrodotoxina (TTX).

Além disso, a isoforma Nav 1.1 está presente tanto em neurônios quanto em células da

glia (Vacher, Mohapatra et al. 2008). A isoforma Nax apresenta estrutura diferenciada,

incluindo menores quantidades de carga nos segmentos sensores de voltagem e

ausência da seqüência curta de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos: isoleucina,

fenilalanina e metionina (IFM), essencial para a inativação rápida do canal (Goldin 2001).

Os CSDVs são estruturas glicoprotéicas transmembrânicas com regiões definidas

para o poro e para os sensores de voltagem (Figura 1). A forma do canal para sódio

mais importante no cérebro de ratos é um complexo heterotrimérico com uma

subunidade α (260 kDa), uma subunidade β1 ligada de forma não covalente (36 kDa) e

uma subunidade β2 ligada por pontes dissulfídicas (33 kDa) (Catterall 1984; Catterall

1992; Catterall 2000). A subunidade principal α, formadora do poro, é composta por

quatro domínios homólogos (I-IV), cada um contendo seis segmentos transmembrânicos

(S1-S6) com uma alça interna que conecta os segmentos 5 e 6 (Catterall 1992; Marban,

Yamagishi et al. 1998). A subunidade contém todos os elementos estruturais

necessários para formar o poro através da membrana e garantir a seletividade iônica

(Noda, 1986). As subunidades β auxiliares são responsáveis pela modulação do canal e

também por suas propriedades cinéticas(Isom, De Jongh et al. 1992; Isom, Ragsdale et

al. 1995; Isom, Scheuer et al. 1995). O segmento 4 de cada domínio apresenta resíduos

de aminoácidos carregados positivamente e exerce papel chave na ativação do canal.


Os segmentos 5 e 6, juntamente com a alça interna entre eles, formam a cobertura do

poro e a alça curta entre os domínios III e IV forma a comporta de inativação, em

particular a seqüência IFM. A inativação do canal ocorre em um ou dois milissegundos

após sua abertura, com bloqueio da porção interna do poro. Os domínios intracelulares

maiores são alvos de modulação do canal pela sua fosforilação (Catterall 2000; Yu and

Catterall 2003).

Figura 1: Estrutura dos CSDVs. Esquema da estrutura dos CSDVs. As subunidades alfa apresentam quatro domínios repetidos (I a IV). Cada domínio consiste de 6 segmentos transmembrânicos. Os segmentos 5 e 6 delimitam o poro do canal, enquanto o segmento 4 é o sensor de voltagem. Os círculos nas alças intracelulares dos domínios III e IV indicam o segmento IFM da comporta de inativação (h‐comporta de inativação) e P os sítios de fosforilação do canal (Yu and Catterall 2003).


A distribuição diferenciada dos CSDVs é essencial para as propriedades

funcionais de um neurônio. Considerando que uma das principais funções dos CSDVs é

gerar potenciais de ação na porção inicial do axônio, verifica-se maior densidade desses

canais nesse segmento neuronal (Garrido, Fernandes et al. 2003). Essas observações

têm dirigido pesquisas para a distribuição destes canais e para a modulação da

excitabilidade dos neurônios pelos mesmos.

Enquanto a relação entre estrutura e função dos CSDVs está bem estabelecida, a

sua importância na modulação da transmissão sináptica ainda não foi esclarecida. Os

CSDVs não só participam da despolarização, mas também estão envolvidos na atividade

elétrica neuronal sublimiar; através de correntes de Na+ persistentes (Raman, Sprunger

et al. 1997), o que aponta para uma nova perspectiva na qual os CSDVs podem integrar

disparos neuronais. Trabalhos desenvolvidos em nosso grupo sugerem que os CSDVs

possuem papel importante nesta modulação. Estudos demonstraram efeitos

diferenciados na [Na+]i, [Ca2+]i e na liberação de glutamato, provocados por toxinas que

atuam em CSDVs, em sinaptosomas de córtex cerebral de ratos (Romano-Silva, Ribeiro-

Santos et al. 1994; Massensini, Moraes-Santos et al. 1998).

Distúrbios na atividade dos CSDVs são responsáveis pela geração de inúmeras

patologias. Doenças musculares podem ser provocadas por mutações em isoformas

Nav1.4; enquanto mutações nos canais Nav1.5 são responsáveis pela síndrome do

complexo QT longo, uma anormalidade cardíaca. Isoformas Nav1.3, 1.7, 1.8 e 1.9 estão

envolvidas na sinalização da dor (Krafte and Bannon 2008), enquanto as isoformas

Nav1.1 estão associadas à epilepsia (Ito, Nagafuji et al. 2002).


1.2 TITYUSTOXINA

Com o objetivo geral de aumentar sua chance de sobrevivência, milhares de

espécies vivas produzem toxinas que são usadas para modificar a fisiologia de outras

espécies. Toxinas podem apresentar grande complexidade química ou serem apenas

moléculas simples. Algumas são inespecíficas, mas muitas são particulares para

moléculas selecionadas. Sendo produtos de uma longa coevolução das espécies

produtoras de toxinas com as espécies alvo, as toxinas têm sido freqüentemente

moldadas em torno destas, o que nos fornece uma importante ferramenta no estudo de

características fisiológicas das espécies alvo (Schiavo, Matteoli et al. 2000).

Diante disso, não é surpresa que a maioria das toxinas conhecidas seja seletiva

para moléculas do tecido nervoso. Essas neurotoxinas têm exercido um papel chave na

neurofisiologia ainda desconhecida.

Venenos escorpiônicos consistem em uma mistura complexa de proteínas

neurotóxicas acídicas e básicas, farmacologicamente ativas, somada a outros

componentes que incluem sais e compostos orgânicos. Apesar disso, estudos com

venenos de diferentes espécies têm demonstrado algumas propriedades em comum,

principalmente a presença de componentes tóxicos ao homem. Essas toxinas são

principalmente proteínas básicas, de baixo peso molecular, formadas por 60-70 resíduos

de aminoácidos, com pontos isoelétricos na faixa de 8,0 a 9,0. Devido ao alto número de

grupos ionizáveis, estas toxinas são capazes de formar associações moleculares com

outras proteínas (Sampaio, Laure et al. 1983; Barhanin, Pauron et al. 1984).

O veneno do escorpião Tityus serrulatus é composto por uma mistura de

peptídeos tóxicos e não tóxicos, além de serotonina, nucleotídeos, aminoácidos,

enzimas líticas (hialuronidase) e lipídios. Algumas de suas toxinas têm sido isoladas e


caracterizadas. Originalmente o veneno foi dividido em duas frações, através de

cromatografia em gel de filtração (Gomez and Diniz 1966); uma delas, a tityustoxina, foi

parcialmente caracterizada. Estudos subseqüentes levaram à modificação do método

proposto e as frações obtidas passaram a ser purificadas por cromatografia de troca

iônica (Toledo and Neves 1976; Sampaio, Laure et al. 1983).

As toxinas do veneno do escorpião Tityus serrulatus podem ser classificadas em

dois tipos, α e β, de acordo com sua ligação específica a sítios determinados dos canais

para sódio dependentes de voltagem (Barhanin, Giglio et al. 1982; Kirsch, Skattebol et

al. 1989)

As frações tóxicas das toxinas do tipo α podem interagir com diferentes canais

iônicos: canais para sódio (Catterall, Morrow et al. 1979) canais para potássio (Carbone,

Wanke et al. 1982) canais para cloreto (DeBin, Maggio et al. 1993) e canais para cálcio

(Valdivia, Kirby et al. 1992).

A tityustoxina, também chamada por alguns autores de T2III, corresponde ao

terceiro pico da recromatografia do segundo pico tóxico (T2) do veneno bruto, obtido em

coluna de troca iônica. Ela é uma proteína, parcialmente seqüenciada, composta de 63

aminoácidos e peso molecular (PM) igual a 7216 (Sampaio, Laure et al. 1983).

