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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PRISCILA MARTINS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, MUTAGÊNICA E TOXICIDADE AGUDA DE DERIVADOS ANFIFÍLICOS DA

O – carboximetilquitosana

ITAJAÍ - 2010

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIASFARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS ESUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

PRISCILA MARTINS



Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella CruzCo-orientador: Prof. Dr. Clóvis Antônio Rodrigues

Itajaí, julho de 2010

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PRISCILA MARTINS

Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.

_____________________________________________Tânia Mari Bellé Bresolin, Doutora

Coordenadora do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas

Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

______________________________________Doutor Alexandre Bella Cruz (Univali)

Presidente

____________________________________Doutor Clóvis Antônio Rodrigues (Univali)

Co-orientador

______________________________________Doutor Rilton Alves de Freitas (Univali)

Membro interno

______________________________________Doutora Jenifer Saffi (UFCSPA)

Membro externo

Itajaí (SC), 9, julho de 2010

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Dedicatória

Dedico este trabalho aos meus pais Romário (in memoriam) e Bernadete,

os melhores pais do mundo e meus maiores exemplos de vida.

Obrigada por tudo!!!

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Agradecimentos

Considerando este trabalho como resultado de uma caminhada, agradecer

pode não ser uma tarefa fácil, nem justa. Para não correr o risco da injustiça,

agradeço de antemão a todos que de alguma forma passaram pela minha vida e

contribuíram para a construção de quem sou hoje, especialmente:

A Deus por ter me iluminado e permitido chegar até aqui.

Ao meu orientador professor Dr. Alexandre Bella Cruz e ao meu co-orientador

professor Dr. Clóvis Antônio Rodrigues, recebam meus sinceros agradecimentos

não só pela orientação e pelo conhecimento compartilhado mais principalmente pela

amizade, pois ser mestre não é apenas lecionar, ensinar não é apenas transmitir o

conteúdo programático. Ser mestre é ser orientador e amigo, guia e companheiro, é

caminhar com o aluno passo a passo. É transmitir a este os segredos da caminhada.

Ser mestre é ser como vocês exemplos de dedicação, de doação e dignidade

pessoal. Muito obrigada por tudo!!!

Ao professor Dr. Rilton Alves de Freitas pelo auxílio e ensinamentos sobre

bioestatística, pela amizade e principalmente pela participação na Banca de

Qualificação transmitindo sugestões as quais contribuíram muito na concretização

deste trabalho.

A professora Dra. Ednéia Casagranda Bueno pela participação na banca de

qualificação com considerações importantes na finalização deste estudo.

A professora MSc. Rosana Cé Bella Cruz pelos conhecimentos transmitidos,

ensaios realizados na parte de micologia e também pela amizade e incentivo.

A todos os professores do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas

pelos ensinamentos transmitidos nesta jornada.

A família que Deus me permitiu escolher: MEUS AMIGOS, obrigada pela

honra de tê-los em minha vida. Costumo dizer que quem tem amigos nunca anda só.

Não caberia nesse espaço, caso fosse citar um a um os nomes de todo os que me

ajudaram nesse percurso, porém não posso deixar de mencionar o nome da minha

GRANDE AMIGA: Elisa Dalmora Muller. Amiga de todas as horas, obrigada por

todas as conversas, pelo apoio, por estar presente em vários momentos da minha

vida e óbvio por todos os happy hours compartilhados. “Nenhum caminho é longo

demais, quando um amigo nos acompanha”.

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A todos os meus colegas de mestrado, em especial Gislaine, Rosana e Thaís

obrigada pelo coleguismo e pelos bons momentos compartilhados durante estes

dois anos.

A professora Dra. Jenifer Saffi e a MSc. Dinara Jaqueline Moura pelos

ensinamentos e oportunidade de estágio no Laboratório de Genotoxicidade da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

As acadêmicas Aline Debrassi e Mariana Eloise Kuhl pela amizade e pela

ajuda na realização dos ensaios laboratoriais.

A FAPESC pela bolsa e apoio financeiro para a realização da pesquisa.

Por fim, agradeço aos meus pais e irmãos pela oportunidade, por acreditarem

no meu potencial e por estarem sempre presentes nos momentos em que mais

precisei, apoiando-me seja qual fosse a decisão por mim tomada. Amo muito

vocês!!!

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“... Em paz com a vida e o que ela me traz,

na fé que me faz otimista demais,

se chorei ou se sorri,

o importante é que emoções eu vivi ...”

Roberto Carlos

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PRISCILA MARTINS

Julho/2010Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella CruzCo-orientador: Prof. Dr. Clóvis Antônio RodriguesÁrea de Concentração: Microbiologia aplicadaNúmero de Páginas: 83

A quitosana (QTS), um biopolímero derivado semi-sintético obtido pela desacetilação da quitina, vem atraindo pesquisadores devido as suas múltiplas bioatividades tais como: hemostasia, antimicrobiana, biodegradável e baixa toxicidade oral. A quitosana inibe o crescimento de uma grande variedade de bactérias e fungos mostrando largo espectro para atividade antimicrobiana. A O-carboximetilquitosana (O-CMQTS) é um derivado da quitosana solúvel em pH ácido e básico pela inserção de grupamentos carboximetil na estrutura do polímero. No presente trabalho onze compostos anfifílicos, derivados da O-CMQTS-hidrofóbicos foram testados a partir da O-CMQTS e de diferentes aldeídos (benzaldeído, p-tolualdeído, anisaldeído, salicilaldeído, 4-hidroxibenzaldeído, 3,4-dihidroxibenzaldeído, 4-clorobenzaldeído, 3-nitrobenzaldeído, 4-nitrobenzaldeído, 2-carboxibenzaldeído e p-N,N-dimetilaminobenzaldeído) através do método homogêneo a fim de detectar a atividade antimicrobiana, bem como o potencial tóxico destas substâncias. Neste sentido, a determinação da atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e fungos leveduriformes, além de cepas resistentes de Staphylococcus aureus de isolados clínicos foi avaliada através do método da diluição em ágar. Ensaios preliminares de avaliação do modo de ação sobre os micro-organismos foram realizados (permeabilidade sobre a membrana celular bacteriana e para a parede celular do fungo Neurospora crassa). Para a avaliação do potencial citotóxico empregou-se o microcrustáceo Artemia salina; enquanto que para a detecção do potencial mutagênico foi utilizado a levedura Saccharomyces cerevisiae (XV 185-14c). Dos onze compostos anfifílicos testados, três apresentaram atividade contra cepas padrão e resistentes de S. aureus entre eles o N-(2-carboxibenzil)-O-carboximetilquitosana, N-(4-hidroxibenzil)-O-carboximetilquitosana e N-(4-metoxibenzil)-O-carboximetilquitosana, e os compostos N-(4-hidroxibenzil)-O-carboximetilquitosana e N-(4-metoxibenzil)-O-carboximetilquitosana apresentaram atividade contra o fungo Candida albicans. Com relação a toxicidade nenhum dos compostos anfifílicos apresentou potencial citotóxico (Artemia salina) e genotóxico (Saccharomyces cerevisiae). Desta forma ficou evidenciado que os derivados anfifílicos testados não apresentaram potencial tóxico e mutagênico direto, sendo que os compostos N-(2-carboxibenzil)-O-carboximetilquitosana, N-(4-hidroxibenzil)-O-carboximetilquitosana e N-(4-metoxibenzil)-O-carboximetilquitosana mostraram atividade antimicrobiana podendo ser empregados na preparação de filmes auxiliares na dissolução de compostos bioativos, com efeito protetor de alimentos, bem como podendo ser empregados como bandagens em feridas, contribuindo na regeneração de tecidos e cicatrizações, lesões e queimaduras.

Palavras-chave: derivados anfifílicos. O-carboximetilquitosana. atividade antimicrobiana. toxicidade.

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EVALUATION OF ANTIMICROBIAL, MUTAGENIC ACTIVITY AND ACUTE TOXICITY OF AMPHIFILIC DERIVATIVES OF

O-carboxymethylchitosan

PRISCILA MARTINSJULY/2010

Supervisor: Alexandre Bella Cruz, Dr.Co-supervisor: Clóvis Antônio Rodrigues, Dr.Area of Concentration: MicrobiologyNumber of Pages: 83

The chitosan (Ch), a semi-synthetic derivative biopolymer obtained by deacetylation of chitin, has

attracted the attention of researchers due to its multiple bioactivities such as hemostasis, antimicrobial,

biodegradable, and low oral toxicity. Chitosan inhibits the growth of a wide variety of bacteria and fungi

showing a broad spectrum of antimicrobial activity. The O-carboxymethylchitosan (O-CMCh) is a

derivative of chitosan soluble in both acidic and basic aqueous solutions, due to carboxymethyl groups

in the polymer structure. In this work eleven amphiphilic compounds, hydrophobic derivatives were

tested from O-CMCh and different aldehydes (benzaldehyde, p-tolualdehyde, anisaldehyde,

salicylaldehyde, 4-hydroxybenzaldehyde, 3,4-dihidroxibenzaldehyde, 4-chlorobenzaldehyde, 3-

nitrobenzaldehyde, 4-nitrobenzaldehyde, 2- carboxybenzaldehyde and p-N, N-

dimethylaminobenzaldehyde) by the homogeneous method to detect antimicrobial activity, and the

potential toxicity of these substances. In this sense, the determination of antimicrobial activity against

Gram-positive and Gram-negative bacteria and yeast, and resistant strains of Staphylococcus aureus

clinical isolates were evaluated by the agar dilution method. Preliminary assays for evaluating the

mode of action on micro-organisms were performed (permeability on the bacterial cell membrane and

cell wall of the fungi Neurospora crassa). To evaluate the cytotoxic potential was employed the brine

shrimp, Artemia Salina, while for the detection of mutagenic potential was used in yeast

Saccharomyces cerevisiae (XV 185-14C). Of the eleven amphiphilic compounds tested, three showed

activity against standard and resistant strains of S. aureus among them the N-(2-carboxybenzyl)-O-

CMCh, N-(4-hydroxybenzyl)-O-CMCh and N-(4-methoxybenzyl)-O-CMCh, and the compounds N-(4-

hydroxybenzyl)-O-CMCh and N-(4-methoxybenzyl)-O-CMCh showed activity against the fungi

Candida albicans. With respect to toxicity any of amphiphilic compounds showed potential cytotoxicity

(Artemia salina) and genotoxicity (Saccharomyces cerevisiae). Thus it was shown that the amphiphilic

derivatives tested showed no potential toxic and direct mutagenic, and the compound N-(2-

carboxybenzyl)-O-CMCh, N-(4-hydroxybenzyl)-O-CMCh and N-(4-methoxybenzyl)-O-CMCh showed

antimicrobial activity could be employed in preparing films aids in the dissolution of bioactive

compounds with protective effects of foods and can be used as bandages in wounds, contributing to

the regeneration of tissue and scarring, injuries and burns.

Key words: amphiphilic derivatives. O-carboxymethylchitosan. antimicrobial activity. toxicity.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Representação esquemática do monômero da quitosana ............. 18Figura 2 Representação esquemática da O-carboximetilquitosana ............. 24Figura 3 Representação esquemática da pele: epiderme, derme e tecido

adiposo ou hipoderme..................................................................... 27Figura 4 Processo da avaliação da atividade antimicrobiana ...................... 46Figura 5 Representação do procedimento para hidratação e eclosão das

larvas de Artemia salina ................................................................. 49Figura 6 Representação da metodologia empregada para avaliação do

potencial tóxico agudo utilizando Artemia salina ............................ 49Figura 7 Representação esquemática do teste de mutagênese em

Saccharomyces cerevisiae XV 185-14c ......................................... 51Figura 8 Curva da titulação condutimétrica da O-CMQTS. Volume da

solução 60 mL, massa do sólido 50 mg, concentração do NaOH

0,1 M .............................................................................................. 53

Figura 9 Condutividade elétrica do micro-organismo E. coli tratado com os

compostos 2-COOH-BzCMQ, 4-OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ e

o antimicrobiano Polimixina – B ..................................................... 63

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Grau de substituição no grupamento NH2 dos derivados

anfifílicos, calculado a partir dos espectros de RMN H1 ................. 54Tabela 2 Atividade antimicrobiana de compostos anfifílicos frente à três

micro-organismos ........................................................................... 56Tabela 3 Atividade antibacteriana (CIM) de alguns compostos anfifílicos

contra as cepas padrão e resistentes (isolados clínicos) de

S.aureus ......................................................................................... 60Tabela 4 Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por

deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na

linhagem haplóide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae,

após o tratamento (1 h) com os compostos anfifílicos 2-COOH-

BzCMQ e 4-OH-BzCMQ em fase estacionária de

crescimento ....................................................................................

.....................

67

Tabela 5 Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por



após o tratamento (1 h) com os compostos anfifílicos 3,4-(OH)2-

BzCMQ, 4-CH3O-BzCMQ e OCMQ em fase estacionária de

crescimento .................................................................................... 68Tabela 6 Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por



após o tratamento (1 h) com os compostos anfifílicos BzCMQ, 4-

CH3-BzCMQ e 4-N,N-(CH3)2BzCMQ em fase estacionária de

crescimento ..................................................................................... 69

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LISTA DE ABREVIATURAS

ATCC: American Type Culture CollectionCIM – Concentração Inibitória MínimaCL50 – Concentração Letal de 50%CMM – Concentração Microbicida MínimaGS – Grau de SubstituiçãoGC- Grau de carboximetilaçãoNCCLS – National Committee for Clinical Laboratory StandardsNIQFAR - Núcleo de Investigações Químico-FarmacêuticasO-CMQTS – O-carboximetilquitosanaPBS – Phosphate Buffered Saline (Tampão Salina Fosfato)QTS – Quitosana RMN 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio UFC – Unidades Formadoras de ColôniasYEPD – Yeast extract peptone dextrose

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 152 OBJETIVOS.............................................................................................. 172.1 Objetivo Geral.......................................................................................... 172.2 Objetivos Específicos............................................................................. 173 REVISÃO DA LITERATURA.................................................................... 183.1 Quitosana e derivados............................................................................ 183.1.1 Mecanismos da ação antimicrobiana da quitosana e derivados........ 213.2 O-carboximetilquitosana........................................................................ 233.3 Doenças Infecciosas............................................................................... 263.4 Agentes Antimicrobianos....................................................................... 303.5 Avaliação do potencial tóxico................................................................ 333.5.1 Toxicidade sobre Artemia salina........................................................... 333.5.2 Mutagenicidade em Saccharomyces cerevisiae.............................. 344 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................... 384.1 Substâncias para análise de atividade antimicrobiana....................... 384.1.1 Síntese da O-CMQTS-hidrofóbica (Método homogêneo).................... 384.1.2 Determinação do grau de carboximetilação......................................... 414.1.3 Solubilização dos derivados anfifílicos................................................ 414.1.4 Caracterização da O-CMQTS e dos derivados anfifílicos.................... 414.2 Material Microbiológico.......................................................................... 424.3 Reagentes e meios de cultivo................................................................ 434.4 Atividade antimicrobiana e antifúngica................................................. 444.4.1 Preparo dos inóculos bacterianos......................................................... 444.4.2 Preparo dos inóculos fúngicos.............................................................. 444.4.3 Concentração inibitória mínima (CIM)................................................... 454.4.4 Concentração microbicida mínina (CMM)............................................. 454.5 Estudo preliminar de mecanismo de ação............................................ 464.5.1 Avaliação do efeito dos compostos anfifílicos sobre a

permeabilidade da membrana bacteriana............................................. 464.5.2 Avaliação do efeito dos compostos anfifílicos sobre a parede

fúngica...................................................................................................... 474.6 Avaliação da toxicidade.......................................................................... 484.6.1 Ensaio com Artemia salina..................................................................... 484.6.2 Ensaio de mutagenicidade...................................................................... 505 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ 53

13

5.1 Grau de carboximetilação....................................................................... 535.1.1 Titulação condutimétrica........................................................................ 535.2 Grau de substituição............................................................................... 545.3 Atividade Antimicrobiana....................................................................... 555.3.1 Cepas padronizadas................................................................................ 555.3.2 Cepas de isolados clínicos..................................................................... 595.4 Estudo preliminar de mecanismo de ação............................................ 615.4.1 Efeito dos compostos anfifílicos sobre a permeabilidade

da membrana bacteriana.......................................................................... 615.4.2 Efeito dos compostos anfifílicos sobre a parede fúngica................... 635.5 Toxicidade frente Artemia salina..................................................... 645.6 Ensaio de citotoxicidade e mutagenicidade em Saccharomyces

cerevisiae................................................................................................... 656 CONCLUSÕES......................................................................................... 70

REFERÊNCIAS......................................................................................... 71APÊNDICE..................................................................................................83

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1 INTRODUÇÃO

A quitosana (QTS) é um biopolímero derivado semi-sintético obtido pela

desacetilação da quitina (presente em exoesqueletos de crustáceos e artrópodes)

composto principalmente de glucosamina (2-amino-2-deoxi-D-glucopiranose) (LIU et al.,

2006), insolúvel em água, e solúvel em soluções aquosas de ácidos orgânicos (MA et al.,

2008).

