UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA PRÓ-REITORIA DE ..._A.pdf · CONTROLE DE QUALIDADE DE...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

ADRIANA TOZETTO

CONTROLE DE QUALIDADE DE EDULCORANTES EM ADOÇANTES COMERCIAIS VIA ESPECTROMETRIA E MÉTODOS DE CALIBRAÇÃO

MULTIVARIADA

PONTA GROSSA 2005

ADRIANA TOZETTO

CONTROLE DE QUALIDADE DE EDULCORANTES EM ADOÇANTES COMERCIAIS VIA ESPECTROMETRIA E MÉTODOS DE CALIBRAÇÃO

MULTIVARIADA

Dissertação apresentada como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos, no Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Estadual de Ponta Grossa. Orientadora: Profa. Dra. Noemi Nagata Co-orientador: Prof. Dr. Ivo M. Demiate.

Ponta Grossa 2005

Ficha catalográfica elaborada por Cristina Maria Botelho- UEPG/BICEN Tozetto, Adriana

T757 Controle de qualidade de edulcorantes em adoçantes comerciais via espectrometria e métodos de calibração multivariada / Adriana Tozetto. Ponta Grossa, 2005.

1144 f.

Dissertação (mestrado)- em Ciência e Tecnologia de

Alimentos da Universidade Estadual de Ponta Grossa. Orientadora: Profa. Dra. Noemi Nagata

Co-orientador: Prof. Dr. Ivo M. Demiate.

1-Análise multivariada. 2-Edulcorantes artificiais. 3-

Edulcorantes naturais. I.T.

CDD: 664.117

Dedico esta dissertação à minha filha Amanda,

meu marido Jean e minha mãe.

AGRADECIMENTOS

À Deus pelo dom da vida...

À meu companheiro Jean, o qual considero meu anjo. Obrigada pelo carinho e

compreensão em todos estes anos.

À minha amada filha Amanda

....... Cor, brilho da minha vida.

À minha querida mãe pelos ensinamentos: como dedicação e perseverança.

Às minhas irmãs Ana Lúcia e Luciana pelo apoio.

À minha Orientadora Noemi agradeço pelos ensinamentos, pela sua dedicação em

nosso trabalho e pela convivência.

Ao meu Co-orientador Ivo pelas preciosas contribuições tanto em nosso trabalho

quanto na minha vida profissional.

Ao Prof. Carlos C. Stadler pelo incentivo, pois sem ele provavelmente não teria

ingressado no curso de Mestrado.

À Prof. Neiva pelos ensinamentos e conselhos, os quais sempre foram transmitidos de

forma carinhosa.

Ao Prof. Gilvan pela excelente coordenação deste curso de Mestrado.

À todos os meus colegas de curso, mas principalmente ao meu amigo Marcelo por

todos estes anos de convivência.

À todos os funcionários do laboratório de Alimentos pela colaboração.

RESUMO

Nos últimos vinte anos, o consumo de alimentos diet e light tem aumentado sistematicamente, o que tem propiciado o constante desenvolvimento de produtos desse gênero. Grande ênfase tem sido dada àqueles produtos que substituem sacarose por um edulcorante de baixo conteúdo calórico. Sendo assim, torna-se necessário o desenvolvimento de técnicas rápidas, versáteis e de baixo custo para o controle de qualidade destes produtos.A Espectroscopia de Infravermelho Médio (FTIR-médio) e a Espectroscopia UV-Visível (UV-Vis) apresentam um conjunto de favoráveis características as quais deveriam garantir suas condições de ferramentas analíticas de primeira importância. No entanto, problemas como complexidade espectral e falta de seletividade, inviabilizam a utilização destas técnicas no controle de qualidade de produtos diet e light.A primeira parte deste trabalho descreve um estudo que objetiva avaliar a eficiência da Análise por Componentes Principais (PCA) associada com FTIR-médio para a classificação, certificação e caracterização da presença de edulcorantes naturais e artificiais em adoçantes de mesa comerciais. Bons resultados foram obtidos, principalmente na classificação e distinção dos diferentes veículos que compõem este tipo de amostra, sendo possível observar uma tendência de análise semi-quantitativa dos mesmos. Características como rapidez, baixo custo e eficiência fazem desta técnica uma excelente opção para a análise qualitativa sugerida.A segunda parte deste trabalho tem por objetivo avaliar o método de Regressão de Mínimos Quadrados Parciais nas suas duas modalidades (PLSR1 e PLSR2) e Regressão por Componentes Principais (PCR) associadas com a técnica de UV-Vis na determinação quantitativa de edulcorantes naturais e artificiais em adoçantes de mesa. Amostras com composição lactose/aspartame e lactose/esteviosídeo foram analisados via UV-Vis e a utilização de técnicas multivariadas permitiu contornar os problemas de intensa interferência espectral, principalmente para a análise dos edulcorantes intensos. Os modelos PLSR apresentaram melhor capacidade de previsão, sendo que o processo de otimização realizado de maneira particular (sistema PLSR1), demonstrou ganho significativo de eficiência nas análises quantitativas apenas para lactose/esteviosídeo.

Palavras-chave: Análise Multivariada, Edulcorantes Artificiais e Naturais

ABSTRACT

In the last twenty years, the use of “diet” and “light” foods has been systematically increased, resulting in a constant development of products of this kind. Emphasis has been done to products that replace sucrose by sweeteners with low caloric contains. For this reasons the development of fast, versatile and low cost methodologies for the quality control of these products is absolutely necessary. Mid Infrared Spectroscopy (FTIR-mid) and UV-Visible Spectroscopy (UV-VIS) show a collection of favorable characteristics, which should guarantee a relevant position as analytical tool. However, problems related to spectral complexity and low selectivity usually makes unfeasible the use of these techniques in the quality control of " diet " and " light " products.The first part of this work describes a study that aims to evaluate the efficiency of the Principal Component Analysis (PCA) in the classification, certification and characterization of natural and artificial sweeteners in commercial products using mid-FTIR spectroscopy. Satisfactory results were obtained, mainly for classification and differentiation of the solvents, with tendency of semi-quantitative analysis. Characteristics as speed, low cost and accuracy make this methodology an ideal choice for the quality control monitoring.The second part of this work describes a study that aims to evaluate the efficiency of the Partial Least Squares in two modalities (PLSR1 and PLSR2) and the Principal Component Regression (PCR) in the quantification of natural and artificial sweeteners in commercial products by UV-VIS spectroscopy.Commercial sweeteners with lactose/aspartam and lactose/steviosideo compositions were analyzed by UV-VIS using the multivariate techniques to resolve the serious overlapping problems, mainly in the analysis of intense sweeteners. The PLSR models present the best prevision capacity in the analysis of the studied systems. Additionally, the efficiency of the models was not significantly improved by the use of the PLSR1 system.

Key-words: Multivariate Calibration, Sweetners

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura química do Esteviosídeo............................................................. 24

Figura 2 - Estrutura química do Aspartame................................................................ 26

Figura 3 - Estrutura química da Sacarina Sódica, Sacarina Cálcica e Sacarina......... 30

Figura 4 - Estrutura química do Ciclamato de Sódio, Ciclamato de Cálcio e Ácido Ciclâmico...................................................................................................

31

Figura 5 - Estrutura química do Acesulfame-K.......................................................... 35

Figura 6 - Estrutura química da Sucralose.................................................................. 36

Figura 7 - Organização dos dados para Calibração Multivariada............................... 55

Figura 8 - Gráfico tridimensional do conjunto de dados composto por 35 amostras. 57

Figura 9 - (A) Gráfico tridimensional ilustrando os eixos das componentes

principais. (B) Gráfico bidimensional da PC1 vs. PC2: scores representados por () e loadings por(----)................................................

58

Figura 10 - Estruturas químicas (A) Frutose, (B) Glicose, (C) Lactose e (D) Sacarose.....................................................................................................

75

Figura 11 - Espectro de infravermelho médio para as 22 amostras (Tabela 5)

analisadas via PCA na região espectral entre 400 cm-1 a 4000 cm-1.........

76

Figura 12 - Gráfico de scores para as 1a e 2a componentes principais na análise de adoçantes de mesa......................................................................................

77

Figura 13 - Espectro de infravermelho médio para a amostra 5 e 6 na região

espectral entre 752,19 cm-1 a 1284,5 cm-1.

78

Figura 14 - Gráfico de pesos para as 1a (vermelho) e 2a (verde) componentes principais na análise de adoçantes de mesa...............................................

80

Figura 15 - Espectro de infravermelho dos adoçantes de mesa nos comprimentos de

onda entre 752,19 a 1284,5 cm-1. (A) veículo lactose, (B) veículo maltodextrina e (C) veículo sacarose.........................................................

81

Figura 16 - Espectro de infravermelho médio na região espectral de interesse para Lactose pura e Sacarose pura.....................................................................

82

Figura 17 - Gráfico de scores para as 1a e 2a componentes principais para a análise

dos adoçantes de mesa na faixa espectral entre 752,19 a 1284,5 cm-1 e sem a amostra 6..........................................................................................

83

Figura 18 - Gráfico de pesos para as 1a (vermelho) e 2a (verde) componentes

principais para a análise dos adoçantes de mesa na faixa espectral entre 752,19 a 1284,5 cm-1 e sem a amostra 6....................................................

84

Figura 19 - 1a derivada dos espectros FTIR-médio de padrões de Aspartame, Lactose e Sacarose.....................................................................................

85

Figura 20 - Espectro UV-VIS de soluções-padrão de Lactose e Aspartame................ 88

Figura 21 - Espectro UV-VIS para as 20 misturas sintéticas de lactose e aspartame

utilizados para a etapa de calibração do modelo PLSR1, PLSR2 e PCR..

89

Figura 22 - PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR2 na análise de lactose e aspartame..................................................

91

Figura 23 - Coeficientes de Regressão do PLSR2, na análise de lactose (preto) e

aspartame (cinza) com espectro completo (canais 1 a 600).......................

91

Figura 24 - Desenvolvimento do modelo PLSR2 para Lactose e Esteviosídeo na análise de adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Coeficientes de regressão nos comprimentos de onda entre 200 a 240 nm (canais 1 a 40)............................................................

92

Figura 25 - Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais na análise de lactose e aspartame....................................................................................

93

Figura 26 - Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais para lactose

e aspartame separados................................................................................

94

Figura 27 - Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo PLSR2 na análise de lactose e aspartame..................................................

95

Figura 28 - Curva de calibração convencional para a determinação de aspartame em

diferentes concentrações de lactose.................................................................

98

Figura 29 - Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose e aspartame em adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Coeficientes de Regressão para lactose (preto) e aspartame (cinza) na faixa espectral entre 200 e 240 nm (canal 1 a 40)...

100

Figura 30 - Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose em adoçantes. (A) Valores previstos vs valores reais para os padrões de calibração; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage...............................

101

Figura 31 - PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR1 na análise de Aspartame................................................................

103

Figura 32 - Modelo PLSR1 otimizado para análise de aspartame em adoçantes. (A) Valores previstos vs valores reais pelo modelo PLSR1; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage...................................................

104

Figura 33 - Modelo PCR otimizado para análise de lactose e aspartame em adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Coeficientes de Regressão para lactose (preto) e aspartame (cinza) na faixa espectral entre 200 e 240 nm (canal 1 a 40)..............................................................

106

Figura 34 - Modelo PCR otimizado para análise de lactose e aspartame em adoçantes. (A) Valores reais vs valores previstos; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage...................................................

107

Figura 35 - Espectro UV-Vis na região entre 200 e 400 nm para Lactose e Esteviosídeo...............................................................................................

110

Figura 36 - Espectro UV-Vis de todas as misturas sintéticas de lactose e

esteviosídeo utilizadas no conjunto de calibração para os comprimentos de onda entre 200 e 800 nm.......................................................................

111

Figura 37 - Coeficientes de Regressão do PLSR2, na análise de lactose (preto) e esteviosídeo (cinza) (A) com espectro completo; (B) Faixa espectral entre 200 e 280 nm (canal 1 a 80)..............................................................

113

Figura 38 - PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR2 na análise de lactose e esteviosídeo...............................................

114

Figura 39 - Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais lactose e

esteviosídeo separadamente.......................................................................

114

Figura 40 - Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo PLSR2 na análise de lactose e esteviosídeo...............................................

115

Figura 41 - Calibração univariada realizada para a determinação de esteviosídeo em

altas concentrações de lactose....................................................................

117

Figura 42 - Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose em adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage...............................................

119

Figura 43 - Valores previstos pelo modelo PLSR1 vs valores reais na análise de lactose........................................................................................................

119

Figura 44 - PRESS em função do número de componentes principais para o modelo

PLSR1 na análise de esteviosídeo..............................................................

122

Figura 45 - Modelo PLSR1 otimizado para análise de aspartame em adoçantes. (A)

Valores reais vs valores previstos pelo modelo PLSR1; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage...................................................

123

Figura 46 - PRESS em função do número de componentes principais para o modelo

PCR na análise de lactose e esteviosídeo...................................................

125

Figura 47 - Valores previstos pelo modelo PCR vs valores reais na análise de lactose e esteviosídeo.................................................................................

126

Figura 48 - Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo

PCR na análise de lactose e esteviosídeo...................................................

126

LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Edulcorantes naturais e/ou artificiais e sua concentração máxima

permitida pela legislação brasileira no produto final................................. 18

Tabela 2 - Misturas binárias de edulcorantes.............................................................. 21

Tabela 3 - Utilização de método colorimétrico na análise de açúcar em

alimentos....................................................................................................

48

Tabela 4 - Utilização de biosensores na análise de açúcares em alimentos................ 49

Tabela 5 - Composição declarada pelos fabricantes das amostras comerciais de adoçantes....................................................................................................

70

Tabela 6 - Misturas sintéticas e suas respectivas concentrações de lactose e

aspartame utilizadas para construção dos modelos multivariados de calibração...................................................................................................

71


aspartame utilizadas para validação dos modelos multivariados de calibração...................................................................................................

72


esteviosídeo utilizadas para construção dos modelos................................

73

Tabela 9 - Faixa de concentração de lactose e esteviosídeo para a etapa de validação....................................................................................................

73

Tabela 10 - Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR2 desenvolvidos........... 96 Tabela 11 - Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR2 97

Tabela 12 - Concentrações de aspartame e lactose com absorbância em 212 nm

obtida de misturas sintéticas utilizadas na construção na calibração convencional..............................................................................................

97

Tabela 13 - Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1 desenvolvidos para Lactose.......................................................................................................

101

Tabela 14 - Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR1

(lactose)......................................................................................................

102

Tabela 15 - Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1 desenvolvidos para Aspartame..................................................................................................

105

Tabela 16 - Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR1

(aspartame)................................................................................................. 105

Tabela 17 - Comparação via RMSEP entre os modelos PCR desenvolvidos............... 107

Tabela 18 - Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PCR.... 108

Tabela 19 - Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1, PLSR2 e PCR.......... 108

Tabela 20 - Resultados da análise de lactose e aspartame em amostras de adoçante comercial via modelo PLSR1 previamente otimizado...............................

109

Tabela 21 - Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR2 desenvolvidos........... 115

Tabela 22 - Resultados obtidos para o modelo PLSR2 na etapa de validação externa. 116

Tabela 23 - Concentrações de esteviosídeo e lactose com absorbância em 211 nm

obtida de misturas utilizadas na construção na calibração convencional..

117

Tabela 24 - Comparação via RMSEP para modelos PLSR1 desenvolvidos................ 120

Tabela 25 - Resultados da validação externa obtidos para o modelo PLSR1 para Lactose.......................................................................................................

120

Tabela 26 - Comparação via RMSEP para modelos PLSR1 desenvolvidos................ 123

Tabela 27 - Resultados obtidos para o modelo PLSR1 na etapa de validação externa

para a determinação de esteviosídeo..........................................................

124

Tabela 28 - Comparação via RMSEP entre os modelos PCR desenvolvidos............... 127

Tabela 29 - Resultados obtidos para o modelo PCR na etapa de validação externa..... 127

Tabela 30 - Comparação entre as Metodologias PLSR1, PLSR2 e PCR...................... 128

Tabela 31 - Resultado de previsão para a amostra comercial obtido para o modelo PLSR1 para lactose e PLSR1 para esteviosídeo........................................

128

LISTA DE SIGLAS

ATR Refletância Total Atenuada

BP-ANN Redes Neurais via Back propagation

CG Cromatografia Gasosa

CP Componente Principal

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLS Mínimos Quadrados Clássicos

DNS Ácido Dinitrossalicílico

FAO Food and Agriculture Organization

FDA Food and Drug Administration

FTIR-médio Infravermelho Médio com Transformada de Fourier

GRAS Generally Recognized as Safe

IDA Ingestão Diária Admitida

JECFA/OMS Comitê Conjunto de Especialistas em Aditivos Alimentares da Organização

Mundial da Saúde

MLR Regressão Linear Múltipla

NIR Infravermelho Próximo

OMS Organização Mundial da Saúde

PCA Análise por Componentes Principais

PCR Regressão por Componentes Principais

PLSR Regressão de Mínimos Quadrados Parciais

PRESS Soma dos Quadrados dos Erros de Previsão

RBF-ANN Redes Neurais via Radial Basis Function

RMSEP Raiz Quadrada da Soma dos Quadrados dos Erros de Previsão

SST Sólidos Solúveis Totais

UV-VIS Ultra-Violeta Visível

WHO World Health Organization

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................... 17 2 REVISÃO DA LITERATURA.............................................................. 20 2.1 EDULCORANTE IDEAL......................................................................... 20 2.2 LEGISLAÇÃO vs EDULCORANTES..................................................... 22 2.3 EDULCORANTES AUTORIZADOS PELA LEGISLAÇÃO

BRASILEIRA............................................................................................

23 2.3.1 Esteviosídeo............................................................................................... 23 2.3.2 Aspartame.................................................................................................. 25 2.3.3 Sacarina..................................................................................................... 29 2.3.4 Ciclamato................................................................................................... 31 2.3.5 Acesulfame-K............................................................................................ 34 2.3.6 Sucralose.................................................................................................... 35 2.4 MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DOS EDULCORANTES............... 37 2.4.1 Edulcorantes Naturais................................................................................ 37 2.4.1.1 Análises Físicas......................................................................................... 38 2.4.1.2 Análises Químicas..................................................................................... 39 2.4.1.2.1 Métodos Espectrofotométricos.................................................................. 39 2.4.1.2.2 Métodos Titulométricos............................................................................. 42 2.4.1.3 Métodos Cromatográficos......................................................................... 42 2.4.1.4 Métodos Enzimáticos................................................................................ 45 2.4.1.4.1 Métodos Espectrofotométricos.................................................................. 45 2.4.1.4.2 Biosensores................................................................................................ 48 2.4.2 Edulcorantes Artificiais............................................................................. 50 2.5 CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA......................................................... 53 2.5.1 Transformação de Dados........................................................................... 55 2.5.2 Pré-Processamento de Dados..................................................................... 56 2.5.3 Análise de Componentes Principais (PCA)............................................... 57 2.5.4 Regressão de Mínimos Quadrados Parciais (PLSR) e Regressão por

Componentes Principais (PCR).................................................................

61 3 OBJETIVOS............................................................................................ 67 3.1 OBJETIVOS GERAIS.............................................................................. 67 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................... 67 4 PARTE EXPERIMENTAL.................................................................... 68 4.1 REAGENTES............................................................................................ 68 4.2 MATERIAL VOLUMÉTRICO................................................................ 68 4.3 EQUIPAMENTOS.................................................................................... 68 4.4 PROGRAMAS COMPUTACIONAIS..................................................... 69 4.5 PROCEDIMENTO ANALÍTICO............................................................. 69 4.5.1 Amostras para o modelo PCA................................................................... 69 4.5.2 Preparo das soluções para construção dos modelos PLSR e PCR............ 70 4.5.2.1 Amostras com Associação de Lactose e Aspartame................................. 70 4.5.2.2 Amostras com Associação de Lactose e Esteviosídeo.............................. 72 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................... 74

5.1 ANÁLISE QUALITATIVA...................................................................... 74 5.1.1 Análise por Componentes Principais (PCA)............................................. 74 5.2 ANÁLISE QUANTITATIVA................................................................... 87 5.2.1 Composição Lactose e Aspartame............................................................. 88 5.2.1.1 Modelo PLSR para Amostras com Composição Lactose e Aspartame..... 89 5.2.1.1.1 PLSR2........................................................................................................ 89 5.2.1.1.2 PLSR1........................................................................................................ 98 A) Lactose.................................................................................................. 99 B) Aspartame............................................................................................. 103 5.2.1.2 Modelo PCR para Amostras com Composição Lactose e Aspartame....... 105 5.2.2 Amostras com Composição Lactose e Esteviosídeo................................. 110 5.2.2.1 Modelo PLSR para Amostras com Composição Lactose e Esteviosídeo. 111 5.2.2.1.1 PLSR2........................................................................................................ 111 5.2.2.1.2 PLSR1........................................................................................................ 118 A) Lactose.................................................................................................. 118 B) Esteviosídeo.......................................................................................... 121 5.2.2.2 Modelo PCR para Amostras com Composição Lactose e

Esteviosídeo....................................................................................................

124 6 CONCLUSÃO.......................................................................................... 130 7 REFERÊNCIAS...................................................................................... 132

17

1 INTRODUÇÃO

Nos últimos vinte anos, o consumo de produtos light e diet vem aumentando

sistematicamente, o que faz com que a indústria de gêneros alimentícios invista pesadamente

em pesquisas orientadas à elaboração de novos produtos. Basicamente, estes produtos estão

direcionados a pessoas que apresentam algum distúrbio no metabolismo de açúcares (ex:

diabéticos) ou, mais recentemente, consumidores que estão em busca de produtos alimentícios

de baixo teor calórico (NELSON, 2001).

A regulamentação brasileira para estes produtos está definida pelas Portarias 27/98 e

29/98 da Secretária de Vigilância Sanitária, órgão do Ministério da Saúde. Segundo a Portaria

27/98, o termo light pode ser utilizado na rotulagem de alimentos em duas situações: a

primeira considera apenas o conteúdo absoluto de nutrientes (sódio, açúcares, gorduras,

colesterol ou valor energético), cujos teores considerados baixos são definidos como atributo

que deve obedecer à legislação específica de cada alimento. A segunda situação compara os

alimentos com teores reduzidos desses nutrientes a alimentos similares de um mesmo

fabricante ou ao valor médio de três produtos similares de uma região. Essa comparação deve

atender a uma diferença mínima de 25% do nutriente ou da caloria do produto. Ou seja, um

produto que traga em seu rótulo a inscrição light não é suficiente para informar a sua

identidade. Um produto pode ser light em relação ao conteúdo de gordura, mantendo a

quantidade de calorias em comparação ao produto convencional.

Segundo a portaria 29/98, os produtos diet são alimentos destinados a dietas com

restrição de nutrientes e/ou podem ser empregados para o controle de peso. No caso das dietas

com restrições, são raros os exemplos onde a ausência de um componente (carboidratos,

gorduras, proteínas ou sódio) não seja obrigatória. Já os produtos destinados ao controle de

peso apresentam dietas para suprir parcialmente as necessidades nutricionais de uma pessoa,

18

são destinados a reduzir ou manter o peso, quando utilizados em substituição às refeições, ou

para ganhar peso, quando consumidos juntamente com as refeições. No lugar do termo diet, o

rótulo do produto também pode usar expressões como: não contém, livre, zero, sem, isento de

free, no, without (SUPER MIX, 2000).

O enfoque deste trabalho será voltado a produtos diet e light, aqueles com restrição ou

redução de carboidratos. Os produtos com estas características apresentam a adição de

edulcorantes artificiais e naturais, cuja Resolução - RDC nº 3, de 2 de janeiro de 2001

estabelece os limites máximos permitidos pela legislação brasileira para tal adição em

alimentos. A Tabela 1 traz os edulcorantes naturais e artificiais e sua concentração máxima

permitida no produto final.

Tabela 1- Edulcorantes naturais e artificiais e sua concentração máxima permitida pela

legislação brasileira no produto final.

EDULCORANTE NATURAL Limite máximo (g/100g ou g/100mL)

Sorbitol, xarope de sorbitol, D-sorbita quantum satis

Manitol quantum satis

Isomalta, isomalte, isomalt quantum satis

Esteviosídeo 0,045 - 0,060

Maltitol, xarope de maltitol quantum satis

Lactitol quantum satis

Xilitol quantum satis

EDULCORANTE ARTIFICIAL

Acesulfame de potássio 0,026- 0,035 (0,20 goma de mascar)

Aspartame 0,056-0,075 (0,40 goma de mascar)

Ácido ciclâmico e seus sais de Ca, K e Na 0,097- 0,130

Sacarina e seus sais de Ca, K e Na 0,022- 0,030

Sucralose, tricloro galacto sacarose (TGS) 0,019- 0,045 (0,25 goma de mascar) quantum satis: quantidade livre.

FONTE: ANVISA, 2004

19

Dentre a ampla variedade de produtos destinados à restrição ou redução de

carboidratos existentes para comercialização, os adoçantes de mesa tem apresentado um

grande crescimento, tanto em termos de consumo quanto em termos da variedade de produtos

disponíveis. A definição de adoçante de mesa segundo a Portaria nº 38, de 13 de janeiro 1998

refere-se a todo produto formulado para conferir o sabor doce aos alimentos e bebidas. No

caso dos produtos formulados para dietas com restrição de sacarose, frutose e glicose

(dextrose), estes são designados como "Adoçante Dietético".

Estes adoçantes podem conter e ser formulados à base de edulcorantes naturais e ou

artificiais permitidos pela legislação (Tabela 1), sendo permitida a utilização de veículos

(excipiente, diluente ou solvente) com as propriedades de conferir volume e/ou proporcionar

diluição à concentração conveniente, facilitando o seu uso. Os veículos autorizados são:

Água, Álcool etílico, Amidos, Amido modificado, Dextrinas, Dextrose, Fruto-

oligossacarídeos, Frutose, Glicerina ou glicerol, Isomalte, Lactose, Maltitol e seu xarope,

Maltodextrina, Manitol, Polidextrose, Polietileno glicol, Propileno glicol, Sacarose, Sorbitol.

Outro aspecto importante para a comercialização de adoçantes de mesa está

relacionado a sua rotulagem, pois é a partir das informações nela inserida que os

consumidores irão optar pelo produto que atenda as suas necessidades. A rotulagem de

adoçantes dietéticos deve possuir principalmente, o nome do(s) edulcorante(s); a quantidade

de sacarose, glicose (dextrose) ou frutose, quando for o caso; nas formulações contendo

aspartame indicar a presença fenilalanina; dentre outros (ANVISA, 2004).

20

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 EDULCORANTE IDEAL

A opção de consumir adoçantes diet e/ou light, está relacionada ao desejo de apreciar o

sabor doce nos alimentos, diminuindo-se ou até mesmo evitando-se a ingestão de açúcares.

De acordo com Verdi e Hood em 1993, para satisfazer completamente o consumidor é

necessário que um edulcorante ideal seja utilizado. Este edulcorante ideal deveria ser uma

cópia exata das propriedades sensoriais da sacarose, isto é apresentar as seguintes

características: não ter gosto residual, promover as propriedades funcionais da sacarose sendo

quimicamente estável, com baixo teor calórico, poder adoçante igual ou superior ao da

sacarose, ser solúvel, não ser tóxica, nem carcinogênica e economicamente acessível.

Infelizmente, nenhum dos edulcorantes comercialmente disponíveis combina todas essas

características, mas estas limitações podem ser parcialmente superadas pelo uso de uma

combinação de edulcorantes (HANGER; LOTZ; LEPENIOTIS, 1996; LIM; SETSER; KIM,

1989; MATYSIAK; NOBLE, 1991).

Hanger, Lotz e Lepeniotis em 1996 reportaram que misturas de edulcorantes de alta

intensidade (ou não nutritivos), isto é que fornecem somente doçura acentuada, propiciam um

perfil de sabor que mais se aproxima da sacarose, uma vez que atributos como off-flavours,

gosto amargo e gosto residual dos edulcorantes são minimizados. Outras vantagens obtidas

através da mistura de edulcorantes são a redução dos custos devido ao sinergismo, a melhora

do poder edulcorante, o aumento da estabilidade em sistemas aquosos e a redução da

exposição a substâncias químicas (VERDI; HOOD, 1993). Embora a primeira mistura de

edulcorantes com sucesso tenha sido a sacarina/ciclamato (GELARDI, 1987), muitos outros

estudos têm sido desenvolvidos para tentar melhorar as características e obter uma mistura

que represente um edulcorante ideal. (HUTTEAU et al., 1998).

21

Hutteau et al., em 1998 realizaram um estudo prévio das características fisiológicas de

misturas binárias de edulcorantes de corpo (fornecem energia e textura aos alimentos),

sacarose e maltitol, e edulcorantes intensos, acesulfame K, aspartame e ciclamato de sódio.

Foram observadas características como sinergismo (percepção de doçura maior na mistura),

aditividade (percepção de doçura igual na mistura) e supressão (percepção de doçura menor

que a soma das intensidades dos edulcorantes individuais) para as diferentes misturas,

conforme revela a Tabela 2.

Tabela 2- Misturas binárias de edulcorantes.

