Universidade de Cuiabá de Cuiabá Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu Mestrado em...

Universidade de Cuiabá

Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu Mestrado em Biociência Animal

RAFAEL EITEL NANI

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO IN VITRO DAS ATIVIDADES CARRAPATICIDA E INSETICIDA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE LARVAS DE

Rhipicephalus microplus (ACARI: IXODIDAE) E Aedes aegypti (DIPTERA: CULICIDAE).

Cuiabá – MT 2016

RAFAEL EITEL NANI



Dissertação apresentada à UNIC, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Biociência Animal.

Orientadora: Profª. Dr.ª Andréia Lima Tomé Melo

Cuiabá – MT 2016

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

NANI, RAFAEL EITEL

Caracterização química e avaliação in vitro das atividades carrapaticida e inseticida de óleos essenciais sobre larvas de Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) e Aedes aegypti (Díptera: Culicidae) / Rafael Eitel Nani – Cuiabá, 2016.

111f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-graduação em Biociência Animal, Universidade de Cuiabá, 2016. “Orientadora: Profª. Drª. Andréia Lima Tomé Melo.” “Co-orientador: Prof. Dr. Wendell Marcelo de Souza Perinotto.”

1. Carrapato. 2. Bovino. 3. Larvas. 4. Aedes aegypti I. Título.

CDU 614.9

RAFAEL EITEL NANI



Dissertação apresentada à UNIC, Programa de Mestrado em Biociência Animal, área e concentração em Saúde Animal como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre, conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:

BANCA EXAMINADORA

___________________________________ Profª. Drª. Andréia Lima Tomé Melo

UNIC

___________________________________ Prof. Dr. Caio Márcio de Oliveira Monteiro

UFG

_____________________________________ Prof. Dr. Wendell Marcelo de Souza Perinotto

UFRB

Cuiabá, ____ de _______________de 20___.

Dedico este trabalho a minha família. A minha querida mãe (Valtraud Kurtz Nani) e querido pai (Rafael Nani). A minha irmã (Márcia Adelheid Nani).

AGRADECIMENTOS

A minha família pelo amor e apoio nesses dois anos. Sem vocês esse sonho não seria possível;

A minha orientadora Profª. Drª. Andréia Lima Tomé Melo, pela força e incentivo na realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos e respeito;

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Wendell Marcelo de Souza Perinotto, pela atenção, paciência e apoio, acreditando na realização deste trabalho;

Aos Professores do curso de Medicina Veterinária que contribuíram com a minha formação;

A minha querida e eterna parceira de estudos Ozeni Souza de Oliveira;

A Profª. Ângela Nolasco pelo incentivo;

Ao Prof. Fábio Miotto, pela força e atenção;

A Profª. Drª. Ivana Póvoa pelo espaço e materiais emprestados do laboratório de Farmacognosia da UNIC;

A técnica de laboratório, Adrienne Cristina Maia de Arruda e Vanda Lúcia Pasquini Basso;

Ao Prof. Dr. Caio Márcio de Oliveira Monteiro, da UFG, ao Prof. Dr. Erik Daemon, da UFJF, a Profª. Drª. Tatiana Pinheiro Novato Lopes, da UFJF, a Profª. Drª. Sabrina Rita da Fonseca Rezende, da UFRRJ, pela ajuda nos experimentos;

À doutoranda, Francês Regiane dos Santos pelas ajuda nas análises;

As colegas Monike Suellen Oliveira Magalhães e Geovana Vilalva Freire que me ajudaram na identificação das substâncias;

A Universidade de Cuiabá, pela possibilidade de concretização de mais um desafio;

Aos meus colegas de estudo, obrigado pelo convívio no ambiente de trabalho, pela amizade e apoio em nossos encontros do mestrado;

Devo muito a todas as pessoas mencionadas aqui, intelectual e emocionalmente. À todos, o meu muito obrigado.

“Nada existe de tão fácil, que não se torne difícil, quando você não o faz de má vontade”.

Pensamento adaptado e modificado de Públio Terêncio Afro “Enquanto há vida, há esperança”

Públio Terêncio Afro

RESUMO

Rhipicephalus microplus, carrapato bovino, é um dos principais problemas sanitários na bovinocultura em países de clima tropical e subtropical. As infestações de R. microplus são controladas com a utilização de acaricidas químicos, ocasionando conseqüências indesejáveis, como por exemplo, poluição ambiental, acúmulo de resíduos em alimentos, intoxicação de mamíferos e cepas de carrapatos resistentes a maioria das bases químicas disponíveis no mercado. Por isso, métodos alternativos de controle vêm sendo amplamente estudados, dentre esses, a utilização de biocarrapaticidas em testes laboratoriais. Diante disso, o presente estudo teve como objetivos realizar a caracterização química e avaliar a atividade acaricida dos óleos essenciais das plantas Citrus sinensis, Lantana camara, Pterodon emarginatus e Vochysia divergens. Para realização dos ensaios biológicos, os óleos essenciais foram extraídos através da técnica de hidrodestilação, analisados e identificados por cromatografia gasosa/espectrofotometria de massa. Para avaliar o efeito acaricida sobre R. microplus, foi utilizado o teste de pacotes larval (TPL) com os óleos essenciais nas concentrações: 0,25%, 0,5%, 1,0% e 1,5%, utilizando como solvente o Tween 80. Após o tratamento, os envelopes contendo as larvas foram acondicionados em câmaras climatizadas a temperatura de 27 ºC e umidade relativa de 80% durante 24 horas. Passado esse tempo realizou se a contagem de larvas mortas e vivas em cada envelope. Os resultados foram analisados estatiscamente utilizando o Biostat 5.0. Na análise de cromatografia foram encontrados os seguintes resultados: C. sinensis revelou 11 compostos químicos presentes no óleo, sendo um composto majoritário, o limoneno (88,25%); L. camara apresentou nove componentes químicos no óleo, tendo como compostos

majoritários: o -cariofileno (12,49%) e davanona B (16,55%); P. emarginatus

revelou sete componentes químicos no óleo cujo majoritário foi -cariofileno (30,23%) e em V. divergens foram identificados três constituintes no óleo, sendo os compostos majoritários os álcoois 3-cis-hexenol (76,34%) e 4-metil-pentanol (18,42%). Através do presente estudo, verificou-se que os óleos essenciais de C. sinensis, L. camara, V. divergens e P. emarginatus, não apresentaram atividade acaricida para R. microplus. Portanto, esses óleos não devem ser utilizados para o controle de R. microplus. Na Medicina Veterinária e Sáude Pública, os mosquitos são extremamente importantes, devido à capacidade de transmitir diversos agentes etiológicos para os seres humanos e animais. O mosquito Aedes aegypti é vetor de vírus causadores das enfermidades conhecidas como dengue, chikungunya e zika, e também do nematóide Dirofilaria immitis causador da dirofilariose. Há décadas utilizam-se medidas de combate ao A. aegypti, como produtos químicos como organofosfados e piretróides. Entretanto, o uso excessivo desses produtos têm acelerado o desenvolvimento do mecanismo de resistência em diversas populações de A. aegypti, também causam poluição ambiental, intoxicação de animais e humanos, e ação sobre insetos não-alvos, dentre outras conseqüências indesejáveis. Diante disso, novas alternativas para o combate ao A. aegypti vêm sendo estudadas, dentre essas, merece destaque a utilização de óleos essenciais. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito inseticida de óleos essenciais das plantas Lantana camara, Melaleuca alternifolia, Pterodon emarginatus e Thymus vulgaris e realizar a caracterização química desses óleos. Para tanto, realizou-se a extração dos óleos essenciais através da hidrodestilação. Esses óleos foram identificados através CG-EM e posteriormente realizada a atividade inseticida sobre larvas de A. aegypti em copos plásticos, onde foram

adicionadas 10 larvas de 3º estádio em 10 mL de água desclorada. Foram testados óleos de L. camara nas concentrações: 17, 88, 176, 220, 260, 350 e 440 ppm, M. alternifolia:17, 89, 178, 267, 350 e 445 ppm, P. emarginatus: 14, 70, 140, 210, 280, 350 e 420 ppm e T. vulgaris: 8, 17, 44, 88, 132, 176 e 260 ppm. Os óleos essenciais foram diluídos em solução aquosa de dimetil sulfóxido 2% (DMSO) e distribuídos nos copos contendo as larvas. O parâmetro avaliado foi o percentual de mortalidade das larvas, que foi verificado após 1h, 2h, 4h, 6h, 12h e 24h da exposição aos óleos. Paralelamente foram feitos controle negativo com água e DMSO 2%. Para analisar a porcentagem de mortalidade utilizou o software Prisma 5.0. Na análise química dos óleos, em L. camara foram identificados nove componentes químicos tendo como

compostos majoritários o -cariofileno (12,49%) e davanona B (16,55%), em M. alternifolia foram detectados 15 constituintes químicos, dos quais destacam quatro

compostos majoritários: -terpineno (9,38%), -felandreno (17,67%), terpinen-4-ol

(40,69%) e o -terpineol (9,31%), em P. emarginatus foram identificados sete

componentes tendo o -cariofileno (30,23%) como majoritário e em T. vulgaris foram verificados 21 constituintes químicos, tendo como compostos majoritários: o

tricicleno (5,61%), o trieno santolina (7,67%), o -cimeno (21,22%), o linalol (6,44%),

o -terpineol (8,57%), o timol (22,53%) e o carvacrol (7,96%). Com relação à atividade inseticida, verificou-se que o controle negativo não apresentou mortalidade. O óleo de L. camara nas concentrações de 260ppm e 350ppm apresentou mortalidade para larvas do A. aegypti de 60% e 90%, respectivamente, em 24 horas. A concentração de 440ppm em 24 horas matou 100% das larvas. O óleo de M. alternifolia, nas concentrações de 267ppm e 350ppm ocasionou mortalidade para larvas do A. aegypti acima de 75%, em 24 horas. Na concentração de 445ppm em 24 horas, a atividade larvicida foi de 100%. O óleo de P. emarginatus, em todas as concentrações (14, 70, 140, 210, 280, 350 e 420ppm) apresentou mortalidade de larvas para o A. aegypti menor que 25% em 24 horas. A atividade larvicida para A. aegypti do óleo de T. vulgaris na concentração de 44ppm foi de 55%, na de 88ppm foi de 70%, as concentrações de 132ppm e 176ppm tiveram uma mortalidade acima de 75% e na concentração de 260ppm, a mortalidade foi de 100% em 1 hora. A partir desses resultados é possível concluir que os óleos essenciais de L. camara, M. alternifolia e T. vulgaris apresentam atividade inseticida e que apresentam potencial para serem utilizados como uma alternativa eficaz aos pesticidas sintéticos existentes para o controle de A. aegypti. Palavras-chave: Carrapato. Controle. Fitoterapia. Mosquitos.

ABSTRACT

Rhipicephalus microplus, cattle tick, is one of the main problems affecting the cattle in countries with tropical climate and subtropical. The infestations of R. microplus are controlled with the use of chemical acaricides, causing undesirable consequences, such as for example, environmental pollution, accumulation of residues in food, intoxication of mammals and strains of ticks are resistant to most chemical bases available on the market. Therefore, alternative methods of control have been widely studied, among these, the use of biocarrapaticidas in laboratory tests. In addition, this study aimed to perform the chemical characterization and evaluate the activity acaricide of essential oils of plants Citrus sinensis, Lantana camara, Pterodon emarginatus and Vochysia divergens. For achievement of the biological tests, the essential oils were extracted using the technique of hydrodistillation, analyzed and identified by gas chromatography/spectrophotometry of earth. To evaluate the effect acaricide on R. microplus, we used the packages larval stage (TPL) with the essential oils in concentrations: 0.25%, 0.5%, 1.0% and 1.5%, using as solvent Tween 80. After the treatment, the envelopes containing the larvae were placed in chambers chambers at a temperature of 27 º C and relative humidity of 80% for 24 hours. Past this time was the count of dead larvae and vivid colors in each envelope. The results were analyzed statiscally using Biostat 5.0. In the analysis of gas were found the following results: C. sinensis showed 11 chemical compounds present in the oil, being a compound interest, the limonene (88.25%); L. camara presented nine chemical components in the oil, having as main compounds:

the -caryiophyllene (12.49%) and davanona B (16.55%), P. emarginatus revealed

seven chemical components in the oil whose interest was the -caryiophyllene (30,23%) and in V. divergens were identified three constituents in the oil, being the majority compounds the alcohol 3-cis-hexenol (76.34%) and 4-methyl pentan-3-ol (18.42%). Through this study, we found that the essential oils of C. sinensis L. camara, P. emarginatus and V. divergens, showed no activity for acaricide R. microplus. Therefore, these oils should not be used for the control of R. microplus. In Veterinary Medicine and Public Health, the mosquitoes are extremely important, due to the ability to transmit various etiologic agents for humans and animals. The mosquito Aedes aegypti is a vector of viruses that cause disease known as dengue fever, chikungunya and zika, and also of the nematode Dirofilaria immitis causes dirofilariasis. For decades we use measures to combat A. aegypti, as chemicals as organofosfados and pyrethroids. However, the excessive use of these products has accelerated the development of the mechanism of resistance in various populations of A. aegypti, also cause environmental pollution, poisoning of humans and animals, action on insects, among other undesirable consequences. In addition, new alternatives for the fight against A. aegypti has been studied among these, worthy of mention is the use of essential oils. Thus, the objective of this work was to evaluate the effect of insecticide essential oils of plants Lantana camara, Melaleuca alternifolia, Pterodon emarginatus and Thymus vulgaris and perform the chemical characterization of these oils. For both, the extraction of essential oils by hydrodistillation. The oils were identified by GC-MS and later held the insecticidal activity against larvae of A. aegypti in plastic cups, which were added 10 larvae of 3rd stage in 10 mL of water desclorada. Were tested oils of L. camara in the concentrations: 17, 88, 176, 220, 260, 350 and 440 ppm, M. alternifolia:17, 89, 178, 267, 350 and 445 ppm, P. emarginatus: 14, 70, 140, 210, 280, 350 and 420 ppm and T. vulgaris: 8, 17, 44, 88, 132, 176 and 260 ppm. The essential oils were diluted in

aqueous solution of dimethyl sulfoxide 2% (DMSO) and distributed in the cups containing the larvae. The parameter evaluated was the percentage of mortality of larvae, which was recorded after 1h, 2h, 4h, 6h, 12h and 24h of exposure to oils. At the same time were made negative control with water and DMSO 2%. To analyze the effect of treatments was performed the statistical analysis of the percentage of mortality using the Prism software 5.0. In the analysis of the chemical characterization of oils, in L. camara were identified nine chemical components

having as main compounds: the -caryiophyllene (12.49%) and davanona B (16.55%), in M. alternifolia were detected 15 chemical constituents, which include

four major compounds: -terpinene (9,38%), -phellandrene (17,67%), terpinen-4-ol

(40.69%) and the -terpineol (9,31%), in P. emarginatus were identified seven

components having the -caryiophyllene (30,23%), as the majority and in T. vulgaris were verified 21 chemical constituents, having as main compounds: the tricicleno