Este biopolímero vem atraindo a atenção de pesquisadores devido as suas

bioatividades tais como antimicrobiana, antitumoral além de atuar na modulação do

sistema imune. A quitosana inibe o crescimento de uma grande variedade de bactérias e

fungos mostrando largo espectro para atividade antimicrobiana e baixa toxicidade em

mamíferos (KONG et al., 2008).

Além desta atividade citada, a quitosana apresenta vantagens em relação a outros

polissacarídeos por ser biodegradável, biocompatível e de baixa toxicidade (ZHU; YUAN;

LU, 2007). Essas características contribuem para a utilização da quitosana e de seus

derivados como matrizes para a imobilização e liberação de fármacos (GONÇALVES et

al., 2005).

Para caracterizar esta atividade antimicrobiana fatores na própria molécula da QTS

vêm sendo estudados, tais como: efeitos do peso molecular, grau de desacetilação,

solventes e pH. Em estudos realizados com os micro-organismos Escherichia coli e

Staphylococcus aureus verificou-se que quando há aumento no grau de substituição por

grupo amino quaternário e diminuição do peso molecular de derivados da

carboximetilquitosana, ocorre um realce na ação antimicrobiana (SUN et al., 2006).

A modificação química da QTS para a preparação de derivados de sal de amônio

quaternário, N-aril, N-piperazil e N-imidazois melhora a atividade antibacteriana da

quitosana (RABEA et al., 2009; MÁSSON et al., 2008; SABAA et al., 2010). Já

modificações com tiuréias, sulfanilamida e nitroaromáticos (EWEIS et al., 2006; ZHONG

et al., 2007; GUO et al., 2005) melhoram a atividade antifúngica e em alguns casos

melhoram a atividade inseticida, como por exemplo derivados alifáticos (RABEA et al.,

2005).

Os derivados de QTS podem apresentar diferentes funções químicas no

organismo. A O-carboximetilquitosana (O-CMQTS) é um derivado da quitosana solúvel

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em água, que contém na sua estrutura grupos COOH e NH2. O aumento das suas

aplicações é devido à característica anfótera, que confere à molécula a capacidade de ser

mais eficiente que a quitosana na perturbação da membrana celular em condições ácidas,

básicas e neutras. As forças responsáveis por esse comportamento são, em condições

neutras, ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas e, em condições ácidas ou

básicas, interações eletrostáticas. Essas propriedades fazem com que a O-CMQTS seja

amplamente estudada e empregada na liberação de genes e fármacos (ZHU et al., 2005).

Este biopolímero apresenta propriedades interessantes, tais como, solubilidade em

meio fisiológico, formação de filmes podendo ser ultilizado como matrizes para liberação

de fármacos (MARTINS et al., 2010). Vêm crescendo a atenção na preparação de filmes

de derivados da quitosana com propriedades antimicrobianas ou a utilização dos filmes

para a incorporação de substâncias com propriedades antimicrobianas a fim de melhorar

a segurança e a vida útil dos alimentos. O emprego de filmes para a liberação controlada

de substâncias antimicrobiana apresenta uma série de vantagens, entre elas a liberação

de uma quantidade adequada do antimicrobiano durante um longo período de tempo,

resultando em um prolongamento de duração da ação (IQBAL; BABAR; ASHRAF, 2002).

Os derivados hidrofóbicos da quitosana e da O-carboximetilquitosana, contendo

grupos aromáticos e alifáticos, estão sendo utilizados para solubilização de fármacos

pouco solúveis (ROSA, 2008), imobilização de enzimas (TAN et al., 2008), preparação de

comprimidos para a liberação de fármacos pouco solúveis (LARGURA, 2009; TIEN et al.,

2003), preparação de nanoparticulas para liberação de fármacos antitumorais (LIU et al.,

2007).

Uma outra vantagem recentemente avaliada foram testes preliminares de

citotoxicidade em células L929, dos derivados O-carboximetilquitosana e O-

carboximetilquitosana-N-benzil mostraram que estes polímeros não apresentaram

atividades citotóxicas (ROSA, 2008).

Diante do exposto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a atividade

antimicrobiana, citotoxicidade e mutagenicidade de derivados anfifílicos da O-

carboximetilquitosana (O-CMQTS).

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar a atividade antimicrobiana, mutagênica e a toxicidade aguda de derivados

anfifílicos da O – carboximetilquitosana.

2.2 Objetivos Específicos

• Determinar a atividade antibacteriana dos derivados anfifílicos (CIM/CBM).

• Determinar a atividade antifúngica dos derivados anfifílicos (CIM/CBM).

• Verificar modo de ação sobre a permeabilidade de membrana celular bacteriana e

parede fúngica.

• Determinar a atividade tóxica aguda dos derivados anfifílicos em Artemia salina.

• Verificar a atividade citotóxica e mutagênica dos derivados anfifílicos em

Saccharomyces cerevisiae.

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3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Quitosana e derivados

A quitosana (Figura 1) é um biopolímero derivado semi-sintético obtido de

esqueletos de crustáceos e artrópodes pela desacetilação da quitina, é composto

principalmente de glucosamina (2-amino-2-deoxi-D-glucopiranose), podendo variar sua

composição em função do grau médio de desacetilação (LIU et al., 2006). Este

biopolímero é um polissacarídeo adequado para aplicações na área de tecnologia

farmacêutica por ser natural, com baixa toxicidade oral, biocompatível, biodegradável e

possuir bioadesividade, que pode ser atribuída às interações iônicas com os componentes

de membrana das mucosas (SANTOS et al., 2003).

OCH2OH

NH2OH

O

nFigura 1: Representação esquemática do monômero da quitosana (glucosamina).

A quitosana é insolúvel em água, porém solúvel em pH ácido, formando géis (FINI;

ORIENTI, 2003). As modificações na sua solubilidade dependem da quantidade de

grupamentos amino protonados na cadeia. O aumento do número destes grupos promove

maior repulsão eletrostática entre as cadeias (SANTOS et al., 2003).

Quando a intenção é a aplicação de biopolímeros nas áreas farmacêutica e

biomédica uma das principais vantagens é a sua baixa toxicidade. A quitosana

apresentou uma baixa toxicidade (DL50 de 16 g/Kg, via oral, em estudos realizados in vivo,

utilizando camundongos). O polímero é biodegradável e apresenta atividade

anticoagulante, antifúngica, antimicrobiana, ausência de alergenicidade entre outras

(FELT; BURI; GURNY, 1998).

As características biológicas peculiares à quitosana são explicadas muitas vezes

pelo grupamento amino livre presentes nas unidades desacetiladas, que são suscetíveis a

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protonação, abrindo assim várias possibilidades de aplicação (DUREJA et al., 2001).

Entre as aplicações biológicas da QTS têm-se: auxiliar em processos de quelação

(BHATIA; RAVI, 2000) e na diminuição dos níveis plasmáticos de colesterol, pois atua

inibindo o mecanismo de transporte de lipídeos no intestino (CHIANG; YAO; CHEN,

2000). Outros estudos mostraram que a quitosana também pode atuar como inibidor de

rejeição após xenotransplante (SASHIWA et al., 2000), ativador de fatores sanguíneos

anticoagulantes (HIRANO et al., 1985), antioxidante (XIE; XU; LIU, 2001), agente

antimicrobiano (JUNG et al., 1999) e até mesmo como carreador de antimicrobianos em

sistemas de liberação (BELLA CRUZ et al., 2008).

A utilização da QTS na liberação controlada de fármacos pode proporcionar uma

atividade terapêutica otimisada através da liberação de uma quantidade adequada da

substância ativa durante um longo período de tempo, promovendo a manutenção da

concentração do fármaco no sangue. Além disso, pode-se prever e reproduzir a cinética

de liberação do fármaco (IQBAL; BABAR; ASHRAF, 2002).

El-Kamel, Ashri e Alsarra (2007) realizaram estudos in vitro de liberação do

metronidazol utilizando filmes de quitosana em utilizando solução de saliva simulada

como meio de liberação, constatando um perfil de liberação do fármaco muito

interessante, uma vez que foi liberado uma quantidade razoável do fármaco no tempo

inicial, seguido de uma liberação mais lenta, o que pode representar uma liberação mais

prolongada do fármaco.

Bella Cruz e colaboradores (2008) realizaram um estudo onde foram desenvolvidos

filmes de quitosana incorporados com tetraciclina. Neste estudo o teste de liberação do

antimicrobiano foi conduzido in vitro para determinar a difusão do antimicrobiano do filme

e sua respectiva atividade, onde foi verificado uma liberação prolongada de tetraciclina

por até 23 dias.

As modificações estruturais de biopolímeros são de grande interesse para seu uso

como matrizes para a liberação de fármacos. A grande quantidade de grupamentos

reativos, como as hidroxilas e os grupos amino, tornam a quitosana susceptível a

mudanças estruturais, principalmente em reações de N-acetilação, N-alquilação, N-

carboxilação, N-sulfonação e formação de bases de Schiff com aldeídos e cetonas

(PETER, 1995).

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Os derivados da quitosana podem apresentar diferentes funções químicas e

biológicas no organismo. O cloreto de N-trimetilquitosana foi sintetizado por Hamman,

Schultz e Kotzé (2003) e poderia ser utilizado para aumentar o transporte do fármaco

através do epitélio pela abertura das estreitas junções entre as células. Foram realizados

experimentos com diferentes graus de quaternização do polímero (12-59%), concluindo-

se que a absorção considerada ótima ocorre em um grau intermediário (48%). Esse fato

pode ser explicado pelo efeito estérico causado pelos grupos metil e pela saturação das

interações eletrostáticas entre o polímero e a membrana celular.

Le Tien e colaboradores (2003) descreveram a N-acilação da quitosana com

cloretos de ácidos graxos a fim de aumentar a hidrofobicidade no polímero e utilizá-lo

como excipiente em sistemas de liberação controlada de fármacos. A característica

hidrofóbica da quitosana que sofreu N-acilação conferiu à molécula a capacidade de

diminuir a velocidade de liberação do fármaco, otimisando as aplicações farmacêuticas

orais e subcutâneas.

Modificações hidrofóbicas em derivados de quitosana também foram estudadas por

Kim e colaboradores (2006). Foram preparadas nanopartículas hidrofóbicas de quitosana

glicol, empregadas como carregadores de paclitaxel, um fármaco utilizado contra vários

tipos de tumores. As nanopartículas apresentaram liberação prolongada do fármaco,

baixa citotoxicidade e um efeito anti-tumoral bastante semelhante a um veículo

clinicamente utilizado para a liberação do paclitaxel, com as vantagens de ser menos

tóxico e de se acumular no tecido tumoral.

Além dos sistemas de liberação controlada de fármacos, a atividade antibacteriana

e antifúngica intrínseca da quitosana tem demonstrado grande interesse. A era moderna

de pesquisa com a quitosana foi anunciada em publicações perto dos anos 90, as quais

descrevem os potenciais antimicrobianos da quitosana e de seus derivados em uma larga

escala de atividades contra micro-organismos patogênicos. De fato, um número de

aplicações comerciais da quitosana tira proveito de sua atividade antimicrobiana incluindo

entre eles, seu uso na preservação de alimento, na odontologia e na oftalmologia, assim

como na manufatura de produtos de limpeza de feridas e materiais têxteis (RAAFAT;

SAHL, 2009).

A busca por substâncias naturais que possam funcionar como preservantes vêm

crescendo na indústria alimentícia. Em comparação a outros materiais com propriedades

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biológicas, a quitosana têm a vantagem de poder incorporar substâncias funcionais como

os minerais e vitaminas, além de possuir atividade antimicrobiana podendo por exemplo

ser usada conjuntamente com preservativos clássicos para fornecer a estabilidade ao

alimento (DUTTA et al., 2009; RAAFAT; SAHL, 2009).

A quitosana inibe o crescimento de uma ampla variedade de bactérias e fungos.

Diversos estudos têm demonstrado o efeito do peso molecular e da concentração da

quitosana na atividade antibacteriana. Por outro lado, foi demonstrado a atividade

antifúngica e sua habilidade para estender a vida de armazenagem de frutas, bem como

que a quitosana, dependendo do tipo e concentração, provocou inibição do crescimento

micelial em Penicillium digitatum e Penicillium italicum, de 25 e 90,5% respectivamente

(LIU et al., 2006).

Kong e colaboradores (2008) realizaram estudo avaliando a atividade

antimicrobiana de microesferas de quitosana contra bactérias Gram-negativas, onde

pôde-se verificar a interação hidrofóbica entre as microesferas e os fosfolipídios da

membrana citoplasmática dos micro-organismos em estudo, causando a sua morte

celular.

3.1.1 Mecanismos da ação antimicrobiana da quitosana e derivados

Devido a protonação do nitrogênio ligado ao C-2 do monômero de glucosamina em

pH abaixo de 6,0 (NH3+), a quitosana torna-se solúvel e tem uma melhor atividade

antimicrobiana que a quitina. O exato mecanismo da ação antimicrobiana da quitosana e

seus derivados ainda é desconhecido, contudo diversos mecanismos que contribuem

para esta ação vem sendo sugeridos. Uma das razões para o caráter antimicrobiano da

quitosana é a carga positiva no grupamento amino, o qual interage eletrostaticamente

com a superfície celular do micro-organismo, alterando a permeabilidade da célula e

provocando a liberação de componentes intracelulares causando a morte da célula. A

quitosana atua principalmente na superfície exterior das bactérias (SEO; MITSUHASHI;

TANIBE, 1992; JUNG et al., 1999). Em baixas concentrações a quitosana policatiônica

liga-se provavelmente a superfície bacteriana carregada negativamente provocando

aglutinação (MASSÓN et al., 2008; DUTTA et al., 2009).

22

A atividade antimicrobiana da quitosana é diretamente proporcional ao seu grau de

desacetilação, o qual está relacionado por sua vez ao número de grupamentos amino

protonados (RAAFAT; SAHL, 2009).

A mudança na permeabilidade da membrana citoplasmática também ressalta um

mecanismo para a atividade antimicrobiana. Kong e colaboradores (2008) realizaram um

estudo para verificar o mecanismo antibacteriano de compostos a base de quitosana

contra Escherichia coli em estado de dispersão sólida, através do método de

condutividade elétrica. Microesferas de quitosana (MC) foram preparados por

emulsificação formando ligação cruzada, e oleoil-CMS (OCMS) foram obtidos pela

introdução de grupos oleoil a quitosana. As microesferas de quitosana mudaram a

permeabilidade da membrana celular causando fuga do conteúdo celular, o que pode

estar correlacionado com a interação hidrofóbica entre as microesferas e os fosfolípidos

da membrana citoplasmática da bactéria Gram-negativa.

