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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

ANA GRAZIELA DE JESUS DEIRÓ

OCORRÊNCIA DE ANTICORPOS ANTI-Toxoplasma gondii, Leishmania spp. e Ehrlichia canis EM CÃES EM MUNICÍPIOS DO ESTADO DA BAHIA

ILHÉUS – BAHIA 2016



Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Ciência Animal Orientador: Prof. Dr. George Rêgo Albuquerque


D324 Deiró, Ana Graziela de Jesus. Ocorrência de anticorpos anti-toxoplasma gon- ddi, Leishmania spp. e Ehrlichia canis em cães em municípios do estado da Bahia / Ana Graziela de Jesus Deiró. – Ilhéus, BA: UESC, 2016. 64f. : Il.; anexos. Orientador: George Rêgo Albuquerque. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Inclui referências.

1. Cão - Doenças. 2. Toxoplasmose em animais. 3. Leishmaniose. 4. Ehrlichia canis. I. Título. CDD 636.0896



Ilhéus – BA, 23 /02/2016

___________________________________

George Rêgo Albuquerque – DSc UESC/DCAA (Orientador)

____________________________________ Renata Santiago Alberto Carlos – DSc

UESC/DCAA

___________________________________ Carlos Wilson Gomes Lopes – PhD, LD

UFRRJ/DPA


DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho a minha família e a de meu esposo, que me apoiou em todos

os momentos, incentivando-me, compreendendo-me e transmitindo-me amor, força

e confiança, possibilitando assim vencer os obstáculos da vida.

Ao meu esposo Walter Junior pelo amor, amizade, paciência e união.

As minhas filhas Luana Marina Deiró de Souza e Ana Letícia Deiró de Souza que

são os bens mais preciosos que tenho e que amo incondicionalmente.

AGRADECIMENTOS

A Deus, nosso Senhor, à Nossa Senhora da Conceição e ao Senhor do Bonfim que

sempre me iluminou e guiou-me, em tudo, dando-me forças para chegar com

sabedoria e disposição à conclusão deste trabalho.

Aos meus pais, Tereza Cristina Bomfim de Jesus Deiró e Haroldo Monteiro Fontes

Deiró, responsáveis pela minha existência, pessoas mais importantes da minha vida,

exemplos de dedicação, honestidade e perseverança, verdadeiros exemplos para a

minha fortaleza, minha base, meu esteio, meu TUDO! Agradeço por proporcionarem

o que eu necessitei. Não conseguiria realizar meus objetivos sem o apoio de vocês.

Muito Obrigado!

Aos meus irmãos, Ricardo Deiró, Pablo Deiró, Renata Deiró, Paula Deiró, Haroldo

Deiró Filho e Rodrigo Deiró, pelo amor e apoio em todas as horas, dignidade,

respeito e exemplos de luta, trabalho, amor e fé, além da torcida pelo meu sucesso.

A todos aos meus familiares e familiares de meu esposo, sempre torcendo pelo meu

sucesso. Agradeço de coração o apoio de todos vocês.

A meu orientador Professor Dr. George Rego Albuquerque, pela confiança, por

aceitar me orientar, pelo carinho, conhecimentos transmitidos, atenção, paciência,

pressão, pelo astral, pelos puxões de orelhas, pelos elogios e pelo incentivo.

Aos diversos professores do programa de pós-graduação em Ciência Animal da

Universidade Estadual de Santa Cruz, principalmente ao Prof.Dr. Alexandre Dias

Munhoz, grata pelos ensinamentos, paciência e compreensão.

Aos meus amigos do “coração” e aos amigos “acadêmicos”, por fazerem parte da

minha vida e por não me permitirem desanimar.

Aos meus amigos e colegas da pós-graduação: Graziela Baroni, Fábio Santos

Carvalho, Luciana Guimarães, Daniele Rocha, Pedro Brito Junior, Gideão Galvão,

Luciana Lacerda e Rodrigo Bezerra, pela ajuda e por compartilharem suas

experiências, dúvidas e conhecimentos ao longo dessa jornada;

A toda equipe do laboratório de parasitologia, obrigada pelo apoio, conversas,

caronas, resenhas, estudos... Enfim, por me ajudarem, vocês fazem parte desta

vitória.

A todos os colegas, funcionários do Hospital Veterinário da UESC.

Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal, pelos

ensinamentos transmitidos;

Aos CCZ’s, ONG’s e proprietários dos animais, por terem entendido na importância

deste projeto e disponibilizarem alguns animais para estudo, permitindo a realização

de coleta de sangue dos cães, material imprescindível para a realização deste

trabalho.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

concessão da bolsa de mestrado.

A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma para a

concretização desse trabalho.

O meu muito OBRIGADO!

"Tudo é uma questão de manter. A mente quieta. A espinha ereta. E o coração tranqüilo."

Walter Franco


RESUMO

Objetivou-se com esse estudo detectar anticorpos IgG anti- Toxoplasma gondii,

Leishmania spp. e Ehrlichia canis em cães do estado da Bahia, bem como detectar a

presença de fatores de risco associados. Amostras de sangue de 300 cães foram

coletadas em diversos municípios deste estado e os soros foram submetidos a

testes sorológicos como Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para T. gondii

e Leishmania spp. e Ensaio Imunoenzimático Indireto (ELISA) para E. canis, no

Laboratório de Parasitologia Veterinária do Hospital Veterinário da Universidade

Estadual de Santa Cruz (HOSPVET). Os dados foram tabulados e analisados pelos

programa EPIINFO 7.1.5. Para o agente etiológico T. gondii, das 300 amostras

coletadas, 122 (40,66%) forram positivas frente a RIFI com títulos de anticorpos

variando de 1:16 à 1:4096. Para Leishmania spp., utilizando também RIFI, 74

(24,66%) mostraram soropositividade, com títulos de anticorpos variando de 1:40 a

1:160. A soropositividade de E. canis foi a maior em relação aos outros agentes,

dos animais amostrados 155 (51,60%) tiveram anticorpos anti-E.canis, no ELISA.

Das 300 amostras analisadas, 4% foram soropositivas tanto para T. gondii quanto

para Leishmania spp., 21% foram sororeagentes para T. gondii e E. canis, 6,70%

mostraram sorologia positiva para E.canis e Leishmania spp. e 5% dos animais

foram soropositivos para os três agentes etiológicos. Dentre os fatores de risco

analisados, a idade foi significativa (p= 0,05), ao Teste Exato de Fisher) para E.

canis e Leishmania spp., os cães errantes foram mais propensos a se infectar com o

Leishmania spp. (p=0,01) do que os cães semidomiciliados e não houve

significância para variável sexo entre os agentes etiológicos estudados. Os

resultados comprovam a presença dos três agentes etiológicos nos municípios

estudados no estado da Bahia, distribuídos de maneira heterogenea e apresentando

animais com coinfecções.

Palavras-chave: toxoplasmose. Leishmaniose. Erliquiose. Fatores de risco.

ANTIBODY OCCURRENCE OF ANTI-Toxoplasma gondii, Leishmania sp. and Ehrlichia canis IN DOGS IN BAHIA STATE MUNICIPALITIES

ABSTRACT

The objective of this study to detect IgG anti-Toxoplasma gondii, Leishmania spp.

and Ehrlichia canis in the state of Bahia dogs as well as the presence of risk factors.

300 dogs blood samples were collected in several counties of this state and the sera

were subjected to serological tests as Immunofluorescence Assay (IFA) for T. gondii

and Leishmania spp. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Indirect (ELISA) for

E. canis in Veterinary Parasitology Laboratory of the Veterinary Hospital of the State

University of Santa Cruz (HOSPVET). The data were tabulated and analyzed by

EPIINFO 7.1.5 program. For the etiologic agent T. gondii, the 300 samples collected,

122 (40.66%) lining positive front IFT with antibody titers ranging from 1:16 to 1:

4096. . For Leishmania spp, also using IFA, 74 (24.66%) showed seropositivity, with

antibody titers ranging from 1:40 to 1: 160. The seropositivity E. canis was higher

compared to other agents, of animals sampled 155 (51.60%) had anti-E.canis

antibodies, ELISA. Of the 300 samples analyzed, 4% were seropositive for both T.

gondii and for Leishmania spp., 21% were reactive serum T. gondii and E. canis,

6.70% showed positive serology for E.canis and Leishmania spp. and 5% of the

animals were seropositive for the three etiological agents. Among the risk factors

analyzed, age was significant (p = 0.05), Fisher's Exact Test) for E. canis and

Leishmania spp., The stray dogs were more likely to become infected with

Leishmania spp. (P = 0.01) than semidomiciliados dogs and there was no

significance to gender among the etiologic agents studied. The results show the

presence of the three etiological agents in the municipalities studied in the state of

Bahia, distributed heterogeneous way and presenting animals with coinfections.

Keywords: Toxoplasmosis, Leishmaniasis, Ehrlichiosis. Risk factors.

LISTA DE FIGURAS Figura Página

1 Ciclo biológico deToxoplasma gondii. Fonte: NEVES, 2010.

21

2 Ciclo Biológico de Leishmania spp.. Fonte: Center for Disease Control and Prevention, 2016

25

3 A. Ciclo Biológico de E. canis. B. Célula infectada por Ehrlichia canis. Fonte: http://slideplayer.es/slide/1105531

30

4 Mapa do estado da Bahia – Mesorregiões Fonte: http://slideplayer.es/slide/5635638Co-

34

5 Coropositividade dos cães amostrados frente aos antígenos de Toxoplasma gondii, Leishmania spp. e E. canis.

39

LISTA DE TABELAS

Tabela Página

1 Valores de ocorrência de anticorpos anti- Toxoplasma gondii em caninos de diferentes estados brasileiros, técnicas e respectivos autores.

22

2 Valores de ocorrência de anticorpos anti- Leishmania em caninos de diferentes estados brasileiros, técnicas e respectivos autores.

