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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA Flávia Regina Santos da Paixão Formulação peletizada de Metarhizium spp.: Produção, termotolerância e potencial no controle de Rhipicephalus microplus Goiânia 2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
Flávia Regina Santos da Paixão
Formulação peletizada de Metarhizium spp.: Produção, termotolerância e potencial no controle de Rhipicephalus
microplus
Goiânia 2016
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Flávia Regina Santos da Paixão
Formulação peletizada de Metarhizium spp.: Produção, termotolerância e potencial no controle de Rhipicephalus
microplus
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública.
Orientador: Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes Co-orientador: Dr. Ricardo N. Marreto
Goiânia 2016
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Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno (a): Flávia Regina Santos da Paixão
Orientador (a): Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes
Co-orientador (a): Dr. Ricardo N. Marreto
Membros:
1. Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes
2. Dr. Lígia Miranda Ferreira Borges
3. Dr. Gabriel Moura Mascarin
Data:08/04/2016
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AGRADECIMENTOS
Agradeço ao professor Doutor Éverton Fernandes, pela oportunidade
concedida e a orientação no Laboratório de Patologia de Invertebrados da UFG.
Ao professor Doutor Ricardo Marreto pela co-orientação pela oportunidade
concedida no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da
UFG.
Ao pesquisador Gabriel Mascarin pelas profundas contribuições e apoio
estatístico.
Ao professor Christian Luz, agradeço pela oportunidade concedida no
Laboratório de Patologia de Invertebrados.
Agradeço a MSc. Alaine Catão, mestranda Tainá Rodrigues, graduanda
Bruna Oliveira e a MSc. Elen Muniz pela ajuda e dedicação para a concretização
deste trabalho. Aos Mestres Cíntia Bernardo, Lucas Barreto, Ronaldo Pereira Junior
e mestrando Marcos Filgueiras, e a toda equipe do Laboratório de Patologia de
Invertebrados pelo apoio.
Agradeço também pelo apoio financeiro do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq. pela concessão de bolsa de
estudos (mestrado). E a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior, CAPES-MERCOSUL pela concessão de bolsa de estudos (mestrado-
sanduíche).
Aos meus pais Joacir Paixão e Marlete Paixão um profundo agradecimento
por sempre incentivar a conquistar novos objetivos apesar dos obstáculos. Agradeço
a minha irmã Késia Paixão pela paciência, dedicação e apoio. Também agradeço a
todos meus familiares e amigos.
vi
SUMÁRIO
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS..........................................................................vii
SÍMBOLOS, SIGLAS ABREVIATURAS .................................................................. x
RESUMO.....................................................................................................................xi
ABSTRACT .............................................................................................................. xii
1 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 1 1.1. Controle microbiano .............................................................................................. 1 1.2. Carrapatos ixodídeos .............................................................................................. 3 1.3. Interferência de fatores abióticos no controle microbiano ..................................... 5
1.4.Formulação de propágulos fúngicos ....................................................................... 6 2 JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 12 3 OBJETIVOS ............................................................................................................ 13 4 MÉTODOS .............................................................................................................. 14
4.1 Coleta e origem dos carrapatos ............................................................................. 14 4.2 Isolados fúngicos estudados e cultivo para obtenção de conídios ........................ 14 4.3 Produção de péletes .............................................................................................. 15
4.4 Produção de conídios em péletes de celulose submetidos à condição ótima (27 ±
1 °C) ou estressante (32 ± 1 °C) de temperatura .......................................................19
4.5 Eficácia de péletes de Metarhizium spp. para controle de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus microplus ............................................................................................ 21
4.6 Eficácia de péletes de IP 119 em diferentes doses para controle de fêmeas
ingurgitadas de Rhipicephalus microplus em condição ótima de temperatura .......... 23 4.7 Eficácia de péletes de CG 47 ou IP 119 para controle de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus microplus em condição estressante de temperatura. .......................... 23 4.8 Produção de péletes com vermiculita ................................................................... 24
4.9 Produção de conídios em péletes de celulose ou vermiculita com o isolado IP
119, submetidos a condição ótima (27 ± 1 °C) ou estressante (32 ± 1 °C) de
temperatura. ............................................................................................................... 24 4.10 Análises estatísticas ............................................................................................ 25
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 26 6 DISCUSSÃO ........................................................................................................... 33 7 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 38
8 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 39 ANEXOS .................................................................................................................... 47
vii
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
Tabela 1: Descrição dos isolados de Metarhizium estudados.
Tabela 2: Composição do meio basal utilizado no preparo do meio de cultura
destinado à produção de microescleródios.
Tabela 3: Composição do Latossolo vermelho estudado.
Figura 1: Microescleródios de Metarhizium anisopliae s.l. (CG 47, IP 46, IP 119,
ARSEF 1883) e Metarhizium robertsii (CG632, ARSEF 1883) quantificados
em microscópio óptico em aumento de 100×. Escala igual 50 µm.
Figura 2: Diagrama esquemático do processo de obtenção dos péletes por extrusão-
esferonização. Fonte de MARTINS (2015).
Figura 3: Processo de obtenção dos péletes: A) Meio líquido com microscleródios;
B) Biomassa fúngica com terra diatomácea sendo filtrada; C)
Homogeneização da massa fúngica com celulose microcristalina; D) e E)
Processo de extrusão; F) Esferonizador; G), H) e I) Péletes de
microescleródios de Metarhizium.
Figura 4: A) e B) Produção de conídios a partir de péletes à base de microescleródio
de M. anisopliae s.s ARSEF 1883 ou IP 119 após 15 dias a 27 ± 1 °C; C)
Suspensão para obtenção de conídios exporulados a partir dos péletes; D)
Inóculo da suspensão com concentração de 1 × 106 conídios mL
-1 em meio
BDAL para avaliação da viabilidade de conídios
Figura 5: Processo de triagem para avaliar a eficácia de péletes de Metarhizium spp.
à base de microescleródios sobre fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
microplus: A) Placas com latossolo vermelho estéril e adição de água
destilada estéril; B) Comparação de placa com latossolo vermelho
umidificado (à esquerda) e seco (à direita); C) Placa com latossolo úmido e 7
mg de péletes; D) Péletes com produção de conídios após15 dias de
incubação a 27 ± 1 °C ; E) Placas preparadas para o bioensaio; F) Fémea
ingurgitada de R. microplus sobre péletes (seta amarela).
viii
Figura 6: A) Fêmea de R. microplus em oviposição; B) Ovos de R. microplus em
tubos de vidro vedados com algodão hidrofílico; C) Larvas de R. microplus
eclodidas dentro do tubo; D) Larvas transferidas para placa de Petri contendo
álcool etílico 96° para quantificação com auxilio de seringa.
Figura 7: Biomassa seca (mg/mL) de vários isolados de Metarhizium spp.
produzidos em meio líquido (MASCARIN et al., 2014). A biomassa (1 mL )
foi seca sobre papel filtro a 32 °C por 2 dias (F= 2.221; df = 5, 17; P=
0.09963). Barras em vermelho representam “médias±desvio-padrão” e
pontos representam valores observados nas repetições independentes.
Figura 8: Produção de ME por diferentes isolados de Metarhizium spp. em meio
líquido (MASCARIN et al., 2014) , com concentração de carbono de 16 g l-1
e relação C:N de 30:1, cultivados em agitador orbital a 250 rpm a 27 ± 1 ºC
por 4 dias ( F= 1.467; df = 5, 29; P = 0.231). Barras em vermelho
representam “médias±desvio-padrão” e pontos representam valores
observados nas repetições independentes.
Figura 9: Produção de conídios a partir de péletes de Metarhizium spp. em meio
agar-água 2% durante 15 dias a 27 ou 32 ± 1°C, em escotofase. Letras
minusculas comparação das médias entre temperatura dentro de cada isolado
fúngico pelo teste de t-Student a P < 0,05.. Letras maiúsculas comparação das
médias entre isolados dentro de cada temperatura 27 ±1 ºC (F = 2,27; gl = 5,
14; P = 0,104) e 32 ±1 ºC (F = 7,01; gl = 5, 14; P = 0,0022).
Figura 10: Triagem da eficácia de péletes de Metarhizium spp. à base de
microescleródios contra fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus,
avaliando seu efeito sobre o período de oviposição das fêmeas, e sobre o
número de larvas eclodidas. Barras de médias e erro-padrão de cada
tratamento (10 fêmeas por grupo).
Figura 11: Triagem da eficácia de concentrações crescentes de péletes à base de
microescleródios de Metarhizium anisopliae s.s IP 119 contra fêmeas
ingurgitadas de R. microplus, avaliando seu efeito sobre o período de
ix
oviposição das fêmease sobre o número de larvas eclodidas. Barras de médias
e erro-padrão de cada tratamento (7 fêmeas por grupo)
Figura 12: Efeito das temperaturas 27 ± 1°C e 32 ± 1°C na eficácia de péletes de
ME de M. anisopliae s.s IP 119 contra fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus
microplus, avaliando o tempo (dias) necessário para observação da
conidiogênese (F = 27.199; df = 1, 87; P = 0.001). Barras de médias e desvio-
padrão. (*) Redução dos dias necessários para conidiogênese do isolado IP
119 a 32 ± 1°C.
Figura 13: Eficácia de péletes de ME de M. anisopliae IP 119 contra fêmeas
ingurgitadas de Rhipicephalus microplus, com base no número de larvas
eclodidas (X2= 43,573; df= 2; P= 0.001). Barras em vermelho representam
“médias±desvio-padrão” e pontos representam eclosão de larvas.
Figura 14: Produção de conídios por grama de péletes à base de microescleródios de
M. anisopliae s.s IP119 formulados com diferentes inertes, vermiculita ou
celulose microcristalina e aplicados sobre meio água-ágar 2% e incubados
sob duas temperaturas 27 ± 1°C ou 32 ± 1°C, em escotofase por 10 dias e por
15 dias.
Anexo: Laudo de análise do solo
x
SÍMBOLOS, SIGLAS ABREVIATURAS
ARSEF- Agricultural Research Service Collection of Entomopathogenic Fungal
Cultures
BDAL- Meio batata dextrose ágar, acrescido de extrato de levedura
CG - Coleção de fungos do laboratório de micologia de invertebrados da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
CM - Celulose microcristalina
EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa e Agropecuária
IP - Coleção de fungos entomopatogênicos do Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
ME – microescleródio (s)
xi
RESUMO
Fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus procuram áreas sombreadas e
úmidas no solo para realizar oviposição. Estes locais apresentam um microclima
favorável para viabilizar o controle deste artrópode com fungos entomopatogênicos.