Como justificativa as bactérias Gram-negativas são mais complexas que as Gram-

positivas, sua parede celular é composta por uma ou poucas camadas de peptideoglicano

e outros três componentes que a envolvem, lipoproteína, membrana externa e

lipopolissacarideo (BLACK, 2002; TRABULSI et al., 2005). Entre os fatores diferenciais

das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, pode-se ressaltar que as bactérias

Gram-negativas não possuem o ácido teicóico, além de possuir menor concentração de

peptideoglicano, sendo que estas características as tornam mais suscetíveis à

permeabilidade da membrana, quando comparadas às bactérias Gram-positivas

(RUSSELL; CHOPRA, 1990; RANG et al., 2003).

A quitosana também pode atuar como um agente quelante de metais inibindo

desse modo a produção de toxinas e o crescimento microbiano, assim como ao penetrar

no núcleo dos micro-organismos a quitosana pode ligar-se ao DNA interferindo na síntese

do mRNA e das proteínas. Este último mecanismo foi proposto para a atividade

antifúngica da quitosana (MASSÓN et al., 2008; DUTTA et al., 2009; RAAFAT;

SAHL, 2009).Alguns estudos demonstram que ajustando o peso molecular ou o grau de

desacetilação, a concentração de quitosana, ou até mesmo o pH, interferi-rá diretamente

na atividade antimicrobiana da quitosana. Outros estudos expõem a modificação da

quitosana a fim de se obter derivados com atividade mais elevada tais como a

23

carboximetilquitosana, sais de amônio quaternário de quitosana, onde o aumento do grau

de quaternização e diminuição do peso molecular dos derivados da carboximetilquitosana

realçavam sua atividade antimicrobiana contra os micro-organismos Escherichia coli e

Staphylococcus aureus (SUN et al., 2006). Acredita-se que reações de N-alquilação ou

arilação da quitosana com aldeídos alifáticos e aromáticos efetivamente realcem as

atividades biológicas da quitosana (RABEA et al, 2009).

3.2 O-carboximetilquitosana

Vários estudos vem sendo realizados para síntese de derivados de quitosana

solúveis em água através de técnicas de alterações químicas diversas (CHEN; PARK,

2003). Entre os derivados de quitosana solúveis em água, a O-carboximetilquitosana (O-

CMQS) é um derivado de éter anfótero, que contém grupos de COOH e grupos de NH2 na

molécula. A O-carboximetilquitosana (O-CMQTS), apresentada na Figura 2, é um

derivado biocompatível da quitosana no qual o grupamento O-hidroxila é substituído por

um grupamento carboximetil em cada monômero, através da formação de uma ligação

éter. Essas modificações estruturais conferem novas propriedades químicas e físicas para

o polímero, tais como, estabilidade à hidrólise, viscosidade elevada (em alta temperatura

e presença de sais) e capacidade de reduzir a tensão superficial, comportando-se como

um tensoativo tornando-o foco de pesquisas na atualidade (ZHU et al., 2005).

Os primeiros trabalhos realizados com a O-carboximetilquitosana mostravam a

potencialidade destes derivados em atividades biológicas. Em 2001, Tokura e Tamura já

relataram com sucesso, o emprego deste polímero na restauração e na regeneração de

tecidos ósseos.

Devido as suas características químicas, físicas e biológicas e sua

biocompatibilidade e habilidade de formar filme, fibras e geis, a O-carboximetilquitosana

tem sido usada extensivamente na biomedicina como um agente de retenção de umidade,

bactericida em limpezas de feridas, como substituto ósseo e pele artificial, em

anticoagulantes do sangue, e como um elemento no sistema de liberação de fármacos

(CHEN et al., 2004).

24

OO

NH2

O

OH

CH2COOH

nFigura 2: Representação esquemática do monômero da O-carboximetilquitosana

Em aplicações biomédicas a O-CMQTS vem sendo utilizada na complexação de

DNA e liberação de genes, pela presença tanto de grupamentos com características

ácidas quanto básicas. Em comparação com a quitosana, a O-CMQTS provou ser mais

eficiente na perturbação de membrana em condições neutras, ácidas e básicas. As forças

responsáveis por esse comportamento são, em condições neutras, ligações de hidrogênio

e interações hidrofóbicas e, em condições ácidas ou básicas, interações eletrostáticas. A

forte interação da O-CMQTS com o maior constituinte de membrana celular aumenta

potencialmente a sua efetividade na liberação de genes e fármacos (ZHU et al., 2005).

Derivados da quitosana também têm sido preparados com o objetivo de aplicação

como antimicrobiano. Três classes de bases de Schiff preparadas pela reação entre a

carboximetilquitosana e aldeídos aromáticos melhoraram a atividade fungicida contra os

fungos Valsa mali, Alternaria solani e Fusarium oxysporium f. sp. vasinfectum (GUO et al.,

2006). Derivados N-alquil e N-benzilquitosana apresentaram atividade inseticida (contra

larvas de Spodoptera littoralis) e antifúngica (Botrystis cinérea e Pyricularia grisea) sendo

que os derivados contendo grupos nitros foram os mais ativos (RABEA et al., 2005).

Em outro estudo, a atividade antifúngica da quitosana e de derivados

carboximetilados foram comparados. O cloridrato de quitosana de baixo e de alto peso

molecular solúvel em água, a carboximetilquitosana, o oligossacarídeo de quitosana e a

N-acetil-D-glicosamina foram testados contra C. albicans, C. krusei e C. glabrata. As

espécies C. albicans e C. krusei foram as mais sensíveis, enquanto a C. Glabrata também

foi inibida, mas em menor intensidade. Porém, apenas os cloridratos de quitosana

mostraram um efeito antifúngico dose dependentes. A carboximetilquitosana,

oligossacarídeo da quitosana e a N-acetil-D-glucosamina apresentaram atividade fraca ou

nenhuma atividade antifúngica (SEYFARTH et al., 2008)

A aplicação da O-CMQS como matriz para a liberação de fármacos foi relatada por

Zhu, Liu e Ye (2006). No estudo foi relatada a incorporação do fármaco antitumoral

25

camptotecina, que é pouco solúvel em água, sendo observado que a característica

hidrofóbica do polímero melhora a eficiência na incorporação do fármaco.

Filmes de O-CMQS incorporados com tetraciclina foram preparados por Martins e

colaboradores (2010) onde a atividade antimicrobiana da tetraciclina manteve-se

preservada, tornando estes filmes matrizes para liberação do fármaco podendo ser

empregados em doenças infecciosas que exigem uma liberação local do agente

antimicrobiano, tais como a periodontite.

Em outro estudo Zhu e colaboradores (2006) prepararam um sistema de liberação

da gatifloxacina com O-CMQTS. A gatifloxacina, uma fluorquinolona de quarta geração,

possui ação principalmente contra cocos Gram-positivos. O sistema preparado com O-

CMQTS reduziu em quatro vezes a concentração inibitória mínima contra bactérias Gram-

negativas, porém não foi significante para bactérias Gram-positivas. Desse modo, o

sistema de liberação preparado pode ser útil para ampliar as aplicações do antimicrobiano

contra as bactérias Gram-negativas.

Liu e colaboradores (2007) sintetizaram novos derivados hidrofóbicos pela ligação

dos grupamentos amino da O-CMQTS com ácido linoléico, investigando o potencial das

nanopartículas formadas na liberação do agente antitumoral adriamicina. As partículas se

mostraram estáveis e proporcionaram ao fármaco uma liberação lenta, que pode ser

controlada pela alteração do pH do meio.

A síntese de derivados da quitosana com características anfifílicas possibilita o

aumento da solubilidade em água de fármacos pouco solúveis, além de reduzir a

toxicidade do sistema de liberação. Essas propriedades foram consideradas na

preparação de um sistema de liberação para a camptotecina utilizando a O-CMQTS. A

camptotecina é um fármaco antitumoral muito efetivo no tratamento de tumores gástricos,

retais e de bexiga, porém apresenta baixa solubilidade em água e um grande número de

efeitos tóxicos, como neutropenia, trombocitopenia, anemia, alopecia, náuseas, vômitos,

diarréia, fadiga e rash cutâneo. Para reduzir tais efeitos adversos, é importante que sejam

desenvolvidos novos sistemas de liberação para sua efetiva administração. Os resultados

mostraram que o sistema de liberação desenvolvido com a O-CMQTS melhorou a

solubilidade do fármaco, além de garantir uma liberação sustentada do mesmo (ZHU; LIU,

YE, 2006).

26

3.3 Doenças Infecciosas

As doenças infeciosas são uma das principais causas de morte em todo o mundo e

envolvem um problema complexo de saúde pública. A partir da segunda metade do

século XX observou-se no mundo um novo quadro epidemiológico com o surgimento das

doenças infecciosas emergentes, definidas como aquelas cuja incidência aumentou nos

últimos vinte anos ou ameaça aumentar em um futuro próximo. Entre algumas destas

doenças incluem-se AIDS, hantavirose pulmonar, doença de Lyme, colite hemorrágica

Ebola, entre outras (CAMPELO; GONCALVES; DONADI, 2005; SCHAECHTER et al.,

2002).

Denomina-se infecção a multiplicação de um agente no organismo de um

hospedeiro, no entanto a doença em si só ocorre a partir do momento em que o micro-

organismo expressa seus efeitos patogênicos e provoca manifestações clínicas. A

infecção pode ser causada de forma endógena ou exógena. As infecções cujo agente

atinge o hospedeiro através de um reservatório ou fonte externa é considerada exógena,

e quando causadas por agentes da microbiota normal do próprio hospedeiro são

classificadas como endógenas (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005).

A pele é o órgão mais acessível do corpo, um dos mais facilmente traumatizável e

sujeito à infecção, sendo composta de duas camadas. Uma superficial denominada

epiderme e a outra mais profunda denominada derme. Os folículos pilosos, as glândulas

sebáceas e as glândulas sudoríparas abrem - se para a superfície cutânea. Abaixo da

derme está a camada subcutânea adiposa, sob a qual localiza-se a fina membrana fascial

que recobre os músculos, ligamentos e outros tecidos conjuntivos. O plano fascial cria

espaço em várias partes do corpo, incluindo a cabeça, o pescoço, dedos, mãos e pés. A

fascia é uma barreira que determina a extensão por onde a infecção pode se disseminar,

mas pode também criar desafios terapêuticos devido à sua impermeabilidade, tendo de

ser tratada cirurgicamente (SEAL; HAY; MIDDLETON, 2000).

Além de ser uma barreira estrutural, a pele é colonizada por uma gama de

organismos que formam sua flora normal. As áreas relativamente áridas do antebraço e

do dorso são colonizadas por um número menor de organismos, predominantemente

bactérias Gram-positivas e leveduras. Nas áreas mais úmidas, como a virília e as axilas,

os organismos são mais numerosos e incluem as bactérias Gram-negativas. A flora

27

normal da pele desempenha um papel importante, assim como a flora normal em outros

locais do corpo, na defesa da superfície de “invasores estranhos”. A infecção da pele e

dos tecidos moles pode estar relacionada com a anatomia da pele (Figura 3). Os

patógenos em geral penetram nas camadas inferiores da epiderme e da derme somente

depois que a superfície da pele foi danificada (MIMS et al., 2005).

Figura 3: Representação esquemática da pele: epiderme, derme e tecido adiposo ou hipoderme.

Fonte: Adaptado de MIMS et al., 2005

A doença microbiana da pele pode resultar de qualquer uma das três linhas de

ataque: rupturas da pele íntegra, permitindo a entrada de organismos infecciosos;

manifestações cutâneas de infecções sistêmicas, que podem surgir como conseqüência

da disseminação hematogênica desde o foco infectado até a pele ou por extensão direta

(p. ex., sinusóides drenantes das lesões actinomicóticas ou infecção anaeróbia

necrotizante por sepse intra – abdominal); lesão da pele mediada por toxinas microbianas

em outro sítio do corpo (p. ex., febre escarlate, síndrome do choque tóxico) (TAN; GOH,

2001).

As lesões na pele variam desde aberturas microscópicas até os grandes

traumatismos, que podem ser acidentais (p. ex., lacerações ou queimaduras) ou

intencionais (p. ex., cirurgia). As feridas por queimaduras ficam estéreis imediatamente

após o acidente, mas tornam-se precocemente colonizadas dentro de horas, com uma

flora bacteriana mista, estes ferimentos causam danos diretos às barreiras mecânicas

corporais e anormalidades na função dos neutrófilos e nas respostas imunes.

Adicionalmente verifica-se um importante desequilíbrio fisiológico com perda de fluidos e

28

eletrólitos. A queimadura proporciona aos organismos colonizadores uma superfície

extremamente nutritiva, e a incidência de uma infecção séria varia não apenas com o

tamanho e a profundidade da lesão, mais também com a idade do paciente. A terapia

antimicrobiana tópica moderna deveria prevenir a infecção de queimaduras que atingem

menos de 30% da área corporal, porém queimaduras maiores são sempre colonizadas. O

Staphylococcus aureus é o primeiro dos patógenos nestas feridas, o fator predisponente

mais importante para a infecção por este micro-organismo de pacientes queimados

parece ser uma anormalidade da função antibacteriana dos neutrófilos. O micro-

organismo é capaz de destruir o tecido granuloso, invadindo e causando septicemia. O

Staphylococcus aureus causa pequenas infecções cutâneas, como furúnculos ou

abcessos, podendo também causar sérias doenças cutâneas pela produção de toxinas

(síndrome da pele escaldada e síndrome do choque tóxico) bem como sérias infecções

em feridas pós – operatórias (MIMS et al., 2005).

Outra forma comum de infecção refere-se a reunião de um grande número de

pessoas doentes sob um mesmo teto, o que traz muitas vantagens, mas algumas

desvantagens, particularmente a facilitação da transmissão de infecção de uma pessoa

para outra. Uma das maiores preocupações na área de saúde é a alta incidência de

infecção hospitalar ou nosocomial, isto é, infecção adquirida em ambientes hospitalares

durante a internação ou após a alta do paciente, quando este esteve hospitalizado ou

passou por procedimentos médicos. A infecção hospitalar atinge o mundo todo e

representa uma das causas de morte em pacientes hospitalizados. No Brasil, segundo o

Ministério da Saúde, a taxa média de infecção hospitalar é de cerca 15%, ao passo que

nos EUA e na Europa é de 10%. Cabe lembrar, no entanto, que o índice de infecção

hospitalar varia significativamente, pois está diretamente relacionada com o nível de

atendimento e complexidade de cada hospital (BENNETT; BRACHMAN, 1998).

As infecções mais frequentementes adquiridas no hospital são: infecções das

feridas operatórias; infecções do trato respiratório e urinário (ITUs), e bacteremias.

Diferentes micro-organismos como bactérias, fungos, e vírus causam infecções

hospitalares. No entanto, o grupo de patógenos que se destaca é o das bactérias que

constituem a flora humana e que normalmente não trazem risco a indivíduos saudáveis

devido sua baixa virulência, mas que podem causar infecção em indivíduos com estado

clínico comprometido – denominadas assim de bactérias oportunistas. O segundo grupo

29

de importância médica nas infecções hospitalares são os fungos, sendo a Candida

albicans e o Aspergillus os patógenos mais freqüentes. Os fungos são responsáveis por

aproximadamente 8% das infecções hospitalares (BENNETT; BRACHMAN, 1998).