27

3 Valores de ocorrência de anticorpos anti- Ehrlichia canis em caninos de diferentes estados brasileiros, técnicas e respectivos autores.

33

4 Titulação dos soros, em número e porcentagem, positivos à detecção de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em cães do estado da Bahia.

37

5 Titulação dos soros, em número e porcentagem, positivos à detecção de anticorpos anti-Leishmania em cães do estado da Bahia.

38

6 Detecção de anticorpos anti- T. gondii em cães e sua distribuição no estado da Bahia, Brasil.

40

7 Detecção de anticorpos anti- Leishmania spp.em cães e sua distribuição no estado da Bahia, Brasil.

41

8 Detecção de anticorpos anti-Ehrlichia canis em cães e sua distribuição no estado da Bahia, Brasil.

42

9 Análise bivariada de fatores associados a infecção de Toxoplasma gondii, Leishmania spp. e Ehrlichia canis relacionados aos cães na Bahia

43

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CEUA

Comitê de Ética no Uso de Animais

ELISA “Enzyme Linked Imuno Sorbent Assay”

EDTA

Ácido etilenodiamino tetra-acético

HAI Reações de Hemaglutinação

IBGE

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

MAD Método de Aglutinaçao Direta

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

RIFI Reação de Imunofluorescência Indireta

SESAB

Secretaria Estadual de Saúde da Bahia

SUVISA Superintendência de Vigilância em Saúde

LISTA DE ANEXOS

Anexos Páginas

A Protocolo da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Toxoplasma gondii.

61

B Protocolo da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania spp..

62

C Protocolo do Teste de ELISA para Ehrlichia canis. 63

SUMÁRIO

Pág.

1 INTRODUÇÃO........................................................................ 16

2 OBJETIVOS............................................................................ 17

2.1 Objetivo geral.......................................................................... 17

2.2 Objetivos específicos.............................................................. 17

3 REVISÃO DE LITERATURA.................................................. 17

3.1 Agentes etiológicos:............................................................. 17

3.1.1 Toxoplasma gondii............................................................... 17

3.1.1.1 Transmissão........................................................................... 18

3.1.1.2 Ciclo Biológico........................................................................ 19

3.1.1.3 Sinais clínicos......................................................................... 21

3.1.1.4 Diagnóstico............................................................................. 22

3.1.1.5 Epidemiologia.......................................................................... 22

3.1.2 Leishmania spp..................................................................... 23

3.1.2.1 Transmissão............................................................................ 24

3.1.2.2 Ciclo Biológico ........................................................................ 25

3.1.2.3 Sinais clínicos......................................................................... 26

3.1.2.4 Diagnóstico............................................................................. 26

3.1.2.5 Epidemiologia.......................................................................... 27

3.1.3 Ehrlichia canis....................................................................... 28

3.1.3.1 Transmissão............................................................................ 28

3.1.3.2 Ciclo Biológico......................................................................... 29

3.1.3.3 Sinais clínicos......................................................................... 31

3.1.3.4 Diagnóstico............................................................................. 31

3.1.3.5 Epidemiologia.......................................................................... 32

3.2 Coinfecções........................................................................... 33

4 MATERIAL E MÉTODOS....................................................... 34

4.1 Local de Realização do Estudo.............................................................. 34

4.2 Coleta do Material Biológico..................................................................... 34

4.3 Coleta de Dados............................................................................................. 35

4.4 Sorologia para Toxoplasma gondii.......................................... 35

4.5 Sorologia para Leishmania spp............................................... 36

4.6 Sorologia para Ehrlichia canis................................................. 36

4.7 Análise Estatística................................................................... 37

5 RESULTADOS....................................................................... 37

6 DISCUSSÃO........................................................................... 44

7 CONCLUSÕES....................................................................... 48

REFERÊNCIAS...................................................................... 49

ANEXOS................................................................................. 61

17

1 INTRODUÇÃO

A toxoplasmose, a leishmaniose e a erliquiose são doenças infecciosas

importantes, com distribuição cosmopolita, que afetam a saúde dos cães, de

outros animais homeotérmicos e dos seres humanos. Cães são considerados

um risco potencial para a transmissão desses agentes etiológicos, o que pode

acarretar em grandes problemas a saúde pública. Os fatores associados a

infecções por Toxoplasma gondii, Leishmania spp. e Ehrlichia canis estão

diretamente relacionados com a via de transmissão e a susceptibilidade do

hospedeiro (LABRUNA; PEREIRA, 2001; CAMARGO et al., 2007; PAULAN et

al., 2013).

Essas três enfermidades são consideradas como zoonoses (BRASIL,

2006; DUBEY; LAPPIN, 2006; PEREZ et al., 2006). Os cães podem servir

como reservatório, como no caso da Leishmania spp e E. canis, podendo levar

a disseminação da doença para outros animais e para o ser humano (COELHO

et al, 2013; GIRARDI et al., 2014). Na toxoplasmose a espécie canina é

importante como sentinela para contaminação humana (SALB et al., 2008).

Associações da infecção por esses parasitos foram relatadas na

literatura por Coelho et al. (2013) demonstrando a detecção de coinfecções por

Leishmania (L.) chagasi, Trypanosoma evansi, T. gondii e Neospora caninum

em cães. Girardi et al. (2014) assinalaram a ocorrência de anticorpos anti-T.

gondii e E. canis.

O diagnóstico dessas enfermidades é realizado principalmente com o

uso de testes sorológicos, devido a boa sensibilidade, ao fácil acesso e baixo

custo. Essa técnica permite o reconhecimento de um maior número de cães

positivos em diferentes estágios de infecção.

A gravidade e a disseminação das doenças causadas pelos agentes T.

gondii, Leishmania spp. e E. canis devem ser consideradas. Ademais, a

necessidade de obter-se mais informações sobre esses agentes e o caráter

endêmico para essas doenças em cães, vem se configurando em várias

regiões do Brasil, o que tem motivado pesquisadores a estudar os agentes

etiológicos causadores, a presença de anticorpos e outros fatores, que possam

contribuir para o controle dessas zoonoses e diminuir o risco de infecção

principalmente para a população human

18

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

O presente trabalho tem como objetivo, verificar a ocorrência de

anticorpos anti- T. gondii, Leishmania spp. e E. canis na população de cães em

municípios do estado da Bahia, e identificar os possíveis fatores de risco.

2.2 Objetivos específicos

Verificar a ocorrência de anticorpos contra T. gondii, Leishmania spp. e

E. canis nos cães dos municípios coletados no estado da Bahia;

Identificar os possíveis fatores de risco associados a essas doenças;

Identificar coinfecções entreT. gondii, Leishmania spp. e E. canis.

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Agentes etiológicos

3.1.1 Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii pertence ao filo Apicomplexa, ordem Coccidia,

família Sarcocystidae é um protozoário intracelular obrigatório, que acomete

humanos e animais homeotérmicos (HILL; DUBEY, 2002; DUBEY, 2008)

O agente etiológico da toxoplasmose foi descoberto em 1908 na Tunísia

por Nicolle e Mancaeux (1908) notados no cérebro do roedor Ctenodactylus

gundi e no Brasil por Splendore (1908) em um coelho doméstico (Oryctolagus

cuniculus), inicialmente identificado como Leishmania gondii por ambos

pesquisadores e em 1909, modificou sua nomeclatura para Toxoplasma gondii

(NICOLLE; MANCEAUX, 1909).

Devido a sua forma de “quarto crescente” ou “meia lua”, o gênero foi

denominado Toxoplasma (do grego taxon=arco) e o nome gondii foi dado em

referência ao roedor onde o parasito foi isolado (BLACK; BOOTHROYS, 2000).

Existe somente uma espécie de Toxoplasma, T. gondii e existem

centenas de cepas e pelo menos três linhagens deste parasito, com a

19

patogenicidade variando entre as diferentes espécies de animais (DUBEY,

2010). T. gondii possui uma grande diversidade genética. Estudos indicaram

que além dos três genótipos Ι, ΙΙ e ΙΙΙ, apresenta ainda genótipos recombinantes

ou com alelos atípicos, tanto nas Américas quanto na Europa (LANGONI et al.,

2001; DUBEY, 2012).

No Brasil os genótipos são geneticamente mais diversificados, com

praticamente ausência de genótipos clonais, apresentando combinações de

alelos das linhagens I, II e III, assim como alelos ausentes em outras regiões

do mundo, chamados de atípicos (PENA et al., 2008; DUBEY; SU, 2009).

Os primeiros relatos de cães positivos para toxoplasmose, ocorreram na

Itália em 1910 descrita por Mello e no Brasil em 1911 por Carini, possuindo

essa espécie uma alta suceptibilidade a infecção (BARBOSA, 2003).

3.1.1.1 Transmissão

A transmissão da toxoplasmose pode ocorrer de três formas principais:

ingestão de tecidos de animais infectados, contendo cistos do parasito, através

de carne crua ou mal cozida, fonte de infecção comum para hospedeiros

definitivos e intermediários; pela ingestão de oocistos eliminados nas fezes de

gatos, através de água e alimentos contaminados, e; terceiro, a infecção

congênita, transplacentária, que pode ser causa de aborto, natimortos ou

mortalidade neonatal (SHERDING, 2003). A transmissão transplacentária pode

ocorrer quando a gestante tiver os taquizoítos circulantes na corrente

sanguínea, o que é comum na infecção primária (LANGONI et al., 2006).

Mulheres que entraram em contato com o agente antes da gravidez geralmente

não infectam seus fetos (MONTAÑO et al., 2010).