(5.61%), the trieno santolina (7.67%), the -cymene (21,22%), linalol (6.44%), the -terpineol (8.57%), thymol (22.53%) and the carvacrol (7.96%). With respect to the insecticidal activity, it was found that the negative control showed no mortality. The oil of L. camara at concentrations of 260 ppm and 350 ppm showed mortality to larvae of A. aegypti to 60% and 90%, respectively, in 24 hours. The concentration of 440ppm in 24 hours killed 100% of larvae. The oil of M. alternifolia, at concentrations of 267 ppm and 350 ppm caused mortality to larvae of A. aegypti above 75% in 24 hours. The concentration of 445ppm in 24 hours, the larvicidal activity was 100%. The oil of P. emarginatus, in all concentrations (14, 70, 140, 210, 280, 350 and 420ppm) showed mortality of larvae to A. aegypti lower than 25% in 24 hours. The larvicidal activity for A. aegypti of oil of T. vulgaris in the concentration of 44 ppm was 55%, in the 88ppm was 70%, the concentrations of 132 ppm and 176 ppm had a mortality rate above 75%, and the concentration of 260 ppm, the mortality rate was 100% in 1 hour. From these results it can be concluded that the essential oils of L. camara, M. alternifolia and T. vulgaris have insecticidal activity and who have potential to be used as an effective alternative to synthetic pesticides for the control of A. aegypti. Keywords: Tick. Control. Phytotherapy. Mosquitoes.

LISTA DE TABELAS

ARTIGO 1 – COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE

ACARICIDA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE Rhipicephalus

microplus (ACARI: IXODIDAE) IN VITRO.

Tabela 1 – Tabela demonstrativa dos componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Citrus sinensis, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção.

66

Tabela 2 – Tabela demonstrativa dos componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Lantana camara, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção.

67

Tabela 3 – Tabela demonstrativa dos componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Pterodon emarginatus, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção.

69

Tabela 4 – Tabela demonstrativa dos componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Vochysia divergens, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção.

70

Tabela 5 – Tabela demonstrativa do percentual de mortalidade de larvas de Rhipicephalus microplus em diferentes concentrações dos óleos essenciais de Citrus sinensis, Lantana camara, Ptederodon emarginatus, Vochysia divergens e controle solvente.

71

ARTIGO 2 – CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE INSETICIDA DE ÓLEOS ESSENCIAIS de Lantana camara, Melaleuca alternifolia, Pterodon emarginatus e Thymus vulgaris SOBRE Aedes aegypti (DIPTERA: CULICIDAE).

Tabela 1 – Tabela demonstrativa dos componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Lantana camara, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção.

89

Tabela 2 – Tabela demonstrativa dos componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Melaleuca alternifolia, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção.

90

Tabela 3 – Tabela demonstrativa dos componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Pteredon emarginatus, com as referidas

91

porcentagens. *TR = Tempo de Retenção.

Tabela 4 – Tabela demonstrativa dos componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Thymus vulgaris, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção.

93

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 1 – Figura demonstrativa da imagem de um carrapato macho de Rhipicephalus microplus (A) e de uma fêmea ingurgitada ainda na pelagem do hospedeiro (B).

24

Figura 2 – Figura demonstrativa do esquema simplificado do ciclo de vida do carrapato Rhipicephalus microplus.

25

Figura 3 – Figura demonstrativa do ciclo Aedes aegypti. 32

Figura 4 – Figura demonstrativa do método de extração – hidrodestilação Clevenger.

37

Figura 5 – Figura demonstrativa do Citrus sinensis – fruto. 39

Figura 6 – Figura demonstrativa da laranjeira com inflorescências e frutos.

39

Figura 7 – Figura demonstrativa da planta Lantana camara. 40

Figura 8 – Figura demonstrativa da árvore Tea Tree (Melaleuca alternifolia).

41

Figura 9 – Figura demonstrativa da árvore sucupira-branca. 42

Figura 10 – Figura demonstrativa de sementes de sucupira. 42

Figura 11 – Figura demonstrativa do Tomilho in natura. 44

Figura 12 – Figura demonstrativa da árvore de Cambará. 45

ARTIGO 1 – COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ACARICIDA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE Rhipicephalus microplus (ACARI: IXODIDAE) IN VITRO.

Figura 1 – Figura demonstrativa da destilação à vapor de folhas de Vochysia divergens.

62

Figura 2 – Figura demonstrativa da cromatografia do óleo essencial de Citrus sinensis.

66

Figura 3 – Figura demonstrativa da cromatografia do óleo de Lantana camara.

67

Figura 4 – Figura demonstrativa da cromatografia do óleo essencial de Pterodon emarginatus.

69

Figura 5 – Cromatografia do óleo essencial de Vochysia divergens.

70


Figura 1 – Figura demonstrativa do processo de extração de óleos essenciais, hidrodestilação, método Clevenger modificado.

86

Figura 2 – Figura demonstrativa da cromatografia do óleo essencial de L. camara com seus respectivos picos.

88

Figura 3 – Figura demonstrativa da cromatografia do óleo essencial de Melaleuca alternifolia com seus respectivos picos.

90

Figura 4 – Figura demonstrativa da cromatografia do óleo essencial de Pterodon emarginatus com seus respectivos picos.

91

Figura 5 – Figura demonstrativa da cromatografia do óleo essencial de Thymus vulgaris e seus respectivos picos.

92

LISTA DE GRÁFICOS

ARTIGO 1 – COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE

ACARICIDA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE Rhipicephalus

microplus (ACARI: IXODIDAE) IN VITRO.


Gráfico 1 – Gráfico demonstrativo da comparação das diferentes concentrações do óleo essencial de Lantana camara com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti, com tempo de 1, 2, 4, 6, 12 e 24 horas. (ppm = partes por milhão).

95

Gráfico 2 – Gráfico demonstrativo da comparação da concentração do óleo essencial de Lantana camara com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti em 24 horas. (ppm = partes por milhão).

95

Gráfico 3 – Gráfico demonstrativo da comparação das diferentes concentrações do óleo essencial de Melaleuca alternifolia com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti, com tempo de 1, 2, 4, 6, 12 e 24 horas. (ppm = partes por milhão).

96

Gráfico 4 – Gráfico demonstrativo da comparação da concentração do óleo essencial de Melaleuca alternifolia com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti em 24 horas. (ppm = partes por milhão).

97

Gráfico 5 – Gráfico demonstrativo da comparação das diferentes concentrações do óleo essencial de Pterodon emarginatus com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti, com tempo de 1, 2, 4, 6, 12 e 24 horas. (ppm = partes por milhão).

98

Gráfico 6 – Gráfico demonstrativo da comparação da concentração do óleo essencial de P. emarginatus com a taxa de mortalidade das larvas de A. aegypti em 24 horas. (ppm = partes por milhão).

99

Gráfico 7 – Gráfico demonstrativo da comparação das diferentes concentrações do óleo essencial de Thymus vulgaris com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti, com tempo de 1, 2, 4, 6, 12 e 24 horas. (ppm = partes por milhão).

100

Gráfico 8 – Gráfico demonstrativo da comparação da concentração do óleo essencial de Thymus vulgaris com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti em 24 horas. (ppm = partes por milhão).

100

LISTA DE ABREVIATURAS

CG Cromatografia gasosa

CL Concentração letal

Cm Centímetro

cm2 Centímetro quadrado

DF Distrito Federal

DIC Detector de ionização de chamas

DMSO Dimetil sulfóxido

EM Espectrofotometria massa

Ev Eletro-volt

FAO Food and Agriculture Organization

gr Grama

H Hora

ºC Graus Celsius

IR Índice de retenção

KDT Tempo “Knockdown”

KI Índice de Kovats

LRI Índice de retenção linear

Km Kilômetro

L Litro

MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Mg Miligrama

Min Minuto

mL Mililitro

Mm Milímetro

MT Mato Grosso

OE Óleo essencial

OMS Organização Mundial da Saúde

OP Organofosforado

ORFS Organofosforados

PDEAa Plano Diretor de Erradicação do Aedes aegypti

PIACD Plano de Intensificação das Ações de Controle da Dengue

P Piretróide

Ppm Partes por milhão

% Porcento

P Probabilidade

TNT Tecido não tecido

TR Tempo de retenção

g Micrograma

UBV Ultra baixo volume

l Microlitro

u.m.a. Unidade de massa atômica

UR Umidade relativa

v/v Volume/volume

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 21

2. REVISÃO DE LITERATURA 24

REFERÊNCIAS 46

3. OBJETIVOS 57

3.1 OBJETIVOS GERAIS 57

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 57

4 ARTIGO 1 58

ARTIGO 1 – COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ACARICIDA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE Rhipicephalus microplus (ACARI: IXODIDAE) IN VITRO.

RESUMO 58

ABSTRACT 59

4.1 INTRODUÇÃO 60

4.2 MATERIAL E MÉTODOS 61

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 65

4.4 CONCLUSÕES 73

REFERÊNCIAS 74

5. ARTIGO 2 79

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE INSETICIDA DE ÓLEOS ESSENCIAIS de Lantana camara, Melaleuca alternifolia, Pterodon emarginatus e Thymus vulgaris SOBRE Aedes aegypti (DIPTERA: CULICIDAE).

RESUMO 79

ABSTRACT 81

5.1 INTRODUÇÃO 83

5.2 MATERIAL E MÉTODOS 85

5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 88

5.4 CONCLUSÕES 101

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 102

6. CONCLUSÕES GERAIS 108

7. ANEXOS 109

21

1. INTRODUÇÃO

O carrapato dos bovinos tem grande importância sanitária no Brasil, devido

aos efeitos do parasitismo, afetando diretamente a produtividade do gado (GRISI et

al., 2014), e a evolução da resistência do Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos

acaricidas sintéticos que tem impulsionado novas investigações científicas sobre

métodos alternativos para controlar este carrapato, que é sem dúvida um dos

parasitos mais importantes para a pecuária brasileira (CAMPOS et al., 2012).

A utilização de óleos essenciais e extratos de plantas medicinais e aromáticas

no controle de carrapatos tem sido foco de pesquisas em vários países. Estudos

sobre a avaliação das atividades inseticida, bactericida, fungicida e, recentemente,

carrapaticida com óleos essenciais têm mostrado resultados promissores, como o

estudo de Lage et al. (2012), avaliando a toxicidade do óleo essencial de Lippia

triplinervis em larvas de Rhipicephalus microplus. Cabe destacar que nessas

pesquisas, é de suma importância a correta caracterização botânica das espécies

vegetais com atividade farmacológica e o estudo de sua composição química, com a

identificação, isolamento e dosagem de seus constituintes (CUNHA et al., 2007).

Considerando isso, vários estudos com plantas têm sido desenvolvidos numa

tentativa de encontrar óleos com propriedades acaricidas. Existem muitas vantagens

com o uso de óleos de plantas no controle deste carrapato, como: utilizá-los de

forma integrada com os acaricidas sintéticos, menores riscos de contaminação

ambiental e dos alimentos, desenvolvimento mais lento de resistência e baixa

toxicidade para animais e seres humanos (SOARES, 2003)

Além dos carrapatos, alguns mosquitos são extremamente importantes em

Medicina Veterinária e Saúde Pública, devido à capacidade de transmitir diversos

agentes etiológicos para os seres humanos e animais. Dentre esses, a espécie

Aedes aegypti é considerada uma das mais preocupantes, pois atua como vetor do

vírus da Dengue, Chikungunya e Zikavírus, doenças consideradas pela Organização

Mundial de Saúde (OMS) como um dos principais problemas de saúde pública no

mundo, com grande incidência nas regiões tropicais do globo (WHO, 2009). Esse

díptero pode servir como vetor da Dirofilaria immitis, um helminto que acomete

animais e o homem (CIRIO, 2005).