Mistura Edulcorante de corpo: edulcorante intenso

Taxa edulcorante Edulcorante de corpo: edulcorante intenso

Sinergismo Sacarose - ciclamato de Na 75:25

Maltitol - ciclamato de Na 50:50

Maltitol-acesulfame-K 75:25

Aditividade Sacarose - acesulfame-K 75:25

Supressão Sacarose - aspartame 25:75

Maltitol - aspartame 25:75 FONTE: HUTTEAU et al., 1998.

A resposta fisiológica mostrou que misturas de edulcorantes de corpo com aspartame

exibiram supressão do sabor doce, enquanto aqueles com ciclamato ou acesulfame-K tendem

a ter propriedades sinérgicas ou aditivas, respectivamente. A Tabela 2 também mostra a taxa

de edulcorante de corpo: edulcorante intenso, na qual estas misturas exibem sinergismo,

aditividade ou supressão do sabor doce (HUTTEAU et al., 1998).

Muitas empresas de refrigerantes utilizam misturas de sacarina/aspartame ou

acesulfame-K/ aspartame para melhorar o sabor de seus produtos. Em solução aquosa a

combinação sacarina-aspartame-ciclamato na taxa de 1:5:8, respectivamente, resulta em uma

melhora da doçura e a qualidade do sabor (definido pela redução em sabores não doces),

22

comparados a estes edulcorantes sozinhos (BAKAL, 1991). Já no caso da combinação

ciclamato/sacarina, a doçura derivada do ciclamato mascara o gosto amargo da sacarina em

refrigerantes carbonatados com uma mistura de 10:1 e ainda proporciona uma doçura próxima

à sacarose (BAKAL, 1991; VERDI; HOOD, 1993).

Iop, Silva e Beleia em 1999 utilizaram um modelo de mistura experimental para

exemplificar a aceitabilidade de sobremesas com baixa caloria contendo uma mistura de

edulcorantes com combinações simples, binárias e terciárias de sacarina, ciclamato e

esteviosídeo. O modelo incluiu diferentes combinações de edulcorantes de acordo com os

limites estabelecidos pelas leis alimentares brasileiras. A mistura na sobremesa propicia uma

diminuição calórica de 37 % quando comparada a um pudim adoçado com sacarose, e a

textura equivalente dos produtos comerciais foi reproduzida com a adição de 0,01g/100mL de

carragena. A adição de carragena foi necessária devido ao aumento da sinerese quando o

açúcar é removido de sobremesas baseadas em amido. Dentre as combinações de edulcorantes

testadas, a mais aceita pela avaliação sensorial foi sacarina/ciclamato na proporção de 0,755 :

0,245.

2.2 LEGISLAÇÃO vs EDULCORANTES

Atualmente, existe uma preocupação muito grande relacionada à segurança na

ingestão destes edulcorantes. Investigações sobre seus efeitos na espécie humana são cada vez

mais importantes, uma vez que a procura por produtos contendo tais edulcorantes cresce a

cada dia.

Os edulcorantes artificiais, acesulfame-K, aspartame, ácido ciclâmico, sacarina, e

neohesperidina são autorizados pelo Comitê Cientifico Europeu de Alimentos, como aditivo

alimentar e também em adoçantes. Eles possuem um valor de ingestão diária aceitável (IDA –

23

quantidade de um determinado composto que pode ser consumido diariamente, com

segurança, durante toda a vida) de 0-9, 0-40, 0-11, 0-5 e 0-5 mg/Kg de peso corporal,

respectivamente (GARNIER-SAGNE; LEBLANC; VERGER, 2001).

Os edulcorantes de baixa caloria aprovados pela Food and Drug Administration (FDA)

são quatro: sacarina, aspartame, acesulfame-K e sucralose. No entanto, existem outros dois

que estão em fase de avaliação, o alitame e o ciclamato.

2.3 EDULCORANTES AUTORIZADOS PELA LEGISLAÇÃO BRASILEIRA

2.3.1 Esteviosídeo

Esteviosídeo é um edulcorante natural de alta intensidade, não nutritivo e extraído das

folhas de Stevia rebaudiana (Bertoni), uma planta nativa do nordeste do Paraguai. Trata-se de

um pó branco, cristalino e sem odor o qual é aproximadamente 300 vezes mais doce que a

sacarose (SOEJARTO et al., 1983), com estrutura química conforme Figura 1.

Está comercialmente disponível e é utilizado em muitos países incluindo Japão e

alguns países da América do Sul como adoçante em uma ampla variedade de alimentos e

bebidas. No entanto, na comunidade Européia, este edulcorante não é utilizado devido à

exigência específica da União Européia a respeito das avaliações de segurança. Nos últimos

anos, pesquisas biomédicas, principalmente nos países Asiáticos, demonstraram que nenhuma

atividade tóxica significativa do esteviosídeo foi observada em uma grande variedade de

sistemas biológicos e confirmaram ainda, a falta de efeitos mutagênicos (SUTTAJIT et al.,

1993), tóxicos subcrônicos (AZE et al., 1991), carcinogênicos (XILI. et al., 1992),

teratôgenicos (YODYINGUARD; BUNYAWONG, 1991), ou contraceptivo

(YODYINGUARD; BUNYAWONG, 1991).

24

Figura 1- Estrutura química do Esteviosídeo FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

O metabolismo do esteviosídeo em humanos foi esclarecido a partir da identificação

de metabólitos na urina e fezes após sua ingestão (KRAEMER; MAURER, 1994).

Poucos são os dados disponíveis para a aplicação prática do esteviosídeo em alimentos

e bebidas. Na realidade, existe um conhecimento muito limitado da sua estabilidade em

diferentes condições de processamento e estocagem, sua interação com outros ingredientes ou

aditivos alimentares.

Os dados disponíveis mostram que o esteviosídeo possui boa estabilidade em solução

aquosa, molho de soja e proteína vegetal hidrolisada armazenada a 30º C por trinta dias

(SHIRAKAWA, ONISH, 1979), assim como, em bebidas carbonatadas e acidificadas com

ácido cítrico e fosfórico em temperatura inferiores a 37ºC por longos períodos de estocagem

(CHANG, COOK, 1983). No entanto, uma pequena degradação foi observada para a

estocagem em vinagres sob aquecimento a 80º C (SHIRAKAWA, ONISH, 1979).

25

Kroyer em 1999 realizou um estudo da estabilidade do esteviosídeo sob diferentes

condições de processamento e estocagem, além dos efeitos de sua interação com vitaminas

aquo-solúveis (ácido ascórbico, tiamina, riboflavina, piridoxina e ácido nicotínico), ácido

orgânicos (acético, cítrico, tartárico), ácido fosfórico, outros edulcorantes de baixa caloria

(sacarina, ciclamato, aspartame, acesulfame-K, Neohesperidina Dihidrochalcona) e com a

cafeína no café e chá. Os resultados deste estudo demonstram que o esteviosídeo apresentou

boa estabilidade até 120ºC, e decomposição em temperaturas acima de 140ºC. Em soluções

aquosas este edulcorante manteve-se estável em uma faixa de pH entre 2-10 mesmo com

tratamento térmico de 80ºC. Porém, sobre condições de extrema acidez (pH 1), uma

significativa diminuição da concentração do esteviosídeo foi detectada. Não foram observadas

mudanças significativas durante estudos de interação do esteviosídeo com outros edulcorantes

de baixa caloria (mesmo após 4 meses de estocagem a temperatura ambiente), cafeína e as

vitaminas do tipo B em soluções aquosas à 80ºC, até 4 horas de incubação. No entanto, foi

observado um efeito protetor do esteviosídeo na degradação do ácido ascórbico. Os estudos

da estabilidade do esteviosídeo em soluções ácidas mostraram uma tendência no aumento da

decomposição do edulcorante em baixos valores de pH, dependendo do tipo de ácido

empregado. Em soluções de concentrações de 10 g/L de ácido acético (pH 2,6), ácido cítrico

(pH 2,1), ácido tartárico (pH 2,1) e ácido fosfórico (pH 1,6) perdas na concentração de

esteviosídeo de 2, 22 ,33 e 75% respectivamente, foram observada após 4 meses de

estocagem.

2.3.2 Aspartame

O aspartame foi descoberto por acaso em 1965 por James Schlatter, pesquisador dos

laboratórios Searle nos Estados Unidos, durante o desenvolvimento de um novo medicamento

para o tratamento da úlcera. O aspartame é o éster metílico de dois aminoácidos, a

26

fenilalanina e o ácido glutâmico, ou seja éster metílico de L-aspartil-L-fenilalanina, sua

estrutura aparece na Figura 2 (CÂNDIDO;CAMPOS, 1996).

Figura 2- Estrutura química do Aspartame FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

Este edulcorante é o único entre os de alto grau de doçura que é metabolizado, sendo

digerido como qualquer dipeptídeo. As esterases intestinais hidrolisam o metiléster e logo as

peptidases liberam os aminoácidos. Uma pequena quantidade do dipeptídeo desmetilado entra

pelo sistema de transporte dos dipeptídeos, consegue entrar nos enterócitos e, a seguir, as

enzimas proteolíticas das células da mucosa completam a hidrólise. Ao final, ingressa no

sistema portal: L-fenilalanina, ácido aspartico e uma pequena quantidade de metanol. Estes

componentes são utilizados pelo corpo da mesma maneira que quando derivados de outros

alimentos, tal como carne, leite, frutas e vegetais (SCHOR; MAZZEI; SUDERA, 1993).

Segundo Butchko em 2002, a ingestão dos produtos metabolizados do aspartame (L-

ácido aspártico, L-fenilalanina e metanol), não deveria acarretar problemas à saúde, uma vez

que na alimentação normal as quantidades destes três componentes são muito superiores. Por

exemplo, um copo de leite desnatado contém 6 vezes mais fenilalanina e 13 vezes mais ácido

aspártico, enquanto um copo de suco de tomate contém 6 vezes mais metanol que um volume

equivalente de bebida adoçado com 100% de aspartame.

27

Além disso, a fenilalanina é um aminoácido essencial para o crescimento, manutenção

e desenvolvimento da vida. Apenas indivíduos com uma doença genética rara, a

fenilcetonúria, devem ter uma dieta rigorosa restringindo o consumo de fenilalanina

(ODACT; TIMUR; TELEFONEU, 2004). A fenilcetonúria é uma desordem genética

(autossômica recessiva) ocasionada pela ausência ou diminuição da atividade da L-

fenilalanina-4-monooxigenase que catalisa a hidroxilação de fenilalanina a tirosina, o que

acarreta aumento nos níveis de fenilalanina e torna a tirosina um aminoácido essencial. O

excesso de fenilalanina é transaminado e sua presença ou de seus metabólitos causam danos

cerebrais. No Brasil, estima-se que 1 entre 14 mil crianças apresentem o problema, há 450

casos registrados no Brasil, 50 dos quais no Paraná, o diagnóstico é feito através do teste do

pezinho, realizado no Paraná desde 1980 (CÂNDIDO; CAMPOS, 1996).

O aspartame possui boa estabilidade quando seco (4,0 a 4,5 % de umidade) e em

condições adequadas de armazenagem, o produto permanece mais de cinco anos sem

apresentar qualquer alteração significativa. Porém na presença de umidade ou em solução, a

ligação éster presente na molécula de aspartame é instável e sob certas condições de

temperatura e pH pode ocorrer a conversão do aspartame em aspartilfenilalanina e/ou a sua

forma cíclica dicetopiperazina (DKP) e pequenas quantidades de β-aspartame. A DKP pode

continuar sua conversão até aspartilfenilalanina que, por fim hidrolisa-se até seus compostos

aminoácidos. Estes produtos de conversão não são doces, e não conferem nenhuma alteração

no sabor (CÂNDIDO; CAMPOS, 1996).

A limitada estabilidade do aspartame impede a sua aplicação em produtos a serem

fritos, cozidos, ou seja, onde o aspartame seria exposto a altas temperaturas de processamento

por um longo período de tempo (BASTIN, 2004). Mas ele pode ser utilizado em vários

processos alimentícios, incluindo UHT (Ultra High Temperature) e HTST (High Temperature

28

Short Time). Ficou demonstrado em vários casos reais que, mesmo a altas temperaturas, em

curtos períodos de tempo a perda de doçura do aspartame foi insignificante, não chegando a

3%. Outra opção para produtos submetidos a longos períodos de processamento seria a adição

do aspartame nos últimos minutos do processo de aquecimento a fim de evitar perdas

(NUTRASWEET, 2003?).

O processo de aprovação do aspartame iniciou nos Estados Unidos em 1973 sendo

liberado pela FDA em 1974. A segurança no consumo do aspartame e seus constituintes

metabólicos por humanos foram verificados através de intensivos estudos toxicológicos em

animais, utilizando-se doses maiores que aquelas possivelmente consumidas por pessoas. Os

estudos farmacológicos em animais não revelaram efeitos do aspartame sobre o sistema

nervoso central, aparelho digestivo, endócrino e reprodutor, nem sobre a resposta inflamatória

a doses que superam em muito as concentrações alcançadas no consumo humano. Com base

nos resultados dos estudos de toxicologia foi constado que no caso do aspartame a quantidade

máxima sem qualquer efeito adverso é de 2000 á 4000mg/Kg de peso corpóreo (BUTCHKO

et al., 2002).

Antes da aprovação pelos sistemas de regulamentação, a segurança no consumo do

aspartame e das concentrações plasmáticas de seus componentes foi estudada em crianças e

adultos sadios, assim como em indivíduos obesos e pessoas portadoras de diabetes, que

seriam os consumidores habituais. Após exaustivas avaliações, os resultados indicaram que o

aspartame não possui efeitos embriotóxicos, teratogênicos, carcinógenos nem outros efeitos

indesejáveis relacionados com o uso (SCHOR; MAZZEI; SUDERA, 1993).

Baseados nos estudos toxicológicos obtidos com animais (geralmente realizados com

roedores durante toda a vida dos mesmos) o Comitê Conjunto de Especialistas em Aditivos

Alimentares da Organização Mundial da Saúde (JECFA/OMS) estabeleceu que a IDA de

29

aspartame seria de até 40 mg/Kg/dia, valor que também corresponde ao IDA do aspartame em

nosso país.

Em decorrência da quantidade relativamente elevada para atingir o valor de IDA para

aspartame (p.ex. um indivíduo de 60 Kg teria de consumir aproximadamente 13 latas de

bebida por dia, ou 65 envelopes de adoçante de mesa ou 20 porções de iogurte, considerando-

se que tudo isso foi adoçado somente com aspartame), agências de regulamentação em mais

de 100 países aprovaram o aspartame para o seu uso como edulcorante (SCHOR; MAZZEI;

SUDERA, 1993).

2.3.3 Sacarina

A sacarina foi descoberta em 1879 pelo químico norte americano Constantin Fahlberg,

que trabalhava no laboratório de Ira Remsen na Universidade de John Hopkins nos Estados

Unidos, quando estudava a oxidação das sulfonamidas (O-toluenosulfonamidas), substâncias

obtidas de derivados de petróleo.

Apesar de ter sido inicialmente usada como antisséptico e como conservante de

alimentos, vem sendo comercializada como edulcorante desde 1900. Sua incorporação em

alimentos aumentou significativamente durante as duas Guerras Mundiais em decorrência da

escassez e racionamento de açúcar.

Quimicamente corresponde a 2,3-dihidro, 3-oxobenzeno iso sulfanazol, sua estrutura

apresenta-se na Figura 3. Ela pode ser comercializada sob a forma ácida, ou sob a forma de

sais de sódio, cálcio ou amônia (CÂNDIDO, CAMPOS, 1996), sendo aproximadamente 300

vezes mais doce que o açúcar. Apresenta um desagradável gosto residual que pode ser

minimizado pela adição de pequenas quantidades de um aminoácido (glicina) ou pela

combinação com ciclamato.

30

Figura 3- Estrutura química da Sacarina Sódica, Sacarina Cálcica e Sacarina FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

Cerca de 80% da sacarina ingerida por via oral é absorvida e excretada inalterada,

sendo no máximo transformada no ácido 2-sulfamoilbenzóico. Ela apresenta uma absorção

lenta e incompleta, sendo a eliminação renal rápida e completa. Estas características fazem

com que doses administradas oralmente sejam em grande parte eliminadas nas primeiras vinte

e quatro horas, ficando uma quantidade de cerca de 5 a 10% para ser excretada após este

prazo (CÂNDIDO, CAMPOS, 1996).

O mais antigo dos edulcorantes artificiais é também aquele que, nos últimos 50 anos

tem estado sujeito a constantes críticas. O Governo Canadense baniu o uso da sacarina como

um aditivo a partir de estudos realizados na década de 70, cujos resultados mostraram uma

possível ligação deste edulcorante com o desenvolvimento de câncer de bexiga urinária em

ratos (CÂNDIDO, CAMPOS, 1996).

31

2.3.4 Ciclamato

O ciclamato é um sal do ácido N-ciclo-hexil-sulfâmico usado como adoçante artificial

não calórico em diversos alimentos e bebidas, e também na indústria farmacêutica. Aparece

na composição dos produtos em três diferentes formas: ciclamato de sódio (C6H11NHSO3Na),

ciclamato de cálcio (C12H24N2S2O6Ca) e ácido ciclâmico (C6H13NO3S), conforme Figura 4. É

inodoro, solúvel em água, álcool e propilenoglicol, sendo mais estável que o aspartame e a

sacarina, o que possibilita sua utilização em altas e baixas temperaturas (BARLATTANI,

1970).

Figura 4- Estrutura química do Ciclamato de Sódio, Ciclamato de Cálcio e Ácido Ciclâmico. FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

A descoberta do ciclamato ocorreu em 1937 por Michael Sveda, um aluno de

graduação da Universidade de Ilinois (EUA), que casualmente descobriu seu sabor adocicado.

Trata-se de um edulcorante 30 vezes mais doce que a sacarose, sem o sabor amargo da

sacarina (AHMED; THOMAS, 1992).

32

A partir da mistura de ciclamato com sacarina na proporção 10:1, houve um aumento

do consumo de adoçantes artificiais nos Estados Unidos na década de 60. Em 1968, foram

produzidas 7.718 toneladas de ciclamato, sendo 69% utilizado em bebidas, 19% em adoçantes

de mesa, 6% em alimentos, 4% em itens não alimentares e 2% destinados para exportação

(EGEBERG et al., 1970). Segundo Burbank e Fraumeni em 1970 foram consumidos, nesse

país cerca de 8.943 toneladas de ciclamato.

Em meados da década de 60 constatou-se que o ciclamato de sódio não era eliminado

de forma invariável, mas poderia ser metabolizado como ciclohexalamina. Em 1969, a

associação de ciclamato/sacarina foi interpretada pelo FDA como indutor de câncer de bexiga

em ratos (PRICE et al., 1970; OSER et al., 1975). A partir desses estudos, seu uso foi

proibido nos EUA após o Americano Department of Health, Education and Welfare concluir

que o ciclamato não apresentava qualquer valor no tratamento da obesidade ou diabetes

(EGEBERG et al., 1970). Apesar disso, o JECFA/OMS aprovou o uso do ciclamato de sódio

em 1977 como adoçante em alimentos e bebidas em mais de 40 países, incluindo Brasil,

Alemanha, Finlândia, Paquistão, África do Sul e Suíça (AHMED; THOMAS, 1992). Em

função da proibição do uso dessa substância pelo FDA dos EUA em 1969, é possível observar

uma redução dos estudos sobre os efeitos do ciclamato de sódio após a década de 70.

Kroes et al. (1977), estudando a toxicidade em longo prazo do ciclamato, sacarina e

ciclohexilamina em ratos, e seus efeitos na reprodução, constataram que nenhuma dessas

substâncias apresentou efeito teratogênico ou afetou a reprodução. No entanto, a

ciclohexilamina apresentou característica embriotóxica, o que pode ser explicado por

evidências no transporte pela barreira placentária tanto do ciclamato quanto a ciclohexilamina

expondo o feto a estas substâncias (SCHECHTER; ROTH, 1971).

33

O ciclamato, quando ingerido em grandes quantidades, produz diarréia em humanos.

De acordo com Egeberg et al. (1970) isso é aparentemente o resultado de um efeito osmótico,

pois não há evidência de que essa substância agrave doenças gastrointestinais orgânicas.

Tanto em seres humanos quanto em várias espécies animais, o ciclamato não é absorvido

completamente no intestino (DICK et al., 1974). Quando absorvido, é rapidamente excretado

na urina sem considerável acúmulo no sangue ou tecidos (COLLINGS, 1989). A maior parte

do ciclamato não absorvido é normalmente eliminada nas fezes, mas uma quantidade variável

pode ser convertida para ciclohexilamina por microorganismos que habitam o colon e o

cecum (RENWICK; WILLIAMS, 1972).

A conversão do ciclamato para ciclohexilamina em humanos é heterogênea, sendo que

aproximadamente 76% dos usuários regulares convertem menos de 0,1% da dose ingerida de

ciclamato, cerca de 8 a 10% convertem 1% ou mais, e 4% convertem 20% ou mais (AHMED;

THOMAS, 1992). Collings (1971), investigando o metabolismo do ciclamato de sódio em

humanos, constatou que a quantidade de ciclohexilamina excretada é proporcional a dose de

ciclamato ingerida.

O principal metabólito do ciclamato, a ciclohexilamina é rapidamente absorvida e

excretada pelos rins, existindo pouca excreção fecal. As taxas de excreção urinária destes

compostos indicam que pouco permanece nos tecidos ou fluidos corpóreos após sua

administração prolongada e em doses elevadas (DICK et al., 1974). Vários produtos do

metabolismo da ciclohexilamina foram identificados em humanos, como o ciclohexanol, a

ciclohexanona e a trans-ciclohexanona-1,2-diol (KOJIMA; ICHIBAGASE, 1968). No

entanto, a inexistência de diferenças entre as rotas de administração em relação à extensão do

metabolismo da ciclohexilamina implica que os tecidos, mais do que a flora intestinal

constitui o principal local para conversão desse metabólito (ROBERTS; RENWICK, 1985).

34

Diversos estudos foram realizados em animais de laboratório visando verificar

toxicidade do ciclamato de sódio ou da sua mistura com a sacarina (DALDERUP; VISSER,

1971). Os resultados revelaram poucos efeitos fisiopatológicos associados com a

administração dessa substância, mesmo em doses elevadas. Atualmente, existem no Brasil

diversos adoçantes de mesa à base desta associação, sendo que os mais vendidos possuem a

proporção de duas partes de ciclamato para uma de sacarina (CARDELLO; SILVA;

DAMÁSIO, 2000). Assunção et al. (1994) avaliando o conhecimento e a quantidade de

adoçante consumida diariamente por 36 indivíduos diabéticos, constatou que 92% deles

consomem adoçantes artificiais não calóricos à base de ciclamato e sacarina em quantidades

inferiores à IDA. De acordo com a Food and Agriculture Organization (FAO) e o World

Health Organization (WHO) Expert Committee on Food Additives, a IDA do ciclamato

corresponde a 50 mg/kg de peso corporal (OSER et al., 1975).

2.3.5 Acesulfame-K

A descoberta do acesulfame-K por Karl Clauss e H. Jensen, da Companhia Hoechst,

em 1967, na Alemanha, ocorreu acidentalmente quando um dos pesquisadores trabalhava no

desenvolvimento de novos produtos e descobriram um composto de gosto doce, não

sintetizado anteriormente. O nome inicial era acetosulfam e, em 1978, a Organização Mundial

da Saúde (OMS) registrou o nome genérico acesulfame potassium salt, sendo que atualmente,

foi abreviado para acesulfame-K (CÂNDIDO, CAMPOS, 1996).

O acesulfame-K é um sal de potássio do 6-metil-l,2,3-oxatiazina-4-ona-2,2-dióxido,

conforme Figura 5. Trata-se de edulcorante não calórico, sendo aproximadamente 200 vezes

mais doce que a sacarose, e não apresenta gosto residual. Sua toxicidade e carcinogenicidade

35

na reprodução foram estudadas em longo prazo, onde ficou demonstrado que o acesulfame-K

é um edulcorante seguro com alto poder adoçante, não sendo metabolizado pelo organismo.

Figura 5- Estrutura química do Acesulfame-K FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

É utilizado em mais de 30 países em milhares de alimentos e bebidas, higiene bucal e

produtos farmacêuticos (MUKHERJEE, CHAKRABARTIT, 1997). Mostra excelente

estabilidade nas seguintes condições: na forma seca, a armazenamento prolongado, às

alterações no processamento especialmente a temperaturas elevadas e pH baixo, em contato

com outros ingredientes ou constituintes dos alimentos e ao ataque microbiológico

(CÂNDIDO; CAMPOS, 1996).

2.3.6 Sucralose

A sucralose, 1,6-dicloro-1,6-dideoxi-β-D-fructofuranosil-4-cloro-4-deoxi-α-D-

galactopiranose, conforme Figura 6, foi sintetizada em um laboratório da Universidade de

Londres, em 1976. No estudo de reações químicas envolvendo a sacarose, os pesquisadores

incorporaram nesta molécula 3 átomos de cloro e casualmente obtiveram um produto 600

vezes mais doce que a sacarose.

36

Figura 06: Estrutura química da sucralose FONTE: (http://sci-toys.com/ingredients/sucralose.html)

Este edulcorante artificial apresenta maior estabilidade ao aquecimento e ao meio

ácido que os edulcorantes baseados em peptídeos como o aspartame. Isto propicia a

manutenção da sua característica mesmo durante cozimento e a pasteurização. Estudos

sensoriais também mostraram que a sucralose não possui gosto residual amargo, apresentando

um sabor muito similar ao do açúcar. Em função destas características, a sucralose pode

tornar possível a fabricação um grande número de alimentos de baixa caloria, e alimentos e

bebidas com baixo teor de açúcar.

Estudos sugeriram que pequenas quantidades de sucralose poderiam passar através da

placenta, no entanto estudos realizados por KILLE et al. em 2000 em ratas e coelhas grávidas

não mostraram nenhum efeito na morfogenia do feto e em nenhum outro parâmetro de

desenvolvimento fetal.

Trata-se de um edulcorante não calórico, cujas ligações carbono-cloro são bastante

estáveis, não sendo hidrolisadas durante a digestão ou metabolismo. Estas características

fazem com que a sucralose seja totalmente excretada sem alteração pelas fezes de maneira

muito rápida. Nenhum tipo de efeito é observado na glicose ou nas enzimas envolvidas na

regulamentação do metabolismo de carboidratos, possibilitando que o mesmo seja ingerido

por diabéticos. Não há indicação de estimulo a secreção da insulina ou redução a

concentração de glicose no plasma (CÂNDIDO; CAMPOS, 1996).

http://sci-toys.com/ingredients/sucralose.html)

37

2.4 MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DOS EDULCORANTES

O uso e o desenvolvimento de novas técnicas analíticas na área da ciência e tecnologia

de alimentos caminha paralelamente com o aumento do número de consumidores interessados

na qualidade da sua alimentação. Conseqüentemente, procedimentos analíticos mais rápidos e

eficientes, menos trabalhosos e onerosos são requeridos. Estas técnicas analíticas, geralmente

apresentam o objetivo de fornecer informações sobre o processamento, controle de qualidade

dos alimentos assegurando sua adequação à legislação vigente.

2.4.1 Edulcorantes Naturais

Uma importante classe de compostos, responsáveis por formar a base de muitos

alimentos está representada pelos carboidratos. A qualidade e o valor calórico dos produtos

alimentícios são em parte dependentes da quantidade e do tipo de carboidratos e da sua

composição. Em decorrência da sua importância, existe um grande interesse na sua

determinação.

Muitos métodos são propostos para a análise destes compostos e entre as análises

tradicionalmente empregadas podemos destacar as análises físicas, químicas e enzimáticas.

Trata-se de técnicas perfeitamente aplicáveis, principalmente devido a sua simplicidade de

operação e muitas vezes de baixo custo. Técnicas mais sofisticadas como as cromatográficas

são muito precisas, porém com o inconveniente de serem complexas e onerosas, e muitas

vezes de utilização inviável em empresas de pequeno e médio porte. Neste último, além de

equipamentos caros, sofisticados e de difícil manutenção, há necessidade de pessoal

capacitado para a operação.

38

2.4.1.1 Análises Físicas

Entre as análises físicas de maior importância na indústria de alimentos estão à análise

polarimétrica, índice de refração e densidade.

A análise polarimétrica é extensivamente utilizada, principalmente nas usinas de cana

de açúcar. Trata-se de um método preciso na determinação da concentração de sacarose se

nenhuma outra substância opticamente ativa estiver presente. Porém se houver outros

açúcares opticamente ativos, o resultado será uma somatória e não somente sacarose

(MORGANO; MORIYA; FERREIRA, 2003).

O índice de refração é um método rápido e simples, rotineiramente utilizado em

indústrias para determinação da concentração de sólidos solúveis totais (SST), principalmente

açúcares, em xaropes, mel e geléias. A medida do índice de refração de uma solução de

carboidratos aumenta linearmente com a concentração, sendo dependente da temperatura

(20 ºC) e do comprimento de onda em que é realizada a medida (λ = 589,3 nm)

(<http:://www.unix.oit.umass.edu/meclemen/581Carbohydrates.html>).