1.3 INTERAÇÃO ENTRE CSDVs E NEUROTOXINAS

Neurotoxinas que atuam em canais para sódio têm sido amplamente utilizadas

como ferramentas no estudo de mecanismos sinápticos sob condições fisiopatológicas.

Elas modificam a atividade do canal e pelo menos seis sítios de ligação das toxinas

foram identificados (Figura 2).


Tetrodotoxina, a guanidina heterocíclica solúvel em água, age no lado extracelular

dos CSDVs, bloqueando a condutância ao sódio (Narahashi 2008). Veratridina é um

alcalóide extraído de plantas liliáceas, que se liga ao sítio 2 dos canais e causa ativação

persistente, em potencial de repouso, via um mecanismo alostérico que bloqueia a

inativação e muda a dependência da voltagem da ativação para potenciais mais

negativos (Catterall 1980). Toxinas de anêmonas do mar, algumas toxinas de aranha,

além de toxinas de escorpião como a TsTX, são exemplo de toxinas que se ligam ao

sítio 3, inibindo ou retardando sua a inativação (Couraud, Rochat et al. 1978; Couraud,

Jover et al. 1982; Pauron, Barhanin et al. 1985; Lazdunski, Frelin et al. 1986). Outra

toxina purificada do veneno do Tityus serrulatus, Tityus gama (TiTX - γ) é um exemplo de

toxina que se liga ao sítio 4 dos canais mudando a dependência de voltagem destes

para potenciais mais negativos e reduzindo a corrente de pico (Vijverberg, Pauron et al.

1984). As brevetoxinas e as ciguatoxinas, solúveis em lipídios, ligam-se ao sítio 5 e

provocam mudança na ativação dos canais para potenciais de membrana mais

negativos e bloqueio de sua inativação (Lombet, Bidard et al. 1987). Conotoxinas

levaram à identificação do sítio 6. Elas causam prolongamento dos potenciais de ação

devido à inibição específica da inativação dos canais (Hasson, Fainzilber et al. 1993).

O sítio 1 dos canais para sódio no cérebro está localizado no segmento SS2 do

lado N-terminal do sexto segmento transmembrânico em cada um de seus quatro

domínios. O sítio 2 dos canais é formado pelos domínios transmembrânicos hidrofóbicos

IS6 e IVS6 da subunidade alfa. O sítio 3 está localizado nas alças extracelulares entre os

segmentos transmembrânicos 5 e 6 nos domínios I e IV do canal e o sítio 4 compreende

resíduos de aminoácidos na alça S3-S4, no final extracelular do sensor de voltagem S4,

no domínio IV da subunidade α (Cestele and Catterall 2000).


Figura 2: Sítios de ligação de neurotoxinas em CSDVs de mamíferos. O sítio1, localizado na alça externa do poro, próximo ao S6, é alvo de ligação da TTX, STX e µ‐conotoxina. O sítio 2, alvo de ação da veratridina, envolve os segmentos IS6 e IVS6. O sítio 3 se localiza nas alças extracelulares entre S5 e S6, nos domínios I e IV e é alvo de toxinas de anêmonas do mar, toxinas de aranha, além de toxinas de escorpião como a TsTX. O sítio 4 compreende as alças dos segmentos IIS3‐S4, sendo alvo da TiTX ‐ γ. Finalmente o sítio 5 envolve os segmentos IS6 e IVS5 e brevetoxinas e as ciguatoxinas se ligam a ele (Cestéle e Catterall, 2000).

1.3.1 Interação entre CSDVs e Tityustoxina

Estudos demonstraram que os peptídios de cadeia longa de toxinas escorpiônicas

são responsáveis pelos seus efeitos neurotóxicos relacionados ao prejuízo na função

dos CSDVs (Catterall, Ray et al. 1976). Contudo a descoberta e o uso de cadeias curtas

de peptídeos específicos para canais para potássio (Garcia, Gao et al. 2001)

dispersaram a continuação dos esforços dedicados ao estudo dos CSDVs.

Recentemente esse panorama tem mudado devido ao novo interesse no estudo destes

canais.

A TsTX é uma toxina do tipo α, capaz de estimular a liberação de

neurotransmissores como acetilcolina (Gomez, Diniz et al. 1975) e glutamato (Romano-

Silva, Ribeiro-Santos et al. 1994), através da entrada de íons sódio e cálcio no terminal


nervoso, em fatias e sinaptosomas de córtex cerebral (Henriques and Gomez 1981),

sendo capaz também de induzir a fosforilação de proteínas (Ribeiro and Gomez 1986).

Moss e cols., em 1974 e Silveira e cols., em 1991 mostraram que a liberação de

catecolaminas induzidas pela toxina de escorpião ocorre por um mecanismo similar ao

produzido pelo estímulo elétrico (Moss, Thoa et al. 1974; Silveira, Moraes-Santos et al.

1991). Os efeitos da TsTX são dependentes do tempo de incubação, do pH e da fonte

de energia no meio de incubação (Gomez, Dai et al. 1973). Utilizando a microscopia

fluorescente para visualização dos CSDVs em células vivas, pesquisadores atualmente

vêm aplicando a TsTX marcada com sondas fluorescentes para estudá-la em modelos

de células em cultura (Massensini, Suckling et al. 2002).

1.4 A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs

Ao contrário do amplo conhecimento sobre a eletrofisiologia dos CSDVs, a

internalização e o tráfego desses canais ainda é um assunto ainda pouco compreendido.

A complexidade morfológica e funcional dos neurônios, com ramificações

dendríticas e axonais, além de múltiplas conexões, é responsável pelas diferenças na

localização e densidade dos canais iônicos e proteínas em geral (Nusser 2009). Para

compreender melhor a função dos diferentes tipos neuronais é necessário determinar a

localização desses canais, bem como de suas isoformas, tanto na membrana celular

quanto nos espaços subcelulares. A localização dos CSDVs na membrana celular de

neurônios foi investigada, utilizando toxina escorpiônica marcada com iodo radioativo

(Catterall 1981).

Os efeitos de ativadores de CSDVs (batracotoxina, toxina escorpiônica α e

veratridina) na densidade destes em cérebro de ratos neonatos, in vitro, foram descritos

(Dargent and Couraud 1990). O estudo sugere que um aumento na concentração


intracelular de sódio, provocado pelos ativadores pode induzir uma diminuição da

densidade de canais na superfície celular. A participação de um compartimento

endosomal ou lisosomal após a internalização dos canais também é possível. O estudo

sugere que os canais não retornam à membrana após a retirada de um ativador. Além

disso, a internalização foi inibida por uma base acidotrópica fraca, que bloqueia a

degradação protéica em lisosomos (Dargent, Jullien et al. 1995). Através de microscopia

eletrônica foi demonstrada a distribuição de uma toxina marcada, com afinidade pelos

CSDVs, nos diferentes compartimentos subcelulares (Paillart, Boudier et al. 1996). Outro

estudo mostrou que a ativação da PKA causa redistribuição de CSDVs cardíacos em

células vivas, apoiando a existência de múltiplos locais de estocagem dos canais que

podem ser mobilizados após estímulos fisiológicos (Hallaq, Yang et al. 2006).

Portanto, o controle da densidade de CSDVs na superfície celular representa um

potencial mecanismo para a regulação da excitabilidade neuronal, apontando para a

necessidade de se investigar a internalização de tais canais.


2 OBJETIVOS


2.1 OBJETIVO GERAL

Investigar a internalização de canais para sódio dependentes de voltagem em

células SN56 usando tityustoxina fluorescente.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

-Investigar se a interação da TsTX-AF488 com os CSDVs ocorre através de ligação

específica ao seu sítio nestes canais.

-Investigar a internalização dos CSDVs ligados à TsTX-AF488 em diferentes

períodos de incubação.

-Investigar se a internalização dos CSDVs ligados à TsTX-AF488 é dependente de

parâmetros fisiológicos necessários aos processos endocíticos como temperatura,

cálcio extracelular e especificidade da proteína ligante.

-Investigar se a internalização dos CSDVs ligados à TsTX-AF488 depende do

influxo de íons sódio.


