UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ - siaibib01.univali.brsiaibib01.univali.br/pdf/Priscila de Oliveira...

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PRISCILA DE OLIVEIRA SCHMITT

INFLUÊNCIA DE EXCIPIENTES FARMACÊUTICOS SOBRE A

EFICÁCIA DE SISTEMAS CONSERVANTES

Itajaí

2015

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

PRISCILA DE OLIVEIRA SCHMITT



Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz Co-orientadora: Profa. Dra Ruth Meri Lucinda da Silva

Itajaí (SC)

agosto de 2015

FICHA CATALOGRÁFICA

S56i

Schmitt, Priscila de Oliveira, 1987-

Influência de excipientes farmacêuticos sobre a eficácia de sistemas

conservantes / Priscila de Oliveira Schmitt, 2015.

91f. ; il.; fig.; quad.

Anexos, Apendice

Cópia de computador (Printout(s)).

Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí,

Mestrado em Ciências Farmacêuticas.

“Orientador: Prof . Dr. Alexandre Bella Cruz ”

“Co-orientadora: Profª Drª Ruth Meri Lucinda da Silva”

Bibliografia: p. 77-84

1. Conservantes Farmacêuticos. 2. Excipientes Farmacêuticos.

3. Conservantes. 4. Eficácia – Testes. 5. Efetividade Antimicrobiana.

I. Título.

CDU: 615.1

CDU: 612.78

Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293

Dedicatória

A Deus, minha família, amigos, colegas de trabalho e orientadores

pelo apoio, força, incentivo, companheirismo e amizade.

Sem eles nada disso seria possível.

AGRADECIMENTOS

A minha família por me amparar nos momentos difíceis, me dar força para superar

as dificuldades, mostrar o caminho nas horas incertas e me suprir em todas as

minhas necessidades. O meu amor eterno.

Ao meu marido Leandro pelo amor, paciência e companheirismo que foram

fundamentais para o meu sucesso nessa caminhada.

Ao meu orientador Alexandre e co-orientadora Ruth pelos conhecimentos

adquiridos, confiança, paciência, atenção e amizade.

As professoras Tania e Angélica pelas contribuições desde o começo, quando esta

dissertação ainda era um projeto.

As minhas amigas e profissionais Daniela, Melissa, Sabrina, Amanda, Helen, Laís,

Eliziane e Ana Flávia pelo grande apoio e disposição em ajudar nessa realização.

Aos meus amigos que sempre estiveram ao meu lado nessa jornada, me apoiando e

entendendo meus momentos de ausência.

A todos os professores do mestrado que de alguma forma contribuíram para a minha

formação, em especial para a professora Rosana Bella Cruz.

Aos funcionários da UNIVALI, em especial os funcionários da secretaria e vigilantes

pelo suporte acadêmico, sempre dispostos e prestativos.

A Deus que está comigo em todos os momentos, me carregando e iluminando

quando falta forças e me protegendo todos os dias.

“Faça o melhor que puder. Seja o melhor que puder.

O resultado virá na mesma proporção do seu esforço."

Renato Russo



Priscila de Oliveira Schmitt Ago/2015

Orientador: Alexandre Bella Cruz, Doutor. Co-orientadora: Ruth Meri Lucinda da Silva, Doutora. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas. Número de Páginas: 91. Devido a natureza dos excipientes que as compõem, as formulações farmacêuticas são particularmente susceptíveis à contaminação microbiana. Falhas nas medidas preventivas e/ou de controle de processos durante a fabricação e armazenamento podem resultar em produtos inadequados ao consumo. Sabe-se que os conservantes são usados para aumentar a vida útil dos produtos, porém sua eficácia pode ser comprometida por interações com os excipientes interferindo na sua solubilidade e/ou disponibilidade, fazendo com que sua concentração não alcance a ação antimicrobiana desejada. O presente estudo teve como objetivo avaliar a influência de excipientes farmacêuticos na eficácia dos conservantes utilizados em formulações semissólidas. A metodologia consistiu na inoculação de população conhecida de cinco suspensões diferentes de micro-organismos patogênicos, em misturas com os excipientes óleo de rícino hidrogenado polietoxilado [ALKEST® CSO 400 H (A)], polissorbato [Tween® 80 (T)], carboximetilcelulose sódica (CS) e goma xantana (GX), todos em diferentes concentrações com a mesma quantidade pré-fixada de sistemas conservantes metilparabeno (M), Phenonip® (P), Verstatil® BP (BP) e Verstatil® PC (PC). Após a análise da eficácia das misturas excipiente-conservante, os conservantes foram adicionados em micro e namoemulsão. Os estudos de influência dos tensoativos não iônicos A e T na ação antimicrobiana dos sistemas conservantes mostraram que o M e o P foram inativados independente da concentração, o BP foi eficaz em todas as condições testadas, exceto para Candida albicans a 40 g/L, enquanto PC se mostrou eficaz somente para o Aspergillus niger, C. albicans e Escherichia coli. Os sistemas conservantes foram eficazes frente ao fungo e a levedura quando na presença de CS, porém sem eficácia frente à Staphylococcus aureus. Os conservantes incorporados em GX também foram eficazes para o fungo e a levedura e, na presença das bactérias, os conservantes P e PC foram inativados. Os conservantes M e BP incorporados em formulações nanoemulsionadas foram eficazes somente para o A. niger. O sistema conservante P mostrou-se eficaz quando incorporado nas formulações, exceto para C. albicans. Os resultados demonstram que embora a ação conservante esteja descrita na literatura, o potencial de inativação mostrou depender do tipo de excipiente, da composição dos sistemas conservantes, da proporção entre excipiente e conservante e da disponibilidade destes na formulação. Palavras-chave: Conservantes. Controle de qualidade microbiológico. Teste de

Eficácia.

THE INFLUENCE OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS ON THE

EFFECTIVENESS OF PRESERVATIVE SYSTEMS.

Priscila de Oliveira Schmitt Aug/2015

Supervisor: Alexandre Bella Cruz, Doctor. Co-supervisor: Ruth Meri Lucinda da Silva, Doctor. Concentration Area: Natural Products and Bioative Synthetic Substances. Number of pages: 91. Due to the nature of the excipients that compose them, pharmaceutical formulations are particularly susceptible to microbial contamination. Failures in preventive measures and/or process control during manufacture and storage can result in products that are unfit for consumption. It is known that preservatives are used to increase the shelf life of products, but their effectiveness can be compromised by interactions with excipients that interfere in their solubility and/or availability, so that their concentration does not achieve the desired antimicrobial effect. This study aimed to evaluate the influence of pharmaceutical excipients in the effectiveness of preservatives used in semi-solid formulations. The methodology consisted of inoculating the known population with suspensions of five different pathogenic micro-organisms, in mixtures with the excipients polyethoxylated hydrogenated castor oil [ALKEST® CSO 400 H (A)], polysorbate [Tween® 80 (T)], carboxymethylcellulose sodium (CS) and xanthan gum (GX), all at different concentrations with the same prefixed amount of preservative systems methylparaben (M), Phenonip® (P) Verstatil® BP (BP) and Verstatil® PC (PC). After analyzing the efficacy of the excipient-preservative mixtures, the preservatives were added in micro and namoemulsion. Studies of the influence on the nonionic surfactants A and T on the antimicrobial action of the preservative systems showed that M and P were inactivated, independent of concentration; the BP was effective in all the tested conditions, except for Candida albicans at 40 g/L, while PC was effective only for Aspergillus niger, C. albicans and Escherichia coli. The preservative systems were effective against fungus and yeast in the presence of CS, but ineffective against Staphylococcus aureus. The preservatives incorporated into GX were also effective for fungi and yeast, and in the presence of bacteria, the preservatives P and PC had its antimicrobial actions inactivated. The preservatives M and BP incorporated into nanoemulsioned formulations were effective only for A. niger. Preservative system P was effective when incorporated into the formulations, except for C. albicans. The results demonstrate that although the preservative action is described in the literature, the potential for inactivation depended on the the type of excipient, the composition of the preservative systems, the ratio of excipient to preservative, and their availability in the formulation. Keywords: Preservatives. Microbial quality control. Challenge test.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Etapas da produção e respectivas estratégias para garantir a

qualidade microbiológica de preparações farmacêuticas..................... 26

Figura 2 Estrutura molecular dos parabenos...................................................... 32

Figura 3 Estrutura molecular do fenoxietanol..................................................... 34

Figura 4 Estrutura molecular do Tween® 80………………………………………. 41

Figura 5 Estrutura molecular da carboximetilcelulose sódica............................ 42

Figura 6 Estrutura molecular da goma xantana................................................. 42

Figura 7 Efeito da redução do crescimento microbiano em UFC/mL na

combinação entre conservante metilparabeno (M) (0,2%) e

Phenonip® (P) (0,2%) e os tensoativos não iônicos ALKEST® CSO

400 H (A) e Tween® 80 (T) nas concentrações (5, 10, 20 e 40 g/L),

frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de

incubação.............................................................................................. 58


combinação entre conservante Verstatil® BP e PC (0,5%) e os

tensoativos não iônicos ALKEST® CSO 400 H (A) e Tween® 80 (T),

nas concentrações (5, 10, 20 e 40 g/L), frente aos cinco micro-

organismos testes, após 28 dias de incubação.................................... 61


combinação entre os conservantes metilparabeno (M) (0,2%),

Phenonip® (P) (0,2%), Verstatil® BP e PC (0,5%) e

carboximetilcelulose sódica nas concentrações 2 e 4 g/L, frente aos

cinco micro-organismos testes após 28 dias de

incubação.............................................................................................. 63


combinação entre conservante metilparabeno (M) (0,2%) e

Phenonip® (P) (0,2%) e goma xantana, nas concentrações (1, 3, 5 e

7 g/L), frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de

incubação.............................................................................................. 65


combinação entre conservante Verstatil® BP e PC (0,5%) e goma

xantana nas concentrações (1, 3, 5 e 7 g/L), frente aos cinco micro-

organismos testes, após 28 dias de incubação....................................

67

Figura 12 Testes de eficácia do conservante metilparabenos (M) na

concentração de 0,2% em micro e nanoemulsão, frente aos cinco

micro-organismos testes....................................................................... 70

Figura 13 Testes de eficácia do conservante Verstatil® BP (BP) na

concentração de 0,5% em micro e nanoemulsão, frente aos cinco

micro-organismos testes....................................................................... 71

Figura 14 Testes de eficácia do conservante Phenonip® (P) na concentração

de 0,2% em micro e nanoemulsão, frente aos cinco micro-

organismos

testes.................................................................................................... 73

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Exemplos de micro-organismos e suas prováveis fontes de

contaminação........................................................................................ 26

Quadro 2 Exemplos de conservantes farmacêuticos comumente utilizados e

seus prováveis modos de ação............................................................ 29

Quadro 3 Exemplos de conservantes permitidos para produtos cosméticos

com a máxima concentração autorizada.............................................. 31

Quadro 4 Solubilidade dos parabenos em água e coeficiente de partição

óleo:água.............................................................................................. 33

Quadro 5 Alguns solventes e a solubilidade do Fenoxietanol.............................. 34

Quadro 6 Tamanho e aspecto dos componentes dos sistemas emulsionados.... 39

Quadro 7 Principais conservantes utilizados na indústria cosméticas e seus

inativantes............................................................................................. 48

Quadro 8 Condições para reconstituição das cepas de micro-organismos para

o estudo de eficácia do conservante.................................................... 49

Quadro 9 Composição das formulações emulsivas.............................................. 53

Quadro 10 Categoria de produtos e critérios para a eficácia antimicrobiana......... 54

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 21

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 23

2.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 23

2.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 23

3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 25

3.1 Contaminação microbiana ...................................................................... 25

3.2 Sistema Conservantes ............................................................................ 28

3.2.1 Parabenos ....................................................................................................... 31

3.2.2 Fenoxietanol ................................................................................................... 34

3.2.3 Outros conservantes ...................................................................................... 35

3.3 Cosméticos .............................................................................................. 36

3.4 Excipientes farmacêuticos em produtos semissólidos ................. 39

3.4.1 Tensoativos ................................................................................................. 40

3.4.2 Macromoléculas ................................................................................. 41

3.5 Interações entre conservantes e demais excipientes .................... 43

3.6 Teste de Eficácia de Conservantes – Challenge test ...................... 45

3.6.1 Micro-organismos testes ................................................................... 45

3.7 Neutralização do Sistema Conservante ........................................... 47

4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 49

4.1 Seleção de conservantes e excipientes para o estudo ....................... 49

4.2 Micro-organismos padrões..................................................................... 49

4.2.1 Preparação do inóculo ......................................................................... 50

4.2.1.1 Bactérias ...................................................................................................... 50

4.2.1.2 Fungos leveduriformes ............................................................................... 50

4.2.1.3 Fungos filamentosos .................................................................................. 50

4.3 Análise de compatibilidade entre conservantes e excipientes........... 51

4.4 Análise de eficácia dos conservantes incorporados em formulações

emulsivas (micro e namoemulsão) .............................................................. 52

4.4.1 Formulações ................................................................................................... 52

4.4.2 Inoculação dos micro-organismos padrões ................................................ 53

4.4.3 Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) ........................... 54

4.5 Categoria de produto, critérios para a eficácia antimicrobiana e

análise dos resultados .................................................................................. 54

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 57

5.1 Análises de compatibilidade entre conservantes e excipientes ........ 57

5.2 Teste de Eficácia do Sistema Conservante – Teste do Desafio ......... 68

6 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 75

REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 77

ANEXO A ................................................................................................................. 85

APÊNDICE A ............................................................................................................ 87

APÊNDICE B ............................................................................................................ 88

APÊNDICE C ............................................................................................................ 89

APÊNDICE D ............................................................................................................ 90

APÊNCIDE E ............................................................................................................ 91

21

1 INTRODUÇÃO

A qualidade microbiológica de produtos constitui um dos atributos essenciais

para o seu desempenho adequado, principalmente em relação à segurança, eficácia

e aceitabilidade. Nos últimos anos houve um crescimento na fabricação de produtos

farmacêuticos, com ênfase para os cosméticos e medicamentos, sendo uma das

razões o aumento da expectativa de vida da população, o que tem levado ao maior

consumo de produtos cosméticos, bem como de medicamentos. Outro fator

relevante é o aumento do consumo dos produtos farmacêuticos por uma maior

parcela da população brasileira (DANA, 2013).

O aumento do consumo e consequente crescimento dos setores de

cosméticos e medicamentos demanda maior cumprimento, pelo setor produtivo, das

boas práticas de fabricação e atendimento às especificações de qualidade a fim de

garantir a qualidade, segurança e eficácia do produto final, o que muitas vezes exige

contínua inovação e investimento no desenvolvimento de novos insumos e

processos (LIZÁRRAGA, 2014).

Falhas nas medidas preventivas e de controle de processos de fabricação

podem resultar em produtos inadequados ao consumo. A contaminação microbiana

tem sido um dos problemas mais importantes da indústria cosmética, pois estes

produtos são reconhecidos por serem substratos para a sobrevivência e

desenvolvimento de uma ampla variedade de micro-organismos, já que possuem

alguns nutrientes que facilitam o crescimento (MOAT; FOSTER, 1988; YAMAMOTO

et al., 2004; HERRERA, 2004). As principais fontes de contaminação microbiana são

a água e as matérias-primas de origem natural. A água é muitas vezes a matéria-

prima utilizada em maior volume na produção cosmética (PARKER, 2005; PAYNE,

2007; ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014).

No processo de fabricação de formulações semissólidas deve haver o

cumprimento das Boas Práticas de Fabricação (BPF), para que sejam fabricados de

forma consistente com a qualidade apropriada para minimizar a possibilidade de

contaminação (RODFORD, 1997; PINTO; KANEKO; OHARA, 2003; PARKER, 2005;

VILLANOVA; SÁ, 2009). Esses produtos precisam ser preservados com a presença

de conservantes que aumentam a vida útil dos produtos, impedindo o

desenvolvimento de bactérias, fungos filamentosos e leveduriformes que podem

22

causar doenças ou simplesmente produzir enzimas oxidativas e/ou hidrolíticas

capazes de promover modificações nas características físicas, químicas e

farmacológicas (CAVALCANTI, 2008).

Há muitos fatores relacionados às formulações que afetam a ação do

conservante, como o pH do produto, a absorção pelo material de acondicionamento,

o coeficiente de partição, a presença de tensoativos e agentes umectantes, a

temperatura de fabricação e estocagem, que podem afetar a concentração inicial do

conservante (SANTOS, 2007).

Em função desses fatores, torna-se imprescindível que o teste de eficácia de

conservante seja seguido para cada tipo de formulação com a finalidade de

assegurar a confiabilidade e um menor índice de contaminação microbiana. Neste

contexto, os testes poderão ser estabelecidos com base na Farmacopeia Brasileira

(BRASIL, 2010), que descreve os parâmetros e os micro-organismos que devem ser

utilizados no teste.