O objetivo deste estudo foi produzir péletes à base de microescleródios (ME) de
Metarhizium spp. (CG 47, CG 632, IP 46, IP 119, ARSEF 1883 e ARSEF 2575) e
avaliar sua virulência sobre fêmeas ingurgitadas de R. microplus em condições de
laboratório. Os péletes foram obtidos a partir de microescleródios produzidos em
meio líquido específico e processados para peletização. A produção de conídios e a
viabilidade de cada formulado de Metarhizium spp. foram observadas distribuindo-se
0, 03g de péletes em meio ágar-água 2%, e incubando-os a 27 ºC ou 32 ºC por 15
dias, resultados mostram que a produção de conídios pelo péletes dos isolados foi
similar para a temperatura de 27 ºC, sendo a viabilidade dos conídios esporulados
superior a 90% em e 32 ºC. Dois bioensaios para triagem da virulência dos isolados
contra R. microplus foram conduzidos: o primeiro com 0,007 g de péletes de cada
um dos isolados de Metarhizium spp. estudados; e o segundo com quantidades
diferentes de péletes (0.002 a0,006 g) do isolado IP 119. Péletes foram distribuídos
sobre a superfície de 5 g de latossolo vermelho estéril, em Placas de Petri, umedecido
com 2 mL de água destilada estéril. Foram preparadas dez réplicas para cada isolado
fúngico. As placas foram incubadas por 15 dias a 27°C e UR> 90% para induzir a
produção de conídios a partir dos grânulos. Placas do grupo controle não foram
acrescidas de péletes. Após este período, foi adicionada uma fêmea em cada placa e
avaliou-se diretamente o início da conidiogênese sobre os carrapatos por 15 dias, e
após este período a massa de ovos foi retirada das placas e acondicionada
individualmente em tubos de vidro para posterior quantificação das larvas eclodidas.
Em ambos os bioensaios, os tratamentos fungicos reduziram o período de oviposição
das fêmeas, assim comoo número de larvas eclodidas. Resultado semelhante
observado paradiferentes concentrações de péletes do isolado IP 119. Bioensaio
similar à metodologia descrita foi conduzido somente com IP 119 e CG 47 em duas
temperatura:s 27 ºC ou 32 ºC. Os resultados mostraram que a 27 ºC péletes
formulados com ME de CG 47 iniciaram a conidiogênese em fêmeas de R. microplus
em tempo médio de 5 dias, e IP 119 em 9 dias. Já os ensaios conduzidos a 32 ºC
mostraram que a conidiogênese sobre as fêmeas de R. microplus iniciaram entre o 5°
e 6° dia. Para ambos isolados o número médio de larvas eclodidas reduziram.(X2=
43.53; df = 2; P <0.001). Péletes de ME com inerte vermiculita apresentaram maior
produção de conídios do que o formulado contendo celulose (P = 0,01). Os
resultados do presente estudo indicam que a formulação peletizada de ME de
Metarhizium spp. foi eficaz no controle de R. microplus em condições de laboratório
por reduzir o número de progênies. Esta formulação merece atenção para
desenvolver potencial carrapaticida biológico, visto que as condições de temperatura
e umidade requeridas para produção de conídios infectivos são similares às
requeridas por este carrapato para produção de ovos e eclosão das larvas no
ambiente.
xii
ABSTRACT
Rhipicephalus microplus engorged females lay their eggs in shaded and humid areas
on the soil; these areas seems favorable for entomopathogenic fungi development,
where they could be applied for tick control. This study produced pellets based on
microesclerotia (ME) of Metarhizium spp. (CG 47, CG 632, IP 46, IP 119, ARSEF
1883 and ARSEF 2575) and assessed their virulence toward R. microplus engorged
females under laboratory conditions. Microsclerotia produced in specific liquid
medium were processed for pelletization. Conidial production and viability of
conidia from each formulated Metarhizium spp. was evaluated by distributing 0,003
g pellets 2% water-agar medium, and incubating them at 27 °C or 32 °C for 15 days.
The results showed that the conidial production among isolates was similar at 27 °C
or 32 °C, and the viability of the conidia was superior than 90% for conidia
produced. Two bioassays were conducted for screening the virulence of isolates
against R. microplus: the first one tested 0,007 g of pellets of each Metarhizium spp.
isolate; the second one tested different concentrations of IP 119 pellets (0,002, to
0,006 g). Pellets were sprinkled on the surface of 5 g sterile oxisol in Petri dishes,
moistened with 2 ml sterile-distilled water. Ten replicates were prepared for each
fungal isolate. The plates with pellets were incubated for 15 days at 27 °C and RH >
90% to induce conidial production; plates from control groups did not receive pellets.
A female was placed in each plate and monitored daily for 15 days for fungal
conidiogenesis on ticks. At day 15, the egg mass was removed from each plate and
transferred to a glass vial and incubated at 27 ± 1ºC to quantify the number of
hatching larvae hatched. In both bioassays the fungal treatment reduced the
oviposition period of females, as well as the number of hatching larvae. A bioassay
was conducted with IP 47 and IP 119 at two different temperatures: 27 °C or 32 °C.
CG 47 pellets incubated at 27 °C incited conidiogenesis on R. microplus females by
day 5, whereas IP 119 iniciated conidiogenesis by day 9. Trials conducted at 32 C
revealed conidiogenesis on R. microplus females between day 5 and 6 for both fungi.
The number of larvae from females exposed to pellets of CG 47 and IP 119 was
reduced.. Tests with pellets of ME produced with the different inert materials showed
that pellets with vermiculite presented higher conidial production compared with the
pellets prepared with cellulose. Therefore, these results together indicate that the
pelletized formulation of ME of Metarhizium spp. was effective in controlling R.
microplus under laboratory conditions by reducing the number of offspring. This
formulation is a potential mycoacaricide, since the temperature and humidity
conditions required for production of infective conidia are conducive to those
required by this tick to lay eggsand hatching larva in the environment.
1
1 REVISÃO DA LITERATURA
1.1. Controle microbiano
Os primeiros registros e tentativas de controle microbiano começaram a partir do
século XIX, quando Agostino Bassi, considerado o pai da patologia de insetos, descreveu
e comprovou a capacidade de o fungo Beauveria bassiana de causar doença e morte em
Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae), em condições bióticas e abióticas favoráveis
(MESSIAS, 1989). A partir dessas observações, Metchnikoff propôs em 1879, o controle
de larvas de Anisoplia austriaca (Coleoptera: Scarabaeidae) utilizando fungos
entomopatogênicos (FARIA; MAGALHÃES, 2001).
O controle microbiano começou no Brasil há mais de 100 anos, sendo que os
primeiros registros apenas relatam a ocorrência de patógenos atacando insetos depois de
1964 com a epizootia de Metarhizium anisopliae sobre as cigarrinhas da cana de açúcar.
Este método biológico de controle vem aumentando especialmente por ser eficiente em
reduzir população de pragas e por apresentar baixo custo e reduzir o impacto ambiental
(ALVES, 1998). Faria e Wraight (2007) observaram que os fungos entomopatogênicos
mais utilizados no controle microbiano como micoinseticidas são: B. bassiana, M.
anisopliae, Isaria fumosorosea, e B. brongniartii. Em 2012, Shahid et al., relatam a
importância de outros gêneros fúngicos, como, Lecanicillium, Nomuraea
(=Metarhizium), Entomophthora, e Neozygites. Os fungos dos gêneros Metarhizium e
Beauveria são os mais empregados para controlar insetos-praga (ALVES; FARIA, 2010)
Os microrganismos entomopatogênicos que são usados em áreas de cultivo
comercial reduzem o uso de agrotóxicos e mantém a população de pragas abaixo do nível
que causa dano econômico, possibilitando a produção de alimentos mais limpos por
reduzir ou substituir o uso de agroquímicos. Dessa forma, seu uso pode beneficiar a
saúde, além de preservar o ambiente (SCOPEL; ROZA-GOMES, 2011). O mercado de
consumo de produtos biológicos mostra-se atraente, pois trata-se de tecnologia mais
sustentável e com retorno econômico relativamente rápido (FERNANDES et al., 2012).
O controle microbiano é bastante eficaz para o controle de determinadas pragas
agrícolas. Diversos estudos demonstram grandes possibilidades de empregá-lo e mostram
um crescente interesse em diversos países, tanto por parte de instituições públicas quanto
empresas privadas que visam a buscar novas cepas em países tropicais e subtropicais..
Sendo o gênero Metarhizium, pertencente à família Clavicipitaceae, um dos mais usados
2
e estudados dos fungos entomopatogênicos para o controle de artrópodes pragas de
importância agrícola, médica e veterinária em diversas partes do mundo (MENT et al.,
2012; HODGE, 2003).
O desenvolvimento da pesquisa brasileira em programas de controle biológico e a
mudança de mentalidade dos produtores e técnicos demonstra que é viável o uso de
fungos entomopatogênicos no controle de pragas (SCOPEL; ROZA-GOMES, 2011).
Pesquisas com fungos entomopatogênicos reportam que M. anisopliae e B. bassiana são
promissores e eficazes no controle biológico de artrópodes de importância médica, Aedes
aegypti e A. albopictus (SCHOLTE et al., 2007),Triatoma infestans (LUZ et al., 2012), e
veterinária, pois, possui potencial de atuar no controle de carrapatos (FERNANDES et
al., 2012), por serem eficazes no controle de Rhipicephalus microplus (=Boophilus
microplus) (POLAR et al., 2005; FERNANDES et al., 2011; CAMARGO et al., 2012;
MUNIZ, 2015), Amblyomma cajennense (LOPES et al., 2007; D´ALESSANDRO et al.,
2012). entre outros.
A infecção de artrópodes por fungos entomopatogênicos começa pelo contato
destes com o conídio, e é seguido por adesão, germinação, e penetração através da
cutícula do artrópode Na sequência há multiplicação do fungo na hemocele e produção de
toxinas, causando a morte do hospedeiro. Após a morte, no exterior do artrópode ocorre o
aparecimento de micélio, e esporulação, que dissemina conídios pelo ambiente
(LECUONA et al., 1996).
A espécie M. anisopliae tem sido relatada como infectante para mais de 100
espécies de insetos, incluindo as espécies que vivem no solo (JACKSON; JARONSKI,
2009). Há fortes evidências de que alguns grupos genéticos de Metarhizium são
adaptados a certas condições do ambiente e a uma ampla gama de hospedeiros (SMALL;
BIDOCHKA, 2005), isto é essencial para regular a densidade populacional (WANG; ST.
LAGER, 2014).
Fungos entomopatogênicos têm se mostrado bastante promissores para o controle
de carrapatos da família ixodidae (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008), os quais são
susceptíveis à infecção causada por Metarhizium (MENT et al., 2012). M. anisopliae é
comumente estudado para o controle de carrapatos e tem demonstrado ser patogênico
para carrapatos R. microplus em condições de laboratório (POLAR et al., 2005;
FERNANDES et al., 2011; MUNIZ, 2015).
3
1.2. Carrapatos ixodídeos
Carrapatos ixodídeos são caracterizados por não apresentarem segmentação
corporal, por possuírem três pares de pernas as larvas e quatro pares de pernas nas ninfas
e adultos. Além disso, esses artrópodes possuem um par de estigmas respiratórios laterais
ou peritremas posteriores às coxas do quarto par de pernas. O corpo do carrapato é
dividido em gnatossoma e idiossoma (FLECHTMANN, 1985). Os ixodídeos são
popularmente denominados carrapatos duros, por possuírem um rígido escudo quitinoso
que cobre toda a região dorsal do macho. Em larva, ninfa e fêmeas adultas somente 1/3
do corpo é coberto com o escudo quitinoso. Os gêneros da família Ixodidae que ocorrem
no Brasil são Amblyomma, Ixodes, Rhipicephalus, Haemaphysalis e Dermacentor (REY,
2002).
Todos os carrapatos são ectoparasitos obrigatórios de vertebrados e necessitam de
repasto sanguíneo para completar o ciclo evolutivo. São vetores de protozoários,
bactérias, e riquétsias para seus hospedeiros. A transmissão de patógenos se deve a forma
de alimentação do parasito, que durante hematofagia podem infectar-se. Além disso,
podem causar lesões que podem favorecer o ataque de outros artrópodes como moscas
varejeiras (URQUHART et al., 1996).
Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1887)pertence à classe Arachnida,
subclasse Acari, ordem Ixodida e família Ixodidae (REY, 2002). Os primeiros relatos
deste carrapato asseguram que a origem foi na Ásia e veio para o Brasil durante a
segunda metade do século XIX, e que os agentes patogênicos por ele transmitidos foram
transportados para a Austrália, Madagascar, África do Sul, América do Sul e do Norte
(MADDER et al., 2011).
O ciclo de vida de R. microplus compreende em um só hospedeiro, especialmente
o gado bovino. Apresenta-se três estágios: larva, ninfa e adultos . Seu desenvolvimento se
completa em duas fases: fase parasitária, que ocorre sobre bovinos, onde estes
ectoparasitas realizam a alimentação sanguínea; e a fase não parasitária que ocorre no
solo após o carrapato abandonar o hospedeiro e compreende o período de oviposição e
eclosão de larvas (URQUHART et al., 1996; GUIMARÃES et al., 2001).
Fêmeas ingurgitadas de R. microplus, ovipõem no ambiente por um período de
15-20 dias, e no final da postura a fêmea morre. Após o período de 14-146 dias, ocorre a
eclosão de larvas; esta eclosão depende das condições climáticas. Depois da eclosão, as
larvas se fixam no hospedeiro, alimentam-se e mudam para o estágio de ninfa. Os
4
machos são encontrados sob as fêmeas e a cópula acontece no hospedeiro. Depois de
fertilizadas, as fêmeas se ingurgitam até atingir o estádio de teleógena, desprendem-se da
pele do hospedeiro e caem ao solo. (TAYLOR et al., 2010).
Em condições de hiperinfestação, o carrapato do bovino pode parasitar outros
hospedeiros (ovinos, caprinos, ungulados silvestres)(FURLONG et al., 2005). A
transmissão de doenças para bovinos por R. microplus pode ocorrer em todos os estágios
parasitários. R. microplus pode transmitir Babesia bigemina, B. bovis e Borrelia theileri
na América do Sul, Anaplasma marginale na Austrália e Ámerica do Sul, e Coxiella
burnetii também na Austrália (TAYLOR et al., 2010).
O carrapato do bovino apresenta importância médico-veterinária por causar
prejuízos aos animais pela perda de sangue, transmissão de doenças, emagrecimento
devido a anemia dos animais, baixa produção de carne e leite, irritação da pele devido às
picadas dos carrapatos. A perda de sangue diária é muito grande em bovinos
ectoparasitados por centenas de carrapatos que realizam repasto sanguíneo e inoculam
substancias tóxicas que comprometem sua saúde, causando anemia nos animais e perdas
econômicas de produção (URQUHART et al., 1996; FORTES,1997).
O impacto econômico calculado em 2008 para o controle de babesiose e
anaplasmose, foi estimado na Austrália, Quênia, Zimbábue, Tanzânia, África do Sul,
China, India, Indonésia e Filipinas, como sendo, respectivamente, de US$ 16.9 , US$ 5.1,
U$ 5.4, U$ 6.8, U$ 21.6, U$ 19. 4, U$ 57.2, U$ 3.1 e U$ 0.6 bilhões de dólares por ano
(BOCK et al., 2008). No Brasil, as perdas econômicas causadas por carrapatos bovinos R.
microplus alcançam $ 3.4 bilhões de reais, e estima-se que a combinação de parasitos
internos e externos cause uma perda maior, chegando a $ 13.96 bilhões de reais por ano
(GRISI et al., 2014)
O controle de R. microplus é feito quase que exclusivamente por métodos
químicos (banho e pulverização do gado com carrapaticida) e inspeção de animais. No
Brasil, o controle é realizado principalmente na fase parasitária, através do emprego de
diferentes grupos químicos. O uso indiscriminado e a má utilização dos carrapaticidas
vêm acarretando sérios problemas de resistência, além de implicações diretas na poluição
do solo e mananciais hídricos (GUIMARÃES et al., 2001), além do acúmulo de resíduos
em alimentos, o que afeta diretamente a saúde humana e animal (FERNANDES et al.,
2012).
Os métodos tradicionais de controle de carrapatos de bovinos são feitos com o uso
de acaricidas químicos; este controle cria risco à produção animal e ao ambiente. Dessa
5
forma, métodos sustentáveis que causaem menos danos ambientais são necessários, e o
controle biológico de carrapatos utilizando fungos entomopatogênicos é considerado um
método de controle alternativo viável e ecologicamente sustentável ao uso exclusivo de
acaricidas químicos (URQUHART et al., 1996).
Muitos fungos entomopatogênicos estão naturalmente associados à carrapatos e
alguns deles têm demonstrado alta virulência em condições laboratoriais por serem
efetivos e causarem mortalidade (MONTEIRO et al., 1998; BITTENCOURT et al., 1999;
FERNANDES et al., 2004; FERNANDES et al., 2008; REIS et al., 2008; ANGELO et
al., 2012; SUN et al., 2013). M. anisopliae senso lato. e B. bassiana s.l. infectam com
maior facilidade larvas de carrapatos, quando comparadas aos estágios de ninfas e adultos
(FERNANDES; BITTENCOURT, 2008). O controle de ixodídeos baseado no emprego
de fungos entomopatogênicos, requer o desenvolvimento de formulações efetivas, que
contornem fatores abióticos adversos (MENT et al., 2010).
1.3. Interferência de fatores abióticos no controle microbiano
Fatores abióticos são condições climáticas ou não climáticas, tais como a radiação
solar, temperatura, umidade, vento, substrato e pesticidas químicos, que influenciam na
estabilidade, sensibilidade e persistência dos propágulos fúngicos no ambiente. Esses
fatores afetam, de forma independente ou coletiva, a germinação, a infecção e posterior
colonização do fungo no hospedeiro, assim como a sua ocorrência em epizootias ou
enzootias (ALVES; LECUONA, 1998; IBRAHIM et al., 1999).
Um dos principais fatores abióticos que influenciam o crescimento e
desenvolvimento de fungos é a temperatura, por afetar diretamente o processo de
germinação e desenvolvimento do fungo. Outros fatores importantes incluem o nível de
água, pH, nível de CO2 e presença de produtos químicos. A resposta positiva ou negativa
a esses fatores depende da espécie, ou da cepa do fungo (GARRAWAY; EVANS, 1984).
Os fungos entomopatogênicos têm distribuição desde o ártico até os trópicos, estando
presente em florestas, savanas, zonas de costas, desertos e pântanos (WANG; ST.
LAGER, 2014). A maioria dos fungos entomopatogênicos são mesofílicos por
desenvolver-se entre as temperaturas de 10 e 40 ºC, sendo ótimas as temperaturas entre
25 e 35 ºC (COONEY; EMERSON, 1964).
A temperatura não ótima, afeta o metabolismo de fungos entomopatogênicos e
altera os processos de produção de enzimas, toxinas, germinação dos esporos,
6
desenvolvimento do tubo germinativo, penetração, colonização e esporulação. Tanto o
calor quanto o frio, são fatores abióticos importantes que podem limitar a eficácia de
fungos entomopatogênicos em programas de controle, podem também afetar a
estabilidade dos patógenos durante o seu armazenamento e durante suas aplicações,
assim como restringir a ocorrência natural destes patógenos (ALVES; LECUONA, 1998;
FERNANDES et al., 2008).
Os fungos entomopatogênicos respondem aos estímulos térmicos, crescem e se
desenvolvem em função da temperatura (EDELSTEIN et al., 2004) e umidade adequada
(DEVI et al., 2005). Elevadas temperaturas e a elevada umidade relativa quando
associadas são prejudiciais ao desenvolvimento fúngico e podem afetar as células
provocando desnaturação de proteínas e desorganização de membranas (CRISAN, 1973;
SETLOW; SETLOW, 1998).
Fungos entomopatogênicos naturalmente tolerantes a temperaturas extremas têm
vantagens durante o processo de infecção e isso desperta interesse para seu uso em
programas de controle biológico. Muitos estudos têm investigado a termotolerância de
isolados de B. bassiana (DEVI et al., 2005; FERNANDES et al., 2008); Isaria sp.
(CABANILLAS; JONES, 2009); M. acridum, M. robertsii, M. anisopliae s.l., Aspergillus
nidulatus (Rangel et al., 2010). Fernandes et al. (2010) avaliaram isolados de diversas
espécies de Metarhizium e demonstraram que a temperatura tanto alta quanto baixa
reduze a viabilidade de conídios.
A avaliação de fungos entomopatogênicos como agentes de biocontrole, além de
observar a virulência do fungo contra uma determinada praga alvo, deve considerar
também a adequação do fungo às condições ambientais da região destinada à aplicação
do bioproduto, pois não há crescimento fúngico abaixo ou acima da temperatura limiar, e
o crescimento atinge o máximo em temperatura ótima (SMITS et al., 2003). A
compreensão da interação patógeno-hospedeiro, o conhecimento sobre oambiente
ecológico onde vive o hospedeiro são fundamentais para direcionar a utilização de
formulações apropriadas (SHAHID et al., 2012).
1.4. Formulação de propágulos fúngicos
Com o constante interesse em minimizar o uso de agrotóxicos e utilizar fungos
entomopatogênicos para o controle de artrópodes, tem-se aumentado a necessidade de
7
melhorar a estabilidade durante o armazenamento e as formas de aplicação dos produtos
à base de fungos, para que a virulência e a eficácia dos propágulos não sejam afetadas. A
condição de armazenamento e de aplicação do bioproduto devem estar relacionadas a
proteção dos propágulos, à qual pode ser conseguida pelo uso de formulações adequadas
(ALVES, 1998; ALVES ; FARIA, 2010).
As formulações contendo fungos entomopatogênicos devem estabilizar o
propágulo após a sua produção e durante o armazenamento; facilitar a manipulação e
aplicação; proteger o propágulo contra fatores abióticos; aumentar a persistência e
favorecer o contato e a interação com o artrópode alvo; disponibilizar uma forma
econômica e de fácil aplicação do produto; propiciar viabilidade prolongada aos
propágulos (JONES; BURGES, 1998). Neste sentido, o êxito de bioinseticidas e
bioacaricidas depende de formulações apropriadas, da sensibilidade do artrópode
hospedeiro ao microrganismo, e de propriedades fisiológicas do material infectivo após
aplicação (DORTA; ARCAS, 1996). A adaptação fisiológica do fungo entomopatogênico
permite aumentar a eficácia do formulado e ajudar a contornar os efeitos deletérios de
fatores abióticos estressantes (MENT et al., 2010).
As formulações contendo fungos entomopatogênicos disponibilizadas
comercialmente são encontradas em diferentes apresentações: 1) formulação em pó para
ser suspendida em água; 2) pó para contato, aplicação direta; 3) dispersão oleosa; 4) iscas
desenvolvidas para atrair e serem consumidas por pragas-alvo; 5) grânulos dispersíveis
em água. Os grânulos são formas sólidas multiparticuladas que apresentam distribuição
de tamanho relativamente uniforme. São formas consideradas mais elaboradas, devido à
homogeneidade e compactação do propágulo na estrutura (FILHO et al., 2007).