3 MATERIAL E MÉTODOS


3.1 TITYUSTOXINA

A neurotoxina utilizada neste estudo, a TsTX, foi obtida a partir do veneno bruto

do escorpião brasileiro Tityus serrulatus, de acordo com metodologia descrita por

Sampaio et al.(1983). A toxina foi fornecida pelo Prof. Dr. Tasso Moraes-Santos, da

Faculdade de Farmácia da UFMG.

A toxina foi repassada na forma liofilizada, sendo diluída em salina para posterior

utilização. Sua concentração foi determinada através da espectrofotometria, com

absorbância medida em 280nm, em duplicatas, para diluições de 1/50 e 1/100. A

constante de conversão utilizada foi 0,48 sendo obtida pelo método de dosagem de

proteínas descrito por Lowry, em 1951. (Lowry, Rosebrough et al. 1951) A toxina foi

separada em alíquotas de 5 μl e mantida congelada a -20°C até a data dos

experimentos.

3.2 MARCAÇÃO DA TOXINA

Toxinas do veneno do escorpião Tityus serrulatus foram purificadas como

descrito previamente (Sampaio et al., 1983). O indicador Alexa Flúor 488 (AF488) reage

com as aminas primárias das proteínas de acordo com o manual do fabricante

(“Molecular Probes, Alexa Flúor Protein Labelling Kit Manual”, catálogo nº A-10235). Em

resumo, 500 µl de uma solução com 3,5 mg/ml de proteína pura (TsTX) foram

adicionados a 50 µl de uma solução de bicarbonato de sódio a 1,0 M. Esta solução foi

transferida para um frasco contendo quantidade suficiente de indicador para reagir com

a proteína e deixado sob leve agitação por 1 hora à temperatura ambiente e ao abrigo da

luz. Para a remoção do indicador livre, as proteínas marcadas foram purificadas usando


uma membrana para exclusão de moléculas com massa molecular menor que 5000 D,

em tampão fosfato pH 7,2 por 24 horas, a 4°C e ao abrigo da luz.

O conjugado de proteína purificado, TsTX-AF488, é estável por vários meses à

-20°C. Portanto, as soluções foram divididas em alíquotas de 5 µl e armazenadas no

freezer à -20°C, protegidas da luz direta. A funcionalidade do conjugado foi avaliada

através da liberação de glutamato em sinaptosomas de córtex cerebral de ratos,

conforme descrito em trabalhos anteriores (Nicholls, Sihra et al. 1987; Romano-Silva,

Ribeiro-Santos et al. 1994).

3.3 CULTURA DE CÉLULAS

Células SN56 foram gentilmente cedidas pelo professor Bruce Wainer, do

Departamento de Patologia da Escola de Medicina da Universidade de Emory, Atlanta,

GA, EUA. As células foram cultivadas em garrafas de 50 ml com 10 ml meio DMEM

suplementado com 10% de soro fetal bovino (“Gibco Life Tecnologies”), 2 mM de L-

glutamina, 1% de estreptomicina e penicilina e o pH foi corrigido para 7,4. Também

foram mantidas em estufa sob atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2, a 37°C. Para

diferenciação, as células foram plaqueadas em lamínulas e mantidas no mesmo meio,

porém sem soro fetal bovino e acrescidas de 1mM de dibutiril AMP-c (Sigma) por no

mínimo 48 h. O meio das células foi trocado a cada 48 h, exceto durante a diferenciação,

quando a troca de meio foi feita a cada 24 h. Durante a incubação, as placas foram

mantidas em KRH (12 mM de NaCl mM, 4 mM de KCl ,1,2 mM de MgSO4 , 25 mM de

Hepes ,10 mM de C6H12O6 e 1 mM de CaCl2) e em estufa, sob atmosfera de 95% de ar e

5% de CO2 , a 37°C. A exceção se aplica aos experimentos de avaliação da

dependência da temperatura, onde as células foram incubadas a 4°C. Após incubação,

as células foram lavadas 3x, rapidamente, com o mesmo meio. Cada experimento foi


realizado pelo menos três vezes, em dias diferentes, e os parâmetros de aquisição de

imagem foram os mesmos em todos os experimentos.

3.4 ESPECIFICIDADE DA LIGAÇÃO DA TsTX-AF488 AOS CSDVs

As células foram plaqueadas e diferenciadas como citado anteriormente e

incubadas em KRH, com 10 µM de TsTX não marcada por 5 min., a 37°C. Após este

período, as mesmas células foram incubadas em KRH com 1µM de TsTX-AF488 por mais

55 min. As células foram lavadas com o mesmo meio e suas imagens capturadas por

microscopia confocal.

Para verificação de ligações inespecíficas da TsTX-AF488 à membrana das

células, outro ensaio foi realizado incubando-as primeiramente com 10 µM de albumina

bovina (Sigma) durante 5 min. a 37°C, e em seguida com 1µM de TsTX-AF488 por mais

55 min. a 37°C.

3.5 INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs-TsTX-AF488 EM CÉLULAS SN56

Após diferenciação, as células foram incubadas com 1 µM de TsTX-AF488 em

KRH por intervalos de tempo crescentes, a 37°C. Ou seja, cada placa foi incubada por 5,

15, 30 e 60 min. Após o período de incubação as células foram lavadas com KRH e suas

imagens capturadas por microscopia confocal.

A autofluorescência das células foi avaliada através de sua incubação apenas

com KRH por 60 min., a 37°C. Os parâmetros para obtenção dessas imagens foram

idênticos aos parâmetros utilizados para as demais aquisições.

Para verificação da dependência da temperatura na internalização dos CSDVs, as

células também foram incubadas com 1 µM de TsTX-AF488, a 4°C, por 60 min., seguindo


o plaqueamento e a diferenciação descritos. Após incubação, as células foram lavadas

com KRH, também a 4°, e suas imagens capturadas no microscópio confocal.

3.6 ATIVIDADE DA TsTX E A INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs-TsTX-AF488

Outro experimento foi realizado com a finalidade de se avaliar a dependência de

atividade da toxina para sua ligação aos CSDVs e conseqüente internalização dos

mesmos. Para tal, procedeu-se a desnaturação da TsTX-AF488 utilizando um agente

desnaturante, β-mercaptoetanol (5%), adicionado a um eppendorf contendo 1 µM de

TsTX-AF488. A mistura foi exposta a uma temperatura aproximada de 100°C por 3

minutos e após resfriamento à temperatura de 37C, seu conteúdo foi adicionado às

células que ficaram incubadas por 60 min., a 37°C. Logo após, suas imagens foram

capturadas no microscópio confocal.

3.7 DEPENDÊNCIA DO Ca2+ NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs-TsTX-AF488

A dependência do cálcio extracelular na internalização dos CSDVs foi avaliada

através da utilização de KRH sem cálcio adicionado de 2 mM de EGTA. As células foram

incubadas neste meio com TsTX-AF488 1 µM durante 60 min., a 37°C. Após o período de

incubação as células foram lavadas com KRH e suas imagens capturadas no

microscópio confocal.

3.8 INFLUXO DE SÓDIO ATRAVÈS DOS CSDVs E A INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs-TsTX-AF488

A dependência do influxo de íons sódio através do canal foi avaliada por meio da

incubação das células em KRH com 1µM de TTX por 5 min. a 37°C e subseqüente

incubação com TsTX-AF488 por mais 55 min. a 37°C. Além disso, em outro experimento,


NaCl foi substituído por 124 mM de cloreto de colina. Após o período de incubação, as

células foram lavadas com KRH e suas imagens capturadas no microscópio confocal.

3.9 ATIVIDADE DA MEMBRANA E A INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs-TsTX-AF488

A fim de verificar o efeito da atividade da membrana celular sobre a internalização

dos CSDVs, foi realizado um experimento no qual as células foram incubadas durante 60

min. a 37°C em KRH sem cálcio, contendo 2mM de EGTA e 1µM de TTX. Após o

período de incubação as células foram lavadas com KRH e suas imagens capturadas no

microscópio confocal.