A densidade assim como o índice de refração relaciona-se com a concentração dos

carboidratos presentes em solução. Sendo a densidade uma relação de massa por volume, o

aumento da concentração de carboidratos aumenta a densidade da solução. Este parâmetro é

rotineiramente utilizado na indústria para determinar a concentração de carboidratos, em

sucos e bebidas (<http:://www.unix.oit.umass.edu/meclemen/581Carbohydrates.html>).

Esses métodos relacionam uma propriedade física com a quantificação dos

carboidratos, mas havendo outras substâncias presentes, tais como ácidos ou sais, estas se

somarão ao resultado. Portanto, muitas vezes o resultado final não é um valor de açúcares,

mas sim de SST.

http://www.unix.oit.umass.edu/meclemen/581Carbohydrates.html


39

Em função dos problemas associados a cada uma destas técnicas, quando uma medida

mais precisa é requerida outras técnicas devem ser utilizadas.

2.4.1.2 Análises Químicas

Numerosos métodos químicos são propostos para determinação de açúcares. Estão

baseados na reação destas substâncias com outros componentes, formando complexos que são

então quantificados.

A maioria dos métodos químicos tradicionalmente empregados para a análise de

açúcares está baseado na propriedade de óxido-redução de cátions (p.ex: cobre), que afetam a

cor das soluções que os contêm, tornando-os adequados para usos analíticos. O Cu++, de

característica cor azul anil quando em solução alcalina, ao ser reduzido estequiometricamente

a Cu+ (Cu2O) proporciona ao meio de reação um precipitado vermelho-tijolo; este é o

fundamento químico do reagente conhecido como licor de Fehling, utilizado para

determinação de sacarose e açúcares redutores. A adequação desse fundamento químico à

dosagem de carboidratos é a base para muitos procedimentos analíticos entre eles os métodos

colorimétricos de Somogyi e Nelson (NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945), titulométricos de

Lane-Eynon (LANE; EYNON, 1923) e de Luff-Schoorl (SILVA; MONTEIRO; ALCANFOR

et al, 2003).

2.4.1.2.1 Métodos Espectrofotométricos

O método colorimétrico de Somogyi e Nelson, por se tratar de uma técnica sensível e

detectar baixas concentrações de açúcares (BREUIL; SADDLER, 1985), continua sendo

muito utilizada (BRAGA; BOM PESSONI; DIETRICH, 1998, DEMIATE; KONKEL;

PEDROSO, 2001, GUTIÉRREZ-MICELI et al., 2002, SHANLEY, 1973, SILVA et al., 2003;

40

SRIVASTAVA; TRIPATHI; JAJU, 1986). Breuil e Saddler (1985) compararam os métodos

de Somogyi-Nelson com àqueles que empregam o ácido dinitrossalicílico (DNS) para

determinação de produtos de hidrólise de celulose e concluíram que o primeiro forneceu

melhores resultados tendo sido menos susceptível aos interferentes presentes no meio.

A determinação da concentração dos açúcares redutores pela técnica colorimétrica

utilizando-se DNS é um método muito popular, relativamente rápido e conveniente. Porém

este método tem algumas limitações, sendo susceptível a interferência de várias substâncias,

incluindo baixa seletividade na análise de diferentes tipos de açúcares e sendo pouco preciso

especialmente em baixas concentrações (BREUIL; SADDLER, 1985). Mesmo com tantos

inconvenientes, esse método continua sendo muito utilizado em análises de alimentos

(BREUIL; SADDLER, 1985, FONTANIELLA et al., 2003, HUTÑAN et al., 1999,

OLIVEIRA et al., 2001, SILVA et al., 2003) e em alguns trabalhos é utilizado como um

método de referência (AMÁRITA; FERNÁNDEZ; ALKORTA, 1997, FERREIRA et al.,

2003, ROTARIU; BALA; MAGEARU, 2002).

Dubois et al. (1956) desenvolveram uma técnica colorimétrica, conhecida como fenol-

sulfúrico, para a determinação de açúcares totais. A solução da amostra desenvolve uma cor

amarela-alaranjada quando tratada com fenol e ácido sulfúrico concentrado, através de uma

reação sensível com coloração estável. A concentração pode ser obtida realizando uma leitura

em 490 nm para hexoses e 480 nm para pentoses e ácidos urônicos. Na literatura recente são

encontrados diversos trabalhos nos quais esta técnica foi empregada (BRAGA; BOM

PESSONI; DIETRICH, 1998, FERREIRA et al., 2003, HATANAKA et al., 1997, HUTÑAN

et al., 1999, MELAMANE; PLETSCHKE; LEUKES, 2003, SILVA et al., 2003).

Baseado no método de Dubois et al. (1956) uma metodologia para a determinação de

lactose em queijos foi desenvolvida (BARNETT; TAWAB, 1957) sendo modificada em 1968

41

(LAWRENCE, 1968). Acton em 1977 novamente modificou esta técnica tornando-a mais

rápida e com uma melhor porcentagem de recuperação da lactose adicionada, entre 94,9% e

101,7%. Em 1999 a técnica de Acton foi utilizada para quantificar lactose em queijos minas

frescal, e pelos resultados apresentados este método obteve uma excelente taxa de

recuperação de lactose, principalmente quando aplicada a concentrações de até 40 µg mL-1

(CARUSO; OLIVEIRA, 1999).

Outro método colorimétrico para a determinação de açúcares totais é denominado

antrona-sulfúrico. O aquecimento e o forte meio ácido produzem hidrólise das ligações

glicosídicas e desidratação dos monômeros, produzindo derivados do furfuraldeído. Estes

reagem com antrona produzindo um composto de coloração característica (LAURENTIM;

EDWARDS, 2003). A solução é resfriada e a absorbância é medida em 620 nm. Schweizer et

al. (2000) utilizaram a técnica e a consideraram eficiente, visto que em comparação com a

técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) a metodologia proposta

apresentou uma superestimação de 10%. Outros trabalhos também utilizaram o método

antrona-sulfúrico para determinação de carboidratos (GRANDY; ERICH; PORTER, 2000,

GUTIÉRREZ-MICELI et al., 2002, MARTÍNEZ-BARAJAS, 2003, REIS et al., 2000,

RODRÍGUEZ- TREJO; DURYEA; WHITE, 2002, SILVA et al., 2003).

Para fins de comparação, Deng e Tabatabai em 1994 avaliaram as metodologias de

Somogyi-Nelson, Azul da Prússia, DNS, Fenol-sulfúrico, Antrona-sulfúrico para análise de

açúcares redutores no solo. As três últimas técnicas apresentaram baixa sensibilidade. Os

métodos Azul da Prússia e Somogyi-Nelson foram os mais sensíveis e precisos, metais

extraídos juntamente com o solo interferem no método de Somogyi-Nelson, a mesma

interferência não acontece no método Azul da Prússia, porém à alta sensibilidade desta

metodologia ocasiona imprecisão nos resultados.

42

2.4.1.2.2 Métodos Titulométricos

Em função da morosidade dos métodos titulométricos e a dependência do resultado

depender da prática do analista, estas técnicas têm sido substituídas. O método titulométrico

de Lane, Eynon (1923) utilizado para a determinação dos açúcares redutores tem sido

descartado pelos órgãos envolvidos com a cana de açúcar, mesmo depois de ter sido adaptada

por Horii, Gonçalves (1991), onde a utilização do equipamento Redutec é incapaz de atender

à demanda das indústrias que recebem um grande número de fornecedores e necessitam

realizar cerca de 500 análises por dia. (ISEJIMA; COSTA; SOUZA JUNIOR, 2003)

Silva et al. (2003) compararam métodos de determinação de açúcares redutores e

açúcares totais, dentre os quais: métodos colorimétricos (DNS, antrona-sulfúrico, fenol-

sulfúrico, Somogyi-Nelson); métodos titulométricos (Lane-Eynon, Luff-Schoorl,

complexometria de EDTA); método gravimétrico de Munson-Walker; método por índice de

refração e o cromatográfico em camada delgada. Os resultados diagnosticaram que as

metodologias que se fundamentam na espectrofotometria, se comportaram melhor que os

métodos titulométicos e gravimétricos na determinação de açúcares redutores.

2.4.1.3 Métodos Cromatográficos

Os métodos cromatográficos são muito eficientes para a detecção e quantificação dos

monossacarídeos e oligossacarídeos em alimentos. Muitas aplicações via CLAE (BARNES;

NICOLSON; VAN WYK, 1995; FERNÁNDEZ-ARTIGAS; GUERRA-HERNÁNDEZ;

GARCÍA-VILLANOVA, 2001; INDYK; EDWARDS; WOOLLARD, 1996; TRUGO;

FARAH; CABRAL, 1995), cromatografia gasosa (CG) (COURTIN; VAN DEN BROECK;

43

DELCOUR, 2000), cromatografia de troca-iônica com detecção amperométrica pulsada

(DING; YU; MOU, 2002; FARINE;MALGOYRE; PUIGSERVER, 2001) e cromatografia de

afinidade iônica (LAU; SHAO; LEE, 2000) são propostos para a determinação de açúcares.

Todos eles apresentam como principal atrativo à possibilidade de análise simultânea de

substâncias.

A CLAE é atualmente a técnica cromatográfica mais importante para a análise de

carboidratos devido à rapidez, seletividade, sensibilidade e precisão das medidas. Uma das

principais vantagens da CLAE em comparação a CG é a rapidez, já que nas análises de CG

muitas vezes há necessidade de derivatização dos compostos de interesse com o objetivo de

torná-los voláteis.

Sturm, Koron, Stampar em 2003 analisaram diferentes variedades de morangos pelo

método CLAE para determinação de açúcares individuais (sacarose, glicose, frutose e xilose)

e ácidos orgânicos em dois diferentes estágios de maturação. Os resultados comprovaram que

a composição química das frutas varia significativamente entre os genótipos da planta e o

estágio de amadurecimento. Já Pérez et al. em 1997, não obtiveram o mesmo sucesso ao

tentar correlacionar a qualidade dos morangos com a determinação de SST, açúcar total,

ácidos tituláveis e ácidos orgânicos. Como citado anteriormente, os SST não medem somente

os açúcares, mas todas as substâncias dissolvidas, as quais apresentam diferentes índices de

refração na água (ácidos, sais, etc) (BARTOLOMÉ; RUPÉREZ; FÚSTER, 1996). Outro

trabalho desenvolvido por Bartolomé, Rupérez, Fúster em 1996 avaliou a influência do

processo de congelamento e estocagem sob refrigeração em açúcares (sacarose, glicose e

frutose) através de dois cultivares de abacaxi por CLAE. Estes resultados foram comparados

com os SST determinados pelo índice de refração, onde se verificou uma correlação positiva

44

entre os açúcares totais determinados por CLAE e SST, apesar dos valores de SST serem

sempre maiores, pelos motivos já discutidos.

Bernárdez, Miguéles, Queijeiro em 2003 utilizando CLAE equipado com detector

universal de espalhamento de luz analisaram glicose, frutose e sacarose em diferentes

variedades de castanha (C. sativa Mill) cultivadas em uma região da Espanha. O enfoque

principal foi à quantificação da sacarose (um dos parâmetros mais importantes para avaliar a

qualidade comercial desta fruta) cuja maior parte das variedades apresentou uma faixa entre 8

% a 15 % dependendo da localidade de cultivo. Resultados parecidos foram obtidos por

pesquisadores franceses, indicando que os teores de sacarose das castanhas destes dois países

são similares.

Também utilizando CLAE, Yuan, Chen (1999) desenvolveram uma metodologia para

a determinação simultânea de açúcares, ácido ascórbico, 5-HMF (5-hidroximetilfurfural),

furfural e quatro outros compostos furânicos em sucos de frutas e bebidas. Outro trabalho

desenvolvido por Lefebvre et al. (2003) também descreveram a determinação simultânea de

carboidratos e produtos de fermentação de uma massa fermentada de trigo.

Trabalhos com CG também evidenciam a determinação simultânea. Katona, Sass,

Molnár-Perl em 1999 utilizaram cromatografia gasosa acoplada a espectroscopia de massa

para a quantificação simultânea de mono, di e trissacarídeos, açúcares, álcoois e ácidos

derivatizados em éter-éster trimetilsilil-oxima em dois cultivares de cenoura em função da

data de colheita e condições de estocagem. Já García Baños, Olano, Corzo em 2000

descreveram uma metodologia mais específica para frutose, glicose, galactose, sacarose,

lactose, maltulose e maltose, presentes em formulações enterais.

A Cromatografia de troca aniônica (alto pH) com detecção amperométrica pulsada está

se tornando uma alternativa atraente para a determinação de carboidratos, devido ao seu alto

45

poder de resolução e sensibilidade. Problemas comumente encontrados durante a separação de

alguns carboidratos (p.ex. maltose de lactose e sacarose (KAINE; WOLNIK, 1998) não

acontecem na técnica de cromatografia de troca aniônica). Esta mesma técnica acoplada com

detecção amperométrica pulsada foi empregada por Cataldi et al. em 2000 para obter um

perfil completo dos açúcares presentes nas folhas e raízes da planta Oliveira (Olea europaea

L. Cv. Coratina). Uma boa separação dos açúcares (mio-inositol, galactinol, mannitol,

galactose, glicose, frutose, sacarose, rafinose e estaquiose) foi obtida, sendo encontrado maior

proporção de glicose e manitol. Técnica semelhante foi utilizada por Farine et al. 2001 que

monitorou os níveis de sacarose, D-glicose, D-frutose e oligossacarídeos em águas doces nas

diversas etapas de extração de açúcar dos resíduos gerados no processamento da cana de

açúcar.

2.4.1.4 Métodos Enzimáticos

Os métodos enzimáticos têm uma grande importância na análise de açúcares. Em

muitos casos superam os métodos químicos e físicos, pois são mais seletivos. Esta maior

seletividade permite identificar os açúcares individualmente em uma mistura. Os métodos

enzimáticos mais empregados podem ser divididos em detecção espectrofotométrica ou

biossensores.

2.4.1.4.1 Métodos Espectrofotométricos

Um exemplo do uso dos métodos enzimáticos espectrofotométricos para determinação

da concentração de açúcares em alimentos é a quantificação simultânea de glicose, frutose e

manose pela ação da enzima hexoquinase.

46

Estes açúcares são convertidos em glicose-6-fosfato (G-6-P), frutose-6-fosfato (F-6-P),

manose-6-fosfato (M-6-P), graças ao ATP que se transforma em ADP na presença da enzima

hexoquinase. Posteriormente, a G-6-P é oxidada pelo NADP+ na presença de glicose-6-

fosfato-desidrogenase (G-6-P-DH).

Finalmente, F-6-P e M-6-P transformam-se pela ação da fosfoglicose-isomerase e da

fosfomanose-isomerase, respectivamente, em G-6-P e segue-se o procedimento descrito

acima.

A quantidade de NADPH formado é proporcional a concentração de G-6-P na amostra

e pode ser medida espectrofotometricamente em 340 nm (MATISSEK; SCHNEPEL;

STEINER, 1998).

As concentrações de maltose e sacarose também podem ser determinadas por esta

técnica hidrolisando-se previamente estes açúcares. No entanto, durante esta etapa outros

oligossacarídeos também podem ser convertidos e determinados simultaneamente

<http:://www.unix.oit.umass.edu/meclemen/581Carbohydrates.html>.

Utilizando o mesmo processo enzimático, hexoquinase/G-6-P-DH/ fosfoglicose

isomerase Mota, Lajolo, Cordenunsi em 1997, determinaram sacarose, glicose e frutose

durante o amadurecimento da banana (Musa spp.) medindo-se a produção de NADPH

espectrofotometricamente. Para a determinação de sacarose, uma hidrólise prévia com

invertase foi realizada e só então a determinação foi feita.

Outro importante método enzimático colorimétrico é o que utiliza a enzima glicose

oxidase (GOD), disponível em muitos kits comerciais. A glicose oxidase catalisa a oxidação


47

da glicose para ácido glicurônico e peróxido de hidrogênio. Através de uma reação oxidativa

de acoplamento catalisada pela peroxidase, o peróxido de hidrogênio formado reage com um

grupo cromóforo doador de hidrogênio (DH2), por exemplo, o-dianisidina, 2,2’-azino-di-(3-

etilbenzotiazolina)-6-sulfonato (ABTS), o-toluidina, 2,6-diclorofenolindofenol ou também

pode ser utilizado polivinilpirrolidona, alquilaurilsulfonato e polietilenoglicol. Os grupos

cromóforos doadores de hidrogênio (DH2) citados anteriormente são oxidados a um derivado

colorido D, cuja leitura da absorbância é realizada na região do visível, variando a absorção

máxima pelo DH2 utilizado. Como a medida de absorbância é diretamente proporcional à

concentração de peróxido, é possível quantificar o teor de glicose na amostra (BERGMEYER;

BERNT, 1974), conforme mostra a equação 2 e 3.

O amido, um polissacarídeo constituído por monômeros de glicose, também pode ser

determinado pelo método enzimático da GOD (DEMIATE; KONKEL; PEDROSO, 2001,

DEMIATE; KONKEL; PEDROSO, 2001, HOLM et al. 1986). Esta análise envolve a

utilização de amilases purificadas (GARCIA; CORDENUNSI; LAJOLO, 1985, MORALES;

ESCARPA; GONZÁLES, 1997, MOTA; LAJOLO; CORDENUNSI, 1997), onde o amido

gelatinizado é hidrolisado a glicose pela amiloglicosidase que é geralmente associada com um

α- amilase, sendo o resultado, dado em termos de glicose e corrigido para amido por um fator

de 0.90 (CHATEL; VOIRIN; LUCIANI, 1996, EMNEUS; NILSSON; GORTON, 1993).

48

Trabalhos recentes abordando métodos espectrofotométricos químicos e enzimáticos e

variações das metodologias abordadas anteriormente têm sido desenvolvidas. Particularidades

destas inovações são mostradas na Tabela 3.

Tabela 3- Utilização de método colorimétrico na análise de açúcar em alimentos. AMOSTRA ANALITO DETECÇÃO LD / FL / E REFERÊNCIA

Leite Lactose Metilamina em pH básico

(λ = 540 nm)

FL: 10 a 80 mg/ml NARINESINGH et

al., 1992

Leite de

cabra

lactose e

galactose

Tio-NAD

(λ = 405 nm)

E: 5 µM (galactose)

E: 10 µM (lactose)

SHAPIRO; SHAMAY;

SILANIKOVE, 2002

Sangue, Soro

e Plasma.

Vinho

Glicose GOD/Hidroquinona/Fe (III)

(λ = 510 nm)

FL: 0,001 a 1,0 mM

LD: 0,5 µM

KATSUMATA;

SEKINE; TESHIMA,

2000

Queijo

parmesão

Lactose GOD/Lactase/Iodeto/Molibidato/

Álcool Polivinilíco (λ=490 nm)

FL> 0,015 % BLAIS; VAILHEN,

1995

Refrigerante

Glicose GOD/H2O2/Fe (III)

(λ=570 nm)

FL: 30 a 200 µM

LD: 10 µM

HARMS et al. 1999

GOD Glicose Oxidase; LD Limite de Detecção; FL Faixa Linear; E Erro.

2.4.1.4.2 Biosensores

Entre as novas tendências nas análises enzimáticas destaca-se o uso dos biosensores,

que desde o seu desenvolvimento, descrito por Clark e Lyons (1962) têm recebido grande

atenção. Este dispositivo combina um sensor biológico responsável pela catálise de uma

determinada reação que produz uma espécie passível de ser detectada por um transdutor de

sinal. O sensor biológico pode ser de um tecido de planta ou animal, células inteiras, células

microbianas, enzimas e seus cofatores anticorpo-antígeno e até hormônios. A técnica de

tradução é geralmente eletroquímica, mas processos ópticos, piezoelétricos ou térmicos

também podem ser utilizados. (IBAÑEZ; CIFUENTES, 2001)

49

Trata-se de uma ferramenta de quantificação com grande potencial na área da análise

de alimentos, principalmente em função de características como a alta seletividade,

sensibilidade, velocidade analítica, assim como, requer condições amenas de temperatura e

pH, com pequena manipulação da amostra para o processamento da análise. Muitos trabalhos

têm sido desenvolvidos com biosensores, na Tabela 4 apresentam-se alguns trabalhos recentes

utilizando esse procedimento.

Tabela 4- Utilização de biosensores na análise de açúcares em alimentos. SENSOR AMOSTRA ANALITO DETECÇÃO LD / FL REFERENCIA

S.cerevisiae Refrigerante sacarose Eletrodo de O2

potenciométrico

FL: 0,01 a 30 mM ROTARIU; BALA;

MAGEARU, 2002

Invertase Cana de

açúcar

sacarose Termométrica FL: 0,10 a 0,50 M THAVARUNGKUL

et al. 1999

Células de

E. coli (K12)

Soluções

padrão

glicose,

frutose e

sacarose

Sensor amperométrico FL>2,5 mM

(Monosac)

FL> 4,0mM (Disac)

HELD et al., 2002

Frutose

desidrogenase

Mel frutose Sensor amperométrico LD< 10 µM

FL> 1,0 mM

BASSI; LEE; ZHU,

1998

GOD Soluções

padrão

glicose Sensor amperométrico FL: 0,027 a 4,0 mM SHANKARAN;

UEHEARA; KATO,

2003

GOD Soluções

padrão

glicose Sensor amperométrico FL> 2 mM COSNIER et al.,

2000

GOD Refrigerante glicose Eletrodo de carbono/

Eletroquimiolescência

FL: 0,05 a 10 mM

LD: 26 µM

ZHU; LI; ZHU, 2002

Lactase

S. cerevisiae

Leite lactose Eletrodo de CO2

potenciométrico

FL: 0,5 a 10 %

(Semilog)

AMÁRITA;

FERNÁNDEZ;

ALKORTA, 1997

β- galactosidase

GOD

Controle da

Fermentação

lactose Eletrodo de O2

potenciométrico

FL> 30 g/L YUAN; CHEN, 1999

GOD Glicose Oxidase; LD Limite de Detecção; FL Faixa Linear.

50

Embora esta técnica analítica apresente inúmeras vantagens, o uso industrial de

biosensores ainda é limitado. Dentre as principais limitações é possível citar: alto custo dos

sensores biológicos, o pequeno tempo vida útil e a necessidade de freqüente calibração do

sistema.

2.4.2 Edulcorantes Artificiais

Os edulcorantes artificiais tais como a sacarina, ciclamato, acesulfame-K, aspartame e

sucralose, têm sido amplamente utilizados pelo setor industrial. No entanto, é a indústria

alimentícia que mais tem explorado seu emprego, desenvolvendo novos produtos e

associações de edulcorantes que satisfaçam seus consumidores. Nas duas últimas décadas, o

crescente consumo destes compostos e uma regulamentação mais restritiva imposta pela

legislação têm propiciado o desenvolvimento de metodologias para detecção e quantificação

de edulcorantes artificiais em alimentos. Até o momento, os métodos mais utilizados são a

CLAE com detecção de UV-Vis, fluorescência ou ainda o método de cromatografia iônica.

(CASALS et al., 1996; RUTER; RACZEK; LEBENSM, 1992; BIEMER, 1989).

Infelizmente, trata-se de técnicas relativamente complexas, de alto custo e nem sempre

aplicáveis para todos os edulcorantes. No caso da determinação de ciclamato via CLAE-UV, a

absorção pobre deste composto inviabiliza esta análise, sendo necessário um pré-tratamento

(oxidação) e derivatização para posterior quantificação. Para estes casos a cromatografia

iônica de alta eficiência é uma alternativa, alguns trabalhos relatam a quantificação de

sacarina sódica, ciclamato de sódio, bem como a determinação simultânea de diversos

edulcorantes artificiais (BIEMER, 1989; CHEN et al., 1997; QU et al., 1999; CHEN; WANG,

2001).

51

Outras técnicas não menos complexas tais como, eletroforese capilar com detecção

potenciométrica (SCHNIERLE; KAPPES; HAUSER, 1998) e técnicas eletroquímicas

baseadas no uso de eletrodo de carbono ou eletrodos íon-seletivo (FATIBELLO-FILHO;

ANICETO, 1997), têm sido propostas para a detecção dos diversos edulcorantes. Filmes

lipidícos também podem ser utilizados para detecção ou monitoramento contínuo de

edulcorantes (NIKOLELIS; HIANIK; KRULL, 1999), uma vez que a produção de corrente

eletroquímica transiente é diretamente proporcional à concentração das espécies de interesse.

Dentre os edulcorantes artificiais mais empregados pela indústria, o aspartame

apresenta as maiores dificuldades de quantificação. Isto é decorrente das técnicas existentes

necessitarem de um tempo de análise muito grande e não possuírem a seletividade necessária

para sua determinação em amostras comerciais (PEREIRA; MARCOLINO-JUNIOR;

FATIBELLO-FILHO, 2000). Alguns destes procedimentos são espectrofotométricos, cuja

seletividade pode ser melhorada por aplicação de procedimentos preliminares de extração. O

método da ninidrina (VESELY; DÁVIDKOVÁ; PRUDEL, 1980), por exemplo, teve sua

seletividade melhorada utilizando-se extrações prévias em carbonato de propileno ou mistura

de isopropanol-metanol (1:1 v/v). Obviamente, as aplicações de procedimentos prévias

atentam contra a performance analítica do procedimento, principalmente no que diz respeito

ao tempo de análise. Métodos potenciométricos também estão disponíveis através da titulação

do aspartame com dinitrofluoro benzeno e detecção do ponto de equivalência com eletrodo de

íon seletivo de fluoreto (FATIBELLO-FILHO; MARCOLINO-JUNIOR; PEREIRA, 1999).

A cromatografia gás-líquida (FURDA; MALIZIA; VERNIERI, 1975) e a CLAE

(TYLER, 1984; STAMP; LABUZA, 1989; TSANG; CLARKE; PARRISH, 1985;

VERZELLA; BAGNASCO; MANGIA, 1985) também têm sido utilizadas para determinação

do aspartame. Esta última técnica apresenta a vantagem de possibilitar a determinação

52

simultânea do aspartame com outros edulcorantes artificiais tal como acesulfame-K, sacarina.

(FATIBELLO-FILHO; MARCOLINO-JUNIOR; PEREIRA, 1999).

Entre as novas tendências é possível destacar o uso de biosensores (GUILBAULT;

LUBRANO, 1988). Trata-se de procedimentos potenciométricos, fundamentados na

utilização de enzimas imobilizadas, como por exemplo, L-Aspartase e carboxipeptidase A

(FATIBELLO-FILHO et al., 1988), aspartato amino-transferase oxidase (VILLARTA,

SULEIMAN, GUILBAULT, 1993), α-quimotripsina e álcool oxidase (CHOU, 1996),

carboxil esterase e álcool esterase (ODACT, TIMUR, TELEFONEU, 2004). Entre os

principais inconvenientes da técnica, destaca-se: o pequeno tempo de vida dos eletrodos em

função da baixa estabilidade das enzimas e a seletividade significativamente menor que a

esperada para sistemas enzimáticos. Outra proposta relata a utilização de um sensor

amperométrico microbiano que utiliza células do Bacillus subtillis (RENNEBERG; RIEDEL;

SCHELLER, 1985) imobilizadas em um eletrodo modificado de oxigênio com membrana de

polietileno. Uma das desvantagens deste sistema está relacionada às sérias interferências

causadas pelos aminoácidos constituintes do aspartame e pela glicose (FATIBELLO-FILHO;

MARCOLINO-JUNIOR; PEREIRA, 1999).

A eletroforese capilar é outra técnica utilizada para a determinação de aspartame.

Walker; Zaugg; Walker em 1997 desenvolveram uma técnica que permite a determinação

simultânea de aspartame, ácido benzóico e cafeína em dois minutos com resultados

comparáveis aos produzidos através de CLAE.

Para a determinação de sucralose Nikolelis e Pantoulias em 2000 desenvolveram uma

técnica eletroquímica para a detecção rápida e sensível, baseado em uma bicamada de

membrana lipídica em superfície estabilizada (MLBSE). A interação da sucralose com a

MLBSE produz uma corrente eletroquímica em poucos segundos após o contato da

53

membrana com o edulcorante. Uma metodologia envolvendo a técnica de cromatografia

gasosa com coluna capilar também foi desenvolvida para a determinação de sucralose,

sacarose, lactulose e manitol. (FARHADI et al., 2003).

2.5 CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA

Frente às barreiras que as técnicas tradicionais apresentam, é notável a necessidade de

desenvolvimento de procedimentos analíticos mais rápidos, seletivos, sensíveis e de baixo

custo quando se objetiva aplicá-los ao setor de controle de qualidade.

Em função destas necessidades e através dos avanços computacionais, principalmente

na área da programação e interfaceamento de instrumentos aos computadores, um grande

número de variáveis podem ser obtidas para uma única amostra, produzindo assim uma

quantidade enorme de informações. Um exemplo notável é a intensidade de absorção em

vários comprimentos de onda que é rotineiramente registrada em um único espectro. A posse

desta grande quantidade de dados associada à utilização de ferramentas quimiométricas

possibilita extrair informações relevantes mesmo a partir de dados químicos de natureza

multivariada. A quimiometria por sua vez, pode ser definida como uma disciplina química

que emprega métodos matemáticos e estatísticos para planejar e/ou selecionar experimentos

de forma otimizada, a fim de fornecer o máximo de informação química com a análise dos

dados obtidos (FERREIRA et al., 1999).