22

Atualmente o controle de A. aegypti é feito por meio de aplicações de

inseticidas organafosforados (GUALTIERE et al., 1997). Porém, o uso frequente e

em doses cada vez maiores desses produtos, têm selecionado populações

resistentes (CARVALHO; SILVA, 2000).

Com o surgimento de formas resistentes do mosquito aos inseticidas

convencionais utilizados, têm crescido a busca por métodos alternativos de controle,

dentre essas, a utilização de óleos essenciais e substâncias naturais que sejam

efetivos no combate ao mosquito adulto e/ou à larva de A. aegypti, e que sejam

isentas de toxicidade para o ambiente (SIMAS et al., 2004).

Tendo em vista os problemas que a dengue apresenta no País, torna-se de

suma importância a descoberta de novos métodos de combate ao seu vetor. Dessa

forma, pelo fato de muitas plantas, por natureza, serem tóxicas para mosquitos, a

mistura de óleos essenciais pode representar uma saída eficiente para esse

problema, frente ao mosquito A. aegypti.

O uso da fitoterapia no controle de pragas de importância médica e veterinária

têm sido um processo incremental, cujo os estudos intensificaram-se na última

década, tanto no Brasil como em outros países (BORGES, 2011).

Dentre os produtos fitoterápicos estão os óleos essenciais (OE), que são

misturas complexas de substâncias com composição química variada. Também

chamados óleos voláteis (GUENTHER, 1948), são líquidos oleosos aromáticos

obtidos a partir de material vegetal (flores, brotos, sementes, folhas, galhos, cascas,

ervas, madeira, frutas e raízes). Eles podem ser obtidos por expressão,

fermentação, substâncias gordas ou por extração (VAN DE BRAAK; LEIJTEN,

1999).

Plantas como o Citrus sinensis, Lantana camara, Melaleuca alternifolia,

Pterodon emarginatus, Thymus vulgaris e Vochysia divergens, possuem

propriedades antibacterianas, antifúngicas, inseticidas, repelentes e através do

método de hidrodestilação (destilação à vapor) realiza-se a extração de óleos

essenciais de cascas, sementes e folhas, para fins terapêuticos. Os constituintes

químicos que compõe os óleos são identificados através da realização da

cromatografia gasosa e espectrofotometria de massa (CHUNGSAMARNYART;

JANSAWAN, 1996; KALITA et al., 2012; SILVA et al., 2002; DUTRA et al., 2009;

MONTEIRO et al., 2009; HESS et al., 1995).

23

Dessa forma, esse estudo teve como objetivos fazer a caracterização química

e investigar as ações carrapaticida e inseticida dos óleos essenciais de Citrus

sinensis, Lantana camara, Melaleuca alternifolia, Pterodon emarginatus, Thymus

vulgaris e Vochysia divergens sobre larvas de R. microplus e A. aegypti in vitro.

24

2. REVISÃO DA LITERATURA

Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Rhipicephalus (Boophilus) microplus é uma espécie de carrapato que tem

como o hospedeiro, animais de produção, principalmente bovinos. Este parasita

ocasiona prejuízos econômicos em países tropicais e subtropicais em atividade de

pecuária, acarretando consequências como anemia provocada, por hematofagismo,

ocorrência de lesões e miíases com desvalorização do couro, hematoparasitoses,

queda na produção de leite, carnes e derivados (BIEGELMEYER et al., 2012). As

condições climáticas no Brasil favorecem a ocorrência e infestação de R. microplus,

que acomete principalmente raças taurinas, zebuínas, e mestiças. (GRISI et al.,

2014; JUNIOR, OLIVERIA, 2005).

O carrapato bovino R. microplus é a única espécie do subgênero Boophilus

que ocorre no Brasil. Em 2003, Murrel e Barcker reclassificaram a espécie, e através

de estudo molecular e morfológico, o Boophilus passou a ser subgênero.

Rhipicephalus (Boophilus) microplus pode ainda ser chamado de B. microplus,

carrapato pertencente à família Ixodidae, à ordem Parasitiformes da classe

Arachnida e da subordem Metastigmata ou Ixodides. Os estágios de vida destes

carrapatos consistem em: ovo, larva, ninfa e adulto (FLETCHMAN, 1990).

Figura 1. Imagem de um carrapato macho de Rhipicephalus microplus (A) e de uma fêmea ingurgitada ainda na pelagem do hospedeiro (B) (SEQUEIRA e AMARANTE, 2002).

25

O carrapato bovino é monoxeno, isto é, necessita de apenas um hospedeiro

para completar o ciclo de vida que pode ser dividido em fase parasitária e fase não

parasitária (FURLONG, 2005).

O ciclo biológico de R. microplus ocorre quando as teleóginas (fêmeas

ingurgitadas) desprendem do hospedeiro e encontram abrigo na pastagem, onde

põem entre 2500 a 3000 ovos e morrem logo após a postura (fase de vida livre ou

não parasitária). Dos ovos, eclodem as larvas, que parasitam o hospedeiro; a larva

sofre muda da cutícula logo que começa a se alimentar e passa para o estágio de

ninfa, ingurgita e sofre ecdise diferenciando em macho ou fêmea, e ao final da fase

como fêmea ingurgitada se desprende do hospedeiro. Essa fase parasitária no

bovino dura aproximadamente 21 dias (JUNIOR, SEIXAS, MASUDA, 2012).

Figura 2. Esquema simplificado do ciclo de vida do carrapato Rhipicephalus microplus. Fase parasitária: (1) larva infectante realizando a fixação no bovino; (2) ninfa; (3) teleógina em estágio final de ingurgitamento. Fase de vida livre: (4) teleógina logo após desprendimento, em período de postura no solo; (5) ovos no solo, em período de incubação; (6) larva no solo (ANDREOTTI, 2002).

Inseticidas e os Bovinos

O desenvolvimento de acaricidas sintéticos vem de longa data,

aproximadamente no ano de 1949, quando foram lançados os carrapaticidas

arsênicos. Estes foram sendo substituídos por exemplares como fosforados,

26

amidinas e ultimamente os piretróides e os quimioterápicos com ação inseticida

(FURLONG, 2005).

O uso de inseticidas e agroquímicos causam prejuízos no meio ambiente

levando a morte de animais silvestres e domésticos, inimigos naturais e

microorganismos; modifica o equilíbrio do solo e altera a cadeia alimentar dos seres

vivos. Tanto os animais quanto os seres humanos são acometidos por doenças

como cânceres, deformações fetais e distúrbios neurológicos entre outras

ocasionando impactos irreversíveis nos sistemas (ROEL, 2001).

Intoxicações em bovinos são frequentes com o uso de inseticidas

organofosforados (ORFS) e carbamatos, sendo as doenças neurológicas os

principais sinais clínicos (CASTRO et al., 2007).

Castro et al. (2007) citam um caso de intoxicação de bovinos com o inseticida

diazinon para o controle de carrapato em Paranoá – DF. Os sinais clínicos

apresentados pelos animais foram: decúbito esternal e lateral, paresia flácida,

tremores musculares, opistótono, dispnéia, bradicardia, epífora, miose, sialorréia,

diarréia e timpanismo. Todos esses sintomas ocorreram devido a doses elevadas do

inseticida utilizadas pelo produtor.

O uso indiscriminado de inseticidas é ineficiente no controle de ectoparasitas.

A falta de conhecimento técnico, risco a saúde dos manipuladores e dos animais,

resistência dos carrapatos e resíduos nos produtos alimentares são algumas das

desvantagens enfrentadas pelos produtores rurais (HERNANDES et al., 2009).

Segundo Klafke et al. (2010), os atuais métodos de controle utilizados para

combater carrapatos baseiam-se no uso de acaricidas organofosforados, piretróides

sintéticos, amitraz e ivermectina, entretanto, estas substâncias químicas têm

sucesso parcial devido ao custo, poluição ambiental e o desenvolvimento de

resistência a acaricidas.

Controle do Carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Bovinos resistentes ao carrapato R. microplus têm sido selecionados. A

variabilidade genética é utilizada como uma estratégia eficiente no controle desses

parasitos, optando apenas por características desejáveis. Essa resistência depende

da atuação de seus genes, dos efeitos ambientais e suas interações com o meio. Os

hormônios sexuais, a idade do bovino e época do ano (clima de cada região)

27

também influenciam na carga parasitária do animal em maior ou menor quantidade

(BIEGELMEYER et al., 2012).

Biegelmeyer et al. (2012) salientam que são imprescindíveis a compreensão

de mecanismos imunológicos desenvolvidos pelos hospedeiros e a identificação de

genes resistentes, sendo eficazes para seleção e melhoramento de bovinos

resistentes a R. microplus.

Para Veríssimo (2013), a criação de bovinos resistentes a R. microplus é

eficaz no controle, já que é econômica e ecológica e não deixa resíduos no meio

ambiente. Raças zebuínas e Jersey colaboram para o controle destes ectoparasitos

na pecuária de corte e leiteira. Alencar, Fraga e Silva (2005) sugerem que o

cruzamento das raças das espécies de Bos taurus e Bos indicus resultaria em

animais adaptados às regiões tropicais, podendo ser aproveitados para adequar o

animal ao ambiente, acrescentando a produtividade, resistência ao carrapato bovino

com eficiência e produção de carnes e leites.

Tratamentos com produtos químicos são os métodos mais utilizados no

controle de carrapatos bovinos, porém, têm causado resistência do parasito,

aumentando o custo de produção e a busca de novas drogas para ação. Controle

biológico (uso de fungos e bactérias), técnicas de manejo e pastagem e controle

imunológico (vacinas) também têm sido estudados para uso no controle de R.

microplus (BIEGELMEYER et al., 2012).

Oliveira et al. (2013) em estudos de resistência do carrapato R. microplus aos

diferentes grupos de acaricidas utilizados na região noroeste do estado de São

Paulo e concluiu que associação de clorpirifós, cipermetrina e citronela foi eficaz, no

entanto, nos demais grupos (amitraz, deltametrina, fipronil e organofosforados) os

resultados apresentados não foram satisfatórios. Segundo os autores, é necessário

a orientação dos produtores quanto ao biocarrapaticidograma e monitoramento de

carrapatos resistentes.

Atualmente estão disponíveis no mercado carrapaticidas químicos de contato

(organofosforados, amidínicos, piretróides sintéticos, fenilpirazois, naturalyte) e os

carrapaticidas sistêmicos (lactonas macrocíclicas e benzofenilureias) (FURLONG,

MARTINS, PRATA, 2007).

Os acaricidas podem causar danos irreversíveis ao meio ambiente

contaminando rios e solos durante manuseio e aplicação (LEAL, FREITAS, VAZ JR.,

2003). Chagas (2004) salienta que o uso de ectoparasiticidas e endoparasiticidas

28

pode ser prejudicial à saúde do animal e à do homem, essas substâncias são

consideradas tóxicas porque contaminam produtos de origem animal como os

alimentos, sendo negligenciada a segurança alimentar do consumidor.

Conforme Marthe et al. (2010), centenas de litros de solução residual de

carrapaticida são gerados e muitas vezes são descartados indiscriminadamente pelo

produtor rural.

Os piretróides correspondem aproximadamente a um terço de todos os

pesticidas utilizados no mundo e também estão entre os carrapaticidas mais

vendidos. A permanência dos piretróides: deltametrina, cipermetrina e permetrina na

água e no solo úmido protegido da incidência da luz solar pode chegar até 80 dias

(VIEIRA et al., 2007).

O acúmulo de carrapaticidas no solo reduz consideravelmente a matéria

orgânica presente neste, prejudicando-o (CHING- JONES, 2008).

Uso de óleos e extratos de plantas medicinais e aromáticas no controle de Rhipicephalus (Boophilus) microplus

De acordo com Roel (2001), a agricultura sustentável busca a utilização dos

recursos disponíveis na propriedade, se preocupando com os impactos ambientais e

a poluição, diminuir a dependência de matéria prima externa com objetivo de

produzir alimentos saudáveis, baratos e com qualidade.

A utilização de plantas medicinais e aromáticas no controle de carrapatos tem

sido foco de pesquisas em vários países. Os óleos essenciais extraídos destas

plantas possuem atividade terapêutica, bactericida, fungicida e inseticida e,

recentemente, está sendo testada a atividade carrapaticida (RIBEIRO et al., 2010;

CLEMENTE et al., 2010; PIRALI-KHEIRABADI, SILVA, 2010; GAZIM et al., 2011).

Algumas vezes o efeito carrapaticida é atribuído aos constituintes químicos

isolados em maior quantidade no óleo essencial que são os componentes

majoritários. Porém, é possível que a atividade do componente principal seja

modulada por outros compostos que estão em menor quantidade (CAMPOS et al.,

2012).

As plantas são utilizadas para tratamento de animais em comunidades rurais

principalmente pelo fácil acesso e disponibilidades e baixo custo, baseando apenas

29

em conhecimentos populares, sem a preocupação com o bem estar animal, a saúde

dos seres humanos e a falta de conhecimento técnico científico (SILVA et al., 2013).

Os vegetais podem ser usados de acordo com a forma e preparo, in natura,

pó, extração aquosa ou alcoólica, óleos essenciais, concentrações, purificação e

isolamento de substâncias pesticidas (CAMPOS et al., 2012).

Os inseticidas extraídos das plantas têm efeito de repelência, inibe a

oviposição e alimentação, altera o sistema hormonal prejudicando a reprodução e

causa a morte nas diversas fases dos insetos. Entretanto, cuidados com a dose

desses bioinseticidas e monitoramento são necessários para o controle (ROEL,

2001).