Os cães podem atuar como vetores mecânicos por xenosmofilia e,

ainda, em certas partes do mundo, a sua carne é consumida por humano. O

hábito de rolar no chão e até mesmo em cima de fezes pode contaminar os

pelos, podendo transmitir os oocistos esporulados do parasito para pessoas,

principalmente crianças (ETHEREDGE et al., 2004). Estudos indicam alta

soropositividade nesses animais, significando que os mesmos caçaram e se

infectaram ou receberam carne crua ou mal-cozida contendo cistos ou até

mesmo que houve contaminação ambiental por oocistos esporulados, assim os

20

cães podem servir como sentinela para contaminação ambiental (DUBEY et al.,

2007, DUBEY; JONES, 2008; SALB et al., 2008, CARLOS et al., 2010).

3.1.1.2 Ciclo Biológico

No seu ciclo, T. gondii se apresenta sob três formas evolutivas: os

taquizoítos, bradizoítos e esporozoítos (DUBEY, 1998).

Os taquizoítos são estruturas de rápida multiplicação e que ocorrem na

infecção aguda, sendo também denominada forma proliferativa. Quando o

número de taquizoítos se tornam excessivos, a célula infectada se rompe e

esses organismos intracelulares são liberados para invadir outras células (

DUBEY, 2012).

Os bradizoítos são confinados em cistos teciduais, principalmente em

músculos esqueléticos e cardíacos, sistema nervoso e olhos, presentes

durante a fase crônica da infecção, sendo também denominada cistozoítos

(DUBEY, 1998; DUBEY, 2008).

Os oocistos são produzidos nas células intestinais de felídeos não

imunes e eliminados imaturos junto com as fezes. No solo, os oocistos passam

por processo de esporulação em período de um a cinco dias, e tornam-se

infectantes ao homem e aos animais. O oocisto possui uma parede bastante

resistente às condições do meio ambiente (LANGONI et al., 2006).

Toxoplasma gondii apresenta dois tipos de reprodução: uma assexuada

em células nucleadas no hospedeiro intermediário e definitivo, e outra sexuada,

ou coccidiana, no epitélio intestinal de felídeos (NEVES, 2010).

Cerca de oito horas após a ingestão das formas infectantes, as mesmas

já estão interiorizadas nas células (fagocíticas e não fagocíticas) do novo

hospedeiro, dentro do vacúolo parasitário, iniciando o processo de reprodução

assexuada por endodiogenia. A reprodução se repete rapidamente, rompendo

as células e os taquizoítos produzidos invadem várias células nas

proximidades, ou à distância, levados pela circulação sanguínea ou linfática

(DUBEY et al., 1998).

Os taquizoítos, após um número desconhecido de divisões, dão origem

a outro estágio denominado de bradizoítos, responsáveis pela formação dos

cistos teciduais. Os cistos normalmente se desenvolvem a partir de seis a sete

21

dias após a infecção nos hospedeiros intermediários contaminados por

oocistos ou cistos de outros tecidos (DUBEY et al. 1998). O interior dos cistos

pode conter centenas de bradizoítos (DUBEY, 2010). Os cistos são mais

prevalentes em tecidos musculares e nervosos, incluindo o cérebro,

musculatura esquelética e cardíaca, embora cistos teciduais possam se

desenvolver em diversos órgãos, incluindo pulmões, fígado e rins, e podem

persistir durante toda a vida do hospedeiro (DUBEY et al., 1998). Devido a sua

localização, cistos teciduais mostram-se importantes no ciclo de vida do T.

gondii, pois hospedeiros carnívoros podem ser infectados pela ingestão de

carne contaminada (DUBEY, 2008).

A reprodução sexuada ocorre quando um felino, não imune, geralmente,

ao caçar animais que estejam na fase aguda ou crônica da toxoplasmose,

ingere taquizoítos, bradizoítos ou oocistos. Qualquer uma das formas

infectantes ingeridas podem penetrar no epitélio intestinal, onde se reproduz

por endodiogenia, seguida de merogonia, produzindo o meronte. A célula

parasitada se rompe e libera os merozoítos, que penetram em outras células

epiteliais, realizando até 5 merogonias, até estarem prontos, dando início à

formação de gametócitos, ou seja, início da reprodução sexuada. O

microgameta (masculino) móvel sai de sua célula e se dirige para uma célula

que contenha um macrogameta (feminino), penetrando aí para formar o zigoto;

essa forma produz uma parede dupla, dando origem ao oocisto. Esse, ainda

imaturo, romperá a célula epitelial em poucos dias e será eliminado junto com

as fezes do animal (Figura 1).

22

Figura 1- Ciclo biológico deToxoplasma gondii.

Fonte: NEVES, 2010.

3.1.1.3 Sinais clínicos

Quando a toxoplasmose foi descrita pela primeira vez em uma cadela,

ela apresentava febre, anorexia, emagrecimento, anemia, vômito e diarréia.

Também foi encontrado edema disseminado, nodulos com parasitas nos

pulmões, exsudato torácico sero-sanguinolento, úlceras intestinais e hipertrofia

de fígado, baço, e linfonodos mesentéricos, no exame post mortem (MELLO,

1910).

A toxoplasmose canina, na maioria das vezes, é secundária a uma

infecção ou imunossupressão. Geralmente, é vista como uma complicação da

cinomose, em especial em cães com sinais neurológicos. Em filhotes ou cães

imunossuprimidos com infecção generalizada, a sintomatologia é aguda e os

animais podem vir a óbito em uma semana. Os sinais clínicos podem ser:

febre, linfoadenopatia, vômito, diarréia, tosse e desconforto respiratório, dor

abdominal e icterícia, irregularidades cardíacas, uveíte e sinais neurológicos,

como inclinação da cabeça, nistagmo, ataxia e acessos convulsivos. Os

taquizoítos podem atravessar a placenta e causar infecção fetal nos animais

prenhes, T. gondii pode ser causa de aborto em cadelas (McCANDLISH, 2001).

23

3.1.1.4 Diagnóstico

Classicamente, o diagnóstico laboratorial da toxoplasmose tem se

baseado na sorologia, histologia, ensaio biológico, diagnóstico molecular e

exame parasitologico de fezes (gatos). Entretanto, a evidenciação do parasita

pela demonstração de seus componentes, como antígenos e segmentos de

DNA, é de alto valor diagnóstico (CAMARGO, 1996).

A Reação de Imunofluorescência indireta (RIFI) é a mais utilizada para

o diagnóstico da toxoplasmose, é um dos melhores métodos de diagnóstico

para a toxoplasmose, sendo sensível e segura, podendo ser usada, tanto na

fase aguda (pesquisa de IgM), como na fase crônica (pesquisa de IgG). Uma

vantagem muito importante na realização do teste é não requerer organismos

vivos, sendo, portanto, a execução mais segura (CAMARGO, 1996). Títulos ≥

16 são considerados positivos para T.gondii em cães (DUBEY, 2010). Também

pode-se fazer levantamentos de anticorpos das classes IgG, IgM, IgA e IgE

pelos métodos de Ensaio Imunoenzimatico (ELISA), quimioluminescência,

hemaglutinação indireta (HAI), Fixação de Complemento (FC) e teste Sabin-

Feldmann (GRANATO, 2008).

3.1.1.5 Epidemiologia

Estudos soroepidemiológicos em diferentes partes do mundo têm

demonstrado a infecção canina por T. gondii, sendo esta bastante comum, com

prevalência que varia entre 20 a 91% (MELLO, 1910; CABRAL et al., 1998;

TENTER et al., 2000; DUBEY, 2010). Devido ao hábito de alimentação

carnívora, os cães são considerados animais de elevada receptividade para o

parasito. O estreito e frequente contato desses animais com humanos é um

fato de extrema importancia para a cadeia epidemiológica da infecção humana

e precisa de atenção especial (LAPPIN, 2004).

A soropositividade a T. gondii em cães é relativamente alta no Brasil,

demonstrando a necessidade de realizar mais estudos com esse parasito

(Tabela 1).

24

Tabela 1- Valores de ocorrência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em

caninos de diferentes estados brasileiros, técnicas e respectivos autores.

Fonte Ano Cidade e estado BR Técnica* N° cães analisados

% cães positivos

BARBOSA et al. 2003 Salvador-BA ELISA 225 63,5

SOUZA et al. 2003 Paraná MAT 1244 21,3

AZEVEDO et al. 2005 Campina Grande- PB RIFI 286 45,1

MOURA et al. 2009 Lages e Balneário Camboriú- SC

RIFI 400 22,3

CARLOS et al. 2010 Itabuna e Ilhéus- BA HAI 529 36,5

ARAÚJO et al . 2011 Alto Paraíso- PR MAD 42 54,8

ZULPO et al. 2012 Londrina- PR RIFI 112 59,8

COELHO et al. 2013 São Paulo – SP RIFI 84 5,9

PAULAN et al. 2013 Ilha Solteira- SP RIFI 93 47,3

SORTE et al. 2015 Cuiabá- MT RIFI 269 48,7

* MAT - Teste de Aglutinação Modificado, RIFI- Reação de Imunofluerescência Indireta, HAI- Teste de Hemaglutinação Indireta, MAD- Método de Aglutinação Direta, ELISA- Ensaio Imunoenzimático Indireto.

Variáveis como raça não definida, idade, acesso à rua, tipo de

alimentação (dieta caseira) e presença de gatos na residência são fatores

predisponentes para a infecção por T. gondii (BARBOSA et al., 2003;

AZEVEDO et al., 2005; MOURA et al., 2009, CARLOS et al., 2010). Os cães

são onívoros carniceiros e quando possuem acesso à rua, apresentam maior

chance de contaminação, pois têm acesso a diversos locais e formas de

alimentação diferentes todos os dias (SOUZA et al., 2003; MOURA et al., 2009;

CARLOS et al., 2010)

Vale salientar que, animais que tem acesso ao médico veterinário,

tornam-se menos expostos a possíveis fatores de risco, pois o proprietário

recebe orientações sobre hábitos de higiene e alimentares além da posse

responsável. A alimentação comercial, a fonte de água controlada, além de

cuidados de higiene e saúde, também minimizam os fatores de risco da doença

(CARLOS et al., 2010).