Desse modo, o objetivo do presente trabalho foi conhecer as concentrações

de excipientes (Alkest®, Tween® 80, carboximetilcelulose sódica e goma xantana)

que afetam a atividade dos agentes antimicrobianos (parabenos e livre de

parabenos) bem como as possíveis interações entre conservantes e outros

componentes de formulações farmacêuticas semissólidas (micro e nanoemulsões).

23

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Estudar a influência de excipientes farmacêuticos na eficácia dos

conservantes (parabenos e livres de parabenos) utilizados em formulações

semissólidas.

2.2 Objetivos Específicos

- Identificar o efeito de tensoativos não iônicos (ALKEST® CSO 400 H e

Tween® 80) na eficácia dos conservantes com parabenos (metilparabeno e

Phenonip®) e livres de parabenos (Verstatil® BP e PC);

- Identificar o efeito entre conservantes parabenos (metilparabeno e

Phenonip®) e livres de parabenos (Verstatil® BP e PC) e macromoléculas (goma

xantana e carboximetilcelulose sódica);

- Realizar teste de eficácia dos conservantes em formulações emulsivas

(micro e nanoemulsão).

25

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Contaminação microbiana

A contaminação microbiana tem sido um dos problemas mais importantes da

indústria cosmética, pois estes produtos são reconhecidos por serem substratos

para a sobrevivência e desenvolvimento de uma ampla variedade de micro-

organismos, já que possuem alguns nutrientes que facilitam o crescimento, tais

como: lipídios, polissacarídeos, álcoois, proteínas, aminoácidos, glicosídeos,

esteroides, peptídeos e vitaminas. Bactérias, bolores e leveduras são capazes de se

multiplicarem em produtos farmacêuticos aquosos quando as condições adequadas

de oxigenação, valor de pH, temperatura, grau osmótico, atividade superficial,

perfume, óleos essenciais estão disponíveis (HERRERA, 2004; MOAT; FOSTER,

1988).

O controle de qualidade para produtos não estéreis deve assegurar que a

carga microbiana presente, tanto no aspecto qualitativo quando no quantitativo, não

comprometa a qualidade final do cosmético e a segurança do usuário. Cargas

microbianas elevadas comprometem a estabilidade do produto, uma vez que o

fármaco pode ser degradado, o pH da formulação pode ser alterado e a aparência

pode ser prejudicada (VILLANOVA; SÁ, 2009).

Morse, et. al. (1967) já afirmava que um produto contaminado por micro-

organismos apresenta um risco potencial à qualidade do produto e à saúde do

consumidor. A contaminação acarreta, entre outras alterações, a separação das

fases emulsionadas, mudança de coloração, pois alguns micro-organismos

produzem pigmentos ou ácidos que alteram o pH e afetam os próprios pigmentos

adicionados à formulação, formação de odores, em virtude da produção de

compostos sulfurados responsáveis pelo odor desagradável e liberação de gases,

em função do metabolismo microbiano.

Para atingir um nível aceitável e seguro de qualidade microbiana nos produtos

cosméticos é imprescindível possuir o conhecimento das fontes e mecanismos

responsáveis por esta contaminação (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE

COSMETOLOGIA, 2014). Os micro-organismos constituem uma parte integrante do

nosso ambiente e podem ser encontrados no ar, no solo e na água (PARKER,

26

2005). Muitos fatores contribuem para o grau de contaminação presente em

preparações farmacêuticas, desde a matéria-prima até o envase do produto final. No

quadro 1 e na figura 1 estão listados os micro-organismos mais comumente

relacionados como fonte de contaminação e aspectos da manufatura higiênica.

A fonte de contaminação da matéria-prima depende da sua origem.

Clostridium spp são encontradas em talcos, a Salmonella spp e Coliformes em

produtos de origem animal e vegetal.

Quadro 1: Exemplos de micro-organismos e suas prováveis fontes de contaminação.

Micro-organismos Fonte de contaminação

Pseudomonas spp, Xantomonas spp, Flavobacterium

spp, Achromobacter.

Água

Esporos de fungos Penicillium spp, Mucor spp,

Aspergillus spp, leveduras. Esporos bacterianos:

Bacillus spp, e Micrococos.

Ar

Clostridium spp; Salmonella spp; Coliformes. Matéria-prima

Coliformes, Staphylococcus spp, Streptococcus spp Pessoal

Fonte: PARKER, 2005.

Figura 1: Etapas da produção e respectivas estratégias para garantir a qualidade microbiológica de preparações farmacêuticas.

Fonte: PARKER, 2005.

27

A capacidade do micro-organismo promover o processo de deterioração

depende da sua capacidade em produzir enzimas adequadas, e o risco maior, no

caso de produtos cosméticos, reside na extrema versatilidade de rotas bioquímicas

dos micro-organismos, possibilitando a síntese de enzimas degradativas.

Dependendo da natureza das moléculas, das características do produto, do número

e tipo de organismos, o processo degradativo pode demandar horas, meses ou

mesmo anos (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).

Diversos estudos da década de 60 e 70 relataram o isolamento de micro-

organismos patogênicos em matérias-primas e produtos manufaturados

farmacêuticos. Esses estudos mostraram a necessidade de um melhor controle de

qualidade microbiológica, que durante o processo de fabricação do produto deve ser

executado com o cumprimento das Boas Práticas de Fabricação (BPF), enfatizando

o princípio de que os produtos sejam fabricados de forma consistente com a

qualidade apropriada para minimizar a possibilidade de contaminação. O uso pode

contribuir para o crescimento microbiano no produto, quando a forma de

administração e armazenamento incorretos pelo consumidor (PARKER, 2005;

PINTO; KANEKO; PINTO, 2015; RODFORD, 1997; VILLANOVA; SÁ, 2009).

As regulamentações acerca das BPF são estabelecidas pelas agências

regulatórias, como a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para

assegurar que padrões mínimos de qualidade sejam seguidos na produção de

produtos farmacêuticos. As empresas brasileiras devem atender os requisitos legais

estabelecidos pelas RDC 48/2013 (cosméticos e produtos de higiene), RDC

67/2007 e RDC 87/2008 (BPM em farmácias magistrais) e RDC 17/2010

(medicamentos) incluindo todo o processo produtivo de controle de qualidade,

sistema de água, produção, envase, entre outros (BRASIL, 2013; BRASIL, 2007;

BRASIL, 2008; BRASIL, 2010).

As principais fontes de contaminação microbiana são a água e as matérias-

primas de origem natural. A água é muitas vezes a matéria-prima utilizada em maior

volume na produção cosmética, contaminando o produto diretamente da água de

processo ou indiretamente através da limpeza ou por contaminação cruzada das

áreas molhadas de pisos, pias e ralos dos equipamentos utilizados durante o

processo (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014; PARKER,

2005; PAYNE, 2007). Micro-organismos que podem ser isoladas a partir de sistemas

de água industrial são do tipo Pseudomonas, Achromobacter ou Alcaligenes

28

(PARKER, 2005; ONADIPE, 2007). As formulações como emulsões, géis,

suspensões ou soluções são mais suscetíveis à contaminação por conter água em

sua formulação (ANVISA, 2004).

As matérias-primas constituídas de pó sintético, geralmente possuem uma

baixa contaminação, porém aquelas de origem natural podem conter elevadas

cargas microbianas, necessitando de tratamento prévio reduzir ou eliminar estar

contaminação (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015; PARKER, 2005). Outros aspectos

podem tornar as condições ideais para o crescimento microbiano em formulações

farmacêuticas, como pH neutro (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).

Com o conhecimento dos fatores envolvidos na contaminação microbiana, é

possível obter uma proteção adicional mediante a inclusão de conservantes na

formulação como uma forma de combater o crescimento de micro-organismos no

produto (PARKER, 2005; PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).

3.2 Sistema Conservantes

Um agente antimicrobiano corresponde a um produto químico natural ou

sintético que mata ou inibe o crescimento de micro-organismos. Agentes que matam

organismos são denominados de biocidas. Agentes que não matam, mas apenas

inibem o crescimento, são denominados de biostáticos (MADIGAN; MARTINKO;

PARKER, 2004).

Os conservantes utilizados em cosméticos são substâncias empregadas para

prevenir a contaminação microbiana (agentes biostáticos) e manter a integridade do

produto farmacêutico durante o período de vida útil ou de prateleira, bem como na

fase de sua utilização pelo consumidor, além de proteger o consumidor de uma

potencial infecção. Esta prevenção é importante, pois o cosmético entra em contato

constante com o ambiente e a pele humana (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE

COSMETOLOGIA, 2014; SOUZA; OHARA; SAITO, 1994; VARVARESOU et al.,

2009).

Os conservantes interferem no crescimento microbiano, na multiplicação e no

metabolismo por meio de um ou mais dos seguintes mecanismos (ALLEN JUNIOR;

POPOVICH; ANSEL, 2013):

- modificação da permeabilidade da membrana celular e perda dos

constituintes da célula (lise parcial);

29

- lise e ruptura citoplasmática;

- coagulação irreversível dos constituintes citoplasmáticos (precipitação de

proteínas);

- inibição do metabolismo celular, como a interferência em sistemas

enzimáticos ou a inibição da síntese da parede celular;

- oxidação dos constituintes celulares;

- hidrólise.

No Quadro 2 são apresentados exemplos de conservantes e seus prováveis

mecanismos de ação.

Quadro 2 – Exemplos de conservantes farmacêuticos comumente utilizados e seus prováveis modos de ação.

Conservantes Prováveis modos de ação

Ácido benzoico,

Ácido bórico,

p-hidroxibenzoatos

Desnaturação de proteínas

Fenois e compostos fenólicos clorados

Ação lítica e desnaturação sobre

membranas citoplasmáticas e para os

conservantes clorados, também pela

oxidação de enzimas

Álcoois Ação lítica e desnaturação de membrana

Compostos quaternários Ação lítica sobre as membranas

Fonte: ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013.

As preparações líquidas e semissólidas que oferecem excelente meio de

crescimento para micro-organismos são na maioria aquosas, necessitando, portanto,

de um sistema conservante para garantir a estabilidade e segurança das fórmulas

farmacêuticas não estéreis (ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013; PINTO;

KANEKO; PINTO, 2015).

Os conservantes possuem grupos funcionais reativos que precisam ser

considerados quando forem utilizados na formulação do produto cosmético. É

necessário um conhecimento de todos os componentes do produto e por estudos de

pré-formulação apropriados para determinar a propensão de interação e seleção do

sistema conservante (ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013; ELDER;

CROWLEY, 2012).

30

A correta escolha do conservante visando garantir que a formulação seja um

“ambiente hostil” aos micro-organismos é baseada em alguns fatores. O tipo de

preparação e a eficácia exigida do sistema de conservação são os critérios

primários. Outros aspectos devem ser considerados durante a formulação como a

contaminação mais frequente, solubilidade em água para atingir a concentração

adequada na fase aquosa de um sistema com duas ou mais fases, a proporção de

conservante que permanece não dissociada no pH da formulação, a concentração

necessária para não afetar a segurança e o conforto do usuário, a estabilidade

durante o prazo de validade da preparação, a compatibilidade com todos os

componentes da formulação e sua interação com a embalagem do produto acabado

(DOORNE, 2007; VILLANOVA; SÁ, 2009; ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL,

2013).

Na escolha do conservante um aspecto a ser considerado é a

regulamentação do uso de substâncias de ação conservante permitidas (Quadro 3).

No Brasil, a lista de conservantes permitidos para produtos de higiene pessoal,

cosméticos e perfumes consta na Resolução RDC 29 de 1º de junho de 2012. A

regulamentação varia de país para país como por exemplo na comunidade europeia

é a diretiva para cosméticos 76/768 EEC que apresenta as mais de 60 substâncias

ativas. O Japão é o país com lista mais restritiva (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE

COSMETOLOGIA, 2014).

Apesar de muitas desvantagens aparentes, a utilização de conservantes

químicos permanece durante o tempo e é a única forma eficaz de garantir a

qualidade microbiológica de preparações farmacêuticas ao longo da vida de

prateleira e utilização. É importante entender os fatores que afetam a atividade de

agentes antimicrobianos, como o pH da formulação e conhecer as possíveis

interações entre conservantes e outros componentes de formulações farmacêuticas

(DOORNE, 2007). Se os componentes da formulação interferirem na solubilidade ou

na disponibilidade do conservante, sua concentração química pode se tornar

ineficaz, uma vez que não é a medida verdadeira da concentração efetiva (ALLEN

JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013).

31

Quadro 3 – Exemplos de conservantes permitidos para produtos cosméticos com a máxima concentração autorizada.

Conservante Máxima concentração autorizada

2-metil-4-isotiazolina-3-ona

(metilisotiazolinona) 0,01%

1,3-Dimetilol-5,5- dimetilhidantoína

(DMDM hidantoína) 0,6%

2-Fenoxietanol (fenoxietanol) 1,0%

Ácido 4-hidroxibenzoico, seus sais e

ésteres (parabenos)

0,4% (expresso como ácido) individual;

0,8% (expresso como ácido) para

misturas de sais ou ésteres.

Imidazolinidil ureia 0,6%

Ácido benzoico e respectivo sal de sódio

(benzoato de sódio) 0,5%

Fonte: ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014; BRASIL, 2012.

3.2.1 Parabenos

Os parabenos estão entre os conservantes mais usados em produtos

cosméticos (FDA, 2007). Quimicamente, são ésteres de alquil de ácido para-

hidrobenzoico, inodoros, incolores e insípidos (Figura 2) (FIB, 2011). As

regulamentações do Brasil, RDC 29/2012 permite o uso de no máximo 0,4% de cada

parabeno e um máximo de 0,8% de parabeno total, no produto cosmético (BRASIL,

2012). Uma gama de produtos pode conter parabenos, que incluem as maquiagens,

hidratantes, produtos para o cabelo, produtos de barbear, entre outros (FDA, 2007).

Os parabenos incluem metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno,

butilparabeno, isopropilparabeno, isobutilparabeno e benzilparabeno (Figura 2). Os

parabenos são eficazes em várias faixas de pH e possuem um largo espectro de

ação antimicrobiana, embora sejam mais eficazes contra bolores e leveduras. Eles

também são mais ativos contra bactérias Gram-positivas do que contra as bactérias

Gram-negativas (ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009).

Podem ser encontrados no mercado na forma isolada como Nipagin®,

Nipasol®, Phenonip®, Phenova®, entre outros.

32

Figura 2: Estrutura molecular dos parabenos.

Fonte: CEZAR, 2014.

A atividade antimicrobiana é proporcional ao comprimento da cadeia do grupo

alquil, característica esta indesejável do ponto de vista de solubilidade em água. Por

esta razão, os ésteres de ácido p-hidroxibenzoico de peso molecular menor são os

mais utilizados. Já a ligação éster é estável à hidrólise em temperatura de

esterilização, característica desejável (LÜCK; JAGER, 2000; FIB, 2011). Também,

como no caso do fenol, os ésteres de ácido p-hidroxibenzoico podem ser ligados em

proteínas, emulsionantes e outros componentes do produto devido ao grupo OH

fenólico e assim, ser inativado (LÜCK; JAGER, 2000).

O mecanismo de ação dos parabenos é corresponde em princípio pelo fenol,

que destrui a membrana celular e desnatura as proteínas intracelulares e inibe a

absorção de nutrientes e de aminoácidos essenciais, tais como a glucose. Como não

são compostos susceptíveis a quebra, a sua ação antimicrobiana é relativamente

independente do pH do meio a ser preservado. Por isso, são superiores aos

conservantes de ácidos orgânicos (LÜCK; JAGER, 2000).

33

Quadro 4 – Solubilidade dos parabenos em água e coeficiente de partição óleo:água.

Parabeno Solubilidade Coeficiente de Partição O/A

Metil

1 em 400 a 25 ºC

1 em 50 a 50 ºC

1 em 30 a 80 ºC

Óleo de Milho – 4.1

Óleo Mineral – 0.1

Óleo de Amendoim – 4.2

Óleo de Soja – 6.1

Etil

1 em 1250 a 15 ºC

1 em 910 a 20 ºC

1 em 120 a 80 ºC





Propil

1 em 4350 a 15 ºC

1 em 2500 a 20ºC

1 em 225 a 80 ºC





Butil

1 em > 5000 a 25 ºC

1 em 670 a 80 ºC


Óleo de Amendoim – 280

Óleo de Soja – 280

Fonte: ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009.

O Cosmetic Ingredient Review (CIR) analisou a segurança de metilparabeno,

propilparabeno, butilparabeno em 1984 e concluiu que eram seguros para utilização

em produtos cosméticos em níveis de até 25%. Em 2004 foi publicado no Journal of

Applied Toxicology um estudo que detectou parabenos em tumores de mama, mas

não comprovou que os parabenos podem causar câncer e nem os seus níveis em

tecidos normais (FDA, 2007).

Um parecer de 2008 sobre parabenos a partir do Comitê Científico da

Comissão Europeia dos Produtos de Consumo afirma que "metilparabeno e

etilparabeno não são preocupantes", mas que "a avaliação da segurança de propil e

butilparabeno necessitam de mais estudos” (DAWSON, 2011).