De maneira geral, o procedimento da análise química é composto de duas etapas

fundamentais. Na primeira, alguns tratamentos físicos e químicos são utilizados com o

objetivo de transformar a amostra, levando-a a um estado físico e químico compatível com a

técnica analítica disponível. Na segunda, modelos de calibração são desenvolvidos para

obtenção de uma função de regressão que permita prever a quantidade da espécie de interesse,

54

a partir de um parâmetro físico ou químico medido. Embora o método de calibração

univariado seja o mais empregado, esta metodologia sub utiliza os dados. A utilização de

apenas um parâmetro dificulta, e às vezes até impossibilita, a determinação de um constituinte

ou constituintes em amostras cujos componentes apresentam interferências espectrais. A

calibração multivariada, por sua vez, permite a determinação de um componente de interesse

em matrizes complexas ou a análise de multicomponentes em sistemas mais simples, onde há

severa interferência espectral.

A calibração em análise multivariada é realizada com “n” espectros para um conjunto

de amostras com composição conhecida em “p” valores de comprimento de onda diferentes,

formando uma matriz X, com “n” linhas e “p” colunas. Uma matriz Y com os valores de

concentração também deve ser formada contendo “n” linhas, correspondendo às diferentes

amostras, e “q” colunas, indicando o número de diferentes analitos presentes nas amostras. O

próximo passo é desenvolver um modelo matemático apropriado (determinando-se um vetor

dos coeficientes de regressão – b) que melhor possa reproduzir Y a partir dos dados da matriz

X (Eq. 4). Esse modelo é utilizado na fase de previsão (com um conjunto teste) para estimar

as concentrações (Yteste) dos constituintes de novas amostras, a partir de seus espectros

(Xteste) (Eq. 5). Como estas metodologias trabalham com matrizes de dados, o processo de

isolar o fator Y da Eq. 4 para a obtenção da Eq.5, implica a utilização da matriz transposta de

X, ou seja, (Xteste)t ( NAGATA ; BUENO ; PERALTA-ZAMORA, 2001).

X = b * Y Eq.04

Yteste = (Xteste)t * b Eq.05

Os dados para a calibração multivariada podem ser organizados conforme ilustra a

Figura 7. Os valores de absorbância dos espectros, a cada comprimento de onda, são as

variáveis independentes, e as concentrações das amostras, as variáveis dependentes.

55

Existem vários métodos matemáticos para a realização dos processos de calibração

multivariada, como a Regressão Linear Múltipla (MLR), Regressão por Componentes

Principais (PCR), Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) e a Regressão de Mínimos Quadrados

Parciais (PLSR).

Figura 7- Organização dos dados para Calibração Multivariada.

Em qualquer uma destas metodologias multivariadas é comum a utilização de

procedimentos de transformação e/ou pré-processamento dos dados para aumentar e melhorar

a eficiência dos modelos ajustados a um determinado problema analítico.

2.5.1 Transformação de Dados

No caso dos procedimentos de transformação de dados, os métodos matemáticos

empregados são orientados às linhas da matriz de dados X. As técnicas mais comuns da

transformação dos dados são: (Pirouette User Guide)

- Primeira e segunda derivada (compensa o aumento de linha de base e melhoram a

separação de sinais não totalmente sobrepostos)

- Alisamento (diminui os ruídos)

Comprimento de onda (nm)

Abs

orbâ

ncia

56

- Log 10 (enfatiza sinais com baixa intensidade)

- Normalização (diminui o efeito das diferenças amostrais)

A aplicação de uma ou mais formas de transformação nos dados deve ser avaliada e

estudada caso a caso, tomando-se certos cuidados para que a escolha seja adequada ao sistema

que se está trabalhando. Nesta fase pode ser incluída ainda a redução ou eliminação de

variáveis.

2.5.2 Pré-Processamento de Dados

Um procedimento comum e importante, realizado antes de qualquer método

multivariado, é o pré-processamento de dados. Estes procedimentos permitem, a partir da

análise multivariada, obter informações mais precisas e exatas dos dados processados.

O procedimento de pré-processamento de dados é orientado às colunas da matriz de

dados, sendo usualmente aplicados tanto nas variáveis independentes (matriz X) quanto nas

variáveis dependentes (matriz Y).

O pré-processamento denominado Dados Centrados na Média é amplamente utilizado

em dados espectroscópicos. Basicamente, subtrai-se o valor de cada elemento da coluna (Xij)

pelo valor médio dos elementos dessa coluna (xmj), obtendo-se como resultado, uma matriz

onde todas as colunas tenham média zero. Esse procedimento facilita a visualização dos dados

(translada o sistema de origem até o centro do conjunto de dados) (THOMAS, 1994).

∑=

=n

1iijj x

n1xm Eq. 6

jijij xmxx −= Eq. 7

57

2.5.3 Análise de Componentes Principais (PCA)

Grande parte dos métodos multivariados modernos estão fundamentados na Análise de

Componentes Principais (PCA). Trata-se de uma importante ferramenta da compressão de

dados que permite a redução da dimensionalidade original, sem que haja perda de informação

relevante (KATEMAN; BUYDENS, 1993; MATLAB USER’S GUIDE).

Para ilustrar e facilitar a visualização dos principais aspectos envolvidos no PCA, um

conjunto constituído por 35 amostras que se distribuem de maneira tridimensional será

utilizado (Figura 8). Cada uma destas dimensões pode representar uma variável medida ou, no

nosso caso particular, valores de intensidade registradas em 3 valores de comprimento de

onda. Uma análise mais minuciosa desta ilustração indica que todo o conjunto amostral pode

ser delimitado por uma caixa retangular, cuja maior particularidade está representada por uma

pequena altura. Em primeira análise, observa-se também que nenhuma variável (Var1, Var 2 e

Var 3) descreve uma parcela importante da variância apresentada pelos dados.

Figura 8- Gráfico tridimensional do conjunto de dados composto por 35 amostras

Em função destes aspectos, e principalmente da característica mais fundamental do

PCA (redução do espaço dimensional) uma rotação e/ou transformação dos eixos originais é

realizada. Este novo sistema de eixos (mais comumente denominados como fatores,

Var 1

Var 2

Var 3

58

componentes principais, ou ainda variáveis latentes) apresenta a direção da máxima variância

de dados, conforme pode ser observado na Figura 9.

Figura 9- (A) Gráfico tridimensional ilustrando os eixos das componentes principais. (B)

Gráfico bidimensional da CP1 vs. CP2: escores representados por () e pesos por

(----).

A primeira componente principal (CP1) tem a direção que descreve a máxima

dispersão das amostras, sendo responsável pela explicação de grande parte da variância

apresentada pelo conjunto. No entanto, apenas esta componente principal não é suficiente

para explicar o comportamento global deste conjunto de dados, sendo necessária uma segunda

componente (CP2), a qual deve ser ortogonal a primeira é responsável pela explicação de uma

parcela importante da variância observada. Em princípio, é possível extrair tantas

componentes principais quanto o número de variáveis. No entanto, dada à baixa variabilidade

dos dados em torno da terceira componente principal (CP3), é possível que esta seja

descartada. Este procedimento atende às duas grandes premissas do PCA, ou seja, a redução

de variáveis, sem perda de informação relevante (KATEMAN; BUYDENS, 1993;

FERREIRA, 1999).

PC1

PC2

PC3

PC2

Var 1

Var 2

PC1

A B

59

Em termos analíticos instrumentais, esta redução do espaço dimensional, conseguido

através da seleção de poucas componentes principais, possibilita remover o ruído instrumental

(ou variações aleatórias), bem como as informações redundantes fornecidas por variáveis

altamente correlacionadas (colinearidade).

A aplicação do PCA propicia a obtenção de duas novas informações extremamente

úteis: os escores e os pesos (Figura 9B). Os escores são as novas coordenadas das amostras,

no novo sistema de eixos das componentes principais. Como cada componente principal é

construída pela combinação linear das variáveis originais, os pesos são os coeficientes desta

combinação, ou seja, trata-se do peso que cada variável original contribui para a obtenção do

novo sistema de eixos (FERREIRA, 1999). A interpretação conjunta dos escores e pesos

originados por poucas componentes principais viabiliza a análise qualitativa de diversos tipos

de amostras.

Um dos principais usos do PCA em alimentos objetiva a classificação e detecção de

diferentes tipos de adulterantes empregados em diversos produtos comerciais. Esta

metodologia tem recebido grande atenção devido à rapidez da análise e baixo custo,

propiciando resultados positivos e demonstrando seu potencial para o controle de qualidade.

A utilização de métodos químicos via úmida para esta mesma finalidade, inviabiliza o

trabalho de controle (mesmo das agências fiscalizadoras), uma vez que os métodos

disponíveis são freqüentemente demorados, de alto custo e muitas vezes acompanhados do

inconveniente de serem detectados por um número limitado de métodos (DOWNEY, 1998).

A eficiência do PCA na análise de adulterantes em alimentos deve-se principalmente a

possibilidade de associa-la à técnica de infravermelho médio. Esta técnica detecta bandas de

absorção bem resolvidas, facilidade na identificação dos grupos funcionais e possui uma

região de impressão digital (1200 a 700 cm-1), onde pequenas diferenças na estrutura e na

60

constituição de uma substância resultam em uma significativa mudança na distribuição dos

picos de absorção desta região do espectro (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 1998).

Um grande número de trabalhos tem sido reportado utilizando espectroscopia de

infravermelho médio com transformada de Fourier (FTIR-médio) em conjunto com PCA. Lai,

Kemsley e Wilson em 1994 investigaram o potencial desta técnica para determinar a

autenticidade de azeite de oliva refinado e azeite de oliva extra virgem. Apesar destas duas

amostras de óleos serem quimicamente e espectroscopicamente muito semelhantes, elas foram

corretamente classificadas, demonstrando o potencial desta metodologia para verificar a

autenticidade destes produtos com grande rapidez. Zagonel, Peralta-Zamora e Ramos em

2004 desenvolveram um procedimento para monitorar a etanólise de óleo de soja degomado.

Os reagentes (triglicerídeos) e os produtos (etil ésteres) envolvidos na etanólise possuem um

espectro no infravermelho médio muito semelhante. Porém, quando os espectros derivados

foram empregados na PCA, na região entre 1700-1800 cm-1, duas componentes principais

mostraram capturar 99,95% da variância total dos dados espectrais.

Um trabalho de classificação de carnes foi realizado por Al-Jowder, Kemsley, Wilson

em 2002, utilizando espectroscopia de infravermelho médio e métodos quimiométricos, PCA,

PLS e Análise Discriminante Linear (LDA) para a discriminação de adulterantes (coração,

tripa, rim, e fígado) em carne de boi, mostrando-se eficiente.

Sivakesava e Irudayaraj em 2002 classificaram adulterantes no mel por FTIR-médio

através de refletância total atenuada. Os adulterantes considerados foram açúcares (glicose,

frutose e sacarose) e açúcares invertidos (de cana de açúcar e de beterraba). Para classificação

dos modelos foram utilizados LDA, compressão de dados via PCA e PLS, sendo que os

adulterantes glicose, frutose e sacarose foram classificados com sucesso.

61

Dupuy et al. em 1997 também utilizaram PCA em conjunto com espectrometria de

infravermelho médio (1500 cm–1 a 700 cm–1) e desenvolveram um método de classificação

para amido de milho modificado. Apesar do grande potencial da análise por PCA, somente

uma classificação parcial dos amidos em subgrupos foi possível. Isto é decorrente dos

espectros de amido de milho serem muito semelhantes, o que torna a classificação mais

difícil. Isto pode ser contornado incluindo dados de diversas amostras de todos os tipos de

modificação do amido de milho encontrados na agroindústria.

2.5.4 Regressão de Mínimos Quadrados Parciais (PLSR) e Regressão por Componentes

Principais (PCR)

Dentre os métodos de análise multivariada quantitativos, destaque deve ser dado ao

PLSR e ao PCR. Ambos são consideravelmente mais eficientes que os métodos multivariados

tradicionais (MRL, CLS), principalmente para lidar com ruídos experimentais, colinearidade e

não linearidade. Todas as variáveis independentes relevantes são incluídas nos modelos

multivariados, o que implica que a calibração pode ser realizada eficientemente mesmo na

presença de interferentes. Além disso, estes métodos são robustos, ou seja, seus parâmetros

praticamente não se alteram com a inclusão de novas amostras no conjunto de calibração

(FERREIRA et al., 1999).

Particularmente, o PLSR tem se tornado uma ferramenta extremamente útil e

importante nos diversos campos da ciência. Este método consiste em decompor as matrizes de

dados X (variáveis independentes) e Y (variáveis dependentes) em uma soma de produtos de

dois vetores (escores, t e u e pesos, p e q) cada um deles representando uma componente

principal (Eq. 7 e 8). Esta metodologia pode ser aplicada em duas versões denominadas

costumeiramente de PLSR1 e PLSR2. O algoritmo matemático é similar, sendo que no

62

PLSR1 um modelo é otimizado para cada um dos analitos, enquanto no PLSR2 um único

modelo é obtido para todos os analitos simultaneamente. O procedimento de representar uma

matriz de dados em termos de escores apenas modifica a maneira como se visualiza os dados

e, portanto não ocorrem perdas de informação estatística relevante, com a vantagem de

reduzir o espaço multidimensional das variáveis sem que haja correlação entre as mesmas.

X = t1p1 + t2p2 + .......+ tnpn + E Eq.8

Y = u1q1 + u2q2 + .......+ unqn + E Eq.9

Existem vários algoritmos matemáticos para calcular esta decomposição, sendo os

mais populares conhecidos por NIPALS (GELADI; KOWALSKI, 1986) e Decomposição de

Valor Singular (SVD). O modelo resultante para as decomposições mostradas na Eq. 8 e 9

estão representadas pelas Eq. 10 e 11.

X = TP’ + E Eq. 10

Y = UQ’ + F Eq. 11

Os elementos das matrizes T e U são os escores de X e Y respectivamente, e os

elementos P e Q são os “pesos”. As matrizes E e F correspondem aos erros, ou seja o quanto o

modelo construído não consegue explicar os dados originais.

Um aspecto característico do método PCR é a construção das componentes principais

utilizando unicamente a decomposição das respostas instrumentais (X) sem levar em

consideração informações provenientes das concentrações (Y). Isto pode constituir uma

fragilidade do método para aqueles casos em que o analito de interesse tem um sinal muito

fraco e, portanto não influencia fortemente nas primeiras componentes principais, fazendo

com que um número maior delas seja necessário para a construção do modelo.

63

A escolha entre estes dois métodos não pode ser aconselhada de uma forma genérica,

uma vez que ambos são igualmente eficientes e as pequenas variações dependem de caso para

caso.

Muitos trabalhos trazem técnicas utilizando metodologias multivariadas em conjunto

com técnicas espectrométricas para a análise quantitativa de alimentos. Lanza e Li (1984)

utilizaram infravermelho próximo (NIR) em conjunto com PLSR para determinação de

açúcares totais e açúcares individuais, empregando a 2a derivada dos espectros de

transmitância em diferentes sucos de frutas como padrões de calibração. Bons resultados

foram obtidos para açúcares totais, principalmente quando modelos de calibração separados

foram feitos levando-se em consideração a qualidade dos sucos de frutas. Resultados com

pouca precisão e sensibilidade foram obtidos para açúcares individuais, devido a forte

sobreposição espectral de glicose, frutose e sacarose. No entanto, estudos realizados em

material seco, cuja forma cristalina propicia maiores detalhes espectrais pela interação

açúcar–açúcar possibilitou a determinação de açúcares individuais. Estes resultados são

provavelmente decorrente da interação açúcar-água que faz os açúcares apresentarem

espectros muito similares, devido a forte absorção da água nesta região.

Li, Goovaerts, Meurens em 1996 conseguiram obter bons resultados com a

combinação da técnica NIR e os métodos MLR e PLSR na determinação e quantificação de

glicose, frutose, sacarose e ácido cítrico, em sucos de laranja. O extrato seco foi utilizado para

evitar o alargamento das bandas pela sobreposição das bandas vibracionais da água, e

melhores resultados foram obtidos empregando-se o método PLSR.

Rambla, Garrigues, Guardiã em 1997 aplicaram NIR e PLSR para identificar e

quantificar, glicose, frutose, sacarose e açúcares totais em misturas sintéticas, assim como em

sucos de frutas empregando medidas de transmitância com 1º derivada. A calibração foi

realizada de duas maneiras: com substâncias puras de cada um dos carboidratos e com

64

misturas binárias e ternárias de glicose, frutose e sacarose. Percebeu-se que os espectros

glicose, frutose e sacarose absorvem em regiões muito parecidas, e a água novamente é o

grande empecilho da determinação. Entre 1300 a 1800 nm observaram-se algumas diferenças

nos espectros sendo possível identificar e quantificar nesta região o conteúdo de açúcares

totais. Entre 2050 e 2300 nm grandes diferenças entre os compostos foram verificadas,

possibilitando a quantificação de cada carboidrato separadamente em amostras contendo

misturas. A primeira derivada eliminou problemas como a absorção da radiação de fundo em

amostras reais (decorrentes da dispersão de partículas sólidas) e intensificou as diferenças

entre os espectros correspondentes aos três carboidratos, porém a sensibilidade da

determinação analítica foi reduzida.

Também utilizando PLSR e técnicas de Espectrometria de Infravermelho Próximo

com Transformada de Fourier (FT-NIR) foram determinadas as concentrações dos açúcares

individuais (glicose, frutose e sacarose) em sucos de maçã e laranja. O modelo PLSR foi

otimizado empregando-se validação cruzada e dados espectrais transformados para 2a

derivada. A habilidade de previsão do modelo foi avaliada em sucos de frutas, comparando-se

os resultados com a CLAE e as técnicas enzimáticas convencionais. Modelos gerados pelos

espectros de transmitância forneceram as melhores performances analíticas com taxa de

recuperação dos açúcares de 93%. A determinação de glicose e frutose nos sucos de maçã e

laranja por NIR apresentou boa precisão e exatidão quando comparando-se aos métodos

analíticos convencionais. No caso da sacarose, os resultados apresentaram-se superestimados

no suco de maçã somente quando comparados com o método CLAE (RODRIGUEZ-SAONA

et al., 2001).

García- Alvarez et al. em 2002 realizaram um trabalho para determinar os parâmetros

polarimétricos do mel por espectroscopia de transflectância NIR em conjunto com PLSR

modificado (MPLSR), utilizando os dados espectrais com 1a e 2a derivada. Para isto, 156

65

amostras de mel foram coletadas durante os anos de 1992 (45 amostras), 1995 (56 amostras) e

1996 (55 amostras). A calibração foi realizada com 118 destas amostras, e a validação foi

feita com as demais 38 amostras, utilizando todas as amostras coletadas nos três anos. Os

resultados foram comparados com métodos polarimétricos convencionais evidenciando que a

metodologia proposta não é efetiva para a análise quantitativa da sacarose no mel, sendo

aceitável apenas como um método semi-quantitativo com um intervalo de confiança de 9,5%

para os méis utilizados neste estudo.

Utilizando FTIR-médio um método totalmente automatizado foi desenvolvido para a

rápida determinação de ácidos orgânicos (ácido cítrico, málico e tartárico) e açúcares (glicose,

frutose, e sacarose) em refrigerantes por injeção seqüencial. Dois modelos PLSR foram

desenvolvidos, um para açúcares e outro para os ácidos orgânicos, baseados na análise dos

padrões contendo todos os seis analitos. O método desenvolvido foi aplicado em amostras

naturais, e seus resultados estão de acordo com os obtidos pelo método enzimático. O método

desenvolvido é caracterizado pelo seu pequeno tempo de análise, simplicidade experimental e

seu potencial para a aplicação em rotinas de análises envolvendo processos de controle de

qualidade (LeTHANH; LENDL, 2000).

Cadet et al. em 1991 aplicaram FTIR-médio com Refletância Total Atenuada (ATR)

para determinar e quantificar sacarose em suco de cana-de-açúcar clarificado, utilizando PCR.

Em decorrência da complexidade da matriz amostral (açúcares, ácidos orgânicos e

aminoácidos), o espectro da sacarose pura mostrou-se muito diferente do espectro da sacarose

em uma mistura. Em decorrência deste aspecto, os melhores resultados foram obtidos quando

a calibração foi realizada com uma mistura de sacarose, frutose e glicose em água. Um

trabalho mais amplo realizado por Cadet em 1999 utilizou PCR para processar espectros de

FTIR-médio com ATR, com o objetivo de determinar não apenas sacarose, mas também

glicose e frutose em amostras de suco de cana-de-açúcar, obtendo bons resultados.

66

O FTIR-médio e vários métodos de calibração multivariada PLSR, MLR e PCR foram

utilizados para determinação de glicose, frutose e sacarose em extratos secos em amostras de

diversos tipos de sucos de frutas. Os resultados apresentaram erros menores que 10%,

comparáveis à determinação por CLAE, e com a vantagem do preparo das amostras e as

leituras no espectrofotômetro serem dez vezes mais rápida que a técnica cromatográfica

(DUPUY et al., 1992).

Bellon (1993) propõe um método utilizando FTIR-médio, ATR e métodos

multivariados (MLR, PCR e PLSR) para determinar a concentração de açúcares nos processos

on-line de fabricação de vinhos. Os modelos PLSR1 com a 1a derivada dos espectros

forneceram os melhores resultados, com erros 1,4; 1,4; 4,9% para frutose, sacarose e glicose,

respectivamente.

Utilizando um espectrofotômetro na faixa do visível Ni, Huang e Kokot em 2003,

realizaram a determinação quantitativa de glicose, frutose e lactose em amostras de alimentos,

baseada na cinética dos açúcares individuais empregando-se ferricianeto de potássio

(K3Fe(CN)6) como oxidante. As cinéticas de oxidação destes açúcares foram otimizadas e

processadas por métodos quimiométricos (PLSR, PCR, CLS, redes neurais artificiais com

back propagation BP-ANN ou radial basis function RBF-ANN) utilizando a 1a derivada ou

os dados cinéticos originais. Os resultados mostraram que a calibração baseada nos dados

com aplicação da 1a derivada mostrou vantagens na fase de previsão dos analitos e os

métodos RBF-ANN e PLSR apresentaram os menores RMSEP relativos (5,6 e 6,8

respectivamente) quando comparados aos outros métodos multivariados, tal como o CLS

(RMSEP relativo de 8,7).

67

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVOS GERAIS

Através do presente trabalho propõe-se estudar a potencialidade de algumas

alternativas multivariadas de calibração, para viabilizar a determinação qualitativa e

quantitativa da classe de edulcorantes (naturais e artificiais) em adoçantes comerciais, via

Espectrometria de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e Espectrofotometria

UV-Visível (UV-Vis).

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Analisar qualitativamente adoçantes comerciais através da técnica de Espectrometria

de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) associada à metodologia de

Análise por Componentes Principais (PCA).

- Avaliar a performance na identificação e classificação de diversos edulcorantes

naturais e artificiais em marcas comerciais de adoçantes.

- Analisar quantitativamente associações de lactose/aspartame e lactose/esteviosídeo,

empregando-se as metodologias multivariadas de Regressão de Mínimos Quadrados

Parciais (PLSR1 e PLSR2) e Regressão por Componentes Principais (PCR) aos dados

espectrais extraídos da técnica de Espectrofotometria UV-Vis.

- Selecionar os modelos de melhor desempenho considerando-se os dados de validação

cruzada e validação externa.

- Determinar quantitativamente os analitos de interesse em adoçantes de mesa vendidos

nos supermercados locais.

- Comparar os resultados com as informações cedidas pelo fabricante.

68

4 PARTE EXPERIMENTAL

4.1 REAGENTES

Todos os reagentes utilizados durante a preparação de amostras, análise via

infravermelho (FTIR-médio) e de soluções (análise via espectrofotometria UV-Vis) foram de

grau analítico PA. Os padrões de edulcorantes artificiais foram gentilmente cedidos pela

Nutrasweet e pela Lowçucar. A água desionizada, utilizada para o preparo e diluição das

soluções, foi obtida através de um sistema de purificação Permution Desionizador.

4.2 MATERIAL VOLUMÉTRICO

O preparo de soluções foi realizado utilizando-se balões volumétricos. As alíquotas

foram tomadas em pipetas volumétricas previamente calibradas, ou através das micropipetas

de volume variável citadas abaixo:

- Micropipeta Eppendorf com variação de volume no intervalo de 500-5000 µl.

- Micropipeta Brand com variação de volume no intervalo de 100-1000 µl.

4.3 EQUIPAMENTOS

- Espectrofotômetro UV-Vis Shimadzu ,modelo Multispec 1501.

- Espectrômetro de Infra-Vermelho Shimadzu, modelo FTIR 8.400.

- Prensa Shimadzu S72-120 KN

- Balança Eletrônica BG 400 Gehaka

69

- Balança Eletrônica ADA 210/C

- Balança Eletrônica LAC 214 Quimis

- Estufa com Circulação e Renovação de ar TE-394/2 Tecnal

4.4 PROGRAMAS COMPUTACIONAIS

- Microcal OriginTM (Versão 5.0)

- MATLAB for Windows (versão 4.0) utilizando-se o programa PLS Toolbox (versão

1.5)

- Pirouette for Windows 3.11.

4.5 PROCEDIMENTO ANALÍTICO

4.5.1 Amostras para o modelo PCA

Os adoçantes de mesa foram obtidos nos supermercados locais e a Tabela 5 apresenta

a composição de cada adoçante de mesa utilizado neste trabalho. Para a análise destas

amostras via FTIR, foram preparadas pastilhas contendo cerca de 1 mg do adoçante e 100 mg

de KBr (grau analítico Merck). Para tal, processos de homogeneização e trituração da amostra

e KBr foram realizados com o auxílio de um almofariz e pistilo de ágata. Posteriormente, toda

a massa foi transferida cuidadosamente para o pastilhador onde uma pressão de 60 KN foi

aplicada para a confecção da pastilha. As pastilhas foram secas à temperatura amena (60º C)

por 6 horas, para garantir que os edulcorantes com instabilidade a altas temperaturas não

fossem degradados. Os espectros foram obtidos na região de 4000 a 400 cm–1, resolução de

4 cm-1 (16 varreduras realizadas). Anterior as medidas de IV das amostras foi obtido um

espectro da pastilha do branco (contendo apenas 100 mg de KBr).

70

Tabela 5- Composição declarada pelos fabricantes das amostras comerciais de adoçantes.

Amostra Veículo (%) Edulcorantes

1 Lactose (93,75%) Aspartame


3 Dextrose e Maltodextrina Aspartame


5 Lactose Ciclamato, Sacarina, Aspartame e Acesulfame-K

6 Lactose Ciclamato, Sacarina, Aspartame e Acesulfame-K

7 Maltodextrina (91,0%) Ciclamato e Sacarina

8 Maltodextrina Sorbitol, Ciclamato e Sacarina

9 Lactose e Maltodextrina Aspartame, Acesulfame-K

10 Lactose e Maltodextrina Ciclamato, Sacarina e Esteviosídeo

11 Maltodextrina (80,0%) Esteviosídeo

12 Maltodextrina (95,5%) Ciclamato, Sacarina

13 Sacarose Sucralose

14 Sacarose (99,7%) Sucralose

15 Sacarose (97,0%) Ciclamato, Sacarina e Aspartame

16 Sacarose (96,5%) Ciclamato e Sacarina

17 Sacarose (99,7%) Aspartame

18 Lactose (95,0%) Ciclamato, Sacarina e Esteviosídeo

19 Lactose (93,0%) Esteviosídeo

20 Lactose (95,0%) Ciclamato, Sacarina e Esteviosídeo



4.5.2 Preparo das soluções para construção dos modelos PLSR e PCR

4.5.2.1 Amostras com Associação de Lactose e Aspartame

As soluções-estoque de aspartame e lactose foram preparadas pela simples pesagem do

padrão em balança analítica e posterior dissolução com água desionizada em balão

volumétrico de 100 mL. Obteve-se então uma solução de concentração 1 g/100mL de

aspartame, e outra contendo 2 g/100 mL de lactose.

71

Todas as outras soluções empregadas para este estudo (misturas sintéticas para a fase

de calibração e previsão) foram obtidas por diluição com água desionizada de ambas as

soluções-estoque. A Tabela 6 mostra a concentração de cada edulcorante nas 20 soluções

empregadas para a construção dos modelos de calibração PLSR e PCR. Para a etapa de

previsão foram preparadas 5 misturas sintéticas (Tabela 7) com concentrações dentro da faixa

estabelecida no conjunto de calibração.

Tabela 6- Misturas sintéticas e suas respectivas concentrações de lactose e aspartame

utilizadas para construção dos modelos multivariados de calibração.