3.1.2 Leishmania spp.

Leishmania spp. pertence a ordem Kinetoplastidae, Família

Trypanossomatidae, são protozoários flagelados que causam doenças

25

cutâneas, mucocutâneas e viscerais em cães, seres humanos e outros

mamíferos (CAMARGO et al., 2007).

Duas espécies do complexo donovani transmitem a doença para o

homem: Leishmania donovani e Leishmania infantum (= L. chagasi). Apresenta

como hospedeiros vertebrados os cães e o homem e, como hospedeiro

invertebrado insetos pertencentes ao gênero Lutzomyia no continente

americano e Plhebotomus na Eurásia e África (ALVAR, 2004).

A leishmaniose é considerada como zoonose, que inclui animais como

reservatórios no ciclo de transmissão, e também como antropozoonose, na

qual o homem se apresenta como fonte de infecção para o mosquito vetor

(ALONSO, 2011).

A leishmaniose visceral (LV), leishmaniose muco-cutânea (LMC),

leishmaniose cutânea difusa (LCD) e leishmaniose cutânea (LC), são fenótipos

associados a doença (BERN; MAGUIRE, 2008). A mais severa dentre todas as

formas clínicas da doença é a leishmaniose visceral (LV) conhecida também

como calazar ou febre dum-dum (COURA, 2005; SRIVIDYA et al., 2012).

O cão desempenha papel fundamental na epidemiologia da LV, por ser

reservatório, devido á riqueza das formas amastigotas na pele (MOREIRA et

al., 2007; CAMARGO et al., 2007). Possui papel ativo na transmissão da

doença para o homem, mesmo os assintomáticos, e a infecção em cães é um

importante parâmetro na estimativa de casos humanos (COELHO et al., 2013).


A Leishmaniose é transmitida através da picada da fêmea do

flebotomínio da espécie Lutzomyia longipalpis infectada. No ambiente silvestre

as principais fontes de infecção para este vetor, são a raposa (Dusicyon

vetulus) o cachorro do mato (Cerdocyon thous) e os marsupiais do gênero

Didelphis spp.. A participação de outras espécies de animais como galinhas,

bovinos, eqüídeos, caprinos, ovinos, suínos e gatos na epidemiologia da

Leishmania parece estar associada à capacidade de atração dos vetores ao

peridomicílio (CAMARGO et al., 1969; CAMARGO et al., 2007).

No ambiente urbano o cão doméstico (Canis familiares) é o principal

reservatório da Leishmania infantum (=L. chagasi), cujas enzootias costumam

26

preceder a ocorrência em humanos. Mesmo assintomáticos os cães são fontes

de infecção para os flebotomíneos e, consequentemente, têm papel ativo na

transmissão da doença (MOREIRA et al., 2007; COELHO et al., 2013).


Os cães, mesmo assintomáticos, são fontes de infecção para os

flebotomíneos (insetos vetores da leishmaniose) e, conseqüentemente, têm

papel ativo na transmissão da doença. O mosquito ao realizar o repasto

sanguíneo se infecta com a forma amastigota. Uma vez no tubo digestivo do

inseto, estas formas diferenciam-se e replicam-se em promastigota metacíclica

(infectante). Posteriormente, as formas promastigotas migram para a faringe

misturando-se com a saliva do inseto, que infecta o hospedeiro através da

picada (BRASIL, 2006; MAIA- ELKHOURY et al., 2008). No novo hospedeiro

essas promastigotas são fagocitadas por células do sistema monuclear

fagocitário, se transformam em amastigotas que se multiplicam por mitose. Os

macrófagos ficam repletos de formas amastigotas, ocorrendo então a

disseminação hematogênica para outros tecidos ricos em células do sistema

mononuclear fagocitário (MOREIRA et al., 2007; HARHAY et al., 2011) (Figura

2).

Figura 2 – Ciclo Biológico de Leishmania spp.

Fonte: Center for Disease Control and Prevention, 2016

27


As alterações clínicas mais freqüentemente observadas em cães com

leishmaniose são linfadenopatias, alterações dermatológicas, hepatomegalia e

esplenomegalia, emaciação e onicogrifose, sendo constatados quadros de

artrite, alterações neurológicas e respiratórias, porém há uma grande

porcentagem de animais assintomáticos ou oligoassintomáticos (MOREIRA et

al., 2007; TRONCARELLI et al., 2009).

O período de incubação da doença é variável, tanto para seres humanos

como para cães. No cão varia de três a sete meses, podendo ocorrer anos

após a infecção,em alguns casos. Em humanos pode variar de 10 dias a 24

meses, em média de dois a quatro meses (BEPA, 2008).


Para a leishmaniose, pelo fato de existir animais assintomáticos ou

oligoassintomáticos e ser uma enfermidade que possui sinais comuns a outras

doenças, o diagnóstico clínico é difícil e inconclusivo. Atualmente, realizam-se

testes parasitológicos, testes sorológicos e moleculares. O diagnóstico

parasitológico é realizado a partir da observação direta de formas amastigotas

do parasito em esfregaços de órgãos linfóides (linfonodos ou medula óssea),

de escarificações de pele, biopsias de baço ou fígado (COIRO, 2014). Os

Testes sorológicos como a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), o

teste de hemaglutinação e o teste de ELISA são muito utilizados (MOREIRA et

al., 2007; COELHO et al., 2013). A RIFI, possui sensibilidade de 82 a 95% e

especificidade de 78 a 92% e é o método mais utilizado no Brasil e

preconizado pelo Ministério da Saúde. Há também o teste sorológico Dual Path

Plataform (DPP) que é um teste rápido qualitativo, imunocromatogográfico com

antígenos recombinantes, recomendado pelo Ministério da Saúde como rotina

para todos os Centros de Controle de Zoonoses a nível nacional (COELHO et

al., 2013). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), com amplificação e

identificação seletiva da seqüência de DNA de interesse, é uma técnica

28

molecular que além de detectar o agente, distingue o tipo de Leishmania, o que

não é possível com o teste sorológico (MOREIRA et al., 2007).

3.1.2. Epidemiologia

Em todo o mundo, e no Brasil, o número de cães infectados com

Leishmania spp. varia de 20 a 90% (BIGELI et al., 2012).

A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é considerada uma endemia nas

áreas rurais do Brasil. A destruição das florestas em larga escala, a adaptação

do flebotomíneo a novos ambientes e a migração das áreas rurais para o meio

urbano, contribuiu para que o ciclo de transmissão chegasse ao meio urbano

(MAIA- ELKHOURY et al., 2008; HARHAY et al., 2011)

O controle da doença possui grande complexidade, devido ao padrão

epidemiológico diversificado e a adoção de difíceis medidas como: a redução

de vetores, eliminação de reservatórios, proteção pessoal, ações de vigilância,

dificuldade na obtenção de diagnóstico rápido e seguro. No Brasil, a eliminação

de cães infectados é recomendado pelo Ministério da Saúde como medida de

controle da LV (BEPA, 2008; HARHAY et al., 2011).

Cães soropositivos para este agente etiológico estão distribuídos de

maneira endêmica no Brasil (Tabela 2).

Tabela 2- Valores de ocorrência de anticorpos anti- Leishmania em caninos de

diferentes estados brasileiros, técnicas e respectivos autores.


% cães positivos

BEZERRA et al. 1996 Ceará MAD 58 58,6

LUCIANO et al. 2009 Bauru - São Paulo RIFI 150 62,7

PAULAN et al. 2013 Ilha Solteira - São Paulo

RIFI 93 37,6

FIGUEIREDO et al. 2014 Pará ELISA/RIFI 435 19,7

CARVALHO et al. 2015 Ilhéus - Bahia ELISA 560 41,7

LEÇA JÚNIOR et al. 2015 Buerarema – Bahia RIFI 292 50,3

D’ANDREA et al. 2015 Presidente Prudente - São Paulo

ELISA 4547 11,2

MENDONÇA; BATISTA; ALVES.

2015 Teresina – Piauí ELISA 70 78,2

PIMENTEL et al. 2015 Petrolina- Pernambuco

ELISA 600 19

JUSI et al. 2015 Jaboticabal – São Paulo

ELISA 482 63

* RIFI- Reação de Imunofluerescência Indireta, MAD- Método de Aglutinação Direta, ELISA- Ensaio Imunoenzimático Indireto.

29

Outros aspectos importantes a serem considerados são aqueles

relacionados ao meio ambiente, tais como terrenos baldios em torno da casa, a

presença de pequenos roedores, animais silvestres e do vetor da doença como

fatores de risco associados à infecção. Tais fatores facilitam a ligação de

transmissão entre animais silvestres e o ambiente peridomiciliar, pois animais

podem atuar tanto como um reservatório quanto como uma fonte de alimento

para o vetor, o que possibilita a infecção em humanos e cães (BRANDÃO-

FILHO et al.; 2003; BRASIL, 2010). A presença de energia elétrica nas casas

também revelou-se como um fator de risco para leishmaniose, e aumentou a

possibilidade de exposição de cães (LEÇA JÚNIOR et al., 2015).

3.1.3. Ehrlichia canis

Ehrlichia canis pertence à ordem Rickttsiales, família Anaplasmataceae,

gênero Ehrlichia (CAMARGO et al., 2007). Atualmente o gênero Ehrlichia

contempla cinco espécies: E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris e E.

ruminantium. São bactérias gram-negativas, parasitos intracelulares

obrigatórios de células hematopoiéticas maduras ou imaturas, especialmente

do sistema fagocitário mononuclear, tais como monócitos e macrófagos, e para

algumas espécies, neutrófilos e células endoteliais (DUMLER et al., 2001).

Os hospedeiros vertebrados mais comuns são os da família Canidae

(cães, coiotes, raposa e chacal) e os carrapatos são os vetores. Os cães são

infestados frequentemente por carrapatos e assim estão expostos a se infectar

com E. canis (LABRUNA; PEREIRA, 2001). No Brasil a erliquiose canina foi

diagnosticada pela primeira vez em Belo Horizonte, MG por COSTA (1973). A

distribuição da doença está relacionada com a distribuição do carrapato vetor,

ocorrendo na Ásia, África, Europa e Américas (KEEFE et al., 1982, LABRUNA;

PEREIRA, 2001).