Pesquisas com extratos vegetais para o controle de R. microplus tem se

intensificado no Brasil e em vários países, com o objetivo de encontrar propriedades

acaricidas e desenvolvimento mais lento de resistência do carrapato ao produto

(BORGES, SOUSA, BARBOSA, 2011). O uso de plantas com propriedades

acaricidas é viável e sustentável minimizando os problemas enfrentados pelos

pecuaristas e diminuindo o uso de agrotóxicos (MACHADO et al., 2013).

Aproximadamente 55 espécies de 26 famílias foram avaliadas no controle do

carrapato R. microplus, sendo uma alternativa viável, fatores intrínsecos e

extrínsecos podem comprometer os princípios ativos que degradam facilmente no

meu ambiente (BORGES, SOUSA, BARBOSA, 2011).

De acordo com Alves et al. (2012), o uso de plantas com propriedades

acaricidas tem contribuído com uma produção sustentável, uma vez que o produtor

poderia utilizar recursos que estão disponíveis na propriedade com baixo custo e

segurança. No entanto, sua eficiência é incipiente e as informações não chegam ao

produtor. A orientação para os produtores deve ser feita incentivando o controle com

uso de produtos alternativos como extratos vegetais (CHAGAS, 2004). Medidas

alternativas para o controle de carrapato bovino estão sendo utilizadas por criadores

de animais de produção em países em desenvolvimento como na Índia. Vários

estudos têm buscado identificar compostos com propriedades inseticidas e ou

acaricidas em plantas (PARVEEN et al., 2014).

Segundo Jacobson (1989), as espécies botânicas mais usadas como plantas

pesticidas pertencem às famílias Meliaceae, Rutaceae, Asteraceae, Annonaceae,

Lamiaceae e Canellaceae.

30

Segundo Broglio-Micheletti et al. (2009), extratos vegetais e folhas, frutos e

sementes da família Meliaceae são amplamente estudados e avaliados quanto ao

poder de controle de parasitas, entre eles o carrapato bovino, em vários países.

Estudos realizados por Broglio-Micheletti et al. (2010) em ação de extrato e

óleo de nim no controle do R. microplus tiveram resultados satisfatórios quando

utilizado extrato da semente (hexano) e óleo emulsionável 1 a 2% ocasionando a

mortalidade das fêmeas ingurgitadas.

Sousa et al. (2008) avaliando a eficácia de extratos oleosos de frutos de

cinamomo (Melia azedarach) sobre o R. microplus concluiram que quando os frutos

estão verdes os resultados são positivos para o controle, contudo, o seu

armazenamento interfere de forma negativa.

Óleos como biocarrapaticidas

Os óleos essenciais de plantas medicinais e aromáticas podem ser

empregados como bactericidas, fungicidas e inseticidas. Essas substâncias são

consequência do metabolismo secundário dos vegetais e o benefício de sua

utilização constitui em não deixar resíduos no ambiente e em produtos derivados de

animais e não causar intoxicação nos animais e no homem (CAMPOS et al., 2012).

Estes óleos são considerados misturas complexas, podendo conter

aproximadamente de dois a 60 componentes diferentes. Esses compostos orgânicos

incluem principalmente monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanóides, variando

suas quantidades em uma mesma espécie, dependendo do método de extração,

clima e período de coleta (CAMPOS et al., 2012).

Garcia et al. (2012) em estudos de atividades acaricidas do óleo essencial

das folhas e caules de Tagetes minuta no controle de R. microplus, R. sanguineus,

Amblyomma cajennense e Argas miniatus, observaram o potencial acaricida em

estádio larval e adultos sobre as quatro espécies avaliadas, sendo mais ativo

quando comparado ao óleo de nim. Terpenóides são componentes encontrados em

plantas com poder inseticidas e não são tóxicos para o meio ambiente, sendo

seguros quando utilizados como fragrâncias e aditivos alimentares.

De acordo com Romero (2008), os óleos essenciais que apresentam

compostos como timol, carvacrol, geraniol, citronelal e linalool, apresentam

importante efeito antiparasitário.

31

Para Cardona et al. (2007) o uso de óleo essencial de Sapindus saponaria

(Sapindaceae) é uma alternativa promissora para o controle de carrapatos em

bovinos, pois ocasionou a morte das fêmeas ingurgitadas e reduziram a eficiência

reprodutiva destas. Broglio-Micheletti et al. (2009) observaram que o óleo extraído

das sementes de Annona muricata demonstrou-se eficaz em baixas concentrações

no controle do carrapato bovino in vitro.

O óleo essencial de Copaifera reticulata, da árvore de copaíba, apresenta

atividade carrapaticida sobre larvas de R. microplus (FERNANDES et al., 2007).

Segundo Gazim et al. (2011), a planta Tetradenia riparia (Lamiaceae) apresenta alta

atividade carrapaticida sobre R. microplus. Estes autores observaram alta

mortalidade de fêmeas ingurgitadas em baixas concentrações do óleo essencial

desta planta, redução do número e do peso dos ovos, diminuição de eclosão e

mortalidade de larvas.

Silva et al. (2009) testaram a toxicidade da espécie Piper aduncum

(Piperaceae) proveniente da floresta amazônica em fêmeas ingurgitadas e larvas de

R. microplus e demonstraram que a mortalidade das larvas desta espécie foi devida

a um constituinte do óleo, derivado de um fenilpropanóide.

Aedes Aegypti

Pertencente ao gênero Aedes (Diptera: Culicidae), o mosquito A. aegypti é

originário da África predominando nas florestas e alimentando-se de roedores e

animais selvagens. Com o aumento da concentração humana a espécie tornou-se

doméstica seguindo as migrações do homem. Atualmente é definido como um

mosquito doméstico, antropofílico e com atividade hematofágica diurna (BRAGA et

al., 2007).

O A. aegypti se desenvolve por meio de metamorfose completa

(holometabolia) passando pelas fases de ovo, larva (4 estágios), pupa e adulto

(SIMAS et al., 2004; NEVES, 2011; MS, 2016).

Os ovos são depositados nas paredes de depósitos artificiais de água limpa

(criadouros) e possuem alta resistência (FUNASA, 2001). A fase larval corresponde

ao estágio da alimentação e do crescimento, passam por quatro estágios evolutivos

até a formação da pupa. Sob condições ótimas, o período entre a eclosão do ovo e a

32

pupação não excede cinco dias (FUNASA, 2001). Corresponde ao momento mais

trabalhado na erradicação devido à sua vulnerabilidade.

A fase de transformação da larva em mosquito adulto corresponde à fase de

pupa. Neste estágio não ocorre alimentação, e possui duração de dois a três dias. O

estágio adulto do vetor representa a fase reprodutiva do inseto. O mosquito

apresenta coloração escura com faixas brancas nas bases dos segmentos tarsais.

As fêmeas se alimentam de sangue com maior freqüência, sendo o repasto

essencial para fornecer proteínas ao desenvolvimento dos ovos. Na natureza o A.

aegypti dura de 30 a 35 dias (FUNASA, 2001).

Figura 3 – Ciclo Aedes aegypti Fonte: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/kitdengue2/epidemiologia/imagens.html

O mosquito Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) é vetor de vírus causadores das

enfermidades conhecidas como dengue, chikungunya e zika (VASCONCELOS,

2015). A dengue e a chikungunya têm sintomas e sinais semelhantes. Enquanto a

dengue se destaca pelas dores nos corpo, a chikungunya é caracterizada por dores

e inchaço nas articulações. Já a zika, apresenta febre mais baixa (ou ausência de

febre), manchas na pele e coceira no corpo (SESAB, 2016). Porém, recentemente,

estudos demonstraram que o vírus da zika pode ocasionar também hidrocefalia em

humanos, quando mulheres gestantes são infectadas pelo agente. Além disso, pode

33

servir como hospedeiro intermediário de Dirofilaria immitis, um helminto que acomete

animais e o homem (CIRIO, 2005).

A transmissão do vírus ocorre através da picada de uma fêmea adulta

infectada, sendo que uma única fêmea de A. aegypti é capaz de transmitir o vírus do

dengue até 12 vezes ou mais, ao longo de sua vida (MARÇAL JUNIOR et al, 2004)

sendo que, uma vez infectada, a fêmea de Aedes permanece assim por toda sua

vida.

O mosquito A. aegypti L., encontrou no mundo moderno condições muito

favoráveis para uma rápida expansão, pela urbanização acelerada, criando cidades

com deficiências de abastecimento de água e de limpeza urbana; pela intensa

utilização de materiais não-biodegradáveis, como recipientes descartáveis de

plástico e vidro; e pelas mudanças climáticas. Com essas condições, espalhou-se

por uma área onde vivem cerca de 3,5 bilhões de pessoas em todo o mundo

(FUNASA, 2002).

Controle de Aedes aegypti

No ano de 1997, teve início o Plano Diretor de Erradicação do A. aegypti no

Brasil (PDEAa) seguido pelo Plano de Intensificação das Ações de Controle da

Dengue (PIACD) desenvolvido pelo Ministério da Saúde. O programa foi efetivo ao

propor a necessidade de atuação multissetorial e prever um modelo descentralizado

de combate à doença, com a participação das três esferas de governo, Federal,

Estadual e Municipal (BRASIL, 2011).

Há possibilidade de utilizar medidas de controle físico, químico e biológico,

sendo os dois primeiros grupos mais utilizados. As medidas adotadas no controle

físico são direcionadas à população como, por exemplo, evitar acúmulo de água em

recipientes como pratos de vasos, pneus vazios e garrafas, manter as caixas d’água,

calhas e cisternas vedadas, evitar o acúmulo de lixo, entre outros. A problemática

desta medida se estabelece na falta do comprometimento da população em seguir

tais parâmetros e a dificuldade ou, muitas vezes, a impossibilidade de inspeção de

100% dos depósitos pelos agentes de rotina (SUCEN, 2002).

Pelo controle químico a utilização de inseticidas destacando os

organofosforados (OP), como o temephós, e os piretróides (P), como a cipermetrina

(LUNA et al., 2004).

34

Os programas de controle de A. aegypti possuem três formas de utilização do

controle químico: a aplicação de inseticida diretamente nos depósitos (tratamento

focal com temephós) contendo as formas imaturas do vetor; a borrifação de

inseticida de ação residual (tratamento perifocal com cipermetrina) nos depósitos a

fim de atingir a forma adulta do vetor, e a aplicação espacial de inseticida a ultra

baixo volume (UBV), indicado para situações restritas de epidemias promovendo a

rápida redução do vetor adulto (FUNASA, 2001).

As ações para o seu controle populacional são realizadas principalmente nas

fases larvais, quando se encontra mais vulnerável. O inseticida organofosforado

temefós tem sido o produto recomendado e utilizado pelo Programa Nacional de

Prevenção à Dengue no Brasil e pela Organização Mundial da Saúde (DIVE, 2014;

CRIVELENTI et al., 2011; CARVALHO et al., 2004). No entanto, já foram

identificadas populações de mosquitos resistentes ao inseticida na Colômbia

(MAESTRES et al., 2009) e em diversos estados do Brasil, como Ceará, Distrito

Federal, Minas Gerais e Paraíba (CARVALHO et al., 2004; LIMA et al., 2006;

BESERRA et al., 2007; HORTA et al., 2011). Além disso, a aplicação de inseticidas

é de alto custo e normalmente tem duração residual de aproximadamente 60 dias, o

que faz com que seja necessário repetir com frequência a sua aplicação para poder

manter o controle do vetor (REY et al., 2010).

A utilização de plantas como bioinseticidas: uma alternativa de controle

Faz-se necessário a busca por novos métodos de controle contra o vetor,

como alternativa, a utilização de plantas com propriedades inseticidas. Diversos

derivados botânicos provocam efeitos sobre os insetos como repelência, inibição de

oviposição e de alimentação, alterações no desenvolvimento e morte (ROEL, 2001).

Além disso, a utilização de produtos extraídos de plantas silvestres, na qualidade de

inseticidas, tem inúmeras vantagens como fácil obtenção, rápida degradação, os

vetores apresentam baixa resistência aos seus componentes, além de apresentarem

baixo custo de produção (FURTADO et al., 2005).

Todas as plantas possuem compostos que são essenciais ao seu

desenvolvimento ou utilizados como defesa. Os principais compostos produzidos

pelas plantas são metabólitos primários, ou seja, moléculas necessárias para a vida

da planta, como aminoácidos, proteínas e ácidos nucléicos. Os metabólitos

35

secundários, por outro lado, são restritos em sua distribuição e são importantes para

a sobrevivência e propagação das plantas que o produzem, funcionando como

defesa contra herbívoros, patógenos ou competidores (BIERMAN, 2009). Em

resposta aos ataques patogênicos, as plantas produzem metabólitos secundários

como os flavonóides, alcalóides e terpenóides que coevoluem com os insetos e

micro-organismos, tornando-se fontes naturais de substâncias inseticidas

(MARANGONI et al., 2012; SIMÕES et al., 2010). A utilização dessas matérias-

primas na produção de extratos para o controle de vetores apresenta vantagens em

relação aos inseticidas sintéticos. Seus princípios ativos apresentam uma taxa de

biodegradabilidade maior e são geralmente menos prejudiciais para a saúde hu-

mana e para o meio ambiente (VIEGAS JÚNIOR, 2003; BARRETO, 2005). É nessa

perspectiva que têm sido desenvolvidas pesquisas para obtenção de inseticidas

naturais menos poluentes e mais seletivos para o controle populacional de vetores

(GUISSONI et al., 2013; BOBADILLA et al., 2005; SANTIAGO et al., 2005; SILVA et

al., 2004).