Concentrações (g/100mL)

Amostras Lactose Aspartame

1 0,264 0,00397

2 0,264 0,01191

3 0,264 0,01588

4 0,264 0,02382

5 0,272 0,00397

6 0,272 0,01191

7 0,272 0,01588

8 0,272 0,02382

9 0,280 0,00397

10 0,280 0,01191

11 0,280 0,01588

12 0,280 0,02382

13 0,288 0,00397

14 0,288 0,01191

15 0,288 0,01588

16 0,288 0,02382

17 0,296 0,00397

18 0,296 0,01191

19 0,296 0,01588

20 0,296 0,02382

72

Tabela 7- Misturas sintéticas e suas respectivas concentrações de lactose e aspartame

utilizadas para validação dos modelos multivariados de calibração.


Lactose Aspartame

0,272 0,0198

0,264 0,0079

0,288 0,0198

0,296 0,0079

0,280 0,0198

Os espectros de todas estas soluções foram obtidos em um Espectrofotômetro UV-Vis

Shimadzu, modelo Multispec 1501 na região de 200 a 800nm com resolução de 1nm.

4.5.2.2 Amostras com Associação de Lactose e Esteviosídeo

As soluções-estoque de aspartame e esteviosídeo foram preparadas pela simples

pesagem do padrão em balança analítica e posterior dissolução com água desionizada em

balão volumétrico de 100 mL. Obteve-se então uma solução de concentração 2 g/100mL de

lactose e outra contendo 0,1 g/100 mL de esteviosídeo.

Todas as outras soluções empregadas para este estudo (misturas sintéticas para a fase

de calibração e validação) foram obtidas por diluição com água desionizada de ambas as

soluções-estoque. A Tabela 8 mostra a concentração de cada edulcorante nas 20 soluções

empregadas para a construção dos modelos de calibração PLSR1 e PLSR2 e PCR. Para a

etapa de previsão foram preparadas 5 misturas sintéticas (Tabela 9) com concentrações dentro

da faixa estabelecida no conjunto de calibração.

Os espectros das soluções foram obtidos em um Espectrofotômetro UV-Vis Shimadzu,

modelo Multispec 1501 na região de 200 a 800 nm com resolução de 1 nm.

73

Tabela 8- Misturas sintéticas e suas respectivas concentrações de lactose e esteviosídeo

utilizadas para construção dos modelos.


Amostras Lactose Esteviosídeo

1 0,264 0,006

2 0,264 0,0148

3 0,264 0,024

4 0,264 0,032

5 0,272 0,006

6 0,272 0,0148

7 0,272 0,024

8 0,272 0,032

9 0,280 0,006

10 0,280 0,0148

11 0,280 0,024

12 0,280 0,032

13 0,288 0,006

14 0,288 0,0148

15 0,288 0,024

16 0,288 0,032

17 0,296 0,006

18 0,296 0,0148

19 0,296 0,024

20 0,296 0,032

Tabela 9- Faixa de concentração de lactose e esteviosídeo para a etapa de validação.


Lactose Esteviosídeo

0,264 0,0092

0,272 0,0268

0,280 0,018

0,288 0,012

0,296 0,030

74

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 ANÁLISE QUALITATIVA

A autenticidade é um critério importante para a qualidade dos alimentos,

principalmente para produtos diet e light, pois a composição declarada na embalagem

determina o preço do produto e possibilita que os consumidores escolham os edulcorantes

naturais e artificiais que acreditam ser o mais seguro para a sua saúde. A troca de edulcorantes

caros por edulcorantes baratos pode ser muito lucrativa para as indústrias, pois geralmente os

consumidores não percebem a modificação, uma vez que o sabor do alimento adulterado pode

ser muito semelhante ao produto legítimo.

Infelizmente, ainda não existem técnicas rápidas e de baixo custo para a classificação e

detecção de adulterantes. As técnicas atualmente disponíveis para este fim são complexas,

requerem grande tempo de análise e alto custo, como por exemplo, as técnicas

cromatográficas.

5.1.1 Análise por Componentes Principais (PCA)

Na literatura atual a PCA têm recebido muita atenção pela sua capacidade de

classificação e também pela possibilidade de detecção de adulterantes. Além da sua grande

capacidade de discriminação sob condições muito similares, ela conta muitas vezes com uma

análise instrumental rápida e de baixo custo.

A eficiência do PCA na análise de adulterantes em alimentos deve-se principalmente a

possibilidade de associá-la à técnica de FTIR-médio, a qual possui características que

possibilitam a classificação e detecção de adulterantes de forma única.

75

As amostras objetos deste estudo possuem estruturas semelhantes e muitas vezes

grupos funcionais iguais, como pode ser evidenciado nas Figuras 1, 2, 3, 4, 5 e 6 apresentadas

anteriormente e também na Figura 10.

(A) (C)

(B) (D)

Figura 10- Estruturas químicas (A) Frutose, (B) Glicose, (C) Lactose e (D) Sacarose. FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

Esta semelhança estrutural e a mistura de edulcorantes nos produtos comerciais fazem

com que o espectro de FTIR-médio dos adoçantes seja muito semelhante. Estas características

impossibilitam a diferenciação e/ou classificação dos diferentes adoçantes apenas pela

simples análise visual dos espectros. A Figura 11 mostra a grande quantidade de informação

similar que os espectros de FTIR-médio de adoçantes comerciais possuem, o que evidencia a

necessidade de uma ferramenta que possibilite analisar qualitativamente este tipo de amostras.

A Análise por Componentes Principais (PCA) foi a ferramenta analítica empregada

com o intuito de classificar os adoçantes de mesa de acordo com a sua composição, ou seja,

certificar e caracterizar a presença dos edulcorantes naturais e artificiais. Esta análise foi

realizada inicialmente pelo processamento dos dados da transmitância de toda faixa espectral

76

do infravermelho (4000 cm-1 a 400 cm-1, conforme mostra a Figura 11) utilizando o programa

Pirouette for Windows 3.11. Foram testados os dados originais e alguns tipos de

transformações de dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao procedimento de pré-

processamento com dados centrados na média.

Figura 11- Espectro de infravermelho médio para as 22 amostras (Tabela 5) analisadas via

PCA na região espectral entre 400 cm-1 a 4000 cm-1.

A melhor classificação para os adoçantes de mesa foi obtida pela aplicação da 1a

derivada aos dados espectrais. Geralmente, este procedimento realiza uma espécie de

deconvolução parcial de sinais não totalmente sobrepostos, o que possibilita que pequenas

diferenças sejam mais bem evidenciadas por este tipo de transformação. A análise de escores

da CP1 vs CP2 (Figura 12) apresenta uma clara separação das amostras pelos veículos que a

compõem.

77

Figura 12- Gráfico de escores para as 1a e 2a componentes principais na análise de adoçantes

de mesa.

Pela análise de escores é possível observar que para altos valores de CP1 estão as

amostras de adoçantes de mesa que possuem o veículo lactose (1, 2, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 e

22) e para baixos valores de CP1 apresentam-se as amostras com veículo sacarose (13, 14, 15,

16 e 17) e maltodextrina (7, 8, 11 e 12).

Enquanto isso, a CP2 propicia duas outras separações, a dos outros veículos (sacarose

e maltodextrina) e também uma que envolve a participação dos edulcorantes artificiais

utilizados para a produção dos adoçantes de mesa. Na primeira, as amostras com veículo

sacarose agrupam-se na região positiva da CP2, enquanto inversamente as amostras com

veículo maltodextrina na região negativa da CP2.

A segunda separação que a CP2 propicia é menos evidente e retrata diferenciações

entre as amostras com veículo lactose. Para altos valores de CP2 encontram-se as amostras

CP2

CP1

78

com composição lactose e aspartame e para baixos valores de CP2 encontram-se as amostras

com composição lactose e diversos edulcorantes.

Neste ponto da análise é possível observar a localização errônea (Figura 12) em

termos de escores da amostra 6 (composição: lactose, ciclamato, sacarina, acesulfame e

aspartame), que aparece no grupo das amostras de composição lactose e aspartame em valores

positivos de CP1 e valores positivos de CP2. Em função das características desta amostra, sua

localização correta deveria ser valores positivos de CP1 e negativos de CP2, junto das

amostras com composição lactose e uma combinação de edulcorantes, mas especificamente

junto da amostra 5 já que possuem a mesma composição.

Comparando os espectros das amostras 5 e 6 na região entre 752,19 a 1284,5 cm-1, é

possível observar uma grande semelhança de bandas, diferindo-se apenas nos valores de

transmitância. Esta característica pode ser decorrente da concentração distinta dos

componentes destes adoçantes ou da diferenças cristalinidade das amostras na preparação das

pastilhas de KBr.

700 800 900 1000 1100 1200 1300

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95Amostra 5Amostra 6

Tran

smitâ

ncia

(%)

Comprimento de onda (cm-1)

Figura 13- Espectro de infravermelho médio para a amostra 5 e 6 na região espectral entre

752,19 cm-1 a 1284,5 cm-1.

79

Este comportamento anômalo ocasionou a retirada da amostra 6 do conjunto de

amostras em estudo e, portanto uma nova PCA foi realizada, mantendo as mesmas

características analisadas anteriormente.

As amostras 9 e 10 não foram citadas anteriormente pois possuem uma

particularidade, ambas contém na sua composição dois diferentes veículos, lactose e

maltodextrina. A localização destas amostras em termos de escores mostra que elas não

apresentam nem valores muito positivos (igual às amostras contendo veículo lactose) e nem

negativos (igual às amostras contendo veículo maltodextrina) na CP1, indicando que o veículo

deve ter realmente uma composição mista e uma menor concentração de lactose.

Uma tendência similar ocorre com a amostra 3, que possui como veículo a mistura de

maltodextrina e dextrose. Em função das diferenças de composição, enquanto as amostras que

possuem exclusivamente maltodextrina aparecem agrupadas em valores negativos de CP1 e

CP2, a amostra 3 particularmente aparece deslocada no sentido de valores mais negativos de

CP2 que as demais amostras.

Para evidenciar as regiões espectrais de FTIR-médio importantes para a organização

em grupos verificada pelos escores (Figura 12), é necessário observar o gráfico de pesos

(Figura 14) que mostra os comprimentos de ondas imprescindíveis na forma de pesos

(positivos ou negativos) para classificação observada.

80

Figura 14- Gráfico de pesos para as 1a (vermelho) e 2a (verde) componentes principais na

análise de adoçantes de mesa.

A análise dos pesos para esta CP fica muito prejudicada, pois há uma grande

quantidade de comprimentos de onda, sendo grande parte deles compostas por valores de peso

próximo de zero (variáveis de menor importância). Isto dificulta a visualização dos

comprimentos de onda realmente importantes para a classificação das amostras. Em função

destes aspectos, os comprimentos de onda com valores de pesos próximos de zero foram

sistematicamente retirados, sem que houvesse a perda das características de classificação

observadas anteriormente. Constatou-se que a região espectral de maior importância (valores

altamente positivos e negativos de pesos) para a classificação das amostras encontra-se entre

752,19 a 1284,5 cm-1. Nesta região, é possível observar similaridades entre os espectros dos

adoçantes com o mesmo veículo, conforme mostra a Figura 15.


Pes

os

81

700 800 900 1000 1100 1200 1300

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Amostra 1 Amostra 2 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 9 Amostra 10 Amostra 18 Amostra 19Amostra 20Amostra 21Amostra 22

Tran

smitâ

ncia

(%)

Comprimento de onda (cm-1) (A)

700 800 900 1000 1100 1200 130020

40

60

80

100

120

Amostra 3 Amostra 7 Amostra 8 Amostra 10 Amostra 11

Tran

smitâ

ncia

(%)

Comprimento de onda (cm-1)(B)

700 800 900 1000 1100 1200 130010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

Amostra 13 Amostra 14 Amostra 15 Amostra 16 Amostra 17

Tran

smitâ

ncia

(%)


(C)

Figura 15- Espectro de infravermelho dos adoçantes de mesa nos comprimentos de onda entre

752,19 a 1284,5 cm-1. (A) veículo lactose, (B) veículo maltodextrina e (C) veículo

sacarose.

82

Destaque deve ser dado ao espectro da amostra 3 (em preto) na Figura 15 (B) que

apresenta um comportamento espectroscópico diferenciado em função da mistura de veículos

presentes nesta amostra (maltodextrina e dextrose). Esta diferença também foi evidenciada

anteriormente na primeira PCA.

Portanto, são estas similaridades (Figura 15) e diferenças (Figura 16) nos dados

espectrais desta região que fazem com que os adoçantes de mesa possam ser agrupados de

maneira distinta. Aqueles que possuem o mesmo veículo se agrupam em um mesmo

quadrante no gráfico de escores, enquanto amostras com veículos diferentes não.

700 800 900 1000 1100 1200 130020

30

40

50

60

70

80

90

100

110 Lactose Sacarose

Tran

smitâ

ncia

(%)


Figura 16- Espectro de infravermelho médio na região espectral de interesse para Lactose

pura e Sacarose pura.

A classificação obtida via PCA, baseia-se principalmente nos diferentes tipos de

veículos que compõem os adoçantes de mesa comerciais e não no tipo de edulcorante

artificial utilizado na sua fabricação. Isto ocorre porque o espectro FTIR-médio dos adoçantes

corresponde ao espectro de uma mistura, veículo + edulcorantes. Como o veículo é o

componente em maior quantidade (correspondem a mais de 90% do conteúdo total em todas

as amostras) o espectro é muito semelhante ao espectro do veículo puro. Este resultado não

83

indica a falta de representatividade dos edulcorantes artificiais, mas sim das suas baixas

concentrações e da alta sobreposição espectral devido à combinação de vários edulcorantes

artificiais.

Com estas evidencias um novo modelo foi construído com as seguintes características:

1a derivada dos dados de transmitância na região de comprimentos de onda entre 752,19 a

1284,5 cm-1, com dados centrados na média e sem a amostra 6.

Com este novo modelo, duas componentes principais são responsáveis pela distinção

entre os veículos. A 1a componente principal descreve 62,53% da variância dos dados,

enquanto a 2a componente principal 19,67%, totalizando 82,21%.

A Figura 17 mostra os escores da nova PCA, cuja classificação para as amostras

permanece a mesma do modelo anterior. No entanto, durante a análise dos pesos (Figura 18),

é possível identificar os comprimentos de onda com os pesos responsáveis pela classificação

das amostras. (pesos mais positivos ou negativos).

Figura 17- Gráfico de escores para as 1a e 2a CP para a análise dos adoçantes de mesa na faixa

espectral entre 752,19 a 1284,5 cm-1 e sem a amostra 6.

CP1

CP2

84

Figura 18- Gráfico de pesos para as 1a (vermelho) e 2a (verde) CP para a análise dos

adoçantes na faixa espectral entre 752,19 a 1284,5 cm-1 e sem a amostra 6.

Analisando o gráfico de escores, Figura 17, observa-se claramente que todas as

amostras que possuem o veículo lactose em sua composição encontram-se em altos valores

positivos de CP1. Através da análise dos pesos, Figura 18, verifica-se que os valores mais

positivos de peso para a CP1 ocorre em sinais localizados no comprimento de onda 902,62

cm-1 (alto valor positivo de peso = 0,2016), 1043,42 cm-1 (peso = 0,1583), 1099,35 cm-1 (peso

= 0,1305) e 879,48 cm-1 (peso = 0,1108). Estes sinais estão presentes no espectro derivado da

lactose pura, mas não dos outros edulcorantes, conforme mostra a simbologia * na Figura 19.

Por outro lado, as amostras que apresentam na sua composição o veículo sacarose ou

maltodextrina encontram-se em valores negativos de CP1. Observando-se o gráfico de pesos,

verifica-se que os valores mais negativos de peso para a CP1 ocorre em um sinal localizado

no comprimento de onda 871,76 cm-1 (alto valor negativo de peso = -0,2020), seguido pelo

sinal em 1016,41 cm-1 (valor negativo de peso = -0,1612). Isso indica que a ausência de sinais

85

característicos da lactose e/ou a presença de um sinal na região de 871,76 cm-1 e 1016,41 cm-1

(conforme simbologia * na Figura 19) separa os veículos que compõem os adoçantes de mesa.

A Figura 19 mostra o espectro derivado de aspartame, lactose e sacarose puros, para

ilustrar os sinais nos seus respectivos comprimentos de onda, associados à classificação das

amostras de adoçantes.

Figura 19- 1a derivada dos espectros FTIR-médio de padrões de Aspartame, Lactose e

Sacarose.

Em relação a CP2, é possível realizar 02 distinções. Na primeira, as amostras com

escores negativos na CP1 formam dois subgrupos, ou seja, aquele com escores positivos na

CP2 (amostras com veículo sacarose) e o outro com escores negativos na CP2 (amostras

contendo veículo maltodextrina). Neste último caso, uma amostra (smp3) apresenta um

comportamento diferenciado, localizando-se nas regiões mais negativas de CP2. Este aspecto

é provavelmente decorrente da presença (dextrose) com sinal nos comprimentos de onda

800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200-6

-4

-2

0

2

4

6

*

*

*

*

***

*

*

Der

ivad

a da

Tra

nsm

itânc

ia


Aspartame Lactose Sacarose

86

842,83 cm-1 e/ou 1031,85 cm-1, sinais estes que apresentam valor de peso negativo na CP2,

sendo –0,1816 e –0,1649 respectivamente.

A segunda distinção possível de ser realizada analisando-se a CP2 está relacionada ao

agrupamento deslocado na região positiva de CP1. Uma pequena diferença pode ser

observada entre as amostras compostas basicamente por lactose/aspartame (se localizam na

região positiva de CP2) daquelas composta por lactose/mistura de edulcorantes artificiais

(tendendo à região negativa de CP2). Este deslocamento para regiões positivas de CP2 das

amostras contendo apenas lactose/aspartame pode ser associado aos pesos (Figura 18) que

indicam que os valores mais positivos de peso para a CP2 ocorre em sinais localizados no

comprimento de onda 1143,42 cm-1 (alto valor positivo de peso = 0,1530) e 1074,28 cm-1

(peso = 0,1078). Estes sinais estão presentes no espectro derivado do aspartame puro

conforme mostra a Figura 19 associada à simbologia *.

Associando-se as informações cedidas por alguns fabricantes de adoçantes de mesa e a

análise deste modelo multivariado é possível inferir dados para uma análise semi-quantitativa

da concentração do veículo lactose (amostras com valores positivos de CP1) que compõem

algumas destas amostras. Este conjunto pode ser subdivido em 4 subgrupos (destacados na

Figura 17). Os subgrupos 1 e 2 estão localizados em valores positivos na CP2, enquanto os

subgrupos 3 e 4 em valores negativos de CP2.

Os subgrupos 1 e 2, são constituídos por amostras cuja composição é feita somente de

lactose e aspartame. Através de dados fornecidos pelos fabricantes, a concentração de lactose

para as amostras que fazem parte do subgrupo 1 é de aproximadamente 95%. No segundo

subgrupo, a concentração de lactose cai para 93,75%.

No caso dos subgrupos 3 e 4 estão as amostras cuja composição é feita de lactose e

uma mistura de edulcorantes artificiais, e a mesma tendência exposta anteriormente pode ser

87

observada. Ou seja, para o subgrupo 3 as amostras possuem uma concentração de lactose de

95% e o subgrupo 4 esta concentração cai para 93%.

Em função dos resultados apresentados neste item, é possível observar que a técnica

de FTIR-médio acoplado a métodos multivariados além de demonstrar seu grande potencial

na classificação, dá evidências da possibilidade de realização de uma análise semi-

quantitativa para os componentes majoritários das amostras analisadas. Esta ferramenta de

baixo custo e simples operação possibilita um controle qualitativo eficiente no qual apenas as

amostras suspeitas poderiam ser levadas para uma análise mais minuciosa.

5.2 ANÁLISE QUANTITATIVA

Nesta etapa, o objetivo maior está representado pelo desenvolvimento de uma

metodologia eficiente na quantificação de edulcorantes naturais e artificiais em adoçantes de

mesa via processos de calibração multivariada (PLSR1, PLSR2 e PCR) acoplados a

espectrofotometria de UV-Vis.

A espectrofotometria de UV-Vis apresenta uma série de características favoráveis, é

uma técnica consolidada, de fácil implementação, baixo custo e alta sensibilidade. No entanto,

a sua utilização como recurso quantitativo fica seriamente comprometida devido a sua baixa

seletividade. A utilização de metodologias multivariadas acopladas à técnica de UV-Vis têm

demonstrado superar de maneira muito eficiente esta dificuldade, isto porque toda a

informação fornecida pela técnica instrumental utilizada é explorada, condição que favorece a

previsão de uma resposta de interesse, com discrepância mínima, mesmo em condições

severas de interferência inter-espécies.

88

5.2.1 Composição Lactose e Aspartame

O aspartame é um dos edulcorantes que possui as maiores dificuldades de

determinação e quantificação, pois as técnicas hoje existentes requerem um tempo de análise

muito grande e não possuem a seletividade necessária para sua determinação em amostras

comerciais. Em função do grande número de produtos que possuem aspartame na sua

composição e sabendo que tanto este analito quanto à lactose absorvem no UV-Vis, este

sistema foi selecionado para desenvolvimento deste trabalho.

Em função da baixa seletividade da técnica UV-Vis, foi possível observar uma alta

interferência espectral na região do ultravioleta entre os dois compostos de interesse (lactose e

aspartame), conforme mostra a Figura 20.

200 250 300 350 4000.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

Aspartame Lactose

Abs

orbâ

ncia

(u.a

.)


Figura 20- Espectro UV-VIS de soluções-padrão de Lactose e Aspartame.

Os modelos de calibração multivariada foram desenvolvidos utilizando-se 20 misturas

sintéticas, sendo cada um deles, posteriormente validado por um conjunto de 5 misturas

89

sintéticas (conforme descrito no item 4.5.2.1, página 71). Os espectros foram inicialmente

processados na sua totalidade (200 nm a 800 nm).

200 300 400 500 600 700 800-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Abso

rbân

cia

(u.a

.)


Figura 21- Espectro UV-Vis para as 20 misturas sintéticas de lactose e aspartame utilizados

para a etapa de calibração do modelo PLSR1, PLSR2 e PCR.

5.2.1.1 Modelo PLSR para Amostras com Composição Lactose e Aspartame

5.2.1.1.1 PLSR2

Durante a fase de calibração o conjunto composto pelos espectros das 20 misturas

sintéticas (Tabela 6, página 71) foi correlacionado com as suas respectivas concentrações.

Nesta etapa, além da utilização dos dados espectrais na sua forma original, foram testados

alguns tipos de transformação de dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao

procedimento de pré-processamento com dados centrados na média, utilizando-se o programa

PLS Toolbox em ambiente Matlab para Windows.

Na procura de um modelo que representasse adequadamente a quantificação de todo o

conjunto de elementos que compõe a matriz em questão, inúmeros modelos foram

desenvolvidos e com base nos vários modelos, verificou-se que a capacidade de previsão é

90

influenciada por vários fatores, tais como: transformações dos dados e regiões espectrais

relevantes. Combinando todos estes fatores o número de modelos de calibração desenvolvidos

foi muito grande e todos com capacidade de previsão distinta, porém somente um modelo foi

escolhido.

O modelo PLSR2 foi desenvolvido inicialmente utilizando-se dados espectrais na

forma original, dados centrados na média e procedimento de validação cruzada. Neste último

procedimento, a calibração pode ser repetida n vezes (n = número de amostras), sendo que em

cada oportunidade uma das amostras do conjunto de calibração é retirada e utilizada como

amostra de previsão. Uma vez que todas as amostras tenham sido tratadas como objeto de

previsão, é possível estimar a Soma dos Quadrados dos Erros de Previsão (PRESS) dada pela

Eq. 12 e escolher o número de componentes principais com obtenção do menor PRESS.

PRESS = Σ (CREAL – CPREVISTO)2 Eq. 12

Sendo assim, a partir do procedimento de validação cruzada foi possível verificar que

após a 3a componente principal não existe nenhum ganho significativo em termos de

minimização do PRESS, conforme mostra a Figura 22. Além disso, estas 3 primeiras CP já

são responsáveis pela explicação de aproximadamente 97,32% da variância dos dados.

O gráfico de coeficientes de regressão, Figura 23, indica que existem regiões no

espectro de UV-Vis com pouca informação analítica para o controle analítico em questão.

Basicamente, trata-se daquelas regiões que apresentam coeficientes de regressão próximos de

0 (zero). Com base nos vários modelos desenvolvidos percebeu-se que a retirada das regiões

com pouca informação analítica contribui para a melhora da capacidade de previsão do

modelo. Portanto somente a região espectral entre 200 a 240 nm foi mantida.

91

0 2 4 6 8 10 120

0.5

1

1.5

2

2.5

3x 10

-3

Número de Componentes Principais

PR

ES

S

Figura 22- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR2 na

análise de lactose e aspartame.

0 100 200 300 400 500 600 700-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6x 10

-3

Número de Variáveis

Coe

ficie

ntes

de

Reg

ress

ão

Figura 23- Coeficientes de Regressão do PLSR2, na análise de lactose (preto) e aspartame

(cinza) com espectro completo (canais 1 a 600).

92

A construção de um novo modelo de calibração com dados originais na faixa espectral

entre 200 e 240 nm (canais 1 a 40), foi realizada. O procedimento de validação cruzada

evidenciou a minimização do PRESS desenvolvendo um modelo com 3CP (Figura 23A)

responsáveis pela explicação de 95,95% da variância dos dados. Este dado foi confirmado

através da análise do conjunto de validação externa que apresentou melhor capacidade de

previsão, realizando a análise com menor erro relativo de previsão. O modelo embasado nos

coeficientes de regressão (Figura 24B) mostra claramente que a região espectral escolhida

apresenta informação analítica relevante para o controle quantitativo em questão.

0 2 4 6 8 10 120

0.5

1

1.5

2

2.5

3x 10-3


PR

ES

S

(A)

0 5 10 15 20 25 30 35 40-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6x 10-3

Canais

Coe

ficie

ntes

de

Reg

ress

ão

(B)

Figura 24- Desenvolvimento do modelo PLSR2 para Lactose e Aspartame na análise de

adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B)

Coeficientes de regressão nos comprimentos de onda entre 200 a 240 nm (canais 1

a 40).

93

A Figura 25 mostra que as concentrações previstas pelo modelo são muito próximas

do valor real. No entanto, o PLSR2 por se tratar de um modelo que engloba uma otimização

global para todos os analitos em questão, apresenta uma curva com uma ampla faixa de

concentração. Este fato faz com que dois conjuntos sejam observados, àqueles com baixa

concentração representados pela previsão de aspartame (menor concentração) e àqueles com

alta concentração representados pela previsão de lactose (maior concentração).

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.350

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

1

1

2

2

3

3

4

4

5

5

6

6

7

7

8

8

9

9

10

10

11

11

12

12

13

13

14

14

15

15

16

16

17

17

18

18

19

19

20

20

Valor Real

Val

or P

revi

sto

Figura 25- Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais na análise de lactose e

aspartame.

Com o intuito de melhorar a visualização da concordância entre os valores reais e

previstos pelo modelo construído para ambos analitos, seus dados foram separados, gerando a

Figura 26. Nela é possível observar que existe uma tendência pouco linear para os dados de

lactose, enquanto para aspartame os valores previstos são bem concordantes com os valores

reais.

94

Figura 26- Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais para lactose e

aspartame separados.

O gráfico dos resíduos em função da leverage (Figura 27) é utilizado para mostrar

evidências que sugerem a existência de amostras anômalas (outliers) no conjunto utilizado

para construir o modelo. Na literatura, é descrito que padrões com um valor de leverage

(medida de influência de uma amostra no modelo de regressão) maior que 3p/n (onde p

corresponde ao número de componentes principais considerados para o modelo e n ao número

de padrões de calibração) (FERREIRA, ANTUNES, MELGO, 1999) podem ser consideradas

como diferentes das demais e com isso representar anomalias que prejudiquem o modelo de

calibração. Por outro lado, o contrário também pode ocorrer. Amostras com alta leverage, e

baixo resíduo podem ser informativas e, portanto importantes para a construção do modelo de

calibração. No caso do modelo em questão, o limite do valor de leverage é de 0,45, e portanto

nenhum padrão de calibração se encontra fora do limite pré-estabelecidos.

Considerando-se que os resíduos na forma de student apresentam uma distribuição

normal é possível aplicar um teste t para verificar se as amostras estão dentro da distribuição

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.0250.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.0250.260 0.265 0.270 0.275 0.280 0.285 0.290 0.295 0.300

0.2550.2600.2650.2700.2750.2800.2850.2900.2950.300

AspartameVal

or P

revi

sto

Valor Real

LactoseValo

r Pre

vist

oValor Real

95

com um nível de confiança de 95%. De acordo com antecedentes bibliográficos (FERREIRA,

ANTUNES, MELGO, 1999), amostras com resíduo superior a 2,5podem corresponder a

amostras anômalas, devendo ser cautelosamente estudadas. Uma amostra com alta leverage e

alto resíduo na forma de student apresenta indícios suficientes para ser considerada uma

amostra anômala, pois ela é muito diferente das amostras do conjunto de calibração e os

valores previstos pelo modelo recém-construído são bastante discordantes dos valores reais. A

partir destas premissas, constatou-se que nenhum dos padrões de calibração apresenta

comportamento anômalo.