3.10 AQUISIÇÃO DE IMAGENS

A aquisição das imagens foi realizada à temperatura ambiente. Lamínulas de

60x15 mm, com as células, foram transferidas para uma câmara de perfusão. As

imagens foram obtidas utilizando um microscópio confocal, Leica TCS SP5, equipado

com objetivas de imersão em água (63x). As preparações foram excitadas com laser de

argônio na linha de 488nm e a luz emitida foi captada por um filtro 510-555nm. As

imagens capturadas foram processadas e analisadas utilizando os programas Adobe®

Photoshop® 7.0 (Adobe Systems Inc.) e ImageJ 1.39 (NIH, USA). Os parâmetros de

aquisição das imagens comparadas foram sempre os mesmos. Nos experimentos com

TsTX-AF488+BSA, com TsTX-AF488 desnaturada e com TsTX-AF488 sem Ca2+ foi utilizado

ganho de 800 v ; nos demais experimentos foi utilizado ganho de 850 v.

3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) e

valores com p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A análise


estatística foi realizada utilizando o método one-way ANOVA, seguido de contraste

ortogonal.


4 RESULTADOS


4.1 ESPECIFICIDADE DA LIGAÇÃO DA TsTX-AF488 AOS CSDVs

A especificidade da ligação da TsTX em células GH3 foi verificada por Massensini

e cols., em 2002. O ensaio de competição entre proteína marcada e não marcada já foi

descrito (Gekle, Mildenberger et al. 1995; Habich, Baumgart et al. 2002) e baseia-se no

bloqueio de uma proteína marcada pelo pré-bloqueio de seu alvo ligante com excesso

da mesma proteína não marcada. O pré-bloqueio parece não ter ocorrido, uma vez que

foi detectada fluorescência no interior da célula, sem diferença significativa em relação à

marcação dos experimentos com toxina marcada (TsTX-AF488: 43,5 ± 3,2; TsTX-

AF488+TsTX: 51,2 ± 7,6) (Figura 3).

A albumina é uma proteína de 69 KDa envolvida no transporte de moléculas

hidrofóbicas (Gekle, Mildenberger et al. 1995). A pré-incubação com albumina tem como

objetivo bloquear ligações inespecíficas, ou seja, bloquear sítios aos quais se ligam

moléculas da ordem de 60 KDa. Não houve diferença significativa entre a marcação com

(30,6 ± 0,6) e sem BSA (28,5 ± 1,3), conforme mostra a figura 4.


TsTX-AF488 TsTX+TsTX-AF488 0

20

40

60

80

Inte

nsid

ade

méd

iade

flu

ores

cênc

ia (U

.A)

Figura 3: Competição entre TsTX e TsTXAF488.

A e C são imagens de luz transmitida. Em B as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. Em D as células foram pré‐incubadas com TsTX 10µM e após 5 min.com TsTX‐AF488 1µM por mais 55 min. O gráfico E mostra que não foi possível detectar diferença na intensidade de marcação entre estes experimentos. Barras de escala correspondem a 20 µm.

A B

C D

E


TsTX-AF488 TsTX-AF488+BSA0

10

20

30

40

Inte

nsid

ade

méd

ia d

eflu

ores

cênc

ia (U

.A)

Figura 4: Competição entre BSA e TsTXAF488.

A e C são imagens de luz transmitida. Em B as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. Em D as células foram pré‐incubadas com BSA e após 5 min. com TsTX‐AF488 1µM por mais 55 min. O gráfico E mostra que não houve diferença significativa na intensidade de marcação entre estes experimentos, sugerindo internalização específica dos CSDVs‐TsTX‐AF488. Barras de escala correspondem a 20 µm.

A B

C D


4.2 INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs-TsTX-AF488

A internalização dos CSDVs-TsTX-AF488 foi avaliada através da incubação das

células SN56 com TsTX-AF488 nos intervalos de tempo de 5, 15, 30 e 60 min. O intervalo

de 60 min., no qual se verificou marcação mais intensa, foi utilizado na comparação dos

demais experimentos (Figura 5).

Após 5 min. de incubação com TsTX-AF488 observou-se marcação no interior das

células com uma intensidade de fluorescência média de 38,7±5,2. O aumento da

intensidade de fluorescência não foi linear nos tempos subseqüentes, com 43,7 ± 3,8

para 15 min. de incubação; 36,4 ± 2,9 para os 30 min. e 43,5 ± 3,2 para o intervalo de 60

min., não sendo detectada diferença significativa entre os intervalos. O intervalo de 60

min. foi escolhido para a realização dos demais experimentos, porque as imagens

revelaram um padrão de fluorescência no citoplasma mais concentrado; enquanto que a

fluorescência nos demais intervalos mostrou-se difusamente distribuída no interior da

célula (Figura 5).


A

C

E

G

B

D

F

H

Figura 5


0

20

40

60

Inte

nsid

ade

méd

ia d

eflu

ores

cênc

ia (U

.A)

5 15 30 60Tempo (min.)

Figura 5: Internalização dos CSDVsTsTXAF488 em diferentes intervalos de tempo. A, B,C e D são imagens de luz transmitida (DIC). Em E, F, G e H as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 5, 15, 30 e 60 min., respectivamente. É possível observar marcação citoplasmática a partir do menor intervalo, sugerindo a internalização dos CSDVs‐TsTX‐AF488. O gráfico I representa a intensidade de fluorescência em unidades arbitrárias (U.A), nos respectivos intervalos. Barras de escala correspondem a 20 µm.

O experimento controle verificou a autofluorescência das células com os

parâmetros de aquisição de imagens utilizados nos demais experimentos (Figura 6). As

imagens de autofluorescência permitem diferenciar a marcação resultante de moléculas

celulares, que são fluorescentes quando excitadas com luz UV/VIS, da marcação

proveniente da TsTX-AF488. A emissão de fluorescência surge de fluoróforos endógenos,

encontrados em mitocôndrias e lisossomos, como NADPH (Monici 2005). Foi observado

aumento significativo na intensidade média de fluorescência das células incubadas por

60 min. com TsTX-AF488 (43,56 ±3,2) em relação ao controle sem toxina (30,38 ± 1,5).

I


TsTX-AF488 Autofluorescência0

10

20

30

40

50

*

Inte

nsid

ade

méd

ia d

eflu

ores

cênc

ia (U

.A)

Figura 6: Autofluorescência das células SN56. A e C são imagens de luz transmitida. Em B as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. Em D as células foram incubadas apenas com meio de cultura. É possível observar um nível de fluorescência basal das células cuja quantificação é mostrada em E. Entretanto a intensidade de autofluorescência é significativamente inferior à intensidade observada quando a TsTX‐AF488 foi incubada por 60 min. * p<0,05. Barras de escala correspondem a 20 µm.

A

C

B

D

E


4.3 DEPENDENCIA DA TEMPERATURA DO MEIO NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs-TsTX-AF488

Neste experimento as células SN56 foram incubadas com TsTX-AF488 a 4°C por

60 min. A esta temperatura, com a diminuição do metabolismo celular, ocorre inibição

dos processos endocíticos (Dunn, Hubbard et al. 1980) uma vez que maioria das

moléculas são internalizadas a 37°C (Nichols 2002; Glebov, Bright et al. 2006). Nossos

resultados mostram que ocorreu redução significativa da marcação citoplasmática

quando a temperatura foi diminuída (TsTX-AF488 a 4°C: 33,5 ± 1,3) em relação ao

controle (TsTX-AF488 a 37°C: 43,5 ± 3,2), como mostrado na figura 7.

4.4 DEPENDÊNCIA DA ATIVIDADE DA TsTX PARA A INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs-TsTX-AF488

A TsTX é uma proteína parcialmente seqüenciada, composta de 63 aminoácidos

(Sampaio e cols., 1983). Como outras proteínas ela apresenta estrutura terciária cuja

estabilidade é conferida, entre outros, por pontes dissulfídicas. O processo de

desnaturação das proteínas ocorre quando há perda da estrutura protéica (exceto da

estrutura primária) pela ação de um agente externo, como calor ou agentes químicos. A

maioria das proteínas perde a sua função biológica quando desnaturadas.