Plantas com efeito inseticida utilizadas no controle de Aedes aegypti

Diversos estudos surgiram na tentativa de demonstrar a eficácia deste tipo de

produto natural no controle do vetor do dengue e têm apresentado resultados

satisfatórios contra o inseto, como o estudo realizado por Fernandes et al. (2001),

que utilizou o extrato aquoso de Piper nigrum (pimenta-do-reino) contra larvas de A.

aegypti obtendo mortalidade total das larvas; o estudo realizado por Furtado et al.

(2005), que utilizou diversos extratos oleosos contra larvas de A. aegypti, como a

Cymbopogon winterianus, a Hypericum perforatum, o Lippia sidoides Cham, todos

demonstraram ter ação larvicida.

Pereira et al. (2006) demonstrou que a exposição de ovos e pupas de A.

aegypti ao extrato de folhas de nim causou retardo nos estágios do mosquito em

relação ao grupo controle, e as larvas expostas ao extrato tiveram média de

mortalidade de 98%.

Em pesquisa realizada por Dua et al. (2009), avaliando o efeito do extrato

oleoso de nim, sob várias concentrações, contra larvas dos mosquitos Anopheles,

Culex e Aedes, apresentou mortalidade de aproximadamente 96% da população

36

larval de todas as espécies de mosquito somente no primeiro dia de exposição,

alcançando mortalidade total da população após sete dias de exposição.

Selvaraj e Mosses (2011) avaliaram a eficiência de extrato etanólico de

cinamomo sobre larvas de Anopheles, Culex e Aedes. Os extratos foram obtidos de

folhas e frutos da planta e expostos às larvas, os resultados atingiram

aproximadamente 83% de mortalidade das larvas somente em 24 horas de

exposição.

Citronela, planta pertencente à família das Poaceae, apresenta duas espécies

diferentes, Cymbopogon winterianus J. e Cymbopogon nardus L., ambas conhecidas

por Citronela (MARCO, 2007).

Em pesquisa realizada por Tawatsin et al. (2001) com objetivo de avaliar a

repelência de diversos óleos essenciais contra mosquitos vetores, foi possível

avaliar o potencial repelente da citronela contra o A. aegypti. Utilizando a exposição

humana contendo o óleo como avaliador, pode-se observar repelência por 6 horas

de exposição ao vetor.

Furtado et al. (2005) buscou avaliar a atividade larvicida do óleo de citronela

contra larvas de A. aegypti. Apresentou bom resultado atingindo alta porcentagem

de mortalidade das larvas em apenas 24 horas de exposição, demonstrando que

mais pesquisas devem ser realizadas visando estabelecer ação larvicida da

citronela.

Extração de óleos essenciais

Basicamente a extração de compostos bioativos de plantas segue um mesmo

padrão: coleta de matéria-prima, identificação botânica, secagem, congelamento,

liofilização, processo de extração, análise cromatográfica, isolamentos de compostos

ativos, purificação, fracionamento, e avaliação da toxicidade (SAHOO et al., 2010).

Para obtenção do extrato hidroalcoólico, a técnica utilizada com maior frequência

para a análise químico-farmacológica é realizada com 50% de água e 50% de etanol

(CECHINEL FILHO, 1998).

No processo de extração de óleos essenciais podem ser aplicados diversos

métodos, como a hidrodestilação, maceração, extração por solvente e gases

37

supercríticos. Dentre esses, o método de maior aplicação é o de hidrodestilação

(BAKKALI et al., 2008).

A concentração de óleos essenciais nas diferentes partes dos vegetais varia

qualitativa e quantitativamente em relação a diversos fatores, como solo, clima,

período do dia e épocas do ano e tipo de adubação. De acordo com Simões e

Spitzer (2004), óleos essenciais obtidos em diferentes órgãos de uma mesma planta

podem apresentar composição química, odor e características físico-químicas

significativamente diferentes.

No método de hidrodestilação o material a ser destilado fica em contato direto

com a água, e quando esta entra em ebulição, arrasta os compostos voláteis

consigo inclusive o óleo, e quando condensa, forma uma mistura heterogênea, com

duas fases, devido à diferença de polaridade e densidade entre a água e o óleo. O

método dessa extração do óleo essencial por hidrodestilação utiliza o aparelho

Clevenger (SILVA et al., 2010).

Figura 4. Método de extração – hidrodestilação Clevenger Fonte: NANI, R.E., 2015

A maioria dos óleos essenciais comercializados é analisado por cromatografia

gasosa e espectrofotometria em massa (CG-EM) (BAKKALI et al., 2008). Os

componentes são identificados por meio da comparação de seu espectro de massa

com espectros avaliados pelo banco de dados de um equipamento, com espectros

existentes na literatura e comparação dos índices de retenção calculados com os

que já existem na literatura (ADAMS, 2007).

38

Plantas Medicinais e Aromáticas utilizadas no estudo

Citrus sinensis

A laranja é o fruto produzido pela laranjeira (Citrus sinensis), uma árvore

pertencente à família Rutaceae, gênero Citrus, espécie sinensis., originária do

sudeste tropical e subtropical da Ásia. A laranja é um fruto híbrido, criado na

antigüidade a partir do cruzamento do pomelo (Citrus maxima) com a tangerina

(Citrus reticulata) (MATTOS JÚNIOR et al., 2005).

Deliciosa fruta cítrica, cultivada no mundo todo, sendo comumente consumida

in natura, em sucos ou em preparações culinárias, como em bolos, caldas, geléias,

chás, compotas, licores, sorvetes e uma infinidade de outras sobremesas. Sua polpa

é surpreendente também em pratos salgados, como em molhos para aves, peixes e

carne vermelha. O óleo essencial é extraído da casca podendo ser usado

diretamente para dar o sabor em bebidas, sorvetes e outros alimentos, e/ou na

fabricação de medicamentos e cosméticos, como sabonetes e perfumes (SANTOS

et al., 2003).

Embora seja uma mistura complexa de mais de 200 componentes, o óleo da

casca de laranja pode ser estudado como uma mistura sintética dos seus 3

compostos majoritários: o limoneno (93,57%), o mirceno (2,38%) e o linalool (2,25%)

(MELO et al., 1997).

O limoneno e o mirceno são monoterpenos. O alto teor de monoterpenos nos

óleos essenciais cítricos é um dos grandes segredos das suas reconhecidas

propriedades terapêuticas. Monoterpenos são as menores moléculas que compõem

os óleos cítricos, e, por este motivo penetram com extrema facilidade em todos os

tecidos do corpo humano, com poderosa ação solvente de gorduras (MELO et al.,

1997).

Os óleos essenciais cítricos, principalmente os da laranja-doce, possuem em

sua maioria um efeito repelente e inseticida de muitos tipos de insetos (MELO et al.,

1997).

39

Figura 5: Citrus sinensis – fruto Figura 6. Laranjeira com inflorescências e frutos Fonte: http://commons.wikimedia.org/wiki/File Fonte: http://commons.wikimedia.org

Lantana camara

Lantana camara L. (Verbenaceae), popularmente conhecida como lantana,

cambarazinho e lantana-cambará é uma planta herbácea ou arbustiva perene,

ramificada, com sistema radicular forte, com flores que se reúnem em

inflorescências e folhas ovaladas (WATANABE, 2005). Originária das Américas,

África e Ásia, atualmente cobre grande parte das florestas na Índia. O alto potencial

germinativo das sementes fez com que essa planta se espalhasse por todos os

países tropicais, tornando-se um empecilho na regeneração de espécies nativas,

pois em estado selvagem são consideradas plantas invasoras (WATANABE, 2005).

No Brasil, Lantana camara é encontrada em todos os estados, desde o Amazonas

até o Rio Grande do Sul, porém não dominam a vegetação (ZENIMORI e PASIN,

2006).

A planta desperta interesse agronômico por florescer durante o ano todo,

sendo cultivada por floricultores para fins ornamentais. A grande variedade de cores

das flores deve-se a cruzamentos entre espécies (ZENIMORI e PASIN, 2006) é

também observada a mudança de coloração conforme a maturação das flores

(WATANABE, 2005).

Algumas espécies de L. camara possuem propriedades tóxicas capazes de

provocar fotossensibilização e distúrbios gastrointestinais em bovinos ou ovinos

(BRITO et al., 2004; TOKARNIA et al., 1999). Apesar disso, em algumas regiões do

http://commons.wikimedia.org/wiki/File

40

mundo seus frutos servem de alimento sem causar efeitos tóxicos a humanos; é

frequentemente utilizada na medicina popular como anti-séptico, contra gripes e

resfriados e para estagnar hemorragias; são conhecidas propriedades alelopáticas e

efeitos repelentes contra larva de mosquitos Aedes (SAGAR et al., 2005).

Segundo Teixeira (2010), um estudo realizado do óleo essencial das

inflorescências de L. camara, identificaram 32 constituintes (98,7%), tendo como

componentes majoritários os sesquiterpenos -longipineno (27,6%), viridifloreno

(14,3%) e cadineno (8,1%).

Figura 7. Planta Lantana camara Fonte: https://spotsandgreens.wordpress.com/2011/11/19/lantana-camara/

Melaleuca alternifolia

O gênero Melaleuca, pertencente à subfamília Leptospermoideae, inclui

aproximadamente 100 espécies nativas da Austrália e Ilhas do Oceano Índico.

Melaleuca alternifolia Cheel é comumente conhecida na Austrália como “árvore de

chá”, florescendo principalmente em áreas de pântano, próximas de rios

(CRONQUIST, 1981).

O principal produto é o óleo essencial (TTO – tea tree oil), de grande

importância medicinal por possuir comprovada ação bactericida e antifúngica contra

diversos patógenos humanos, sendo utilizado em formulações tópicas

(GUSTAFSON et al., 1998; CARSON et al., 2006). O TTO possui aproximadamente

41

100 componentes (BROPHY et al., 1989), sendo os principais: o terpinen-4-ol, -

terpineno, -terpineno, 1,8-cineol e o -pineno (COX et al., 2001) e é um óleo

parcialmente solúvel em água.

Segundo Carson et al. (2006), o terpinen-4-ol está presente em 30-40% da

composição, sendo o componente que detêm a principal atividade antimicrobiana,

pois induz perda da membrana, interferindo na integridade e fisiologia bacteriana.

O 1,8-cineol, considerado irritante da pele, pode, aumentar a permeabilidade

da membrana facilitar a entrada de outros agentes antimicrobianos e por isso alguns

autores o consideram como detentor de efeito antimicrobiano marginal (WILLIANS,

1990; CARSON et al., 2002; GROPPO, 2002; HAMMER et al., 2003).

Os monoterpenos oxigenados presentes no óleo essencial da M. alternifolia

possuem atividade tóxica sobre larvas de Aedes albopictus com concentração letal

(LC50) de 267,13 ppm (CONTI et al., 2014).

Figura 8. Árvore Tea Tree (Melaleuca alternifólia) Fonte: https://www.google.com.br/search?q=melaleuca+alternifolia

Pterodon emarginatus

Conhecida popularmente como Sucupira branca, Pterodon emarginatus Vogel

(Fabaceae) é uma árvore do cerrado que pode atingir até 15 metros de altura,

(RIZZINI e MORS, 1995; LORENZI, 1998; CARVALHO et al., 1999; SABINO et al.,

1999; COELHO et al., 2001). A P. emarginatus está incorporada à medicina popular

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brasileira, na qual o óleo essencial apresenta-se fortemente aromático, usado no

combate ao reumatismo e diabetes. Esse óleo amargo, quando misturado com água,

é também empregado sob a forma de gargarejo, trazendo resultados positivos

contra a inflamação da garganta em humanos (RIZZO e FERREIRA, 1990;

BRANDÃO, et al., 2002) e inflamações do peritônio (edema) em ratos e outros

animais (CARVALHO et al., 1999).

Estudos fitoquímicos do gênero Pterodon têm revelado a presença de

alcalóides na casca (TORRENEGRA et al., 1989), isoflavonas e alguns triterpenos

no caule (MARQUES et al., 1998) e diterpenos (FASCIO et al., 1976; ARRIAGA et

al., 2000) e isoflavonas (BRAZ e GOTTLIEB, 1971) em óleo das sementes.

Segundo Carvalho (1998), a partir do extrato bruto dos frutos de P. emarginatus,

verificou-se atividade antiinflamatória, atribuindo esta ação à presença de compostos

terpênicos. Outros estudos mostram a ação protetora do extrato hexânico bruto dos

frutos de P. emarginatus frente ao stress oxidativo e nitrosativo induzido por

exercícios agudos em ratos (PAULA et al., 2005).

No extrato hexânico foram caracterizados os ácidos graxos, sesquiterpenos

(α-cariofileno, β-cariofileno, mirceno, α-pineno, farneseno) e diterpenos tricíclicos

furânicos com o isolamento do 6α,7β-diacetoxivouacapan-17β-oato de metila

(TEIXEIRA, 2003). Estudos realizados por Moraes (2007), foram isolados os

triterpenos lupeol e betulina das frações hexânica e diclorometânica

respectivamente, obtidas a partir do extrato etanólico bruto das cascas do caule.