Por sua vez, os péletes também são formas sólidas multiparticuladas que, ao
contrário dos grânulos, apresentam elevada esfericidade e estrutura mais densa (DUKIĆ-
OTT et al., 2009). O emprego desses sistemas tem potencial para melhorar a estabilidade
das células fúngicas, as quais estão inseridas em uma estrutura mais densa e com maior
capacidade protetora frente à fatores abióticos, como a radiação solar. Além disso, os
péletes são estruturas de tamanho mais uniforme quando comparados aos grânulos
convencionais e apresentam ainda uma forma mais homogênea.
A tecnologia de obtenção de péletes é comum na indústria farmacêutica, sendo
sua produção viável industrial e economicamente. A peletização é um processo de
aglomeração que transforma pós finos em formas esféricas de maior dimensão (diâmetro
variável de 0,5 a 2,0 mm) (DUKIĆ-OTT et al., 2009; ABDUL; CHANDEWAR;
8
JAISWAL, 2010). Algumas técnicas utilizadas na peletização são a extrusão e
esferonização, criopeletização, globulação e compressão. Dentre todas, a mais
frequentemente empregada é a extrusão-esferonização, que foi desenvolvida em meados
da década de 1960 com o propósito de desenvolvimento de formas farmacêuticas para
liberação modificada de fármacos (GANDHI; LAL KAUL; PANCHAGNULA, 1999;
SUPRIYA; RAJNI; RANA, 2012).
A extrusão-esferonização consiste num processo com múltiplas etapas: (1)
preparo de mistura seca, na qual os pós são misturados até obtenção de dispersão
homogênea; (2) umedecimento da mistura de pós (malaxagem), que é realizada sob
constante agitação, até formação de massa suficientemente plástica, de baixa aderência e
com características lubrificantes (HARRISON; NEWTON; ROWE, 1985; SOUZA et al.,
2002; GAO et al., 2013); (3) extrusão, a massa úmida é impelida através de orifícios para
ganhar forma e diâmetro uniformes. Essa etapa ocorre em extrusor (parafuso e rolos são
os mais comuns) (VERVAET; BAERT; REMON, 1995); (4) esferonização, etapa na qual
o extrusado é submetido à alta rotação sobre prato de fricção rotatório, até que seja
quebrado e talhado em numa forma cujo comprimento é igual ao seu diâmetro (DUKIĆ-
OTT et al., 2009); e (5) secagem, para atingir a umidade final desejada pode-se secar os
péletes obtidos à temperatura ambiente ou utilizar equipamentos com emprego de
temperatura elevada, como estufas de ar circulante ou leito fluidizado (SUPRIYA;
RAJNI; RANA, 2012).
A celulose microcristalina é considerada o adjuvante padrão-ouro no preparo de
péletes altamente esféricos, devido às suas propriedades reológicas (coesividade e
plasticidade) ideais para a técnica de extrusão-esferonização. No entanto, alguns autores
já relataram a utilização de outros excipientes na produção de péletes pela técnica de
extrusão- esferonização (DUKIC et al., 2007).
Pesquisas de desenvolvimento de formulações fúngicas superiores às
comercialmente disponíveis são necessárias e importantes para aumentar a
disponibilidade de micoacaricidas comerciais e beneficiar a agricultura, reduzindo o risco
de resistência e o impacto ao agroecossistema relacionados à aplicação de agentes
químicos (SHAHID et al., 2012). O desenvolvimento das formulações depende das
propriedades fisiológicas e físicas do patógeno, assim como da localização e hábitat dos
artrópodes alvos (DAOUST et al., 1983).
Os micoinseticidas são produtos a base de fungos, importantes na agricultura
moderna e sustentável (ALVES et al., 2001). Além dos conídios, outros propágulos
9
fúngicos têm sido investigados para produção de biopesticidas à base de fungos
entomopatogênicos, como, por exemplo, os microescleródios (ME), os quais constituem
um aglomerado quitinizado de hifas, formando uma estrutura compacta e de resistência
do microrganismo (JACKSON; JARONSKI, 2009).
A formação de propágulos fúngicos resistentes a condições ambientais
desfavoráveis e na ausência de hospedeiro foi observada em Macrophomina phaseolina,
um fungo fitopatogênico que persiste no ambiente na forma de microescleródio (VIANA;
SOUZA, 2002). Jackson e Jaronski (2009) produziram microescleródio de três isolados
de M. anisopliae s.l. para serem usados no controle de Tetanops myopaeformis (Diptera:
Ulidiidae), e mostraram excelente eficiência no controle deste díptero. Neste estudo, os
autores mostraram pela primeira vez que isolados de M. anisopliae produzem não
somente blastosporos, micélio e clamidosporos, mas também microescleródios.
A descoberta de que alguns fungos entomopatogênicos produzem
microescleródios aumentou o número de pesquisas e o interesse comercial para o uso
destes propágulos no controle de insetos que vivem no solo ou que desenvolvem algum
estágio de seu ciclo evolutivo no solo. Foi observada a produção de microescleródio do
fungo entomopatogênico Nomuraea rileyi (Ascomicota: Hypocreales) quando cultivado
em meio líquido apropriado, ea virulência foi determinada usando larvas de Etilla
zinckenella (Lepdoptera: Pyralidae) (SONG et al., 2014).
Microescleródio obtido por meio líquido foi passível de ser formulados para
facilitar sua aplicação, armazenamento e otimização do uso para controle de artrópodes
alvos. A produção granular de ME de Metarhizium spp. foi primeiramente relatada por
Jackson e Jaronski (2009); com o meio de cultivo contendo ME, adicionava-se terra
diatomácea para dar consistência a biomassa e para obter os grânulos. Este mesmo
método utilizando terra diatomácea para obteção de grânulos foi relatado por Mascarin et
al. (2014) quando investigaram a produção de ME de isolados de Metarhizium spp.
originados do Brasil. Behle et al. (2013) e Behle e Jackson (2014) também produziram
grânulos de ME utilizando argila como matéria.
A terra diatomácea e a argila têm a função de dar forma e consistência ao
bioproduto, por incorporar ME de maneira uniforme e auxiliar durante a reidratação do
grânulo para a produção de conídios. Os formulados com terra diatomácea ou argila em
seu estado final de bioproduto não apresentam esferonicidade uniforme devido ao método
de obtenção dos grânulos. No entanto, Goble et al. (2016) utilizaram argila caulim e um
10
método mais elaborado com o auxílio de um extrusor para a obtenção do formulado de
ME e também obtiveram grânulos.
A atividade inseticida dos microescleródios de M. brunneum foi observada para
larvas de Alphitobius diaperinus (Coleoptera: Tenebrionidae) (BEHLE; JACKSON,
2014) e também para larvas de Popillia japonica (Coleoptera: Scarabaeidae) (BEHLE et
al., 2015). Com o grande interesse em entender e utilizar os microescleródios como
micoinseticidas, Song et al. (2015) investigaram os mecanismos moleculares de N. rileyi
para entender a formação e diferenciação morfogenética do fungo em microescleródios, e
os resultados mostraram que dois genes Sho1p e Sln1p estão envolvidos e têm importante
papel na regulação e formação destas estruturas, além disso, estes genes são expressos
durante a esporulação e virulência de N. rileyi.
O desenvolvimento de péletes contendo microescleródios de Metarhizium abre
novas possibilidades no controle biológico de artrópodes, pragas agrícolas ou urbanas,
que dependem do solo para completar o ciclo evolutivo. O solo é um ambiente favorável
para esta formulação, porque geralmente oferece condições adequadas de temperatura e
umidade devido ao microclima proveniente do tipo de vegetação, forragem e evaporação
do solo (MASCARIN et al., 2014). Os microescleródios quando re-hidratados produzem
conídios capazes de infectar insetos suscetíveis (BEHLE; JACKSON, 2014), e a
formulação granular pode contribuir para que as células fúngicas persistam no ambiente
por várias semanas (BEHLE et al.,2013).
Estudos têm demonstrado que Metarhizim spp. produzem microescleródios
quando formulados em meio líquido rico em carbono; os propágulos mostraram boa
estabilidade durante o armazenamento e potencial para o controle de insetos que vivem
no solo (MASCARIN et al., 2014). A eficácia da formulação granular de microescleródio
de M. brunneum (Hypocreales: Clavicipitaceae) para o controle de ninfas e adultos de
Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae), carrapato vetor da doença de Lyme para humanos
nos Estados Unidos, foi confirmada a partir da determinação da susceptibilidade dos
indivíduos expostos aos conídios esporulados a partir do formulado granular; foi
observada mortalidade tanto de ninfas quanto de adultos (BEHLE et al.,2013).
O trabalho de Behle et al. (2013) é a única investigação disponível sobre o uso de
microescleródio no biocontrole de carrapatos. Compreender e aprofundar os estudos
nesta abordagem de biocontrole podem contribuir para o sucesso do controle biológico de
carrapatos no solo durante a fase não parasitária, já que as condições exigidas para a
esporulação de conídios a partir dos microescleródios no ambiente são condições
11
similares às que as fêmeas ingurgitadas de R. microplus procuram para realizar
oviposição. No Brasil, péletes de Metarhizium contendo microescleródios não estão
disponíveis comercialmente, o que sugere a necessidade de novas investigações
(MASCARIN et al., 2014).
O presente estudo investigou a união de duas estratégias originais para o controle
do carrapato bovino: o uso de microescleródios e o desenvolvimento de formulações do
fungo em péletes, ambas com potencial para melhorar a estabilidade e infectividade dos
fungos entomopatogênicos.
12
2 JUSTIFICATIVA
Fungos entomopatogênicos estão naturalmente associados a carrapatos e alguns
deles têm demonstrado alta virulência em condições laboratoriais, sendo Metarhizium
anisopliae s.l. e Beauveria bassiana s.l. os mais investigados (FERNANDES;
BITTENCOURT, 2008). No entanto, fatores abióticos, especialmente a temperatura alta,
podem exercer forte influência sobre a biologia de fungos entomopatogênicos e sobre a
fisiologia de muitas espécies de carrapato em suas fases parasitárias ou não
parasitárias(FREITAS et al. 2004). Apesar de estudos evidenciarem o efeito acaricida de
propágulos fúngicos, como conídios e blastosporos, sobre carrapatos, pouco se sabe sobre
o efeito de microescleródios (ME) sobre carrapatos ixodídeos (BEHLE et al., 2013) e seu
potencial como bioproduto para controle deste artrópode.
Considerando que as fêmeas ingurgitadas de ixodídeos procuram locais úmidos
no solo para realizar postura, torna-se muito atrativo explorar a estratégia do uso de
péletes de ME no solo, já que conídios são produzidos a partir dos péletes na presença de
elevada umidade, podendo estes então infectar o carrapato. Os ME têm-se mostrado mais
eficazes do que produtos à base de conídios, quando aplicados diretamente no solo, para
o controle de Ixodes scapularis (BEHLE el al.,2013).
Controlar populações de carrapatos durante a fase não parasitária do ciclo
biológico é extremamente importante para reduzir a população deste ectoparasito e
consequentemente os danos causados pelo seu parasitismo, em especial a transmissão de
agentes ptogênicos. Até o presente estudo, não há opções de biocontrole com fungos
entomopatogênicos para tratar o ambiente contra carrapato. É relevante salientar que o
uso de péletes para veiculação de fungos entomopatogênicos é original e apresenta
potencial para aumentar a persistência do fungo no solo, além de facilitar sua aplicação e
possivelmente melhorar a eficácia do produto.
