UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO 14PB INS/DEL DO GENE HLA-G COM A ENDOMETRIOSE EM MULHERES DE

MATO GROSSO– BRASIL

Joziane Agnoria da Silva Seidel

CUIABÁ

2014

ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO 14PB INS/DEL DO GENE HLA-G COM A ENDOMETRIOSE EM MULHERES DE

MATO GROSSO– BRASIL

Joziane Agnoria da Silva Seidel

Orientadora: Profa. Dra. Bianca Borsatto Galera

Coorientador: Prof. Dr. Sebastião Freitas de Medeiros

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde, Área de Concentração Reprodução Humana e Climatério.

CUIABÁ

2014

JOZIANE AGNÓRIA DA SILVA SEIDEL

ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO 14PB INS/DEL DO GENE HLA-G

COM A ENDOMETRIOSE EM MULHERES DE MATO GROSSO– BRASIL

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal de Mato Grosso,

como requisito parcial para obtenção do título de Mestre

em Ciências da Saúde. Aprovação em 18/12/2015

Bianca Borsatto Galera

_____________________________________________

1º Membro da banca (UFMT)

Sebastião Freitas de Medeiros

_____________________________________________

2º Membro da banca (UFMT)

José Meireles Filho

_____________________________________________

3º Membro da banca (UNIC)

Cuiabá, 2014

v

À Trindade Santa (Deus Pai, Deus Filho e Deus Espírito Santo) por aliviarem

a caminhada, carregando-me no colo quando humanamente meus pés não tinham

força para continuar... A Ti Jesus, Fonte de Eterno Amor, dedico esta pesquisa, para

que ela sirva para melhorar a qualidade de vida de tantas mulheres que sofrem pela

dor cíclica ou pelo desejo da maternidade.

Aos meus pais, José Astrogildo da Silva e Doralice Dias de Oliveira, meus

eternos intercessores e exemplo de vida Cristã.

Ao meu Esposo, Roberson Gustavo Seidel, pela confiança e renuncia diante

de tantas coisas para junto comigo percorrer esse caminho de sonhos, onde

encontramos realidades tão difíceis, mas que só foi possível superar por

acreditarmos que somos uma só carne.

Ao meu filho Arthur Gustavo, por desde o meu ventre estar me ensinando o

quanto a prática do amor materno supera todas as dificuldades.

vi

AGRADECIMENTO

À minha orientadora Bianca Borsatto Galera por ter acreditado em mim e

confiado que eu seria capaz de superar as fragilidades existentes. Obrigada por

fazer o possível e o impossível para não deixar faltar material no laboratório, mesmo

às vezes precisando tirar dinheiro do próprio bolso para que a pesquisa não

parasse. Agradeço a Deus pelo ser humano que você é, serei eternamente grata por

você se preocupar com a minha pessoa quando a pesquisadora se demonstrou tão

frágil.

Ao Dr. Sebastião de Freitas Medeiros, figura imponente e que possui um

sorriso muito mais contagiante do que sua face de seriedade, obrigada pela atenção

disponibilizada a cada orientação.

À professora Carmem Lúcia Bassi Branco por se disponibilizar e me atender

com tanta calma e paciência, algo que fazia com que eu me sentisse única.

Obrigada por me socorrer intelectualmente e com alguns não poucos insumos para

a pesquisa.

À minha amiga e companheira de provações, Eloísa Helena Kubiszeski,

obrigada por ter sido canal para que eu iniciasse essa aventura e principalmente por

não ter me deixado sozinha durante todo o percurso.

Ao meu amigo Aguiar Farina, que eu aprendi a admirar como pessoa,

obrigada por ter doado seu tempo para me ajudar.

À toda equipe da INTRO, da recepção passando pela equipe de enfermagem

até os cirurgiões e anestesistas, aqui em especial a figura da Arlene Alves Serra que

sempre me atendeu nos incansáveis telefonemas para saber da agenda cirúrgica, as

enfermeiras Sabrina Lira e Camila Bahama, ao Dr. Fernando Bahia e Dr. Victor

Alves por sempre que houve necessidade ter esperado o término da entrevista para

sedar a paciente, à Dra. Marcia Yamamoto e Dr. Matheus Medeiros por dividir a

alegria conosco a cada paciente controle. Obrigada à enfermeira Jacklyne Silva

Barbosa companheira e intermediária para marcações de orientações com o

professor Sebastião.

À equipe do Hospital e Maternidade Femina na pessoa do Dr. Acir André

Novaczyk, valeu a pena ter acordado você às 6h da manhã quando na verdade você

estaria de plantão até as 12h, desculpa novamente e obrigada.

vii

Ao professor e Dr. Dalton Ferreira juntamente com o Dr. Oacir Monteiro da

Silva Junior pelas pacientes confiadas à nossa pesquisa.

A todas as mulheres que aceitaram participar desta pesquisa, por confiarem a

nós seus dados pessoais além de aceitarem levar uma ―picadinha do bem‖ para que

pudéssemos realizar a parte laboratorial, bem como por acreditarem junto conosco

que a ciência pode mudar o rumo da história.

Aos membros da banca da qualificação e/ou defesa, professora Carmem

Lúcia Bassi Branco, professor Marcial Francis Galera, professor Sebastião Freitas de

Medeiros e professor José Meireles Filho pelo carinho e tempo disponibilizado a

correção da minha dissertação, obrigada por cada sugestão.

Obrigada Hélida Leseux, secretária do Programa de Pós-Graduação por

continuar sorrindo diante de tantas perguntas e atrasos!! Adoooro você, Deus lhe

pague.

Aos meus colegas de bioestatística e epidemiologia, Letícia, Nayara,

Thamires, Ruberlei, Lucas e Eloisa, pelas incansáveis rodas de estudo e discussões

sobre as disciplinas e fé cristã. Vocês moram em meu coração.

Às minhas colegas de laboratório, Regiane Festi e Naiana Leotti pelas

orientações de organização e uso do Laboratório, essa convivência nem sempre

pacífica me ajudou a crescer nos desafios que os relacionamentos interpessoais me

propôs. Obrigada aos técnicos do Laboratório de Histologia e Genética, Ronaldo, Jô,

Cáceres e Denésio pelo respeito, torcida e auxílio diante de cada uma das etapas do

mestrado.

Às pessoas que por muitas vezes foram a extensão das minhas mãos dentro

do laboratório ou na digitação interminável dos protocolos de entrevista: Eloísa

Kubiszeski, Ana Luisa, Ariane Queiroz, Daniela, Iara Nascimento e Luíza Thicaci.

Aos meus amigos da Secretaria de Saúde por me apoiarem e segurarem as

pontas sem nunca reclamar para que eu pudesse conciliar estudo e serviço.

Obrigada Karina Toniasso, Maria Carolina Lopes e Janaina Lugli, vocês são MARA!

Obrigada meu ―paizinho‖ e minha ―mãezinha‖, meus eternos amores, pela

inesgotável fonte de amor, paciência e renuncia. Obrigada por me ajudarem a

conquistar mais esta formação e por ter dado a mim um lar saudável para que eu me

desenvolvesse como pessoa.

Ao meu esposo, obrigada por estar comigo, por ser paciente diante de tantos

momentos de ―TPMs‖ fora do ciclo, obrigada por me fazer acreditar que a família é o

viii

maior bem que podemos ter nesta vida. Ao meu filho, obrigada meu pequenino por

sorrir para mim, seu sorriso faz tudo valer a pena.

Aos meus irmãos e irmãs Julimar, Gilberto, Jouvane, Jonatham, Jaine e

Joselaine, bem como cunhadas Marcilene, Erinete, Gisele, Jackeline e cunhado

Clesio e aos meus sobrinhos e afilhados (são muitos!!!) pela torcida e paciência

diante das minhas ausências.

ix

―Pai nosso que estais no céu, santificado seja o teu nome, venha o teu reino; seja

feita a tua vontade, assim na terra como no céu‖

(Mateus 6, 9-10)

x

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 .................................................................................................. 8

Estadiamento da endometriose proposto pela Sociedade Americana de

Medicina Reprodutiva (1996).

Figura 2 .................................................................................................. 11

Esquema do gene do antígeno leucocitário humano-G (HLA-G) e sua

transcrição.

Figura 3 .................................................................................................. 13

Esquema do processamento alternativo na região 3’-UTR, com presença do

14pb e marcação de onde são removidos 92pb do RNAm de HLA-G.

Figura 4 .................................................................................................. 21

Eletroforese em gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata para

observação do polimorfismo HLA-G 14pb ins/del.

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 ................................................................................................. 24

Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do

gene HLA-G nas mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose

(controle).