Figura 9. Árvore Sucupira-branca Figura 10. Sementes de sucupira Fonte: www.plantasmedicinaisefitoterapia.com Fonte:www.plantasmedicinaisefitoterapia.com

http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjvic-Upc_PAhUDfZAKHdf3BugQjB0IBg&url=http%3A%2F%2Fwww.plantasmedicinaisefitoterapia.com%2Fcha-de-semente-de-sucupira.html&psig=AFQjCNF0j66d94XfNDZq_ewzZxTS2k5zQg&ust=1476156305714283

http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjvic-Upc_PAhUDfZAKHdf3BugQjB0IBg&url=http%3A%2F%2Fwww.plantasmedicinaisefitoterapia.com%2Fcha-de-semente-de-sucupira.html&psig=AFQjCNF0j66d94XfNDZq_ewzZxTS2k5zQg&ust=1476156305714283

http://www.plantasmedicinaisefitoterapia.com/

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Thymus vulgaris Thymus vulgaris L. conhecido popularmente por tomilho, é uma planta

medicinal, aromática e condimentar, pertencente à família Lamiaceae, originária da

Europa e cultivada no sul e sudeste do Brasil. (PORTE e GODOY, 2001).

Thymus vulgaris é um subarbusto perene, ereto, ramificado, muito aromático,

de 20-30 cm de altura, com ramos levemente cobertos de pelos brancos e de folhas

simples, pequena, verde escuras de forma oval e com comprimento entre 6 e 12

mm. É utilizada como planta medicinal, especiarias e seu óleo essencial têm

atividades antimicrobianas e antioxidantes comprovados (NASCIMENTO, et al.,

2000).

Os óleos essenciais extraídos de T. vulgaris são amplamente usados como

agentes anti-sépticos em muitas preparações farmacêuticas, e como aromatizante

em produtos alimentares. Existem várias espécies de Thymus sp. que diferem em

características morfológicas e na composição de óleos essenciais. Caracterizam-se

por um odor forte e penetrante e, por vezes, um sabor muito pronunciado balsâmico

e picante (CORTICCHIATO, et al., 1998).

O óleo essencial de tomilho possui atividades antimicrobianas (bactérias e

fungos), carminativa e expectorante, isso se deve a diversidade de componentes

químicos, principalmente o carvacrol e o timol. Atividades antifúngicas, pesticidas e

antibacterianas do óleo essencial de tomilho também foram relatadas (DAFERERA,

et al., 2000; KALEMBA, KUNICKA, 2003 e BAGAMBOULA, et al., 2004).

HAMMER, et al., (1999) relataram a atividade do tomilho contra Candida

albicans, Staphylococcus aureus e Escherichia coli apresentando a concentração

inibitória mínima de 0.03% (v/v) para os microrganismos citados.

Estudos realizados por GRANGER e PASSET (1973), demonstraram as

seguintes concentrações mínimas e máximas dos principais componentes em T.

vulgaris francês em diferentes condições ambientais: linalool (3-67%), acetato de

terpenilo (2-62%), o timol (0,2-65%) e carvacrol (0,2-72%) extraídos por

hidrodestilação.

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Figura 11. Tomilho in natura Fonte: http://hortas.info/como-plantar-tomilho

Vochysia divergens

Vochysia divergens Pohl (Vochysiaceae), conhecida por cambará, é uma

árvore colonizadora de campos inundáveis do Pantanal Matogrossense. O gênero

Vochysia compreende 105 espécies, sendo o maior da família Vochysiaceae.

Encontra-se amplamente distribuído pela América tropical (México ao Brasil) e é

muito estudado com intuito de reflorestamento de solos erodidos, pobres, ácidos e

improdutivos (CARPENTER et al., 2004). Em geral, as espécies do gênero Vochysia

possuem um amplo uso medicinal pela população, principalmente contra infecções

respiratórias, asma, bronquite e distúrbios gastrointestinais (HESS et al., 1995a;

ZUCARO et al., 2000; WENIGER et al., 2005; GUARIM NETO, 2006).

A espécie Vochysia divergens possui relevância econômica para a população

pantaneira. Da árvore, a madeira é utilizada para fabricação de canoas e formação

de ranchos. Além disso, sua madeira é considerada própria para tábuas, muito

utilizada na marcenaria, produção de compensado e celulose (POTT e POTT, 1994;

HESS et al., 1995a; GUARIM NETO, 2006).

Outro aspecto importante da utilização de V. divergens pela população

ribeirinha é a exploração da espécie como “produto florestal não madeirável”. O

cambará é empregado, de forma considerável, como planta medicinal (folha e

casca) sendo um recurso terapêutico contra doenças respiratórias e problemas

gastrintestinais. Com a casca do caule prepara-se um xarope com mel famoso por

ser expectorante, curar tosse, gripe e, também, utilizado no tratamento de

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apendicites. A partir das folhas são preparados chás usados contra asma, gripe e

distúrbios digestivos (POTT e POTT, 1994; HESS et al., 1995a; GUARIM NETO,

2006).

Apesar do interesse econômico e ampla utilização medicinal do cambará pela

população, existem pouquíssimos relatos sobre a composição química e atividade

biológica de V. divergens. Os poucos estudos fitoquímicos encontrados para a

espécie estão relacionados com o isolamento e caracterização de um esteróide e

cinco triterpenos do extrato etanólico das cascas (HESS et al., 1995a; HESS &

MONACHE, 1999). O conhecimento de rotas biossintéticas de classes químicas

otimiza a detecção, identificação e o processo de isolamento das substâncias de

interesse. No que diz respeito às atividades biológicas relacionadas à espécie, foi

verificado que o extrato etanólico das cascas de V. divergens apresentou atividade

bactericida frente à Staphylococcus aureus e antinociceptiva, de forma dose-

dependente, em camundongos submetidos a testes nociceptivos com formalina (dor

e inflamação) e contorções abdominais induzidas por ácido acético (HESS et al.,

1995b; BEIRITH et al., 1999b).

Figura 12. Árvore de Cambará Fonte: NANI, R.E., 2015

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57

3. OBJETIVOS

3.1 . OBJETIVOS GERAIS

Caracterizar quimicamente e avaliar in vitro as propriedades acaricida e

inseticida de óleos essenciais em larvas de Rhipicephalus microplus (Acari:

Ixodidae) e Aedes aegypti L. (Diptera: Culicidae).

3.2 . OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Extrair e caracterizar os constituintes químicos dos óleos de plantas medicinais e

aromáticas;

Avaliar in vitro a atividade carrapaticida dos óleos em larvas de Rhipicephalus

microplus;

Analisar a atividade inseticida dos óleos essenciais em larvas de Aedes aegypti;

Comparar as atividades carrapaticida e inseticida dos óleos essenciais em larvas

de Rhipicephalus microplus e Aedes aegypti.

58

ARTIGO 1

COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ACARICIDA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE Rhipicephalus microplus (ACARI: IXODIDAE) IN VITRO.

RESUMO

NANI, R.E. Composição química e atividade acaricida de óleos essenciais sobre Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) in vitro 2016. Dissertação

(Mestrado Biociência Animal) – Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2016.

Rhipicephalus microplus, carrapato bovino, é um dos principais problemas sanitários na bovinocultura em países de clima tropical e subtropical. As infestações de R. microplus são controladas quase que exclusivamente com a utilização de acaricidas químicos, o que ao longo dos anos tem ocasionado conseqüências indesejáveis, como por exemplo, poluição ambiental, acúmulo de resíduos em alimentos, intoxicação de mamíferos e acelerado o processo de cepas de carrapatos resistentes a maioria das bases químicas disponíveis no mercado. Por isso, métodos alternativos de controle vêm sendo amplamente estudados, dentre esses, a utilização de biocarrapaticidas oriundos do metabolismo secundário de plantas tem se destacado pelos resultados promissores, principalmente em testes laboratoriais. Diante disso, o presente estudo teve como objetivos realizar a caracterização química e avaliar a atividade acaricida dos óleos essenciais das plantas Citrus sinensis, Lantana camara, Pterodon emarginatus e Vochysia divergens. Para realização dos ensaios biológicos, os óleos essenciais foram extraídos através da técnica de hidrodestilação e analisados por cromatografia gasosa/espectrometria de massa para caracterização química dos constituintes. A identificação das substâncias do óleo essencial foi realizada por meio de seus índices de retenção (IR). Para avaliar o efeito acaricida sobre R. microplus, foi utilizado o teste de pacotes larval (TPL) com os óleos essenciais nas concentrações: 0,25%, 0,5%, 1,0% e 1,5%, utilizando como solvente o Tween 80. Após o tratamento, os envelopes contendo as larvas foram acondicionados em câmaras climatizadas a temperatura de 27 ºC e umidade relativa de 80% durante 24 horas. Passado esse tempo realizou se a contagem de larvas mortas e vivas em cada envelope. Os resultados foram analisados estatiscamente utilizando o Biostat 5.0. Na análise de cromatografia foram encontrados os seguintes resultados: C. sinensis revelou 11 compostos químicos presentes no óleo, sendo um composto majoritário, o limoneno (88,25%); L. camara apresentou nove componentes químicos no óleo, tendo como

compostos majoritários: o -cariofileno (12,49%) e davanona B (16,55%); P.

emarginatus revelou sete componentes químicos no óleo cujo majoritário foi -cariofileno (30,23%) e em V. divergens foram identificados três constituintes no óleo, sendo os compostos majoritários os álcoois 3-cis-hexenol (76,34%) e 4-metil-pentanol (18,42%). Através do presente estudo, verificou-se que os óleos essenciais de C. sinensis, L. camara, V. divergens e P. emarginatus, não apresentaram atividade acaricida para R. microplus. Então, conclui-se que esses óleos não devem ser utilizados para o controle de R. microplus, e a partir do conhecimento dos seus constituintes, novos estudos poderão testar a atividade sobre outros organismos. Palavras-chave: Carrapato. Controle. Fitoterapia.

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CHEMICAL COMPOSITION AND ACTIVITY OF THE ACARICIDE ESSENTIAL OILS ON Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) IN VITRO.

ABSTRACT

NANI, R.E. Chemical composition and activity of the acaricide essential oils on Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) 2016. Dissertation (Master Animal Bioscience) - University of Cuiabá, Cuiabá, 2016. Rhipicephalus microplus, cattle tick, is one of the main problems affecting the cattle in countries with tropical climate and subtropical. The infestations of R. microplus are controlled almost exclusively with the use of chemical acaricides, which over the years has caused undesirable consequences, such as for example, environmental pollution, accumulation of residues in food, intoxication of mammals and accelerated the process of strains of ticks are resistant to most chemical bases available on the market. Therefore, alternative methods of control has been widely studied, among these, the use of biocarrapaticidas from secondary metabolism of plants has been highlighted by promising results, especially in laboratory tests. In addition, this study aimed to perform the chemical characterization and evaluate the activity acaricide of essential oils of plants Citrus sinensis, Lantana camara, Pterodon emarginatus and Vochysia divergens. To achieve the biological tests, the essential oils were extracted using the technique of hydrodistillation and analyzed by gas chromatography/mass spectrometry for chemical characterization of constituents. The identification of substances of essential oil was performed by means of their indices (RI). To evaluate the effect acaricide on R. microplus, we used the packages larval stage (TPL) with the essential oils in concentrations: 0.25%, 0.5%, 1.0% and 1.5%, using as solvent Tween 80. After the treatment, the envelopes containing the larvae were placed in chambers chambers at a temperature of 27 º C and relative humidity of 80% for 24 hours. Past this time was the count of dead larvae and vivid colors in each envelope. The results were analyzed statiscally using Biostat 5.0. In the analysis of gas were found the following results: C. sinensis showed 11 chemical compounds present in the oil, being a compound interest, the limonene (88.25%); L. camara presented nine

chemical components in the oil, having as main compounds: the -caryiophyllene (12.49%) and davanona B (16.55%), P. emarginatus revealed seven chemical

components in the oil whose interest was the -caryiophyllene (30,23%) and in V. divergens were identified three constituents in the oil, being the majority compounds the alcohol 3-cis-hexenol (76.34%) and 4-methyl pentan-3-ol (18.42%). Through this study, we found that the essential oils of C. sinensis L. camara, V. divergens and P. emarginatus, showed no activity for acaricide in R. microplus. Thus, we conclude that these oils should not be used for the control of R. microplus, but through the understanding of their constituents, further studies can be conducted to test the activity on other organisms. Keywords: Tick. Control. Phytotherapy.

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INTRODUÇÃO

O carrapato bovino, conhecido como Rhipicephalus microplus (Acari:

Ixodidae) é um ectoparasita hematófago, distribuído em regiões tropicais e

subtropicais. Atualmente, causa grandes perdas econômicas aos criadores de gado.

A infestação desse ectoparasito pode causar redução no ganho de peso, afetando a

produção de carne e leite, além disso, R. microplus é vetor de agentes patogênicos

dos gêneros Babesia e Anaplasma, além de acarretar aumento em gastos com mão

de obra especializada, equipamentos e produtos químicos para o tratamento de

animais (GRISI et al., 2014).

Atualmente o controle deste carrapato é realizado através do uso intensivo de

acaricidas sintéticos como os organofosforados, piretróides, amidínicos, lactonas

macrocíclicas, entre outros, no qual, normalmente emprega-se formas de tratamento

com diferentes dosagens e sem padronização (VARGAS et al., 2003; RODRIGUEZ-

VIVAS et al., 2006), tal fato pode ocasionar intoxicação dos animais, dos seres

humanos, e contaminação do ambiente e alimentos (SAMISH, GLAZER, 2001;

CHAGAS, 2004).

O manejo inadequado e os frequentes tratamentos com produtos químicos

são os principais fatores que aceleram o aparecimento da resistência parasitária

(FURLONG et al., 2004).