13
3 OBJETIVOS
Objetivo geral:
Desenvolver péletes contendo microescleródios de Metarhizium spp. para o
controle microbiano de carrapatos durante sua fase de vida não parasitária.
Objetivos específicos:
Formular péletes contendo Metarhizium spp. a partir de microescleródios
(ME) produzidos por cultivo submerso em meio líquido;
Quantificar os conídios produzidos a partir dos péletes contendo ME de
Metarhizium spp. incubados em condição ótima ou estressante de temperatura,
e avaliar sua viabilidade;
Avaliar a patogenicidade de conídios produzidos a partir dos péletes contendo
ME de Metarhizium spp. em fêmeas ingurgitadas de R.microplus em condição
ótima de temperatura e umidade, e selecionar isolados com maior eficácia;
Avaliar a eficácia de conídios produzidos após a aplicação de quantidades
distintas de péletes contendo ME do melhor isolado de Metarhizium spp. em
fêmeas ingurgitadas de R. microplus, expostas a condições ótimas de
temperatura e umidade.
Avaliar a bioeficácia de conídios produzidos a partir dos péletes contendo ME
de Metarhizium spp. para fêmeas ingurgitadas de R. microplus quando
submetidos à condição estressante de temperatura;
Formular péletes contendo inertes, celulose ou vermiculita e misturar com ME
de Metarhizium spp. produzidos por cultivo em meio líquido;
Quantificar os conídios produzidos a partir dos péletes compostos de celulose
ou vermiculita com ME de Metarhizium spp. incubados em condição ótima ou
estressante de temperatura, e avaliar sua viabilidade.
14
4 MÉTODOS
4.1 Coleta e origem dos carrapatos.
Fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus foram coletadas em bovinos
naturalmente infestados e mantidos na Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade
Federal de Goiás/ UFG. Os carrapatos foram coletados de animais sem contato prévio
com carrapaticidas por um período mínimo de 30 dias. Após coleta, as fêmeas
ingurgitadas eram levadas ao laboratório, lavadas em água corrente e em seguida imersas
em solução de hipoclorito de sódio a 1% durante cinco minutos. Posteriormente, eram
enxaguadas em água destilada estéril e secas em papel toalha estéril; este procedimento
proporcionou a antissepsia da cutícula. As fêmeas foram selecionadas e identificadas
segundo BARROS-BATTESTI, ARZUA, BECHARA (2006), que estabeleceram uma
chave de identificação de ixodídeos representantes da fauna brasileira. As fêmeas
identificadas de R. microplus foram utilizadas em bioensaios, conforme metodologia
descrita abaixo.
4.2 Isolados fúngicos estudados e cultivo para obtenção de conídios.
Foram estudados seis isolados de Metarhizium spp. (Tabela 1), sendo dois
provenientes da Coleção de Fungos Entomopatogênicos do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP/UFG) (ROCHA et
al., 2011), dois da Coleção de Fungos do Laboratório de Micologia de Invertebrados, da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN, Brasília, Brasil) e dois
isolados proveniente da ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures, Ithaca,
New York, Estados Unidos da América.
Os fungos foram cultivados em placas de Petri (95 × 15 mm) com meio de cultura
Batata Dextrose Ágar (DifcoTM
, Laboratories, Sparks, França) acrescido de extrato de
levedura 1g L-1
(BactoTM
Yeast Extract, Sparks, MD, USA) (BDAL) durante 15 dias a
27±1 °C em escotofase.
15
Tabela 1: Descrição dos isolados de Metarhizium estudados.
Isolados* Espécies Origem Substrato/
hospedeiro
Ano
CG 47 Metarhizium
anisopliae s.s
Distrito Federal, Brasil Galactica sp.
[Lepidoptera:
Galacticidae]
1980
CG 632 Metarhizium
robertsii
Distrito Federal, Brasil Acromyrmex
sp.
[Hymenoptera:
Formicidae]
1997
IP 46 M. anisopliae s.l. Parque Nacional da
Emas, GO, Brasil
Solo 2001
IP 119 M. anisopliae s.s. Norte de Goiás, Brasil Solo 2001
ARSEF
1883
M.anisopliae s.s Goiânia, GO, Brasil Tibraca
limbativentris
[Hemiptera;
1985
ARSEF
2575
M. robertsii Carolina do Sul, EUA, Curculio
caryae
[Coleoptera:
Curculionidae]
1988
(*) IP: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública; CG: Coleção de Fungos do Laboratório de
Micologia de Invertebrados da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia; ARSEF: ARS Collection of
Entomopathogenic Fungal Cultures.
4.3 Produção de péletes
Conídios foram coletados da superfície da cultura com auxílio de uma espátula e
suspensos em 10 mL de solução de polisorbato (Tween 80®) a 0,05% (v/v) (Sigma
Chemical Co., St.Louis, EUA). As suspensões foram agitadas com pérolas de vidro em
vórtex e então quantificadas em hemacitômetro e, em seguida, ajustadas à concentração
final de 5,0 × 107
conídios mL-1
para inoculação em meio líquido com relação carbono
nitrogênio (C:N) de 30:1. Três frascos foram preparados para cada isolado de
Metarhizium spp., cada frasco (250 ml) foi preenchido com 1,5 g de extrato de levedura;
53,5 mL de meio basal (Tabela 2); 36,5 mL de solução de glicose (7,3% m/v)] e 10 mL
16
da suspensão conidial, totalizando 100 mL/ frasco (MASCARIN et al., 2014). Os fungos
foram cultivados em agitador orbital (TE-420, Tecnal®, Brazil) a 250 rpm e 27 ± 1 ºC por
4 dias. Os frascos foram examinados diariamente e agitados manualmente para minimizar
o crescimento micelial na parede do frasco. No quarto dia após a inoculação, as amostras
foram manejadas para medir a concentração de microescleródios (ME), o acúmulo da
biomassa e a dosagem volumétrica da biomassa para iniciar a formulação dos péletes.
Tabela 2: Composição do meio basal utilizado no preparo do meio de cultura destinado à
produção de microescleródios.
Fórmula
molecular
Componentes
P.A.
Quantidade
(g/l)
C6H12O6 D (+) Glicose Anidra
(Dextrose) P.A. ACS
200
KH2PO4 Fosfato de potássio
monobásico P.A.
4
CaCl2.2H2O Cloreto de cálcio 0,8
MgSO4.7H2O Sulfato de magnésio P.A 0,6
FeSO4.7H2O Sulfato ferroso P.A. 0,1
MnSO4.H2O Sulfato de manganês II
P.A.
0,016
ZnSO4.7H2O Sulfato de Zinco P.A. 0,014
Um mililitro foi retirado da cultura para determinar a concentração de ME, e foi
diluída em 9 mL de solução de polisorbato 80 (Tween 80®, 0,05%, v/v). Em seguida,
uma alíquota de 100 µL desta suspensão de ME foi colocada sobre uma lâmina (25,4 ×
76,2 mm) e coberta com lamínula de vidro (24 × 50 mm). Os ME foram quantificados em
microscópio óptico (DM2500, Leica® Mycrosystems Ltd., Switzerland) em aumento de
100× (Figura 1). As suspensões de ME foram constantemente agitadas em vórtex para
assegurar homogeneidade das amostras. Apenas os ME maiores que 50 µm de diâmetro,
compactos e com coloração escura foram contabilizados como ME (JACKSON;
JARONSKI, 2009). As medições foram feitas com o software ToupView 3.7 For Digital
Camera FMA037 7,5 mm (Fixed Microscope Adapter), acoplado ao microscópico óptico.
17
Figura 1: Microescleródios de Metarhizium anisopliae s.l. (CG 47, IP 46, IP 119,
ARSEF 1883) e Metarhizium robertsii (CG632, ARSEF 1883) quantificados em
microscópio óptico em aumento de 100×. Escala igual 50 µm.
Para avaliação do acúmulo de biomassa, 1 mL da cultura líquida foi coletado dos
frascos de cultura, e a biomassa foi separada do meio por filtração em disco de papel
filtro de 5 cm com poro de 14 µm (Qualy®
, JProlab, São José dos Pinhais, PR, Brasil) de
7 cm de diâmetro, com peso previamente determinado. Em seguida, a biomassa e o disco
18
de papel filtro foram secos a 32 °C por 2 dias até obter o peso da biomassa constante e,
então, o peso foi registrado (JACKSON; JARONSKI, 2009).
O meio líquido com ME foi transferido para proveta de vidro 500 mL, e para
cada 100 mL do meio foram adicionados 5g de terra diatomácea (DE, Keepdry, Irrigação
Dias Cruz Ltda- Me, São Paulo, SP, Brasil) para formar uma biomassa homogênea. Esta
bioamassa foi filtrada a vácuo (Bomba de vácuo TE-05, Tecnal®, Brazil) em papel filtro
com espessura de 205 µm com poro de 14 µm (Qualy®
, JProlab, São José dos Pinhais,
PR, Brasil), e mantida em dessecador com sílica gel por 10 dias (Sigma-Aldrich, RJ,
Brasil) sob refrigeração (5 ºC), a sílica era trocada uma vez ao dia, até a umidade do
dessecador atingir 20%. A umidade na câmara foi monitorada com auxílio de um Data
Logger Hobbo® modelo U14-001 (Onset Computer Corporation).
O preparo dos péletes foi executado no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica
da Faculdade de Farmácia da UFG. Trinta gramas da biomassa (contendo terra
diatomácea e biomassa fúngica) foram acrescidos de 20 g de celulose microcristalina
(Via Farma Importadadora Ltda., Ipiranga - SP, Brasil). Quantidade suficiente de água
destilada foi adicionada à mistura para se obter maior homogeneidade. A massa foi então
extrusada em equipamento contendo malha de aço inoxidável com abertura de 0,5 mm
(Extrusor 20, Caleva Process Solution Ltd., Inglaterra) e os extrusados foram
esferonizados a 1500 rpm por 3 minutos em esferonizador Caleva (Multi Bowl
Spheronizer, Caleva Process Solutions Ltd., Inglaterra) (Figura 2) e (Figura 3). Os péletes
foram acondicionados em dessecador até a umidade no interior do recipiente atingir 5%.
Em seguida foi estocado a -20ºC, em tubos de plástico tipo Falcon de 15 mL.
Figura 2: Diagrama esquemático do processo de obtenção dos péletes por extrusão-
esferonização. Fonte de MARTINS (2015).
19
Figura 3: Processo de obtenção dos péletes: A) Meio líquido com microscleródios; B)
Biomassa fúngica com terra diatomácea sendo filtrada; C) Homogeneização da massa
fúngica com celulose microcristalina; D) e E) Processo de extrusão; F) Esferonizador;
G), H) e I) Péletes de microescleródios de Metarhizium.
4.4 Produção de conídios em péletes de celulose submetidos à condição ótima
(27 ± 1 °C) ou estressante (32 ± 1 °C) de temperatura.