Tabela 2 ................................................................................................. 24

Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do

gene HLA-G nas mulheres com endometriose conforme o grau da doença.

Tabela 3 ................................................................................................. 25

Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do

gene HLA-G nas mulheres com endometriose, reagrupadas em estágio menos

avançado e mais avançado.

Tabela 4 ................................................................................................... 25

Distribuição das variáveis clínicas entre as mulheres com endometriose (caso)

e sem endometriose (controle).

Tabela 5 ................................................................................................. 26

Distribuição e frequência genotípica do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-

G nas mulheres com endometriose que apresentaram infertilidade.

Tabela 6 ................................................................................................. 26

Distribuição e frequência genotípica do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-

G nas mulheres que tiveram endometriose (caso) e que apresentaram

abortamento.

xii

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

µL- Microlitro

3’UTR- 3´ Untranslated region – Região 3’ não traduzida

ACs- Anticorpos

ASRM- American Society for Reproductive Medicine – Sociedade Americana de

Medicina Reprodutiva

DNA- Deoxyribonucleic acid - Ácido desoxirribonucléico

dNTP's- Deoxyribonucleotide - Desoxirribonucleotídeos fosfatados

EDTA- Ethylenediamine tetraacetic acid - Ácido etileno diamino tetracético

FP- fluido peritoneal

HLA-G – Human leukocyte antigen- Antígeno leucocitário humano-G

HW- Hardy-Weinberg

IC- Intervalo de confiança

ILs- Interleucinas

INS/DEL- Inserção/deleção

INTRO – Instituto Tropical de Medicina Reprodutiva e Climatério

Kb- Kilo base

KDa- Kilo Dalton

MHC- Major histocompatibility complex – Complexo principal de histocompatibilidade

mL- Mililitro

mM- Milimolar

Ng- Nanograma

OR- Odds Ratio – Razão de chance

Pb- Par de base

PCR- Polymerase Chain Reaction- Reação em cadeia de polimerase

Ph- Potencial hidrogeniônico

RNAm- Ribonucleic acid messenger – Ácido ribonucleico mensageiro

SDS- Dodecil sulfato de sódio

TCLE- Termo de consentimento livre e esclarecido

Tris- Hidroximetil-aminometano

Xg- gravidade

IFN-γ: interferon gama

xiii

RESUMO

A endometriose é uma condição nosológica caracterizada pela presença de tecido

funcional semelhante ao endométrio eutópico em locais como peritônio pélvico,

ovários, septo reto-vaginal. Sua prevalência varia entre 30 a 50% nas mulheres

inférteis. O quadro clínico inclui dispareunia profunda, dismenorreia incapacitante,

dor pélvica crônica e infertilidade. A influência de genes envolvidos com o sistema

imunológico e suas variantes têm sido investigadas quanto à suscetibilidade e

evolução da endometriose. O gene antígeno leucocitário humano-G (HLA-G)

pertence ao complexo de histocompatibilidade principal classe I, mapeado e 6p21 e

contem o polimorfismo 14pb inserção/deleção (ins/del). O presente estudo objetiva

identificar possível associação entre o polimorfismo 14pb ins/del no gene HLA-G e

endometriose em mulheres de Mato Grosso, Brasil. O desenho epidemiológico é

observacional do tipo caso-controle. Foram incluídas 349 mulheres (209 casos e 140

controles) com idades entre 16 a 50 anos, atendidas e diagnosticadas através de

videolaparoscopia em serviço de referência em reprodução humana de Mato

Grosso. Entrevistas semipadronizadas e coleta de amostras de sangue periférico

foram realizadas. Obtiveram-se DNA através do método com utilização de sais, foi

realizada reação em cadeia de polimerase utilizando iniciadores específicos, os

fragmentos foram visualizados em gel de poliacrilamida 10%. As frequências

genotípicas e alélicas do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G entre casos e

controles mais observadas foram os genótipos heterozigotos ins/del 111 (53,1%) e

69 (49,3%) e alelos del 249 (59,6%), 151 (54,0%), respectivamente. Em relação ao

estadiamento, as frequências genotípicas ins/del no grau I foram 28 (58,3%); grau II,

36 (46,2%); grau III, 21 (48,8%) e grau IV, 26 (65,0%). As frequências alélicas del no

grau I foram 54 (56,3%); grau II, 98 (62,8%); grau III, 49 (57,0%) e grau IV, 48

(60,0%). Não houve diferença estatisticamente significante em nenhuma variável

analisada. Quanto a avaliação do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G nas

variáveis clínicas entre casos com ou sem infertilidade, a maior frequência obtida

foram os genótipos heterozigotos ins/del em 88 (55,0%) das pacientes com

infertilidade e em 23 (47,0%) das pacientes sem infertilidade. O alelo del foi

observado nas inférteis com frequência de 186 (58,1%) e nas mulheres sem

infertilidade apresentou frequência de 63 (51,7%). Analisando as mulheres com

xiv

endometriose e que relataram ter tido abortamento ou não, observou-se que os

genótipos heterozigotos foram mais frequentes. Nas mulheres com abortamento a

frequência foi de ins/del 13 (48,1%) e sem abortamento ins/del 98 (53,8%). Os

resultados não foram estatisticamente significantes em todas as variáveis clínicas

analisadas p>0,05. Nosso estudo verificou que o polimorfismo 14pb ins/del no gene

HLA-G não está associado à endometriose em mulheres de Mato Grosso – Brasil.

As frequências genotípicas e alélicas não estão associadas com a doença ou com o

estadiamento da mesma, as frequências genotípicas também não estão associadas

com infertilidade e com abortamento.

Palavras-chave: Endometriose, HLA-G, 14pb.

ABSTRACT

Endometriosis is a nosological condition characterized by the presence of functional

tissue similar to eutopic endometrium in pelvic peritoneum, ovaries, rectovaginal

septum. Its prevalence in infertile women varies between 30 and 50%. The clinical

manifestations are variable, including deep dyspareunia, disabling dysmenorrhea,

chronic pelvic pain and infertility. The influence of genes involved in the immune

system and its variants have been investigated for their susceptibility and

progression of endometriosis. The gene of human leukocyte antigen-G (HLA-G)

belongs to the main histocompatibility complex class I. It´s mapped on 6p21, has

eight exons and seven introns being translated region where polymorphism is

present 14pb insertion/deletion (ins/del). This study aims to identify possible

association between the polymorphism 14pb ins/del in HLA-G gene and

endometriosis in women of Mato Grosso-Brazil. The epidemiological design is

observational case-control type. 349 women were included (209 cases and 140

controls) aged 16-50 years, seen and diagnosed by laparoscopy in a human

reproduction center of Mato Grosso. Interviews and collection of peripheral blood

samples were performed for each participant. DNA was extracted by salting out

method, polymerase chain reaction using specific primers, was performed and the

fragments were visualized on 10% polyacrylamide gel. The genotypic and allelic

frequencies of polymorphism 14pb ins/del HLA-G gene between cases and controls

were observed more heterozygous genotypes ins/del 111 (53.1%) and 69 (49.3%)

and alleles del 249 (59, 6%), 151 (54.0%), respectively. As regards staging, the

genotypic frequencies ins/del grade I were 28 (58.3%); grade II, 36 (46.2%); grade

III, 21 (48.8%) and grade IV, 26 (65.0%). The allelic frequencies del grade I were 54

(56.3%); grade II, 98 (62.8%); grade III, 49 (57.0%) and grade IV, 48 (60.0%). There

was no significant difference in any variable analyzed. As the evaluation of

polymorphisms 14pb ins/del HLA-G gene in the clinical variables between cases with

or without infertility, most often heterozygous genotypes obtained were ins/del in 88

(55.0%) patients with infertility and 23 (47.0%) patients without infertility. The allele

del was observed in infertile woman with a frequency of 186 (58.1%) and in no

infertile women showed frequency of 63 (51.7%). Analyzing women with

endometriosis and who reported abortion or not, it was noted that heterozygous

genotypes were more frequent. In women with abortion was the frequency of ins/del

13 (48.1%) and without abortion ins/del 98 (53.8%). The results were not statistically

significant in all clinical variables p>0.5. Our study found that the polymorphism 14pb

ins/del in HLA-G gene did not influence the susceptibility to endometriosis in women

Mato Grosso - Brazil. The genotypic and allelic frequencies are not associated with

the staging and/or severity of the disease, infertility and miscarriages.

Keywords: Endometriosis, HLA-G, 14pb

SUMÁRIO

Dedicatória...................................................................................... v

Agradecimentos.............................................................................. vi

Epígrafe........................................................................................... ix

Lista de figuras................................................................................

Lista de gráficos..............................................................................