Segundo o FDA, os resultados da investigação que indicam uma possível

conexão entre parabenos e câncer não são conclusivos, e que mais pesquisas

precisam ser realizadas (FDA, 2007).

34

3.2.2 Fenoxietanol

O Fenoxietanol é um líquido incolor, ligeiramente viscoso (Figura 3). Sua

atividade antibacteriana é eficaz numa ampla faixa de pH contra estirpes de

Pseudomonas aeruginosa e em menor medida para outros organismos gram-

negativos. É mais frequentemente utilizado em combinação com outros agentes de

conservação, tais como parabenos, para se obter um espectro mais amplo de ação

antimicrobiana.

As regulamentações do Brasil, RDC n. 29/2012 permite o uso em formulações

farmacêuticas para aplicação tópica, a uma concentração entre 0,5 - 1,0% (BRASIL,

2012). Possui solubilidade por vários agentes como descritos no Quadro 5.

Figura 3: Estrutura molecular do Fenoxietanol.


Quadro 5 – Alguns solventes e a solubilidade do Fenoxietanol

Solvente Solubilidade em 20 ºC

Acetona Miscível

Etanol (95%) Miscível

Glicerina Miscível

Isopropil 1 em 26

Óleo Mineral 1 em 143

Óleo de Oliva 1 em 50

Óleo de Amendoim 1 em 50

Água 1 em 43


35

3.2.3 Outros conservantes

O ácido benzoico é amplamente utilizado em alimentos, cosméticos, e

produtos farmacêuticos, como um conservante antimicrobiano. A grande atividade

em valores de pH entre 2,5-4,5. Apenas o ácido não dissociado mostra propriedades

antimicrobiana, pois é desta maneira que possui a capacidade de penetrar através

da parede celular e sua ação depende do pH do meio. Apresenta moderada

atividade bacteriostática contra a maioria das espécies de bactérias Gram-positivas

e menos contra bactérias Gram-negativas (LUCK; JAGER, 2000; ROWE; SHESKEY;

QUINN, 2009).

A ação antimicrobiana do ácido benzoico é baseada em várias intervenções

sobre o sistema enzimático das células dos micro-organismos. Em muitas bactérias

e leveduras, por exemplo, as enzimas que são inibidas controlam o metabolismo do

ácido acético e a fosforilação oxidativa (LUCK; JAGER, 2000).

O ácido bórico é utilizado como um conservante antimicrobiano, em gotas

para os olhos, produtos cosméticos, pomadas e cremes tópicos. Em concentrações

diluídas é utilizado como um antisséptico suave, com fraca propriedade

bacteriostática e fungistática. É incompatível com água, bases fortes e metais

alcalino. Reage violentamente com anidridos de ácido e de potássio. Isto também

forma um complexo com a glicerina, que é um ácido mais forte do que ácido bórico

(ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009). Atua bloqueando as enzimas do metabolismo do

fosfato. Por sua constante de dissociação ser mais baixa que o restante dos

conservantes, o Ácido bórico se encontra quase exclusivamente não dissociado

(LUCK; JAGER, 2000).

O fenol é utilizado em formulações farmacêuticas tópicas e cosméticas. É

largamente utilizado como um anti-séptico, desinfetante e agente terapêutico.

Apresenta atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas e Gram-

positivas, fungos e vírus. Em soluções aquosas de concentração 1% são

bacteriostáticos, enquanto em soluções mais fortes são bactericidas. Possui maior

atividade em soluções ácidas; o aumento da temperatura também aumenta a

atividade antimicrobiana e é inativado pela presença de substâncias orgânicas

(ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009).

36

3.3 Cosméticos

Cosméticos são preparações constituídas por substâncias naturais ou

sintéticas, de uso externo nas diversas partes do corpo humano, pele, sistema

capilar, unhas, lábios, órgãos genitais externos, com o objetivo exclusivo ou principal

de limpá-los, perfumá-los, alterar sua aparência e ou protegê-los ou mantê-los em

bom estado. Entre os produtos incluídos nesta definição são hidratantes de pele,

perfumes, batons, esmaltes de unha, maquiagens, xampus, etc (ANVISA, 2004;

FDA, 2012).

De acordo com pesquisa Pyxis Consumo, ferramenta de dimensionamento de

mercado do Ibope Inteligência, o consumo de produtos de beleza e higiene cresceu

11% em 2013 na comparação com o ano anterior. Segundo o estudo, os brasileiros

gastaram R$ 55,13 bilhões com tais produtos naquele ano (SOUSA, 2013),

tornando-se o segundo maior mercado mundial de cosméticos (DINARDO, 2013).

O Brasil possui 2.412 empresas atuando no mercado de produtos de higiene

pessoal, perfumes e cosméticos, de acordo com a Abihpec dessas, 20 são

empresas de grande porte, a maioria delas multinacionais, com vendas líquidas

acima de R$ 100 milhões, representando 73% do volume de negócios total do setor

(SANTOS, 2014).

Algumas razões para esse excelente desempenho são o aumento da

expectativa de vida da população, o que tem levado a população a querer manter

uma aparência jovial por mais tempo e principalmente o maior acesso das pessoas

das classes C e D a esses produtos, a elevação do valor agregado médio dos

produtos adquiridos pela classe C e o incremento da produtividade e da inovação

das indústrias desse tipo, promovendo aumento da variedade de bens oferecidos

(DANA, 2013).

Os produtos cosméticos podem ser apresentados nos estados líquido,

semissólido e sólido. As emulsões semissólidas apresentam como cremes, loções e

géis (ANVISA, 2008), cada qual com características únicas e destinadas à aplicação

tópica. Elas podem ser aplicadas sobre a pele e as preparações não

medicamentosas são utilizadas devido a seus efeitos físicos como protetoras ou

lubrificantes (ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013).

Os cremes são preparações farmacêuticas semissólidas que contêm um ou

mais agentes dissolvidos ou dispersos em uma base adequada, geralmente uma

37

emulsão óleo em água. São utilizados principalmente em produtos para aplicação

tópica sobre a pele (ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013).

Os géis são sistemas semissólidos que consistem em dispersões de

pequenas ou grandes moléculas em um veículo líquido aquoso que adquire

consistência semelhante às geleias pela adição de um agente gelificante como os

derivados de celulose (carboximetilcelulose sódica) e as gomas naturais (goma

xantana) (ALLEN JUNIOR; POPOVICH; ANSEL, 2013).

A ANVISA exige que as empresas produtoras tenham implantado as normas

de boas práticas de fabricação, conforme as normas técnicas oficialmente

estabelecidas. Dentre as exigências presentes nas normas, está a necessidade da

realização de ensaios de controle de qualidade em todas as fases do processo de

fabricação. Essas normas são dinâmicas e devem ser atualizadas para acompanhar

a evolução tecnológica dos processos, novos equipamentos e gerenciamento da

qualidade (YAMAMOTO et al., 2004).

Os cosméticos, em geral, são excelentes meios para existência e proliferação

de micro-organismos, pois são fontes de elementos essenciais ao seu

desenvolvimento. As contaminações, que podem ser de origem física, química ou

microbiológica, são as principais causas de insucesso na obtenção de cosméticos de

qualidade e eficácia percebidas pelos consumidores (CROSHAW, 1977).

A atenção no controle dos produtos não estéreis assegura que a carga

microbiana presente no produto, seja no aspecto qualitativo ou quantitativo, não

comprometa a qualidade final ou a segurança do paciente (PINTO; KANEKO;

PINTO, 2015).

Com exceção das pomadas oftálmicas, as preparações tópicas não precisam

cumprir o requisito de esterilidade. Elas devem, entretanto, apresentar padrões

aceitáveis de carga microbiana, e as formulações propensas ao crescimento

microbiano devem conter conservantes (ALLEN JUNIOR; ANSEL; POPOVICH,

2007).

O setor de cosméticos é um dos setores mais dinâmicos da atualidade. Exige

uma contínua inovação e investimento constante no desenvolvimento de novos

projetos e processos, capaz de satisfazer a uma ampla gama de consumidores que

estão ansiosos por novidades (LIZÁRRAGA, 2014).

O mercado global vem passando por períodos de grandes competições

científicas e tecnológicas, principalmente após a nanociência e a nanotecnologia

38

terem sido reconhecidas como uma tendência chave na ciência do século XXI, o que

tem ocasionado um aumento nos recursos humanos e financeiros na indústria

mundial (BRUXEL et al., 2012).

A produção de cosméticos que emprega nanotecnologia, nanocosméticos,

especificamente falando, encontra-se mundialmente inserida na indústria de

cosméticos convencionais, constituindo-se em uma linha de produtos diferenciados

de base nanotecnológica, sendo geralmente classificada como um setor específico

da indústria química juntamente com os produtos de higiene pessoal e perfumaria

(FRONZA et al., 2007).

O interesse no uso da nanotecnologia aplicada a cosméticos é recente no

Brasil e vem crescendo, trazendo mais pesquisadores das principais universidades

brasileiras. Além disso, já existem empresas nacionais produtoras de matérias-

primas com base nanotecnológica (LIZÁRRAGA, 2014).

As nanoemulsões são dispersões estáveis com diâmetro médio de gota em

tamanho manométrico. Este sistema é composto por óleo, água e um ou mais

agentes surfactantes, podendo ser uma dispersão óleo em água (O/A) ou água em

óleo (A/O) (BENITA; MARTINI; SEILLER, 1996).

No setor cosmético, nanomateriais, como as nanopartículas, estão presentes

em xampus, condicionadores, cremes dentais, cremes antirrugas, cremes

anticelulites, clareador de pele, hidratantes, pós-faciais, loções pós-barba,

desodorantes, sabonetes, foto protetores, maquiagens de modo geral, perfumes e

esmaltes (FRONZA; et al., 2007).

As microemulsões são sistemas isotrópicos, transparentes, de baixa

viscosidade e termodinamicamente estáveis, obtidas quando uma mistura de

tensoativos apropriada é usada pela facilidade de aplicação e adesão na pele, como

hidratantes, preparações de protetor solar, produtos de bronzeamento, produtos

antienvelhecimento, desodorantes, perfumes, entre outros (ADNAN, et al., 2008;

NEMEN, LEMOS-SENNA, 2011; VICENTINI, 2008).

39

Quadro 6 – Tamanho e aspecto dos componentes dos sistemas emulsionados.

Denominação Tamanho (µm) Aspecto

Macroemulsão 2 - 20 Branco leitoso

Nanoemulsão 0,1 - 0,3 Branco azulado

Microemulsão < 0,1 Translúcido

Soluções micelares 0,01 Límpido

Soluções

moleculares 0,001 Límpido

Fonte: ALLEN JR.; ANSEL; POPPOVICH, 2007.

3.4 Excipientes farmacêuticos em produtos semissólidos

Os excipientes são adicionados à formulação com o intuito de facilitar a

preparação e a aceitabilidade por parte do usuário do produto e assegurar o

funcionamento da formulação. Entre os excipientes estão agentes desintegrantes,

diluentes, lubrificantes, agentes suspensores, agentes emulsionantes, flavorizantes,

corantes e estabilizantes químicos, entre outros (ASHFORD, 2005).

Para a escolha dos excipientes farmacêuticos utilizados na manipulação é

importante considerar os vários tipos de estabilidade e os fatores genéricos que

afetam a forma farmacêutica (ALLEN JUNIOR; ANSEL; POPOVICH, 2007).

Os excipientes estão incluídos nas fórmulas farmacêuticas em produtos

semissólidos assumindo a função de base carreadora de ativos, e para auxiliar na

fabricação, administração e/ou absorção e raramente possuem atividade

farmacológica (CROWLEY; MARTINI, 2001). São essenciais na produção dos

cosméticos não só porque melhoram determinadas características, como o aspecto,

o odor, o sabor ou a estabilidade, mas também porque diminuem o custo final do

produto (ALLEN JUNIOR; ANSEL; POPOVICH, 2007).

Uma ampla variedade de excipientes está disponível para a preparação de

formas farmacêuticas semissólidas. Os mais utilizados são: glicerídeos, ceras,

hidrocarbonetos, silicones polioxietilenoglicóis e homólogos, géis de produtos

minerais, bentonita e silício, géis de polímeros orgânicos, alginatos, gelose, pectina,

metilcelulose e carboximetilcelulose sódica, amido, entre outros (STORPIRTIS et al.,

2011).

40

Os excipientes podem ser classificados mediante a função que

desempenham na formulação. Os mais significativos considerando a reatividade

para a estabilidade do sistema são os tensoativos e os agentes doadores de

viscosidade, como as macromoléculas.

3.4.1 Tensoativos

Os tensoativos são substâncias que reduzem a tensão superficial da água

permitindo a formação de emulsões estáveis e a preparação de misturas uniformes

de substâncias químicas imiscíveis (VILLANOVA; SÁ, 2009).

Apesar dos tensoativos de origem natural serem preferidos aos sintéticos, por

apresentarem resultados adequados de emulsificação, agentes emulsionantes

auxiliares têm sido empregados para conferir maior estabilidade à emulsão

(MEDINA; SALVADO; DEL POZO, 2001). São amplamente empregados em

emulsões para uso externo como emulsificante o/a.

Os polissorbatos são derivados polioxietilênicos de ésteres de sorbitano. Os

tensoativos não-iônicos são substâncias sintéticas, empregados para preparação

tanto de emulsões o/a como de emulsões a/o para uso interno e externo. São

compatíveis com substâncias aniônicas e catiônicas são muito resistentes a

mudanças de pH. O tipo de emulsão formada depende do equilíbrio entre os grupos

hidrofílicos e lipofílicos, citando-se como exemplo, glicóis, ésteres de glicerol,

polissorbatos, esteres de sorbitano, entre outros (ALLEN JUNIOR; ANSEL;

POPOVICH, 2013; FERREIRA, 2002).

Os mono e diglicerídeos etoxilados possuem algumas das características dos

polissorbatos. São produzidos pela reação de um éster de glicerídeo convencional

com óxido de etileno para produzir uma estrutura que funciona de maneira

semelhante a dos polissorbatos (FERREIRA, 2002). Tensoativos não iônicos do

grupo dos poloxâmeros e polioxietileno-sorbitanos (Tweens®) têm se mostrado

promissores em combinação com os fosfolipídios, pois levam à formação de filmes

mistos compactos, conferindo maior estabilidade à formulação (BRUXEL et al.,

2012).

41

Figura 4: Estrutura molecular do Tween® 80

Fonte: PubChem

3.4.2 Macromoléculas

Os derivados da celulose, como a metilcelulose, são utilizados

extensivamente como excipientes farmacêuticos em diferentes aplicações. Podem

ser utilizados como espessantes na indústria alimentar (CALEGUER; BENASSI,

2007; ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009) e como matriz para a liberação controlada

de fármacos na indústria farmacêutica (LOPES; LOBO; COSTA, 2005). Também são

utilizados na indústria farmacêutica e de cosméticos para produção de géis

hidrofílicos, tendo um aumento na sua aplicação devido à sua fácil espalhabilidade e

por não serem gordurosos. Esses geis têm vantagens quanto a toxicidade,

biocompatibilidade, biodegradabilidade, alta estabilidade e baixo custo, além de

serem encontrados em abundância na natureza (Figura 4) (LIMA NETO; PETROVIK,

1997; ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009).

A carboximetilcelulose sódica ou carmelose é amplamente utilizada nas

formulações farmacêuticas orais e tópicas, principalmente para aumentar a

viscosidade. Soluções aquosas viscosas são usadas como estabilizantes de

emulsões de uso tópico. Também é usada em produtos cosméticos, produtos de

higiene pessoal e alimentos, sendo fortemente incompatível com soluções ácidas e

sais solúveis de ferro e outros metais tais como: alumínio, mercúrio, zinco e também

apresenta incompatibilidade com goma de xantana. (ROWE; SHESKEY; QUINN,

2009).

42

Figura 5: Estrutura molecular da carboximetilcelulose sódica.


A importância das gomas está na sua habilidade de controlar as

características reológicas (viscosidade, elasticidade e plasticidade) de sistemas

aquosos por meio de estabilização de emulsões, suspensão de partículas e controle

de cristalização (LUCCA; TEPPER, 1994).

A goma xantana (Figura 5) é amplamente utilizada na indústria de

formulações farmacêuticas orais e tópicas, cosméticos e alimentos como um agente

de suspensão e estabilização. É também utilizado como um agente espessante e

emulsificante. Não é tóxica, é compatível com a maioria dos outros ingredientes

farmacêuticos, e tem boas propriedades de estabilidade e viscosidade. A goma

xantana também tem sido utilizada como um agente de gelificação para

administração de formulações tópicas contendo nanopartículas ou microemulsão.

Este polissacarídeo é estável em uma ampla faixa de pH (pH 3-12) e temperaturas

de 10 – 60 ºC (ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009).