Trinta miligramas (0,03 g) de péletes de cada isolado (CG 47; CG 632; IP 46; IP
119; ARSEF 1883 ou ARSEF 2575) foram colocados em placas de Petri (95 × 15 mm)
contendo 20 mL de meio ágar-água 2%. As placas foram incubadas a 27 ± 1 °C ou 32 ± 1
°C, por 15 dias. Após esse período, os conídios foram suspensos em solução aquosa de
Tween 80® (0,05%, v/v), e as suspensões foram quantificadas em hemocitômetro para
avaliação da produção de conídios na placa. Em seguida, as suspensões foram ajustadas
20
para a concentração de 1 × 106 conídios mL
-1, e um teste da viabilidade dos conídios foi
conduzido retirando-se de cada suspensão uma alíquota de 20 µL e inoculando-a no
centro de uma placa de Petri (35 x 10 mm) com 8 ml de BDA acrescido de 1g/ L1 de
extrato de levedura, 0,002% (p/v) de Benomil (BENLATE 500, Du Pont, Brasil)
(MILNER et al., 1991; BRAGA et al., 2001), e 0,05% (p/v) de Cloranfenicol (Figura 4).
Figura 4: A) e B) Produção de conídios a partir de péletes à base de microescleródio de
M. anisopliae s.s ARSEF 1883 ou IP 119 após 15 dias a 27 ± 1 °C; C) Suspensão para
obtenção de conídios esporulados a partir dos péletes; D) Inóculo da suspensão com
concentração de 1 × 106 conídios mL
-1 em meio BDAL para avaliação da viabilidade de
conídios
As placas foram incubadas por 48 h a 27 ± 1 ºC em ausência de luz. Para permitir
a recuperação do fungo proveniente de estresse e permitir a germinação dos conídios de
forma fidedigna. Após este período, duas gotas de lactofenol de Amann mais azul de
algodão foram aplicadas com pipeta Pasteur sobre a amostra inoculada no meio de
21
cultura nas placas de Petri. As placas foram observadas ao microscópico óptico com
magnitude de 400× para determinar a viabilidade dos conídios. Um número mínimo de
300 conídios por placa foi avaliado e o percentual de conídios germinados foi calculado
(BRAGA et al. 2001). Quatro repetições foram conduzidas independentemente.
4.5 Triagem da eficácia de péletes de Metarhizium spp. para controle de
fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus.
Os testes foram conduzidos espalhando-se manualmente 0,007 g de péletes sobre
a superfície de 5 g de latossolo vermelho estéril seco, previamente tamizado com malha
de 1 mm, e umedecido com 1 mL de água destilada em placa de Petri (65 × 15 mm). A
composição do solo utilizado nos ensaios é apresentada na Tabela 3. Para cada isolado
testado (CG 47; CG 632; IP 46; IP 119; ARSEF 1883 ou ARSEF 2575), 10 placas foram
preparadas. Outras 10 placas contendo apenas latossolo vermelho umedecido foram
usadas no grupo controle. As placas foram incubadas por 15 dias a 27 ± 1 °C e umidade
próxima de saturação para permitir a esporulação dos conídios a partir dos péletes (Figura
4).
Tabela 3: Composição do latossolo vermelho.
Análise Granulométrica*
Argila 422 g.Kg-1
Silte 26 g.Kg-1
Areia total 552 g.Kg-1
Classificação Argilosa
Tipo de solo (MAPA)** 3
(*) Laudo de análise do solo no ANEXO A.
(**) MAPA: Ministério da agricultura, pecuária e abastecimento.
Após esse período, em cada placa de Petri foi colocada uma fêmea ingurgitada de
R. microplus, previamente pesada (Figura 5). As fêmeas foram acompanhadas
diariamente e avaliadas quanto à oviposição e o início da conidiogênese sobre os
indivíduos mortos. Parâmetros como peso final da fêmea, peso de ovos, índice de
produção de ovos, índice nutricional e reprodução estimada não foram determinados,
devido ao ajuste da metodologia, para permitir o bioensaio com fêmeas de R. microplus
22
sobre latossolo. Todos esses parâmetros eram influenciados com grânulos de latossolo, a
quantificação das larvas estabeleceu a capacidade de reprodução da fêmeas.
Figura 5: Processo de triagem para avaliar a eficácia de péletes de Metarhizium spp. à
base de microescleródios sobre fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus: A)
Placas com latossolo vermelho estéril e adição de água destilada estéril; B) Comparação
de placa com latossolo vermelho umidificado (à esquerda) e seco (à direita); C) Placa
com latossolo úmido e 7 mg de péletes; D) Péletes com produção de conídios após15 dias
de incubação a 27 ± 1 °C ; E) Placas preparadas para o bioensaio; F) Fémea ingurgitada
de R. microplus sobre péletes (seta amarela).
Ao término da postura, a massa de ovos de cada fêmea foi pesada e colocada em
tubo de ensaio vedado com algodão hidrófilo, e mantidos a 27 ± 1°C e UR ≥ 80% para
permitir a eclosão das larvas (Figura 6). Foi realizado uma repetição com dez réplicas .
Os seguintes parâmetros foram investigados: peso inicial da fêmea ingurgitada; período de
postura, e eclosão larval, avaliado através da quantificação total das larvas eclodidas em
cada tubo. A quantificação das larvas foi feita mergulhando-as em álcool etílico 96° em
placas de Petri, e sugando-as com auxílio de seringa de 10 mL, agulha (BD1 20 × 40 18 G1
½) e contagem em microscópio estereoscópico.
23
Figura 6: A) Fêmea de R. microplus em oviposição; B) Ovos de R. microplus em tubos
de vidro vedados com algodão hidrofílico; C) Larvas de R. microplus eclodidas dentro
do tubo; D) Larvas transferidas para placa de Petri contendo álcool etílico 96° para
quantificação com auxilio de seringa.
4.6 Triagem da eficácia de péletes de IP 119 em diferentes doses para
controle de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus em condição ótima de
temperatura.
Cinco doses de péletes de ME (0,002, 0,003, 0.004, 0,005 ou 0,006 g) foram
aplicadas sobre a superfície de 5 g de latossolo vermelho estéril umidecido em placa de
Petri (65 × 15 mm). As placas foram incubadas por 15 dias a 27 ± 1 °C e UR próxima da
saturação para permitir a produção de conídios a partir dos péletes. O grupo controle com
10 réplicas foi mantido nas mesmas condições de temperatura e UR. Após esse período,
em cada placa de Petri foi colocada uma fêmea ingurgitada de R.microplus, e então as
placas foram incubadas nas mesmas condições de temperatura e umidade. Foi realizada
uma repetição com dez réplicas, e os parâmetros analisados foram os mesmos descritos
para os bioensaios descritos no item 4.5.
4.7 Eficácia de péletes de CG 47 ou IP 119 sobre fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus microplus em condição estressante de temperatura.
Sete miligramas de péletes foram aplicados sobre a superfície de 5 g de latossolo
vermelho estéril umedecido com água destilada em placa de Petri (65 × 15 mm). As
placas foram incubadas por 15 dias a 27± 1 °C ou 32 ± 1 °C e umidade relativa próxima
de saturação para permitir a produção de conídios a partir da superfície dos péletes. Após
esse período, em cada uma das 10 placas de Petri foi colocada uma fêmea ingurgitada de
R.microplus, e então as placas foram incubadas novamente a 27± 1 °C ou 32 ± 1 °C e UR
24
na mesma condição. Nos grupos controle não foi aplicada a formulação peletizada. Os
parâmetros analisados foram os mesmos descritos para os bioensaios realizados em
temperatura ótima, 27 ± 1 °C (iten 4.5). Três repetições independentes foram realizadas.
4.8 Produção de péletes com vermiculita
Conídios do isolado IP 119 foram cultivados conforme item 4.3. Para cada 100
mL da biomassa líquida foi adicionado 5 g da mistura constituída de 78% de vermiculita
expandida (AgroFloc®, Brasil Minérios, GO, Brasil) triturada até atingir o aspecto de pó,
20% de terra diatomácea e 2 % de dióxido de silício. Esta biomassa homogênea foi
filtrada a vácuo (Bomba de vácuo TE-05, Tecnal®
, Brazil) em papel filtro com espessura
de 205 µm e poro de 14 µm (Qualy®
, JProlab, São José dos Pinhais, PR, Brasil) e foi
homogeneizada com o restante da mistura 95 g. Quantidade suficiente de água destilada
foi adicionada à mistura para se obter maior homogeneidade. A massa foi então extrusada
em equipamento contendo malha de aço inoxidável com abertura de 0,5 mm (Extrusor
20, Caleva Process Solution Ltd., Inglaterra) e esferonizada a 1500 rpm por 3 minutos em
esferonizador Caleva (Multi Bowl Spheronizer, Caleva Process Solutions Ltd.,
Inglaterra). Os péletes foram secos em leito fluidizado (Hüttin, Bosch, Stuttgart,
Alemanha) por 30 minutos em temperatura de 40°C. Balança de infravermelho (IV 2000,
Gehaka, SP, Brasil) foi usada para verificar o teor de água dos péletes até atingir 5%. Os
péletes foram armazenados em tubos de plástico tipo Falcon 15 ml.
4.9 Produção de conídios em péletes de celulose ou vermiculita com o isolado
IP 119, submetidos à condição ótima (27 ± 1 °C) ou estressante (32 ± 1 °C) de
temperatura.
Trinta miligramas de péletes do isolado IP 119 foram colocados em placas de
Petri (95 × 15 mm) contendo 20 mL de meio ágar-água 2%. As placas foram incubadas a
27 ± 1 °C ou 32 ± 1 °C, por 10 e 15 dias. Após esse período, os conídios foram suspensos
em solução aquosa de Tween 80® (0,05%, v/v), e as suspensões foram quantificadas em
hemacitômetro para avaliação da produção total de conídios na placa. Em seguida, as
suspensões foram ajustadas para a concentração de 1 × 106 conídios mL
-1, e um teste da
viabilidade dos conídios foi conduzido, conforme descrito no item 4.4.
25
4.10 Análises estatísticas
Os dados de produção de conídios foram submetidos à análise paramétrica usando
um modelo linear com efeitos mistos, em que os efeitos fixos foram discriminados por
“temperatura” e “isolados” e o termo de interação destes fatores, enquanto o efeito
aleatório foi atribuído às repetições experimentais. As médias de produção de conídios
entre isolados para cada temperatura foi comparada por contrastes LSmeans a P < 0,05,
enquanto as comparações duas a duas para temperatura dentro de cada isolado fúngico foi
realizada com o test t-Stdent a P < 0,05.
Os dados de produção de microescleródios foram ajustados a um modelo geral
linear com distribuição normal (Gaussiana) e os dados transformados por log(x). E os
dados de produção de biomassa foram ajustados a um modelo linear misto (MLM) com
distribuição normal, em que o efeito fixado foi representado por “isolados” e atribui-se o
efeito aleatório para “frascos” (repetições). Em seguida, as médias de tratamentos foram
comparadas por contrastes de Tukey HSD a 5% de significância.
O efeito dos tratamentos fúngicos à base de microescleródios, temperatura de
incubação e peso inicial de fêmeas sobre a variável resposta “número total de larvas
eclodidas por fêmea” foi descrito por meio de um modelo generalizado linear
inflacionado de zeros e com distribuição binomial negativa (pacote glmmADMB). Este
modelo inflacionado de zeros foi empregado aqui devido ao excessivo número de valores
com resposta “zero” (Long, 1997), indicando que fêmeas do carrapato não ovipositaram
ou que os ovos não estavam viáveis por outros motivos que não os tratamentos fúngicos.
A distribuição negativa binomial foi utilizada para modelar os dados de contagem
(número de larvas eclodidas) com superdispersão (isto é, generalização da distribuição de
Poisson para dados de contagem levando-se em conta o parâmetro de superdispersão dos
dados). Como a interação “Tratamento vs. Temperatura” não foi significativa no modelo,
logo o modelo utilizado foi o aditivo (isto é: tratamento + temperatura + peso fêmeas).