A utilização repetida e errônea destes compostos propiciou a seleção de

indivíduos resistentes à maioria dos grupos químicos disponíveis no mercado

(PATARROYO et al., 2009).

Este fato levou à busca de novas alternativas para controle de carrapatos, e

nesse contexto substâncias de origem vegetal, como por exemplo, extratos e óleos

essenciais apresentam grande potencial. Como aspecto favorável a essa

abordagem, podemos citar que, possuem fácil biodegradabilidade e podem agir de

modo variado, dificultando assim o desenvolvimento de cepas resistentes (CHAGAS,

2004).

Oriundos do metabolismo secundário de plantas, estes metabólitos atuam

como mecanismos de defesa contra diversos patógenos. Possuem componentes

principais que estão em maior quantidade denominados compostos majoritários,

61

porém, em alguns óleos, compostos em menor quantidade agem em sinergia

(LEYVA et al., 2009).

Metabolitos secundários de vegetais têm recebido considerável atenção na

busca de novos pesticidas e têm sido encontrados para desempenhar o papel da

toxina, agir como repelentes e reguladores de crescimento de artrópodes e controle

comportamental destes agentes (COSKUN et al., 2008; MONTEIRO et al., 2009).

Os óleos essenciais e os seus componentes puros estão associados com

várias atividades biológicas, tais como: antimicrobiana, anti-helmíntica, moluscicida,

inseticida e acaricida (TUÑÓN et al., 2006; MARTINS, GONZALEZ, 2007; CETIN et

al., 2009; HENRIQUE et al., 2009; PIRALI-KHEIRABADI et al., 2009; PIRALI-

KHEIRABADI, SILVA, 2010; RIBEIRO et al., 2010).

Nos últimos anos, intensificou-se a investigação de atividade acaricida dos

óleos essenciais (RIBEIRO et al., 2010; CLEMENTE, et al., 2010; PIRALI-

KHEIRABADI, SILVA, 2010; GAZIM et al., 2011).

Nesta perspectiva, o presente estudo teve como objetivo verificar os

constituintes químicos dos óleos essenciais das plantas Citrus sinensis Linn

(Rutaceae), Lantana Camara Linn (Verbenaceae), Pterodon emarginatus Vogel

(Fabaceae) e Vochysia divergens Pohl (Vochysiaceae) e analisar a atividade

acaricida sobre larvas de R. microplus.

MATERIAL E MÉTODOS

Etapa 1 – Coleta e transporte das plantas medicinais e aromáticas e extração

dos éleos essenciais

As plantas utilizadas no experimento foram coletadas no cerrado, na MT 010,

Km 19, 15°26'27.4"S 56°10'52.9"W, próximo a região de Cuiabá e na MT 060, Km

14, 16°18'16.2"S 56°38'06.3"W, próximo a região de Poconé, Mato Grosso, Brasil.

Foram escolhidas as plantas medicinais C. sinensis devido à ação acaricida

(CHUNGSAMARNYART, JANSAWAN, 1996), L. camara pela ação larvicida

(KUMAR, 2008) e anti-filariose (MISRA, 2006), P. emarginatus pela atividade anti-

reumática, anti-inflamatória e analgésica (CORREA, 1975) e V. divergens com ação

antimicrobiana (HESS et al., 1995). Os espécimes foram coletadas nos meses de

julho, agosto, setembro e outubro de 2015 no período matutino, acondicionadas em

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sacos plásticos à temperatura de 25 ºC, e encaminhadas ao laboratório de

Farmacognosia da Universidade de Cuiabá–MT. As folhas e sementes das espécies

vegetais foram selecionadas, lavadas, secadas, trituradas e acondicionadas em

recipientes de polietileno.

Os óleos essenciais foram extraídos das cascas da planta C. sinensis, das

folhas L. camara e V. divergens, das sementes de P. emarginatus e previamente

trituradas. Usou-se 100 g em 1000 mL de água destilada, para obtenção do óleo

essencial. A extração do óleo foi feita por hidrodestilação (BAKKALI et al., 2008) em

processo contínuo por período de 4 h, utilizando-se sistemas de vidro do tipo

Clevenger modificado (figura 1), acoplados a sistemas de refrigeração, com

temperatura da água de condensação em torno de 10 ºC. Os óleos obtidos foram

coletados com auxílio de uma pipeta e armazenados em tubos tipo eppendorf,

identificados, protegidos da luz sob ausência de oxigênio e conservados em

ambiente refrigerado de 5 – 10 ºC.

Figura 1. Processo de extração de óleos essenciais por hidrodestilação utilizando o método Clevenger modificado.

Figura 1. Destilação à vapor de folhas de Vochysia divergens Fonte: Nani, R.E., 2015

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Etapa 2 – Análises cromatográficas e espectrofotometria de massa (CG-EM)

dos óleos essenciais

As análises qualitativas dos óleos essenciais foram realizadas usando um

sistema de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-

EM), utilizando um equipamento Shimadzu, modelo GC-17A, com detector seletivo

de massa, modelo QP2010 Plus (Shimadzu). As análises foram realizadas em

coluna capilar HP-5 (30 m x 0,25 nm de diâmetro interno x 0,25 mm de espessura de

filme, Agilent), com programação de temperatura de 60 °C a 260 °C (3 °C min-1),

depois 10 °C/min até 290 °C e temperatura do injetor a 220 ºC. O gás carreador

utilizado foi o hélio com vazão de 1,0 mL min-1, razão de split 1:30 e volume injetado

de 1,0 µL (óleo essencial solubilizado em diclorometano). As condições do

espectrômetro de massa foram: interface de 310 ºC, fonte de íons a 220 ºC, energia

de impacto de 70 eV e fragmentos detectados na faixa de varredura de 40-500 u.m.a

no modo scan.

As análises quantitativas foram realizadas em um cromatógrafo em fase

gasosa equipado com um detector de ionização de chamas (CG-DIC), utilizando-se

um equipamento HP-5890-Série II (Agilent), com a mesma coluna e as mesmas

condições experimentais, porém com temperatura do detector de 280 oC. A

quantidade relativa (%) de cada componente no óleo foi expressa como

percentagem da área do pico em relação à área total dos picos no extrato.

Etapa 3 – Composição química e identificação dos constituintes químicos dos

óleos essenciais

A identificação das substâncias dos óleos essenciais foi realizada por meio de

seus índices de retenção (IR), calculados para cada constituinte a partir da injeção

de uma mistura de padrões de hidrocarbonetos lineares (C8-C20) nas mesmas

condições da amostra, e comparados com o valor tabelado e com os modelos de

fragmentação da literatura (ADAMS, 2007), bem como pela comparação dos

espectros de massas das amostras com os existentes no banco de dados do

aparelho (biblioteca Nist08). Foram utilizados os tempos de retenção da amostra e

de uma série homóloga de n-alcanos (C8 – C40), onde os valores de LRI foram

obtidos pela seguinte equação:

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LRI = 100*[n+(Tr-Trn)/(TrN - Trn)]

Onde:

LRI = índice de retenção linear

n = número de carbonos da série de n-alcanos com tempo de retenção anterior ao

do composto de interesse

Tr = tempo de retenção do composto de interesse

Trn = tempo de retenção da série de n-alcanos anterior ao do composto de interesse

TrN = tempo de retenção da série de n-alcanos posterior ao do composto de

interesse

Etapa 4 – Obtenção dos carrapatos

Foram obtidas as larvas R. microplus por fêmeas ingurgitadas a partir de

infestação artificial em bezerros mantidos na fazenda experimental da Embrapa

Gado - Unidade de Pesquisa, localizada no município de Coronel Pacheco, Minas

Gerais, Brasil. Após 21 dias da infestação, as fêmeas de R. microplus totalmente

ingurgitadas foram coletadas, levadas ao laboratório, lavadas em água destilada,

secas com folhas de papel toalha e acondicionadas em placas de Petri, e mantidas

em câmara de temperatura controlada (27± 1°C) e umidade relativa (UR > 80%)

para a oviposição. Após 15 dias do início da ovipostura, os ovos foram pesados em

alíquotas de 200 mg, colocados em seringas de plástico com a parte de

acoplamento da agulha cortada e fechou-se com algodão hidrofílico. As seringas

foram então mantidas sob as mesmas condições de temperatura e umidade

mencionadas acima. As larvas submetidas aos tratamentos tinham entre 15 e 21

dias de idade (pós eclosão).

Experimento 5 – Solubilização dos óleos essenciais e ensaios biológicos com

larvas de R. microplus através do método do Teste de Pacotes Larval

Esta etapa do trabalho foi realizada no Laboratório de Parasitos Artrópodes

da Universidade Federal de Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil.

Foram preparadas formulações dos óleos essenciais de C. sinensis, L.

camara, P. emarginatus e V. divergens nas seguintes concentrações: 0,25 mg/mL,

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0,5 mg/mL, 1,0 mg/mL e 1,5 mg/mL, utilizando como solvente o Tween 80 na

concentração de 3%.

O teste de pacotes larval foi utilizado de acordo com Stone e Haydock

(1962) com modificações, segundo Monteiro et al. (2012). Aproximadamente 100

larvas foram colocadas no centro de folhas de papel de filtro medindo 6 x 6 cm.

Estas folhas foram dobradas e os bordos foram selados com clipes. Em seguida,

cada um dos lados do pacote foi umedecido com 90 L das soluções a serem

testados. No delineamento, foram estabelecidos cinco grupos com dez repetições e

cada grupo foi tratado com as respectivas formulações, tendo ainda um grupo de

controle tratado com o solvente E um grupo controle sem nenhum tratamento. Os

grupos experimentais foram mantidos em câmaras climatizadas a 27 ± 1°C e UR >

80 ± 10 %, vale ressaltar que o grupo controle sem nenhum tratamento foi

acondicionado em uma câmara separada dos outros grupos. A mortalidade foi

avaliada após 24 h, com a utilização de uma bomba de vácuo com um ponta da

pipeta na extremidade de um tubo de borracha para contar as larvas mortas e vivas.

A mortalidade foi expressa em percentagem (larvas mortas total × 100 / larvas total).

Análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o software Biostat versão 5.0.

Os valores percentuais foram transformados em √arcsinx. Os valores médios de

cada tratamento foram analisados por ANOVA e teste de Tukey (P<0,05). No caso

de distribuições não paramétricas, os valores foram comparados através dos testes

não paramétricos de Kruskal-Wallis e de Student-Newman - Keuls (P<0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na análise da composição química e identificação dos constituintes dos óleos

essenciais através da CG-EM, C. sinensis revelou 11 compostos sendo o limoneno o

composto majoritário (88,25%; TR: 9,529) (figura 2, tabela 1).

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Figura 2. Cromatografia do óleo essencial de Citrus sinensis. Tabela 1. Componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Citrus sinensis, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção

TR KI calculado Nome % Área

6,218 890,9322 Tricicleno 1,38

7,443 942,83 -pineno 0,97

8,023 944 Mirceno 4,71

8,429 955 n–octanal 0,77

9,529 986 Limoneno 88,25

12,227 1050,5215 Linalool 1,4

14,508 1102,0899 -fenchocamphorone 0,05

16,104 1135,7821 Mircenol 0,21

16,797 1150,4116 2-cis-nonen-1-al 1,08

18,423 1184,7371 Carvona 0,18

19,637 1210,3761 Neral 0,25

Segundo Melo et al. (1997), o óleo de C. sinensis é uma mistura complexa

que pode ser estudado como uma mistura sintética dos seus dois componentes-

chave: o limoneno, representante da fração terpênica, e o linalool, representante da

fração oxigenada.

Análise da composição de óleo essencial de C. sinensis utilizando

cromatografia gasosa / espectrometria de massa (CG-EM) revelou d-limoneno

(73,24%) como componentes principal, com ação significativa do óleo essencial de

C. sinensis contra larvas e pupas de mosca doméstica (KUMAR, 2012).

O óleo essencial de C. sinensis pode conter até 300 diferentes compostos

químicos. Os componentes majoritários são os monoterpenos: limoneno (94%), α-

67

pineno (0,54%), sabineno (0,74%) e mirceno (1,18%) (MARRIOTT, SHELLIE,

CORNWELL, 2001).

Yang et al. (2009), observou que o óleo essencial de resíduos cítricos contêm:

limoneno (80,51%), γ-terpineno (6,80%), p-cimeno (4,02%), β-mirceno (1,59%), α-

pineno (1,02 %), e α-terpinoleno (0,56%), confirmando o presente estudo.

No óleo de L. camara foram identificados nove componentes químicos (figura

3, tabela 2) tendo como compostos majoritários: davanona B (16,55%; TR: 32,767) e

o -cariofileno (12,49%; TR: 26,004).

Figura 3. Cromatografia do óleo essencial de Lantana camara.

Tabela 2. Componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Lantana camara, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção


6,217 890,8898305 tricicleno 5,07

7,555 931,483039 -pineno 3,61

9,473 985,2537146 1,8-cineole 4,36

12,244 1050,907029 linalool 3,92

24,142 1305,775541 -cubebeno 1,36

26,004 1346,51061 -cariofileno 12,49

27,374 1376,48217 Epi--santaleno 7,36

29,116 1415,277142 -elemeno 4,32

32,767 1498,900596 davanona B 16,55

Segundo Zandi-Sohani et al. (2012), os principais constituintes do óleo

essencial de L. camara identificados por análise de GC-MS foram o α-humeleno, cis-

cariofileno, germacreno-D, biciclogermacreno, aromadendreno, β-curcumina, óxido

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humuleno, sabineno, α-terpineol, cariofileno óxido, zingeberene, α-pineno, acetato

de geranilo e β-elemeno.