Figura 6: Estrutura molecular da goma xantana


43

3.5 Interações entre conservantes e demais excipientes

Vários fatores afetam a estabilidade de um produto. Variáveis relacionadas à

formulação, ao processo de fabricação, ao material de acondicionamento e às

condições ambientais e de transporte podem influenciar na estabilidade do produto

(ANVISA, 2004). Para Voigt (1982), incompatibilidades compreendem os efeitos

recíprocos entre dois ou mais componentes de uma preparação farmacêutica.

A presença de incompatibilidade deve ser investigada considerando toda

formulação (FERREIRA, 2002). As incompatibilidades podem ocorrer entre as

substâncias ativas, entre as substâncias coadjuvantes (excipientes), entre as

substâncias ativas e as coadjuvantes, ou entre uma ou outra e o material da

embalagem ou impurezas (CAVALCANTI, 2008). A instabilidade das formulações

pode ser visualmente detectada por mudanças na aparência física, na cor, no odor,

no gosto ou na textura (ALLEN JUNIOR; ANSEL; POPOVICH, 2007).

Segundo a origem e a manifestação, as incompatibilidades podem ser físicas,

químicas ou terapêuticas. As físicas se caracterizam pela não-uniformidade

classificadas como solução incompleta resultando num produto não homogêneo;

precipitação quando uma substância precipita no solvente insolúvel; separação de

líquidos imiscíveis e liquefação de ingredientes sólidos (FERREIRA, 2002).

As incompatibilidades químicas caracterizam-se pela transformação parcial ou

total das substâncias associadas, formando compostos secundários, como novas

propriedades químicas e consequentemente, novas propriedades farmacodinâmicas.

Das classes de incompatibilidades, esta é a que merece maior atenção, não só por

ser mais frequente, mas por trazer muitos prejuízos para a indústria e para o

consumidor (FERREIRA, 2002).

A eficácia do conservante pode ser comprometida por interações com

ingredientes ativos e excipientes ou outros comportamentos físico-químicos (ELDER;

CROWLEY, 2012). Com relação à característica física do produto, se solução,

suspensão ou emulsão, diversos fatores podem interferir nesta inativação,

dependendo da complexidade da fórmula. Observando primeiramente os tipos de

reação que podem ocorrer, pode-se ponderar que numa fórmula complexa como

emulsão, uma série de fatores podem anular a atividade do sistema conservante

(PINTO; KANEKO; PINTO, 2015). A estabilidade química de um fármaco pode ser

44

reduzida, caso o mesmo seja incorporado em um excipiente inadequado ou que

contenham coadjuvantes farmacotécnicos incompatíveis (FERREIRA, 2002).

Com a variedade de conservantes disponíveis e o grande número de

excipientes em uso nas formulações farmacêuticas e cosméticas, interações de

diferentes naturezas são possíveis no sentido de inativar a ação antimicrobiana do

sistema conservante (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).

Muitas das combinações incompatíveis que resultam em desativação do

conservante envolvem macromoléculas, como os diversos derivados da celulose, os

polietilenoglicois e as gomas, como a adraganta, que comprovadamente atraem e

complexam os conservantes, como os parabenos e os compostos fenólicos,

tornando-os indisponíveis para sua função. Os excipientes interferem na solubilidade

e na disponibilidade do conservante, fazendo com que sua concentração química

não seja a medida verdadeira (ANSEL; POPOVICH; ALLEN, 2000).

Os parabenos são inativados (parcialmente ou completamente) por fontes

ligantes de hidrogênio, tais como os compostos altamente etoxilados, como os

polissorbatos e outros compostos, como os derivados de celulose, proteínas e

lecitinas. Podem também ser absorvidos por muitos tipos de argilas ou compostos

semelhantes (C&P, 2007).

Segundo Schmolka (1973) diversos conservantes que apresentam

características lipofílicas, como é o caso dos parabenos tornam-se susceptíveis à

solubilização micelar por emulsificantes. Uma micela é uma agregação de moléculas

ou a formação de uma nova fase, e são obtidas quando os tensoativos se encontram

em concentração superior à concentração micelar crítica (conhecida como a CMC

concentração micelar crítica). Esta propriedade de agregação ou formação de

micelas, se reflete em alterações marcadas nas propriedades da solução, incluindo a

tensão de superficial, o índice de refração, solubilidade, condutividade elétrica, etc.

A incompatibilidade de conservantes com outros componentes da fórmula

geral é detectada durante o teste de eficácia inicial. Mudanças mais sutis podem

ocorrer lentamente e serem detectadas durante testes de estabilidade. Isto ocorre

quando os ensaios de eficácia de conservante detectam que o sistema conservante

se torna inadequado por não inativar um ou mais organismos testes com rapidez

suficiente para satisfazer os critérios de aceitação (DOORNE, 2007).

45

3.6 Teste de Eficácia de Conservantes – Challenge test

Para definir o conservante para determinada formulação, é necessário que se

faça o teste de desafio do conservante, a fim de se determinar a substância química

e a concentração mínima efetiva para garantir que o produto se mantenha sem

contaminação, conforme a legislação específica, durante sua fabricação, na

embalagem e durante sua distribuição, além de resistir a possíveis contaminações

introduzidas pelo usuário em função do mau uso (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).

O teste de desafio (Challenge Test) ou teste de eficácia de conservantes tem

como objetivo avaliar a eficácia do sistema conservante necessário à proteção

satisfatória do produto, desde a fabricação, uso pelo consumidor até o prazo final de

validade. Consiste na inoculação da amostra com a suspensão de micro-

organismos, com carga conhecida e, avaliações periódicas do número de

sobreviventes e comparação dos resultados com as especificações (ASSOCIAÇÃO

BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014; RUSSEL, 2003).

A eficácia antimicrobiana, seja ela inerente ao produto ou devida à adição de

conservantes, precisa ser demonstrada para produtos tópicos múltipla-dose;

produtos orais; oftálmicos; otológicos; nasais; fluidos de diálise; irrigação, etc

(BRASIL, 2010).

Para o propósito com o teste, os produtos são separados em 4 categorias.

Categoria 1 - Injetáveis, outros parenterais incluindo emulsões, produtos otológicos,

nasais estéreis, oftálmicos constituídos de base ou veículo aquoso; Categoria 2 -

Produtos de uso tópico. Constituídos de base, ou veículo aquoso, produtos nasais

não estéreis e emulsões, incluindo aqueles aplicados em membranas mucosas;

Categoria 3 - Produtos orais constituídos de base ou veículo aquoso, exceto

antiácidos e Categoria 4 - Antiácidos constituído de base aquosa (BRASIL, 2010).

3.6.1 Micro-organismos testes

O método da Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010) para o teste de eficácia

de conservantes recomenda que sejam utilizadas as cepas padrões dos micro-

organismos Candida albicans, Aspergillus niger, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa e Staphylococcus aureus.

46

O uso de micro-organismos-padrão permite abrangência morfológica e

metabólica de bactérias, leveduras e fungos que estão largamente distribuídos na

natureza e que tenham sido associados a problemas microbiológicos. Permite ainda

a comparação de sistemas conservantes em produtos diferentes. Isso possibilita

padronizar a potência do sistema conservante e comparar os sistemas conservantes

em produtos similares (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).

Os micro-organismos específicos foram escolhidos por serem patogênicos

conhecidos (Pseudomonas aeruginosa), indicadores de contaminação fecal

(Escherichia coli), ou indicadores de baixos níveis de higiene (Staphylococcus

aureus) (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).

Staphylococcus aureus é uma bactéria, Gram-positiva com colônias

aglomeradas em forma de cocus que se dividem em mais de um plano. Distingue-se

de outras espécies de Staphylococcus por apresentar na base das colônias

pigmentação ouro e os resultados positivos para coagulase, fermentação de manitol

e teste de desoxirribonuclease (LOWEY, 1998). São anaeróbios facultativos e

catalase positivos, não resistem ao calor. Já suas toxinas, responsável pela

síndrome do choque tóxico, uma infecção grave caracterizada por febre alta,

vômitos, algumas vezes ocasionando a morte são altamente termo-resistentes,

suportando tratamentos térmicos severos. Cresce comparativamente bem sob

condições de alta pressão osmótica e pouca umidade, o que parcialmente explica

porque podem crescer e sobreviver nas secreções nasais e sobre a pele (SILVA et

al., 2010; TORTORA et al., 2006).

A Escherichia coli é uma das espécies entéricas predominante no intestino

humano e, como parte da microbiota intestinal normal, assim como outras espécies

podem proporcionar benefícios à saúde do hospedeiro, por exemplo, prevenir a

colonização do intestino por agentes patogênicos. No entanto, existem algumas

estirpes de E. coli, por vezes referidos como enteropatogênicas, que podem causar

graves doenças diarreicas em humanos (FDA, 2012).

Pseudomonas aeruginosa é uma espécie de bactérias cuja principal

característica é a extrema versatilidade metabólica e nutricional, que permite a

utilização de uma enorme variedade de compostos orgânicos como fonte de carbono

e energia (GARRITY; BOONE; CASTENHOLZ, 2001). São bastonetes retos ou

ligeiramente curvos, Gram-negativos, não formam esporos, não toleram condições

ácidas, são catalase positivas, oxidase positivas e formam pigmentos fluorescentes;

47

podem ser encontradas na água, no solo, na poeira em suspensão, no ar e nos

vegetais, e conseguem resistir a inúmeros antisépticos e antibióticos (KIMATA et al.,

2004; PIRNAY et al., 2005).

Aspergillus niger é um membro do gênero Aspergillus que inclui um conjunto

de fungos que são geralmente considerados assexuados, embora as formas

perfeitas (formas de reprodução sexual) foram encontradas. Aspergillus são

onipresentes na natureza. Eles estão amplamente distribuídos geograficamente, e

foram observados em uma ampla gama de ambientes, pois eles podem colonizar

uma grande variedade de substratos. A. niger é comumente encontrado como um

crescente saprófita em folhas mortas, grãos armazenados, pilhas de compostagem,

e outra vegetação em decomposição. Os esporos são divulgados, e estão muitas

vezes associados com os materiais orgânicos e de solo (TSCA, 1997).

Aspergillus estão entre os fungos mais frequentemente isolados de solos. Os

esporos assexuados abundantes produzidos dentro dos conidióforos são resistentes

a muitos estresses ambientais, o que permite que o organismo sobreviva durante

períodos inativos (TSCA, 1997).

A Candida albicans é uma levedura capaz de provocar qualquer tipo de

doença, superficial, cutânea, subcutânea ou sistêmica. É encontrada no corpo

humano, como saprobiotas, em animais, em frutas etc. No ser humano torna-se

patogênica quando as condições do hospedeiro são favoráveis, pois são agentes

oportunistas. Ao exame microscópico, compõe-se de células em levedura,

unicelulares com brotamento e filamentos septados (McCULLOUGH; ROSS;

READE, 1996; MINAMI, 2003).

3.7 Neutralização do Sistema Conservante

Entende-se que no teste de eficácia de um produto cosmético um

conservante antimicrobiano específico deve ser precedido pela sua neutralizado

para recuperar os micro-organismos viáveis através de neutralizantes específicos,

bem como os meios de cultura, diluentes e diluições adequadas para a realização

das análises (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014).

Existem três métodos comuns para neutralizar as propriedades

antimicrobianas de um produto: neutralização química, diluição e filtração.

48

A inibição química de bactericidas é o método mais adequado para o teste de

eficácia antimicrobiana. A escolha da composição do inativante químico (diluente)

em testes microbiológicos depende do sistema conservante utilizado

especificamente para cada produto (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE

COSMETOLOGIA, 2014). Os inativantes para os principais conservantes são

apresentados no Quadro 7.

Quadro 7 – Principais conservantes utilizados na indústria cosméticas e seus inativantes.

Conservantes Inativantes

Parabenos polissorbato 80 3% p/v

Formaldeído histidina 0,1% p/v

Imidazolidinil ureia

Diazolinil ureia

DMDM hidantoína

histidina 0,5% p/v

Fenoxietanol polissorbato 80 2% p/v

lecitina de soja 0,3% p/v

Fonte: ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA, 2014.

49

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Seleção de conservantes e excipientes para o estudo

Foram utilizadas várias combinações de conservantes e excipientes como,

macromoléculas e tensoativos não-iônicos comumente utilizados nas formulações

semissólidas, provenientes do Laboratório de Farmacotécnica e da Farmácia Escola

da UNIVALI.

Os tensoativos não iônicos Alkest® CSO 400 H (Lote: 130817M58483) e Tween

80® (Lote: 36668), as macromoléculas carboximetilcelulose sódica (Lote: 3781*OS-

004031/F01) e goma xantana (Lote: 3959*140787) e os conservantes metilparabeno

(Lote: 3772*LG1111), Phenonip® (Lote: GBG0028130), Verstatil® BP (Lote: 406050)

e Verstatil® PC (Lote: 406570).

4.2 Micro-organismos padrões

Os micro-organismos relacionados no Quadro 8 são indicados para o estudo

de eficácia do conservante segundo a Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010) e

foram repicados partir das culturas padrões originais.

Quadro 8 – Condições para reconstituição das cepas de micro-organismos para o estudo de eficácia do conservante.

Micro-organismos Temp. de inoculação

ºC

Tempo de incubação do

inoculo (h)

Tempo de incubação para a recuperação

microbiana (dias)

Escherichia coli - ATCC 8739 32,5 ± 2,5 18 – 24 3 – 5

Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027 32,5 ± 2,5 18 – 24 3 – 5

Staphylococcus aureus - ATCC 6538 32,5 ± 2,5 18 – 24 3 – 5

Candida albicans - ATCC 10231 22,5 ± 2,5 44 – 52 3 – 5

Aspergillus niger - ATCC 16404 22,5 ± 2,5 144 – 240 6 – 10

FONTE: BRASIL, 2010.

50

4.2.1 Preparação do inóculo

4.2.1.1 Bactérias

Para o preparo dos inóculos bacterianos foram utilizadas a bactéria Gram-

positiva Staphylococcus aureus e as Gram-negativas Escherichia coli e

Pseudomonas aeruginosa.

Cada bactéria foi transferida para o meio de manutenção Mueller-Hinton

preparado conforme anexo A, e incubada a 37 ºC por 18-24 h, para assegurar

pureza e viabilidade das culturas jovens.

Foram selecionadas de 4 a 5 colônias de bactérias recém ativadas e

transferidas para tubo de ensaio com 5 mL de solução NaCl 0,86% estéril,

homogeneizado em agitador de tubos por 15 s. Ajustou-se a densidade do inóculo

por espectrofotometria a 520 nm, por comparação com a escala de 0,5 de

McFarland, para obter a concentração de aproximadamente 1,5 x 105 células/mL

(CLSI, 2009).

4.2.1.2 Fungos leveduriformes

Foi utilizado o inóculo de Candida albicans a qual foi cultivada em ágar

Sabouraud dextrosado preparado conforme anexo A, para assegurar pureza e

viabilidade das culturas jovens de 24 a 48 h a 30 ºC.

Para preparar o inóculo, foram selecionadas 5 colônias da levedura, as quais

foram suspensas em 5 mL de NaCl 0,85% estéril e homogeneizadas em agitador de

tubo por 15 s. A densidade do inóculo foi ajustada por espectrofotometria a 520 nm,

por comparação com a escala de 0,5 de McFarland, para obter a concentração de

aproximadamente 1,5 x 104 células/mL (NCCLS, 2002).

4.2.1.3 Fungos filamentosos

Para o preparo do inóculo de fungo filamentoso foram utilizadas cepas de

Aspergillus niger.

Foi mantido em ágar Sabouraud à temperatura ambiente por 7 a 10 dias para

obtenção de cultura jovem. O respectivo inóculo foi preparado removendo os

esporos do fungo a partir de cultura jovem, com auxílio de uma alça, transferidos

51

para tubo com água estéril e homogeneizado em agitador de tubos por 30 s. A

suspensão conidial foi filtrada, para remoção das hifas, novamente homogeneizada

e ajustada para 1,0 x 104 células/mL com adição de água (NCCLS, 2002).

4.3 Análise de compatibilidade entre conservantes e excipientes

Testes de compatibilidade entre conservantes e excipientes foram realizados

com base na Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010), utilizando e analisando uma

concentração pré-fixada dos conservantes com diferentes concentrações dos

excipientes individualmente.

As concentrações dos conservantes utilizadas neste estudo foram escolhidas

com base nos limites máximos de cada um e foram escolhidas as concentrações

intermediárias. Foram testados quatro tipos de conservantes: Metilparabeno (0,2%),

Phenonip® (0,2%); Fenoxietanol com Benzoato de sódio (Verstatil BP®) a 0,5% e

Fenoxietanol com Caprililglicol (Verstatil PC®) a 0,5%.