Lista de siglas e abreviações..........................................................

x

xi

xii

Resumo...........................................................................................

Abstract...........................................................................................

xiii

xiv

I Introdução....................................................................................... 1

II Objetivos

II.1 Objetivo geral............................................................................

II.2 Objetivos específicos................................................................

4

5

5

III Revisão da literatura

III.1 Endometriose: considerações gerais.......................................

III.2 Etiopatogenia ..........................................................................

III.3 O antígeno leucocitário humano-G (HLA-G)............................

III.4 O polimorfismo 14pb no gene HLA-G......................................

6

7

9

10

12

IV Métodos

IV.1 Tipo de estudo.........................................................................

IV.2 População de estudo e amostra..............................................

IV.3 Considerações éticas...............................................................

IV.4 Tamanho da amostra...............................................................

IV.5 Critérios de inclusão................................................................

IV.6 Critérios de exclusão...............................................................

IV.7 Variáveis estudadas.................................................................

IV.8 Processamento de amostras biológicas..................................

IV.8.1 Coleta de amostras.......................................................

IV.8.2 Extração de DNA..........................................................

IV.8.3 Quantificação do material extraído...............................

IV.9 Técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR)...............

IV.10 Análise de dados

15

16

16

16

16

17

17

17

18

18

18

19

20

21

V Resultados...................................................................................... 22

VI Discussão....................................................................................... 28

VII Conclusões..................................................................................... 32

VIII Anexos............................................................................................ 34

IX Referências bibliográficas.............................................................. 40

1

I.INTRODUÇÃO

2

I. INTRODUÇÃO

A endometriose é uma condição nosológica caracterizada pela presença de

tecido funcional semelhante ao endométrio eutópico em locais como peritônio

pélvico, ovários, septo reto-vaginal e mais raramente no pericárdio, pleura e sistema

nervoso central (NÁCUL; SPRITZER, 2010). Tem prevalência que varia entre 30 a

50% das mulheres inférteis (HOLOCH; LESSEY, 2010, NAVARRO et al., 2006).

Além do quadro clínico e de marcadores biológicos, a precisão diagnóstica da

endometriose envolve a utilização da vídeolaparoscopia, procedimento que permite

a visualização de lesões suspeitas, o estadiamento da doença e a obtenção de

amostras para exame histopatológico (BERBEL et al., 2008).

Cerca de 20 a 25% das mulheres acometidas pela endometriose são

assintomáticas, permanecendo o restante dos casos com quadros clínicos variáveis,

incluindo dispareunia profunda e às vezes dismenorreia incapacitante, dor pélvica

crônica e infertilidade (BULLETTI et al., 2010).

A intensidade da dismenorreia independe do grau de comprometimento

pélvico causado pela endometriose e do tempo de manifestação da doença, a dor

pode ainda ser influenciada por fatores psicológicos. Mulheres sintomáticas para

referem ter seu cotidiano de trabalho, lazer, prática esportiva e vida sexual

comprometida devido às dores cíclicas (MATTA; MULLER, 2006, MISON et al.,

2012). Portanto, o impacto bio-psico-social desta doença é elevado, tanto para a

paciente quanto para a saúde pública (NAVARRO et al., 2006).

Fatores genéticos têm sido investigados quanto a influência na fisiopatologia.

No entanto, o papel de genes envolvidos com o sistema imunológico e suas

variantes na suscetibilidade a endometriose ainda é incipiente, mostrando-se um

caminho promissor a ser explorado. Estudos devem avançar no sentido de definir o

tipo de resposta linfocitária predominante e quais as citocinas que participam

efetivamente deste processo (POPPE, 2008).

O gene do Antígeno leucocitário humano-G (HLA-G) pertence ao complexo de

histocompatibilidade principal (MHC) classe I, localizado no braço curto do

cromossomo 6 (6p21), possui oito éxons e sete íntrons e uma região 3’não traduzida

3

(3’-UTR) sendo este último o local onde esta presente o polimorfismo 14pb

inserção/deleção (ins/del). O gene HLA-G está associado a resposta imunológica

por participar do balanço à resposta imune, influenciando a atividade das células

citotóxicas (HORNUNG, 2001; KAWASHIMA, 2009). Embora ainda de maneira

inconclusiva, a endometriose é uma doença inflamatória que envolve aumento de

citocinas que são características do padrão imune. Portanto, estudos com

marcadores genéticos da resposta imunitária são promissores para melhor

compreensão da fisiopatogênese da doença (PODGAEC et al., 2007). Trabalhos

semelhantes a este, que busquem respostas para o mecanismo etiopatogênico da

endometriose envolvendo o polimorfismo 14pb ins/del no gene HLA-G inexistem na

população de mulheres em Mato Grosso. A literatura demonstra que a endometriose

pode ser uma doença autoimune, que o gene HLA-G está envolvido com a resposta

imunológica e que de fato há influência do polimorfismo 14pb ins/del na expressão

deste gene, sendo assim, esta pesquisa tem como objetivo identificar as frequências

alélicas e genotípicas do polimorfismo 14pb ins/del neste gene em mulheres com

endometriose neste Estado.

4

II. OBJETIVOS

5

II. OBJETIVOS

II.1 Objetivo Geral

Examinar a possível associação entre o polimorfismo 14pb ins/del no gene

HLA-G e endometriose em mulheres de Mato Grosso, Brasil.

II.2 Objetivos Específicos

Identificar as frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo 14pb ins/del

no gene HLA-G em mulheres com e sem endometriose.

Examinar possível associação entre o polimorfismo 14pb ins/del no gene

HLA-G, presente em mulheres com endometriose, e variáveis clínicas.

6

III. REVISÃO DA LITERATURA

7

III. REVISÃO DA LITERATURA

III.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE A ENDOMETRIOSE

A endometriose é uma doença benigna crônica e que na maioria das vezes

acomete mulheres na idade reprodutiva causando diminuição da qualidade de vida,

infertilidade e altos custos sociais. Os depósitos ectópicos de endométrio podem ser

encontrados no peritônio pélvico, ligamentos útero-sacros, fundo de saco de

Douglas, ovários ou mesmo em estruturas fora da pelve (KONDO et al., 2011).

Observam-se mulheres que manifestam sintomas cíclicos de dor no período

menstrual, como dor pélvica crônica, dispareunia de profundidade e/ou sintomas

intestinais e urinários cíclicos como dor ou sangramento ao evacuar/urinar durante o

período menstrual (PODGAEC et al., 2010).

Achados nos exames laboratoriais e de imagem podem predizer com

aceitável acurácia se a paciente tem endometriose, embora o diagnóstico definitivo

seja dado pela videolaparoscopia. Esta possibilita não só o diagnóstico como

também o tratamento cirúrgico, com a cauterização e excisão dos focos, lise das

aderências e estadiamento da doença (KONDO et al., 2011, NÁCUL;SPRITZER,

2010). Há uma maior suspeita no diagnóstico de endometriose quando a mulher

apresenta dor pélvica e infertilidade (HOLOCH; LESSEY, 2010). Trabalhos sugerem

um possível papel da endometriose na etiopatogenia da infertilidade, visto que 20 a

50% das mulheres inférteis apresentam endometriose e 30 a 50% das mulheres com

endometriose são inférteis (NAVARRO et al., 2006). Pesquisa realizada em Mato

Grosso mostrou que 76,4% das mulheres inférteis apresentaram endometriose

(MEDEIROS et al., 2012)

A endometriose pélvica pode ser classificada durante a laparoscopia pelos

critérios da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva - American Society for

Reproductive Medicine (ASRM), revisado em 1996, em: estadiamento I (mínimo),

estadiamento II (leve), estadiamento III (moderado) e estadiamento IV (severo), de

acordo com número, tamanho e porcentagem de implantes superficiais ou profundos

conforme mostra a Figura 1.

8

4.5 Coletas de sangue e processamento das

Figura 1. Estadiamento da endometriose proposto pela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (1996).

9

III.2 ETIOPATOGENIA

A etiopatogenia da endometriose ainda não foi totalmente elucidada.

Sampson, em 1921, durante cirurgia abdominal de duas mulheres visualizou lesões

na região peritoneal, estruturalmente e funcionalmente parecidas com o endométrio,

e as denominou ―adenomas do tipo endometrial‖. Fez duas importantes

observações: primeiro, percebeu que os cistos hemorrágicos ovarianos (do tipo

achocolatado- hoje denominado endometriomas) rompiam-se facilmente durante o

procedimento e pensou que os mesmos podiam ser responsáveis pelos ―adenomas

do tipo endometrial‖. Segundo, observou que estas mulheres estavam menstruadas

durante a cirurgia e que parte do sangramento uterino drenava na cavidade

abdominal. Em 1927, o mesmo reformulou o conceito que cunhou o termo

endometriose, hipotetisando que, devido à menstruação retrógrada, o tecido do

endométrio se implantaria na cavidade peritoneal. Essa teoria é ainda uma das mais

aceitas nos dias atuais (SAMPSON, 1927 apud BENAGIANO, 2006). No entanto,

esta hipótese não explica todas as formas clínicas de endometriose encontradas.