As médias de tratamentos foram, em seguida, comparadas por meio de contrastes de
Tukey HSD ao nível de 5% de significância. Uma análise de correlação pelo método não-
paramétrico de Spearman foi aplicada para as variáveis respostas número total de larvas
eclodidas e tempo para conidiogênese. Esta análise mostraou qual o tipo de associação
entre essas variáveis (negativa, positiva ou neutra) com base no valor do índice r e seu
respectivo p-valor. As análises foram realizadas através do software R v.3.1.3 (R Core
Team, 2015).
26
5 RESULTADOS
Os isolados de Metarhizium spp. produzidos em meio líquido tiveram biomassa
seca similares (F= 2.221; df= 5, 17; P= 0.09963) (Figura 7), assim como a produção de
microescleródios (ME) (F = 1.467; df= 5, 29; P= 0.231) (Figura 8).
A produção de conídios a partir de 0,03 g de péletes de ME de Metarhizium spp.
incubados sobre meio ágar-água 2% a 27 ± 1 ºC variou entre 7,5 × 107 (IP 119) e 2,6 ×
107 (ARSEF 2575), não havendo diferença significativa entre os isolados (F = 2,27; gl =
5, 14; P = 0,104). Na temperatura de 32 ± 1 ºC, a produção de conídios foi entre 1,3 × 107
e 8,7 × 106 para maioria dos isolados; no entanto, ARSEF 2575 produziu 1,5 × 10
5
conídios/ 30 mg de péletes, e diferiu estatisticamente dos demais isolados (F = 7,01; gl=
5, 14; P = 0,0022). A temperatura de 32 ±1 ºC interferiu negativamente na produção de
conídios a partir de péletes formulados com ME (Figura 9). Os conídios produzidos a
partir de péletes de ME para todos isolados apresentaram viabilidade superior a 91,6%
quando produzidos a 27±1 ºC (F6, 5= 0.6278 P= 0.7079) e 32 ±1 ºC (F6, 5= 0.4859 P=
0.7973).
No bioensaio de triagem conduzido com exposição de fêmeas ingurgitadas de R.
microplus a conídios produzidos a partir dos péletes de ME sob a temperatura de 27 ± 1
ºC, o tempo médio para observação da conidiogênese fúngica sobre as fêmeas tratadas foi
de quatro dias para o isolado CG 47, seis dias para o ARSEF 1883, sete dias para os
isolados IP 46, IP 119 e ARSEF 2575, e nove dias para o isolado CG 632(Figura 10). O
período de oviposição das fêmeas, assim como o número de larvas de R. microplus
eclodidas, foram reduzidos pelos tratamentos das fêmeas com Metarhizium spp. (Figura
10).
No teste de triagem com diferentes quantidades de péletes de ME para a produção
de conídios contra fêmeas ingurgitadas de R. microplus, foi observado que o período
requerido para detecção do interrompimento da oviposição e para observação da
conidiogênese dos fungos sobre as fêmeas foi entre 7 dias e 11 dias nos grupos tratados
com IP 119 para todas as concentrações de péletes avaliadas (Figura 11). Todas as
concentrações dos péletes de ME de IP 119 reduziram o número de larvas eclodidas.
(Figura 11).
Nos bioensaios conduzidos nas condições de 27 ± 1 ºC ou 32 ± 1 ºC foram
detectados conidiogênese sobre as fêmeas de R. microplus expostas a conídios a partir
27
dos péletes formulados com os isolados CG 47 ou IP 119 (F = 27.199; df = 1, 87; P =
0.001); CG 47 promoveu conidiogênese em fêmeas de R. microplus em tempo médio de
5 dias, enquanto que IP 119 promoveu conidiogênese em tempo médio de 9 dias nos
testes conduzidos a 27 ±1 ºC. Quando os testes foram conduzidos a 32 ± 1 ºC, o tempo
médio de 5 dias foi requerido para ambos isolados para detecção da conidiogênese sobre
as fêmas. Além disso, a temperatura de 32 ± 1 ºC acelerou o tempo para início da
conidiogênese do isolado IP 119(Figura 12). O número médio de larvas eclodidas nos
grupos tratados com conídios a partir de péletes de ME de CG 47 e IP 119, indicaram que
os estes isolados reduziram significamente o número de descendente em relação ao
controle e não houve diferença estatística entre temperaturas sobre o número de larvas
eclodidas, por isso os resultados estão em um único gráfico (X2
= 43.57, df = 2, P <
0.001) (Figura 13).
O tipo de formulação e a temperatura foram os fatores que influenciaram
significativamente a produção de conídios por péletes do isolado IP119, enquanto que a
produção de conídios foi similar em ambos os tempos de incubação. A produção de
conídios em péletes foi consideravelmente superior quando incubado a 27 ± 1 ºC do que
a 32 ± 1 ºC, indicando que altas temperaturas podem afetar este parâmetro de
desenvolvimento do fungo numa formulação granular, independentemente do tipo de
inerte usado na formulação. A temperatura e tempo de incubação, no geral, a formulação
contendo vermiculita apresentou maior produção de conídios em relação à formulação
contendo celulose. Não houve interação entre quaisquer combinação dos fatores
temperatura, formulação e tempo de incubação (Figura 14).
28
Figura 7: Biomassa seca (mg/mL) de vários isolados de Metarhizium spp. produzidos em meio
líquido (MASCARIN et al., 2014). A biomassa (1 mL ) foi seca sobre papel filtro a 32 °C por 2
dias (F= 2.221; df = 5, 17; P= 0.09963). Barras em vermelho representam “médias±desvio-
padrão” e pontos representam valores observados nas repetições independentes.
Figura 8: Produção de ME por diferentes isolados de Metarhizium spp. em meio líquido
(MASCARIN et al., 2014) , com concentração de carbono de 16 g l-1
e relação C:N de 30:1,
cultivados em agitador orbital a 250 rpm a 27 ± 1 ºC por 4 dias ( F= 1.467; df = 5, 29; P =
0.231). Barras em vermelho representam “médias±desvio-padrão” e pontos representam
valores observados nas repetições indepenentes.
29
Figura 9: Produção de conídios a partir de péletes de Metarhizium spp. em meio agar-água 2%
durante 15 dias a 27 ou 32 ± 1°C, em escotofase. Letras minusculas comparação das médias
entre temperatura dentro de cada isolado fúngico pelo teste de t-Student a P < 0,05.. Letras
maiúsculas comparação das médias entre isolados dentro de cada temperatura 27 ±1 ºC (F =
2,27; gl = 5, 14; P = 0,104) e 32 ±1 ºC (F = 7,01; gl = 5, 14; P = 0,0022).
30
Figura 10: Triagem da eficácia de péletes de Metarhizium spp. à base de microescleródios
contra fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus, avaliando seu efeito sobre o período de
oviposição das fêmeas, e sobre o número de larvas eclodidas. Barras de médias e erro-padrão
de cada tratamento (10 fêmeas por grupo).
Figura 11: Triagem da eficácia de concentrações crescentes de péletes à base de
microescleródios de Metarhizium anisopliae s.s IP 119 contra fêmeas ingurgitadas de R.
microplus, avaliando seu efeito sobre o período de oviposição das fêmease sobre o número de
larvas eclodidas. Barras de médias e erro-padrão de cada tratamento (7 fêmeas por grupo)
31
Figura 12: Efeito das temperaturas 27 ± 1°C e 32 ± 1°C na eficácia de péletes de ME de M.
anisopliae s.s IP 119 contra fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus, avaliando o
tempo (dias) necessário para observação da conidiogênese (F = 27.199; df = 1, 87; P = 0.001).
Barras de médias e desvio-padrão. (*) Redução dos dias necessários para conidiogênese do
isolado IP 119 a 32 ± 1°C.
Figura 13: Eficácia de péletes de ME de M. anisopliae IP 119 contra fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus microplus, com base no número de larvas eclodidas (X2= 43,573; df= 2; P=
0.001). Barras em vermelho representam “médias±desvio-padrão” e pontos representam
eclosão de larvas.
32
Figura 14: Produção de conídios por grama de péletes à base de microescleródios de M.
anisopliae s.s IP119 formulados com diferentes inertes, vermiculita ou celulose microcristalina
e aplicados sobre meio água-ágar 2% e incubados sob duas temperaturas 27 ± 1°C ou 32 ± 1°C,
em escotofase por 10 dias e por 15 dias.
33
6 DISCUSSÃO
Microescleródios (ME) são estruturas fúngicas de proteção formados por
agregados de hifas quitinizadas que até recentemente acreditava-se que eram produzidos
apenas por fungos endofíticos ou fitopatogênicos (JACKSON; JARONSKI, 2009). Em
espécies de Metarhrizium, a produção de microescleródios foi relatada em 2009
(JACKSON; JARONSKI, 2009), e em 2014 para Nomuraea rileyi (=Metarhizium rileyi)
(SONG et al., 2014). Estes propágulos, por serem estruturas de resistência a fatores
abióticos e por persistirem no ambiente, apresentam grandes vantagens para o controle de
artrópodes pragas e vetores.
Os isolados de Metarhizium spp. foram selecionados com base em estudos já
publicados, que mostraram a capacidade de produção de ME dos isolados de CG 47, CG
632 e ARSEF 1883 (= CG 168) (MASCARIN et al., 2014), a virulência de IP 119 para R.
microplus (MUNIZ, 2015) e de IP 46 para insetos (LUZ et al., 2012; RODRIGUES et
al.,2015). O isolado ARSEF 2575 foi adicionado ao presente estudo por possuir
termotolerância conhecida (FERNANDES et al., 2010; RANGEL et al., 2005).
Os ME de Metarhizium foram obtidos em laboratório por cultivo em meio líquido
nutricionalmente apropriado, composto essencialmente por sais, extrato de levedura e
glicose (JACKSON; JARONSKI, 2009; BEHLE; JACKSON, 2014; BEHLE et al., 2015;
MASCARIN et al., 2014). A produção de ME no meio líquido é influenciada pela relação
de Carbono: Nitrogênio (C:N) do meio (JACKSON; JARONSKI, 2009), quanto maior
for a quantidade de N, maior é o acúmulo de biomassa. A relação C:N do presente estudo
foi 30:1, e pôde-se observar um maior acúmulo de biomassa.. Os isolados CG 47, CG
632 e ARSEF 1883 produziram biomassa seca superior aos valores relatados por
Mascarin et al. (2014), que utilizaram maior relação C:N 50:1, ou seja, havia menor
concentração de nitrogênio no meio.
Da mesma forma, Behle e Jackson (2014) mostraram que a biomassa acumulada
em meio com relação C:N de 30:1 foi maior quando comparada à biomassa produzida em
meio com relação C:N de 50:1, como mostrado no presente estudo. Meio com
quantidades diferentes de relação C:N (10:1, 30:1 e 50:1) foram avaliados por Jackson e
Jaronski (2009) e os resultados motraram a produção de ME em quantidade similar por
isolados de M. anisopliae cultivados por 2, 4 ou 8 dias nos diferentes meios, porém, uma
maior concentração foi necessária para suportar maiores concentrações de ME.