A fim de verificar se a perda de função da TsTX seria capaz de alterar a dinâmica

de internalização dos CSDVs-TsTX-AF488 foi realizado um experimento no qual um

agente desnaturante, β-mercaptoetanol, foi utilizado. Este agente provoca ruptura das

pontes dissulfídicas, causando perda funcional da proteína. As imagens revelaram uma

marcação intensa na região da membrana citoplasmática, diferente daquela observada

em experimentos anteriores. Observou-se acúmulo de fluorescência em várias regiões


da membrana, sugerindo que os CSDVs-TsTXAF488 não são internalizados quando a

toxina perde sua função (Figura 8).


TsTX-AF488 TsTX-AF488 à 4°C0

10

20

30

40

50

*

Inte

nsid

ade

méd

iade

fluo

resc

ênci

a (U

.A)

Figura 7: Inibição da internalização dos CSDVsTsTXAF488 com a diminuição da temperatura. A e C são imagens de luz transmitida. Em B as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. Em D as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min., a 4°C. O gráfico E mostra que houve redução significativa na intensidade de marcação quando a temperatura foi reduzida, sugerindo dependência do metabolismo celular para a internalização dos CSDVs‐TsTXAF488. * p<0,05. Barras de escala correspondem a 20 µm.

A B

C D

E


Figura 8: Inibição da internalização dos CSDVsTsTXAF488 com a desnaturação da toxina. A e C são imagens de luz transmitida. Em B as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. Em D as células foram incubadas por 60 min.com TsTX‐AF488 previamente desnaturada com β‐mercaptoetanol a uma temperatura de aproximadamente 100°C, minutos antes da incubação. A marcação concentrou‐se na membrana citoplasmática das células, o que foi observado apenas neste experimento. Barras de escala correspondem a 20 µm.

A B

C D


4.5 DEPENDÊNCIA DO Ca2+ NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs-TsTX-AF488

Os canais para cálcio dependentes de voltagem exercem papel importante na

endocitose de vesículas sinápticas (Chen, Deng et al. 2003). A redistribuição de canais

para potássio em neurônios hipocampais também requer o influxo de cálcio (Kim, Jung

et al. 2007), porém, pouco se sabe sobre a importância do cálcio extracelular na

internalização dos CSDVs. Quando as células foram incubadas em meio sem Ca2+

ocorreu redução significativa da marcação citoplasmática quando comparadas àquelas

incubadas em meio com Ca2+ (TsTX-AF488: 30,6 ± 0,6; TsTX-AF488 sem Ca2+ :26,8 ± 0,6),

como mostrado na figura 9.


TsTX-AF488 TsTX-AF488 sem Ca 2+0

10

20

30

40

Inte

nsid

ade

méd

ia d

eflu

ores

cênc

ia (U

.A)

*

Figura 9: Participação do cálcio extracelular na internalização dos CSDVsTsTX

AF488. A e C são imagens de luz transmitida. Em B as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. Em D as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. em meio de cultura sem cálcio e com EGTA. O gráfico E mostra que não foi possível detectar diferença na intensidade de marcação entre estes experimentos. Barras de escala correspondem a 20 µm. * p<0,05.

A B

C D


4.6 DEPENDÊNCIA DO INFLUXO DE SÓDIO NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs-TsTX-AF488

Um estudo de Dargent e Couraud (1990) observou que a adição de ativadores de

canais para sódio (veratridina e batracotoxina), ao meio de cultura, provocou o

desaparecimento dos CSDVs da membrana celular. O desaparecimento induzido dos

canais foi abolido por TTX, o que sugere que a sua internalização é dependente do Na+

extracelular. Além disso, a adição de colina (íon não permeante) também aboliu o

desaparecimento dos canais.(Dargent and Couraud 1990)

Entretanto os resultados obtidos não corroboram os resultados descritos na

literatura. As imagens, obtidas quando TTX foi adicionada ao meio, revelaram

intensidade de marcação semelhante àquelas sem adição de TTX (TsTX-AF488: 43,5 ±

3,2; TsTX-AF488+TTX:38,4 ± 1,2)(Figura 10). As células, em cujo meio foi adicionado

cloreto de colina, também não apresentaram intensidade de fluorescência

significativamente diferente daquelas sem adição de cloreto de colina (TsTX-AF488: 43,5

± 3,2; TsTX-AF488+cloreto de colina: 40,0 ± 2,2) (Figura 11).


TsTX-AF488 TTX+TsTX-AF488

0

10

20

30

40

50

Inte

nsid

ade

méd

iade

fluo

resc

ênci

a (U

.A)

Figura 10: Participação do influxo de íons sódio na internalização dos CSDVsTsTX

AF488. A e C são imagens de luz transmitida. Em B as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. Em D as células foram pré‐incubadas com TTX e após 5 min. com TsTX‐AF488 por mais 55 min. O gráfico E mostra que não foi possível detectar diferença na intensidade de marcação entre estes experimentos. Barras de escala correspondem a 20 µm.

A B

C D

E


TsTX-AF4880

10

20

30

40

50

Inte

nsid

ade

méd

iade

fluo

resc

ênci

a (U

.A)

TsTX-AF488 +cloreto de colina

Figura 11: Internalização dos CSDVsTsTXAF488 com a substituição do sódio por

colina. A e C são imagens de luz transmitida. Em B as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. Em D as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. em meio de cultura onde cloreto de sódio foi substituído por cloreto de colina. O gráfico E mostra que não foi possível detectar diferença na intensidade de marcação entre estes experimentos. Barras de escala correspondem a 20 µm.

A B

C D

E


4.7 DEPENDÊNCIA DA ATIVIDADE DA MEMBRANA NA INTERNALIZAÇÃO DOS CSDVs-TsTX-AF488

Os experimentos conduzidos onde as células foram incubadas com KRH sem Ca2+

contendo TTX 1µM e EGTA 2mM revelaram intensidades de marcação citoplasmática

significativamente inferiores em relação àqueles onde havia somente TsTX-AF488 (TsTX-

AF488: 43,5 ± 3,2; TsTX-AF488+TTX sem Ca2+ :31,8 ± 2,2) (Figura 12).


TsTX-AF488 TsTX-AF488+TTX sem Ca2+0

10

20

30

40

50

*

Inte

nsid

ade

méd

ia d

eflu

ores

cênc

ia (U

.A)

Figura 12: Participação concomitante do influxo de sódio e do cálcio extracelular na internalização dos CSDVsTsTXAF488. A e C são imagens de luz transmitida. Em B as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. Em D as células foram incubadas com TsTX‐AF488 por 60 min. em meio de cultura na ausência de cálcio extracelular, com EGTA e com TTX pré‐incubada nos 5 min. iniciais. Houve redução significativa da marcação em relação às células incubadas em meio com cálcio e sem TTX, sugerindo a possível dependência concomitante do influxo de sódio e do cálcio extracelular para a ocorrência da internalização dos CSDVs TsTXAF488. Barras de escala correspondem a 20 µm. * p<0,05.

A B

C D


5 DISCUSSÃO


Os CSDVs são amplamente conhecidos por gerarem potenciais de ação em

células excitáveis, entretanto sua participação na modulação sináptica ainda permanece

pouco esclarecida. Estudos sobre a sua distribuição, bem como sobre fatores

responsáveis por sua regulação, na membrana plasmática, são essenciais para a

compreensão da excitabilidade neuronal. Com a finalidade de investigar a internalização

dos CSDVs foi utilizada a TsTX, uma ferramenta capaz de se ligar de forma específica a

estes canais, além de provocar a despolarização do neurônio. Portanto a internalização

da TsTX-AF488 sugere a internalização dos canais.