Em adição à menstruação retrógrada, há a hipótese de imunidade alterada,

na qual se sugere que as células do endométrio migradas para a cavidade pélvica

invadiriam o tecido pélvico e seriam responsáveis por influenciar uma cascata de

eventos, podendo inclusive causar irritação na cavidade e instalando neste local

uma doença inflamatória como a endometriose, com possível acometimento de

nervos, ovários, uretra e intestino. Como o sistema imune é o responsável pela

remoção de células do endométrio ou detritos menstruais, o que não é retirado pode

permanecer na superfície peritoneal e até mesmo invadir o espaço retoperitoneal

(HOLOCH; LESSEY, 2010). Acredita-se que este excesso de endométrio que por

alguma falha na vigilância imunológica não foi eliminado da cavidade, elevaria os

níveis de antígenos, provocando uma resposta auto-imune, seja pela tolerância

imunológica ou falha na rejeição das células invasoras (MATHUR, 2000).

Além da hipótese da menstruação retrógrada e imunidade alterada, há a

hipótese da metaplasia celômica. Esta teoria sugere que como o peritônio contém

células indiferenciadas, as mesmas poderiam diferenciar-se em células do

10

endométrio, e isso poderia contribuir para o desenvolvimento da endometriose

(MACER, 2012). Essa hipótese seria possível devido a cavidade pericárdica,

cavidade pleural e cavidade peritoneal serem formadas a partir do mesmo espaço, o

celôma intraembrionário (MOORE, 2008).

O estudo em genética como base na busca de mecanismos que possam

influenciar no desenvolvimento da endometriose tem sido fortemente discutido

(MATHUR, 2000). Estudos de polimorfismos em genes e sua associação com

endometriose têm sido frequentemente pesquisados, tais como, estudo envolvendo

o receptor de estrogênio α e o citocromo P450c17α (CYP17) (HSIEH, 2004).

Polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 (KUBISZESKI, 2013). Polimorfismo

promotor funcional fator nuclear-kB (BIANCO et al., 2012).

A busca por uma definição molecular da patogênese da endometriose ainda

está em seus primórdios (BENAGIANO, 2006). A observação da expressão do HLA-

G em doenças imunes e inflamatórias é relativamente recente, porém, torna-se cada

vez mais evidente que a molécula HLA-G é capaz de exercer ação direta ou

sustentada no sistema imunológico por meio dos seus efeitos imunorregulatórios

(BRENOL et al., 2012).

III.3 ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO-G (HLA-G)

O gene HLA-G pertencente ao MHC que é subdividido em classes I, II e III,

mapeado no braço curto do cromossomo 6 (6p21), aproximadamente, 230 kb

telomérica (Figura 2A). O HLA-G pertence a classe I e possui oito éxons, sete

íntrons e uma região 3’-UTR (GERAGHTY et al., 1987). O RNAm do gene HLA-G

codifica uma proteína de 39kDa de comprimento que contém três domínios

extracelulares ligados a membrana α1, α2, α3, (Figura 2B) (CAROSELLA et al.,

1996). O transcrito primário de HLA-G apresenta sete isoformas de RNAm que vai

de HLA-G1 a G7 devido ao processamento alternativo (Figura 2C) (CAROSELLA et

al., 1999).

O processamento remove os íntrons e une os éxons, formando o RNAm

maduro, que continua a ser modificado (poliadenilação) até ser exportado do núcleo

para ser traduzido em produto proteico. O processamento que converte o pré-RNA

11

em RNAm maduro precisa ocorrer com precisão, evitando perda ou adição de

nucleotídeos nos sítios de junção dos éxons. Sendo assim, os pré-RNAs alternativos

devido a esta estratégia pode dar origem a mais de um produto polipeptídico, ou

seja, mais de uma proteína por gene (WATSON et al., 2006).

Figura 2 - Esquema do gene do Antígeno Leucocitário Humano-G (HLA-G) e sua

transcrição. Adaptado.

Fonte: http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/GC_HLA-G.html

À partir de 1990, foi observado que a molécula HLA-G encontra-se na

interface feto placentária e é expresso na superfície do trofoblasto, sendo

responsável pela proteção do feto contra a resposta imune da mãe (BRENOL et al.,

2012). Porém, não está restrito a tecidos fetais, foi relatado que o HLA-G também é

expresso nas células epiteliais do timo adulto, ilhotas pancreáticas e em células-

tronco (CAROSELLA et al., 1999).

12

A função da molécula HLA classe I é o reconhecimento de células alvos pelos

linfócitos T citotóxicos (LTC); esta molécula é reconhecida juntamente com o

antígeno por um receptor expresso em sua superfície. Todas as células nucleadas

possuem o MHC classe I e este pode estimular os linfócitos T (CD8+) a produzir

citocinas, capazes de estimular a atividade citotóxica das células natural Killer (NK) e

dos macrófagos. As NK são responsáveis pela apoptose de células infectadas e

podem secretar citocinas como o interferon gama(IFN-γ) que ativam os macrófagos

e aumentam a capacidade destes em fagocitar (DELVES, ROITT, 2000). Porém, a

classe I do MHC, em contato direto com a NK, pode ativar o receptor inibitório deste,

e assim, não haverá destruição da célula (MORETTA et al., 2002).

A expressão do HLA-G foi estudada nas mulheres com endometriose,

principalmente no fluído peritoneal (FP) (EIDUKAITE; TAMOSIUNAS, 2008,

HORNUNG et al., 2001, KAWASHIMA et al., 2009), e no epitélio do estroma e

epitélio glandular retirados dos tecidos eutópicos e ectópicos (BARRIER et al., 2006,

HORNUNG et al., 2001, KAWASHIMA et al., 2009).

Na literatura, existem descrições da expressão do HLA-G com esclerose

múltipla, doença celíaca, asma, doença de Behçet, sarcoidose, pênfigo vulgar e

miocardiopatia dilatada idiopática, transplantes, tumores celulares, estados

inflamatórios e infecções virais (SCHNEIDER, 2009).

III.4 POLIMORFISMO 14 PB INSERÇÃO/DELEÇÃO (INS/DEL)

O HLA-G tem sido foco de estudos, principalmente devido a variações

nucleotídicas presentes nele, sendo o polimorfismo 14pb ins/del um dos mais

estudados, uma vez que estes podem influenciar na regulação da expressão do

HLA-G (TURECK, 2011).

Em estudo prévio, o polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G foi analisado

em 121 indivíduos humanos e 41 macacos divididos em cinco espécies diferentes.

Foi observado que a sequência de 14pb estava presente (ins) em todas as espécies

de macacos, enquanto nos humanos, a sequência de 14pb ins poderia estar

13

presente ou ausente. Sendo assim, provavelmente o gene polimórfico é o 14pb

deleção (CASTRO et al., 2000).

Análise detalhada da região 3’-UTR do gene HLA-G pode auxiliar no

esclarecimento de mecanismos subjacentes de controle da expressão do HLA-G.

Autores inferem que a região 3’-UTR que apresenta o alelo 14pb ins pode estar

associado a baixa disponibilidade do RNAm, enquanto que o 14pb del causaria alta

disponibilidade do mesmo (CASTELLI et al., 2010). O alelo HLA-G que possui 14pb

ins ao ser submetido ao processamento alternativo perde 92 bases da região 3’-

UTR, sendo que essas são retiradas transversalmente de parte do transcrito (Figura

3). Embora este alelo esteja associado com um RNAm mais estável, ainda assim,

representam a minoria dos transcritos (VEIT; CHIES, 2009).

Figura 3 – Esquema do processamento alternativo na região 3’-UTR, com presença do 14pb e marcação de onde são removidos 92pb do RNAm. Adaptado. Fonte: Rosseau et al., 2003.