O carrapato marrom do cão, Rhipicephalus sanguineus, lato sensu no

Vet Parasitology, é o principal vetor e reservatório da doença, é endêmico em

praticamente todas as regiões do Brasil. Esses artrópodes contaminam-se ao

30

realizar o repasto sanguíneo em um cão infectado. Essa infecção pode ocorrer

em qualquer estágio de parasitemia do cão e a transmissão é transestadial

(DAGNONE et al., 2001; HARRUS et al., 2010).

Cães sadios são infectados quando os carrapatos realizam o repasto

sanguíneo, inoculando a secreção salivar contaminada com E. canis no interior

do hospedeiro. (COSTA, 1973; ANDEREG; PASSOS, 1999).

Em condições experimentais, o carrapato Dermacentor variabilis

também foi capaz de transmitir E. canis (HARRUS; WANER, 2010). No Brasil,

COSTA Jr et al. (2007) incluíram também Amblyomma cajennense (=A.

sculptum), nos Estados Unidos, como potencial vetor de E. canis em áreas

rurais.

Os cães são os únicos hospedeiros de importância para a manutenção

das populações de R. sanguineus (LABRUNA ;PEREIRA, 2001).


As larvas, as ninfas e carrapatos adultos ao se alimentarem de um

hospedeiro na fase aguda da doença, ingerem leucócitos infectados pela E.

canis, mais tarde esses microorganismos se disseminam por hemócitos do

intestino do artrópode para a glândula salivar. No repasto sanguíneo carrapatos

inoculam secreção salivar contaminada nos cães (DAGNONE et al., 2001).

Nos cães infectados o ciclo da E. canis ocorre em monócitos e possui

três estádios: no primeiro, os corpúsculos elementares entram nos monócitos

por fagocitose. Esses corpúsculos crescem e se dividem dentro dos limites do

fagossomo, pois a fusão fagolisossomal não ocorre em células infectadas. A

multiplicação ocorre por fissão binária. O segundo estádio ocorre de três a

cinco dias após infecção, onde um pequeno número de corpúsculos

elementares, denominados corpúsculos iniciais são observados como

inclusões pleomórficas. O terceiro estágio ocorre entre sete a 12 dias

subseqüentes, onde há o crescimento adicional e multiplicações. Os

corpúsculos iniciais desenvolvem-se para inclusões maduras, que na

microscopia óptica têm aspecto de “amora”, as chamadas mórulas, que

tipificam o gênero. Os monócitos infectados, geralmente apresentam mórulas e

cada mórula contém vários corpúsculos elementares. As mórulas liberam esses

31

corpúsculos quando as células infectadas se rompem ou então são liberadas

por exocitose e o ciclo infeccioso é repetido (NYINDO et al., 1971; DAGNONE

et al., 2001; ZHANG et al., 2006) (Figura 3).

Acrescenta-se que o parasito localiza-se nas células reticulo endoteliais

do fígado, baço e linfonodos, onde ocorre a replicação primária em macrófagos

mononucleares e linfócitos (SWANGO et al., 1989).

Figura 3. A. Ciclo Biológico de E. canis. B. Célula infectada por Ehrlichia canis.

Fonte: http://slideplayer.es/slide/1105531

A

B

32


Os cães infectados por E. canis podem ser classificados clinicamente em

quatro fases: assintomática, fase aguda, subclínica e crônica. O período de

incubação da erliquiose canina é de 8 a 20 dias (HARRUS et al., 2004).

Durante a fase assintomática o cão apresenta-se aparentemente

normal. Na fase aguda, que dura de duas a quatro semanas, as riquétsias

replicam-se nos leucócitos e se replica por fissão binária antes de se

disseminar para outros órgãos do hospedeiro. Após essa fase o parasita se

espalha através da circulação por diversos órgãos. Animais apresentam

sintomas inespecíficos incluindo febre, secreção ocular e nasal e também

sinais clínicos normalmente de grande comprometimento como depressão,

perda de peso, anorexia, febre, esplenomegalia, linfonodomegalia, vasculite,

sinais neurológicos, musculares, oculares e de poliartrite (ANDEREG;

PASSOS, 1999; DAGNONE et al., 2001; HARRUS; WANER , 2010).

Após a fase aguda o animal pode se curar, ou entrar na fase subclínica,

onde os sinais clínicos desaparecem, mas a riquétsia se mantém no

organismo. Esta fase pode persistir por anos (NYINDO et al., 1971; DAGNONE

et al., 2001). Cães imunocompetentes podem eliminar o parasita, enquanto que

os cães com resposta imunológica insuficiente entrarão na fase crônica da

doença. A fase crônica desenvolve-se em alguns animais após a fase

subclínica e pode variar de leve a severa. Nesta fase normalmente há

complicações da infecção e exacerbação dos sintomas agudos como

sangramentos por mucosas e conjuntivas (DAGNONE et al., 2001; CASTRO et

al., 2004, NEER, 2006, UENO et al., 2009).

Na fase crônica severa, ocorre comprometimento da medula óssea com

pancitopenia, o óbito por hemorragias secundárias à trombocitopenia ou

infecções secundárias podem ocorrer nesta fase (DAGNONE et al., 2001;

HARRUS et al., 2010).


Para a erliquiose, o diagnóstico clínico dos cães, baseia-se nas

alterações clínicas, no histórico e nas alterações hematológicas. O diagnostico

33

é confirmado com a visualização de inclusões intracitoplasmáticas em

leucócitos (mórulas) em esfregaços sanguíneos, porém é um diagnóstico difícil.

Mórulas de E. canis podem ser detectadas em monócitos por um curto período

de tempo, mas geralmente não são observadas durante as fases subclínica e

crônica da infecção. Outro tipo de diagnóstico é o isolamento e cultura da

bactéria, mas possui um resultado muito lento, de 30 a 70 dias. Teste

sorológicos como ELISA e RIFI são bastante utilizados, bem como o

diagnóstico molecular (HARRUS et al., 2004; HARRUS; WANER, 2010). Kits

sorológicos utilizados na detecção da erliquiose canina, como, o “kit”

Immunocomb, baseado na técnica de “Dotblot-ELISA”, detecta anticorpos da

classe IgG específicos (NAKAGHI et al., 2008). O teste de “Dotblot enzyme

linked-immunoassay”(Dotblot-ELISA) é uma técnica sensível para a detecção

de anticorpos no soro. A técnica utiliza antígenos purificados de cultura de

células DH 82 infectadas com E. canis aderidos a microplacas. O “Dotblot-

ELISA” é tão sensível e específico quanto a RIFI. Os resultados são de fácil

leitura por pessoal não treinado e proporcionam um registro permanente

(ANDREG; PASSOS,1999).

3.1.3.5 Epidemiologia

Ehrlichia canis possui potencial zoonótico, com contaminação do homem

e envolvimento de cães e infestações por carrapatos (PEREZ et al., 2006).

Segundo Labruna e Pereira (2001), os cães podem ser carreadores

deste agente em regiões endêmicas e houve uma grande expansão de

populações do carrapato R. sanguineus nas últimas décadas, o que torna bem

provável que a doença venha ocorrendo frequentemente nos cães.

Estudos epidemiológicos (Tabela 3) sobre a infecção por E. canis no

Brasil estão sendo realizados para melhor avaliar os históricos clínicos, idade,

sexo e raça dos cães e a presença de carrapatos, na tentativa de se

estabelecer fatores de riscos para a doença (DAGNONE et al., 2003; TRAPP et

al., 2006).

34

Tabela 3- Valores de ocorrência de anticorpos anti- Ehrlichia canis em caninos

de diferentes estados brasileiros, técnicas e respectivos autores.


% cães positivos

TRAPP et al. 2006 Rio Grande do Sul ELISA 381 23

AGUIAR et al. 2007 Monte Negro- Rondônia RIFI 314 31,2

CARLOS et al. 2011 Ilhéus e Itabuna- Bahia ELISA 200 36

KRAWCZAK et al. 2012 Santa Maria – Rio Grande do Sul

RIFI 316 4,43

SOUSA et al. 2013 Mato Grosso do Sul RIFI 60 65

PAULAN et al. 2013 Ilha Solteira - São Paulo RIFI 93 75,3

WITTER et al. 2013 Mato Grosso RIFI 77 70,1

SPOLIDORIO et al. 2013 Amazonia RIFI 129 16,2

GIRARDI et al. 2014 Cuiabá – Mato Grosso RIFI 58 94,8

GUEDES et al. 2015 Ituberá-Bahia RIFI 379 32,7

* RIFI- Reação de Imunofluerescência Indireta, ELISA- Ensaio Imunoenzimático Indireto.

3.2 Coinfecções

Devido a abundância, a atividade dos vetores e os períodos de

transmissão serem semelhante, além da presença dos cães nas áreas

endêmicas, a infecção desses animais pela Leishmania spp., E. canis e T.

gondii coexistem (COX, 2001).

Estudos no Brasil demonstram alta frequencia de infecção por T. gondii,

Leishmania spp e E. canis em cães variando de 3 a 95% (DUBEY, 2010; HILL

& DUBEY, 2002; GRANATO, 2008; ZULPO et al., 2012; COELHO et al.,

2013).

Coelho e colaboradores (2013) encontraram coinfecção por Leishmania

spp. em 20% (1/5) dos animais positivos para o T. gondii e 66,6% (2/3) para N.

caninum e um cão macho jovem positivo para toxoplasmose apresentou

mórulas de Ehrlichia spp.

Em um estudo realizado por pesquisadores do Hospital Veterinário da

Universidade Federal de Cuiabá, dos seis cães soropositivos para T. gondii,

cinco apresentaram coinfecção por E. canis (GIRARDI et al., 2014).