Os excipientes foram divididos em duas categorias, tensoativos não iônicos

(Tween® 80 – polissorbato 80 e ALKEST® CSO 400 H – óleo de rícino polietoxilado

hidrogenado) nas concentrações 40, 20, 10 e 5 g/L e macromoléculas (goma

xantana e carboximetilcelulose sódica) nas concentrações 1, 3. 5 e 7 g/L e 2 e 4 g/L

respectivamente. As concentrações dos tensoativos foram utilizadas a partir da

maior concentração utilizada para neutralizar a ação do conservante para a usual em

cosméticos. Já para as macromoléculas, foram utilizadas conforme a concentração

usual em cosméticos. Concentrações maiores de carboximetilcelulose sódica (4 e 6

g/L) não passaram nos testes preliminares, pois impossibilitou a homogeneização

dos micro-organismos e a retirada de alíquotas para a contagem.

Foram utilizadas as seguintes combinações:

- Conservante + excipientes + caldo nutriente;

- Conservante + caldo nutriente;

- Excipientes + caldo nutriente;

- Caldo nutriente.

Além dos conservantes e excipientes, a mistura teve como fonte de nutriente

o caldo nutriente. O pH foi ajustado para 6,9 e os meios foram esterilizados durante

15 m sob temperatura de 120 ºC e pressão de 1,3 kg/cm³.

52

As culturas de inóculo de cada um dos micro-organismos requeridos foram

inoculadas em duplicata em cada frasco estéril com tampa em três repetições (dias

alternados).

O volume de inóculo introduzido ficou entre 0,5% e 1,0% em relação ao

volume total. As combinações inoculadas foram incubadas em estufa com

temperatura a 22,5 ± 2,5 °C.

Após os intervalos de 7, 14 e 28 dias de incubação, cada frasco com amostra

inoculada foi analisado pelo método de superfície. Foram adicionados em placas de

Petri, separadamente, de 15 a 20 mL de ágar Mueller-Hinton (para bactérias) e ágar

Sabouraud dextrose (para fungo e levedura). Após a solidificação, foram

adicionados à superfície de cada meio de cultura, 50 µL do tubo de ensaio. As

placas contendo ágar Mueller-Hinton foram incubadas a 32,5 ± 2,5 °C durante 24 –

48 h para determinação do número de bactérias. As placas contendo ágar

Sabouraud-dextrose foram incubadas a 22,5 ± 2,5 °C durante 5 - 7 dias para

determinação do número de fungos e as placas contendo ágar Sabouraud-dextrose

a 30 ºC durante 24 – 48 h para determinar o número de leveduras.

Após o tempo de incubação das placas, foi determinado o número de

Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de cada amostra em cada intervalo de

tempo.

4.4 Análise de eficácia dos conservantes incorporados em formulações

emulsivas (micro e namoemulsão)

4.4.1 Formulações

Após os resultados de compatibilidade obtidos nos testes entre conservantes

e excipientes, foram escolhidos três conservantes (metilparabeno, Phenonip® e

Verstatil BP®) os quais foram incorporados em formulações emulsivas

(microemulsão e nanoemulsões) e foi verificada a eficácia dos conservantes nos

produtos finais.

As formulações emulsivas empregadas no presente estudo foram

desenvolvidas por Fischer-Muller (2013) e a composição está descrita no Quadro 9.

53

Quadro 9 – Composição das formulações emulsivas.

Excipientes Microemulsões Nanoemulsões

Micro M Micro BP Micro P Nano M Nano BP Nano P

Alkest® e

Span80® 40% 40% 40% 20% 20% 20%

Polymol® 10% 10% 10% 10% 10% 10%

Água

ultrapurificada q.s.p. q.s.p. q.s.p. q.s.p. q.s.p. q.s.p.

Metilparabeno 0,2% - - 0,2% - -

Phenonip® - - 0,2% - - 0,2%

Verstatil® BP - 0,5% - - 0,5% -

Fonte: Fischer-Muller, 2013.

Os componentes da fase oleosa (óleo, tensoativos e conservantes) e aquosa

(água) foram pesados em béquer separados e aquecidos em banho-maria (80 ºC).

Quando as fases atingiram 80 ºC, a fase aquosa foi gotejada cuidadosamente sobre

a fase oleosa sob agitação constante. Após adicionado toda a fase aquosa, a

formulação permaneceu sob agitação em banho-maria por 5 min e depois em

agitação constante até resfriar.

As formulações foram acondicionadas em frasco de plástico com capacidade

de 100 g.

4.4.2 Inoculação dos micro-organismos padrões

Em cada embalagem com tampa estéril foi inoculada uma concentração do

suficiente para se obter uma concentração final no produto 1 x 105 UFC/ mL para

cada micro-organismos requerido.

O volume de inóculo introduzido estava entre 0,5% e 1,0% em relação ao

peso total das emulsões. Foram retirados 10 g de cada embalagem para ter a

contagem do tempo zero e em seguida foram mantidas em estufa com temperatura

entre 22,5 ± 2,5°C. As emulsões foram analisadas em 7, 14 e 28 dias.

54

4.4.3 Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC)

Em cada período de amostragem, 10 g de cada emulsão foram transferidos

para 90 mL de caldo Caseina-soja (TSB) contento os inativantes Tween® 80 (30 g/L)

e lecitina de soja (3 g/L) estéril. As amostras foram homogeneizadas e 1 mL foi

inoculado pelo método de superfície, em cada meio de cultura (ágar Caseína-Soja –

TSA para bactérias e ágar Sabouraud-dextrose – SAB para fungos e leveduras). As

placas contendo TSA foram incubadas a 32,5 ± 2,5 °C durante 24 - 48 h para

determinação do número de bactérias, as placas contendo SAB a 22,5 ± 2,5 °C

durante 5 - 7 dias para determinação do número de fungos e para determinação do

número de leveduras foram incubadas contendas a 30 ºC 24 - 48 h.

Após o período de incubação, foi determinado o número de UFC/mL de cada

amostra em cada intervalo de tempo.

4.5 Categoria de produto, critérios para a eficácia antimicrobiana e análise dos

resultados

Os requisitos para a eficácia antimicrobiana do conservante foram atingidos

quando os critérios estabelecidos pela Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010) para

a categoria foram atingidos, conforme apresentado no Quadro 10.

Quadro 10 – Categoria de produtos e critérios para a eficácia antimicrobiana.

Tipo de produto Micro-

organismo

Tempo (dia)

7º 14º 28º

Categoria 2 –

Produtos de uso

tópico. Constituídos de

base, ou veículo

aquoso, produtos

nasais não estéreis e

emulsões, incluindo

aqueles aplicados em

membranas mucosas

Bactérias ---

Deve haver

redução de 2 logs

do nº de UFC

inicialmente

inoculados

Não deve haver

aumento da

contagem em

relação ao 14º dia

Bolores e

leveduras ---

Não deve haver

aumento do nº de

UFC inicialmente

inoculados

Não deve haver

aumento do nº de

UFC inicialmente

inoculados

Fonte: BRASIL, 2010.

55

A concentração de cada micro-organismo (UFC/mL) presente em cada

emulsão foi calculada e comparada com a contagem no tempo inicial. Os resultados

das mudanças das concentrações dos inóculos nos produtos foram expressos

através do valor de redução logarítmica.

57

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A qualidade microbiológica de produtos farmacêuticos constitui um dos

atributos essenciais para o seu desempenho adequado, principalmente em relação à

segurança, eficácia e aceitabilidade do produto. Neste trabalho, foi testado a eficácia

dos conservantes metilparabeno, Phenonip®, Verstatil BP® e Verstatil PC® utilizando

diferentes excipientes (ALKEST® CSO 400 H, carboximetilelulose sódica, goma

xantana e Tween® 80) para avaliar a compatibilidade entre eles através da redução

do crescimento dos micro-organismos padrões.

Os conservantes utilizados no preparo das formulações em estudo foram os

parabenos metilparabeno e uma combinação de metil, etil, butil, propil e isobutil

parabenos em fenoxietanol (Phenonip®) que são os mais utilizados em farmácias

magistrais e na indústria cosmética e fenoxietanol e benzoato de sódio (Verstatil®

BP) e fenoxietanol e caprililglicol (Verstatil® PC), uma alternativa promissora em

função da resistência ao uso dos parabenos. Para entender a interações entre os

conservantes e os excipientes, foram escolhidos para este estudo dos insumos

usualmente utilizados em formulações semissólidas.

5.1 Análises de compatibilidade entre conservantes e excipientes

A eficácia do conservante pode ser comprometida por interações

(incompatibilidade) com insumos ativos, excipientes ou outros comportamentos

físico-químicos (ELDER; CROWLEY, 2012). Com o objetivo de verificar a

interferência de excipientes farmacêuticos na atividade antimicrobiana dos

conservantes utilizados em formulações semissólidas, o presente trabalho desafiou

isoladamente os excipientes para conhecer essas interações.

A Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2010) recomenda o uso de 5 micro-

organismos teste cada um em concentração final em torno de 105 células/mL para

bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura. A contagem é realizada no 7º, 14º

e 28º dia de incubação. O conservante desafiado é considerado eficiente se após o

décimo quarto dia houver uma redução logarítmica de 2 logs do crescimento

microbiano para bactérias em comparação ao inóculo inicial e se não houver

58

aumento do número de UFC/mL em comparação com o inóculo inicial para fungos e

leveduras.

Os resultados obtidos com a contagem de micro-organismos viáveis no

estudo utilizando os conservantes metilparabeno (0,2%) e Phenonip® (0,2%) com os

tensoativos não iônicos ALKEST® CSO 400 H e Tween® 80 separadamente, são

apresentados na Figura 7.

Figura 7: Efeito da redução do crescimento microbiano em UFC/mL na combinação entre conservante metilparabeno (M) (0,2%) e Phenonip® (P) (0,2%) e os tensoativos não iônicos ALKEST® CSO 400 H (A) e Tween® 80 (T) nas concentrações (5, 10, 20 e 40 g/L), frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de incubação.

Inóculos iniciais: 105 células/mL para bactérias e 104 células/mL para fungo e levedura.

59

Na combinação de metilparabeno com 10 g/L e 5 g/L de Tween® 80 ocorreu

uma redução na contagem para a Candida albicans após 28 dias de incubação. Não

houve redução de 2 logs no crescimento microbiano para os demais micro-

organismos.

O conservante Phenonip® (mistura de fenoxietanol com metil-, etil-, propil-,

butil e isobutilparabeno) apresentou incompatibilidade frente aos tensoativos não

iônicos, pois o crescimento dos micro-organismos utilizados no teste, não foi

reduzido a 2 logs, como descritos na Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2010), pelo

contrário, o número de UFC/mL dos micro-organismos aumentou entre os dias 14º e

28º dias.

DeLuca e Kostenbauder (1960) relataram que a concentração inibidora de

dois conservantes catiônicos, cloreto de cetilpiridínio e cloreto de benzalcônio, foi

reduzida na presença de Tween® 80 com a bactéria Enterobacter aerogenes.

Corroborando com os resultados obtidos nessa pesquisa, Brown e Richards

(1964) relataram que a atividade de cloreto de benzalcônio com menor concentração

de clorexidina, foi aumentada por uma baixa concentração (0,02%) de Tween® 80,

mas que em concentração mais elevada (0,5%) eliminou completamente o efeito

antimicrobiano de ambos os conservantes. Kurup et al. (1991) apresentaram

resultados semelhantes, quando estudaram o efeito de diferentes concentrações de

Tween® 80 sobre metilparabeno, fenoxietanol, e clorocresol contra Pseudomonas

aeruginosa.

Schwarb et. al. (2001) testou a qualidade microbiológica de produtos

cosméticos encontrados no mercado Suíço. Dos 11 produtos (de cuidados da pele

suíços e formulações internacionais) da marca envolvida no surto da P. lilacinus

invasiva, 3 marcas contendo os conservantes metilparabeno, propilparabeno,

etilparabeno e fenoxietanol, não cumpriram os critérios de eficácia da preservação

antimicrobiana frente aos micro-organismos Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus, Candida albicans, Aspergillus niger.

Muitos conservantes são utilizados em preparações farmacêuticas e uma

variedade de interações ocorre entre conservantes e a fase oleosa emulsionada e as

moléculas ou micelas de emulsificantes.

Segundo Schmolka (1973) esses resultados podem ser devido ao fato de que

por diversos conservantes apresentarem características lipofílicas, como é o caso

dos parabenos, esses compostos tornam-se susceptíveis de solubilização micelar

60

por emulsificantes. Acima da concentração micelar crítica, há uma diminuição na

concentração aquosa livre de conservante e, consequentemente, uma diminuição na

atividade antimicrobiana.

Segundo o Guia ABC de microbiologia (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE

COSMETOLOGIA, 2014), os parabenos são inativados (parcialmente ou

completamente) por fontes ligantes de hidrogênio, tais como os compostos

altamente etoxilados, como os polissorbatos (Tween® 80 a 3%) e outros compostos,

como os derivados de celulose, proteínas e lecitinas e isso pode explicar os

resultados observados na Figura 7.

Os resultados obtidos com a contagem de micro-organismos viáveis neste

estudo utilizando o conservante Verstatil® BP (0,5%) frente aos dois tensoativos não

iônicos (ALKEST® CSO 400 H e Tween® 80) separadamente, foi eficaz, pois

apresentou redução logarítmica (2 logs) na contagem de micro-organismos viáveis

após 28 dias de incubação (Figura 8). O conservante Verstatil® PC na combinação

com o ALKEST® CSO 400 H foi eficaz frente ao fungo Aspergillus niger, pois

conseguiu reduzir a concentração de UFC/mL nos dias 14 e 28 em comparação ao

inoculo inicial.

Na combinação com o emulsificante ALKEST® CSO 400 H nas concentrações

testadas (5, 10, 20 e 40 g/L) o conservante Verstatil® PC (0,5%) não apresentou uma

conservação eficaz, pois houve um aumento do crescimento entre os dias 14º e 28º

de incubação dos micro-organismos Candida albicans nas concentrações 40, 20 e

10 g/L, para Escherichia coli nas concentrações 40, 20 e 10 g/L e para

Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus na concentração de 40, 20, 10 e

5 g/L (Figura 8).

Nas concentrações de 5 g/L de ALKEST® CSO 400 H com o conservante

Verstatil® PC (Figura 8) a levedura Candida albicans permaneceu com a mesma

concentração do inóculo inicial no 14º dia e reduziu 2 logaritmos no 28º dia. Já para

a bactéria Escherichia coli houve uma redução logarítmica de 2 logs no 14º dia em

relação ao inóculo inicial, mas permaneceu com a mesma contagem no 28º dia nas

concentrações de 5 e 10 g/L.

61

Figura 8: Efeito da redução do crescimento microbiano em UFC/mL na combinação entre conservante Verstatil® BP e PC (0,5%) e os tensoativos não iônicos ALKEST® CSO 400 H (A) e Tween® 80 (T), nas concentrações (5, 10, 20 e 40 g/L), frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de incubação.


O conservante Verstatil® PC (0,5%) na combinação com o tensoativo Tween®

80 na concentração de 20 g/L (Figura 8), a levedura Candida albicans permaneceu

com a mesma quantidade de UFC/mL entre o 14º e 28º dias de incubação.

O fenoxietanol (principal componente do Verstatil® BP e PC) possui um amplo

espectro de ação contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e pouca

62

eficiência para fungos. Recomenda-se a associação com outro conservante para

potencializar a ação antimicrobiana (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE

COSMETOLOGIA, 2014), confirmando o bom resultado frente aos tensoativos não-

iônicos do Verstatil® BP (associação de fenoxietanol com benzoato de sódio).

A baixa conservação antimicrobiana da associação de Verstatil® PC e o

ALKEST® CSO 400 H pode estar relacionada com a incompatibilidade do

fenoxietanol, principal agente conservante, com tensoativos não iônicos (ROWE;

SHESKEY; QUINN, 2009). O fenoxietanol no Verstatil® PC está associado com um

emoliente caprililglicol, que por si só não é considerado um conservante, mas em

conjunto com um conservante pode potencializar a ação antimicrobiana. Esta

potenciação é de maior interesse no caso dos micro-organismos mais resistentes,

como Gram-negativos e fungos (PINTO; KANEKO; PINTO, 2015).

A associação do Verstatil® PC com os tensoativos não iônicos, bem como as

outras duas associações estudadas (metilparabeno e tensoativos não iônicos;

Phenonip® e tensoativos não iônicos), apresentaram baixa conservação frente aos

micro-organismos quando comparadas à associação de Verstatil® BP e tensoativos

não iônicos.

Os resultados obtidos com a contagem de micro-organismos viáveis no

estudo utilizando os conservantes metilparabeno e Phenonip® na concentração de

0,2% e Verstatil® BP e PC na concentração de 0,5% com 2 e 4 g/L de

carboximetilcelulose estão expressados na Figura 9.

Os resultados obtidos com a contagem de micro-organismos viáveis neste

estudo utilizando o conservante metilparabeno (0,2%) e Phenonip® (0,2%) frente a

carboximetilcelulose sódica, nas concentrações de 2 e 4 g/L, apresentaram alta

compatibilidade a qual pode ser verificada pela redução logarítmica (2 logs) na

contagem de quase todos os micro-organismos viáveis após 28 dias de incubação

(Figura 9).