Estudos avaliaram isoformas do polimorfismo 14pb ins na região 3’-UTR

através de biópsia de trofoblasto e demonstraram que o produto do gene que

contem este polimorfismo está presente em níveis bem menores que as mesmas

isoformas com sequência de polimorfismo que apresenta o 14pb del (HVIID et al.,

2003). Sendo assim, na gestação, o HLA-G parece desequilibrar o balanço da

resposta imune Th1/Th2 vindo a favorecer respostas do tipo Th2, levando a inibição

das células NK e prosseguimento da gestação, dessa forma o HLA-G atuaria como

molécula imunossupressora (VIANA et al., 2007). Como o polimorfismo 14pb ins

diminui os níveis de HLA-G, isto permitiria a ocorrência de uma resposta T auxiliares

do tipo 1 (Th1), com ativação das células NK, o que levaria a ocorrência da pré-

14

eclâmpsia ou até ocasionaria o abortamento (SCHNEIDER, 2009, VIANA et al.,

2007).

As células Th1 são secretoras de citocinas pró-inflamatórias como o IFN-γ e

IL-2, que servem de gatilho para o envolvimento de células imunes como as NK,

macrófagos e linfócitos T. Enquanto as células Th2 são produtoras de citocinas

antiinflamatória, principalmente o IL-4 e IL-10 (MOSMANN et al., 1986 apud

PODGAEC et al., 2007). As respostas Th1 e Th2 coexistem e raramente se

enquadram exclusivamente em Th1 ou Th2, mas uma predomina sobre a outra,

levando em consideração o tipo e quantidade de antígenos envolvidos, bem como o

local onde a resposta imune tem início (RIZZO et al., 1995). Embora IL-10 tenha sido

descrito como um produto Th2 foi observado que ela também é secretada por Th1 e

por macrófagos ativados (ABBAS et al., 1996). Nas mulheres com endometriose, foi

observado que quando o padrão de resposta Th1 está ativo, o padrão Th2 também

pode estar presente, sugerindo que ambos os braços da resposta imune estão

envolvidos (PODGAEC et al., 2007).

No Brasil, não foram encontrados trabalhos com o polimorfismo 14pb do gene

HLA-G em mulheres com endometriose, porém o mesmo tem sido estudado em

distúrbios gestacionais como o abortamento e pré-eclâmpsia (VIANNA, 2007), na

população de Belém do Pará foi realizado pesquisa genética populacional com este

polimorfismo (BARBOSA, 2009). Também foi investigado em amostra afro-brasileira

do residente no Paraná (TURECK, 2011), em patologias como o Lupus Eritematoso

Sistêmico (VEIT et al., 2009), em doenças reumatológicas (BRENOL et al., 2012) e

em doenças inflamatórias intestinais (SCHNEIDER, 2009).

15

IV. MÉTODOS

16

IV. MÉTODOS

IV.1 TIPO DE ESTUDO

O desenho epidemiológico do estudo foi observacional do tipo caso-controle.

IV.2 POPULAÇÃO DO ESTUDO E AMOSTRA

A população do estudo compreendeu 349 mulheres em idade fértil entre 16 a

50 anos com queixas de dor pélvica ou infertilidade, encaminhadas para realização

de videolaparoscopia, padrão ouro para o diagnóstico de endometriose (PRIETO et

al., 2012). O recrutamento das participantes ocorreu no Instituto Tropical de

Medicina Reprodutiva e Menopausa (INTRO) de Cuiabá- MT entre o período de

janeiro de 2010 a janeiro de 2013.

Considerou como casos 209 mulheres com diagnóstico de endometriose

confirmado por videolaparoscopia e exame histopatológico. Enquanto 140 mulheres

que realizaram videolaparoscopia sem confirmação diagnóstica de endometriose,

foram incluídas como controles.

IV.3 CONSIDERAÇÕES ÈTICAS

O protocolo da pesquisa foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa envolvendo Seres Humanos do Hospital Universitário Júlio Müller, com o

número de parecer: 267.286 (Anexo 2). Todas as mulheres pesquisadas assinaram

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo 3).

IV.4 TAMANHO DA AMOSTRA

O cálculo da amostra foi realizado com α=5% e para poder de teste β=90%,

Z é o valor bicaudal relacionado com a hipótese nula e Z é o valor unicaudal

inferior relacionado com a hipótese alternativa, sendo assim Z =1,96 e Z =1,28,

17

1 0,24 corresponde a menor frequência polimórfica do gene HLA-G 14pb

(genótipo ins/ins) encontrado em um estudo com uma população de Mato Grosso-

Cuiabá (LEOTTI, 2010) e 2 0,28, assume uma proporção de 20% acima do valo

de 1 . com a seguinte fórmula

2

21

221111 )1()1()1(2

ZZn

Assim, seriam necessárias 100 mulheres com endometriose e 100 mulheres sem a

patologia.

IV.5 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO

Foram incluídas no estudo mulheres encaminhadas para videolaparoscopia

que se encontravam em idade fértil (16 a 50 anos). As pacientes incluídas como

casos foram aquelas cujo diagnóstico de endometriose pélvica ficou confirmado pela

visualização dos focos com biopsia confirmatória de endometriose. As pacientes

controles foram aquelas em que não houve visualização de lesões endometrióticas

na cavidade pélvica.

IV.6 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO

Atendendo a proposta da pesquisa, foram excluídas mulheres que não

residiam no estado de Mato Grosso, além de mulheres que já se encontravam na

menopausa devido a necessidade de análise alélica e genotípica e sua associação

com sinais clínicos. Mulheres que não concordaram com a punção venosa para

coleta de material biológico e/ou assinatura do TCLE também foram excluídas desta

pesquisa.

IV.7 VARIÁVEIS ESTUDADAS

As participantes responderam a um questionário semi-padronizada, onde se

coletou variáveis de interesse como idade, naturalidade, procedência, etnia

(autoreferida), profissão, situação marital, dados ginecológicos e obstétricos,

18

presença ou não de focos de endometriose e estadiamento da doença; as lesões

foram observadas na videolaparoscopia e classificadas de acordo com os critérios

da ASRM, revisados em 1996 (Figura 1).

IV.8 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS

IV.8.1 Coleta de amostras

Após aplicação do questionário, foi realizado venopunção com técnica

asséptica com coleta de 8mL de sangue distribuídos em dois tubos de 4mL

contendo anticoagulante EDTA (VACUPLAST®), os mesmos foram armazenados em

freezer -20°C (CONSUL®), até a data de extração.

IV.8.2 Extração de DNA

Todos os experimentos foram executados no laboratório de genética da

Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Mato Grosso. O protocolo para a

extração de DNA baseou-se no método salting out, proposto por John et al. (1990),

modificado por Lahiri e Nurnberger em 1991, executado com pequenas

modificações. Foram utilizadas micropipetas (EPPENDORF®) calibradas para o

preparo de todos os reagentes e utilização destes nos experimentos. Os preparos

das soluções se deram da seguinte maneira: Solução de lise I com água bidestilada

autoclavada, adicionou-se o tris (10mM), acertou-se o pH da solução entre 7,5 e 8,0

com HCl, dissolveu-se sacarose (0.32mM), MgCl2 (5mM) e Triton 100. Esta solução

foi acondicionada na geladeira (CONSUL®) em frasco envolvido com papel alumínio.

Na solução de lise II utilizou-se água bidestilada autoclavada como solvente e

adiciona-se o tris (10mM), EDTA (10mM), NaCl (10mM) e SDS 0,5% no mesmo,

este foi acondicionado em temperatura ambiente. No preparo para a solução de

precipitação de proteína utilizou-se água bidestilada autoclavada como solvente e

como soluto apenas o NaCl (6M), este foi acondicionado em temperatura ambiente.

Na data de extração de DNA o sangue foi retirado do freezer para alcançar a

temperatura ambiente. Colocou-se o sangue em tubo para centrifugação com fundo

cônico (Tipo Falcon®) com tampa rosqueável de volume 15 mL, livre de Dnase,

Rnase, pirogênios e toxinas, adicionou-se 8mL de solução de lise I, passou-se no

vórtex (FANEM®) até homogeneizar e em seguida foi agitado manualmente. Marcou-

19

se 10 min da hora em que foi adicionada a solução e o mesmo foi centrifugado

(SIGMA®) por 5min em 8.000xg. Despejou-se o sobrenadante deixando no fundo do

tubo o sedimento e adicionou-se a este 4mL de solução de lise I, novamente o tubo

foi agitado em vórtex até homogeneizar, em seguida agitou-se manualmente até

completar mais 10mim; centrifugou-se por 5min em 8.000xg. Despejou-se o

sobrenadante deixando o sedimento no fundo do tubo, adicionou-se a este 2mL de

solução de lise I, novamente passou-se no vórtex até homogeneizar, em seguida

agitou-se manualmente até completar os 10mim, centrifugou-se por 5min em

8.000xg. Desprezou-se o sobrenadante deixando o sedimento no fundo do tubo e

adicionou-se a este 1mL de solução de lise II, passou-se no vórtex até

homogeneizar; em seguida adicionou-se 0,33µL da solução de precipitação de

proteína e passou-se no vórtex novamente até homogeneizar; centrifugou-se por

5min em 8.000xg; foi aspirado 1100µL do sobrenadante e distribuído 550µL em dois

microtubos de polipropileno (Corning®) com tampa de pressão, livre de

Rnase/Dnase, autoclavável, adicionou-se 550µL de isopropanol a este e agitou-se

manualmente até que o DNA fosse revelado, em seguida os microtubos foram

acondicionado em centrifuga (SIGMA®) por 10min a 14.000xg; ao serem retirados,

desprezou o sobrenadante e adicionou-se 500µL de álcool etílico 70% para

purificação do DNA; passou-se no vórtex até desprender o sedimento, centrifugou-

se por 10min em 14.000xg; (repete-se esse procedimento de lavagem com etanol

70% três vezes). Desprezou-se o sobrenadante e o sedimento foi deixado em

dequitação por aproximadamente 3h (tempo o suficiente para evaporação do álcool

etílico); após esse período, foi adicionado 200µL de água bidestilada e autoclavada

ao sedimento e passado no vórtex até homogeneizar.