Outro estudo, realizado em um assentamento rural no município de Ilha

Solteira em São Paulo, 93 amostras de soro de cães foram coletadas. Um cão

(1,1%) apresentou sorologia positiva para os cinco parasitas estudados, e a

35

maioria dos cães (61,3%) mostraram anticorpos reativos a partir de 2 a 3

parasitas com as seguintes associações: Leishmania × Babesia × Toxoplasma

ou Leishmania × Ehrlichia × Toxoplasma (48,6 %) ou Leishmania × Babesia ×

Ehrlichia (31,4%). A associação entre dois parasitas variou de 62,9% para

74,3% (PAULAN et al., 2013).

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Local de Realização do Estudo

O estudo foi realizado nos seguintes municípios da Bahia: Dias D’ávila

(CCZ), Itabuna (CCZ), Ilhéus (CCZ), Salvador (semidomiciliados), Feira de

Santana (ONG), Jequié (semidomiciliados), Eunápolis (CCZ), Una

(semidomiciliado) e Brumado (ONG) do estado da Bahia. O estado da Bahia

localiza-se na região Nordeste do Brasil. Possui 14.016.906 habitantes, uma

área de 564.733,177 Km² e 417 municípios e esta dividido em 7 mesorregiões

(Figura 4 )(IBGE, 2010). A população canina do estado esta estimada em 2,1

milhoes (SESAB, 2014).

Figura 4 – Mapa do estado Bahia - Mesorregiões baianas

Fonte: Fonte: http://slideplayer.com.br/slide/5635628

36

4.2 Coleta do Material Biológico

Amostras sanguíneas de 300 cães foram coletadas no período de

novembro de 2014 a novembro de 2015, sendo esses animais originados de

Centro de Controle de Zoonoses (CCZ), Organizações não-governamentais

(ONG) de defesa de animais ou cães que tinham proprietários, mas tinham

acesso a rua (semidomiciliados) dos seguintes municípios da Bahia: Dias

D’ávila (CCZ), Itabuna (CCZ), Ilhéus (CCZ), Salvador (semidomiciliados), Feira

de Santana (ONG), Jequié (semidomiciliados), Eunápolis (CCZ), Una

(semidomiciliado) e Brumado (ONG).

Os animais eram heterogêneos em idade, sexo e raça. Foram coletados

3mL de sangue por punção venosa, cefálica ou jugular de cada animal,

acondicionado em tubo sem EDTA para obtenção do soro sanguíneo e

realização da sorologia. Os valores obtidos em todas as análises foram

tabulados em pacote Excel.

O projeto obedeceu aos princípios de bioética e bem estar animal do

Comitê de Ética no Uso dos Animais (CEUA-UESC), recebendo o número de

protocolo 12/018.

4.3 Coleta de Dados

As informações de identificação dos animais (sexo, idade e cidade de

origem), foram anotadas em planilhas para controle dos resultados e para

posterior repasse de informações.

4.4 Sorologia para Toxoplasma gondii

Para realização da sorologia para pesquisa de anticorpos contra T.

gondii foi utilizada Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), considerando

como ponto de corte a diluição de 1:16. Foi utilizado conjugado anti-IgG canino

Sigma (Anti-DogIgG – F4262, Sigma-Aldrich ®) na diluição de 1:128. Para a

leitura das lâminas, foi utilizado microscópio com sistema de epifluorescência

(OLYMPUS, BX 51®).

37

Foram consideradas positivas as reações com completa fluorescência

na periferia dos taquizoítos. As lâminas sensibilizadas com taquizoítos da cepa

RH, fixadas em metanol foram confeccionadas no laboratório do Hospital

Veterinário da Universidade Estadual de Santa Cruz e sendo os controles

positivo e negativo provenientes de amostras de soros de cães deste

experimento, submetidas aos testes HAI e RIFI. O protocolo de realização da

RIFI encontra-se no Anexo A.

4.5 Sorologia para Leishmania spp.

Para realização da sorologia para pesquisa de anticorpos contra

Leishmania spp. foi utilizada Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI),

considerando como ponto de corte a diluição de 1:40. Foi utilizado conjugado

anti-IgG canino Sigma (Anti-DogIgG – F4262, Sigma-Aldrich ®) na diluição de

1:128. Para a leitura das lâminas, foi utilizado microscópio com sistema de

epifluorescência (OLYMPUS, BX 51®).

Foram consideradas positivas as reações com completa fluorescência

na periferia das promastigotas. As lâminas sensibilizadas com promastigotas

de L. infantum, fixadas (formol 2%), foram confeccionadas no laboratório

Imunodot e os controles positivo e negativo foram provenientes do laboratório

de Biomanguinhos. O protocolo de realização da RIFI encontra-se no Anexo B.

4.6 Sorologia para Ehrlichia canis

Para realização da sorologia para pesquisa de anticorpos contra E. canis

foi utilizado o teste de ELISA IMUNOTEST® Ehrlichia canis do laboratório

Imunodot, conforme orientações do fabricante. A leitura da reação foi realizada

em um leitor de microplacas de ELISA (Microplate Reader MRX TC Plus,

Dynex Technology), a um comprimento de onda de 405 nm. O protocolo de

realização do teste ELISA encontra-se no Anexo C.

38

4.7 Análise Estatística

Para identificar fatores de risco associados à infecção por T. gondii, foi

conduzida uma análise bivariada usando o Teste do Qui-quadrado e o Teste

Exato de Fisher com nível p=0,05, utilizando o programa estatístico EPI-INFO

versão 7.1.5.

5 RESULTADOS

5.1. Soropositividade para T. gondii

Das 300 amostras coletadas 122 (40,66%) foram soropositivas frente à

RIFI. O título de anticorpos desses animais variou de 1:16 a 1:4096 (Tabela 4).

Tabela 4: Titulação dos soros, em número e porcentagem, positivos à

detecção de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em cães em municípios do

estado da Bahia.

Titulação NºAnimais %

16 3 2,46

32 8 6,56

64 31 25,41

128 23 18,85

256 33 27,05

512 3 2,46

1024 7 5,74

2048 6 4,92

4096 8 6,56

Total 122 100%

5.2. Soropositividade para Leishmania spp.

O número de animais sororeagentes frente à RIFI utilizando o antígeno

total de promastigotas de L. infantum foi 74 (24,66%). O título de anticorpos

desses animais variou de 1:40 a 1:160 (Tabela 5).

39

Tabela 5: Titulação dos soros, em número e porcentagem, positivos à

detecção de anticorpos anti-Leishmania spp. em cães em municípios do estado

da Bahia.

Titulação NºAnimais %

40 24 32,43

80 42 56,76

160 8 10,81

Total 74 100

5.3. Soropositividade para E. canis

A soropositividade de E. canis foi a maior em relação aos reagentes a T.

gondii e Leishmania. spp . Dos 300 animais amostrados 155 (51,60%)

apresentaram anticorpos anti-E. canis, no ELISA.

5.4. Co-soropositividade para Toxoplasma gondii, Leishmania spp. e Ehrlichia canis

Das 300 amostras dos cães, 4% mostraram-se soropositivos tanto para

T. gondii quanto Leishmania spp., 21% foram sororeagentes para T.gondii e E.

canis, 6,70% mostraram sorologia positiva para E.canis e Leishmania spp e 5%

dos animais foram soropositivos para os três agentes (Figura 4).

40

Figura 5. Positividade dos cães amostrados frente aos antígenos de

Toxoplasma gondii, Leishmania spp. e Ehrlichia canis.

Todas as mesorregiões apresentaram animais positivos para os três

agentes, porém com soropositividade variadas. Dentre as mesorregiões

analisadas, a do Centro Norte Baiano demonstrou maior soropositividade para

os três agentes analisados, seguida da mesorregião Centro-Sul Baiano. A

mesorregião do Sul Baiano apresentou a menor positividade para T. gondii e E.

canis e a mesorregião Metropolitana de Salvador apresentou menor

positividade para Leishmania spp. (Tabela 6, 7 e 8).

12 (4%)

41

Tabela 6 – Detecção de anticorpos anti- Toxoplasma gondii em cães e sua

distribuição no estado da Bahia, Brasil.

Mesorregião/Município Reativos Não reativos Total

n % n % N %

Mesorregião do Sul Baiano

58

38,7

92

61,3

150

50

Itabuna Ilhéus Una Eunápolis

30 8 10 10

37 30

58,8 40

51 19 7 15

63 70

41,2 60

81 27 17 25

27 9 5,6 8,4

Mesorregião do Centro-Norte Baiano

6

54,5

5

45,5

11

3,7

Feira de Santana

6 54,5 5 45,5

11 3,7

Mesorregião do Centro-Sul Baiano

35

41,7

49

58,3

84

28

Jequié Brumado

35 0

41,7 0

35 14

58,3 100

70 14

23,3 4,7

Mesorregião Metropolitana de Salvador

23

41,8

32

58,2

55

18,3

Salvador Dias D’Ávila

12 11

32,4 61,1

25 7

67,6 38,9

37 18

12,4 5,9

Total 122 40,66 178 59,33 300 100

42

Tabela 7 – Detecção de anticorpos anti- Leishmania spp. em cães e sua

distribuição no estado da Bahia, Brasil.