Para o fungo Aspergillus niger e a levedura Candida albicans houve redução

logarítmica do inóculo inicial para o 14º dia e permaneceu após 28º dias, exceto na

concentração 2 g/L com o conservante Verstatil® PC frente a levedura Candida

albicans.

63

Figura 9: Efeito da redução do crescimento microbiano em UFC/mL na combinação entre os conservantes metilparabeno (M) (0,2%), Phenonip® (P) (0,2%), Verstatil® BP e PC (0,5%) e carboximetilcelulose sódica nas concentrações 2 e 4 g/L, frente aos cinco micro-organismos testes após 28 dias de incubação.


Os resultados da combinação de 0,2% de metilparabeno com 2 g/L de

carboximetilcelulose sódica não foram satisfatórios para a bactéria Pseudomonas

64

aeruginosa na combinação de, pois não apresentaram redução logarítmica (2 logs)

na contagem de UFC/mL após 14 dias de incubação (Figura 9).

A bactéria Staphylococcus aureus foi resistente à conservação de 0,2% de

metilparabeno e Phenonip® em 2 g/L de carboximetilcelulose sódica, apresentando

redução logarítmica (2 logs) na contagem de UFC/mL no 14º dia, mas aumentou a

população microbiana após 28 dias de incubação. Os dois conservantes

(metilparabeno e Phenonip®) foram eficazes em 2 g/L de carboximetilcelulose frente

a bactéria Escherichia coli, reduzindo 2 logaritmos após 14 dias de incubação em

comparação ao inóculo inicial (105 células/mL).

Na concentração de 4 g/L de carboximetilcelulose sódica, a combinação com

0,2% de metilparabeno e Phenonip® diminuíram a quantidade de UFC/mL das

bactérias Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa em concentração ao inóculo

inicial para o 14º dia e permaneceram com a mesma quantidade após 28º dia de

incubação (Figura 9). O metilparabeno diminuiu também a quantidade de UFC/mL

da bactéria Staphylococcus aureus após 28 dias de incubação.

Muitas das combinações incompatíveis que reconhecidamente inativam os

conservantes contêm macromoléculas, incluindo vários derivados de celulose,

polietilenoglicóis e gomas naturais. Dentre essas macromoléculas, está a goma

adraganta, que pode atrair e reter alguns conservantes, como os parabenos e os

compostos fenólicos, tornando-os inaptos para realizar sua função (ALLEN JUNIOR;

POPOVICH; ANSEL, 2013).

O efeito da concentração de 2 g/L de carboximetilcelulose sódica com o

conservante Verstatil® PC não foi satisfatório, pois houve um aumento do número de

UFC/mL após 28 dias de incubação para os micro-organismos Candida albicans,

Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. O conservante Verstatil® BP

não foi satisfatório frente as bactérias Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e

Staphylococcus aureus.

A atividade do fenoxietanol (principal ativo do Verstatil® BP e PC) contra

Pseudomonas aeruginosa na presença de derivados de celulose foi estudada por

Kurup et al. (1995), onde a atividade dos conservantes, em diferentes

concentrações, foram reduzidos na presença de macromoléculas. Independente da

combinação entre os conservantes e o derivado de celulose, a interação entre eles

foi um dos mecanismos predominante para a redução da atividade. Todos os micro-

65

organismos (Staphylococcus spp, Bacillus spp e Micrococcus spp) testados por

Flores, Morillo e Crespo (1997) foram resistentes do fenoxietanol 0,4%.

Figura 10: Efeito da redução do crescimento microbiano em UFC/mL na combinação entre conservante metilparabeno (M) (0,2%) e Phenonip® (P) (0,2%) e goma xantana, nas concentrações (1, 3, 5 e 7 g/L), frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de incubação.


Já para goma xantana em todas as concentrações analisadas (1, 3, 5 e 7 g/L)

na combinação com metilparabeno (0,2%) e Phenonip® (0,2%), os micro-organismos

Aspergillus niger e Candida albicans diminuíram a quantidade de UFC/mL da

66

concentração inicial (104 células/mL) para o 14º dia e permaneceram com a mesma

quantidade de UFC/mL entre os dias 14 e 28 de incubação. (Figura 10)

Em todas as concentrações de goma xantana (1, 3, 5 e 7 g/L) na combinação

com o conservante metilparabeno (0,2%) a bactéria Escherichia coli teve redução

logarítmica (2 logs) de UFC/mL após 28 dias de incubação, portanto o conservante

foi eficaz.

A Pseudomonas aeruginosa apresentou redução logarítmica frente à goma

xantana na concentração de 1 g/L na combinação com o conservante metilparabeno

(0,2%) e para as demais concentrações (3, 5 e 7 g/L) o conservante não teve sua

ação microbiana eficaz para esta bactéria.

Na concentração de 3 g/L de goma xantana na combinação com o

conservante metilparabeno (0,2%) a bactéria Staphylococcus aureus apresentou

uma redução de 2 log da concentração inicial (105 células/mL) para o 14º dia, mas

apenas 1 log após 28 dias. Na concentração de 5 g/L houve a redução de 2 logs

após 28º dias, mostrando que o conservante foi eficaz nessas das concentrações de

goma xantana.

O conservante Phenonip® (0,2%) na combinação 1 e 5 g/L de goma xantana

(Figura 10), não apresentou uma conservação eficaz para as bactérias Escherichia

coli e Pseudomonas aeruginosa, pois não houve uma redução logarítmica de mais

de 2 logs após 28 dias de incubação. Para a bactéria Staphylococcus aureus na

concentração de 1, 3 e 5 g/L de goma xantana houve redução logarítmica de 2 logs

após 28 dias de incubação.

Segundo Doorne (2007), espessantes semissintéticos, tais como a celulose

modificada, pode diminuir a concentração de conservantes. Portanto, se aumentar a

concentração do conservante a tendência é de diminuir o crescimento dos micro-

organismos.

Os conservantes Verstatil® BP e PC (0,5%) foram eficazes para os micro-

organismos Aspergillus niger e Cadida albicans em todas as concentrações de (1, 3,

5 e 7 g/L) de goma xantana. Na concentração de 1 g/L de goma xantana (Figura 11),

houve redução do crescimento das bactérias Escherichia coli e Pseudomonas

aeruginosa no 14º dia em comparação com o inoculo inicial.

A ação antimicrobiana do Verstatil® PC não foi eficaz para as bactérias

Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, pois houve um aumento do

67

crescimento entre 14º e 28º dia de incubação dos micro-organismos nas

concentrações de 3, 5 e 7 g/L de goma xantana.

Figura 11: Efeito da redução do crescimento microbiano em UFC/mL na combinação entre conservante Verstatil® BP e PC (0,5%) e goma xantana nas concentrações (1, 3, 5 e 7 g/L), frente aos cinco micro-organismos testes, após 28 dias de incubação.


A partir dos resultados do estudo da compatibilidade entre os conservantes e

excipientes, foi verificado a eficácia dos conservantes (metilparabeno, Phenonip®,

Verstatil® BP e PC) quando misturados com a carboximetilcelulose sódica frente aos

micro-organismos, exceto para S. aureus. Já para a goma xantana, houve

resistência das bactérias Gram-negativas Escherichia coli e Pseudomonas

68

aeruginosa nas maiores concentrações de goma xantana, dificultando a

homogeneização e consequentemente a disponibilidade do conservante na

formulação.

O conhecimento detalhado de como estas interações entre os componentes

da formulação interferem na eficácia dos agentes antimicrobianos podem ser

prejudiciais à conservação do produto serve de base para um melhor cuidado no

desenvolvimento de formulações, pois esses sistemas conservantes são

amplamente empregados na manipulação de cosméticos.

Tabela 1 – Análise da compatibilidade entre conservantes (metilparabeno, Phenonip®, Verstatil® BP e PC) e excipientes (Alkest CSO 400 H®, Tween® 80, carboximetilcelulose sódica, goma xantana) em diferentes concentrações, frente aos 5 micro-organismos testes.

Excipientes Concentração Metilparabeno Phenonip Verstatil BP Verstatil PC

Alkest® CSO 400 H

5 + (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; C; E; P; S) - (A; C; E)

+ (S; P)

10 + (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; C; E; P; S)

- (A; E) + (C; S; P)

20 + (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; C; E; P; S)

- (A) + (C; E; S; P)

40 + (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; E; P; S)

+ (C) - (A) + (C; E; S; P)

Tween® 80

5 - (C) + (A; E; P; S)

+ (A; C; E; P; S) - (A; E; P; S) + (C)

- (A; E; P) + (C; S)

10 - (C) + (A; E; P; S)

+ (A; C; E; P; S) - (A; C; E; P; S)

- (A; C) + (E; S; P)

20 + (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; C; E; P; S) - (A; C)

+ (E; S; P)

40 + (A; C; E; P; S) + (A; C; E; P; S) - (A; E; P; S)

+ (C) - (A) + (C; E; S; P)

Carboximetilcelulose sódica

2 - (A; C; E) + (P; S)

- (A; C; E; P) + (S)

- (A; C; E) + (P; S)

- (A; C; E) + (P; S)

4 - (A; E; P; S) + (C)

- (A; C; E; P + (S)

- (A; C) + (E; P; S)

- (A; C; E) + (P; S)

Goma Xantana

1 - (A; C; E; P) + (S)

- (A; C; S) + (E; P)

- (A; C; E; P) + (S)

- (A; C; E; P) + (S)

3 - (A; C; E; S) + (P)

- (A; C; S) + (E; P)

- (A; C; E; P) + (S)

- (A; C; E) + (P; S)

5 - (A; C; E; S) + (P)

- (A; C; S) + (E; P)

- (A; C; E; S) + (P)

- (A; C; S) + (E; P)

7 - (A; C) + (E; P; S)

- (A; C) + (E; P; S)

- (A; C; E; S) + (P)

- (A; C) + (E; P; S)

Legenda: Aspergillus niger (A); Candida albicans (C); Escherichia coli (E); Pseudomonas aeruginosa (P); Staphylococcus aureus (S). Símbolo: (-) houve redução de 2 logs no crescimento de bactérias e não houve aumento do crescimento de fungos; (+) não houve redução de 2 logs no crescimento de bactérias e houve aumento do crescimento de fungos.

5.2 Teste de Eficácia do Sistema Conservante – Teste do Desafio

Após os resultados de compatibilidade obtidos nos testes dentre conservantes

e excipientes, foram escolhidos o Verstatil® BP por apresentar o melhor resultado

frente aos tensoativos não iônicos e as macromoléculas, o metilparabeno por ser um

69

conservante muito utilizado em cosmético e o Phenonip® por ser uma mistura de

vários conservantes, mesmo não apresentando um resultado satisfatório no teste

com os excipientes.

As formulações de microemulsões e nanoemulsões adicionadas de 0,2% de

metilparabeno, 0,2% de Phenonip® e 0,5% de Verstatil® BP foram desafiados com

cada um dos cinco micro-organismos e, em períodos de tempo pré-determinados (7,

14 e 28 dias). As amostras dessas formulações foram diluídas e inoculadas em meio

sólido para a contagem de micro-organismos viáveis presentes nas formulações.

Os resultados do teste do desafio das emulsões com os conservantes

metilparabeno, Verstatil® BP e Phenonip® podem ser observados nas Figuras 12, 13,

14.

Os inóculos microbianos (105 UFC/mL) foram obtidos a partir de uma diluição

de uma suspenção de células equivalente a escala nefelométrica 0,5 de MacFarland

(1,5 x 108 UFC/mL). Sendo assim, depois de padronizadas quanto à turbidez, foi

realizada a contagem padrão em placas a fim de verificar se a densidade da carga

microbiana estava dentro do preconizado. Analisando os resultados, foi verificado

que no tempo zero as contagens de micro-organismos estavam na ordem de 105

UFC/mL, isto é o desejável em um teste do desafio, pois desta forma se verifica a

quantidade inicial de inóculo adicionada.

No tempo zero, o contato entre o micro-organismo e o conservante presente

na formulação é muito rápido, não permitindo que ocorra uma diminuição da carga

microbiana.

De acordo com a Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010), nos critérios para

eficácia antimicrobiana, a microemulsão e a nanoemulsão enquadram-se na

categoria 2 (produtos de uso tópico, constituídos de base, ou veículo aquoso,

produtos nasais não estéreis e emulsões, incluindo aqueles aplicados em

membranas mucosas). Portanto o critério baseia-se na redução de 2 log no número

de UFC/mL inicialmente inoculados para bactérias no 14º dia, e no 28º dia a

contagem não deve aumentar em relação ao 14º dia. Já para bolores e leveduras

não deve haver aumento no número de UFC/mL inicialmente inoculados no 14º e

28º dia.

70

Figura 12 – Testes de eficácia do conservante metilparabenos (M) na concentração de 0,2% em micro e nanoemulsão, frente aos cinco micro-organismos testes.


71

Figura 13 – Testes de eficácia do conservante Verstatil® BP (BP) na concentração de 0,5% em micro e nanoemulsão, frente aos cinco micro-organismos testes.


Formulações de microemulsão e nanoemulsão, os conservantes

metilparabeno (0,2%) Verstatil® BP (0,5%) não foram eficazes, por não apresentar

redução logarítmica (2 logs) na contagem de micro-organismos viáveis após 14 dias

de incubação.

Nas emulsões, o metilparabeno (0,2%) não foi eficaz e segundo Rowe,

Sheskey e Quinn (2009), por apresentar uma atividade antimicrobiana baixa quando

72

utilizado individualmente, sua atividade pode ser melhorada através da utilização de

combinações com outros parabenos como efeitos sinérgicos. As combinações de

fenoxietanol com metil-, etil-, propil-, butil e isobutilparabeno são usados com

frequência em conjunto, como é o caso do conservante Phenonip®. Pode-se também

adicionar outros excipientes, tais como: propileno glicol (2-5%); álcool feniletílico e

EDTA.

Assim como muitos conservantes, os parabenos apresentam uma atividade

antimicrobiana reduzida na presença de alguns surfactantes não-iônicos,

usualmente utilizados em formulações de cremes (PharmaSpecial, 2004). Em

virtude da não eficácia do metilparabeno em emulsões, houve a necessidade de

testar o Phenonip® para verificar sua resposta antimicrobiana em formulações

semissólidas.

Shaqra, Al-Momani e Al-Groom (2014) inocularam Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus em cosméticos como xampu,

creme para as mãos e condicionador contendo os conservantes metilparabeno,

propilparabeno e DMDM hidantoína na concentração de 0,2% e imidazolidinil ureia

na concentração de 0,3%. Eles observaram que a bactéria Pseudomonas

aeruginosa foi resistente a todos os conservantes. As outras bactérias variaram na

sua resistência, mas a bactéria Staphylococcus aureus foi resistente ao conservante

metilparabeno e a Escherichia coli foi resistente aos dois conservantes.

Como esperado, a resistência aos conservantes variou de um micro-

organismo para outro, o que justifica a necessidade de associações de vários

conservantes.

Santos (2006) verificou a eficácia após 28 dias em creme Lanette® com a

mistura dos conservantes metilparabeno (0,2%) e propilparabeno (0,1%), quando

inoculado com as bactérias Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus.

O resultado obtido com o conservante Verstatil® BP incorporado na fase

oleosa das emulsões foi um pouco inesperado, pois se esperava um resultado de

eficácia como no estudo frente aos dois tensoativos (ALKEST® CSO 400 H e

Tween® 80) com a redução logarítmica (2 logs) na contagem de micro-organismos

viáveis após 28 dias de incubação.

73

Figura 14 – Testes de eficácia dos conservantes Phenonip® (P) na concentração de 0,2% em micro e nanoemulsão, frente aos cinco micro-organismos testes.


Parker, McCafferty, Macbride (1968) e Wallhausser (1984) relatavam uma

variedade de agentes antimicrobianos cuja interação demonstrou sinérgia, como

Phenonip®, composto por fenoxietanol com metil-, etil-, propil-, butil e

isobutilparabeno. Conservantes antimicrobianos pertencentes aos mesmos grupos

químicos são utilizados para produzir efeitos aditivos quando utilizados em

combinação. O presente estudo da eficácia do conservante frente aos excipientes e

74

incorporados em micro e nanoemulsões mostra que em ensaios simples entre

conservante e excipientes, nem sempre reproduzem os mesmos resultados em

produtos prontos para comercialização.

O conservante Phenonip® teve pouca ação frente aos excipientes quando

testado isoladamente, mas quando incorporado na microemulsão e nanoemulsão

apresentou ação antimicrobiana frente aos micro-organismos. Este resultado

corrobora com os resultados encontrados por Smaoui e Hlima (2012) que testaram o

Phenonip® em xampu para crianças frente aos micro-organismos Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e Aspergillus

niger que apresentaram eficácia após 14 dias de incubação. As combinações de

parabenos mostraram ter um efeito sinérgico sobre as bactérias como anteriormente

descritas por Doron (2001).