Os traumatismos acidentais ou intencionais, destroem a integridade da superfície

corporal e deixam-na predisposta à infecção. Traumatismo acidental pode resultar na

introdução profunda de micro-organismos na ferida, as espécies envolvidas dependerão

da natureza da ferida. O Staphylococcus aureus é a causa mais importante de infecção

das feridas cirúrgicas, esta infecção pode ser adquirida durante a cirurgia ou no pós –

operatório e pode ter origem no próprio paciente, em outro paciente ou ainda dos

membros da equipe. A ferida cirúrgica é mais vulnerável que o tecido normal; pode ter seu

suprimento sanguíneo prejudicado e pode abrigar corpos estranhos tais como linha de

sutura. Estudos clássicos de feridas infectadas mostraram que menos estafilococos são

necessários para dar início a uma infecção em torno de uma sutura do que em pele

normal sadia. Infecções em feridas podem ser severas, e os organismos podem invadir a

corrente sanguínea com possível disseminação de outros locais como válvulas cardíacas,

causando endocardite em ossos, osteomielite e piorando portanto, ainda mais o paciente

comprometido (MIMS et al., 2005).

Os cateteres intravenosos e os utilizados nas diálises peritoneais rompem a

integridade das barreiras cutâneas e permitem aos organismos da flora cutânea do

paciente ou aos das mãos de seus cuidadores acessar facilmente locais mais profundos.

Os estafilococos são os patógenos mais comuns de tais infecções, mas corineformes,

bastonetes Gram-negativos e Candida sp. são também implicados. Uma das formas para

prevenir estas infecções por cateteres seria cobrir o sítio de inserção com curativo para

prevenir contato desnecessário com o ambiente (MIMS et al., 2005).

Burkatovskaya e colaboradores (2006), em estudos realizados com ratos em

feridas contaminadas com Staphylococcus aureus constataram que bandagens a base de

acetato de quitosana foram mais eficazes que as bandagens a base de alginato e de

sulfadiazina de prata pois, mataram a bactéria na ferida antes que a invasão sistêmica

pudesse ocorrer.

Além das infecções cutâneas, outras infecções merecem destaque entre elas a

doença periodontal, a qual engloba um grupo de doenças inflamatórias de origem

infecciosa, incluindo gengivite e periodontite, que afetam os tecidos de sustentação do

30

dente. A doença periodontal é a maior responsável pela perda de dentes em seres

humanos, devido a sua natureza crônica e indolor, desenvolvendo-se de forma gradativa

e assintomática. Somente nos últimos estágios, com bolsas periodontais profundas e

mobilidade dental ela é percebida (TAVARES et al., 2007).

Nas últimas décadas uma grande variedade de agentes antimicrobianos de uso

local ou sistêmico têm surgido com a finalidade de auxiliar no tratamento da doença

periodontal, agindo como adjuvantes do tratamento convencional (TAVARES et al., 2007).

Porém, o insucesso com o uso de antimicrobianos sistêmicos é uma presença constante

em diversos estudos, e esta relacionado, em geral, com a seleção do antimicrobiano

inadequado, dosagens e duração insuficientes do tratamento, uso de medicamentos com

ação antagônica, a constante presença de cepas resistentes, a falta de adesão do

paciente ao tratamento, os fatores locais desfavoráveis da doença periodontal dificultam a

ação do agente antimicrobiano assim como fatores relacionados à resposta do hospedeiro

(PINTO et al., 2003). Desta forma, os agentes antimicrobianos de liberação local ocupam

lugar de destaque na terapia periodontal, uma vez que os mesmos são aplicados

diretamente no interior da bolsa periodontal com a finalidade de alcançar as bactérias

remanescentes (MEIRA et al., 2007).

Os filmes matriciais para liberação de antimicrobianos surgiram com o objetivo de

oferecer uma dosagem apropriada de liberação de fármacos dentro da bolsa periodontal,

porque a estrutura anatômica da bolsa permite uma inserção relativamente fácil do

sistema de liberação. Além disso, o uso de polímeros biodegradáveis pode aumentar a

adesão do paciente, porque o filme inserido não precisa ser removido (PERUGINI et al.,

2002).

3.4 Agentes Antimicrobianos

Os agentes antimicrobianos não erradicam uma infecção, mas produzem uma

redução do número de micro-organismos viáveis, ao inibir sua proliferação ou causar sua

morte celular (ZACCHINO et al., 2003).

A descoberta da penicilina, o primeiro antibiótico de atividade clínica, por Alexander

Fleming em 1928, deu início a era da antibióticoterapia. O resultado final desse progresso

31

científico refletiu-se na mudança da expectativa de vida frente à várias doenças

infecciosas, antes de difícil tratamento e de alta mortalidade (SCHAECHTER et al., 2002).

O tratamento de doenças infecciosas constitui-se ainda hoje num dos campos de

maior impacto dos avanços da tecnologia e de obtenção das soluções para os problemas

da área médica. Novos medicamentos contra micro-organismos foram descobertos e

continuam a ser procurados visando maior potência antimicrobiana, menor toxicidade,

melhor comportamento farmacocinético e ação decisiva contra agentes infecciosos

resistentes a drogas anteriormente ativas (TAVARES, 1996).

Esses medicamentos atuam pela interferência no crescimento dos micro-

organismos ou morte celular. A droga antimicrobiana ideal mata o micro-organismo nocivo

sem prejudicar o hospedeiro sendo este o princípio da toxicidade seletiva. As drogas

utilizadas na quimioterapia das doenças infecciosas são classificadas em dois grupos. As

drogas que são sintetizadas por procedimentos químicos em laboratórios, denominadas

drogas sintéticas, e as drogas produzidas por bactérias e fungos, denominadas

antibióticos (TORTORA; FUNCKE; CASE, 2000).

Reações inibitórias similares entre colônias em meio sólido são comumente

observadas em microbiologia e o mecanismo de inibição é conhecido como antibiose. A

partir desta palavra surgiu o termo antibiótico, uma substância produzida por micro-

organismo que, em pequenas quantidades, inibe o crescimento de outro micro-organismo

(TORTORA; FUNCKE; CASE, 2000).

O agente antimicrobiano ideal deve exibir toxicidade seletiva, a qual pode ser uma

função de um receptor específico necessário para a ligação do fármaco, ou pode

depender da inibição de eventos bioquímicos essencias para o micro-organismo, mas não

para o hospedeiro. Isto deve ocorrer, com maior probabilidade, nos organismos

procariotos do que nos eucariotos, em função do maior grau de diferença com as células

hospedeira (MIMS et al., 2005). Sabe-se que muitos antifúngicos são nefro e

hepatotóxicos o que pode ser muitas vezes mais grave que a própria patologia causada

pelo agente microbiano. Algumas substâncias químicas com propriedades

antimicrobianas são altamente tóxicas, a ponto de serem utilizadas apenas topicamente.

Para uso interno, a droga antimicrobiana deve possuir toxicidade seletiva, por isso deve

ser determinada a relação entre a toxicidade para o micro-organismo e para o organismo

hospedeiro (índice terapêutico) (SCHAECHTER et al., 2002).

32

Os agentes antimicrobianos são também classificados como sendo específicos e

inespecíficos. Os específicos atuam principalmente sobre o micro-organismo invasor sem

afetar significativamente o hospedeiro. Os antimicrobianos inespecíficos, ou seja,

compostos capazes in vitro de matar ou inibir o crescimento de qualquer micro-organismo,

não são considerados quimioterápicos e sim desinfetantes, anti-sépticos, germicidas,

biocidas, esterilizantes, sanitizantes, com uso exclusivamente tópico (DE SOUZA et al.,

2003).

Os micro-organismos geralmente adquirem resistências aos antimicrobianos por

mutações genéticas, mas muitas vezes pode não ser a mutação o fator responsável pela

resistência. Os mecanismos de resistências clinicamente relevantes, incluem a síntese de

enzimas que inativam a droga, prevenção do acesso ao sítio alvo (inibição da absorção

ou aumento da excreção) ou modificação do sítio alvo (BLACK, 1996; SCHAECHTER et

al., 2002).

Devido ao fato das células bacterianas e fúngicas diferirem, o modo de ação

também é particular para cada micro-organismo. Os agentes bacterianos podem ser

classificados seguindo diversos critérios, tais como estrutura química, mecanismo de ação

e espectro de atividade entre outros (LOPES, 2005). Segundo Brooks e Morsea (2000),

os antimicrobianos podem ser classificados em quatro categorias, de acordo com o sítio

alvo: inibidores da síntese da parede celular; inibidores da função da membrana;

inibidores da síntese de proteínas; inibidores da síntese de ácidos nucléicos e como

antimetabólitos.

Durante as últimas décadas, o uso desenfreado de agentes antimicrobianos tem

contribuído para a resistência de micro-organismos a estes agentes. Associado a esse

uso irracional e ao desenvolvimento da resistência, houve um aumento dramático de

infecções, principalmente fúngicas, como resultado das imunodeficiências associadas à

AIDS, quimioterapia anticancerígena, transplantes, idosos e neonatos (ZACCHINO et al.,

2003).

Atualmente, o surgimento de micro-organismos resistentes vem crescendo e a

perspectiva para o uso de drogas antimicrobianas no futuro é ainda incerta. Contudo,

algumas ações podem ser adotadas para reduzir este problema, como controle do uso

indiscriminado de antimicrobianos, desenvolvimento de pesquisa para melhor entender os

33

mecanismos genéticos de resistência, além da continuidade dos estudos de

desenvolvimento de novas drogas sintéticas ou naturais (NASCIMENTO et al., 2000).

3.5 Avaliação do potencial tóxico

Apenas a triagem farmacológica não é suficiente para justificar a continuação dos

estudos farmacológicos. São necessários testes toxicológicos in vitro, mesmo em estágios

iniciais do desenvolvimento de novos fármacos, para garantir a segurança toxicológica

das substâncias em avaliação (BELLA CRUZ et al., 2009). A avaliação da toxicidade

compreende uma série de dados que podem ser obtidos por meio de micro-organismos,

células animais e vegetais (métodos in vitro) e utilizando animais de laboratório, ou até

mesmo em seres humanos, visando classificar toxicologicamente uma substância química

(CAVALCANTE et al., 2000; SOUZA et al., 2003; MIGUEL; BOSCO, 2005). Nesse

contexto, os ensaios de citotoxicidade utilizando modelos celulares, bem como ensaios de

genotoxicidade devem ser elaborados como critérios de seleção de possíveis candidatos

a estudos farmacológicos futuros in vivo (BELLA CRUZ et al., 2009)

Dentre as metodologias empregadas para realizar a avaliação do potencial tóxico ,

no presente trabalho foram abordados a toxicidade aguda frente a Artemia salina, bem

como a mutagenicidade e citotoxicidade avaliadas utilizando a levedura Saccharomyces

cerevisiae (XV 185-14c)

3.5.1 Toxicidade sobre Artemia salina

A avaliação de toxicidade geral é considerada fundamental como ensaio preliminar

no estudo de substâncias com propriedades biológicas. Deste modo, utilizou-se

organismos simples para o monitoramento da resposta tóxica, existindo apenas um

parâmetro envolvido: morte ou vida (CAVALCANTE et al., 2000; LHULLIER; HORTA;

FALKENBERG, 2006). Neste sentido, pode-se empregar larvas do microcrustáceo

Artemia salina como um indicador de toxicidade.

Há uma crescente necessidade para o desenvolvimento de bioensaios gerais, os

quais possam detectar um amplo espectro de atividades farmacólogicas em compostos

naturais e sintéticos que sejam rápidos, fáceis e de baixo custo. O ensaio de A. salina

34

preenche todos esses requisitos (MEYER et al., 1982). Além disso, outras características

tornam este organismo uma espécie apropriada para o seu uso na toxicologia, entre elas

a larga distribuição geográfica, cultura e manutenção relativamente simples em

laboratório, resistência a manipulação, ciclo de vida curto e grande produção da prole

(NUNES et al., 2006).

Cavalcante e seus colaboradores (2000), relataram que em 1956 surgiu a primeira

publicação de um trabalho utilizando a Artemia salina, deste então, diversos trabalhos

buscam correlacionar a toxicidade sobre Artemia salina com atividades biológicas, como

antifúngica, antimicrobiana, parasiticida entre outras (SOLIS et al., 1993; ZANI et al.,

1995; PELKA et al., 2000; CHAN-BACAB et al., 2003; EL-SAYED ALI 2009; LI et al.,

2009). Além disso, também há relatos na literatura (SIQUEIRA et al., 1998) sobre o uso

sistemático deste bioensaio na avaliação prévia de substâncias com possível atividade

antitumoral.

3.5.2 Mutagenicidade em Saccharomyces cerevisiae

Os testes de genotoxicidade detectam efeitos adversos de agentes físicos e

químicos no material genético de células (DNA ou cromossomos) e a subsequênte

expressão de tais mudanças. Os mais utilizados são aqueles que detectam mutações em

células germinativas ou somáticas, por exemplo mutação gênica, associada a alterações

na seqüência de nucleotídeos do DNA, ou ao nível cromossômico, como aberrações e

micronúcleos. As células respondem ao seu DNA lesado utilizando diferentes estratégias

de ação, tais como morte por citotoxicidade ou apoptose, modulação da expressão gênica

controlando o ciclo celular, e reparação do material genético por via livre ou sujeita a erro,

sendo a segunda responsável pela fixação das mutações. A mutagenicidade é, portanto,

a mudança, dano gênico, inibição ou dano do mecanismo de reparo ao DNA resultando

em uma célula alterada. Normalmente é a combinação destes fatores que compõem a

resposta a danos genéticos (SILVA; ERDTMANN; HENRIQUES, 2003; OGA; CAMARGO;

BATISTUZZO, 2008).

Diversos ensaios para identificação de agentes mutagênicos e/ou genotóxicos vêm

sendo desenvolvidos, sendo que um dos organismos utilizados nestes ensaios é a

levedura S. cerevisiae. A levedura S. cerevisiae é um organismo eucarioto amplamente

35

estudado e notavelmente semelhante às células de mamíferos no que referem-se às

macromoléculas, organelas e proteínas com homologia a proteínas humanas, tornando-a

uma ferramenta importante nas pesquisas sobre mutagênese, reparo do DNA e

mecanismos que respondem ao estresse oxidativo (COSTA; FERREIRA, 2001;

GASPARRI, 2005; MOURA, 2006).

As leveduras podem crescer tanto em condições anaeróbias quanto aeróbias. A S.

cerevisiae pertence ao grupo das leveduras anaeróbias facultativas. Isto significa que ela

fermenta hexoses, como a glicose e a frutose, independente da concentração de oxigênio

(COSTA; FERREIRA, 2001; MOURA, 2006). A glicose é a principal fonte de carbono da

S. cerevisiae, uma preferência que é mediada por um complexo processo de repressão e

ativação de genes e de proteínas, usualmente conhecida como repressão da glicose ou

repressão catabólica. Quando a concentração de glicose cai para menos de 0,2% no

meio, há a desrepressão das enzimas que participam da biossíntese na mitocôndria e de

outros genes necessários para o crescimento aeróbico (DE WINDE et al., 1997;

GANCEDO, 1998; GASPARRI, 2005; MOURA, 2006). Este crescimento apresenta fases

distintas do ponto de vista metabólico e cinético. Após um breve período de adaptação em

meio rico (YEPD – 2% glicose), chamado de fase lag, as células iniciam uma divisão

celular a cada hora e meia (fase exponencial), com energia proveniente da fermentação

da glicose. Ao diminuir a disponibilidade de glicose no meio, ocorre a desrepressão

catabólica (transição diáuxica), na qual há uma parada transiente na divisão celular,

enquanto as células são preparadas para o metabolismo respiratório. Após, ela reassume

a divisão celular em um ritmo mais lento (uma divisão a cada três ou quatro horas),

utilizando o etanol como fonte de carbono produzido durante a fermentação (fase pós-

diáuxica). Quando todas as fontes de carbono forem exauridas, as células entram na fase

estacionária na qual podem sobreviver por muito tempo na ausência de nutrientes

(PRINGLE; HARTWELL, 1982; FUGE; WERNER, 1997; GASPARRI, 2005; MOURA,

2006).