Mesorregião/Município Reativos. Não reativos. Total

N % n % n %


39

26%

111

74%

150

50


19 6 2 12

23,45 22,2 11,8 48

62 21 15 13

76,55 77,8

88,2 52

81 27 17 25

27 9 5,6 8,4


4

36,4

7

63,6

11

3,7

Feira de Santana

4 36,4 7 63,4

11 3,7


23

27,3

61

72,7

84

28

Jequié Brumado

17 6

24,3 42,85

53 8

75,7 57,15

70 14

23,3 4,7


8

14,55

47

85,45

55

18,3


2 6

5,5 33,3

35 12

94,5 66,7

37 18

12,4 5,9

Total 74 24,66 226 75,33 300 100

43

Tabela 8 – Detecção de anticorpos anti-E. canis em cães e sua distribuição no

estado da Bahia, Brasil

Mesorregião/Município Reativos Não reativos Total

N % n % n %


66

44

84

56

150

50


41 8 9 8

50,6 29,6 52,9 32

40 19 8 17

49,4 70,4 47,1 68

81 27 17 25

27 9 5,6 8,4


7

63,6

4

36,4

11

3,7

Feira de Santana

7 63,6 4 36,4

11 3,7


51

60,7

33

39,3

84

28

Jequié Brumado

44 7

62,9 50

26 7

37,1 50

70 14

23,3 4,7


31

56,4

24

43,6

55

18,3


16 15

43,2 83,3

21 3

56,8 16,7

37 18

12,4 5,9

Total 155 51,66 145 48,33 300 100

Entre os fatores analisados, observou-se associação entre a idade e a

soropositividade de Leishmania spp. e de E. canis (p = 0,05). Houve

associação de cães errantes com infecção por Leishmania (p.=0,01). Não

houve fatores associados a infecção pelo T. gondii e nenhuma associação

significativa relacionada aos agentes estudados e o sexo do animal foi

observada (Tabela 9).

44

Tabela 9 – Análise bivariada de fatores associados a infecção de Toxoplasma

gondii, Leishmania spp. e Ehrlichia canis em cães da Bahia.

Variáveis Animais Χ2 Valor de p OR IC 95%

Positivo Negativo

Leishmania spp.

Faixa etária 2,74 0,09* 5,9 0,77 – 45,4

≥ 01 ano 73 209

< 01 ano 1 17

Sexo 0,53 0,46 0,8 0,46 – 1,34

Macho 26 64

Fêmea 214 491

Errante 6,10 0,01 2,11 1,19 – 3,73

Sim 53 123

Não 21 103

Toxoplasma gondii

Faixa etária 1,94 0,16 2,5 0,80 – 7,84

≥ 01 ano 118 164

< 01 ano 4 14

Sexo 0,11 0,73 1,1 0,70 – 1,76

Macho 65 90

Fêmea 57 88

Errante 2,10 0,14 0,68 0,43 – 1,09

Sim 65 111

Não 57 67

Ehrlichia canis

Faixa etária 3,41 0,06* 3 1,02– 8,50

≥ 01 ano 150 132

< 01 ano 5 13

Sexo 0,1 0,74 1,1 0,70 – 1,74

Macho 82 73

Fêmea 73 72

Errante 1,08 0,29 0,76 0,48 – 1,20

Sim 86 90

Não 69 55

* Χ2- Teste Qui-Quadrado; p valor: probabilidade; OR: Chances de Ocorrer; CI 95%: 95% Intervalo de Confiança; * Teste Exato de Fisher p=0,05

45

6 DISCUSSÃO

A prevalência de cães com T. gondii encontrada neste estudo (40,66%)

foi similar a descrita por Azevedo et al. (2005) na Paraíba (45,1%), por Paulan

et al. (2013) em São Paulo (47,3%) e por Sorte et al. (2015) no Mato Grosso

(48,7%). Entretanto, foi maior que as encontradas por Moura et al. (2009) em

Santa Catarina (22,3%) e por Coelho et al. (2013) em São Paulo (5,9%) e

inferior as obtidas Zulpo et al. (2012) no Paraná, que encontraram prevalência

de 59,8%.

No Brasil, há uma grande variação nos valores de ocorrência de T.

gondii, variando de 3,1% (CHAPLIN et al., 1980) a 91% (GERMANO et al.,

1985). As diferenças observadas nos valores da prevalência podem ser devido

as características regionais geo-climáticas e fatores epidemiológicos, como

presença de felinos infectados, a idade, o cuidado com animais, aspectos

culturais, habitat e praticas sanitárias (LANGONI et al., 2006; CARLOS et al.,

2010).

Quando se comparam diferentes populações como cães domiciliados,

errantes e rurais, na infecção por T. gondii, verifica-se que cães rurais e

errantes têm maior chance de infecção, devido ao maior acesso a oocistos

esporulados (alimentos e água contaminada) ou cistos encontrados nas caças

(pequenos mamíferos ou pássaros) e em carcaça de açougues, carcaça de

animais abatidos em propriedades rurais e restos alimentares (CABRAL et al.,

1998; CARLOS et al., 2010).

A presença da infecção de T. gondii em cães indica um ambiente

contaminado por oocistos ou carnes contaminadas por cistos do parasita, e

como esses animais vivem no mesmo ambiente que as pessoas e se

alimentam das mesmas carnes, podem servir como sentinela da infecção

humana (DUBEY et al., 2007; SALB et al., 2008; DUBEY; JONES, 2008).

No presente trabalho a mesorregião do Centro - Norte Baiano

apresentou maior positividade para T. gondii, 54,5%(6/11) dos cães foram

soropositivos na RIFI. O números de amostras coletadas de cães nesta

mesorregião foi inferior as demais mesorregiões, provavelmente, interferindo

no resultado.

46

Em relação ao agente etiológico Leishmania spp., encontrou-se nesse

estudo a prevalência 24,66%, similar ao trabalho de Figueiredo et al. (2014) no

Pará (19,7%). E inferior aos estudos de Luciano et al. (2009) e Paulan et al.

(2013) em São Paulo com prevalência de (62,7%) e (37,6%), respectivamente.

A Bahia é um estado endêmico para leishmaniose canina, porém esse

resultado pode ter sofrido influencia dos cães residentes em Ilhéus e Una, onde

não há a presença de L. infantum, e em Salvador, onde o registro de casos

caninos ainda é baixo. Todavia, observa-se potencial para a transmissão dessa

zoonose, pois algumas cidades possuem fronteiras com regiões positivas, além

do intenso movimento migratório humano e animal e características

socioambientais favoráveis a expansão do vetor, e, conseqüentemente, da

doença.

O potencial de urbanização é demonstrado pela ocorrência de casos

(131) de leishmaniose visceral nos centros urbanos de importantes cidades do

Estado da Bahia, entre os quais: Feira de Santana, Serrinha, Jequié, Juazeiro,

Irecê, Camaçari e Salvador, correspondendo a 23,73% dos casos. No ano de

2015 as maiores incidências foram observadas em municípios da mesorregião

do Centro Sul Baiano e nos municípios da mesorregião do Centro Norte

Baiano, segundo Boletim epidemiológico da SUVISA/SESAB (2015),

corroborando com os resultados encontrados nesse trabalho, onde observou-

se cães com maior soropositividade para Leishmania spp. nestas

mesorregiões.

Os municípios estudados são áreas urbanizadas e mostraram

positividade para leishmaniose em cães, corroborando com estudos prévios já

realizados por Azevedo et al. (1996) e Carvalho et al. (2015) no estado da

Bahia.

Dentre os fatores de risco associados, Rondon et al. (2008) e Carvalho

et al. 2015 em seus estudos afirmam que animais mais velhos são mais

propensos a terem mantido contato com Leishmania spp., concordando com os

achados desse estudo. Cães com idade inferior a 1 ano tiveram menos tempo

de contato com o vetor e devem permanecer mais no ambiente doméstico, o

que também reduz a possibilidade de contato com o vetor.

Nesse estudo cães errantes capturados por CCZ’s ou mantidos pelas

ONG’s foram mais propensos a se infectar com Leishmania spp. (p= 0,01) do

47

que os cães semidomiciliados, demonstrando que se os animais que ficaram

na rua, mais expostos ao vetor, são mais propensos a terem a infecção, o

mesmo foi encontrado por CARVALHO et al. (2015).

A mesorregião do Centro - Norte Baiano apresentou maior positividade

para também para Leishmania spp., 36,4%(4/11) dos cães foram soropositivos

na RIFI, podendo ter relação com a quantidade de amostras coletadas nessa

mesorregião.

Para E. canis, foi encontrada a prevalência de 51,66% similar com

estudos de Silva et al (2010) no Mato Grosso (42,5%), e superior ao

encontrado por Carlos et al. (2011) em Ilhéus e Itabuna - Bahia (36%), por

Krawczak et al. (2012) no Rio Grande do Sul (4,43), Spolidorio et al. (2013) na

Amazônia (16,2%) e por Guedes et al. (2015) em Ituberá - BA (32,7%). Porém

é inferior ao encontrado nos estudo de Witter et al. (2013) em São Paulo

(70,1%) e de Girardi et al. (2014) no Mato Grosso (94,8%). Essas diferenças,

provavelmente estão relacionadas a variação do clima de cada região e ao

nível de exposição aos carrapatos das populações estudadas.

A elevada freqüência de cães soropositivos para E. canis, enfatiza a

importância desse agente nos municípios estudados.

A alta prevalência de E. canis em animais de zonas urbanas

semidomiciliados e errante, provavelmente, está relacionado a facilidade de

adaptação que R. sanguineus tem ao ambiente urbano, principalmente se

tratando de uma população de cães sem uso de carrapaticidas. Isso corrobora

com o estudo de Guedes et al. (2015), que afirmam que o carrapato R.

sanguineus é mais freqüente em áreas urbanas do que nas áreas rurais, o que

conseqüentemente aumenta a exposição dos cães para a E. canis. Carlos et al

2011, utilizou em sua pesquisa animais domiciliados resultando em uma

menor prevalência da infecção por esse agente, pois trata-se de uma

população que usa carrapaticida e tem acesso ao médico veterinário.

Alguns fatores podem favorecer o desenvolvimento da erliquiose canina,

como a presença e distribuição do vetor R. sanguineus, o comportamento do

animal, a idade, o habitat e o tipo de população estudada (LOULY et al., 2006;

AZEVEDO et al, 2011; CARLOS et al., 2011; GUEDES et al., 2015).