Tendo em vista a avaliação indireta dos CSDVs com a técnica utilizada, os

resultados sugerem a internalização dos canais ligados a TsTX-AF488 por alguma via

endocítica ou a internalização apenas da TsTXAF488. Além disso, pode ser que os canais

não estejam sendo internalizados de forma íntegra; a interação da TsTX-AF488 pode

provocar a ruptura de sua estrutura e, dessa forma, fragmentos dos canal poderiam

estar sendo internalizados por um mecanismo não endocítico. Estudos realizados

posteriormente poderão confirmar a hipótese inicial.

Ao se considerar a internalização dos CSDVs, esta deve ocorrer rapidamente uma

vez que foi detectada marcação, no interior da célula, superior à marcação de

autofluorescência. O estímulo despolarizante, provocado pela TsTX, pode ser o

responsável pela ocorrência rápida desse evento. Nos intervalos de tempo

subseqüentes, a intensidade de fluorescência foi semelhante, embora seja possível

visualizar um padrão mais intenso de marcação quando as células foram incubadas com

TsTX-AF488, por 60 min. É possível que neste intervalo os canais estejam agrupados

dentro de vesículas endocíticas, enquanto que em intervalos de tempo inferiores eles

estejam distribuídos difusamente pelo citoplasma. Por outro lado, não se pode descartar

a possibilidade de internalização apenas da TsTX-AF488 e tampouco do canal não


íntegro ligado a ela. Este pode ocorrer via um mecanismo não endocítico cuja ocorrência

também poderia ocorrer em intervalos de tempo menores.

A especificidade de ligação, descrita por Massensini e cols., em 2002, não pôde

ser observada. Nesse estudo foram utilizadas células GH3, enquanto que o presente

estudo utilizou células SN56. A expressão diferenciada nos tipos celulares e

conseqüentemente a quantidade de CSDVs presentes na membrana plasmática podem

ter contribuído para a diferença nos resultados. Além disso, é possível que os intervalos

de tempo em que as células foram incubadas com a toxina fluorescente sejam

responsáveis pelo fenômeno observado. Neste estudo o ensaio de competição durou 60

min., enquanto que no estudo citado acima o mesmo ensaio durou 5 min. Como a

ligação da TsTX aos CSDVs é reversível, um tempo superior de incubação deve

possibilitar um aumento na freqüência de ligação e de desligamento das toxinas,

facilitando a ligação de mais toxina marcada e sua conseqüente internalização. As

outras possibilidades referem-se à internalização apenas da TsTX-AF488 ou ainda do

canal não íntegro associado a ela, por um mecanismo não saturável e provavelmente

não endocítico.

O pré-bloqueio com albumina não alterou a marcação intracelular da TsTX-AF488.

A albumina é a proteína plasmática mais abundante, sendo responsável pelo transporte

de substâncias como bilirrubina, estradiol, cortisol, entre outras. O fato de ser

inespecífica, em função do grande número de ligantes que a ela podem se associar

(Kragh-Hansen 1981) permite sua utilização como ferramenta para investigar a

especificidade do objeto em estudo. O resultado encontrado parece confirmar a ligação

específica da TsTX-AF488 aos CSDVs, de acordo com o estudo de Massensini e cols.,

em 2002. Ou então a TsTX-AF488 estaria sendo internalizada também por um


mecanismo específico ou o mesmo poderia ocorrer com o canal não íntegro, associado

a ela.

Quando a TsTX-AF488 foi incubada a 4°C observou-se redução significativa da

marcação intracelular. O resultado sugere que a internalização, possivelmente dos

CSDVs, depende do metabolismo celular e também de alguma via endocítica, tendo em

vista que a maioria dos processos endocíticos é ativo, dependente de energia e ocorre

em temperaturas fisiológicas (37°C). Da mesma forma, a internalização tanto da TsTX-

AF488 sozinha quanto do canal não íntegro, associado a ela, poderia estar sendo inibida

a esta temperatura.

A atividade da TsTX parece fundamental para sua internalização e dos CSDVs. A

adição de um agente desnaturante, β-mercaptoetanol, à temperatura aproximada de

100°C, parece ter provocado sua perda funcional, com ruptura das pontes dissulfídicas e

perda da estrutura protéica secundária e terciária. Resíduos específicos de aminoácidos

são responsáveis pela interação das toxinas do tipo α, com os CSDVs (Kharrat, Darbon

et al. 1989), portanto é possível que a manutenção da estrutura primária não tenha

impedido sua ligação aos CSDVs uma vez que foi observada intensa marcação na

região da membrana plasmática, o que não foi visto em nenhum outro experimento.

Embora a TsTX tenha se ligado aos canais, a perda de sua estrutura secundária e

terciária deve ter impedido sua ação. Portanto, com a inatividade da toxina, a entrada de

Na+ na célula foi menor quando comparada quando a toxina estava ativa, pois nesta

forma ela consegue retardar a inativação dos canais. Novamente outra possibilidade

refere-se à internalização da TsTX-AF488 sozinha. Ela pode não ter internalizado com

sua perda funcional. Apesar de pouco provável, é possível que ela tenha outro ligante na

membrana celular, porém a literatura descreve apenas sua interação com os CSDVs.

Curioso é o fato da TsTX-AF488 não ter sido lavada já que não estava em sua forma


ativa; sua estrutura protéica primária, com a conservação dos resíduos de aminoácidos

parece suficiente para sua ligação. Essa conservação apóia a hipótese inicial, uma vez

que os resíduos de aminoácidos são responsáveis pela interação com o sítio 3 dos

CSDVs. A ação da TsTX pela inibição do movimento externo do segmento IV dos

CSDVs poderia explicar os resultados encontrados. Quando a toxina está ativa, ocorre

inibição das correntes de comporta (“gating currents”) evitando que ocorra a inativação

rápida dos canais ainda que não haja fluxo de íons Na+. Entretanto quando ela está

inativa, mesmo ligada, não deve ocorrer inibição das correntes de comporta. Dessa

forma os canais se inativariam e não ocorreria sua internalização. Esta por sua vez

poderia estar ocorrendo como um mecanismo “protetor” contra uma hiperexcitabilidade

neuronal, ou seja, na iminência de um fluxo iônico mais prolongado, os CSDVs seriam

internalizados a fim de evitá-lo.

A retirada do Ca2+ extracelular, com adição de um quelante -EGTA- inibiu a

marcação intracelular. Portanto a internalização dos CSDVs parece depender do cálcio

extracelular, provavelmente devido à sua participação nos processos endocíticos da

membrana celular. De forma contrária, a internalização da TsTX-AF488 ou do canal não

íntegro, ligado a ela, poderia ocorrer sem a dependência do cálcio ou das vias

endocíticas.

Os resultados obtidos com a adição de TTX e com a substituição do cloreto de

sódio por cloreto de colina, no meio de incubação, foram semelhantes. Mais uma vez

não ocorreu inibição da marcação. A TTX se liga aos CSDVs externamente, bloqueando

o fluxo iônico. Entretanto o mecanismo de comporta do canal, ou seja, a ativação e a

inativação funcionam normalmente sob estímulo despolarizante (Narahashi 2008). Esse

comportamento foi demonstrado pela medida das correntes de ativação e inativação do

canal que não foram afetadas pela TTX (Bezanilla and Armstrong 1974; Keynes and


Rojas 1974). Portanto os resultados do presente estudo sugerem que a possível

internalização dos CSDVs não depende do fluxo iônico, mas sim do seu estado ativado,

uma vez que a TsTX se liga preferencialmente a esse estado. O mesmo parece ocorrer

com a substituição do cloreto de sódio por cloreto de colina. Neste caso o fluxo de íons

também não ocorre, entretanto a TsTX deve estar ligada aos canais no estado ativado,

permitindo que os mesmos sejam internalizados. A internalização da TsTX-AF488 sem os

canais ou do canal não íntegro, ligado a ela, poderia revelar o mesmo padrão de

marcação, uma vez que estes não deve se dependentes de fluxo íons Na+

A concomitante retirada do Ca2+ extracelular e a adição de TTX ao meio

provocaram redução significativa da marcação intracelular. O resultado foi semelhante

àquele obtido com a redução da temperatura para 4°C. A esta temperatura, como o

metabolismo celular está diminuído, tanto os mecanismos de endocitose quanto o influxo

de Na+ são menores, o que é semelhante ao que ocorre com a retirada do Ca2+ e com a

adição de TTX, respectivamente. Da mesma forma, o resultado poderia se aplicado à

ocorrência da internalização da TsTX-AF488 sem o canal ou do canal não íntegro.