Os ensaios com leveduras têm sido de grande utilidade na determinação de

agentes mutagênicos ambientais ou farmacológicos, servindo para complementar os

ensaios de mutagenicidade realizados em bactérias (HENRIQUES et al., 1987; POLI et

al., 1999; TERZIYSKA et al., 2000; GASPARRI, 2005). Estes ensaios são rápidos,

sensíveis, econômicos e reprodutíveis, apresentando resultados confiáveis na

36

identificação biológica. Além disto, a levedura possui um sistema endógeno de ativação

metabólica constituído por um complexo enzimático (citocromo P-450) e detoxificação,

sem a necessidade da adição de um sistema exógeno, sendo desta forma, uma vantagem

sobre os ensaios bacterianos (PAULA-RAMOS et al., 1991; MORENO et al., 1991; POLI

et al., 1999; BURKE; DAWSON; STEARNS, 2000; BEZERRA et al., 2008; MEDINA, et al.,

2008). Com relação aos estudos de mutagenicidade e genotoxicidade anteriormente

realizados os resultados obtidos mostraram correlação de, aproximadamente, 80% com

aqueles observados em humanos (HENRIQUES et al., 2001).

Os experimentos de mutagenicidade mais comumente utilizados são os de

mutações reversas. Estes se baseiam na restauração ou compensação de um defeito

gênico responsável por um requerimento nutricional (ZIMMERMANN, 1975; GASPARRI,

2005). A restauração se deve a uma reversão exata do defeito original, enquanto que a

compensação pode ser devido a uma mutação secundária dentro do gene (mutação

supressora interna) ou por uma mutação externa, como no caso dos alelos sem sentido

(nonsense – mutação que resulta na alteração de um códon que determina um

aminoácido para um códon de terminação da síntese protéica) (HAWTHORNE;

LEOPOLD, 1974; ATKIN et al., 1993; GASPARRI, 2005). A reversão de auxotrofia para

prototrofia pode ser causada por uma substituição, inserção ou deleção de pares de

bases, ou ainda uma mutação induzida por supressor do gene mutante original

(HENRIQUES et al., 1987; GASPARRI, 2005).

Para que seja identificada a mutação reversa é necessária à utilização de uma

linhagem com alterações genéticas adequadas, como por exemplo, a linhagem haplóide

de S. cerevisiae XV185-14c, isolada por Von Borstel. Esta linhagem permite a detecção

de dois tipos de mutações lócus específico: reversões do alelo ocre lis1-1 (alteração no

códon UAA de término de cadeia) ou do alelo missense his1-7 (códon alterado codifica

um aminoácido diferente), e reversões por deslocamento do quadro de leitura do DNA

(frameshift) verificadas no lócus hom3-10. As células revertentes podem ser detectadas

pela semeadura em placas contendo meio seletivo no qual o fator de crescimento

inicialmente requerido não está presente, ou está em quantidades muito pequenas,

permitindo um background de crescimento (PARRY; PARRY, 1984; GASPARRI, 2005).

Diante do exposto, esta pesquisa tem como objetivo avaliar a atividade

antimicrobiana através da concentração inibitória mínima (CIM), concentração microbicida

37

mínima (CMM) citotoxicidade e mutagenicidade de derivados anfifílicos da O-

carboximetilquitosana (O-CMQTS).

38

4 MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho trata-se de pesquisa experimental de laboratório na área de

microbiologia (sub-área microbiologia aplicada) e da química orgânica (sub-área da

síntese orgânica), que foram desenvolvidos nos Laboratórios do Núcleo de Investigações

Químico-Farmacêuticas – NIQFAR: Pesquisa em Microbiologia (sala 311, Bloco 17 –

CCS) e Síntese Orgânica (sala 404, Bloco 17 – CCS).

4.1 Substâncias para análise de atividade antimicrobiana

A O-CMQTS foi preparada a partir da reação da quitosana (grau de desacetilação

da quitosana utilizada foi de 80 % e massa molar viscosimétrica 6,7 x 104 g/mL) com o

ácido monocloroacético a partir da metodologia descrita por Chen e Park (2003) com as

modificações descritas por Rosa (2008).

4.1.1 Síntese da O-CMQTS-hidrofóbica (Método homogêneo)

Os derivados anfifílicos que foram utilizados nos ensaios de atividade

antimicrobiana e antifúngica foram preparados pela mestranda Aline Debrassi orientada

pelo Prof. Dr. Clóvis Antônio Rodrigues, a partir da reação da O-CMQTS com os

seguintes aldeídos: benzaldeído, p-tolualdeído, anisaldeído, salicilaldeído, 4-

hidroxibenzaldeído, 3,4-dihidroxibenzaldeído, 4-clorobenzaldeído, 3-nitrobenzaldeído, 4-

nitrobenzaldeído, 2-carboxibenzaldeído e p-N,N-dimetilaminobenzaldeído, apresentados

nos Quadros 1a e 1b. As reações foram conduzidas em meio homogêneo segundo a

metodologia descrita na literatura (RABEA et al., 2005; ROSA, 2008), e descrita

resumidamente, a O-CMQTS (de 2 a 5 g) foi dissolvida em cerca de 300 mL de água. Um

equivalente de aldeído aromático foi adicionado à solução de O-CMQ com agitação,

acrescentou-se metanol até aspecto homogêneo. Em seguida, o pH foi ajustado para

aproximadamente 4 e a mistura reagiu durante 24 h. Posteriormente, foi adicionado

NaBH4 e a mistura foi mantida sob agitação por mais uma hora e meia. Os derivados a

serem formados foram precipitados pela adição de acetona, sendo depois filtrados. O

39

aldeído remanescente foi removido pelo método de Soxhlet com etanol durante dois dias

e os derivados foram secos a vácuo (RABEA et al., 2005).

Quadro 1a: Relação de derivados anfifílicos utilizados para a avaliação de atividade antimicrobiana e potencial de toxicidade.

Sigla Nome Estruturaa pH b

2-COOH-BzCMQN-(2-carboxibenzil)-O-carboximetilquitosana O

O

NH

O

OH

CH2COOH

OOH

7,5

BzCMQN-benzil-O-carboximetilquitosana O

O

NH

O

OH

CH2COOH 7,2

4-OH-BzCMQN-(4-hidroxibenzil)-O-carboximetilquitosana O

O

NH

O

OH

CH2COOH

OH

7,1

3,4-(OH)2-BzCMQN-(3,4-dihidroxibenzil)-O-carboximetilquitosana O

O

NH

O

OH

CH2COOH

OH

OH

7,0

4-CH3O-BzCMQN-(4-metoxibenzil)-O-carboximetilquitosana O

O

NH

O

OH

CH2COOH

OCH3

6,7

4-CH3-BzCMQN-(4-metilbenzil)-O-carboximetilquitosana O

O

NH

O

OH

CH2COOH

CH3

7,0

4-N,N-(CH3)2BzCMQN-(4-N,N-dimetilbenzil)-O-carboximetilquitosana O

O

NH

O

OH

CH2COOH

N

CH3

CH3

6,9

Legenda: a Estrutura do monômero substituído; b pH da dispersão (10 mg/mL).

40

Quadro 1b: Relação de derivados anfifílicos utilizados para a avaliação de atividade antimicrobiana e potencial de toxicidade.

Legenda: a Estrutura do monômero substituído; b pH da dispersão (10 mg/mL).

Sigla Nome Estruturaa pHb

4-Cl-BzCMQN-(4-clorobenzil)-O-carboximetilquitosana

7,5

3-NO2-BzCMQN-(3-nitrobenzil)-O-carboximetilquitosana O

O

NH

O

OH

CH2COOH

NO2

6,5

4-NO2-BzCMQN-(4-nitrobenzil)-O-carboximetilquitosana O

O

NH

O

OH

CH2COOH

NO2

6,5

OCMQO- carboximetilquitosana

OO

NH2

O

OH

CH2COOH 6,5

N,OCMQN–O–carboximetilquitosana O

O

NH

O

OH

CH2COOH

CH2COOH

7,0

2,4-(COOH)2-BCMQN-(2,4-dicarboxibenzoil)-O-carboximetilquitosana

OO

NH

O

OH

CH2COOH

O

OH

O O

OH

7,4

2-COOH-BCMQN-(2-carboxibenzoil)-O-carboximetilquitosana O

O

NH

O

OH

CH2COOH

O

OH

O

7,3

41

4.1.2 Determinação do grau de carboximetilação

Foram dissolvidos 50 mg de O-CMQTS em aproximadamente 50 mL de água. Em

seguida, foram adicionadas alíquotas de 0,25 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e os valores

da condutividade, obtidos com o auxílio de um condutivímetro, utilizados para construir

um gráfico de condutividade versus volume de hidróxido de sódio adicionado. O

prolongamento das curvas ascendente e descendente determina os pontos de inflexão,

que correspondem às variáveis V1 e V2 presentes na fórmula abaixo (Equação 1), onde

5,8 é o equivalente em massa correspondente a 0,1 mEq de CH2COO- e M é a massa em

miligramas do polímero.

%CH2COO- = (V2 – V1) x 5,8 x 100 (Eq. 1) M

4.1.3 Solubilização dos derivados anfifílicos

A solução estoque dos derivados anfifílicos foi preparada na concentração de 10

mg/mL, utilizando água destilada como solvente e ajustando o pH (6,5-7,5) até a

solubilização com HCl e NaOH (2,0 M).

4.1.4 Caracterização da O-CMQTS e dos derivados anfifílicos

A O-CMQTS e os derivados anfifílicos foram caracterizados por espectroscopia de

infravermelho e ultravioleta, sendo o grau de substituição dos derivados determinado

através da espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H pela acadêmica Aline

Debrassi segundo metodologia descrita por Liu e colaboradoes (2006). O método é

bastante simples e está baseado nos valores das integrais do próton ligado ao C-2 do

anel glicosídico, próximo a 3,0 ppm e o sinal característico do substituinte. Neste trabalho

foi escolhido o sinal da região dos prótons aromáticos, pois estes estão numa região

“limpa” do espectro (~ 7,0 ppm). O valor do GS é obtido com auxilio da equação abaixo

(Equação 2).

42

GS= [(AI 1HAr ~ 7,0 ppm) / (AI 1H C2 ~ 3,0 ppm)] x 1 / (N 1Har) (Eq. 2)

Onde: AI 1H arom equivale à área correspondente a integral dos

hidrogênios aromáticos; AI 1H C-2 - área correspondente a integral do

hidrogênio ligado ao C-2, e (N 1H arom) – número de prótons ligado ao

anel aromático.

4.2 Material Microbiológico

Os micro-organismos utilizados para a realização dos ensaios de atividade

antimicrobiana foram:

Bacillus subtilis (ATCC 2385)

Enterococcus faecalis (ATCC 19433)

Escherichia coli (ATCC 11775)

Proteus mirabilis (ATCC 25933)

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)

Salmonella enterica sorovar Typhimurium (ATCC 14028)

Staphylococcus aureus (ATCC 6538P)

Staphylococcus aureus (S.a 1 - isolado clínico)








Staphylococcus saprophyticus (ATCC 35552)

Streptococcus agalactie (ATCC 13813)

43

Os fungos leveduriformes utilizados para atividade antifúngica foram:

Candida albicans (ATCC 10231)

Neurospora crassa (ATCC 9279)

Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763)

Todas as cepas ATCC foram adquiridas da Coleção de Culturas da Newprov

Produtos para Laboratório (Pinhais/PR), e as cepas de isolado clínico foram fornecidas

pelo Laboratório Escola de Análises Clínicas da UNIVALI (Itajaí/SC).

As bactérias foram mantidas em ágar Nutriente e conservadas sob refrigeração (4

ºC) no Laboratório de Pesquisa em Microbiologia do curso de Farmácia da UNIVALI,

sendo repicadas em intervalos de 15 a 30 dias para manter as colônias viáveis.

Os fungos (leveduriformes e filamentosos) foram mantidos em ágar Sabouraud

dextrosado. As leveduras foram armazenadas sob refrigeração (4 ºC) e os fungos

filamentosos sob temperatura ambiente na micoteca do Laboratório de Micologia da

UNIVALI, sendo repicados em intervalos de 15 a 30 dias para manter as colônias viáveis.

Para a avaliação da mutagenicidade foi empregado a levedura:

Saccharomyces cerevisiae (XV185-14c)

Foi empregada uma linhagem haplóide de S. cerevisiae XV185-14c (MAT alfa

ade2-2 arg4-17 his1-7 lys1-1 trp5-48 hom3-10) que foi obtida através do Laboratório de

Reparo de DNA em eucariontes – Departamento de Biofísica da Universidade Federal do

Rio Grande do Sul, Porto Alegre/RS. Esta linhagem foi construída e cedida pelo Dr. R. C.

Von Borstel (Departamento de Genética da Universidade de Alberta/Canadá).

4.3 Reagentes e meios de cultivo

Os meios de cultivo empregados para os ensaios de atividade antimicrobiana e

mutagenicidade foram:

• Ágar-ágar 1,5% ( Merck)

• Ágar Mueller-Hinton (Merck)

• Ágar Nutriente (Merck)

44

• Ágar Sabouraud dextrosado (Difco)

• Ágar Completo [glicose 2% (Nuclear), extrato de levedura 1% (Criteriom), peptona

0,5% (Merck), ágar-ágar 1,5% ( Merck)]

• Caldo Completo [glicose 2% (Nuclear), extrato de levedura 1% (Criteriom), peptona

0,5% (Merck)]

• Cetoconazol (Sigma M-3512)

• Extrato de levedura 1% (Criteriom)

• Protease peptona 0,5% (Merck)

• Sacarose 4% (Nuclear)

4.4 Atividade antimicrobiana e antifúngica

4.4.1 Preparo dos inóculos bacterianos

Para o preparo do inóculo foram selecionadas de 4 a 5 colônias da bactéria

ativadas em ágar Mueller-Hinton e transferidas para tubo de ensaio com 5 mL de solução

NaCl 0,86 % estéril, seguidas de homogeneização em agitador de tubos por 15 segundos.

A densidade do inóculo foi ajustada por espectrofotometria a 520 nm, por comparação

com a escala de 0,5 de McFarland, obtendo-se a concentração de aproximadamente

1,5x108 células/mL. Em cada frasco foi inoculado uma alçada calibrada de 1 µL,

resultando em concentração final de aproximadamente 1,5x105 células (NCCLS, 2006).

4.4.2 Preparo dos inóculos fúngicos

Cada levedura foi cultivada em ágar Sabouraud dextrosado, pelo menos duas

vezes, para assegurar pureza e viabilidade das culturas jovens de 24 e 48 horas a 37 °C.

Para o preparo dos inóculos foram selecionadas 5 colônias da levedura, com

aproximadamente 1 mm de diâmetro, as quais foram suspensas em 5 mL de NaCl 0,85%

estéril e homogeneizadas em agitador de tubos por 15 segundos. A densidade do inóculo

foi ajustada por espectrofotometria a 520 nm para a obtenção de transmitância

equivalente a 95%, obtendo-se uma concentração final entre 1 e 5x106 células/mL. Cada

45

frasco com meio recebeu uma alçada calibrada de 1 µL, atingindo concentração final

entre 1 e 5x103 células, como descrito por Espinel-Ingroff e Pfaller (1995).

4.4.3 Concentração inibitória mínima (CIM)

O método consiste em preparar diluições seriadas dos compostos anfifílicos a

serem testados, em meios de cultura sólidos, semear o micro-organismo em estudo, e

após incubação, verificar a menor concentração da amostra que inibiu o crescimento do

mesmo (NCCLS, 2006; ESPINEL-INGROFF; PFALLER, 1995).