48

Animais acima de um ano foram mais propensos a infecção de E. canis

(p valor = 0,05) corroborando com os estudos de Azevedo et al. (2011) e

Guedes et al. (2015), possivelmente, por que cães mais jovens foram menos

expostos ao vetor.

A mesorregião do Sul Baiano apresentou maior soropositividade para E.

canis 44%. Essa porcentagem pode ter sido influenciada pelo número de

amostra coletada, que foi superior a todas as mesorregiões.

A variável sexo não foi significativa para as três doenças analisadas,

semelhante ao encontrado por Carlos et al. (2011), Carvalho et al. (2015) e

Leça Junior et al. (2015).

A coinfecção de pelo menos dois desses parasitos é comum no Brasil,

mostrando que os cães estão expostos a diversos agentes patogênicos,

influenciado, principalmente, pelo clima tropical que favorece a proliferação de

vetores e a manutenção de oocistos no ambiente (DUBEY; LAPIN, 2006;

COELHO et al., 2013; GIRARDI et al, 2014;). Paulan et al. (2013) também

verificaram coinfecções por T. gondii, Leishmania e E. canis em cães na cidade

de Ilha Solteira em São Paulo, porém apresentou 18,27% de coinfecção para

estes agentes, superior ao encontrado nesse trabalho (5%).

Em se tratando de coinfecções é importante ressaltar que um patógeno

possa funcionar como agente facilitador para o estabelecimento de outras

infecções. A presença de anticorpos anti-Ehrlichia evidencia o contato prévio

com o agente e pode ser considerado um fator imunossupressor, que pode

desencadear reativação ou maior susceptibilidade para a ocorrência da

toxoplasmose e outras doenças (BOOZER et al., 2003; DUBEY; LAPIN, 2006).

Cães infestados por carrapatos possuem 53% mais chance de

adquirirem infecção por L. chagasi em comparação aos cães sem infestação,

as infestações por carrapatos causam anemia, debilidade e aumenta a

ocorrência de coinfecção (PAZ et al., 2010). Já Feitosa et al. (2000) e Mekusas

et al. (2009) relatam que a imunossupressão causada pela LVC pode

promover, em regiões endêmicas, a ocorrência de coinfecções com outros

agentes tais como E. canis., os autores concluíram que a erliquiose possa ser

um fator contribuidor para o estabelecimento da infecção por leishmaniose.

Esse estudo mostrou que cães residentes em diversos municípios da

Bahia apresentaram soropositividade para os três agentes estudados, podendo

49

albergar mais de um, e ter como consequência uma exacerbação dos sinais

clínicos apresentados e o surgimento de complicações. Considerando que as

coinfecções podem exacerbar uma imunossupressão, os animais

coparasitados estão mais propensos a apresentarem altas parasitemias, o que

assegura a transmissão vetorial e a permanência das enzootias.

7 CONCLUSÃO

O uso das técnicas de RIFI e ELISA possibilitaram a identificação de

animais soropositivos para Toxoplasma gondii, Leishmania spp. e

Ehrlichia canis na população canina de algumas mesorregiões do estado

da Bahia.

A idade dos animais foi considerada o fator de risco associado a

leishmaniose e erliquiose canina;

Cães errantes têm maior predisposição a se infectar por Leishmania

spp., possivelmente por uma maior exposição ao vetor, onde as chances

de ocorrer é duas vezes mais;

A distinta distribuição da infecção pelos três agentes etiológicos

estudados em diversas cidades da Bahia reflete uma distribuição

heterogênea destes agentes etiológicos estudados no presente trabalho.

50

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62

ANEXOS

Anexo A – Protocolo da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para

Toxoplasma gondii

Procedimentos para contagem de taquizoítos: Preencher a câmara de Neubauer com os taquizoítos. Realizar contagem em cinco dos 25 quadrantes centrais. Multiplicar o resultado por 50, o que corresponde à quantidade de

taquizoítos por L. O número ideal é de 1.500 – 2.000 taquizoítos/L para preparo do antígeno.

Diluir o material ressuspenso para uma concentração de 1.500 a 2.000

taquizoítos por L. Preparo das Lâminas:

Adicionar 10 L do antígeno em cada poço da lâmina. Secar em estufa a 37ºC por aproximadamente 30 minutos. Fixar em metanol por cinco minutos Acondicionar em lenço de papel e papel alumínio , armazenando a -

20ºC, até o momento do uso. Execução da técnica de RIFI:

Lavar as lâminas em PBS por 5 minutos. Secar as lâminas em temperatura ambiente ou estufa a 37ºC (tempo =

até secar). Diluir o soro, segundo seu ponto de corte (1:64).

Adicionar 10 L da diluição das amostras de soro.

Adicionar 10 L dos soros controles positivo e negativo. Incubar a 37ºC por 30 minutos, em câmara úmida. Lavar as lâminas duas vezes com PBS por 5 minutos. Secar as lâminas a temperatura ambiente. Diluir o conjugado com FITC (isotiocianato de fluoresceína) em solução

de PBS-Azul de Evans (0,5%), de acordo com o título determinado no Laboratório.

Adicionar 10 L do conjugado diluído em cada poço e proteger da luz. Incubar a 37ºC por 30 minutos, em câmara úmida, sempre protegendo

da luz. Lavar as lâminas duas vezes com PBS por 5 minutos (protegendo da

luz). Secar as lâminas a temperatura ambiente. Adicionar uma gota de glicerina entre os poços e cobrir com lamínula. Fazer a leitura em objetiva de 40x no microscópio com lâmpada de

mercúrio de alta pressão USH102 e filtro de seleção de comprimento de onda de 450 nm.

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Anexo B – Protocolo da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para

Leishmania spp.

1. Retirar as lâminas do refrigerador e deixe-as secar em temperatura ambiente

por 10 a 15 minutos;

2. Adicionar 10 µL do soro controle negativo na cavidade de número 6 da

lâmina e 10 µL do soro controle positivo na cavidade 7;

3. Adicionar 10 µL dos soros teste diluídos nas cavidades restantes,

registrando-se a posição de cada uma conforme a marcação na lâmina;

4. Incubar as lâminas por 30 minutos em estufa a 37°C, em câmara úmida;

5. Utilizando cuba de vidro, lavar as lâminas três vezes em PBS 1X

concentrado, 5 minutos em cada lavada;

6. Adicionar 10 µL do conjugado diluído em azul de Evans e PBS;

7. Incubar as lâminas por 30 minutos em estufa a 37°C, em câmara úmida;

8. Utilizando cuba de vidro, lavar as lâminas três vezes em PBS 1X

concentrado, 5 minutos em cada lavada;

9. Montar as lâminas com lamínula e glicerina tamponada, e fazer a leitura em

microscópio equipado para leitura de imunofluorescência, usando objetiva de

40 X.

Observação: Após a montagem, proteger as lâminas da exposição à luz e fazer

a leitura em seguida.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:

1. Reação positiva: os parasitas apresentarão fluorescência esverdeada

distribuída por toda a sua superfície.

2. Reação negativa: não haverá fluorescência e o campo aparecerá escuro.

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Anexo C – Protocolo do Teste de ELISA para Ehrlichia canis.

PREPARO DOS REAGENTES PARA01 (UMA) PLACA:

- Soros Controles: Os soros controles positivo e negativo estão PRONTOS

PARA USO para serem colocados na placa sensibilizada. Recomenda-se

colocá-los nos primeiros poços da placa.

- Preparo do PBS-Tween 20: Diluir 50 mLdo PBS 20X em 950 mLde água

destilada. Acrescentar 0,5 mLde Tween 20.

- Amostras-teste: As amostras-teste devem ser diluídas 1:200 em PBS-Tween

20, utilizando-se placa de transferência não sensibilizada ou tubos tipo

eppendorf e, posteriormente, transferidas para a placa sensibilizada com

antígenos com auxílio de uma pipeta multicanal. Utilize o mapa fornecido para

anotar a localização dos soros controles e das amostras-teste.

- Preparo do conjugado (anti-IgG de Cão): Diluir 1,2 mL de conjugado em 8,8

mL de PBS-Tween 20.

USO VETERINÁRIO OBS: preparar somente no momento de uso e proteger da

luz. PROCEDIMENTO:

1. Retirar as placas do refrigerador e deixe-as em temperatura ambiente por 5

a 10 minutos;

2. Adicionar 100 µL dos soros controles negativo e positivo, e 100 µL das

amostras-teste diluídas nos respectivos pocinhos, registrando-se a posição de

cada um conforme marcação na placa.

3. Incubar as placas por 1 hora em estufa a 37°C, em câmara úmida.

4. Lavar as placas três vezes com PBS-Tween 20. Após a última lavagem,

bater a placa sobre uma superfície plana, acolchoada com várias camadas de

papel toalha. Secar bem a placa. Não deixar bolhas dentro dos pocinhos.

5. Adicionar 100 µL/pocinho do conjugado (anti-IgG de cão) diluído.

6. Incubar as placas por 1 hora em estufa a 37°C, em câmara úmida.

7. Repitir o procedimento de lavagem e secagem das placas conforme item 4.

8. Adicionar 100 µL/pocinho da solução de substrato.

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9. Envolvel a placa em papel alumínio, incubando-a em temperatura ambiente

de 15 a 30 minutos.

10. Adicionar 50 µL/pocinho da solução de bloqueio da reação.

11. Fazer a leitura da placa em leitor de microplaca de ELISAcom filtro de 405

nm.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:

- Calcular o Índice de Corte (I.C.) O I.C. é a média das densidades ópticas

(D.O.s) dos soros controles negativos, multiplicada pelo fator 2,5.

- As amostras que apresentarem coloração amarela intensa e densidade

óptica (D.O.) igual ou maior que o I.C., serão consideradas positivas a Ehrlichia

canis.

- As amostras que não apresentarem coloração amarela intensa e D.O menor

que o I.C, serão consideradas negativas para Ehrlichia canis.

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