A análise dos resultados também deve considerar a sensibilidade da técnica

utilizada. É possível que exista diferença entre os experimentos realizados, porém o

limite para detecção da fluorescência pode não ter permitido a observação dessas

diferenças. A fluorescência só pôde ser detectada com parâmetros de aquisição muito

altos, com isso a faixa de variação dos níveis de marcação entre os experimentos ficou

bastante reduzida. A utilização de uma técnica complementar é necessária para

confirmar tanto a internalização dos CSDVs como sua dependência dos parâmetros

fisiológicos investigados. A próxima etapa deste estudo deve consistir em quantificar a

proteína na membrana ou no citoplasma e determinar se seu peso molecular

corresponde ao peso molecular dos CSDVs.


A relevância do atual estudo baseia-se da inovação da ferramenta utilizada. Este

é o primeiro estudo que investiga a internalização dos CSDVs utilizando uma toxina

fluorescente como marcador dos canais e como estímulo despolarizante,

concomitantemente. Com a técnica empregada foi possível observar os eventos sem a

fixação da amostra e sem outro estímulo externo além da própria TsTX.


6 CONCLUSÕES


• A marcação fluorescente relativa à TsTX-AF488 no citoplasma de células SN56

sugere a internalização de CSDVs.

• A internalização da TsTX-AF488 com os CSDVs deve ocorrer por alguma via

endocítica específica, tendo em vista a não competição entre TsTX-AF488 e BSA.

• A internalização de CSDVs-TsTX-AF488 parece depender do metabolismo celular,

tendo em vista a redução significativa da marcação intracelular com a diminuição

da temperatura.

• A internalização de CSDVs-TsTX-AF488 parece depender do Ca2+ extracelular,

tendo em vista a redução significativa da marcação intracelular com a adição de

EGTA ao meio e concomitante retirada do cálcio extracelular.


7 BIBLIOGRAFIA


Armstrong, C. M. and B. Hille (1998). "Voltage-gated ion channels and electrical

excitability." Neuron 20(3): 371-80.

Barhanin, J., J. R. Giglio, et al. (1982). "Tityus serrulatus venom contains two classes

of toxins. Tityus gamma toxin is a new tool with a very high affinity for studying the

Na+ channel." J Biol Chem 257(21): 12553-8.

Barhanin, J., D. Pauron, et al. (1984). "New scorpion toxins with a very high affinity for

Na+ channels. Biochemical characterization and use for the purification of Na+

channels." J Physiol (Paris) 79(4): 304-8.

Bezanilla, F. and C. M. Armstrong (1974). "Gating currents of the sodium channels:

three ways to block them." Science 183(126): 753-4.

Carbone, E., E. Wanke, et al. (1982). "Selective blockage of voltage-dependent K+

channels by a novel scorpion toxin." Nature 296(5852): 90-1.

Catterall, W. A. (1980). "Neurotoxins that act on voltage-sensitive sodium channels in

excitable membranes." Annu Rev Pharmacol Toxicol 20: 15-43.

Catterall, W. A. (1981). "Localization of sodium channels in cultured neural cells." J

Neurosci 1(7): 777-83.

Catterall, W. A. (1984). "The molecular basis of neuronal excitability." Science

223(4637): 653-61.

Catterall, W. A. (1992). "Cellular and molecular biology of voltage-gated sodium

channels." Physiol Rev 72(4 Suppl): S15-48.

Catterall, W. A. (2000). "From ionic currents to molecular mechanisms: the structure

and function of voltage-gated sodium channels." Neuron 26(1): 13-25.

Catterall, W. A., C. S. Morrow, et al. (1979). "Neurotoxin binding to receptor sites

associated with voltage-sensitive sodium channels in intact, lysed, and detergent-

solubilized brain membranes." J Biol Chem 254(22): 11379-87.


Catterall, W. A., R. Ray, et al. (1976). "Membrane potential dependent binding of

scorpion toxin to action potential Na+ ionophore." Proc Natl Acad Sci U S A 73(8):

2682-6.

Cestele, S. and W. A. Catterall (2000). "Molecular mechanisms of neurotoxin action

on voltage-gated sodium channels." Biochimie 82(9-10): 883-92.

Chen, Y., L. Deng, et al. (2003). "Formation of an endophilin-Ca2+ channel complex

is critical for clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis." Cell 115(1): 37-48.

Couraud, F., E. Jover, et al. (1982). "Two types of scorpion receptor sites, one related

to the activation, the other to the inactivation of the action potential sodium

channel." Toxicon 20(1): 9-16.

Couraud, F., H. Rochat, et al. (1978). "Binding of scorpion and sea anemone

neurotoxins to a common site related to the action potential Na+ ionophore in

neuroblastoma cells." Biochem Biophys Res Commun 83(4): 1525-30.

Dargent, B. and F. Couraud (1990). "Down-regulation of voltage-dependent sodium

channels initiated by sodium influx in developing neurons." Proc Natl Acad Sci U S

A 87(15): 5907-11.

Dargent, B., F. Jullien, et al. (1995). "Internalization of voltage-dependent sodium

channels in fetal rat brain neurons: a study of the regulation of endocytosis." J

Neurochem 65(1): 407-13.

DeBin, J. A., J. E. Maggio, et al. (1993). "Purification and characterization of

chlorotoxin, a chloride channel ligand from the venom of the scorpion." Am J

Physiol 264(2 Pt 1): C361-9.

Dunn, W. A., A. L. Hubbard, et al. (1980). "Low temperature selectively inhibits fusion

between pinocytic vesicles and lysosomes during heterophagy of 125I-asialofetuin

by the perfused rat liver." J Biol Chem 255(12): 5971-8.

Garcia, M. L., Y. Gao, et al. (2001). "Potassium channels: from scorpion venoms to

high-resolution structure." Toxicon 39(6): 739-48.

Garrido, J. J., F. Fernandes, et al. (2003). "Dynamic compartmentalization of the

voltage-gated sodium channels in axons." Biol Cell 95(7): 437-45.


Gekle, M., S. Mildenberger, et al. (1995). "Endosomal alkalinization reduces Jmax

and Km of albumin receptor-mediated endocytosis in OK cells." Am J Physiol

268(5 Pt 2): F899-906.

Gellens, M. E., A. L. George, Jr., et al. (1992). "Primary structure and functional

expression of the human cardiac tetrodotoxin-insensitive voltage-dependent

sodium channel." Proc Natl Acad Sci U S A 89(2): 554-8.

Glebov, O. O., N. A. Bright, et al. (2006). "Flotillin-1 defines a clathrin-independent

endocytic pathway in mammalian cells." Nat Cell Biol 8(1): 46-54.

Goldin, A. L. (2001). "Resurgence of sodium channel research." Annu Rev Physiol 63:

871-94.

Gomez, M. V., M. E. Dai, et al. (1973). "Effect of scorpion venom, tityustoxin, on the

release of acetylcholine from incubated slices of rat brain." J Neurochem 20(4):

1051-61.

Gomez, M. V. and C. R. Diniz (1966). "Separation of toxic components from the

brazillian scorpion Tityus serrulatus venom." Mem Inst Butantan 33(3): 899-902.

Gomez, M. V., C. R. Diniz, et al. (1975). "A comparison of the effects of scorpion

venom tityustoxin and ouabain on the release of acetylcholine from incubated

slices of rat brain." J Neurochem 24(2): 331-6.

Habich, C., K. Baumgart, et al. (2002). "The receptor for heat shock protein 60 on

macrophages is saturable, specific, and distinct from receptors for other heat

shock proteins." J Immunol 168(2): 569-76.