34
Todos os isolados selecionados foram capazes de produzir ME e possivelmente
cada isolado produziu um morfotipo de ME, alongada em IP 119, IP 46 e arredondada em
CG 47; CG 632; ARSEF 1883 e ARSEF 2575. Essas observações foram feitas durante o
processo de quantificação de ME depois de cultivado no meio de fermentação por quatro
dias.
Para a obtenção de um formulado de ME com maior uniformidade, o processo e
tecnologia de peletização foi usado no presente estudo. Os fungos entomopatogênicos
foram transfomados em péletes utilizando o método de extrusão-esferonização com 60%
da biomassa fúngica acrescido de terra diatomácea e 40% de celulose microcristalina.
Esta é uma metodologia inovadora para produção de bioproduto com finalidade para
controle microbiano de artrópodes. Os péletes poderiam permitir melhor esporulação de
conídios, porquê a relação área- superfície, que geralmente tende a produzir maior
esporulação para tamanhos menores de grânulos, devido a forma esférica de sua
superfície, além de otimizar a aplicabilidade, porque possui tamanho uniforme com
aspecto granular.
O método de peletização mostrou-se viável para obtenção de péletes altamente
esféricos com 0,5 mm de diâmetro, devido ao uso de celulose microcristalina (CM) que
garantiu a homogeneidade da massa (DUKÍC-OTT et al., 2009) junto com a terra
diatomácea e a biomassa. Esta metodologia não interferiu negativamente na biologia do
fungo, pois conídios foram produzidos a partir dos péletes em meio ágar-água 2% ou
latossolo vermelho; ambos os substratos foram importantes para garantir a re-hidratação
dos péletes. O formulado preparado à base de ME com celulose produziu conídios,
comprovando a viabilidade dos péletes, e mesmo quando submetidos a 32 ºC, a
conidiogênese (produção de conídios) não foi impedida para a maioria dos isolados
investigados.
No entanto, péletes do isolado CG 47 apresentaram alto rendimento na produção
de conídios a 27 ± 1 ºC, mas tiveram sua produção significativamente reduzida quando
incubados a 32 ± 1 ºC, revelando que esta temperatura interferiu negativamente na
eficácia dos péletes produzidos com este isolado. Temperaturas de 25 a 40 ºC já foram
investigadas para a produção de conídios a partir de grânulos de ME sobre meio agar-
água e revelou que a temperatura constante de 40 ºC reduz a habilidade da produção de
conídios a partir dos grânulos; no entanto, em temperatura alta por períodos diários
determinados, a produção de conídios foi maior do que quando comparado à exposição
35
constante à mesma temperatura. A temperatura de 25 ºC foi considerada favorável e ideal
para melhor produção de conídios por grânulos de ME (BEHLE et al., 2015).
As formulações de fungos entomopatogênicos têm a função de proteger o
própagulo contra fatores abióticos estressante e facilitar sua aplicação (ALVES, 1998;
ALVES; FARIA, 2010). O uso de determinadas formulações tem-se mostrado promissor
para o controle de carrapatos, como relatado por Camargo et al. (2008) que
demonstraram que formulações oleosas têm eficácia sobre o controle de R. microplus em
condições de laboratório. Os principais métodos de controle de carrapatos baseiam-se na
utilização de acaricidas químicos (organofosforados, piretroides e lactonas
macrocíclicas); esta forma de controle quando utilizada de forma inadequada e
indiscriminada causa poluição ambiental, seleciona indivíduos resistentes e deixa
resíduos em alimentos de origem animal, pois tais produtos utilizados para controle de R.
microplus são destinados exclusivamente à aplicação sobre o animal (FERNANDES;
BITTENCOURT, 2008).
Formulações fúngicas, ainda que se mostrem eficazes em testes laboratoriais ou
em animais estabulados para controle de carrapatos, é atualmente direcionada a
aplicações de conídios sobre bovinos infestados para controle de carrapatos durante a
fase parasitária (LEEMON; JONSSON, 2008; CAMARGO et al., 2012). Ainda que
aplicações de suspensões conidiais se mostrem eficazes para controle de carrapatos na
fase de vida não parasitária quando aplicadas sobre a vegetação, devido especialmente ao
fato das criações de bovinos no Brasil serem particularmente extensivas, essas aplicações
seriam muito onerosas, o que limitaria sua prática (KAAYA; HASSAN, 2000).
Bioprodutos a partir de fungos entomopatogênicos registrados para o controle de
carrapatos, no entanto, ainda não são disponíveis no mercado brasileiro (FARIA;
WRAIGHT, 2007).
O biocontrole de R. microplus tem sido investigado com maior ênfase a partir de
formulações conidiais, e essas formulações quando aplicadas sobre bovinos infestados
demonstram o potencial e a eficácia promissora de fungos entomopatogênicos de atuar no
controle desses carrapatos (FERNANDES; BITTENCOURT; ROBERTS, 2012; POLAR
et al., 2005; FERNANDES et al., 2011; CAMARGO et al., 2012; MUNIZ, 2015). A
partir do referencial teórico sobre utilização de grânulos de ME para controle de insetos
que realizam parte do ciclo de vida no solo, o presente estudo buscou testar péletes de
ME para controle do carrapato R. microplus que apresenta duas fases de vida: uma
parasitária e outra não parasitária. A fase de vida não parasitária é iniciada quando as
36
fêmeas ingurgitadas desprendem-se do hospedeiro e caem ao solo (ambiente) para
realizar oviposição, geralmente em locais sombreados e úmidos (BENNETT, 1974).
O presente estudo propõe um método tecnológico para a obtenção de péletes de
ME para o controle de R. microplus; esta formulação merece atenção como um potencial
carrapaticida biológico, visto que as condições de temperatura e umidade requeridas para
a esporulação de conídios infectivos são as mesmas requeridas por este carrapato para
realizar oviposição e para posterior eclosão das larvas. Grânulos de microescleródios de
Metarhizium spp. já foram relatados por possuírem grande potencial para o controle de
ninfas do carrapato Ixodes scapularis, as quais foram susceptíveis à infecção fúngica
(BEHLE et el., 2013).
A virulência de conídios produzidos a partir de ME para o carrapato R. microplus
foi mostrada com péletes de Metarhizium spp. aplicados sobre a superfície de solo estéril
úmido para evidenciar a efetividade dos formulados, quando incubados a temperatura de
27 ± 1 ºC e UR ≥ 80%. O contato das fêmeas ingurgitadas de R. microplus com os péletes
e com os conídios produzidos a partir desses péletes em placas de Petri proporcionaram
uma condição favorável à infecção pelo fungo. Esta condição pode ser alcançada em
condições naturais, no entanto, muitas variáveis ambientais foram desprezadas nos testes
em condições controladas de laboratório.
Os resultados obtidos a partir do bioensaio de triagem utilizando 0,007 g de
péletes, possibilitaram selecionar dois isolados de M. anisopliae s.s., (CG 47 e IP 119)
por apresentar relevante produção de conídios a partir dos péletes, menor tempo para
detecção de conidiogênese sobre fêmeas ingurgitadas de R. microplus. O menor tempo
(dias) para detecção de conidiogênese dos fungos sobre as fêmeas de R. microplus esteve
diretamente associado ao menor número de larvas eclodidas.Isso refere-se também ao
fato de que as fêmeas tiveram menos tempo para realizar oviposição, pois o número de
larvas gerado por fêmea é, de forma geral, relacionado à sua capacidade de conversão do
seu peso em ovos (BENET, 1974).
Os testes de triagem das diferentes quantidades de péletes (g) formulados com
ME do isolado IP 119 foi adicionado ao presente estudo para verificar se em quantidades
menores era possível encontrar a concentração ótima a ser aplicada para garantir a
efetividade do formulado. Os resultados foram favoráveis e mostrou que independente da
quantidade de péletes sobre o latossolo úmido, os conídios produzidos foram capazes de
infectar fêmeas e interromper precocemente a oviposição, reduzindo consequentemente o
número de larvas por fêmeas.
37
Os bioensaios conduzidos sob a temperatura de 32 ± 1 ºC e UR ≥ 80% revelaram
que a conidiogênese sobre as fêmeas ingurgitadas de R. microplus para CG 47 e IP 119
não foi afetada negativamente. Os dois isolados reduziram significativamente o número
de larvas eclodidas, independentemente da temperatura de incubação (32 ± 1 ºC ou 27 ±
1 ºC). Os resultados destes bioensaios mostram que o controle de carrapatos com a
formulação peletizada em condições de laboratório evidencia o uso de ME como ativo
biológico eficaz. Os péletes à base de ME de Metarhizium spp. foram eficazes no
controle de R. microplus por reduzir o número de progênies, e abre novas perspectivas
para o controle biológico de R. microplus durante sua fase de vida não parasitária.
A formulação a base de ME de Metarhizium spp. e terra diatomácea, acrescida de
CM resultou em péletes, um bioproduto fúngico. A CM garante, no entanto,
características orgânicas aos péletes produzidos. Outro inerte selecionado foi a
vermiculita por ser um mineral. Os péletes foram transformados utilizando o método de
extrusão-esferonização com 70% de vermiculita, 20% de biomassa fúngica acrescido de
terra diatomácea e 2% de dióxido de silicio. Os dois formulados foram capazes de
produzir conídios viáveis na constante temperatura de 27 ± 1 ºC ou 32 ± 1 ºC durante 10
e 15 dias. Este é o primeiro relato de um péletes composto por 100% de inertes minerais,
o que contrasta a forma convencional baseada em alginato (CARNEIRO; GOMES, 1997)
ou celulose microcristalina.
As duas formulações peletizadas obtidas no presente estudo abrem novas
perspectivas para serem usadas não somente para o controle biológico de carrapatos, mas
também para outros artrópodes de importância médica e veterinária que desenvolvam
uma fase da vida no solo. Os formulados com celulose ou vermiculita possuem como
ingrediente ativo ME que não necessitam de nutrientes para iniciar a germinação
micelogênica. Os ME necessitam apenas de umidade e condições de temperaturas
favoráveis para que a produção de conídios infectantes ou infectivos seja desencadeada.
O fator umidade pode ser contornado pela composição e diâmetro do pélete, e
pelas características do local de aplicação devido à perspectiva de aplicação em solo
coberto por vegetação (microclima úmido); essas condições podem garantir temperatura
e umidade adequadas estabelecidas pelo sombreamento e pelo processo natural de
gutação (formação de gotículas de água na borda das folhas, proveniente do metabolismo
da respiração das plantas). Os efeitos do estresse térmico também podem ser contornados
com a formulação de ME a partir de isolados fúngicos mais tolerantes ao calor.
38
7 CONCLUSÕES
1. Isolados de Metarhizium spp. (CG 47, CG 632, IP 46, IP 119, ARSEF 1883 e
ARSEF 2575) foram capazes de produzir microescleródios (ME) em meio líquido
submerso.
2. A tecnologia de peletização permitiu a formação de péletes de ME de
Metarhizium spp.
3. A germinação micelogênica dos péletes ocorreu em temperatura constante de 27
°C e de 32 °C e em seguida conídios viáveis foram produzidos.
4. Conídios produzidos a partir de péletes de ME de Metarhizium spp. foram
virulentos para fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus tanto à 27 °C como a 32
°C, sendo capazes de infectá-las e reduzirem seu período de postura e o número de larvas
eclodidas.
5. Péletes de ME do isolado IP 119 constituído de inerte orgânico ou inorgânico
foram capazes de produzir conídios viáveis em temperaturas constantes de 27 e 32 °C.
39
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ANEXOS