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1

1

2 2

3

3

4

4

5

5 6

6

7

7

8

8

9

9

10

10

11 11 12

12

13

13

14 14 15

15

16

16

17

17

18

18

19

19

20

20

Leverage

Res

íduo

s na

form

a de

Stu

dent

Figura 27- Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo PLSR2 na

análise de lactose e aspartame.

A otimização do modelo de calibração PLSR2 para a associação lactose/aspartame

contou também com a utilização de um conjunto de validação externa (Tabela 7, página 72),

sendo que para cada modelo desenvolvido calculou-se os valores da Raiz Quadrada da Soma

dos Erros de Previsão (RMSEP, Eq. 13), conforme mostra a Tabela 10.

96

RMSEP = (Σ(CREAL – CPREVISTA)2/n)1/2 Eq. 13

Onde: CREAL é a concentração real, CPREVISTO é a concentração estimada pelo modelo e n é o

número de amostras do conjunto de validação.

O modelo mais adequado (destacado em negrito na Tabela 10) foi aquele utilizando

dados originais, pré-processamento com dados centrados na média e escolha de 3 CP. A

Tabela 11 mostra os resultados da previsão e erros relativos para a determinação de lactose e

aspartame do conjunto de validação externa (Tabela 7, 72) empregando-se o modelo mais

adequado.

Tabela 10- Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR2 desenvolvidos

Metodologia PLSR2 RMSEP

Lactose

RMSEP

Aspartame

Nº de

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda 0,0209 8,00 E-3 3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 240nm 0,0209 3,85 E-4 3

1a derivada, todos os comprimentos de onda 0,0205 7,40 E-4 4

1a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 240nm 0,0202 6,40 E-4 3

2a derivada, todos os comprimentos de onda 0,024 1,20 E-3 7

Considerando que o aspartame é um edulcorante com grandes dificuldades de análise,

e as concentrações empregadas são muito baixas, os resultados da sua previsão para o

conjunto de validação externa foram satisfatórios.

O mesmo não pode ser dito para a análise quantitativa de lactose. Embora sua

concentração seja muito superior ao aspartame, percebe-se que os valores previstos são

praticamente iguais para todas as amostras do conjunto de validação externa. Ou seja, parece

que o método analítico aplicado não consegue diferenciar as concentrações de lactose

estudadas (que variam de 0,27 a 0,30 g/100 mL). Em função destes aspectos, um método

97

univariado foi realizado para confirmar a influência das diferentes concentrações de lactose na

análise de aspartame.

Tabela 11- Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR2.

Concentração real

(g/100 mL)

MODELO PLSR

Conc. prevista (g/100 mL) e Erro relativo (%)

Lactose Aspartame Lactose Erro Aspartame Erro

0,272 0,0198 0,2947 8,3 0,0199 0,5

0,264 0,0079 0,2985 13,1 0,0079 0,0

0,288 0,0198 0,2968 3,0 0,0195 -1,5

0,296 0,0079 0,3009 1,6 0,0071 -10,1

0,280 0,0198 0,2993 6,9 0,0198 0,0

Para este fim, dados de absorbância no comprimento de onda de absorção máxima do

aspartame (212 nm) foram coletados para diferentes concentrações de aspartame e lactose,

conforme mostra a Tabela 12.

Tabela 12- Concentrações de aspartame e lactose com absorbância em 212 nm obtida de

misturas sintéticas utilizadas na construção na calibração convencional.

Concentração (g/100mL)

Lactose Aspartame

Absorbância (u.a.)

212 nm

0,264 0,00397 0,781

0,272 0,01191 1,1219

0,280 0,01588 1,1095

0,288 0,02382 0,9776

0,264 0,00794 0,8885

98

Uma representação gráfica destes dados é apresentada na Figura 28, cuja dispersão dos

dados indica que não existe uma linearidade na relação concentração de aspartame e

absorbância em 212 nm na presença de diferentes concentrações de lactose. Estes resultados

evidenciam que embora o modelo multivariado não consiga distinguir as diferentes

concentrações de lactose (na faixa estudada) este dado tem influência na absorção molecular

em 212 nm e impede que o aspartame possa ser determinado quantitativamente sem

conhecimento da concentração de lactose.

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.0250.75

0.80

0.85

0.90

0.95

1.00

1.05

1.10

1.15

Abso

rbân

cia

(u.a

.)

[Aspartame] (%)

Figura 28- Curva de calibração convencional para a determinação de aspartame em diferentes

concentrações de lactose.

5.2.1.1.2 PLSR1 Uma vez que o sistema PLSR1 otimiza um modelo para cada composto de interesse, é

possível realizar um ajuste mais fino, obtendo-se, na maioria dos casos, modelos com melhor

capacidade de previsão. Evidentemente, a aplicação desta forma operacional envolve alguns

problemas de caráter prático, principalmente relacionados com a necessidade de investir

maior tempo para a elaboração do modelo.

99

Embora cada modelo tenha sido desenvolvido de maneira isolada, procurando-se

condições particulares que promovessem uma melhor capacidade de previsão, a estratégia de

trabalho, foi praticamente a mesma. Desta forma, os resultados serão apresentados e a

discussão será realizada apenas para aqueles casos onde uma interpretação diferenciada do

que foi apresentado anteriormente seja necessária.

A) Lactose

O modelo de calibração PLSR1 foi inicialmente desenvolvido utilizando toda a faixa

espectral, 200 a 800 nm, conforme Figura 21. Durante esta etapa foram testados os dados

originais e alguns tipos de transformações de dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao

procedimento de pré-processamento com dados centrados na média. Tal como observado nos

estudos envolvendo o processo PLSR2, verificou-se que uma melhora na capacidade de

previsão do modelo utilizando-se dados originais.

Assim como no modelo anterior (PLSR2), o gráfico de coeficientes de regressão,

indica que existem regiões no espectro de UV-Vis com pouca informação analítica para o

controle analítico em questão. As regiões que apresentam coeficientes de regressão próximos

de 0 (zero) foram retiradas, restando somente a região espectral entre 200 a 240 nm (canais 1

a 40).

O modelo PLSR1 foi então desenvolvido a partir do procedimento de validação

cruzada e os resultados de PRESS em função do número de componentes principais

demonstraram que a partir da 3a CP não ocorrem melhoras significativas no PRESS (Figura

29A) sendo explicado 94,47 % da variância dos dados. A retirada de boa parte da região

espectral inicial, propicia a construção de um modelo com os coeficientes de regressão

apresentados na Figura 29B. Novamente, os dados da validação cruzada foram confirmados

100

através dos resultados da capacidade de previsão do modelo para o conjunto de validação

externa.

Apesar do sistema estudado PLSR1 envolver a quantificação de apenas 1 analito

(lactose), é possível verificar que um maior número de componentes principais é necessário

para melhorar a capacidade de previsão do modelo multivariado. A necessidade de duas CP a

mais, provavelmente é decorrente da modelagem de não-linearidades do sistema estudado.

0 2 4 6 8 10 120

1

2

3

4

5

6

7

8

9x 10-4


PRE

SS

0 5 10 15 20 25 30 35 40-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4x 10-3

Canais

Coe

ficie

ntes

de

Reg

ress

ão

(A) (B) Figura 29- Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose em adoçantes. (A) PRESS em

função do número de componentes principais; (B) Coeficientes de Regressão para

lactose na faixa espectral entre 200 e 240 nm (canal 1 a 40).

Pode ser observado que o gráfico de valores previstos vs valores reais (Figura 30A),

não se caracteriza pela formação de dois grupos e uma melhor visualização do ajuste do

modelo pode ser observada. Este fato é decorrente da curva apresentar somente valores para a

concentração de lactose (concentração majoritária). Outro fato relevante é a presença de 5

agrupamentos que representam as cinco diferentes concentrações de lactose empregadas nas

soluções utilizadas para construção do conjunto de calibração.

101

0.26 0.265 0.27 0.275 0.28 0.285 0.29 0.295 0.30.255

0.26

0.265

0.27

0.275

0.28

0.285

0.29

0.295

0.3

12

34

5

678

9

101112

13141516

17181920

Valor Real

Val

or P

revis

to

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1

2

3

4

5

6

7

8 9

10 11

12 13

14 15

16 17

18 19

20

Leverage

Res

íduo

s na

form

a de

Stu

dent

(A) (B) Figura 30- Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose em adoçantes. (A) Valores

previstos vs valores reais para os padrões de calibração; (B) Resíduos na forma de

student em função da leverage.

A análise de amostras anômalas foi realizada da mesma maneira descrita

anteriormente. Não foram identificadas anomalias em função dos valores de resíduos na

forma de student, nem em função da leverage (Figura 30B).

Levando-se em consideração todos os aspectos abordados, vários modelos foram

construídos e todos eles avaliados a partir do valor de RMSEP obtido para o conjunto de

validação externa (Tabela 13). Conforme destacado em negrito, o melhor modelo apresentou

as seguintes características: dados originais de absorbância na faixa de 200 a 240 nm, com

pré-processamento de dados centrados na média, e ausência de amostras anômalas.

Tabela 13- Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1 desenvolvidos para Lactose

Metodologia PLSR 1 RMSEP

Lactose

Nº de

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda 0,0209 3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 240nm 0,0209 3

1a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 240nm 0,0220 3

2a derivada, todos comprimentos de onda 0,0220 6

102

Os resultados de previsão do modelo de melhor desempenho para o conjunto de

validação externa são apresentados na Tabela 14.

Tabela 14- Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR1 (lactose).

Concentração Real MODELO PLSR1 (g/100 mL) Concentração Prevista e Erro Relativo

Lactose Lactose (g/100 mL) Erro Relativo (%) 0,272 0,2947 8,3

0,264 0,2985 13,1

0,288 0,2969 3,1

0,296 0,3009 1,6

0,280 0,2994 6,9

Conforme pode ser observado na Tabela 14 este procedimento levou ao

estabelecimento de um modelo com capacidade de previsão muito similar ao modelo PLSR2

(Tabela 11) com os mesmos problemas relatados anteriormente, ou seja, com valores de

previsão sempre muito parecidos.

Como se trata de um modelo multivariado totalmente otimizado para a análise de

lactose, os resultados continuam a indicar que a metodologia adotada é pouco eficiente na

análise requerida. Uma possível explicação para tal ocorrência está associada à baixa

absortividade molar que a lactose apresenta na técnica espectrofotométrica, o que dificulta a

previsão de concentrações similares deste composto mesmo sendo este majoritário da

amostra. Um exemplo numérico pode dar a dimensão da justificativa apresentada: uma

solução contendo cerca de 1% de lactose tem uma absorbância (u.a.) no UV-Vis de 0,0549.

Como a diferença nas concentrações dos padrões de calibração e validação é menor que 1%,

as diferenças nos valores de absorbância são ínfimas.

103

B) Aspartame

A otimização de um modelo PLSR1 para a quantificação de aspartame seguiu etapas

muito semelhantes àquelas apresentadas para a quantificação de lactose. O mesmo conjunto

de calibração foi utilizado (20 misturas sintéticas, Tabela 6 página 71), sendo testado o

emprego dos dados na sua forma original, assim como, alguns tipos de transformações de

dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao procedimento de pré-processamento com

dados centrados na média.

Dentre os vários modelos construídos, o de maior capacidade de previsão apresentou as

seguintes características: dados originais de absorbância na faixa espectral entre 200 nm e 240

nm e dados centrados na média. O procedimento de validação cruzada indicou a necessidade

de um modelo contendo 3 CP para minimização do PRESS (Figura 31), sendo explicados

99,72% da variância dos dados.

0 2 4 6 8 10 120

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1x 10-4


PR

ES

S


análise de Aspartame.

104

O gráfico de valores previstos vs valores reais obtidos via PLSR1 (Figura 32A),

apresenta somente a faixa de concentração para aspartame, permitindo uma melhor

visualização dos dados. É possível perceber que a análise de aspartame apresentou grande

concordância entre os valores previstos e reais. O comportamento dos padrões de calibração

em termos de resíduos na forma de student e leverage (Figura 32B), evidencia que todos os

padrões apresentam resíduos ≤ 2,5, apenas o padrão 1 apresenta leverage um pouco maior

que o limite de 0,45. Como este padrão apresenta a menor concentração de aspartame, sua

presença no conjunto de calibração pode ser muito informativa para a construção do modelo.

Em função deste aspecto, a retirada deste padrão do conjunto de calibração foi testada, não

acarretando melhora na capacidade de previsão do modelo.

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.0250

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

Valor Real

Val

or P

revis

to

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

1

2

3

4 5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

Leverage

Res

íduo

s na

form

a de

Stu

dent

(A) (B)

Figura 32- Modelo PLSR1 otimizado para análise de aspartame em adoçantes. (A) Valores

previstos vs valores reais pelo modelo PLSR1; (B) Resíduos na forma de student

em função da leverage.

Os modelos otimizados foram aplicados ao conjunto de validação externa obtendo os

seguintes valores de RMSEP, Tabela 15.

105

Tabela 15- Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1 desenvolvidos para Aspartame


Aspartame

Nº de

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda 4,85 E-4 3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 240nm 3,85 E-4 3

1a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 240nm 6,50 E-4 4


Os erros relativos para o melhor modelo PLSR1 obtido para aspartame (dados

originais, dados centrados na média e 3CPs) foram iguais aos valores obtidos para o modelo

PLSR2 em 100% das amostras (Tabela 16).

Tabela 16- Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR1

(aspartame).

Concentração Real MODELO PLSR1 (g/100 mL) Concentração Prevista e Erro Relativo Aspartame Aspartame (g/100 mL) Erro (%)

0,0198 0,0199 0,5

0,0079 0,0079 0,0

0,0198 0,0195 -1,5

0,0079 0,0071 -10,1

0,0198 0,0198 0,0

5.2.1.2. Modelo PCR para Amostras com Composição Lactose e Aspartame

O modelo PCR foi construído de maneira similar ao modelo PLSR2 previamente

descrito. Os mesmos tipos de transformação e pré-processamento de dados foram testados,

resultando em modelos muito similares aos obtidos anteriormente. No caso da otimização do

modelo PCR, foram empregados dados originais e centrados na média, sendo o número ideal

de componentes principais obtidos via procedimento de validação cruzada. Conforme mostra

a Figura 33A, após a 3a CP não existe nenhum ganho significativo em termos de minimização

106

do PRESS. Além disso, estas 3 CP já são responsáveis pela explicação de aproximadamente

95,85% da variância dos dados. Embora o algoritmo matemático que rege a construção do

modelo PCR seja diferenciado do PLSR, é possível observar pelos dados obtidos, que ambas

metodologias propiciam similaridade de resultados.

De acordo com o gráfico dos coeficientes de regressão (Figura 33B) a região espectral

entre 200 a 240 nm continua sendo aquela que apresenta informação analítica relevante para a

análise pretendida.

0 2 4 6 8 10 120

0.5

1

1.5

2

2.5

3x 10-3


PR

ESS

0 5 10 15 20 25 30 35 40-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6x 10-3

Canais

Coe

ficie

ntes

de

Reg

ress

ão

(A) (B)

Figura 33- Modelo PCR otimizado para análise de lactose e aspartame em adoçantes. (A)

PRESS em função do número de componentes principais; (B) Coeficientes de

Regressão para lactose (preto) e aspartame (cinza) na faixa espectral entre 200 e

240 nm (canal 1 a 40).

A Figura 34A mostra-se muito semelhante à Figura 25 (modelo PLSR2). Como já

comentado anteriormente o gráfico fornece poucas informações uma vez que uma ampla faixa

de concentração pode ser observada. Este fato faz com que a visualização do ajuste do modelo

para os dois grupos em particular fique bastante prejudicada.

107

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.350

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

1

1

2

2

3

3

4

4

5

5

6

6

7

7

8

8

9

9

10

10

11

11

12

12

13

13

14

14

15

15

16

16

17

17

18

18

19

19

20

20

Valor Real

Val

or P

revis

to

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1

1

2 2

3

3

4

4

5

5 6

6

7

7

8

8

9

9

10

10

11

11 12

12

13

13

14 14 15

15

16

16

17

17

18

18

19

19

20

20

Leverage

Res

íduo

s na

form

a de

Stu

dent

(A) (B)

Figura 34- Modelo PCR otimizado para análise de lactose e aspartame em adoçantes. (A)

Valores previstos vs valores reais; (B) Resíduos na forma de student em função da

leverage.

Para o modelo PCR, o limite máximo do valor para leverage é 0,45 (3p/n). A Figura

33B evidencia que o padrão 1 apresenta valor um pouco acima deste limite, no entanto com

baixo valor de Resíduo na forma de Student. Em função destes aspectos e dos antecedentes

dos modelos anteriormente construídos o padrão 1 foi mantido no conjunto de calibração.

Na Tabela 17 são apresentados os valores de RMSEP de alguns modelos PCR

desenvolvidos.

Tabela 17- Comparação via RMSEP entre os modelos PCR desenvolvidos

Metodologia PCR RMSEP

Lactose

RMSEP

Aspartame

Nº de

CP




2a derivada, todos os comprimentos de onda (trocar) 0,0130 1,50 E-3 3

108

Para o melhor modelo obtido (dados originais, dados centrados na média e 3CPs) os

resultados da análise de lactose e aspartame e seus respectivos erros relativos para as amostras

que compõem o conjunto de validação são apresentados na Tabela 18.

Tabela 18- Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PCR.

Concentração Real MODELO PCR (g/100 mL) Conc. Prevista (g/100 mL) e Erro Relativo (%)

Lactose Aspartame Lactose Erro % Aspartame Erro % 0,272 0,0198 0,2946 8,3 0,0199 0,5

0,264 0,0079 0,2985 13,1 0,0079 0,0

0,288 0,0198 0,2967 3,0 0,0195 -1,5

0,296 0,0079 0,3009 1,6 0,0071 -10,1

0,280 0,0198 0,2992 6,8 0,0198 0,0

Também neste caso, é possível constatar problemas nos resultados obtidos para a

análise de lactose. Este fato indica a independência do problema, com o algoritmo matemático

utilizado e reforça a justificativa dada anteriormente.

Comparando-se os modelos de melhor capacidade de previsão em cada uma das

modalidades (PLSR2, PLSR1 e PCR) é possível observar que os resultados de previsão são

praticamente iguais, conforme evidencia os valores de RMSEP apresentados na Tabela 19.

Tabela 19- Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1, PLSR2 e PCR.

Metodologia RMSEP Lactose RMSEP Aspartame Nº de CP

PLSR1 0,0209 3

PLSR1 3,85 E-4 3

PLSR2 0,0209 3,85 E-4 3

PCR 0,0208 3,85 E-4 3

109

De acordo com os dados da Tabela 19 é possível observar que qualquer um dos 3

modelos otimizados produzem resultados de previsão praticamente idênticos. Em função

destes resultados, o modelo PLSR2 foi escolhido para prever o sistema estudado devido a sua

praticidade de aplicação. Nesta etapa foram utilizadas 6 amostras de adoçantes de mesa

comerciais com a composição estudada, conforme mostra a Tabela 20.

Tabela 20- Resultados da análise de lactose e aspartame em amostras de adoçante comercial

via modelo PLSR2 previamente otimizado.

Concentração declarada MODELOS PLSR2

(g/100 mL) Concentração prevista (g/100 mL)

Lactose Aspartame Lactose Aspartame

0,2812 0,0188 0,3042 0,0175

0,2812 0,0188 0,3034 0,0196

0,2862 0,0108 0,3002 0,0155

0,2850 0,0120 0,3035 0,0136

0,2871 0,0114 0,3031 0,0125

0,2860 0,0114 0,3043 0,0156

Embora o sistema estudado seja bastante complexo em termos analíticos e

espectrofotométricos, os resultados obtidos para a análise de aspartame foram satisfatórios,

principalmente quando se consideram características como: baixo custo e pequeno tempo de

análise.

Em duas amostras analisadas (destacadas em negrito na Tabela 20) foi possível

observar uma discrepância maior do valor previsto com aquele declarado pelo fabricante para

a quantificação de aspartame (informações de embalagem, ou por contato direto). Como o

modelo otimizado apresentou boa capacidade de previsão para este analito, esta discrepância

pode ser decorrente da heterogeneidade das amostras no preparo do adoçante.

110

Para a análise da lactose esta metodologia não demonstrou eficiência, porém para este

analito há disponíveis diversas técnicas de análise (conforme item 2.4.1 da revisão da

literatura).

5.2.2 Amostras com Composição Lactose e Esteviosídeo

Na literatura recente não são relatadas técnicas para a análise de esteviosídeo, porém

por se tratar de um edulcorante natural vem se destacando entre os consumidores. O crescente

aumento no número de produtos com este edulcorante, evidencia a necessidade de

desenvolvimento de técnicas para analisá-lo.

Uma vez que o esteviosídeo apresenta absorção molecular no UV-Vis e conhecendo-se

as características associadas a esta técnica, uma proposta de aplicação de métodos

multivariados para esta quantificação foi estudada. A Figura 35 mostra a interferência

espectral associada ao sistema lactose/esteviosídeo.

200 300 400 500 600 700 800

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2 Lactose Esteviosídeo

Abso

rbân

cia

(u.a

.)


Figura 35- Espectro UV-Vis na região entre 200 e 400 nm para Lactose e Esteviosídeo

111

A metodologia multivariada foi conduzida basicamente da mesma maneira

apresentada anteriormente para o sistema lactose/aspartame. Ou seja, inicialmente

desenvolvendo modelos de calibração PLSR2, seguidos da construção dos modelos PLSR1

para cada componente de interesse e por último a metodologia PCR.

Os modelos foram desenvolvidos a partir de 20 misturas sintéticas, conforme Tabela 8

página 73, enquanto para a etapa de validação um conjunto de 5 misturas sintéticas (Tabela 9

página 73 foram utilizadas. Os espectros foram processados na faixa entre 200 nm à 800 nm,

região correspondente a ultravioleta e visível (UV-Vis), conforme Figura 36.

200 300 400 500 600 700 800

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Abs

orbâ

ncia

(u.a

.)


Figura 36- Espectro UV-Vis de todas as misturas sintéticas de lactose e esteviosídeo utilizadas

no conjunto de calibração para os comprimentos de onda entre 200 e 800 nm.

5.2.2.1 Modelo PLSR para Amostras com Composição Lactose e Esteviosídeo

5.2.2.1.1 PLSR2

Durante a fase de calibração o conjunto composto pelos espectros das 20 misturas

sintéticas (Tabela 8, página 73) foi correlacionado com as suas respectivas concentrações.

Nesta etapa, além da utilização dos dados espectrais na sua forma original, foram testados

alguns tipos de transformação de dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao

112

procedimento de pré-processamento com dados centrados na média. Com base nos vários

modelos desenvolvidos, verificou-se que a capacidade de previsão do modelo é altamente

influenciada pelo tipo de transformação utilizada.

Na procura de um modelo que melhor representasse a quantificação de todo o

conjunto de elementos que compõe a matriz em questão, inúmeros modelos foram

desenvolvidos e com base nos vários modelos, verificou-se que a capacidade de previsão é

influenciada por vários fatores, tais como: transformações dos dados e regiões espectrais

relevantes. Combinando todos estes fatores o número de modelos de calibração desenvolvidos

foi muito grande e todos com capacidade de previsão distinta, porém somente um modelo foi

escolhido (àquele mais robusto e com melhor capacidade de previsão).

No modelo PLSR2 otimizado empregou-se dados espectrais na forma original,

centrados na média e procedimento de validação cruzada. Foram mantidos os comprimentos

de onda relevantes (faixa espectral mantida foi entre 200 a 280 nm, canais 1 a 80) conforme

podemos evidenciar na Figura 37A e 37B. A retirada dos comprimentos de onda com

coeficiente de regressão próximo de zero, propiciou o desenvolvimento de um modelo com

melhor capacidade de previsão.

O processo de validação cruzada evidenciou no modelo PLSR2 que após a 3a

componente principal não há nenhum ganho significativo na diminuição do erro de previsão

(PRESS), conforme Figura 38, sendo estas responsáveis por 96,25% da variância dos dados.

Uma vez que o sistema em estudo possui dois analitos, esperava-se no mínimo duas

componentes principais, uma componente principal para cada elemento de interesse. A

necessidade de uma CP a mais, provavelmente é decorrente da modelagem de não-

linearidades do sistema estudado.

113

0 100 200 300 400 500 600 700-0.02

-0.015

-0.01

-0.005

0

0.005

0.01

0.015


Coe

ficie

nte

de R

egre

ssão

(A)

0 10 20 30 40 50 60 70 80-0.02

-0.015

-0.01

-0.005

0

0.005

0.01

0.015


Coe

ficie

nte

de R

egre

ssão

(B)

Figura 37- Coeficientes de Regressão do PLSR2, na análise de lactose (preto) e esteviosídeo

(cinza) (A) com espectro completo; (B) Faixa espectral entre 200 e 280 nm (canal

1 a 80).

114

0 2 4 6 8 10 12 140

0.5

1

1.5

2

2.5

3x 10-3


PR

ES

S


análise de lactose e esteviosídeo.

A Figura 39 demonstra as concentrações previstas e reais pelo modelo desenvolvido.

Evidenciando uma boa concordância entre estes dados.

Figura 39- Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais lactose e esteviosídeo

separadamente.

0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.0350.00

0.01

0.02

0.03

0.260 0.265 0.270 0.275 0.280 0.285 0.290 0.295 0.300

0.26

0.27

0.28

0.29

0.30

EsteviosídeoVal

or P

revi

sto

Valor Real

LactoseValo

r Pre

vist

o

Valor Real

115

Um detalhe importante ocorrido durante a construção do modelo PLSR2 desenvolvido

para esta matriz está representado pelos baixos valores de resíduos e leverage para todos os

padrões de calibração (Figura 40), não havendo dúvidas com relação à inexistência de

amostras anômalas.

0.05 0.1 0.15 0.2 0.25-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

1 1

2

2

3 3

4

4

5

5 6

6

7

7

8

8

9

9

10

10 11

11

12

12

13

13

14

14

15

15 16

16 17

17

18

18

19

19

20

20

Leverage

Res

íduo

s na

form

a de

stu

dent

Figura 40- Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo PLSR2 na

análise de lactose e esteviosídeo

O modelo descrito anteriormente foi empregado na determinação de lactose e

esteviosídeo no conjunto de validação externa apresentando os seguintes valores de RMSEP,

Tabela 21.

Tabela 21- Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR2 desenvolvidos


Lactose

RMSEP

Aspartame

Nº de

CP




2a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 280nm 7,11 E-3 3,53 E-3 6

116

Os resultados e erros relativos obtidos para o melhor modelo (destacado em negrito na

Tabela 21) são apresentado na Tabela 22.

Tabela 22- Resultados obtidos para o modelo PLSR2 na etapa de validação externa

Concentração real MODELO PLSR2

(g/100 mL) Conc. prevista (g/100 mL) e erro relativo (%)

Lactose Esteviosídeo Lactose Erro Esteviosídeo Erro

0,264 0,0092 0,2991 13,3 0,0108 17,4

0,272 0,0268 0,2967 9,1 0,0267 -0,4

0,280 0,0180 0,2978 6,3 0,0207 15

0,288 0,0120 0,2993 3,9 0,0127 5,8

0,296 0,0300 0,3008 1,6 0,0292 -2,7

Para a determinação de lactose, o mesmo problema evidenciado no sistema

lactose/aspartame se repetiu. Sendo assim uma curva analítica convencional foi realizada para

verificar a real influência da concentração de lactose na determinação de esteviosídeo, uma

vez que o modelo multivariado dá indícios de não diferenciar concentrações similares de

lactose.

Para isto, valores de absorbância em 211 nm (comprimento de onda máximo para

esteviosídeo) de uma mistura sintética contendo esteviosídeo e em uma alta concentração de

lactose, foram correlacionados à concentração de esteviosídeo, conforme Tabela 23.

117

Tabela 23- Concentrações de esteviosídeo e lactose com absorbância em 211 nm obtida de

misturas utilizadas na construção na calibração convencional.

Concentração (g/100mL)

Lactose Esteviosídeo

Absorbância 211 nm

(u.a.)

0,264 0,0060 0,573

0,272 0,0148 0,699

0,280 0,0240 0,795

0,288 0,0320 0,766

0,296 0,0268 0,636

0,296 0,0300 0,676

A Figura 41 mostra o resultado da calibração univariada convencional para a

determinação da concentração de esteviosídeo. Este analito não possui linearidade nas

concentrações de interesse, devido as diferentes concentrações de lactose, evidenciando sua

influência na determinação do esteviosídeo.

0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.0350.55

0.60

0.65

0.70

0.75

0.80

Abs

orbâ

ncia

(u.a

.)

[Esteveosídeo] (%)

Figura 41- Calibração univariada realizada para a determinação de esteviosídeo em altas

concentrações de lactose

118

5.2.2.1.2 PLSR1

A metodologia multivariada na forma operacional PLSR1 foi empregada de maneira

similar à explicitada durante o desenvolvimento do modelo PLSR2.

A) Lactose

O modelo de calibração PLSR1 para a lactose foi desenvolvido inicialmente utilizando

a faixa espectral completa (200 nm a 800nm), dados centrados na média e procedimento de

validação cruzada. Dentre os vários modelos desenvolvidos, aquele que apresentou maior

capacidade de previsão utiliza os dados em sua forma original.