Os compostos anfifílicos foram solubilizados em água na concentração de 10

mg/mL e adicionadas em séries de 14 frascos com capacidade para 5 mL em diferentes

concentrações (100 a 5000 µg/mL). Em seguida, a cada frasco foi adicionado 1 mL de

meio ágar Mueller-Hinton para as bactérias e 1 mL de ágar Sabouraud dextrosado para

as leveduras, seguido de imediata homogeneização da mistura. Após a solidificação dos

respectivos meios de cultura, os micro-organismos, previamente ativados em crescimento

exponencial, foram inoculados com alça calibrada de 1 μL, sendo então, incubados a 37

°C por 18 a 24 horas para as bactérias, e 25 °C por 24 a 48 horas para os fungos

leveduriformes, e 25 °C por período de 5 a 15 dias para os fungos filamentosos.

Após o período de incubação, efetuaram-se as leituras da concentração inibitória

mínima através da observação da presença ou não de crescimento visível. Para

interpretação dos resultados foi considerada a menor concentração do composto

necessária para inibir o crescimento do micro-organismo.

Como controle positivo empregou-se frascos com os micro-organismos inoculados

sem a presença das sustâncias teste. A leitura dos resultados foi considerada válida

somente na presença de crescimento microbiano nos controles. Os ensaios foram

repetidos por três vezes para garantir a reprodutibilidade do resultado.

4.4.4 Concentração microbicida mínina (CMM)

Para determinar a concentração microbicida mínima, as culturas do ensaio de CIM,

foram submetidas às suas respectivas subculturas em meio ágar Mueller-Hinton com o

auxílio de replicador (Sigma), isento de substâncias teste e incubadas a 37 ºC por 18 a 24

46

horas. Após a incubação as culturas foram inspecionadas para a verificação visual do

crescimento microbiano (Figura 4).

Para a interpretação dos resultados foi considerado que a inibição total no ensaio

de CIM e crescimento do micro-organismo na subcultura (CMM) significou ação

bacteriostática, e a ausência de crescimento na subcultura significou ação bactericida

(BARON; FINEGOLD, 1990).

Figura 4: Processo da avaliação da atividade antimicrobiana.

4.5 Estudo preliminar de mecanismo de ação

4.5.1 Avaliação do efeito dos compostos anfifílicos sobre a permeabilidade da

membrana bacteriana

Os compostos anfifílicos (2-COOH-BzCMQ, 4-OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ),

foram avaliados para verificação da atividade em inibir a função da membrana celular

através do método modificado descrito por Ye e colaboradores (2005).

47

O inóculo microbiano foi preparado após a ativação da Escherichia coli em ágar

Mueller-Hinton (37 oC por 24 horas). Cinco colônias isoladas, com tamanho aproximado

de 1 mm, foram transferidas para um tubo de ensaio com solução salina (NaCl 0,86 %) e

a concentração de células foi ajustado por comparação com a escala de Mac Farland 0,5

(1,5x108 células/mL), sendo então centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos.

Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi suspendido em solução

de glicose 5%. O procedimento foi repetido até que a sua condutividade elétrica estivesse

perto da condutividade da solução de glicose 5%, tornando a solução isotônica.

Os compostos testados foram acrescentados à solução de glicose 5% em

diferentes concentrações (156,25; 312,5; 625,0; 1250; 2500 e 5000 µg/mL) sendo usada

como controle positivo a Polimixina B a qual foi testada nas concentrações de 25, 50 e

100 µg/mL, sendo realizada a leitura da condutividade elétrica (L1). Posteriormente, a

estas mesmas concentrações foi adicionado 100 µL do inóculo bacteriano previamente

preparado. Depois de homogeneizado, as amostras foram incubadas à 37 oC durante 1

hora e então a condutividade foi verificada novamente (L2).

A diferença da condutividade elétrica dos compostos com e sem inóculo foi

representada pela fórmula ΔL = L2 – L1, e a condutividade da bactéria inativada por

aquecimento em glicose 5% (banho a 100 oC / 5 min). Foi usada como controle negativo

(Lo). A razão entre ΔL/Lo indicou a condutividade elétrica relativa dos compostos

analisados.

4.5.2 Avaliação do efeito dos compostos anfifílicos sobre a parede fúngica

Os compostos anfifílicos (4-OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ), foram avaliados para

verificação da atividade em inibir a parede celular fúngica, através da observação de

malformações das hifas no ensaio da Neurospora crassa (IM70 ATCC 9279).

No ensaio qualitativo da N. crassa foi utilizado meio de cultura com a seguinte

composição: 30 mL de meio contendo 0,5 % de protease peptona, extrato de levedura 1

%, 4,0 % sacarose e 1,5 % ágar-ágar. O meio foi autoclavado a 121 °C por 15 min, e

distribuído em placas de Petri (9 cm de diâmetro). Após resfriamento parcial (40 °C) do

meio, foram semeados 30 μL do inóculo de esporos de N. crassa e incubado a

48

temperatura ambiente sob luz direta. Após a solidificação do meio, aplicou-se sobre este,

discos de papel de 0,65 mm. Os compostos foram dissolvidos em água e colocados sobre

os discos na concentração de 2000 µg/mL (concentração na qual é ativo contra a

levedura Candida albicans), com auxílio de micropipeta.

Para preparar o inóculo dos esporos de N. crassa, o cultivo foi feito em meio

contendo 0,25 % de protease peptona (p/p), 0,25 % de extrato de levedura (p/p) 1 % de

sacarose (p/p) e 1,5 % ágar (p/p) por 4-5 dias de incubação à temperatura ambiente e luz,

produzindo uma coloração laranja no crescimento das hifas com esporos. O inóculo foi

feito em tampão contendo 75 mg/% K2HPO4 (grau reagente) em solução de glicerol e

água 15:85. A suspensão do espóro livre de hifas foi preparado de acordo com Wright,

Scott e Gorman (1983) e ajustada a 106 UFC/mL.

Os discos contendo somente água estéril como controle negativo também foram

incluídos no ensaio, e 1,25 μL de cetoconazol também foi adicionado ao disco como

controle positivo, os quais devem produzir um halo claro.

N. crassa é um fungo filamentoso que quando em presença de inibidores da

parede celular fúngica e sob certas condições (37 ˚C e meio osmótico), cresce como

protoplasma (sem parede celular) e que microscopicamente mostra malformações (hifas

curtas e ramificadas) (SELITRENNIKOFF, 1992). Os halos de inibição foram examinados

para verificar se havia má formação das hifas e se a aparência era de aspecto enevoado

ou manchado, seguindo-se a incubação das placas a temperatura ambiente por 24 horas

sob luz direta.

4.6 Avaliação da toxicidade

4.6.1 Ensaio com Artemia salina

Para realizar esse ensaio de citotoxicidade utilizou-se o microcrustáceo Artemia

salina Leach. Nas Figuras 5 e 6 estão apresentados os esquemas que ilustram a

metodologia empregada.

Os ensaios foram realizados conforme o método descrito por Meyer et al. (1982) e

Lopez et al. (2002), adaptado às condições do Laboratório de Microbiologia. Uma solução

de cada composto anfifílico foi preparada na concentração de 10 mg/mL. Os ovos de

49

Artemia salina (1 g/L) foram colocados em um frasco contendo água marinha sintética

consistindo de 23 g NaCl, 11 g MgCl2.6H2O, 4 g Na2SO4, 1,3 g CaCl2.2H2O, 0,7 g KCl em

1000 mL de água destilada e o pH foi ajustado para 9,0 usando Na2CO3 (LEWAN et al.,

1992), e incubados para eclodirem sob aeração, em banho-maria a 25 ºC por 24 horas

com iluminação (2000 Lux) e mais 24 horas sem iluminação. Após este período, em

microplacas (100 μL), foram preparadas diferentes concentrações das substâncias, que

variam de 31,25 μg/mL a 1000 μg/mL e a cada uma delas foram adicionados de 6 a 12

larvas do microcrustáceo, e novamente incubado em estufa (20 ºC a 25 ºC) por 24 horas.

Legenda: 1:Oxigênio, 2: Banho-maria, 3: iluminação e 4: Válvula de liberação da larvas.

Figura 5: Representação do procedimento para hidratação e eclosão das larvas de Artemia salina.

Figura 6: Representação da metodologia empregada para avaliação do potencial tóxico agudo utilizando Artemia salina.

6 a 12 larvasCompostos anfifílicos nas concentrações de 31,25 á

1000 µg/mL

Microplacas

24 horas

EstufaLeitura larvas vivas

x larvas mortasPrograma de

Probitos

Análise estatística

Os cistos foram colocados em um

Erlenmeyer contendo água

Incubação durante 24 horas (banho-maria), seguido de oxigenação e 24 horas de

iluminação

50

O resultado foi obtido através da contagem do número de Artemia salina vivas e

mortas para cada diluição (concentração). O ensaio foi realizado em triplicata. Como

controle positivo, foi utilizado uma solução de dicromato de potássio na concentração de

800 μg/mL e como controle negativo 200 μL de água marinha.

A leitura do resultado foi validada somente quando nos controles positivos houve

observação da morte de todos os indivíduos (Artemia salina) e no controle negativo a

sobrevivência de todos os indivíduos.

Para o cálculo final da concentração letal de 50% (CL50) e seu respectivo intervalo

de segurança foi utilizado o método de Probitos de análise. Os compostos foram

considerados tóxicos quando o ensaio de toxicidade frente a Artemia salina for menor que

250 μg/mL (MEYER et al., 1982; DOLABELA, 1997; PARRA et al., 2001).

4.6.2 Ensaio de mutagenicidade

Para este ensaio utilizou-se a linhagem haplóide Saccharomyces cerevisiae

(XV-185-14c), como descrito em Medina et al. (2008), com algumas modificações. O

crescimento das células foi feito em meio líquido completo (YEL) contendo 1% de extrato

de levedura, 2% de bactopeptona e 2% de glicose (Difco, Oxoid ou Vetec). Para

determinação do número de células viáveis, ou seja, unidades formadoras de colônias,

foram feitas semeaduras em meio YEPD solidificado com 2% de bacto-ágar, marca Vetec

(AUSUBEL et al., 1989).

Para todos os tratamentos, as células foram ressuspendidas e diluídas em PBS

(tampão salina fosfato-Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,76 mM, KCl 2,7 mM, e NaCl 137 mM;

pH 7,4) sendo que o PBS também foi usado como controle negativo. Neste teste foi

empregado o Meio Sintético (SC) suplementado (SC-histidina, SC-lisina e SC-

homoserina), nos quais os aminoácidos foram omitidos, conforme descrito por Ausubel e

colaboradores (1989).

Em frasco de Erlenmeyer contendo 20 mL de YEL foi inoculada uma colônia

isolada dessa linhagem e colocada para crescer em shaker (incubadora com agitação

orbital – LABLINE), à 180 rpm e 30oC, durante 24 horas, para atingir a fase estacionária.

As culturas assim mantidas atingiam uma concentração de 1 a 2 x108 células/mL. Duas

diluições foram feitas e as células foram então contadas em câmera de Neubauer no

51

microscópio óptico. Posteriormente, 5 mL desta suspensão foi passada para um tubo

Falcon de 10 mL e centrifugada por 5 minutos a 5000 rpm. Após esta centrifugação,

desprezou-se o sobrenadante e adicionou-se uma quantidade de PBS calculada para

atingir a concentração de 1x 109 células/mL.

Dessa suspensão final, utilizou-se 100 μL para cada tratamento (25; 62,25; 125;

250 e 500 μg/mL) dos compostos anfifílicos. As células foram tratadas por 1hora à 30 oC,

sob agitação à 800 rpm. Determinou-se a sobrevivência através de semeadura em meio

mínimo completo (SC). Para cada tubo de tratamento foram feitas cinco diluições, a

concentração do tubo de onde foram retirados os volumes para a semeadura equivalente

a 1 x 103 células/mL, as placas foram colocadas em estufa na ausência de luz a 30 oC

por 5 dias. Para detecção de mutação induzida (revertentes das marcas auxotróficas

his1-7 lis1-1 hom3-10) as células foram semeadas em meio mínimo seletivo na

concentração de 1 x 108 células/mL nas mesmas condições de incubação. Como controle

positivo foi utilizado o composto nitroquinoleína-1-óxido (4-NQO 5 µM) (Sigma). O teste foi

feito em duplicata (Figura 7).

Figura 7: Representação esquemática do teste de mutagênese em Saccharomyces cerevisiae XV 185-14c.

52

A mutação his1-7 é um alelo com mutação de sentido incorreto do tipo não

supressivo, e portanto as reversões são a conseqüência de mutações no próprio locus.

Entretanto, o alelo lis1-1 corresponde a uma mutação do tipo ocre sem sentido, a qual

pode ser revertida de forma locus-específica ou através de mutação para frente (forward

mutation) em um gene supressor. A diferença entre as reversões verdadeiras e mutações

supressoras no locus lis1-1 foi bem descrita por Schuller e Von Borstel (1974), em que o

conteúdo de adenina reduzido no meio SC-lis mostra reversão no locus quando as

colônias são vermelhas e mutações supressoras quando as colônias ficam brancas.

Acredita-se que hom3-10 contenha mutação frameshift, devido a sua resposta a uma

série de agentes sabidamente mutagênicos.

Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando o Teste ANOVA-

Dunnett, comparando-se os tratamentos dos derivados anfifílicos com o controle negativo

(dose zero dos derivados anfifílicos). Foi considerado estatisticamente significativo

*p<0,05 , **p<0,01 e ***p<0,001.

53

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Antes da realização dos ensaios biológicos, os derivados anfifílicos da O-CMQTS

foram caracterizados quanto ao seu grau de carboximetilação e grau de substituição.

5.1 Grau de carboximetilação

5.1.1 Titulação condutimétrica

A titulação condutimétrica foi utilizada para determinar o grau de substituição dos

lotes de O-CMQTS. O gráfico de condutividade versus volume de hidróxido de sódio

adicionado foi construído, sendo que os dois pontos de inflexão no gráfico indicam a

neutralização do ácido carboxílico (Figura 8).

Figura 8: Curva da titulação condutimétrica da O-CMQTS. Volume da solução 60 mL, massa do sólido 50 mg, concentração do NaOH 0,1 M.

A partir do prolongamento das curvas ascendente e descendente dos pontos de

inflexão determinou-se o volume de NaOH gasto para a neutralização (Figura 8). A

aplicação destes valores na equação 2 permitiu calcular o grau de carboximetilação (GC)

da O-CMQTS, que correspondeu a 44,31%, correspondendo a um grau de

54

carboximetilação bem acima daquele encontrado para o polímero preparado através do

método descrito por Chen e Park (2003). Este resultado reflete a dificuldade na

padronização do processo de síntese, sendo, portanto, necessária a caracterização de

todos os lotes sintetizados.

5.2 Grau de substituição

O grau de substituição dos derivados foi determinado através da espectroscopia de

ressonância magnética nuclear de 1H e calculado a partir da Equação 2 que utiliza os

valores das integrais dos sinais na região de 7,0 e 3,0 ppm, o qual é mostrado na Tabela

1. O grau de substituição dos derivados anfifílicos da O-CMQTS varia muito dependendo

do substituinte e da metodologia empregada na síntese. Liu e colaboradores (2007)

relatam um GS de 3 % quando o ácido linoleico foi utilizado como modificador, Liu e

colaboradores (2006), mostraram um GS que variou de 25-48% quando o anidrido

hexanoílico foi utilizado na síntese. A utilização de anidrido succínico produziu um

derivado com GS de 72 % (ZHU; YAUN; LU, 2007). A partir da equação que utiliza os

valores das integrais dos sinais na região de 7,0 e 3,0 ppm, o grau de substituição dos

derivados foi calculado e é mostrado na Tabela 1.

Tabela 1: Grau de substituição no grupamento NH2 dos derivados anfifílicos, calculado a partir dos espectros de RMN H1.

Sigla pH GS(%)2-COOH-BzCMQ 7,5 64BzCMQ 7,2 124-OH-BzCMQ 7,1 273,4-(OH)2-BzCMQ 7,0 34-CH3O-BzCMQ 6,7 34-CH3-BzCMQ 7,0 44-N,N-(CH3)2BzCMQ 6,9 654-Cl-BzCMQ 7,5 183-NO2-BzCMQ 6,5 514-NO2-BzCMQ 6,5 34,8OCMQ 6,5 0,0

Legenda: Grau de substituição (GS) (10mg/mL).