IV.8.3 Quantificação do material extraído

A quantificação do DNA foi realizada em aparelho NanoDrop modelo

2000/2000c Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific®), com este aparelho

pode-se também observar o grau de pureza dos DNAs. As amostras com pouco

DNA (abaixo de 20ng/ µL) e fora do padrão de pureza (A 260/280 entre 1.6 a 2.0 e

A260/230 entre 1.7 a 2.1) foram desprezadas por não permitir identificação

satisfatória do polimorfismo em reação em cadeia de polimerase (PCR), portanto

uma nova extração foi realizada. Foi retirado 10µL das amostras de DNA e

20

armazenadas em outro microtubo para manuseio, todas as amostras foram

guardadas em freezer -80ºC até a data da técnica de PCR.

IV.9 GENOTIPAGEM POR REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)

Inicialmente foi preparado o mix em capela Workstation para PCR modelo

WS-02. O mix utilizado foi composto de água bidestilada autoclavada,

desoxinucleotídeos dNTP's (Biotecnologia®), tampão (10X PCR com 100mM Tris-

HCL, Ph 8.6; 500mM KCL, 15mM MgCl2), MgCl2 (25mM) e enzima Taq DNA

Polimerase (Affymetrix®), iniciadores para HLA-G 14pb (Eurofins®). Por fim, foi

adicionado 1,5µL das amostras de DNA, onde o volume final de cada microtubo foi

de 15µL. Em seguida, os mesmos foram acondicionados em termociclador

(Amplitherm Thermal Cyclers® 96X) para amplificação da molécula de DNA,

programado com temperatura/tempo de desnaturação inicial 94ºC-5’, 30 ciclos com

desnaturação 94ºC-45‖; anelamento 56ºC-45’’ e alongamento 72ºC-1’ e

alongamento final 72ºC-7’ (TEXEIRA et al., 2013). A sequência de iniciadores

utilizados para análise em PCR do polimorfismo 14pb (forward 5’-

TGTGAACAGCTGCCCTGTGT-3’ e reverse 5’- AAGGAATGCATTCAGCATGA-3’. Após a

amplificação, os fragmentos obtidos foram analisados em gel poliacrilamida a 10%

por aproximadamente 1h00min a 250v e corados com nitrato de prata. Foram

observados fragmentos 14pb ins (152 pb) e 14pb del (138 pb) como mostrado na

Figura 4:

21

FIGURA 4 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata para observação do polimorfismo 14pb ins/del do HLA-G, entre colunas de 01 a 14. 01- Marcador de peso molecular 100pb; 02- homozigotos para inserção; 03, 05, 08 e 12- homozigotos para deleção; 04, 06, 07, 09, 10 e 13 heterozigotos inserção/deleção; 11- branco (amostra sem DNA); 14- controle positivo.

IV.10 ANÁLISE DE DADOS

Para as variáveis continuas com distribuição normal foram calculado a média

e o desvio padrão. Para a associação do genótipo entre os polimorfismo do gene

HLA-G 14pb ins/del e a endometriose foram utilizados teste de proporção qui-

quadrado (χ2) de Pearson. Para associação alélica entre os polimorfismo do gene

HLA-G 14pb ins/del e a endometriose foram utilizados teste de proporção qui-

quadrado (χ2) de Pearson e Razão de Chance (OR), com intervalo de confiança de

95%. O valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significante. Os dados

foram digitados em dupla entrada, armazenados e analisados com auxílio do

Programa EpiData Software, version 2.2.2 build 177, Dinamarca.

22

V. RESULTADOS

23

V. RESULTADOS

As pacientes incluídas no estudo com endometriose apresentaram uma média

de idade de 32,04 anos (±5,87), e nas mulheres sem endometriose foi de 31,90 anos

(±5,74). A idade da menarca ocorreu em torno dos 12,55 anos para ambos os

grupos. O estado civil predominante foi convivência marital tanto entre os casos 168

(80,4%) como entre os controles 110 (78,6%). Quanto à etnia, as raças branca e

parda foram igualmente autorreferidas no grupo de casos, sendo 95 (45,5%) cada

uma; entre controles a etnia predominante foi a parda em 66 mulheres (47,1%). O

grau de escolaridade de maior frequência foi as com ensino superior 141 (67,5%) e

80 (57,1%) nos grupos de casos e controles, respectivamente.

As frequências genotípicas, referentes ao polimorfismo 14pb ins/del no gene

HLA-G, observadas entre casos (X2=5,779; GL=2, P=0,06) e controles (X2=0,024;

GL=2, p=0,99) demonstrou que a população da pesquisa encontra-se em equilíbrio

de Hardy-Weinberg.

Na Tabela 1 estão apresentadas as frequências genotípicas observadas entre

os grupos de casos e controles, sendo os heterozigotos os mais frequentes,

correspondendo a ins/del em 111 (53,1%) e 69 (49,3%), respectivamente. A maior

frequência alélica observada entre as pacientes com endometriose foi del 249

(59,6%); e entre as pacientes sem endometriose del em 151 (54,0%). Não houve

diferença estatisticamente significante em nenhuma variável analisada.

24

Tabela 1. Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G nas mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle).

Variável Caso

(n=209)

Controle

(n=149)

X2 p OR/ IC95%

Genótipo

ins/ins 29(13,9%) 30(21,4%) Referência

ins/del 111(53,1%) 69(49,3%) 2,868 0,090 0,6022 (0,3312-1,093)

del/del 69(33,0%) 41(29,3%) 2,905 0,088 1,661 (0,9122-3,314)

Alelo

ins 169(40,4%) 129(46,0%) Referência del 249(59,6%) 151(54,0%) 2,181 0,1398 0,7947

(0,5851-1,079)

Na Tabela 2, estão apresentados o grupo de casos e os diferentes graus de

apresentação da doença. Observa-se que as frequências genotípicas não se

diferenciaram conforme o estadiamento da endometriose, sendo o genótipo

heterozigoto mais observado, ins/del no grau I, 28 (58,3%); grau II, 36 (46,2%); grau

III, 21 (48,8%) e grau IV, 26 (65,0%), não houve diferença estatisticamente

significante em nenhuma categoria. As frequências alélicas mais presentes foi del

em todos os estágios, o alelo del no grau I, 54 (56,3%); grau II, 98 (62,8%); grau III,

49 (57,0%) e grau IV, 48 (60,0%), sem significância estatística.

Tabela 2. Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G nas mulheres com endometriose conforme o grau da doença.

Variável Grau I (n=48)

Grau II (n=78)

Grau III (n=43)

Grau IV (n=40)

p

Genótipo ins/ins 07 (14,6%) 11 (14,1%) 08 (18,6%) 03 (7,5%) Referência

ins/del a 28 (58,3%) 36 (46,2%) 21 (48,8%) 26 (65,0%) 0,3993

del/del b 13 (27,1%) 31 (39,7%) 14 (32,6%) 11 (27,5%) 0,6948

Aleloc

ins 42 (43,7%) 58 (37,2%) 37 (43,0%) 32 (40,0%)

Referência

del 54 (56,3%) 98 (62,8%) 49 (57,0%) 48 (60,0%) 0,7126

aTeste X2= 2,950; GL=3, bTeste X2

=1,446; GL=3, cTeste X2=1,370; GL=3

25

Na Tabela 3, as mulheres com endometriose foram reagrupadas de acordo

com gravidade da doença, sendo a endometriose de grau I e II as formas menos

agressivas e os graus III e IV as formas mais agressivas. As frequências genotípicas

e alélicas entre os dois grupos foram bem próximas, não havendo diferença

estatisticamente significante em nenhuma das duas observações, com p>0,05 para

todas as variáveis. As frequências alélicas foram maiores do polimorfismo del, com

152 (60,3%) nos estágios menos avançados e 97 (58,4%) nos mais avançados.