É importante dar atenção especial às combinações de excipientes com

conservantes e suas concentrações. Produtos cosméticos que contenham muitos

ingredientes podem ter um efeito sinérgico ou antagônico sobre o efeito dos

conservantes contra os micro-organismos (STEINBERG, 2006). A atividade do

sistema conservante deve ser testada no produto a ser preservado, pois vários

fatores, incluindo ingredientes e projeto/planejamento de formulação, podem

influenciar a ação do conservante.

Os resultados demonstram a necessidade de conhecer a eficácia dos

sistemas conservantes quando incorporados em formulações contendo excipientes

capazes de neutralizar a ação dos conservantes, pois embora sejam

incompatibilidades farmacêuticas descritas na literatura, o potencial de inativação e a

intensidade com que ocorre depende ainda do tipo de excipiente (classe química) e

dos demais componentes da formulação, da composição dos sistemas

conservantes, da proporção entre excipiente e conservante e disponibilidade destes

na formulação.

75

6 CONCLUSÕES

Os estudos de influência dos tensoativos não iônicos Alkest® e Tween® 80 na

ação antimicrobiana dos sistemas conservantes mostraram que o metilparabeno e o

Phenonip® foram inativados na presença dos tensoativos testados independente da

concentração dos mesmos.

Os dois conservantes livres de parabenos avaliados, Verstatil® BP e PC,

sofreram menor influência dos tensoativos do que os sistemas contendo parabenos.

O Verstatil® BP foi eficaz em todas as condições testadas, exceto para Candida

albicans na presença dos tensoativos a 40 g/L, enquanto Verstatil® PC, embora com

resultados melhores do que os obtidos com os parabenos, se mostrou eficaz

somente para o Aspergillus niger, Candida albicans e Escherichia coli.

Os sistemas conservantes analisados (metilparabeno, Phenonip®, Verstatil®

BP e PC) foram eficazes frente ao Aspergillus niger e Candida albicans quando na

presença de carboximetilcelulose sódica em diferentes concentrações. Frente às

bactérias a resposta conservante dependeu do micro-organismo, não sendo eficaz

na presença da bactéria gram-positiva Staphylococcus aureus.

Um comportamento semelhante de eficácia dos conservantes frente ao

Aspergillus niger e Candida albicans foi observado na presença da goma xantana.

Quando na presença das bactérias, os conservantes Phenonip®, Verstatil® PC

sofreram inativação pela goma xantana em diferentes concentrações da mesma,

enquanto o metilparabeno e o Verstatil® BP mantiveram a eficácia na maioria das

condições testadas.

Os conservantes metilparabeno (0,2%), Phenonip® (0,2%) e Verstatil® BP

(0,5%) foram incorporados em microemulsão e nanoemulsão. Todos os

conservantes mostraram eficácia frente à contaminação das formulações por

Aspergillus niger. O metilparabeno e o Verstatil® BP não foram eficazes frente à

Candida albicans, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus

aureus no teste do desafio do conservante.

O Phenonip® na concentração de 0,2% mostrou-se eficaz como sistema

conservante quando incorporado nas formulações nanoemulsionadas (micro e

nanoemulsão), mantendo a qualidade microbiológica das formulações quando

exposto aos micro-organismos testados, exceto para a Candida albicans.

77

REFERÊNCIAS

AZEEM, A.; RIZWAN, M.; AHMAD, F. J.; KHAN, Z. I.; KHAR, R. K.; AQIL, M.; TALEGAONKA, S. Emerging role of microemulsions in cosmetics. Recent Patents on Drug Delivery & Formulation, v. 2, p. 275-289, 2008. ALLEN JUNIOR, L. V.; ANSEL, H. C.; POPOVICH, N. G. Formas farmacêuticas e sistemas de liberação de fármacos. 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2007. ALLEN JUNIOR, L. V.; ANSEL, H. C.; POPOVICH, N. G. Formas farmacêuticas e sistemas de liberação de fármacos. 9. ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. ANSEL, H. C.; POPOVICH, N. G.; ALLEN JUNIOR, L. V. Desenvolvimento farmacotécnico: considerações gerais, matérias-primas e boas práticas de fabricação. In: __. Farmacotécnica: Formas farmacêuticas e Sistemas de liberação de Fármacos. 6. ed. Baltimore: Editorial Premier, 2000. Cap. 4, p. 113-174. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de estabilidade de produtos cosméticos. Brasília, 2004. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de controle de qualidade de produtos cosméticos. Brasília, 2008. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE COSMETOLOGIA. Guia ABC de microbiologia. 4. ed. São Paulo: Pharmabooks, 2014. ASHFORD, M. Biodisponibilidade: fatores físico-químico e relacionados à forma farmacêutica. In: AULTON, M. E. Delineamento de formas farmacêuticas. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. BENITA, S.; MARTINI, M. C.; SEILLER, M. Cosmetic applications of vesicular delivery systems. In: Microencapsulation: methods and industrial applications, BENITA, S. (Ed.). New York, Marcel Dekker, 1996. p. 587-631. BOLLE, A.; MIRIMANOFF, A. Antagonism between non-ionic detergentes and antiseptics. J. Pharm. Pharmacol., v. 2, p. 685-692, 1950. BRASIL. ANVISA. Farmacopéia brasileira. 5. ed. Brasília, 2010. ______. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n. 29/2012, de 1 de junho de 2012 – Estabelece a Lista de Substâncias de Ação Conservante permitidas para Produtos de Higiene Pessoal, Cosméticos e Perfumes. Disponível em: <http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/2569e7004c58f11fb8e7f8dc39d59d3e/Resolu%C3%A7%C3%A3o+RDC+N%C2%BA+29,+de+1%C2%BA+de+junho+de++2012.pdf?MOD=AJPERES> Acesso em: 31 jul. 2015. ______. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n. 48/2013, de 25 de outubro de 2013 – Aprova o Regulamento Técnico de Boas Práticas de Fabricação para Produtos de Higiene Pessoal, Cosméticos e Perfumes,

78

e dá outras providências. Disponível em: <http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/2569e7004c58f11fb8e7f8dc39d59d3e/Resolu%C3%A7%C3%A3o+RDC+N%C2%BA+29,+de+1%C2%BA+de+junho+de++2012.pdf?MOD=AJPERES> Acesso em: 31 jul. 2015. ______. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n. 67/2007, de 08 de outubro de 2007 – Dispõe sobre Boas Práticas de Manipulação de Preparações Magistrais e Oficinais para Uso Humano em farmácias. Disponível em: <https://www.farmacia.ufg.br/up/130/o/RDC_67_de_2007.pdf> Acesso em: 14 ago. 2015. ______. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC n. 87/2008, de 21 de novembro de 2008 – Altera o Regulamento Técnico sobre Boas Práticas de Manipulação em Farmácias. Disponível em: < http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2008/res0087_21_11_2008.html> Acesso em: 14 ago. 2015. _______. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 17/2010, de 16 de abril de 2010 – Dispõe sobre as Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos. Disponível em: < http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2010/res0017_16_04_2010.html> Acesso em: 14 ago. 2015. BROWN, M. R. W; RICHARDS, R. M. E. Effect of polysorbate (Tween 80) on the resistance of Pseudomonas aeruginosa to chemical inactivation. J. Pharm. Pharmacol., v. 16, p. 51-55, 1964. BRUXEL, F.; LAUX, M.; WILD, L.B.; FRAGA, M.; KOESTER, L.S.; TEIXEIRA, H. F. Nanoemulsões como sistemas de liberação parenteral de fármacos. Quim. Nova, v. 35, n. 9, p. 1827-1840, 2012. CALEGUER, V. F.; BENASSI, M. T. Effect of adding pulp carboxymethyl celulose and arabic gum to sensory characteristics and acceptance of powdered orange-flavored refreshments. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 27, p. 270-7, 2007. CAVALCANTI, L. C. Incompatibilidade farmacotécnica: Motivo, recomendação e uso terapêutico. 2. ed. São Paulo: Pharmabooks, 2008. CEZAR, J. Separação Simultânea: Fenoxietanol e Parabenos.18 set. 2014. Disponível em: <http://www.saasambiental.com.br/blog/juliocezarsary,iso17025,LIMS,laboratorio,incertezademedicao/merck/> Acesso em: 1 jun. 2015. CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, Approved Standard M07 – A8. CLSI, Wayne, PA, 2009. C&P; COSMÉTICOS & PERFUMES. Conservantes. Cosméticos & Perfumes, n. 43, p. 28-52, 2007.

79

CROSHAW B. Preservatives for cosmetics and toiletries, J. Soc. Cosmet. Chem., v. 28 p. 3-16.,1977. CROWLEY, R.; MARTINI, L. Excipient interactions. Pharmaceutical Technology, v. 13.3, p. 26, mar. 2001. DANA, S. Cosméticos no Brasil. Folha de São Paulo, 29 maio 2013. Disponível em: <http://carodinheiro.blogfolha.uol.com.br/2013/05/29/cosmeticos-no-brasil/>. Acesso em: 27 set. 2015.

DAWSON, A. ‘Paraben-free’: Should you care? Los Angeles Times, 08 maio 2011. Disponível em: < http://articles.latimes.com/2011/may/08/image/la-ig-beauty-parabens-20110508>. Acesso em: 31 jul. 2015.

DELUCA, P. P., KOSTENBAUDER, H. B. Inativation of preservatives with macromolecules. IV. Binding of quaternary ammonium compounds by nonionic agents. J. Amr. Pharm. Ass. Sci. ed. 49, p. 430-437, 1960.

DINARDO, A.C. Mercado de cosméticos brasileiro é o segundo no ranking global. Correio Braziliense, 26 maio, 2013. Disponível em: <http://www.correiobraziliense.com.br/app/noticia/economia/2013/05/26/internas_economia,367965/mercado-de-cosmeticos-brasileiro-e-o-segundo-no-ranking-global.html>. Acesso em: 23 set. 2013.

DOORNE, H. V. Preservative Stability and Efficacy: Formulation influences. In: DENYER, S. P.; BAIRD, R. M. Guide to Microbiological Control in Pharmaceutical and Medical Devices. 2. ed. Boca Raton: CRC Press, 2007. Cap. 15, p. 349-366. DORON, S. FRIEDMAN, M.; FALACH, M.; SADOVNIC. E.; ZVIA, H. Antibacterial effect of parabens against planktonic and biofilm Streptococcus sobrinus. Int. J. Antimicrob. Ag., v. 18 p. 575-578, 2001.

ELDER, D. P.; CROWLEY, P. J. Antimicrobial Preservatives Part Two: Choosing a Preservative. American Pharmaceutical Review: The Review of American Pharmaceutical Business & Technology, Usa, 1 jan. 2012. Disponível em: <http://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/38885-Antimicrobial-Preservatives-Part-Two-Choosing-a-Preservative/>. Acesso em: 9 ago. 2015. FDA - Food and Drug Administration. Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. 2. ed. Pathogenic Escherichia coli Group, p. 68. 2012. Disponível em: <http://www.fda.gov/downloads/Food/FoodborneIllnessContaminants/UCM297627.pdf> Acesso em: 9 jul. 2015. FDA - Food and Drug Administration. Parabens, 2007. Disponível em: < http://www.fda.gov/cosmetics/productsingredients/ingredients/ucm128042.htm> Acesso em: 7 jul. 2014.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Friedman%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11738348

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Falach%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11738348

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sadovnic%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11738348

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zvia%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11738348

80

FERREIRA, A.O. Guia prático da farmácia magistral. 2. ed. Juiz de Fora, 2002. FIB, FOOD INGREDIENTS BRASIL. Dossiê conservantes. Food Ingredients Brasil, n. 18, p. 29-51, 2011. FISCHER-MÜLLER, A. F. Desenvolvimento de sistemas nanoemulsionados contendo extrato de flores de Allamanda cathartica L. para aplicação cosmética. 2013. 138f. Dissertação (Mestrado) – Programa e Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, 2013. FLORES, M.; MORILLO, M.; CRESPO, M. L. Deterioration of Raw Materials and Cosmetic Products by Preservative Resistant Microorganisms. Int. Biodeter. & Biodeg., v. 40, p. 157-160, 1997. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008. FRONZA, T.; GUTERRES, S.; POHLMANN, A.; TEIXEIRA, H. Nanocosméticos: em direção ao estabelecimento de marcos regulatórios. Porto Alegre: UFRGS, 2007. GARRITY, G. M.; BOONE, D. R.; CASTENHOLZ, R. W. Bergey´s manual of systematic bacteriology. 2 ed., Hardcover, 2001. HERRERA A.G. Microbiological analysis of cosmetics. Methods Mol. Biol. v. 268 p. 293-5, 2004. IVAN. Atualização sobre o fenoxietanol. Cosmética em Foco. 17 jun. 2014. Disponível em: <http://www.cosmeticaemfoco.com.br/2014/06/atualizacao-sobre-o-fenoxietanol.html#ixzz3T5QMTyiN> Acesso em:01/06/2015. KIMATA, N.; NISHINO, T.; SUZUKI, S.; KOGURE, K. Pseudomonas aeruginosa isolated from marine environments in Tokyo bay. Microbial. Ecol., v. 47, p. 41-47, 2004. KURUP, T.R.R.; WAN, L.S.C.; CHAN, L.W. Effect of surfactants on the antibacterial activity of preservatives. Pharm. Acta Helv., v. 66, p. 274-280, 1991. KURUP, T.R.R.; WAN, L.S.C.; CHAN, L.W. Interaction of preservatives with macromolecules: Part II. Natural hydrocolloids. Pharm. Acta Helv., v. 67, p. 301-307, 1995. LIMA NETO, A. S.; PETROVICK, P. R. A celulose na farmácia. Cad. Farm., v. 13, p. 19-23,1997. LIZÁRRAGA, A. Brazil on board with Nanotechnology. In-Cosmetics, 29 jul. 2014. Disponível em: <http://news.in-cosmetics.com/2014/07/brazil-on-board-with-nanotechnology/> Acesso em: 16 Mar. 2015. LOPES, C. M.; LOBO, J. M. S.; COSTA, P. Formas farmacêuticas de liberação modificada: polímeros hidrofílicos. Braz. J. Pharm. Sci., v. 41, p. 143-54, 2005.

81

LOWEY, F.D. Staphylococcus aureus infections. N. Engl. J. Med., v. 339, p. 520-532. Aug. 1998. Disponível em: <http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJM199808203390806> Acesso em: 10 Out. 2014. LUCCA, P. A.; TEPPER, B. J. Fat replacers and the functionality of fat foods. Tends in food science & technology, v. 5, n. 1, p. 12-19, 1994. LUCK, E.; JAGER, M. Conservación química de los alimentos: características, usos e efectos. 2 ed. Acribia, 2000. MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Microbiologia de Brock. São Paulo: Prentice Hall, 2004.

MARKOWETZ, A. New aspects in the preservation of cosmetics. Cosmetics, v. 128, n. 4, p. 22-24, 2002. McCULLOUGH, M. J.; ROSS, B. C.; READE, P. C. Candida albicans: a review of its history, taxonomy, epidemiology, virulence attributes, and methods of strain differentiation. Int. J. Oral Maxillofac Surg., 1996. MEDINA, J.; SALVADO, A.; DEL POZO, A. Use of ultrasound to prepare lipid emulsions of lorazepam for intravenous injection. Int. J. Pharm. v. 216 p. 1-8, 2001. MINAMI, P. S. Micologia: métodos laboratoriais de diagnóstico das micoses. São Paulo: Manole, 2003. MOAT, A.G.; FOSTER, J.W. Microbial physiology. 2. ed. New York: Wiley, 1988. MORSE L.J.; WILLIAMS H.L.; GRENN JR F.P.; ELDRIDGE E.E.; ROTTA JR. Septicemia due to Klebsiella pneumoniae originating from a hand-cream dispenser. New Engl J Med 1967; 277: 472-473.

NCCLS. Método de referência para testes de Diluição em Caldo para Determinação da Sensibilidade a Terapia Antifúngica de Fungos Filamentosos; Norma Aprovada. NCCLS document M38-A (ISBN 1-56238-470-8). NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2002. NEMEN, D.; LEMOS-SENNA, E. Preparação e caracterização de suspensões coloidais de nanocarreadores lipídicos contendo resveratrol destinados à administração cutânea. Química Nova, v. 34, n. 408, 2011.

OHARA, M. T.; FISCHER, D. C. H.; SAITO, T. Contaminação microbiana em condicionadores de cabelos. Revista Farmácia Bioquímica da Universidade de São Paulo, v. 27, n. 1, p.28-36, 1991. ONADIPE, A. O. Microbiological Considerations for Biotechnological Products. In: DENYER, S. P.; BAIRD, R. M. Guide to Microbiological Control in Pharmaceutical and Medical Devices. 2. ed. Boca Raton: CRC Press, 2007. Cap. 5A, p. 89 - 109.