Os gráficos de Coeficientes de Regressão vs Canais para a metodologia PLSR1 são

muitos similares em comportamento com aquele obtido por PLSR2 (Figura 37), e, portanto

não serão mostrados. Sendo assim, a faixa de comprimento de onda entre 200 e 280nm

(canais 1 a 80) é aquela que apresenta informação analítica relevante.

Otimizando este modelo com todas as amostras e seus dados originais, restringindo o

comprimento de onda entre 200 e 280 nm e utilizando dados centrados na média, constatou-se

através do procedimento de validação cruzada interna que após a 2a componente principal

(Figura 42A), não há nenhum ganho significativo na diminuição do erro de previsão (PRESS),

as quais são responsáveis por 93,36% da variância dos dados. A Figura 42B indica novamente

que nenhum padrão de calibração apresenta resíduos e leverage fora dos limites estatísticos,

não sendo detectadas a presença de amostras anômalas.

119

0 2 4 6 8 10 12 141

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11x 10-4


PR

ES

S

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12 13

14

15

16

17

18 19

20

Leverage

Res

íduo

s na

form

a de

stu

dent

(A) (B)

Figura 42- Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose em adoçantes. (A) PRESS em

função do número de componentes principais; (B) Resíduos na forma de student


Como pode ser evidenciado na Figura 43, há uma visualização melhor do ajuste do

modelo PLSR1 em comparação ao modelo PLSR2, isto se deve ao gráfico apresentar somente

faixa de concentração para lactose (concentração majoritária) onde é possível perceber a

presença de 5 agrupamentos que representam as cinco diferentes concentrações de lactose

empregadas nas soluções utilizadas para construção do conjunto de calibração.

0.26 0.265 0.27 0.275 0.28 0.285 0.29 0.295 0.30.26

0.265

0.27

0.275

0.28

0.285

0.29

0.295

0.3

1

23

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

141516

17

181920

Valor Real

Val

or P

revi

sto

Figura 43- Valores previstos pelo modelo PLSR1 vs valores reais na análise de lactose.

120

Com essa melhor visualização percebe-se que não há grande concordância entre os valores

reais e os valores previstos para concentração de lactose, o que já era esperado devido às

considerações anteriores, isto é as concentrações de lactose não estão sendo previstas corretamente.

O modelo descrito anteriormente apresentou a melhor capacidade de previsão na

determinação de lactose no conjunto de validação externa, conforme pode ser evidenciado na

Tabela 24.

Tabela 24- Comparação via RMSEP para modelos PLSR1 desenvolvidos


Lactose

Nº de

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda 0,022 3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 280nm 0,021 2

1a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 280nm 0,016 4


Os erros relativos obtidos para o conjunto de validação externa empregando-se o

modelo de melhor desempenho são apresentados na Tabela 25.

Tabela 25- Resultados da validação externa obtidos para o modelo PLSR1 para Lactose

Concentração real MODELO PLSR1 (g/100 mL) Concentração Prevista e Erro Relativo (%)

Lactose Lactose (g/100 mL) Erro (%) 0,264 0,2986 13,1

0,272 0,2961 8,9

0,280 0,2976 6,3

0,288 0,2982 3,5

0,296 0,2993 1,1

121

Seguindo a mesma tendência mostrada no modelo anterior, assim como naqueles

envolvendo o sistema lactose/aspartame, a previsão da concentração da lactose não se

mostrou eficiente. Embora a metodologia resulte em baixos erros relativos os resultados

mascaram a real situação, ou seja, a técnica é pouco eficiente para prever estas concentrações

de lactose. Vale a pena ressaltar que se um arredondamento fosse efetuado, todas as amostras

do conjunto de validação teriam a mesma concentração, 0,30 g/ 100 mL.

B) Esteviosídeo

O procedimento de otimização do modelo PLSR1 para esteviosídeo foi desenvolvido

da mesma forma descrita anteriormente, sendo que a utilização de dados na sua forma original

propicia o desenvolvimento de modelos com melhor capacidade de previsão.

Os gráficos de Coeficientes de Regressão vs Canais para a metodologia PLSR1 não

serão mostrados por serem muito similar aos apresentados no modelo PLSR2 (Figura 37).

Também para este caso, a região entre 200 nm a 280 nm (canais 1 a 80) é a mais relevante

para a construção do modelo em questão.

Construindo um modelo PLSR1, constatou-se através do procedimento de validação

cruzada que após a 3a CP, conforme Figura 44, não há nenhum ganho significativo na

diminuição do erro de previsão (PRESS), as quais são responsáveis por 98,6% da variância

dos dados.

122

0 2 4 6 8 10 12 14 160

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2x 10-3


PR

ES

S


análise de esteviosídeo

Observando a Figura 45A, devido a melhor visualização do ajuste do modelo PLSR1,

pode ser constatado que há concordância entre valores previstos vs valores reais para

esteviosídeo.

Analisando a Figura 45B Resíduos na forma de Student vs Leverage, não há a

identificação de comportamentos anômalos quando se utilizam os critérios estatísticos usuais,

pois para ser considerada uma amostra anômala a amostra deve possuir alto valor de resíduo

(maior que2,5) e concomitantemente alto valor de leverage (0,3) 3p/n.

123

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.040

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

Valor Atual

Val

or P

revis

to

0.05 0.1 0.15 0.2 0.25-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

1

2

3

4

5 6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

Leverage

Resí

duos

na

form

a de

stu

dent

(A) (B)

Figura 45- Modelo PLSR1 otimizado para análise de esteviosídeo em adoçantes. (A) Valores

previstos vs valores reais pelo modelo PLSR1; (B) Resíduos na forma de student


A partir dos vários modelos desenvolvidos, a etapa de validação externa foi realizada e

os resultados de RMSEP de alguns modelos estão apresentados na Tabela 26, sendo que o

modelo de melhor capacidade de previsão está destacado em negrito.

Tabela 26- Comparação via RMSEP para modelos PLSR1 desenvolvidos


Esteviosídeo

Nº de

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda 1,60 E-3 3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 280nm 1,45 E-3 3



A Tabela 27 apresenta os erros relativos para o modelo com as seguintes

características: dados originais na faixa espectral de 200 a 280 nm, com dados centrados na

média e 3CPs.

124

Tabela 27- Resultados obtidos para o modelo PLSR1 na etapa de validação externa para a

determinação de esteviosídeo

Concentração Real MODELO PLSR1 (g/100 mL) Concentração Prevista e Erro Relativo

Esteviosídeo Esteviosídeo (g/100 mL) Erro (%) 0,0092 0,0108 -17,4

0,0270 0,0266 1,5

0,0180 0,0206 14,4

0,0120 0,0127 5,8

0,0300 0,0292 -2,7

5.2.2.2. Modelo PCR para Amostras com Composição Lactose e Esteviosídeo

O modelo PCR foi construído de maneira similar ao modelo PLSR2 previamente

descrito para lactose e esteviosídeo. A fase de calibração foi construída utilizando o mesmo

conjunto composto pelos espectros das 20 misturas sintéticas (Tabela 8, página 73), sendo

testados o emprego dos dados na sua forma original, assim como, alguns tipos de

transformações de dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao procedimento dados

centrados na média.

De acordo com os dados de coeficientes de regressão, os comprimentos de onda

menos importantes foram retirados, permanecendo somente os comprimentos de onda entre

200 nm a 280 nm (canais 1 a 80).

O número de componentes principais foi encontrado, utilizando o procedimento de

validação cruzada, conforme Figura 46 sendo necessário 3 CP, pois a partir desse valor não se

tem mais uma variância residual significativa, sendo responsável pela explicação de

aproximadamente 96,17% da variância dos dados, o modelo PCR otimizado necessitou do

mesmo número de componentes principais o modelo PLSR2 previamente construído.

125

0 2 4 6 8 10 12 140

0.5

1

1.5

2

2.5

3x 10-3


PR

ESS

Figura 46- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PCR na


A escolha por 3 CP deve-se ao baixo valor de PRESS e os baixos erros relativos para a

previsão do conjunto de validação. Como anteriormente comentado o gráfico que apresenta as

concentrações previstas pelo modelo vs as concentrações reais fornece poucas informações

visto a ampla faixa de concentração, isto porque o PCR semelhantemente ao modelo PLSR2

por se tratar de um modelo que engloba uma otimização geral de todos os analitos (lactose e

esteviosídeo) apresenta uma curva com uma ampla faixa de concentração. Este fato faz com

que a visualização do ajuste do modelo para os analitos em estudo fique bastante prejudicada.

126

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.350

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

1

1

2

2

3

3

4

4

5

5

6

6

7

7

8

8

9

9

10

10

11

11

12

12

13

13

14

14

15

15

16

16

17

17

18

18

19

19

20

20

Valor Atual

Val

or P

revi

sto

Figura 47- Valores previstos pelo modelo PCR vs valores reais na análise de lactose e

esteviosídeo

Analisando o gráfico de Resíduos na forma de Student vs Leverage não há a

identificação de comportamentos anômalos, conforme Figura 48, pois não há amostras com

valor de resíduo superior a 2,5 e amostras com alto valor de leverage (3p/n=0,45).

0.05 0.1 0.15 0.2 0.25-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

1 1

2

2

3 3

4

4

5

5 6

6

7

7

8

8

9

9

10

10

11

11

12

12

13

13

14

14

15

15 16

16 17

17

18

18

19

19

20

20

Leverage

Res

íduo

s na

form

a de

stu

dent

Figura 48- Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo PCR na


127

Os menores valores de RMSEP na determinação de lactose e esteviosídeo no conjunto

de validação externa via PCR foram obtidos pelo modelo descrito anteriormente. Ou seja,

àquele desenvolvido com dados originais, centrados na média e 3CPs, conforme evidencia a

Tabela 28.

Tabela 28- Comparação via RMSEP entre os modelos PCR desenvolvidos

Metodologia PCR RMSEP

Lactose

RMSEP

Aspartame

Nº de

CP




2a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 280nm 7,4 E-3 4,51 E-3 7

Os resultados da previsão e seus respectivos erros relativos para o conjunto de

validação são mostrados na Tabela 29 a seguir.

Tabela 29- Resultados obtidos para o modelo PCR na etapa de validação externa

Concentração real MODELO PCR

(g/100 mL) Conc. prevista (g/100 mL) e erro relativo (%)

Lactose Esteviosídeo Lactose Erro Esteviosídeo Erro

0,264 0,0092 0,2991 13,3 0,0109 -18,5

0,272 0,0268 0,2927 9,1 0,0267 0,4

0,280 0,0180 0,2978 6,3 0,0207 -15,0

0,288 0,0120 0,2992 3,9 0,0127 -5,8

0,296 0,0300 0,3008 1,6 0,0292 2,6

Considerando que não há técnicas disponíveis para a análise de esteviosídeo, esta

técnica mostrou possuir todos os requisitos para ser amplamente utilizadas por laboratórios de

pequeno e médio porte (baixo custo, pequeno tempo de análise) na sua determinação

128

quantitativa. As dificuldades de análise para lactose indicam que este método não é

recomendável para sua análise nas condições estudadas, porém não impedem que este sistema

seja utilizado para analisar produtos comerciais com alta concentração de lactose e baixa

concentração de esteviosídeo.

Na Tabela 30 apresentam-se os valores de RMSEP para cada uma das modalidades

(PLSR2, PLSR1 e PCR) otimizadas. Em função destes resultados, o modelo PLSR1 foi

escolhido para prever o sistema estudado uma vez que apresenta o menor valor de RMSEP

para esteviosídeo.

Tabela 30- Comparação entre as Metodologias PLSR1, PLSR2 e PCR.

Metodologia RMSEP Lactose RMSEP esteviosídeo Nº de CP

PLSR1 0,021 2

PLSR1 1,4 E -3 3

PLSR2 0,021 1,5 E-3 3

PCR 0,021 1,5 E-3 3

A Tabela 31 apresenta o resultado obtido para a previsão de um adoçante comercial

(composição lactose e esteviosídeo) utilizando o modelo PLSR1 otimizado. Embora todas as

etapas do desenvolvimento demonstrassem que os resultados de lactose não são confiáveis,

dados de previsão para este analito também são apresentados.

Tabela 31- Resultado de previsão para a amostra comercial obtido para o modelo PLSR1 para

lactose e PLSR1 para esteviosídeo

Concentração Declarada MODELOS PLSR1

(g/100 mL) Concentração Prevista (g/100 mL)

Lactose Esteviosídeo Lactose Esteviosídeo

0,279 0,0215 0,2978 0,0170

129

A quantificação do esteviosídeo via sistema espectrofotométrico associado à

metodologia de calibração multivariada apresentou uma diferença de 20,9% entre o valor

previsto e o declarado pelo fabricante na embalagem. Esta diferença pode ser decorrente da

falta de homogeneidade da amostra de adoçante utilizada para preparo das soluções. Como se

trata de uma pequena quantidade de esteviosídeo em relação ao veículo lactose, e sendo

ambos edulcorantes encontrados na forma sólida, a dificuldade de homogeneização do lote é

considerável.

130

6 CONCLUSÃO

Foi possível demonstrar pelo trabalho realizado que a utilização de métodos

espectroscópicos, como FTIR-médio e UV-Vis, em conjunto com métodos quimiométricos

pode resultar em aplicações analíticas de grande potencial, para determinações qualitativas e

quantitativas.

Na primeira parte deste trabalho foi empregada a PCA em dados de espectroscopia de

infravermelho médio para classificação de adoçantes de mesa. Este método mostrou ser

perfeitamente capaz de classificar os adoçantes de mesa de acordo com a sua composição,

principalmente no que diz respeito à diferenciação dos veículos, mostrando ser uma técnica

rápida e eficiente para a análise qualitativa de açúcares possibilitando um controle de

qualidade mais ágil.

Considerando o conjunto de amostras analisado (em termos de quantidade e

qualidade) e a dificuldade na obtenção de pastilhas perfeitamente homogêneas para análise

via FTIR-médio, a metodologia mostrou-se adequada para distinguir os adoçantes compostos

de lactose/aspartame daqueles que contém lactose/mistura de edulcorantes. Vale a pena

ressaltar que em alguns processos industriais não é necessária a quantificação das amostras,

mas apenas uma indicação qualitativa, para verificar se o produto está ou não dentro dos

padrões normalmente aceitos, o que viabilizaria a aplicação deste tipo de metodologia.

No caso da quantificação espectrofotométrica de uma mistura de lactose/aspartame e

lactose/esteviosídeo, a intensa sobreposição das bandas espectrais impossibilita que as

técnicas convencionais de análise sejam realizadas. A utilização de técnicas multivariadas

permitiu contornar parte dos problemas de interferência espectral ou das baixas absorbâncias

apresentadas, propiciando bons resultados principalmente na análise quantitativa dos

edulcorantes intensos em adoçantes de mesa comerciais.

131

A proposta metodológica de determinar as concentrações de aspartame e esteviosídeo,

neste tipo de amostra, apresenta algumas vantagens, dentre as quais é possível destacar: baixo

custo, alta sensibilidade e pequeno tempo de análise.

A análise de lactose apresenta algumas dificuldades. Embora os modelos

desenvolvidos não tenham a capacidade de diferenciar concentrações de lactose tão similares,

os dados de absorção deste composto influem na análise de aspartame e esteviosídeo. Ou seja,

a metodologia proposta é adequada para sistemas como os aqui estudados, mesmo nas

situações onde é alta a concentração do veículo e baixa a concentração do edulcorante intenso.

O processo de calibração multivariada fundamentado em regressão por mínimos

quadrados parciais (PLSR) permite obter a melhor modelagem dos estudos em questão. Uma

pequena melhora é obtida no sistema lactose/esteviosídeo quando o processo de otimização é

realizado de maneira particular (sistema PLSR1), ou seja, um modelo para cada composto de

interesse, gerando modelos mais robustos com melhor capacidade de previsão.

132

7 REFERÊNCIAS

Disponível em: <http://sci-toys.com/ingredients/sucralose.html) >. Acesso em: 26/12/04

ACTON, G. H. Determination of lactose in cheese. The Australian Journal Dairy Technology, p. 111, setembro/1977. AHMED, F.E.; THOMAS, D.B. Assessment of the carcinogenicity of the nonnutritive sweetner cyclamate. Crit Rev Toxicol, v. 22, p.81-118, 1992. AL-JOWDER, O.; KEMSLEY, E.K.; WILSON, R.H. Detection of Adulteration in Cooked Meat Products by Mid-Infrared Spectroscopy. Journal Agriculture Food Chemistry, v. 50, p. 1325-1329, 2002. AMÁRITA, F.; FERNÁNDEZ, C. R.; ALKORTA, F. Hybrid biosensors to estimate lactose in milk. Analytica Chimica Acta, v. 349, p.153-158, 1997. Analysis of Carbohydrates. Disponível em: <http:://www.unix.oit.umass.edu/meclemen/581Carbohydrates.html>. Acesso em: 28 setem. 2003. ANVISA. Disponível em:< http://www.anvisa.gov.br/scriptsweb/Busca/busca.asp?palavrachave=edulcorantes>. Acesso em: 12 out.2004. ARRUDA, J.G.F.; MARTINS, A.T.; AZOUBEL, R. Ciclamato de sódio e rim fetal. Revista Brasileira de Saúde Materno Infantil, v. 3, n.2, abril/junho/2003. Artificial Sweetners. Disponível em: http://web.unbc.ca/chemistry/CHEM110/artificial.pdf em 03/07/2004. ASSUNÇÃO, M.C.F.; ANDERSSON, G.B.; CAVALCANTI, Z.C.H. Uso de adoçantes alternativos pelos diabéticos. J Bras Med [JBM], v. 67, p. 62-69, 1994. AYAZ, F. A.; BERTOFT, E. Sugar and Phenolic acid composition of stored comercial Oleaster fruits. Journal of Food Composition and Analysis, v.14, p. 505-511, 2001. AZE, Y.; TOYODA, K.;IMAIDA, K.; HAYASHI, S.; IMAZAWA, T.; HAYASHI, Y.; TAKAHASHI, M. Subchronic oral toxicity study of stevioside in F344 rats. Eisei-Shikenjo-Hokuku, v.109, p.48-54, 1991. BAKAL, A.I. Mixed sweetener functionality. In: Alternative Sweeteners, New York 2º edição, O’Brien Nabrs R. C. Gelardi, p.381-399, 1991. BARNES, K.; NICOLSON, S. W.; VAN WYK, B-E. Nectar Sugar Composition in Erica. Biochemical Systematics and Ecology, v. 23, n.4. p.419-423, 1995. BARNETT, A. J. G; TAWAB, G. A. A rapid method for the determination of lactose in milk and cheese. Journal Science Food Agriculture, v. 8, p. 437-441, 1957. BARTOLOMÉ, A. P.; RUPÉREZ, P.; FÚSTER, C. Changes in soluble sugars of two pineple fruit cultivars during frozen storage. Food Chemistry, v.56, n.2, p.163-166, 1996.

http://sci-toys.com/ingredients/sucralose.html)


http://www.anvisa.gov.br/scriptsweb/Busca/busca.asp?palavrachave=edulcorantes

http://web.unbc.ca/chemistry/CHEM110/artificial.pdf

133

BASSI, A. S.; LEE, E.; ZHU, J. Carbon paste mediated, amperometric, thin film biosensors for fructose monitoring in honey. Food Research International, v. 31, n. 2, p. 119- 127, 1998. BARLATTANI, M. Rassegne sintetiche di terapia. II problema dei ciclamati. Rass Clin Ter Sci Affini v.52, p.565-570, 1970. BASTIN, S. Nonnutritive Sweeteners. State Food and Nutrition Specialist. Disponível em: <http://www.ca.uky.edu/agc/pubs/fcs3/fcs3105/fcs3105.pdf > Acesso: 18 jul.2004. BELLON, V. Fermentation control using ATR and FT-IR spectrometer. Sensors and Actuators, v. 12, p.57-64, 1993. BERGMEYER, H. U.; BERNT, E. Determination of glucose with glucose oxidase and peroxidase. 1974In: Bergmeyer, H.U. (ed.). Methods of enzymatic analysis. New York: Verlag Chemie-Academic Press, p. 1205-1215. BERNÁRDEZ, M. M.; MIGUÉLES, J. M.; QUEIJEIRO, J. G. HPLC determination of sugars in varieties of chestnut fruits from Galicia (Spain). Journal of Food composition and Analysis. Disponível em: <http://www.sciencedirect.com> Acesso em 02dez.2003. BIEMER, T.A. Analysis of saccharin, Acesulfame-K and sodium cyclamate by high-performance ion chromatography. Journal chromatography, v. 463, p.463-468, 1989. BLAIS, B. W.; VAILHEN, C. A novel enzymatic microassay for the determination of lactose in grated parmesan cheese. Food Control, v. 6, n.4, p. 215-217, 1995. BRAGA, M. R.; BOM PESSONI, R. A.; DIETRICH, S. M. C. Cell wall polysaccharide composition of leaves of tropical rubiaceae differing in phytoalexin response. Revista Brasileira Fisiologia Vegetal , v.10, n.2, p. 71-78, 1998. BREUIL, C.; SADDLER, N. Comparison of the 3,5 dinitrosalicylic acid and Nelson- Somogyi methods of assaying for reducing sugars and determining cellulase activity. Enzyme and Microbiology Technology, v. 7, p. 327-332, 1985.

BURBANK, F.; FRAUMENI, J.F.Jr. Synthetic sweetener consumption and bladder cancer trends in the United States. Nature, v. 227, p. 296-297, 1970.

BUTCHKO, H.H. et al. Aspartame: Review of Safety. Regulatory Toxicology and Pharmacology, v.35, p.S1-S93, 2002. CADET, F. Measurement of sugar content by multidimensional analysis and mid-infrared spectroscopy. Talanta, v. 48, p. 867-875, 1999. CADET,F.; BERTRAND, D.; ROBERT, P. MAILLOT, J.; DIEUDONNE, J.; ROUCH,C. Quantitative determination of sugar cane sucrose by multidimensional statistical analysis of their mid-infrared attenuates total reflectance spectra. Applied Sprectroscopy, v.45, n.2, p.166-172, 1991. CÂNDIDO, L.M.B.; CAMPOS, A.M. Alimentos para fins especiais: Dietéticos. São Paulo: Varela, 1996.

CARDELLO, H.M.A.B.; SILVA, M.A.A.P.; DAMÁSIO, M.H. Análise descritiva quantitativa de edulcorantes em diferentes concentrações. Ciência Tecnologia Alimentos, v.20, p.318-328, 2000.

http://www.ca.uky.edu/agc/pubs/fcs3/fcs3105/fcs3105.pdf

http://www.sciencedirect.com

134

CARUSO, E. C; OLIVEIRA, A. J. Quantificação de lactose em queijo Minas Frescal. Scientia Agrícola, v. 56, n.1, p. 243-246, 1999. CASALS, L.; REIXACH, M.; AMAT, J.; FUENTES, M.; SERRA-MAJEM, L. Quantification of cyclamate and cyclohexylamine in urine samples using high-performance liquid chromatography with trinitrobenzenesulfonic acid pre-column derivatization. Journal Chromatography, v. 750, p.397-402, 1996. CATALDI, T. R. I.; MARGIOTTA, G.; IASI, L.; DI CHIO, B.; XILOYANNIS, C.; BUFO, S. A. Determination of sugar compounds in Olive Plant Extracts by Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection, Analytica Chemica, v. 72, p. 3902-3907, 2000. CHANG, S.S.; COOK, J.M. Stability studies of stevioside and rebaudioside A in carbonated beverages. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 31, p. 409-412, 1983. CHATEL S, VOIRIN A, LUCIANI A, ARTAUD J. Starch identification and separation in sweetened fruit preparations. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 44, n. 2, p.505-506, 1996. CHEN, Q-C.; MOU, S.-F.; LIU, K.-N.; YANG, Z-Y.; NI, Z.M. Separation and determination of four artificial sweeteners and citric acid by high-performance anion-exchange chromatography. Journal of Chromatography A, v.771, p.135-143, 1997. CHEN, Q-C.; WANG, J. Simultaneous determination of artificial sweeteners, preservatives, caffeine, theobromine and theophylline in food and pharmaceutical preparations by ion chromatography. Journal of Chromatography A, v. 927, p. 57-64, 2001. CHOU, S.F. Amperometric biosensor for the determination of the artificial sweetener aspartame with an immobilized bienzyme system. Biosens Bioelectron, v.11, p. ,1996. CLARK, L. C.; LYONS, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Annals of the New York Academy of science, v.102, n. 1, p. 29-45, 1962. COLLINGS, A.J. The metabolism of sodium cyclamate. In: Birch GG, editor. Sweetness and sweeteners. London: Applied Science, p.51-68, 1971. COLLINGS, A.J. Metabolism of cyclamate and its conversion to cyclohexylamine. Diabetes Care, v. 12, p. 50-55, 1989. COSNIER, S.; SZUNERITS, S.; MARKS, R. S.; NOVOA, A.; PUECH, L.; PEREZ, E.; RICO-LATTES, I. A rapid and easy procedure of biosensor fabrication by micro-encapsulation of enzyme in hydrophilic synthetic latex films. Application to the amperometric determination of glucose. Electrochemistry Communications, v. 12, n. 12, p. 851-855, 2000. COURTIN, C. M.; VAN DEN BROECK, H.; DELCOUR, J. A. Determination of reducing end sugar residues in oligo- and polysaccharides by gas-liquid chromatography. Journal Chromatography A, v.866, p. 97-104, 2000.

DALDERUP, L.M.; VISSER, W. Influence of extra sucrose, fats, protein and of cyclamate in the daily food on the life-span of rats. Experientia, v.15, p. 519-521, 1971.

DEMIATE, I. M.; KONKEL, F. E.; PEDROSO, R. A. Enzymatic determination of starch in doce de leite using dialysis. Ciência Tecnologia Alimentos, v. 21, n. 3, p. 339-342, 2001.

135

DEMIATE, I. M.; KONKEL, F. E.; PEDROSO, R. A. Avaliação da qualidade de amostras comerciais de doce de leite pastoso- Composição química. Ciência Tecnologia Alimentos v.?, n.?, p.339-342, 2001. DEMIATE, I. M.; WOSIACKI, G.;CZELUSNIAK, C.;NOGUEIRA, A. Determinação de açúcares redutores e totais em alimentos, comparação entre método colorimétrico e titulométrico. Publicatio UEPG, v. 8, n. 01, p. 65-78, 2002. DENG, S. P.; TABATABAI, M. A. Colorimetric determination of reducing sugar in soils. Soil Biology & Biochemistry, v.26, n.4, p.473-477, 1994.

DICK, C.E.; SCHNIEPP, M.L.; SONDERS, R.C.; WIEGAND, R.G. Cyclamate and cyclohexylamine: lack of effect on the chromosomes of man and rats in vivo. Mutat Res, v. 26, p.199-203, 1974.

DING, Y.; YU, H. MOU, S. Direct determination of free amino acids and sugars in green tea by anion-exchange chromatography with integrated pulsed amperometric detection. Journal Chromatography A, v. 982, p. 237-244, 2002. DOWNEY, G. Food and food ingredient authentication by mid-infrared spectroscopy and chemometrics. Trends in analytical chemistry, v.17, n.7, p.418-424, 1998. DUARTE, I. F.; BARROS, A.; DELGADILLO, I.; ALMEIDA, C.; GIL, A. M. Application of FTIR spectroscopy for the quantification of sugars in Mango juice as a function of ripening. Agricultural and Food Chemistry, v. 50, p.3104-3111, 2002. DUBOIS, M.; GILLES, K. A.; HAMILTON, J. K.; REBERS, P. A.; SMITH, F. Colorimetric method for determination of sugars and Related Substances, Analytical Chemistry, v. 28, n.3, p.350-356, 1956. DUPUY, N.; MEURENS, M.; SAOMBRET, B.; LEGRAND, P. Determination of sugars and organic acids in fruit juices by FT MID-IR investigation of dry extract. Applied Spectroscopy, v. 46, n.5, p.860-863, 1992. DUPUY, N.; WOJCIECHOWSKI, C.; TA, C.D.; HUVENNE, J.P.; LEGRAND, P. Mid-infrared spectroscopy and chemometrics in corn starch classification. Journal of Molecular Structure, v. 410-411, p. 551-554, 1997. EGEBERG, R.O.; STEINFELD, J.L.; FRANTZ, I.; GRIFFITH, G.C.; KNOWLES, J.R. R.H.; ROSENOW, E.; SEBRELL, H.; VAN ITALLIE, T. Report to the secretary of HEW from the Medical Advisory Group on cyclamates. JAMA, v. 211, p.1358-61, 1970. EMNEUS, J.; NILSSON, G.; GORTON, L. A flow injection system for the determination of starch from different origins with immobilized alpha-amylase and amyloglicosidase reactors. Starch/Stärke, v. 45, n. 8, p. 264-270, 1993. FARHADI, A.; KESHAVARZIAN, A.; HOLMES, E.W.; et al.G as chromatographic method for detection of urinary sucralose: application to the assessment of intestinal permeability. Journal of Chromatography B, v. 784, p. 145–154, 2003. FARINE, S. Separation and identification of enzymatic sucrose hydrolysis products by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection. Journal Chromatography A, v. 920, p. 299-308, 2001.