Tabela 3. Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G nas mulheres com endometriose, reagrupadas em estágio menos avançado e mais avançado.

Graus I e II Graus III e IV p

Genótipo ins/ins 18 (14,3%)

11 (13,3%)

referência

ins/del a 64 (50,8%)

47 (56,6%)

0,6676

del/del b 44 (34,9%) 25 (30,1%) 0,8735

Aleloc

ins 100 (39,7%)

69 (41,6%)

referência

del 152 (60,3%)

97 (58,4%) 0,70

aTeste X2= 0,1844; GL=1, bTeste X2= 0,0253; GL=1, cTeste X2=0,147; GL=1

Na Tabela 4, analisou-se duas das principais variáveis clínicas associadas a

endometriose: infertilidade e abortamento. Observa-se nesta população que as

mulheres com endometriose apresentaram uma frequência de infertilidade de 160

(76,6%), sendo estatisticamente significante (p=0,012). Abortamento tanto entre o

grupo caso e controle não foi estatisticamente significante, com p>0,05.

Tabela 4. Distribuição das variáveis clínicas entre as mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle).

Variável Caso (n=209)

Controle (n=140)

X2 p OR/IC 95%

Infertilidade

Sim 160 (76,6%) 90 (64,3%) 6,211 0,012 1,811 (1,129-2,909)

Não 49 (23,4%) 50 (35,7%)

Abortamento

Sim 27 (12,9%) 18 (12,9%) 0,000 0,986 1,005 (0,5308-1,905) Não 182 (87,1%) 122 (87,1%)

26

Na Tabela 5, as frequências genotípicas observadas entre as mulheres com

endometriose e infertilidade foram: ins/ins 23 (14,4%), ins/del 88 (55,0%) e del/del 49

(30,6%) e no grupo controle foram ins/ins 06 (12,2%), ins/del 23 (47,0%) e del/del 20

(40,8%) com p=0,41.

Tabela 5. Distribuição e frequência genotípica do polimorfismo 14pb ins/del do gene

HLA-G nas mulheres com endometriose que apresentaram infertilidade.

Genótipo Infertilidade

SIM % NÃO %

(n=168) (n=41)

X2 p OR

IC

95%

ins/ins 23 (14,4) 06 (12,2) referência 1

ins/del 88 (55,0) 23 (50,0) 0,000 0,9971 1,002 0,3729-2,976

del/del 49 (30,6) 20 (40,8) 0,7209 0,3958 1,558 0,5612-4,752

Conforme apresentado na Tabela 6, as frequências genotípicas entre as

mulheres com endometriose e que relataram abortamento foram ins/ins 5 (18,5%),

ins/del 13 (48,1%) e del/del 09 (33,3%) e sem abortamento ins/ins 24 (13,2%),

ins/del 98 (53,8%) e del/del 60 (33,0%). Os resultados não apresentaram diferença

estatisticamente significante, em todas as variáveis analisadas p>0,05.

Tabela 6. Distribuição e frequência genotípica do HLA-G nas mulheres que tiveram endometriose (caso) e que apresentaram abortamento.

Genótipo Abortamento

------------------------------

Sim % Não %

(n=27) (n=182)

X2 p OR

IC

95%

ins/ins 5 (18,5%) 24(13,2%) referência 1

ins/del 13(48,1%) 98(53,8%) 0,6275 0,4283 1,565 0,4612-4,745

del/del 9(33,3%) 60(33,0%) 0,2939 0,5878 1,384 0,3847-4,582

ins/del + del/del 22(18,5%) 158 (86,8%) 0,5593 0,4545 1,493 0,4646-4,183

27

VI.DISCUSSÃO

28

VI. DISCUSSÃO

A endometriose é uma condição nosológica que tem influenciado a qualidade

de vida da mulher adulta moderna, por muitas vezes estar associada a desconfortos

como dor pélvica importante, fluxo menstrual intenso, irregular e a infertilidade

(NÁCUL; SPRITZER, 2010).

No presente trabalho, foram estudados polimorfismo genético e variáveis

clínicas de mulheres com endometriose e mulheres hígidas para esta condição,

oriundas de serviço considerado referência em reprodução humana de Mato Grosso.

A maioria das mulheres encontrava-se na quarta década de vida, possuíam

convivência marital e nível superior de escolaridade, sendo estes dados

concordantes com a literatura (BELLELIS et al., 2010; ZIMMERMMANN et al., 2010).

Tais achados eram esperados, uma vez que as mesmas foram recrutadas em uma

clínica cuja demanda se restringe a pacientes conveniadas e particulares.

As frequências genotípicas, referentes ao polimorfismo 14pb ins/del no gene

HLA-G observadas entre casos e controles, demonstrou que a população da

pesquisa encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg.

A análise do polimorfismo 14pb ins/del no gene HLA-G mostrou que os

genótipos heterozigotos, bem como o alelo del apresentaram uma frequência maior

no grupo de mulheres com endometriose, porém, não foi estatisticamente

significante.

Na literatura, não foram encontrados trabalhos semelhantes utilizando este

polimorfismo. No entanto, estudos analisando a expressão do gene HLA-G são

relativamente frequentes (HORNUNG et al., 2001; BARRIER et al., 2005,

KAWASHIMA et al., 2009; EIDUKAITE, TAMOSIUNAS, 2008).

Pesquisa através de western blotting, verificou a expressão do gene HLA-G

no fluído peritoneal de mulheres com e sem endometriose, além do cultivo de

células do estroma eutópico e ectópico de mulheres com endometriose. A presença

do HLA-G não foi encontrada em nenhuma das amostras de mulheres com

endometriose (HORNUNG et al., 2001). Em outro trabalho, a expressão do HLA-G

29

foi analisada através da imuno-histoquímica, onde também não encontraram HLA-G

no epitélio do estroma e no epitélio glandular. Porém, no mesmo estudo, foi

demonstrada a presença do transcrito de HLA-G em 92,8% das amostras do epitélio

glandular retirado das lesões peritoneais, a técnica utilizada foi a de hibridação in

situ. Nas biópsias de endométrio eutópico não se identificou o transcrito do HLA-G

em nenhum grupo (BARRIER et al., 2005).

O achados na literatura diferem dos encontrados no presente trabalho, pois o

fato da maioria dos autores não terem observado HLA-G solúvel se justificaria se

população do presente estudo apresentasse uma frequência do genótipo 14pb ins

maior que o 14pb del, uma vez que a diminuição da expressão da proteína do HLA-

G está associada ao alelo ins (VEIT et al., 2009). Porém, deve-se levar em

consideração que nos trabalhos de Hornung e Barrier, uma amostragem

relativamente pequena foi utilizada.

Em outro estudo, a expressão do HLA-G foi analisada por citometria de fluxo

e coloração imuno-histoquímica no FP e no epitélio do endométrio eutópico de

mulheres com e sem endometriose durante todas as fases do ciclo menstrual e

observaram que o mesmo é expresso no endométrio eutópico, porém, apenas

durante a fase menstrual. Durante esta mesma fase, há um aumento da expressão

do HLA-G no FP, independente do grupo ter ou não endometriose, algo que

caracteriza o ambiente intra-uterino no período menstrual como um espaço

fisiologicamente instável, além de apoiar a teoria da menstruação retrógrada

(KAWASHIMA et al., 2009). O HLA-G solúvel foi observado no FP de mulheres com

e sem endometriose, através do método ELISA, mas não foi encontrada diferença

estatisticamente entre os dois grupos (EIDUKAITE, TAMOSIUNAS, 2008).

O presente trabalho é concordante com estes achados, pois o polimorfismo

14pb del foi observado em maior frequência e isto faz com aumente a possibilidade

da expressão do HLA-G ser detectado. O HLA-G5/HLA-G1 são detectados no soro

apenas quando o HLA-G apresenta 14pb del/del na região 3’-UTR (RIZZO et al.,

2005). Porém, mesmo havendo uma frequência expressiva do polimorfismo 14pb del

em nosso estudo e sendo encontrado HLA-G solúvel nos trabalhos mencionados, os

achados não foram estatisticamente significantes.