55

5.3 Atividade Antimicrobiana

A atividade antibacteriana, bem como a atividade antifúngica da quitosana e seus

derivados estão diretamente relacionadas com o peso molecular, grau de desacetilação,

modificações químicas, grau de substituição, pH, comprimento e posição do substituinte

nas unidades de glucosamina da quitosana e do organismo alvo (RABEA et al., 2009).

Neste contexto, derivados anfifílicos da O-carboximetilquitosana (Quadro 1a e 1b) foram

desenvolvidos introduzindo grupamentos hidrofóbicos, pois, de acordo com Sun e

colaboradores (2006) os derivados da quitosana solúveis em água, nas circunstâncias

fisiológicas ácidas e básicas, podem ser bons candidatos para aumentar a atividade

antimicrobiana.

5.3.1 Cepas padronizadas

Inicialmente foi realizado um teste piloto para verificar a possível ação

antimicrobiana dos compostos anfifílicos contra um representante de bactérias Gram-

positivas (Staphylococcus aureus), bactéria Gram-negativa (Escherichia coli) e dos fungos

leveduriformes (Candida albicans), até a concentração máxima de 5000 µg/mL.

Os resultados mostraram que, de todos os 14 compostos testados apenas o

composto 2-COOH-BzCMQ demonstrou atividade significativa (300 µg/mL) contra a

bactéria S. aureus. Os compostos 4-OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ, apresentaram

atividade para os micro-organismos S. aureus e C. albicans, porém em concentrações

mais elevadas, 2000 µg/mL e 3000 µg/mL (4-OH-BzCMQ) e 2000 µg/mL e 2000 µg/mL

(4-CH3O-BzCMQ) respectivamente (Tabela 2).

Excluindo-se os outros compostos e analisando somente os três que

aparesentaram ação antimicrobiana, foi comparado os resultados apresentados na Tabela

2, com o grau de substituição (GS) (Tabela 1), podendo-se observar que a atividade

antimicrobiana foi diretamente proporcional ao grau de substituição. Dentre os compostos

que apresentaram atividade antimicrobiana verificamos que o composto 2-COOH-BzCMQ

é o que possui maior GS (64%) e conseqüentemente o que apresentou maior atividade

frente a cepa de S. aureus. Isto pode estar relacionado com o aumento das cargas

56

negativas na molécula, ocasionando portanto uma maior interação com as cargas

positivas na superfície da célula (SUN et al., 2006).

Tabela 2: Atividade antimicrobiana de compostos anfifílicos frente à três micro-organismos.

Compostos Concentração inibitória mínima (µg/mL)Testados S. aureus E. coli C. albicans

2-COOH-BzCMQ 300 >5000 >50004-OH-BzCMQ 2000 >5000 2000

4-CH3O-BzCMQ 3000 >5000 2000

Legenda: Staphylococcus aureus (S.aureus), Escherichia coli (E. coli), Candida albicans

(C. albicans).

Esta relação foi anteriormente evidenciada por Sajomsang e colaboradores (2008),

onde a atividade antimicrobiana verificada em amostras de quitosana metilada e seus

derivados foi significativa quando o grau de quaternização aumentou, fazendo com que as

cargas positivas do grupamento amônio quaternário da quitosana interagissem

eletrostaticamente com as cargas negativas da superficie celular do micro-organismo

testado (E. coli). Outro parâmetro a ser avaliado leva em consideração a pesquisa

realizada por Sajomsang e colaboradores (2009) com derivados quaternários da N-aril

quitosana, onde se observou que o grupamento 2-carboxi mostrou menor CIM em relação

ao grupamento 4-Hidroxi frente a cepas de S. aureus com concentrações de 16 µg/mL e

64 µg/mL, respectivamente. Este efeito foi constatado no presente estudo onde o

composto 2-COOH-BzCMQ apresentou CIM de 300 µg/mL enquanto que a do composto

4-OH-BzCMQ foi de 2000 µg/mL contra a mesma cepa (Tabela 2).

A falta de atividade dos demais compostos anfifílicos frente ao micro-organismo

Staphylococcus aureus podem estar diretamente relacionada com os diferentes

substituintes destes compostos (Quadro 1a e 1b), ou ao grau de substituição, ou ainda ao

grau de ionização.

O motivo pelo qual os compostos anfifílicos não foram ativos contra a Escherichia

coli (bactéria Gram-negativa) pode estar relacionado com as diferenças existentes na

composição da parede celular de ambos micro-organismos. No caso das bactérias Gram-

57

positivas, sua parede celular é composta inteiramente por peptideoglicano. Esta camada

de peptideoglicano é composta por redes com vários poros, os quais permitem com que

moléculas estranhas entrem na célula sem nenhuma dificuldade. Ao contrário das

bactérias Gram-negativas, onde sua parede celular é composta por uma fina camada de

peptideoglicanos e envolvida por uma membrana externa constituída por

lipopolissacarídeos, lipoproteínas e fosfolipídeos.

Além disso, agregado à membrana externa, há o espaço periplasmático, composto

por enzimas responsáveis pela inativação de algumas substâncias com ação

antibacteriana. Contudo, muitos organismos Gram-negativos exibem alto nivel de

resistência intrínseca a uma série de antimicrobianos, pois sustentam na membrana

externa um mecanismo de efluxo ativo, o qual age como uma barreira para estes agentes

(VAN BAMBEKE et al., 2003; KOLER; PECHERE; PLESIAT, 1999; HANCOCK; BELL,

1998; NIKAIDO, 1994; 1989). Assim, todas essas características adjuntas, explicam o

porquê muitos agentes antimicrobianos têm dificuldade em penetrar nessa membrana

(RANG et al., 2003; SUN et al., 2006; SABAA et al., 2010).

De acordo com Másson e colaboradores (2008), o mecanismo exato da ação

antimicrobiana ainda é desconhecido. Contudo diversos mecanismos que contribuem

para esta ação vem sendo sugeridos, entre eles: a formação de um revestimento

impermeável na superfície bacteriana; a interação de derivados da quitosana de baixo

pesos molecular com substâncias eletronegativamente na célula; a inibição do

crescimento do micro-organismo através da quelação de metais; e também a penetração

da quitosana nas células conduzindo a inibição de várias enzimas e interferência na

síntese de mRNA e proteínas.

Apesar de muitas hipóteses explicarem a atividade antimicrobiana da quitosana, a

mais praticável é a mudança na permeabilidade da célula devido interações entre a

quitosana policatiônica e as cargas eletronegativas na superfície das células (SABAA et

al., 2010). Helander e colaboradores (2001), mostraram que a quitosana interrompeu as

propriedades da membrana externa das bactérias Gram-negativas, pois a quitosana é

protonada em condições ácidas e os grupos carboxil e fosfato da superfície bacteriana

são aniônicos oferecendo portanto potentes sítios para ligações eletrostáticas. De outro

lado, S. aureus (bactéria Gram-positiva) tem a sua parede celular composta

58

principalmente por peptideoglicanos, os quais impedem esta formação na camada da

superfície celular.

Os derivados anfifílicos no presente estudo diferem da quitosana ao apresentarem

cargas negativas no grupamento carboxil devido a presença da carboximetilquitosana,

portanto não interagindo com os componentes aniônicos da superfície das bactérias

Gram-negativas demostrando, com isso, a ausência da atividade antimicrobiana contra

Escherichia coli previamente testada.

Deve-se considerar que parte das pesquisas com a quitosana, assim como com os

derivados da mesma apresentam atividade antimicrobiana com CIM de valores superiores

a 200 μg/mL (XING et al., 2009; ZHONG et al., 2009; KONG et al., 2008). Esta situação

também é evidenciada na pesquisa de Rabea e colaboradores (2009), onde foram

utilizados derivados de N-benzil quitosana para avaliação da atividade antibacteriana

frente Staphylococcus aureus. Segundo os autores, a quitosana e seus derivados

metilados apresentaram atividade biológica, pois foram capazes de inibir o crescimento

bacteriano em concentrações que variam de 16 à 512 μg/mL, em pH 5.5. Sun e

colaboradores (2006), em estudos realizados com carboximetilquitosana quaternária,

verificaram atividade antimicrobiana contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus

onde a CIM foi 625 µg/mL e 1250 µg/mL respectivamente, quando o grau de substituição

é aumentado e o peso molecular diminuído a atividade antimicrobiana torna-se mais

acentuada.

Os estudos conduzidos por Rabea e colaboradores (2009) indicando a atividade

biológica de derivados da N-benzilquitosana demonstraram que os derivados exibem

atividade inibitória contra bactérias e contra fungos cujo teste de germinação mostrou

para a maioria dos derivados uma porcentagem de inibição de 90%, demonstrando que a

modificação química da quitosana com aldeídos aromáticos foi significativa na atividade

antimicrobiana. Estes dados da literatura comprovam a atividade antifúngica observada

nos compostos 4-OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ contra a cepa de Candida albicans com

CIM de 2000 µg/mL para ambos os compostos (Tabela 2). Um dos mecanismos

propostos por Dutta e colaboradores (2009) para a atividade antifúngica da quitosana foi

que ao penetrar no núcleo dos micro-organismos a quitosana pode ligar-se ao DNA

interferindo na síntese do mRNA e das proteínas.

59

Um estudo avaliou a atividade antifúngica com relação ao peso molecular de

derivados da quitosana, em especial a carboximetilquitosana, foram testados contra

cepas de Candida albicans, Candida krusei e Candida glabrata. Estes testes constataram

que o baixo peso molecular está diretamente associado a baixa atividade antifúngica

sendo que o caráter policatiônico da quitosana é crucial para esta atividade (SEYFARTH

et al, 2008).

Por apresentar atividade antibacteriana contra a cepa de Staphylococcus aureus, o

composto 2-COOH-BzCMQ também foi testado contra outras bactérias Gram-positivas

(Bacillus subtilis, Enterococcus sp. e Staphylococcus saprophyticcus, Streptococcus

agalactiae), Gram-negativas (Salmonella typhi, Proteus mirabillis e Pseudomonas

aeruginosa) e a levedura Sacharomyces cerevisiae porém não apresentou atividade até a

concentração máxima testada (5000 µg/mL).

A hipótese preliminar para a atividade antibacteriana do composto 2-COOH-

BzCMQ pode ser relacionada à presença de um grupamento carbóxi presente na

molécula. Assim foram sintetizados outros compostos 2,4-(COOH)2-BCMQ, 2,(COOH)2-

BCMQ e NOCMQ, que foram testados para a avaliação de atividade contra as bactérias

Gram-positivas (S. aureus e S. agalactiae) e Gram-negativas (E. coli, P. mirabillis, P.

aeruginosa e S. typhimurium). Estes três compostos não mostraram atividade até a

concentração de 5000 µg/mL, sugerindo que provavelmente o grupamento carbóxi não

seja o único responsável pela atividade antibacteriana.

5.3.2 Cepas de isolados clínicos

Como os compostos 2-COOH-BzCMQ, 4-OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ

apresentaram atividade específica contra S. aureus, foi realizado testes de atividade

antimicrobiana (CIM) e (CBM) contra outras cepas padrão desta bactéria e cepas

resistentes de isolados clínicos (S.a 1 – S.a 8) (Tabela 3).

Os três compostos testados apresentaram atividade antibacteriana (CIM) para

todas as cepas testadas porem mais significativa para o composto 2-COOH-BzCMQ com

concentrações entre 300 e 700 µg/mL. Entretanto a concentração bactericida mínima

(CBM), para todas as cepas, foi superior a 5000 µg/mL.

60

Estes resultados tornam-se significativos para a indicação de emprego destes

compostos na confecção de bandagens como uma opção em tratamentos de difícil

cicatrização, em ferimentos infeccionados com exsudação, ferimentos causados por

queimaduras, lesões causadas par aplicações em radioterapia em enfermidades diversas,

queimaduras de sol, arranhões, transplantes e implantes de enxertos e de um modo geral,

em todos os tipos de cirurgias ou distúrbios dermatológicos, em cujos tratamentos são

necessários meios úmidos e estéreis.

Recentemente, foram relatados que os filmes de derivados hidrofóbicos da O-

carboximetilquitosana apresentam propriedades de transmissão de vapor de água,

indispensáveis para a preparação de filmes para o tratamento de queimaduras

(BRESSAN 2009). Portanto, as propriedades antimicrobianas dos derivados aliados às

propriedades de transmissão de vapor de água tornam estes derivados potenciais

polímeros para a preparação de filmes para o tratamento de queimados.

Tabela 3: Atividade antibacteriana (CIM) de alguns compostos anfifílicos contra as cepas padrão e resistentes (isolados clínicos) de S. aureus.

Micro-organismo Atividade antibacteriana (CIM) (µg/mL)2-COOH-BzCMQ 4-OH-BzCMQ 4-CH3O-BzCMQ

S. aureus ATCC 300 2000 3000S.a 1 400 2000 4000

S.a 2 300 2000 5000

S.a 3 400 2000 2000

S.a 4 700 2000 2000

S.a 5 400 2000 2000

S.a 6 700 2000 2000

S.a 7 400 3000 5000

S.a 8 500 3000 5000

Legenda: Staphylococcus aureus ATCC (S. aureus ATCC), Staphylococcus aureus resistentes de

isolados clínicos (S.a 1, S.a 2, S.a 3, S.a 4, S.a 5, S.a 6, S.a 7, S.a 8); Concentração inibitória mínima

(CIM).

O Staphylococcus aureus causa pequenas infecções cutâneas, como furúnculos ou

abcessos, podendo também causar sérias doenças cutâneas pela produção de toxinas

61

(síndrome da pele escaldada e síndrome do choque tóxico) bem como sérias infecções

em feridas pós – operatórias (MIMS et al., 2005).

Como os estafilococos são encontrados na pele e na nasofaringe, a eliminação das

bactérias é comum, sendo responsável principalmente por muitas infecções hospitalares.

O S. aureus é um dos patógenos hospitalares mais importantes e mais disseminados,

representando a terceira causa mais comum de infecções sangüíneas, sendo também

particularmente problemático em berçários. Além de S. aureus, outras espécies de

Staphylococcus correspondem, atualmente, à maior causa coletiva de infecções

sangüíneas adquiridas em hospitais, sendo também altamente prevalentes como agentes

responsáveis por infecções de ferimentos (ZAVADINACK-NETTO et al., 2001; MADIGAN;

MARTINKO; PARKER, 2004).

5.4 Estudo preliminar de mecanismo de ação

5.4.1 Efeito dos compostos anfifílicos sobre a permeabilidade da membrana

bacteriana

Considerando os resultados da atividade antimicrobiana apresentados nas Tabelas

2 e 3 foi realizado um estudo preliminar para verificar o modo de ação dos compostos 2-

COOH-BzCMQ, 4-OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ.

De modo geral, os agentes antimicrobianos podem manifestar sua atividade por

vários mecanismos, os quais podem ser descritos como: inibidores da síntese da parede

celular, inibição da síntese de proteínas, inibição da síntese de ácidos nucléicos,

inibidores do ácido fólico e inibidores da função da membrana celular (FONSECA, 1999;

SCHAECHTER et al., 2002; SOUZA et al., 2003).

Para avaliação da inibição da função da membrana celular, um dos possíveis

mecanismos de ação dos compostos anfifílicos que tiveram atividade antimicrobiana (2-

COOH-BzCMQ, 4-OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ) foi empregada a cepa da bactéria

Gram-negativa Escherichia coli e o antimicrobiano Polimixina B (200 µg/mL) como

controle positivo, e verificada a condutividade elétrica dos compostos acima através do

método modificado por Kong e colaboradores (2008). Segundo Xing e colaboradores

(2008), quando a integridade funcional da membrana citoplasmática é rompida, pequenos

62

íons como K+ e PO4-3 evadem-se seguidos por macromoléculas como DNA e RNA além de

outros materiais ocorrendo a lesão ou morte celular. A liberação destes componentes

intracelulares pode ser verificada através do aumento da condutividade elétrica indicando

com isso um dano na membrana celular.