136

FARINE, S.;MALGOYRE, R.; PUIGSERVER, A.; BIAGINI, A. Study of sweet water recovery in the Marseilles Saint-Louis Sucre refinery using high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection. International Sugar Journal, v.103, n.103, p.112-115, 2001. FATIBELLO-FILHO, O.; SULEIMAN, A.A.; GUILBAULT, G.G.; LUBRANO, G.L.. Bienzymatic electrode for the determination of aspartame in dietary products. Analytical Chemistry, v. 60, p. 2397-2399, 1988. FATIBELLO-FILHO, O.; ANICETO, C. Potentiometric determination of saccharin in dietary products using a coated-carbon rod ion-selective electrode. Analytical Letters, v. 30, p. 1653-1666, 1997. FATIBELLO-FILHO, O.; MARCOLINO-JUNIOR, L.H.; PEREIRA, A.P. Solid-phase reactor with copper(II) phosphate for flow-injection spectrophotometric determination of aspartame in tabletop sweeteners. sugar, glucose, fructose and sucrose in aqueous solutions of fruit juices. Analytica Chimica Acta, v. 384, n. 2, p.167-174, 1999. FERNÁNDEZ-ARTIGAS, P.; GUERRA-HERNÁNDEZ, E.; GARCÍA-VILLANOVA, B. Changes in sugar profile during infant cereal manufacture. Food Chemistry, v. 74, p. 499-505, 2001.

FERREIRA, L. S.; DE SOUZA, M. B.Jr. ; TRIERWEILER, J. O.; BROXTERMANN, O.; FOLLY, R. O. M., HITZMANN, B. Aspects concerning the use of biosensors for process control: experimental and simulation investigations. Computers & Chemical Engineering, v. 27, p. 1165-1173, 2003.

FERREIRA, M. M. C.; ANTUNES, A. M.; MELGO, M. S.; VOLPE, P. L. O. Quimiometria I: Calibração Multivariada, um tutorial. Química Nova, v. 22, n. 5, p.724 –731, 1999. Food Factos for you. Disponível em: <http://www.wisc.edu/foodsafety/assets/foodfacts_2003/foodfacts_may_2003.pdf >. Acesso em: 03 jul.2004.

FONTANIELLA, B.; VICENTE, C.; LEGAZ, M. E.; ARMAS, R.; RODRÍGUEZ, C. W.; MARTÍNEZ, M.;PIÑÓN, D.; ACEVEDO, R.; SOLAS, M. T. Yellow leaf syndrome modifies the composition of sugarcane juices in polysaccharides, phenols and polyamines. Plant Physiology and Biochemistry, v.43, p.1027-1036, 2003.

FURDA, I.; MALIZIA, M.G.; VERNIERI, P.J. Decomposition products of L-aspartyl-L-phenylalanine methyl-ester and their identification by gas-liquid-chromatography. Journal Food Chimica Acta, v. 23, p. 340-343, 1975. GARCÍA-ALVAREZ, M.; CERESUELA, S.; HUIDOBRO, J. F; HERMIDA, M.; RODRÍGUEZ-OTERO, J. L. Determination of Polarimetric Parameters of Honey by Near-Infrared Transflectance Spectroscopy, Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.50,p.419-425, 2002. GARCÍA BAÑOS, J. L.; OLANO, A.; CORZO, N. Determination of Mono and Disaccharide Content of Enteral Formulations by Gas Chromatography. Chromatographia, v.52, p.221-224, 2000. GARCIA, E.; CORDENUNSI, B. R.; LAJOLO, F. M. Determinação de amido em embutidos: comparação entre o método de Fehling e método enzimático. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.5, n. 1, p.39-46, 1985.

http://www.wisc.edu/foodsafety/assets/foodfacts_2003/foodfacts_may_2003.pdf

137

GARNIER-SAGNE, I.; LEBLANC, J.C.; VERGER, PH. Calculation of the intake of three intense sweetners in young insulin-dependent diabetic. Food and Chemical Toxicology, v. 39, p. 745-749, 2001. GELADI, P.; KOWALSKI, R. B. Partial least-square regression – A tutorial. Analytica Chimica Acta, v.185, p. 1, 1986. GELARDI, C. The multiple sweetener approach and new sweeteners on the horizon. Food Technology, v.41, n.1,p. 123-124, 1987. GRANDY, A. S.; ERICH, M. S.; PORTER, G. A. Suitability of the anthrone-sulfuric acid reagent for determining water soluble carbohydrates ion soil water extracts. Soil Biology & Biochemistry, v.32, p.725-727, 2000. GUILBAULT, G.G.; LUBRANO, G.J. Enzyme electrodes for the sugar substitute aspartame. Analytical Chemistry, v. 206, p. 369, 1988 GUTIÉRREZ-MICELI, F. A.; ARIAS-CASTRO, C.; DENDOOVEN, L.; MÉNDEZ-SALAS, R.; RODRÍGUEZ-MENDIOLA, M. A.; OCHOA-ALEJO, N. BELLO-PÉREZ, L. A. Regulación enzimática de la acumulación de sacarosa en plantas de caña de azúcar (Saccharum ssp). Agrociencia, v.36, p. 411-419, 2002. HANGER, L.Y.; LOTZ, A.; LEPENIOTIS, S. Descriptive profiles of selected high intensity sweeteners (HIS), HIS blends, and sucrose. Journal of Food Science, v.61, p. 456-458, 464, 1996. HARMS, D.; MEYER, J.; WESTERHEIDE, L. KREBS, B.; KARST, U. Determination of glucose in soft drinks using its enzymatic oxidation and the detection of formed hydrogen peroxide with a dinuclear iron (III) complex. Analytica Chimica Acta, v. 401, p. 83-90, 1999.

HATANAKA, Y.; INAOKA, K.; ÖZBOY, Ö; DEMIATE, I. M.; KOBAYASHI, O.; HIGASHIHARA, M.; HIYAMA, K. Study of some properties of starch isolated from halotolerant microalgae Dunaliella. Journal Appl. Glycosci. v.44, n.04, p.515-522, 1997.

HELD, M.; SCHUHMANN, W.; JAHREIS, K.; SCHMIDT, H. Microbial biosensor array with transport mutants of Escherichia coli K12 for the simultaneous determination of mono-and disaccharides. Biosensor and Bioelectronics, v. 17, n.11-12, p. 1089-1094, 2002.

HOLM, J.; BJÖRCK, I.; DREWS, A.; ASP, N.G. A rapid method for the analysis of starch. Starch/stärke, v. 38, n. 7, p. 224-226, 1986.

HORII, J. ; GONÇALVES, R. H. Um método alternativo para a determinação de AR e ART. STAB Açúcar, álcool e Subprodutos, v. 10, n. 2, p. 45-47, 1991.

HUTÑAN, M.; MRAFKOVÁ, L.; DRTIL, M.; DERCO, J. Methanogenic and Nonmethanogenic activity of granuleted sludge in anaerobic baffled reactor. Chem Papers, v. 53, n.6, p.374-378, 1999. HUTTEAU, F.; MATHLOUTHI, M.; PORTMANN, M.O.; KILCAST, D. Physicochemical and psychophysical characteristics of binary mixtures of bulk and intense sweeteners. Food Chemistry, v.63, n.1, p.9-16,1998. IBAÑEZ, E.; CIFUENTES, A. New analytical Techniques in Food Science and Nutrition. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v. 41, n.6, p. 413-450, 2001.

138

INDYK, H. E.; EDWARDS, M. J.; WOOLLARD, D. C. High performance liquid chromatographic analysis of lactose-hydrolysed milk. Food Chemistry, v. 57, n.4, p. 575-580, 1996. INSTITUTO ADOLFO LUTZ- Normas Analíticas. Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, São Paulo: IAL, 1976. IOP, S.C.F.; SILVA, R.S.F.; BELEIA, A.P. Formulation and evaluation of dry dessert mix containing sweetener combinations using mixture response methodology. Food Chemistry, v.66, p. 167-171, 1999. ISEJIMA, E. M.; COSTA, J. A. B.; SOUZA JUNIOR, D. I. S. Método de determinação de açúcares redutores aplicável no sistema de pagamento de cana de açúcar. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 37, n.5, 2002. Disponível em:<http::// www.scielo.com.br>. Acesso em: 06 jul. 2003. KAINE, L. A.; WOLNIK, K. A. Detection of counterfeit and relabeled infant formulas by high-pH anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection for the determination of sugar profiles. Journal of Chromatography A, v. 804, p. 279-287, 1998. KATEMAN, G.; BUYDENS, L. “Quality Control in Analytical Chemistry- A Series of Monographs on Analytical Chemistry and its applications”, v.20, 2ºedição, Wiley Interscience Publication, New York, 1993. KATONA, Z.s. F.; SASS, P.; MOLNÁR-PERL, I. Simultaneous determination of sugars, sugar alcohols, acids and amino acids in apricots by gas chromatography-mass spectrometry. Journal Chromatography A, v. 847, p. 91-102, 1999.

KATSUMATA, H.; SEKINE, T.; TESHIMA, N. A new flow-injection determination of glucose based on the redox reaction of hydroquinone with iron(III) in the presence of 1,10-phenanthroline. Talanta, v. 51, n. 6, p. 1197- 1204, 2000.

KILLE, J.W. et al. Sucralose: Assessment of Teratogenic Potential in the Rat and the Rabbit. Food and Chemical Toxicology, v. 38 (suppl.2), s.43-52, 2000. KOJIMA, S.; ICHIBAGASE, H. Studies on synthetic sweetening agents. VIII. Cyclohexylamine, a metabolite of sodium cyclamate. Chem Pharm Bull, v.14, p. 971-974, 1966. KOJIMA, S.; ICHIBAGASE, H. Studies on synthetic sweetening agents. XII. The binding of sodium cyclamate with bovine serum albumin. Chem Pharm Bull, v. 16, p. 1619-1622, 1968. KRAEMER, T.; MAURER, H.H. On the metabolism of the sweetener stevioside in humans. European Journal of Pharmaceutical Sciences, v.2, p.103, 1994. KROES, R.; PETERS, P.W.J.; BERKVENS, J.M.; VERSCHUUREN, H.G.; DE VRIES, T.H.; VAN ESCH, G.J. Long-term toxicity and reproduction study (including a teratogenicity study) with cyclamate, saccharin and cyclohexylamine. Toxicology, v. 8, p. 285-300, 1977. KROYER, G.T. The low calorie sweetener stevioside: Stability and interaction with food ingredients. Lebensm Wiss u Technology, v.32, p.509-512, 1999. LAI, Y.W.; KEMSLEY, K.E.; WILSON, R.H. Potential of Fourier Transform Infrared Spectroscopy for the Authentication of Vegetable Oils. Journal Agricultural Food Chemical, v. 42, p.1154-1159, 1994.

http://www.scielo.com.br

139

LANE, H.; EYNON, L. Determination of reducing sugar by means of Fehling´s solution with methylene blue as internal indicator. Journal Soc Chem Ind, v.42, p. 32-37, 1923.

LANZA, E.; LI, B.W. Application for near infrared spectroscopy for predicting the sugar content of fruit juices. Journal of Food Science, v. 49, p. 995-998, 1984.

LAU, O.; SHAO, B.; LEE, M. T. W. Affinity mass sensors: determination of fructose. Analytica Chimica Acta, v. 403, n.1-2, p. 49-56, 2000.

LAURENTIM, A.; EDWARDS, C. A. A microtiter modification of the anthrone-sulfuric acid colorimetric assay for glucose-based carbohydrates. Analytical Biochemistry, v. 315, p.143-145, 2003.

LAWRENCE, A. J. The determination of lactose in milk products. The Australian Journal Dairy Techonology v.23, p. 103, 1968.

LEFEBVRE, D.; GABRIEL, V.; VAYSSIER, Y.; FONTAGNÉ-FAUCHER, C. Simultaneous HPLC determination of sugars, organic acids and ethanol in Sourdough Process. Disponível em: <http:://www.sciencedirect.com>. Acesso em: 03 agos. 2003.

LeTHANH, H.; LENDL, B. Sequential injection Fourier transform infrared spectroscopy for the simultaneous determination of organic acids and sugars in soft drinks employing automated solid phase extraction. Analytica Chimica Acta, v. 422, p. 63-69, 2000.

LI, W.; GOOVAERTS, P.; MEURENS, M. Quantitative analysis of individual sugar and acids in orange juices by near-infrared spectroscopy of dry extract. Journal Agricultural and Food Chemistry, v.44, p.2252-2259, 1996.

LIM, H.; SETSER, C.S.; KIM, S.S. Sensory studies of high potency multiple sweetener systems for shortbread cookies with and without polydextrose. Journal of Food Science, v.54, p.625-628, 1989. MARTENS, H.; NAES, T. Multivariate calibration. New York: Wiley, 1988. MARTÍNEZ-BARAJAS, E. Análisis de la acumulación de azúcares en pericarpios de los genotipos silvestres de jitomate (Lycopersicon esculentum). Agrociencia, v.37, p.363-370, 2003. MATISSEK, R.; SCHNEPEL, F. M.; STEINER, G. In: Análisis de los alimentos. Fundamentos, métodos, aplicaciones. Zaragoza: Acribia, 1998. Cap.1.p.1 e 13. Cap. 4.p.113-162. MATLAB USER’S GUIDE- Statistic Toolbox, version 3.0; The Mathworks. Disponível em: <http:://www.mathworks.com/products. Acesso em: 01 maio 2003. MATYSIAK, N.L.; NOBLE, A.C. Comparison of temporal perception of fruitness in model systems sweetened with aspartame, an aspartame + acesulfame K blend, or sucrose. Journal of Food Science, v.56, p. 823-826, 1991.

MELAMANE, X.; PLETSCHKE, B. I.; LEUKES, W. D.; WHITELEY, C.G. Cleaning fouled membranes using sludge enzymes. Disponível em: <http://www.wre.org.za>. Acesso em: 26 setem. 2003.

MORALES, M. D.; ESCARPA, A.; GONZÁLES, M. C. Simultaneous determination of resistent digestible starch in foods and foods products. Starch/Stärke , v.49, n.11, p.448-453, 1997.

http://www.sciencedirect.com

http://www.mathworks.com/products

http://www.wre.org.za

140

MORGANO, M. A.; MORIYA,C.; FERREIRA, M. M. C. Determinação Quantitativa do Teor de Sacarose em açúcar cristal por Espectroscopia FT-IR/ATR e Regressão Multivariada, Brazilian Journal, v.6, p.77-83, 2003.

MOTA, R. V.; LAJOLO, F. M.; CORDENUNSI, R. B. Composição em carboidratos de alguns cultivares de Banana (Musa spp.) durante o armazenamento. Ciência Tecnologia de Alimentos, v. 17, n.2, p. 94-97, 1997.

MUKHERJEE, A.; CHAKRABARTIT, J. In vivo exposed to cytogenetic studies on mice acesulfame-K a non-nutritive sweetener. Food and Chemical Toxicology, v. 35, p. 1177-1179, 1997.

NAGATA, N.; BUENO, M. I. M. S.; PERALTA-ZAMORA, P. Métodos matemáticos para a correção de interferências espectrais e efeitos interelementos na análise quantitativa por fluorescência de raios-x. Química Nova, v.24, n. 4, p. 531-539, 2001.

NARINESINGH, D.; STOUTE, V. A.; DAVIS, G.; PERSAD, D. Improved spectrophotometric determination of lactose in milk using flow-injection analysis. Analytica Chimica Acta, v. 258, p.141-149, 1992.

NELSON,A.L. Sweetners: Alternative. Carbohydrate Polymers, v. 44, 2, p.172, 2001.

NELSON, N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. Journal Biol Chem , v.153, p. 375-380, 1944.

NI, Y.; HUANG, C.; KOKOT, S. A kinetic spectrophotometric method for the determination of ternary mixtures of reducing sugars with aid of artificial neural networks and multivariate calibrations. Analytica Chimica Acta, v.408, p.53-65, 2003.

NICKERSON, T. A.; VUJICIC, I. F.; LIN, A. Y. Colorimetric Estimation of Lactose and its hydrolytic products. Journal of Dairy Science, v.59, n.3, 1975.

NIKOLELIS, D.P.; HIANIK, T.; KRULL, U.J. Capillary electrophoretic determination of different classes of organic. Eletroanalysis, v. 11, p. 7, 1999. NIKOLELIS, D.P.; PANTOULIAS, S. A minisensor for the rapid screening of sucralose based on surface-stabilized bilayer lipid membranes. Biosensors & Bioelectronics, v. 15, p. 439–444, 2000. NIKOLELIS, D.P.; PANTOULIAS, S.; KRULL, U.J.; ZENG, J. Electrochemical transduction of the interactions of the sweeteners acesulfame-K, saccharin and cyclamate with bilayer lipid membranes (BLMs). Eletrochimica Acta, v. 46,n. 7, p.1025-1031, 2001. NUTRASWEET. Manual técnico. São Paulo [2003?]. ODACT, D.; TIMUR, S.; TELEFONEU, A. Carboxyl esterase-alcohol oxidase based biosensor for the aspartame determination. Food Chemistry, v. 84, p.493-496, 2004.

OLIVEIRA, M. A.; RODRIGUES, C.; REIS, E. M.; NOZAKI, J. Production of fungal protein by solid substrate fermentation of cactus Cereus peruvianus and Opuntia ficus indica. Química Nova, v. 24, n.3, p. 307-310, 2001.

OSER, B.L.; CARSON, S.; COX, G.E.; VOGIN, E.E.; STERNBERG, S.S. Chronic toxicity study of cyclamate: saccharin (10:1) in rats. Toxicology, v. 4, p. 315-30, 1975.

141

PARKE, S.A.; BIRCH, G.G.; PORTMANN, M.O.; KILCAST, D. A study of the solution properties of selected binary mixtures of bulk and intense sweeteners in relation to their psychophysical characteristics. Food Chemistry, v. 67,p. 247-259, 1999. PEREIRA, A.P.; MARCOLINO-JUNIOR, L.H.; FATIBELLO-FILHO, O. Determinação espectrofotométrica de aspartame em adoçantes por injeção em fluxo usando em reator em fase sólida contendo fosfato de zinco imobilizado. Química Nova, v. 23, n. 5, p.167-171, 2000.

PÉREZ, A. G.; OLÍAS, R.; ESPADA, J.; OLÍAS, J. M.; SANZ, C. et al. Rapid determination of sugars, non-volatile acids and ascorbic acids in strawberry and others fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.45, p.3545-3549,1997.

Pirouette User Guide; version 3.02;Infometrix; Washington; Copyright 1990-2001; Chapter 04. PRICE, J.M.; BIAVA, C.G.; OSER, B.L.; VOGIN, E.E.; STEINFELD, J.; LEY, H.L. Bladder tumors in rats fed cyclohexylamine or high doses of a mixture of cyclamate and saccharin. Science. v. 167, p. 1131-1132, 1970. QU, F.; QI, Z.-H.; LIU, K.N.; MOU, S.-F. Determination of aspartame by ion chromatography with electrochemical integrated amperometric detection. Journal of chromatography A, v.850, p.277-281, 1999. RAMBLA, F. J.; GARRIGUES, S.; GUARDIA, M. de la. PLS-NIR determination of sugar, glucose, fructose and sucrose in aqueous solutions of fruit juices. Analytica Chimica Acta, v. 344, p.41-53, 1997.

REIS, J. M. R.; LIMA, L. C.; VILAS BOAS, E. V. B.; CHITARRA, A. B. Relação entre o grau de coloração da casca e algumas características da qualidade de tangerina “Polkan”. Ciência Agrotécnica, v. 24, p.182-186, Lavras, 2000.

RENNEBERG, R.; RIEDEL, K.; SCHELLER, F. Microbial sensor for aspartame. Appied Microbiology Biotechnology v. 21, p.180-181, 1985. RENWICK, A.G.; WILLIAMS, R.T. The metabolites of cyclohexylamine in man and certain animals. Biochemical Journal, v. 129, p. 857-867, 1972. REVISTA SUPER MIX, n.61, p.36-37, 2000. ROBERTS, A.; RENWICK, A.G. The metabolism of 14C-cyclohexylamine in mice and two strains of rat. Xenobiotica, v.15, p. 477-483, 1985. RODRIGUEZ-SAONA, L.; FRY, F. S.; McLAUGHLIN, M. A.; CALVEY, E. M. Rapid analysis of sugars in fruit juices by FT-NIR spectroscopy. Carbohydrate Research, v. 336,n.1, p.63-74 , November 2001.

RODRÍGUEZ- TREJO, D. A.; DURYEA, M. L.; WHITE, T. L. Fertilización nitrogenada y concentración de carbohidratos en plántulas de pinus palustris Mill. Producidas a raíz desnuda. Agrociencia, v. 36, p. 683-691, 2002.

ROGGO, Y. ; DUPONCHEL,B. N. ; HUVENNE, J. P. Sucrose content determination of sugar beets by near infrared reflectance spectroscopy. Compararison of calibration methods and calibration transfer. Journal Near Infrared Spectroscopy, v.10, n.137-150, 2002.

142

ROTARIU, L.; BALA, C.; MAGEARU, V. Yeast cells sucrose biosensor based on a potentiometric oxygen electrode. Analytica Chimica Acta, v. 458, n. 1,p. 215-222, 2002.

RUTER, L.; RACZEK, D.I.; LEBENSM, Z. Sensitive and seletiveHPLC procedure with prechromatographical derivatization for the determination of cyclamate in food stuffs. Zeitschrift fur lebensmittel-untersuchung und-forschung, v. 194, p.520-523, 1992.

SCHECHTER, P.J.; ROTH, L.J. Whole-body autoradiography of 14C sodium cyclamate in pregnant and fetal rats. Toxicol Appl Pharmacol, v. 20, p. 130-133, 1971.

SCHNIERLE, P.; KAPPES, T.; HAUSER, P.C. Capillary electrophoretic determination of different classes of organic. Analytical chemistry, v. 70, p. 3585-3589, 1998. SCHOR, I.; MAZZEI, E.; SUDERA, O.A. A segurança do Aspartame. Atualização Clínica.[s.l:s.n.], 1993. SCHWEIZER, P. ; KMECL, A.; CARPITA, N.; DUDLER, R. A soluble carbohydrate elicitor from Blumeria graminis f. sp. Tritici is recognized by a broad range of cereals. Physiological and Molecular Plant Pathology, v.56, p. 157-167, 2000.

SHANKARAN, D. R.; UEHEARA, N.; KATO, T. A metal dispersed sol–gel biocomposite amperometric glucose biosensor. Biosensors and Bioelectronics, v. 18, n. 5-6, p. 721-728, 2003.

SHANLEY, R. M. Analysis of free sugars in yoghurt. The Astralian Journal Dairy Technology, v. 28, n.2, p.58-60, 1973.

SHAPIRO, F.; SHAMAY, A.; SILANIKOVE, N. Determination of lactose and D-galactose using thio-NAD+ instead of NAD+. International Dairy Journal, v.12, p. 667-669, 2002.

SHIRAKAWA, T.; ONISH, T. Quantitative analysis of stevioside in soy sauce and hydrolisate of vegetable protein. Kagawa-ken Hakko Shokuhin Shikenjo Hokuku, v.71, p. 35-39, 1979.

SILVA, R. N.; MONTEIRO,V. N.; ALCANFOR, J. D. X.; ASSIS, E. M.; ASQUIERI, E. R. Comparação de métodos para a determinação de açúcares redutores e totais em mel. Ciência e tecnologia de alimentos, v.23, n.3, p. 337-341, set-dez. 2003.

SIVAKESAVA, S.; IRUDAYARA, J. Classification of simple and complex sugar adulterants in honey by mid-infrared spectroscopy. International Journal Food and Technology, v. 37, p. 351-360, 2002.

SKOOG, D.A.; HOLLER, F.J.;NIEMAN, T.A. Principles of Instrumental Analysis In: Applications of Infrared Spectrometry, EUA, Cap. 17, 5º ed., p.404 a 428.

SOEJARTO, D.D.; COMPADRE, C.M.; MEDON, P.J.; KAMATH, S.K.;KINGHORN, A.D. Potential sweetening agents of plant origin, II. Field search for sweet-tasting stevia species. Economic Botany, v.37, p.71-79, 1983.

SOMOGYI, M. A. New reagent for the determination of sugar. Journal Bio Chemistry, v. 160, p. 61-68, 1945.

143

SRIVASTAVA, Y. P.; TRIPATHI, C. D.; JAJU, B. P. Interaction between antibacterial agents and insulin on blood sugar level in Rabbits. Indian Journal Pharmacology, v.18, p. 265-266, 1986.

STAMP, J.A.; LABUZA, T.P. An ion-pair high-performance liquid-chromatographic method for the determination ofaspartame and its decomposition products. Journal Food Science, v. 54, p. 1043-1046, 1989.

STURM, K.; KORON, D.; STAMPAR, F. The composition of fruit of different strawberry varieties depending on maturity stage. Food Chemistry, v.83, p. 417-422, 2003.

SUPER MIX. Nem tudo que é diet é light. V.61, p.36-37, set.2000.

SUTTAJIT, M.; VINITKETKAUMNUEN, U.; MEEVATEE, U.; BUDDHASUKH, D. Mutagenicity and human chromosomal effect of stevioside, a sweetener from Stevia rebaudiana Bertoni. Environmental Health Perpective, v. 101, n.3, p. 53-56, 1993.

THAVARUNGKUL, P.; SUPPAPITNARM, P.; KANATHARANA, P.; MATTIASSON.B. Batch injection analysis for the determination of sucrose in sugar cane juice using immobilized invertase and thermometric detection. Biosensors and Bioelectronics, v. 14, n. 1, p. 19-25, 1999.

THOMAS, E.V. A primer on Multivariate Calibration. Analytical Chemistry, v.66, p.795A-840A, 1994.

TRUGO, L. C.; FARAH, A.; CABRAL, L. Oligosaccharide distribution in Brazilian soya bean cultivars. Food Chemistry, v.52, p. 385-387, 1995.

TSANG, W.S.; CLARKE, M.A.; PARRISH, F.W. Determination of aspartame and its breakdown products in soft drinks by reverse-phase chromatography with UV detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry,v.33, p.734-738, 1985. TYLER,T.A. Liquid-chromatographic determination of sodium saccharin, caffeine, aspartame, and sodium benzoate in cola beverages. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v.67, p. 745-747, 1984. YODYINGUARD, V.; BUNYAWONG, S. Effect of stevioside on growth and reproduction. Human Reproduction, v. 6, p. 158-165, 1991.

YUAN, J-P.; CHEN, F. Simultaneous separation and determination of sugar, ascorbic acid and furanic compunds by HPLC-dual detection. Food Chemistry, v.64, p.423-427, 1999.

VAINIONPÃÃ, J.; SMOLANDER, M.; ALAKOMI, H-L.; RITVANEN, T.; RAJAMÃKI, T.; ROKKA, M.; AHVENAINEN. Comparison of di.erent analytical methods in the monitoring of the quality of modi.ed atmosphere packaged broiler chicken cuts using principal component analysis. Journal of Food Engineering. Disponível em:< www.elsevier.com/locate/jfoodeng>. Acesso em:15/07/2004. VERDI, J.R.; HOOD, L.L. Advantages of alternative sweeteners blends. Food Technology, v.47, n.6, p.1996-1998, 1993. VERZELLA, G.; BAGNASCO, G.; MANGIA, A. Ion-pair high-performance liquid-chromatographic analysis of aspartame and related products. Journal chromatography, v. 349, p. 83-89, 1985.

http://www.elsevier.com/locate/jfoodeng

144

VESELY, Z.; DÁVIDKOVÁ, E.; PRUDEL, M. Determination of alpha-L-aspartyl-L-phenylalanine methylester hydrochloride in soft drinks. Die nahrung, v. 24, p. 525-528, 1980. WALKER, J.C.; ZAUGG, S.E. WALKER, E.B. Analysis of beverages by capillary electrophoresis. Journal chromatography A, v. 781, p. 481-485, 1997. VILLARTA, R.L.;SULEIMAN,A.A.;GUILBAULT,G.G. Amperometric enzyme electrode for the determination of aspartame in diet food. Microchem. Journal, v.48, p. 60-64, 1993. XILI, L.; CHENGJIANY, B.; ERYI, X.; REIMING, S.; YUENMING, W.; HAODONG, S.; ZHIYIAN, H. Chronic oral toxicity and carcinogenicity study of stevioside in rats. Food and Chemical Toxicology, v.30, p. 957-965, 1992. ZAGONEL, G.F.; PERALTA-ZAMORA, P.; RAMOS, L.P. Multivariate monitoring of soybean oil ethanolysis by FTIR. Talanta, v.63, p.1021–1025, 2004. ZHU, L.; LI, Y.; ZHU, G. A novel flow through optical fiber biosensor for glucose based on luminol electrochemiluminescence. Sensors and Actuators B: Chemical, v. 86, n. 2-3, p. 209-214, 2002.

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA PRÓ-REITORIA DE ..._A.pdf · CONTROLE DE QUALIDADE DE...

Documents

Transcript of UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA PRÓ-REITORIA DE ..._A.pdf · CONTROLE DE QUALIDADE DE...