30

Em todos os graus de acometimento da endometriose, nenhum genótipo ou

alelo chamou atenção por ser mais ou menos frequente no presente estudo. O grupo

com endometriose foi ainda reagrupado em estágios iniciais (grau I e II) e estágios

mais avançados (grau III e IV) e, novamente, o polimorfismo analisado não conferiu

associação com nenhuma das variáveis avaliadas. Estes achados corroboram com

um estudo prévio que analisou a presença de HLA-G solúvel e estadiamento da

endometriose e não observaram diferença estatisticamente significante nas

concentrações de HLA-G solúvel tanto nos estágios iniciais como nos estágios mais

avançados (EIDUKAITE, TAMOSIUNAS, 2008). Embora não se tenha analisado a

expressão do HLA-G no presente trabalho, os resultados de quem o fizeram são

concordantes com a frequência do polimorfismo 14pb ins/del observado neste

estudo.

Aproximadamente 77% das mulheres com diagnóstico de endometriose,

apresentavam infertilidade, concordando com pesquisa publicada em Mato Grosso,

com 76,4% (MEDEIROS et al., 2007), dado esperado, uma vez que as mulheres

recrutadas nesta e na outra pesquisa foram em sua grande maioria pertencentes a

mesma clínica. Estes dados estão acima do encontrado na literatura, que afirmam

que 20 a 50% das mulheres inférteis apresentam endometriose. Também vale

ressaltar que as mulheres foram recrutadas em uma clínica de infertilidade, algo que

pode justificar essa diferença. Pressupõe-se que a cavidade pélvica de uma mulher

acometida por endometriose apresente um ambiente desfavorável para o sucesso

gestacional, uma vez que existe um desequilíbrio no FP, como a produção de

autoanticorpos específicos para o endométrio (INAGAKI et al., 2011).

A investigação do polimorfismo 14pb na amostra de mulheres de Mato Grosso

foi uma tentativa de se identificar um possível marcador molecular para

endometriose e suas características clínicas, considerando uma de suas hipóteses

etiológicas vinculada ao sistema imunológico (HOLOCH; LESSEY, 2010)

O abortamento é frequentemente relatado em mulheres com esta patologia

(D’HOOGHE et al, 2003; VIANA, 2007), No presente estudo não houve diferença

estatisticamente significante entre endometriose e abortamento. Porém, analisando

os grupos, observou-se um percentil menor do alelo 14 pb ins nas pacientes com

endometriose que apresentaram abortamento, mas não houve diferença

31

estatisticamente significante como o encontrado por Wang (2013) que sugeriu que o

14pb ins quando encontrado em níveis diminuídos é uns dos responsáveis para o

insucesso gestacional e pré-eclâmpsia.

Hipóteses tentam relacionar o HLA-G com a resposta imunológica Th1 e Th2.

Pesquisa analisou que a secreção de HLA-G5/HLA-G1 é precedida pela expressão

de IL-10, e embora a expressão do mesmo seja menor na presença do genótipo

14pb del, não apresentou diferença estatisticamente significante na concentração de

IL-10 no soro quando os três genótipos foram comparados (RIZZO, 2005). Outro

estudo encontrou diferença estatisticamente significante quando observaram a

secreção dessas citocinas no FP de mulheres com endometriose e sem

endometriose, onde o IFNγ e do IL-10 nas pacientes com endometriose foi maior.

Isso demonstra que enquanto um padrão de resposta está ativo, o outro também

pode estar presente, porém sugerem que na endometriose o equilíbrio no sistema

imunológico tende para a resposta Th2 (PODGAEC, 2007). Embora o IL-10 tenha

sido inicialmente descrito como um produto Th2 é claro que esta citocina também é

secretada por Th1 e por macrófagos ativados (ABBAS et al., 1996). Outra pesquisa

avaliando o percentual de NK e de autoanticorpos em sangue periférico de mulheres

com e sem endometriose pélvica, demonstrou que a concentração de NK foi mais

elevada nas pacientes com endometriose, e muito mais elevada ainda nas pacientes

com estadiamento avançado. Essa resposta de ativação das NK é uma resposta

Th1 (DIAS, 2010). Assim, o envolvimento do HLA-G com as citocinas ainda não é

bem claro.

Embora o polimorfismo 14pb do gene HLA-G seja considerado responsável

pelo processamento alternativo que ocorre na extremidade 3’-UTR e esteja

associado com maior ou menor expressão da molécula, vale lembrar que existe o

polimorfismo 3142 localizado também na região 3’-UTR, bem próximo do

polimorfismo 14pb ins/del, algo que pode causar desequilíbrio de ligação com o

mesmo. O polimorfismo 3142 tem sido estudado e parece ser um fator importante

para a regulação da expressão do HLA-G (VEIT, 2009). Se este polimorfismo tem ou

não implicação na etiopatogenia da endometriose, não se sabe.

32

Diante da complexidade etiológica da endometriose, da inexistência de outros

estudos com o polimorfismo 14pb ins/del no gene HLA-G em mulheres acometidas,

pode se inferir que outros fatores devem estar influenciando sua fisiopatologia.

33

VII.CONCLUSÕES

34

VII. CONCLUSÕES

O polimorfismo 14pb ins/del no gene HLA-G não apresenta associação com a

endometriose em mulheres de Mato Grosso - Brasil.

Nas mulheres com endometriose, as frequências genotípicas e alélicas não

estão associadas com o estadiamento e/ou gravidade da doença, com infertilidade e

com abortamento.

35

VIII.ANEXOS

36

Anexo 1

37

38

39

Anexo 2

PROTOCOLO DE ENTREVISTA E COLETA DE AMOSTRA

Entrevistador: ______________________ Data:____/____/______. Grupo: Caso ( ) Controle ( )

1- Nome: ____________________________________________ 2. Registro:___________________

3- Data de Nasc: _______________4- Telefone: _______________5- Naturalidade:

________________

6 –Estado Civil:_______________8 – End. Completo:______________________________________

Bairro:_____________________Cidade:_______________Estado:___CEP:____________________

7 – Naturalidade do Pai:_________________da Mãe:______________________________________

8 – Naturalidade do Avô Paterno:___________________da Avó Paterno:_______________________

9 – Naturalidade do Avô Materno:__________________da Avó Materno: ______________________

10- Peso: _______________11 – Altura: ______________ 12 – Escolaridade: __________________

13 – Etnia:( ) branco ( ) negro ( ) pardo ( ) asiático ( ) índio 14 – Profissão: _________________

15- Idade da menarca:__________ 16 – Gesta:________ 17- Paridade:________ 18-

Abortamento:_______

19 - Ciclos menstruais: ( )regulares ( )irregulares Intervalo de dias: ________ 20 – DUM:__________

21- Idade na época do inicio dos sintomas: _______ anos

22– Data do Diagnóstico da endometriose:________anos. (OBS: se portadora da patologia)

23 - Principal sintoma na época do diagnóstico: ( )Infertilidade ( ) dor a menstruação ( ) Dor

pélvica ( ) Dor a relação sexual ( ) Sintomas urinários, se sim,

quais:_________________________________ ( ) Sangramento menstrual Anormal, como:

__________ ( ) Sintomas gástricos, se sim, quais:_____________________ ( ) Cefaléia ( )

Enxaqueca ( ) Outras_________________________

24- Outras doenças que possa ter tido: ( ) Ca de mama ( ) Ca de ovário ( ) outras

neoplasias_______________ ( ) disfunção tireoidiana ( ) doença autoimune __________________

( ) dislipidemia ( )leiomioma ( ) ovário policístico ( )

E_______S

40

25 - Idade na época do inicio dos sintomas: _______ anos

26- Números de médicos que a assistiram antes do diagnóstico: _______________________________

27- No caso de gravidez, complicações pré-natais: _________________________________________

28 - A senhora faz algum tipo de reposição hormonal?( )sim ( )não Há qto tempo ________________

29- Usou Anticoncepcional?( )não ( ) Sim. Houve melhora dos sintomas? ( ) Sim ( ) Não

30 – Usou AINES? ( ) Não ( ) Sim. Houve melhora dos sintomas? ( ) Sim ( ) Não.

31- Diagnóstico da cirurgia: ( ) Endometriose ( ) Sem doença

32-Grau da endometriose: ( )mínima (I); ( )Leve (II); ( )moderada (III); ( ) Severa(IV)

33 - Resultado da patologia comprova endometriose: ( ) Sim ( ) Não

34- Familiares com endometriose: ( ) Não ( ) Sim. quem?_________________________________

35- História familiar de câncer de ovário, mama e/ou linfoma?( ) Sim ( )Não ( ) Outras

36- Aspecto emocional (como você se sente?

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

37- Fumo: ( )sim ( ) não 38– Álcool: ( ) sim ( ) não ( ) 39 – Atividade Física: ( ) sim ( )

não

40– Alimentação: ___________________________________________________________________

41– Amostra de Sangue: ____________ml

41

IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

42

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