82

PARKER, M.S.; McCAFFERTY, M.; MACBRIDE, S. Phenonip: a broad spectrum preservative. Soap Perfum. Cosmet., v. 41 p. 647-649, 1968. PARKER, M. Contaminação microbiológica e conservação de produtos farmacêuticos. In: AULTON, M. E. Delineamento de formas farmacêuticas. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. PAYNE, D. N. Microbial Ecology of the Production Process. In: DENYER, S. P.; BAIRD, R. M. Guide to Microbiological Control in Pharmaceutical and Medical Devices. 2. ed. Boca Raton: CRC Press, 2007. Cap. 3, p. 51-67. PINTO, T. J. A.; KANEKO, T. M.; PINTO, A.F. Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. 4 ed. São Paulo: Manole, 2015. PIRNAY, J. P.; MATTHIJS, S.; HURI, C.; CHABLAIN, P.; BILOCQ, F.; ELDERE, J. V.; DE VOS, D.; ZIZI, M. ; TRIEST, L. ; CORNELIS, P. Global Pseudomonas aeruginosa biodiversity as reflected in a Belgian river. Environ. Microbiol., v.1, p. 1-12, 2005. PharmaSpecial. NIPAGIN® M e NIPASOL® M: Metilparabeno e Propilparabeno. Informativo técnico, 2004. PUBCHEM – Open Chemistry Database – Tween 80. Disponível em: <http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/443315#section=2D-Structure> Acesso em: 10 ago. 2015. RODFORD, R. Safety and evaluation of preservatives. Int. J. Cosm. Sci., v. 19 p. 281–290, 1997. ROWE, R. C.; SHESKEY, P. J.; QUINN, M. E. Handbook of Pharmaceutical Excipients. 6. ed. London, UK: Pharmaceutical Press e Washington, DC: American Pharmacists Association, 2009. RUSSEL, A. D. Challenge testing: Principles and practice. Int. J. Cosm. Sci., v. 25, p. 147-153, 2003. SANTOS, A. L. R. Avaliação do Sistema Conservante em Formulação com Extrato Hidroalcóolico de Schinus terebinthifolius Raddi - Anacerdiaceae. 112 f. Disertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2007. SANTOS, H. Panorama e perspectivas para a indústria brasileira de cosméticos. In-Cosmetic, 20 mar. 2014. Disponível em: <http://news.incosmetics.com/2014/03/ panorama-and-perspectives-for-the-brazilian-cosmetics-industry/> Acesso em: 16 Mar. 2015. SANTOS, N. P. A farmacotécnica de incorporação dos parabenos interfere na atividade antimicrobiana?. 2006. 41 f. Monografia (Graduação) - Feevale, Novo Hamburgo, 2006.

83

SCHMOLKA, I. R. The Synergistic Effets of Nonionic Surfactants upon Cationic Germicidal Agents. J Soc. Cosmet. Chem., v. 24 p. 577-592, 1973. SCHWARB, F.P.; GABARD B.; BIELI E.; SCHWAB S.; SURBER C. Microbiological Quality of Topical Drug Formulations: Efficacy of Antimicrobial Preservation against Paecilomyces lilacinus. Dermatology., v. 203 p. 248-266, 2001. SHAQRA, Q. M. A.; AL-MOMANI, W.; AL-GROOM, R. M. Susceptibility of some bacterial contaminants recovered from commercial cosmetics in Jordan to preservatives and antibiotics. Trop. J. Pharm. Res. Feb., v. 13 p. 255-259, 2014. SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A.; TANIWAKI, M. H.; SANTOS, R. F. S.; GOMES, R. A. R. Manual de métodos de analise microbiológica de alimentos e água. São Paulo: Varela, 2010. SMAOUI, S.; HLIMA, H. B. Effects of parabens and isothiazolinone on the microbiological quality of baby shampoo: the challenge test. Biocontrol Sci. v. 17, p. 135-142, 2012. SOUSA, D. Estudo prevê alta de 11% no consumo de itens de beleza. Exame, 9 set. 2013. Disponível em: <http://exame.abril.com.br/economia/noticias/estudo-preve-alta-de-11-no-consumo-de-itens-de-beleza> Acesso em: 23 set. 2015. SOUZA, M.R.S.E.L.; OHARA, M.T.; SAITO, T. Contaminação microbiana em emulsões cosméticas para aplicação dérmica. Revista Farmácia Bioquímica da Universidade de São Paulo, v. 30, n. 1, p. 23-28, jan/jun. 1994. STEINBERG, D. C. Preservatives for Cosmetics. 2. ed. Allured Publishing Corporation: Carol Stream, 2006. STORPIRTIS, S.; GONGALVES, J.E.; CHIANN, C.; GAI, M.N. Biofarmacotécnica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2011. THOMPSON, J.E. A prática farmacêutica na manipulação de medicamento. Porto Alegre: Artmed, 2006. TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 8. ed. São Paulo: Artmed, 2006. TSCA – Biotechnology program under the toxic substances control act. Aspergilus niger final risk assessment. EPA, 1997. Disponível em: <http://www.epa.gov/biotech_rule/pubs/fra/fra006.htm> Acesso em: 9 ago. 2013. VARVARESOU, A.; PAPAGEORGIOU, S.; TSIRIVAS, E.; PROTOPAPA, E.; KINTZIOU, H.; KEFALA, V.; DEMETZOS, C. Self-preserving cosmetics. Int. J. Cosmet. Sci., v. 31, p. 163-175, 2009. VICENTINI, F. T.; SIMI, T. R.; DEL CIAMPO, J. O.; WOLGA, N.O.; PITOL, D. L.; IYOMASA, M.M.; BENTLEY, M.V.; FONSECA, M.J. Quercetin in w/o

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gabard%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11701981

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bieli%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11701981

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Schwab%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11701981

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Surber%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11701981

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Simi%20TR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18304790

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Del%20Ciampo%20JO%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18304790

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wolga%20NO%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18304790

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pitol%20DL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18304790

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pitol%20DL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18304790

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Iyomasa%20MM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18304790

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bentley%20MV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18304790

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fonseca%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18304790

84

microemulsion: in vitro and in vivo skin penetration and efficacy against UVB-induced skin damages evaluated in vivo. Eur. J. Pharm. Biopharm., v. 69, n. 948, 2008. VILLANOVA, J.C.O.; SÁ, V. R. Excipientes: Guia prático para padronização – formas farmacêuticas orais, sólidas e líquidas. 2. ed. São Paulo: Pharmabooks, 2009. VOIGT, R. Tratado de tecnologia farmacêutica. 3 ed. Zaragoza-Espana: Editorial Acribia, 1982. WALLHAUSER, K.H. Antimicrobial preservatives used by the cosmetic industry. In KABARA J.J.; Cosmetic and Drug preservation, Principles and Practices. New York: Marcel Dekker, 1984. YAMAMOTO, C.H.; PINTO, T.J.; MEURER, V.M.; CARVALHO, A.M.; REZENDE, P. Controle de Qualidade Microbiológico de Produtos Farmacêuticos, Cosméticos e Fototerápicos Produzidos na Zona da Mata, MG. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE EXTENSÃO UNIVERSITÁRIA, 2, Belo Horizonte, 2004. Anais...Belo Horizonte: Universidade Federal de Minas Gerais, 2004.

85

ANEXO A

Descrições dos meios de cultura de acordo com o manual do fabricante Caldo Nutriente Digestão péptica de tecido animal.........................................................................5,0 g

Extrato de levedura................................................................................................1,5 g

Extrato de carne bovina..........................................................................................1,5 g

Cloreto de sódio.....................................................................................................5,0 g

pH após esterilização.......................................................................................7,4 ± 0,2

Agar Muller Hinton Infusão de Carne Bovina....................................................................................300,0 g

Caseína Ezimática Hidrolisada............................................................................17,5 g

Amido.....................................................................................................................1,5 g

Agar......................................................................................................................17,0 g


Agar Sabouraud Dextrose Dextrose...............................................................................................................40,0 g

Peptonas..............................................................................................................10,0 g

Agar......................................................................................................................15,0 g

Água purificada................................................................................................1000 mL


Ágar Caseína Soja

Peptona de caseína pancreática..........................................................................15,0 g

Farinha de soja obtida por digestão papaínica......................................................5,0 g

Cloreto de sódio ....................................................................................................5,0 g

Agar .....................................................................................................................15,0 g



86

Caldo Caseína Soja

Peptona de Caseína pancreática.........................................................................17,0 g

Farinha de soja obtida por digestão papaínica......................................................3,0 g

Cloreto de sódio.....................................................................................................5,0 g

Fosfato de potássio dibásico..................................................................................2,5 g

Glicose monoidratada............................................................................................2,5 g


pH após esterilização......................................................................................7,3 ± 0,2

Esterilização e acondicionamento dos meios de cultura Meios em placas

Esterilizar o meio a 121 ºC durante 15 minutos e distribuir, assepticamente, em

placas de Petri estéreis. Conservar sobre refrigeração até o uso por no máximo uma

semana.

Meios líquidos

Dissolver os ingredientes do meio e distribuir nos frascos. Esterilizar a 121 ºC

durante 15 minutos. Conservar sobre refrigeração até o uso.

87

APÊNDICE A

Efeito da redução do crescimento microbiano na combinação entre conservante metilparabeno (M) e Phenonip® (P) (0,2%) e os tensoativos não iônicos ALKEST® CSO 400 H e Tween® 80, frente aos cinco micro-organismos testes.

Concentração

Tensoativos não iônicos

Micro-organismo

ALKEST ® Tween® 80

14 d

28 d

14 d 28 d

M P M P M P M P

40 g/L

Aspergillus niger 103 107 108 > 108 > 108 104 > 108 107

Candida albicans 107 107 107 107 > 108 > 108 > 108 107

Escherichia coli > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108

Pseudomonas aeruginosa > 108 > 108 107 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108

Staphylococcus aureus > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108

20 g/L

Aspergillus niger 107 107 107 > 108 103 107 107 106

Candida albicans 107 107 107 107 107 > 108 107 > 108

Escherichia coli > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108

Pseudomonas aeruginosa > 108 > 108 107 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108

Staphylococcus aureus 107 > 108 107 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108

10 g/L

Aspergillus niger > 108 105 > 108 107 108 104 106 107

Candida albicans 106 > 108 107 > 108 104 107 103 > 108

Escherichia coli 107 > 108 107 > 108 107 > 108 107 > 108

Pseudomonas aeruginosa > 108 > 108 > 108 107 > 108 > 108 > 108 > 108

Staphylococcus aureus > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108

5 g/L

Aspergillus niger > 108 > 108 > 108 > 108 103 103 106 106

Candida albicans 107 107 108 > 108 104 107 10² 107

Escherichia coli 107 > 108 103 > 108 106 > 108 < 10¹ > 108

Pseudomonas aeruginosa 107 > 108 107 > 108 > 108 > 108 > 108 > 108

Staphylococcus aureus > 108 > 108 > 108 > 108 107 > 108 107 > 108

88

APÊNDICE B

Efeito da redução do crescimento microbiano na combinação entre conservante Verstatil® BP e PC (0,5%) e os tensoativos não iônicos ALKEST® CSO 400 H e Tween® 80, frente aos cinco micro-organismos testes.

Concentração

Tensoativos não iônicos

Micro-organismo

ALKEST ® Tween® 80

14 d

28 d

14 d 28 d

BP PC BP PC BP PC BP PC

40 g/L

Aspergillus niger < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101

Candida albicans 106 107 104 106 107 107 104 107

Escherichia coli 103 >108 101 105 < 101 >108 < 101 102

Pseudomonas aeruginosa 103 105 < 101 >108 102 >108 < 101 103

Staphylococcus aureus 104 >108 102 >108 < 101 >108 < 101 103

20 g/L


Candida albicans < 101 103 102 105 104 104 < 101 104

Escherichia coli < 101 107 < 101 106 < 101 106 < 101 102

Pseudomonas aeruginosa < 101 >108 10¹ >108 10² >108 101 105

Staphylococcus aureus < 101 >108 < 101 105 < 101 >108 < 101 105

10 g/L


Candida albicans < 101 105 < 101 105 < 101 104 < 101 102

Escherichia coli 103 103 < 101 103 101 106 102 103

Pseudomonas aeruginosa < 101 106 < 101 104 10² >108 < 101 103

Staphylococcus aureus 104 >108 < 101 < 101 < 101 >108 < 101 103

5 g/L


Candida albicans < 101 104 < 101 102 102 103 < 101 < 101

Escherichia coli 102 101 101 101 102 102 102 102

Pseudomonas aeruginosa < 101 >108 < 101 < 101 < 101 >108 < 101 104

Staphylococcus aureus 101 101 < 101 > 108 102 < 101 < 101 < 101

89

APÊNDICE C

Efeito da redução do crescimento microbiano na combinação entre os conservantes metilparabeno e Phenonip® (0,2%) e Verstatil® BP e PC (0,5%) e a carboximetilcelulose sódica, frente aos cinco micro-organismos testes.

Concentração Micro-organismo

Carboximetilcelulose sódica

14 d

28 d

M P BP PC M P BP PC

2 g/L

Aspergillus niger < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹

Candida albicans < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ 10²

Escherichia coli < 10¹ < 10¹ 10² < 10¹ 10¹ < 10¹ 10¹ 10³

Pseudomonas aeruginosa 104 10³ 10¹ < 10¹ 10³ < 10¹ 10² 10²

Staphylococcus aureus 10² 10¹ 108 106 104 10² >108 105

4 g/L

Aspergillus niger < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹

Candida albicans < 10¹ < 10¹ < 10¹ 10¹ 10² 10¹ 10¹ < 10¹

Escherichia coli 103 10² 105 10¹ 10³ 10² < 10¹ < 10¹

Pseudomonas aeruginosa < 10¹ 10³ < 10¹ < 10¹ < 10¹ 10³ 10¹ 10²

Staphylococcus aureus 10³ 104 > 108 106 10³ 10³ >108 >108

90

APÊNDICE D

Efeito da redução do crescimento microbiano na combinação entre os conservantes metilparabeno e Phenonip® (0,2%) e Verstatil® BP e PC (0,5%) e a goma xantana, frente aos cinco micro-organismos testes.

Concentração Micro-organismo

Goma xantana

14 d

28 d

M P BP PC M P BP PC

1 g/L


Candida albicans 102 < 101 < 101 < 101 101 < 101 < 101 < 101

Escherichia coli 102 105 102 102 102 103 102 102

Pseudomonas aeruginosa 103 >108 10³ 104 103 103 10³ < 101

Staphylococcus aureus 106 102 >108 >108 105 102 >108 >108

3 g/L


Candida albicans < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 101

Escherichia coli 101 >108 101 10² < 101 >108 < 101 10²

Pseudomonas aeruginosa >108 >108 10³ 106 >108 >108 10² >108

Staphylococcus aureus 103 102 < 101 10³ 102 < 101 102 105

5 g/L

Aspergillus niger < 101 < 101 < 101 < 101 < 101 101 < 101 101

Candida albicans < 101 102 < 101 < 101 < 101 101 < 101 101

Escherichia coli < 101 >108 10² 106 < 101 >108 102 102

Pseudomonas aeruginosa >108 >108 106 106 >108 106 >108 106

Staphylococcus aureus < 101 103 < 101 103 < 101 103 < 101 103

7 g/L


Candida albicans < 101 104 < 101 104 < 101 102 < 101 101

Escherichia coli < 101 >108 < 101 < 101 102 >108 < 101 102

Pseudomonas aeruginosa 105 106 105 106 105 107 105 >108

Staphylococcus aureus < 101 105 102 105 104 < 101 < 101 104

91

APÊNCIDE E

Testes de eficácia dos conservantes metilparabenos (M) e Phenonip® na concentração de 0,2% e de Verstatil® BP (BP) na concentração de 0,5% em microemulsão, frente aos cinco micro-organismos testes.

Micro-organismo 7 d 14 d 28 d

M P BP M P BP M P BP

Microemulsão

Aspergillus niger 10¹ 10² 10¹ 10² 10¹ 10² 10¹ < 10¹ 10¹

Candida albicans > 108 > 108 > 108 105 105 > 108 > 108 103 > 108

Escherichia coli < 10¹ 104 < 10¹ < 10¹ 103 104 < 10¹ 10² > 108

Pseudomonas aeruginosa

< 10¹ 103 104 < 10¹ 103 10³ 10³ < 10¹ > 108

Staphylococcus aureus > 108 105 < 10¹ < 10¹ 10² > 108 > 108 < 10¹ > 108

Nanoemulsão

Aspergillus niger 10¹ 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹ < 10¹

Candida albicans > 108 108 > 108 > 108 106 > 108 > 108 104 > 108

Escherichia coli > 108 105 105 > 108 103 105 > 108 < 10¹ > 108

Pseudomonas aeruginosa

> 108 103 > 108 > 108 103 > 108 > 108 10² > 108

Staphylococcus aureus > 108 104 > 108 > 108 103 104 > 108 < 10¹ > 108

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ - siaibib01.univali.brsiaibib01.univali.br/pdf/Priscila de Oliveira...

Documents

Transcript of UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ - siaibib01.univali.brsiaibib01.univali.br/pdf/Priscila de Oliveira...