Hallaq, H., Z. Yang, et al. (2006). "Quantitation of protein kinase A-mediated

trafficking of cardiac sodium channels in living cells." Cardiovasc Res 72(2): 250-

61.

Hasson, A., M. Fainzilber, et al. (1993). "Alteration of sodium currents by new peptide

toxins from the venom of a molluscivorous Conus snail." Eur J Neurosci 5(1): 56-

64.

Henriques, M. C. and M. V. Gomez (1981). "The effect of scorpion venom tityustoxin

on the uptake of calcium in synaptosomes." Brain Res Bull 7(3): 255-9.


Hodgkin, A. L. and A. F. Huxley (1952). "The dual effect of membrane potential on

sodium conductance in the giant axon of Loligo." J Physiol 116(4): 497-506.

Isom, L. L., K. S. De Jongh, et al. (1992). "Primary structure and functional expression

of the beta 1 subunit of the rat brain sodium channel." Science 256(5058): 839-42.

Isom, L. L., D. S. Ragsdale, et al. (1995). "Structure and function of the beta 2 subunit

of brain sodium channels, a transmembrane glycoprotein with a CAM motif." Cell

83(3): 433-42.

Isom, L. L., T. Scheuer, et al. (1995). "Functional co-expression of the beta 1 and type

IIA alpha subunits of sodium channels in a mammalian cell line." J Biol Chem

270(7): 3306-12.

Ito, M., H. Nagafuji, et al. (2002). "Autosomal dominant epilepsy with febrile seizures

plus with missense mutations of the (Na+)-channel alpha 1 subunit gene, SCN1A."

Epilepsy Res 48(1-2): 15-23.

Keynes, R. D. and E. Rojas (1974). "Kinetics and steady-state properties of the

charged system controlling sodium conductance in the squid giant axon." J Physiol

239(2): 393-434.

Kharrat, R., H. Darbon, et al. (1989). "Structure/activity relationships of scorpion

alpha-toxins. Multiple residues contribute to the interaction with receptors." Eur J

Biochem 181(2): 381-90.

Kim, J., S. C. Jung, et al. (2007). "Regulation of dendritic excitability by activity-

dependent trafficking of the A-type K+ channel subunit Kv4.2 in hippocampal

neurons." Neuron 54(6): 933-47.

Kirsch, G. E., A. Skattebol, et al. (1989). "Modification of Na channel gating by an

alpha scorpion toxin from Tityus serrulatus." J Gen Physiol 93(1): 67-83.

Krafte, D. S. and A. W. Bannon (2008). "Sodium channels and nociception: recent

concepts and therapeutic opportunities." Curr Opin Pharmacol 8(1): 50-6.

Kragh-Hansen, U. (1981). "Molecular aspects of ligand binding to serum albumin."

Pharmacol Rev 33(1): 17-53.


Lazdunski, M., C. Frelin, et al. (1986). "Polypeptide toxins as tools to study voltage-

sensitive Na+ channels." Ann N Y Acad Sci 479: 204-20.

Lombet, A., J. N. Bidard, et al. (1987). "Ciguatoxin and brevetoxins share a common

receptor site on the neuronal voltage-dependent Na+ channel." FEBS Lett 219(2):

355-9.

Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, et al. (1951). "Protein measurement with the Folin

phenol reagent." J Biol Chem 193(1): 265-75.

Marban, E., T. Yamagishi, et al. (1998). "Structure and function of voltage-gated

sodium channels." J Physiol 508 ( Pt 3): 647-57.

Massensini, A. R., T. Moraes-Santos, et al. (1998). "Alpha- and beta-scorpion toxins

evoke glutamate release from rat cortical synaptosomes with different effects on

[Na+]i and [Ca2+]i." Neuropharmacology 37(3): 289-97.

Massensini, A. R., J. Suckling, et al. (2002). "Tracking sodium channels in live cells:

confocal imaging using fluorescently labeled toxins." J Neurosci Methods 116(2):

189-96.

Monici, M. (2005). "Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic

applications." Biotechnol Annu Rev 11: 227-56.

Moss, J., N. B. Thoa, et al. (1974). "On the mechanism of scorpion toxin-induced

release of norepinephrine from peripheral adrenergic neurons." J Pharmacol Exp

Ther 190(1): 39-48.

Narahashi, T. (2008). "Tetrodotoxin: a brief history." Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol

Sci 84(5): 147-54.

Nicholls, D. G., T. S. Sihra, et al. (1987). "Calcium-dependent and -independent

release of glutamate from synaptosomes monitored by continuous fluorometry." J

Neurochem 49(1): 50-7.

Nichols, B. J. (2002). "A distinct class of endosome mediates clathrin-independent

endocytosis to the Golgi complex." Nat Cell Biol 4(5): 374-8.


Noda, M., T. Ikeda, et al. (1986). "Expression of functional sodium channels from

cloned cDNA." Nature 322(6082): 826-8.

Nusser, Z. (2009). "Variability in the subcellular distribution of ion channels increases

neuronal diversity." Trends Neurosci 32(5): 267-74.

Paillart, C., J. L. Boudier, et al. (1996). "Activity-induced internalization and rapid

degradation of sodium channels in cultured fetal neurons." J Cell Biol 134(2): 499-

509.

Pauron, D., J. Barhanin, et al. (1985). "The voltage-dependent Na+ channel of insect

nervous system identified by receptor sites for tetrodotoxin, and scorpion and sea

anemone toxins." Biochem Biophys Res Commun 131(3): 1226-33.

Raman, I. M., L. K. Sprunger, et al. (1997). "Altered subthreshold sodium currents and

disrupted firing patterns in Purkinje neurons of Scn8a mutant mice." Neuron 19(4):

881-91.

Ribeiro, A. M. and M. V. Gomez (1986). "The effect of calmodulin inhibitors on the

release of acetylcholine and protein phosphorylation induced by tityustoxin, K+

and ouabain." Brain Res Bull 16(5): 673-80.

Romano-Silva, M. A., R. Ribeiro-Santos, et al. (1994). "Tityustoxin-mediated Na+

influx is more efficient than KCl depolarisation in promoting Ca(2+)-dependent

glutamate release from synaptosomes." Neurosci Lett 169(1-2): 90-2.

Sampaio, S. V., C. J. Laure, et al. (1983). "Isolation and characterization of toxic

proteins from the venom of the Brazilian scorpion Tityus serrulatus." Toxicon

21(2): 265-77.

Schiavo, G., M. Matteoli, et al. (2000). "Neurotoxins affecting neuroexocytosis."

Physiol Rev 80(2): 717-66.

Silveira, N. P., T. Moraes-Santos, et al. (1991). "Effects of Tityus serrulatus scorpion

venom and one of its purified toxins (toxin gamma) on the isolated guinea-pig

heart." Comp Biochem Physiol C 98(2-3): 329-36.


Toledo, D. and A. G. Neves (1976). "Purification and partial characterization of a

second toxin from the scorpion Tityus serrulatus." Comp Biochem Physiol B 55(2):

249-53.

Vacher, H., D. P. Mohapatra, et al. (2008). "Localization and targeting of voltage-

dependent ion channels in mammalian central neurons." Physiol Rev 88(4): 1407-

47.

Valdivia, H. H., M. S. Kirby, et al. (1992). "Scorpion toxins targeted against the

sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-release channel of skeletal and cardiac muscle."

Proc Natl Acad Sci U S A 89(24): 12185-9.

Vijverberg, H. P., D. Pauron, et al. (1984). "The effect of Tityus serrulatus scorpion

toxin gamma on Na channels in neuroblastoma cells." Pflugers Arch 401(3): 297-

303.

Whitaker, W. R., R. L. Faull, et al. (2001). "Comparative distribution of voltage-gated

sodium channel proteins in human brain." Brain Res Mol Brain Res 88(1-2): 37-53.

Yu, F. H. and W. A. Catterall (2003). "Overview of the voltage-gated sodium channel

family." Genome Biol 4(3): 207.

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