A membrana citoplasmática age como uma barreira de permeabilidade seletiva e

controla a composição interna da célula. Quando a integridade funcional da membrana é

rompida, macromoléculas e íons evadem-se, ocorrendo a lesão ou morte celular. As

polimixinas são os exemplos desse mecanismo, na inibição da membrana celular

(JAWETZ; MELNICK; ADELBERG, 2000).

Foi verificado um aumento gradativo na condutividade da Polimixina B quando

a suspensão bacteriana foi adicionada. Por se tratar de um antimicrobiano inibidor da

função da membrana celular, este fármaco possui atividade detergente, penetrando na

membrana externa para a membrana interna da bactéria. Assim, ocorre diminuição da

integridade da membrana devido à perda de componentes essenciais citoplasmáticos

e conseqüente morte bacteriana (PLORDE, 1994; ROSSI; ANDREAZZI, 2005).

A medida que as concentrações dos compostos em questão foram aumentadas

sem a suspensão bacteriana (L1), a condutividade dos mesmos aumenta

correspondentemente. Porém, ao adicionarmos a suspensão bacteriana (L2), estas

condutividades passam a diminuir, ao contrário do que acontece com a Polimixina B.

Este perfil é mostrado na Figura 9 e Apêndice A.

À medida que aumentamos a concentração dos compostos anfifílicos a diferença

nas condutividades diminui, enquanto que na Polimixina B esta diferença aumenta

comprovando que quando há um aumento na condutividade elétrica da suspensão

celular a membrana citoplasmática é quebrada causando dano celular. Neste contexto, os

resultados demonstram que os compostos testados não exercem mecanismo de ação

sobre a membrana bacteriana.

63

Figura 9: Condutividade elétrica do micro-organismo E. coli tratado com os compostos 2-COOH-BzCMQ, 4-

OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ. Inserto antimicrobiano Polimixina – B.

5.4.2 Efeito dos compostos anfifílicos sobre a parede fúngica

Para um agente antimicrobiano é de grande importância que ele seja potente na

sua atividade, mas que não seja tóxico para o hospedeiro. Devido a composição da célula

fúngica ser muito semelhante à célula do hospedeiro, a maioria dos agentes antifúngicos

utilizados atualmente são tóxicos também para o homem. Para a utilização terapêutica

dos agentes antifúngicos é necessário o estudo do seu mecanismo de ação, a fim de

encontrar fármacos que sejam seletivamente tóxicos para os micro-organismos

(ZACCHINO et al., 1998).

O ensaio da Neurospora crassa permite avaliar macroscopicamente inibidores da

parede celular fúngica. A parede é uma estrutura que somente está presente na célula

fúngica. Um agente antifúngico ideal é aquele que atua somente na célula fúngica, ou que

seja seletivo e menos tóxico para a célula hospedeira.

64

Em razão dos compostos 4-OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ terem apresentado

atividade contra Candida albicans, foi avaliado o possível mecanismo de ação através do

ensaio de Neurospora crassa. Os dois compostos não inibiram o fungo Neurospora

crassa nem foram observadas mal-formações das hifas, indicando que estes compostos

provavelmente não atuem inibindo a parede celular.

5.5 Toxicidade frente Artemia salina

Um dos métodos utilizados, para detecção do potencial tóxico dos compostos

anfifílicos da O-carboximetilquitosana, foi o ensaio utilizando o microcrustáceo Artemia

salina. Este ensaio é considerado uma ferramenta muito útil para avaliação preditiva da

toxicidade aguda (SOLIS et al., 1993; CARBALLO et al., 2002; COLEGATE; MOLYNEUX,

2008).

Para elucidar os resultados encontrados neste bioensaio, faz-se necessário a

obtenção da CL50 e seus respectivos intervalos de confiança utilizando o método de

Probitos. De acordo com Dolabela (1997), uma substância é considerada altamente tóxica

quando a CL50 for menor que 80 μg/mL, moderadamente tóxica, quando os valores são

entre 80 μg/mL e 250 μg/mL e quando os valores forem acima de 250 μg/mL a substância

é considerada com baixa toxicidade ou não tóxica.

Os compostos anfifílicos da O-carboximetilquitosana testados para este bioensaio

(2-COOH-BzCMQ; BzCMQ; 4-OH-BzCMQ; 3,4-(OH)2-BzCMQ; 4-CH3O-BzCMQ; 4-CH3-

BzCMQ; 4-N,N-(CH3)2BzCMQ e O-CMQ) não apresentaram toxicidade até a CL50 1000

μg/mL.

Apesar da Artemia salina ser utilizada como um ensaio preliminar de toxicidade,

outros ensaios para confirmar tal atividade devem ser conduzidos. Ressalta-se que não

são descartados testes de toxicidade aguda em roedores a fim de confirmar a ausência

de citotoxicidade observado no modelo in vitro.

65

5.6 Ensaio de citotoxicidade e mutagenicidade em Saccharomyces cerevisiae

Outros ensaios utilizados para detecção do potencial tóxico dos compostos foram a

citotoxicidade e mutagenicidade. O primeiro tem o objetivo de avaliar a capacidade de

inviabilizar o metabolismo microbiano, enquanto que o segundo tem o propósito de avaliar

o possível dano genético causado pelos compostos na linhagem XV 185-14c de

Saccharomyces cerevisiae.

Nas tabelas 4, 5 e 6 pode-se observar que os oito compostos testados não são

capazes de induzir diretamente a mutagenicidade na linhagem XV 185-14c de

Saccharomyces cerevisiae em nenhuma das doses testadas.

Os oito compostos testados não apresentaram potencial mutagênico na

concentração máxima de 500 μg/mL (p > 0,05) sobre a linhagem testada (XV 185-14c)

mostrando que não há diferença estatística entre as médias dos compostos e as do

controle negativo.

É importante ressaltar que a partir da concentração de 125 μg/mL os compostos

testados começam a ser citotóxicos para a linhagem de Saccharomyces cerevisiae, uma

vez que diminuíram significativamente a viabilidade das células com exceção dos

compostos 2-COOH-BzCMQ, 4-OH-BzCMQ e O-CMQ os quais obtiveram significância na

concentração de 250 μg/mL.

Os resultados apresentados sugerem que os compostos não apresentam ação

mutagênica direta, mas não são descartados outros efeitos tóxicos relativo a uma possível

ação pró-mutagênica. Para uma possível confirmação desta ação sugere-se o teste de

genotoxicidade na presença de um sistema metabólico, fração microssomal (S-9) de

fígado de mamífero e outros organismos (LAMB et al., 1999).

Portanto, como foi observado neste trabalho, a ausência de indução mutagênica

direta e citotoxicidade frente a Artemia salina valorizam ainda mais os resultados obtidos

na avaliação antimicrobiana para os compostos 2-COOH-BzCMQ, 4-OH-BzCMQ e 4-

CH3O-BzCMQ, sugerindo que estes compostos possam ser empregados em bandagens

para ferimentos, contribuindo na regeneração de tecidos e cicatrizações, lesões e

queimaduras. Já a falta de toxicidade nos demais derivados tornam-os mais promissores

no que diz respeito à eficácia e segurança, podendo ser empregados na preparação de

filmes auxiliares na dissolução de compostos bioativos com efeito protetor de alimentos

66

permitindo com isto o desenvolvimento de novas pesquisas, sugerindo-se que mais

estudos com estes compostos sejam feitas a fim de elucidar o mecanismo de ação

antimicrobiano validando ainda mais as propriedades biológicas deste polímero.

67

Tabela 4: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haplóide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento (1 h) com os compostos anfifílicos 2-COOH-BzCMQ e 4-OH-BzCMQ em fase estacionária de crescimento.

Composto Tratamento (μg/mL)

Sobrevivência(%)

Revertenteshis 1/108

Sobreviventesa

Revertenteslis 1/108

Sobreviventesb

Revertenteshom 1/108

Sobreviventesa

4 NQO 1 - 354 ± 8,5c** 199 ± 15,5c** 193 ± 96,2c**PBS 0 100 ± 0,0 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 2,5 ± 0,7

25 112,5 ± 38,9c 4,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,762,25 88,0 ± 35,3 1,0 ± 1,4 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7

2-COOH-BzCMQ 125 40,5 ± 3,5 6,0 ± 1,4 0,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7250 22,0 ± 7,1* 2,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7500 9,5 ± 0,7* 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,725 98,0 ± 39,6 6,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 5,0 ± 1,4

62,25 108,0 ± 18,4 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 1,5 ± 0,74-OH-BzCMQ 125 43,0 ± 14,1 4,0 ± 1,4 2,0 ± 1,4 0,5 ± 0,7

250 24,5 ± 7,8* 6,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7500 18,5 ± 7,8* 3,5 ± 2,1 1,5 ± 0,7 2,5 ± 0,7

Legenda: Nitroquinoleína-1-óxido (4 NQO 5 μM- controle positivo); Tampão Salina Fosfato (PBS – controle negativo); a Revertentes de lócus-específico; b Revertentes de lócus não-específico; c Significância e desvio-padrão de dois experimentos independentes; Dados significativos em relação ao grupo controle negativo (PBS) * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001 no teste ANOVA (Dunnett’s Multiple Comparison Test’).

68

Tabela 5: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haplóide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento (1 h) com os compostos anfifílicos 3,4-(OH)2-BzCMQ, 4-CH3O-BzCMQ e OCMQ em fase estacionária de crescimento.


Sobrevivência(%)


Sobreviventesa


Sobreviventesb


Sobreviventesa

4 NQO 1 - 335,0 ± 28,3c** 190,5 ± 4,9c** 218,0 ± 9,9c**PBS 0 100 ± 0,0 3,5 ± 0,7 3,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7

25 95,5 ± 3,5c 10,0 ± 1,4 3,0 ± 1,4 7,0 ± 1,462,25 89,5 ± 3,5 7,0 ± 1,4 2,5 ± 0,7 5,0 ± 1,4

3,4-(OH)2-BzCMQ 125 77,0 ± 0,0* 5,0 ± 1,4 2,5 ± 0,7 3,5 ± 0,7250 67,5 ± 2,1** 4,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7500 63,5 ± 2,1** 3,0 ± 1,4 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,725 89,0 ± 4,2 3,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 3,0 ± 1,4

62,25 68,5 ± 4,9** 2,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 3,0 ± 1,44-CH3O-BzCMQ 125 56,0 ± 7,1** 2,5 ± 1,4 1,5 ± 0,7 3,5 ± 0,7

250 58,0 ± 2,8** 2,5 ± 1,4 1,5 ± 0,7 4,0 ± 1,4500 54,0 ± 5,6** 2,5 ± 1,4 0,5 ± 0,7 3,0 ± 1,425 85,0 ± 12,7 6,0 ± 1,4 3,0 ± 1,4 3,5 ± 0,7

62,25 86,5 ± 3,5 5,0 ± 1,4 2,5 ± 0,7 3,5 ± 0,7OCMQ 125 86,5 ± 3,5 3,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 3,5 ± 0,7

250 79,5 ± 3,5* 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7500 66,5 ± 3,5** 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7


69

Tabela 6: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haplóide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento (1 h) com os compostos anfifílicos BzCMQ, 4-CH3-BzCMQ e 4-N,N-(CH3)2BzCMQ em fase estacionária de crescimento.


Sobrevivência(%)


Sobreviventesa


Sobreviventesb


Sobreviventesa

4 NQO 1 - 364,0 ± 21,2c** 244,0 ± 52,3c** 392,5 ± 24,7c**PBS 0 100 ± 0,0 14,0 ± 1,4 6,0 ± 1,4 2,0 ± 1,4

25 109,5 ± 7,8c 16,0 ± 1,4 4,0 ± 1,4 1,5 ± 0,762,25 104,5 ± 4,9 16,5 ± 0,7 2,5 ± 2,1 4,0 ± 1,4

BzCMQ 125 24,0 ± 5,6** 13,0 ± 1,4 2,0 ± 1,4 3,5 ± 0,7250 14,5 ± 0,7** 12,5 ± 2,1 1,5 ± 0,7 2,0 ± 1,4500 12,5 ± 0,7** 6,5 ± 2,1 0,5 ± 0,7 1,5 ± 0,725 95,0 ± 12,7 17,0 ± 1,4 3,0 ± 1,4 2,5 ± 0,7

62,25 73,5± 10,6 14,0 ± 1,4 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,74-CH3-BzCMQ 125 55,5 ± 7,8** 11,0 ± 2,8 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7

250 37,5 ± 2,1** 7,0 ± 1,4 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7500 17,5 ± 4,9** 5,5 ± 2,1 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,725 172,0 ± 4,2** 17,0 ± 2,8 3,5 ± 2,1 4,0 ± 1,4

62,25 106,5 ± 9,2 13,0 ± 2,8 3,0 ± 1,4 3,5 ± 0,74-N,N-(CH3)2BzCMQ 125 74,0 ± 4,2 5,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 2,0 ± 1,4

250 63,0 ± 5,6** 4,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7500 26,5 ± 3,5** 3,5 ± 2,1 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7


6 CONCLUSÕES

• Dentre os derivados anfifílicos da O-carboximetilquitosana os compostos 2-

COOH-BzCMQ, 4-OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ apresentaram atividade

antibacteriana contra cepas padrão de Staphylococcus aureus e destacando

atividade também para cepas resistentes de isolados clínicos deste micro-

organismo entre as concentrações de 300 a 5000 µg/mL.

• Frente a avaliação da atividade antifúngica, observou-se que os compostos

4-OH-BzCMQ e 4-CH3O-BzCMQ inibiram o crescimento da levedura Candida

albicans com CIM de 2000 µg/mL para ambos.

• Quanto ao possível mecanismo de ação, constatou-se que os compostos

anfifílicos da O-carboximetilquitosana não atuam sobre a membrana

bacteriana nem inibindo a parede fúngica.

• Nenhum dos compostos anfifílicos da O-carboximetilquitosana testados

apresentaram citotoxicidade frente ao microcrustáceo Artemia salina até a

concentração máxima testada de 1000 µg/mL.

• No teste de mutagenicidade pode-se observar que os oito compostos

anfifílicos da O-carboximetilquitosana testados não foram capazes de induzir

diretamente a mutagenicidade na linhagem XV 185-14c de Saccharomyces

cerevisiae em nenhuma das doses testadas, entretanto apresentaram

significativa atividade citotóxica entre as concentrações de 125 e 250 µg/mL.

70

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82

Apêndice

Apêndice A - Tabela da avaliação da permeabilidade da membrana bacteriana através da condutividade elétrica.

CompostosTestados

Condutividade elétrica (µs/cm)25

µg/mL50

µg/mL100

µg/mL156,2µg/mL

312,5µg/mL

625µg/mL

1250µg/mL

2500µg/mL

5000µg/mL

2-COOHBzCMQL1 - - - 306,9 625,3 1203,3 2324 4709 9302L2 - - - 311,7 599,3 1110,7 2231 4597 8661

4-OH-BzCMQL1 - - - 70,84 129,54 246,5 365,7 898,4 1751L2 - - - 87,52 124,64 238,9 341,3 864,2 1725,4

4-CH3O-BzCMQL1 - - - 65,30 122,37 203,8 408,7 821,8 1613L2 - - - 63,94 122,27 201,1 390,8 796,9 1498,6

Polimixina BL1 80,8 126,0 267,7 - - - - - -L2 84,7 127,2 272,1 - - - - - -

Legenda: Material testado + glicose 5% (L1); Material testado + glicose 5% + suspensão bacteriana (Escherichia coli) incubado por 1hora à 37ºC (L2);

Polimixina B (controle positivo).

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