Deena e Thoppil (2000), analisando a atividade antimicrobiana para o óleo

essencial de L. camara, coletada em Calicut, Índia. Os constituintes majoritários

encontrados por estes autores foram (E)-cariofileno (35%), acetato de geranila

(22%), acetato de terpenila (6%) e acetato de bornila (4%).

Affonso et al (2007) analisou a composição química de L. camara,

compararam dos espectros de massas das amostras com biblioteca de espectros

Wiley6th, índices de retenção calculados a partir de uma série homóloga de

hidrocarbonetos alifáticos saturados com dados na literatura. Os constituintes

majoritários foram: trans-cariofileno (24,5%), d-germancreno (24,8%) e

biclogermancreno (20%).

Santos et al. (2007) avaliou a composição química e ação antibacteriana da L.

camara, em 5 (cinco) linhagens. O cromatograma revelou 86,96% dos constituintes

químicos, tendo como majoritários: biciclogermancreno (19,42%), isocariofileno

(16,70) e delta-guaieno (12,94%).

Costa et al. (2009), em seu experimento identificou os seguintes constituintes

químicos majoritários no óleo de L. camara: biciclogermacreno (19,42%),

isocariofileno (16,70%), valenceno (12,94%) e germacreno D (12,34%).

As diferenças na qualidade e quantidade na composição do óleo essencial de

L. camara entre este estudo e outros podem ser devido a variação genética, clima,

distribuição geográfica e sazonal da planta, ciclo vegetativo, fatores extrínsecos e

processo de obtenção desses óleos (OHNO et al., 2003).

No óleo de P. emarginatus foram identificados sete componentes químicos,

cujo componente majoritário foi -cariofileno (30,23%; TR: 26,163), (figura 4, tabela

3) sendo todos hidrocarbonetos sesquiterpênicos.

69

Figura 4. Cromatografia do óleo essencial de Pterodon emarginatus Tabela 3. Componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Pterodon emarginatus, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção

Tr KI calculado Nome % Área

24,171 1306,409976 Bicicloelemeno 4,29

24,915 1322,686502 -elemeno 9,68

26,163 1349,989061 -cariofileno 30,23

27,392 1376,875957 -humuleno 6,25

28,556 1402,450756 germancreno D 8,59

29,163 1416,353642 Biciclogermancreno 8,39

30,25 1441,250573 Cis-muurola-3,5-dieno 6,93

Na pesquisa de Teixeira (2003), no extrato hexânico foram caracterizados

ácidos graxos, sesquiterpenos (α-cariofileno, β-cariofileno, mirceno, α-pineno,

farnesene) e diterpenos tricíclicos furânicos com o isolamento do 6α,7β-

diacetoxivouacapan-17β-oato de metila.

Em estudo realizado por Polo et al. (2004), a análise qualitativa e quantitativa

do óleo essencial dos frutos de P. emarginatus evidenciou a presença dos

constituintes: α-pineno, mirceno, metil eugenol, etil eugenol, eugenol geraniol,

cariofileno.

Na análise da composição química do óleo essencial dos frutos de P.

polygalaeflorus obtido por Campos et al. (1990), foram identificados os seguintes

compostos químicos: ilangeno, α-capaeno, β-cariofileno, α-humuleno, γ-elemeno e

δ-cadineno, assemelhando-se à análise do óleo essencial das sementes de P.

emarginatus efetuada no presente trabalho.

70

Pelos dados descritos, para o óleo essencial de V. divergens foram

identificados três constituintes, sendo os compostos majoritários os álcoois 3-cis-

hexenol (76,34%; TR: 4,257) e 4-metil-pentanol (18,42%; TR: 4,511), além da

presença de um aldeído aromático: benzaldeído (5,24%; TR: 7,036) (figura 5, tabela

4).

Figura 5. Cromatografia do óleo essencial de Vochysia divergens. Tabela 4. Componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Vochysia divergens, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção

TR KI calculado LRI literatura Composto químico %Área

4,257 807,83 859 3-cis-hexenol 76,34

4,511 818,60 838 4-metil-pentanol 18,42

7,036 916,93 960 Benzaldeído 5,24

O 3-cis-hexenol identificado como sendo responsável pelo odor de cheiro

verde da grama e de outros vegetais e é usado contra possíveis ataques de

predadores.

Há poucos relatos na literatura mencionando os constituintes químicos de V.

divergens, e Hess et al. (1995), concluíram em trabalho com atividade antibacteriana

e análise fitoquímica de V. divergens que o ácido serícico isolado das cascas do

caule é o principal componente e justifica o seu uso como planta medicinal na

terapia de doenças infecciosas por comunidades onde há presença de cambará no

Mato Grosso.

71

Os poucos componentes identificados podem ser justificados pelo tipo de

extração ou mesmo as condições de análises instrumentais, sendo necessário rever

as etapas e promover ajustes que previnam perdas nessas etapas para garantir uma

identificação completa. Embora o estudo de análise dos constituintes químicos de V.

divergens tenha sido parcialmente realizado, foram isoladas três substâncias, mas

apenas duas, com atividade biológica encontradas na literatura científica.

Nos testes com larvas de R. microplus, verificou-se que os óleos das cascas

da C. sinensis, das folhas de L. camara e V. divergens e das sementes de P.

emarginatus, não apresentaram atividade acaricida sobre larvas de R. microplus, em

nenhuma das concentrações testadas (tabela 5).

Tabela 5. Percentual de mortalidade de larvas de Rhipicephalus microplus em diferentes concentrações dos óleos essenciais de Citrus sinensis, Lantana camara, Pterodon emarginatus, Vochysia divergens e controle solvente.

Controle Solvente

Citrus sinensis

Lantana camara


Vochysia divergens

(%) de mortalidade na concentração

0,25 mg/mL 0 0 0 0 0


0,50 mg/mL 0 0 0 0 0


1,0 mg/mL 0 0 0 0 0


1,5 mg/mL 0 0 0 0 0

De acordo com Gainza et al. (2015), o óleo essencial de C. sinensis

apresentou limoneno como componente principal (96,0%), conforme o presente

estudo. No entanto, os autores não testaram a atividade acaricida, mas sim anti-

helmíntica do óleo de C. sinensis sobre ovos e larvas de Haemonchus contortus e

observaram que no teste de eclosão dos ovos (EHT), as CL50 e CL90 do óleo

essencial foram, respectivamente, 0,27 e 0,99 mg/mL para C. sinensis. Já Castro et

al. (2011), testaram o óleo de C. sinensis sobre fêmeas ingurgitadas de R. microplus

e observaram uma eficácia de 47,8% na concentração de 200 mg/mL. Segundo

Castro et al. (2011), este resultado pode ser devido ao limoneno, presente no óleo

de C. sinensis em grande quantidade, pois, segundo Ferrarini (2008), este

72

monoterpeno possui uma ação carrapaticida sobre R. microplus, além de causar

letalidade de larvas e impedir a eclosão de ovos.

A diferença entre os resultados deste estudo e do Ferrarini et al. (2008)

utilizando limoneno pode estar relacionada à metodologia utilizada para testar a

toxidade das larvas. No presente estudo foi utilizado o método descrito por Stone e

Haydock (1962) e adaptado por Monteiro et al. (2012), que é a única recomendada

pela FAO e pelo MAPA, Brasil. Neste teste, pacotes de papel filtro contendo as

larvas são levemente umedecidas com a substância a ser testada e a mortalidade é

determinada após 24 horas. Diferentemente do método empregado por Ferrarini et

al. (2008), as larvas são colocadas dentro de sacos de tecido TNT, imersos durante

5 minutos em 10 mL de substância a ser testada, e a mortalidade é determinada em

48 horas. Portanto, as diferenças na metodologia podem ter contribuído para as

discrepâncias encontradas nos testes com limoneno nos dois estudos.

Veríssimo et al. (2013) estudou o efeito do terpeno d-limoneno e do óleo

essencial de laranja e uma mistura dos dois (40% terpeno limoneno e 20% óleo de

laranja), sobre a relação do peso de ovos e peso das teleóginas de carrapatos dos

bovinos. Houve diferença significativa entre tratamentos, porém, nenhum diferiu do

tratamento controle (água destilada), não afetaram a postura das teleóginas, não

foram eficazes no combate ao carrapato.

Na pesquisa de Barro et al. (2015) foi observado atividade moderada (p<0,05)

do óleo essencial de L. camara sobre fêmeas de R. microplus. Na maior

concentração utilizada (100 mg/mL) a eficácia obtida foi de 55,65%, sendo essa

atividade consequente à diminuição da eclodibilidade de ovos (49,63%), não

havendo variações significativas na redução da oviposição (p>0,05) à medida em

que a concentração do óleo essencial foi sendo elevada.

Em pesquisa, Moyo et al. (2009), utilizaram o extrato de L. camara a 40%, em

bovinos infestados por R. microplus e obtiveram eficácia de 57%.

Diferentes quimiotipos desta espécie podem apresentar diferentes atividades

biológicas (JÚNIOR et al., 2014).

Godoi et al. (2015) relatam que utilizando extrato de P. emarginatus em cinco

concentrações (480 μl/mL, 320 μl/mL, 160 μl/mL, 80 μl/mL e 40 μl/mL), a mortalidade

de larvas, na maior concentração (480 μL/mL) foi 33,15% e a porcentagem de

mortalidade do teste com controle positivo (2 μL/mL, amitraz), foi de 31,03%,

mostrando que o extrato de P. emarginatus não possui potencial acaricida.

73

Sabulal et al. (2006), determinou a composição química e atividade

antimicrobiana do óleo do rizoma de Zingiber nimmonii, uma espécie de gengibre

endêmica no sul da Índia. Neste, os autores relatam ser o óleo uma fonte natural rica

em β-cariofileno (42,2%) além dos isômeros α-humuleno (27,7%) e isocariofileno

(traços), exibindo significativa atividade inibitória contra fungos (Candida glabrata, C.

albicans e Aspergillus niger) e bactérias (Bacillus subtilis e Pseudomonas

aeruginosa).

Bustamante et al. (2010) verificou que o extrato etanólico bruto das cascas da

P. emarginatus apresentou atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas

esporuladas e não esporuladas, Gram-negativas e o fungo C. albicans.

O cis-3-hexenol identificado na V. divergens, é explorado como atenuador às

respostas ao estresse e ansiedade em estudos com camundongos, similarmente em

seres humanos induz ao prazer e possui efeito calmante (NIKAIDO; MIYATA;

NAKASHIMA, 2011).

Existem poucos estudos na literatura científica demonstrando a atividade

acaricida dos óleos de P. emarginatus e V. divergens, em larvas de R. microplus,

nos quais, os estudos existentes aplicam-se mais as atividades antimicrobianas em

seres humanos ou em outros animais. E a partir dos resultados aqui encontrados,

verificou-se que ambos óleos essenciais não apresentaram ação larvicida para R.

microplus.

CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos, foi possível concluir que os óleos de C.

sinensis, L. camara, P. emarginatus e V. divergens avaliados não apresentaram

eficácia de caráter carrapaticida em larvas de R. microplus, exigida pelo Ministério

da Agricultura. Além disso, através da comparação do presente estudo com relatos

da literatura percebe-se que a metodologia utilizada no tratamento dos carrapatos

pode levar a diferente resultados utilizando o mesmo óleo essencial. Sendo assim,

conclui-se que esses óleos não devem ser utilizados para o controle de R.

microplus, mas que através da caracterização química e conhecimento dos seus

constituintes, novos estudos poderão ser realizados para testar a atividade sobre

outros organismos.

74

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79

ARTIGO 2

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE INSETICIDA DOS ÓLEOS

ESSENCIAIS DE Lantana camara, Melaleuca alternifolia, Pterodon emarginatus E Thymus vulgaris SOBRE Aedes aegypti (DIPTERA: CULICIDAE).

RESUMO

NANI, R.E. Caracterização química e atividade inseticida dos óleos essenciais de Lantana camara, Melaleuca alternifolia, Pterodon emarginatus e Thymus

vulgaris sobre Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). 2016. Dissertação (Mestrado Biociência Animal) – Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2016.

O mosquito Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) é vetor de vírus causadores das enfermidades conhecidas como dengue, chikungunya e zika, e também do nematóide Dirofilaria immitis causador da dirofilariose. Há décadas utilizam-se medidas de combate ao A. aegypti, como o controle físico e químico principalmente com organofosfados e piretróides. Entretanto, o uso excessivo desses produtos tem acelerado o desenvolvimento do mecanismo de resistência em diversas populações de A. aegypti. Diante disso, novas alternativas para o combate ao A. aegypti vêm sendo estudadas, como a utilização de óleos essenciais. Por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito inseticida de óleos essenciais das plantas Lantana camara, Melaleuca alternifolia, Pterodon emarginatus e Thymus vulgaris e também fazer a caracterização química desses óleos. Para tanto, realizou-se a extração dos óleos essenciais através do método Clevenger (hidrodestilação). Os óleos foram identificados através da CG-EM e posteriormente realizada a atividade inseticida sobre larvas de A. aegypti em copos plásticos, onde foram adicionadas 10 larvas de 3º estádio em 10 mL de água desclorada. Foram testados óleos de L. camara nas concentrações: 17, 88, 176, 220, 260, 350 e 440 ppm, M. alternifolia: 17, 89, 178, 267, 350 e 445 ppm, P. emarginatus: 14, 70, 140, 210, 280, 350 e 420 ppm e T. vulgaris: 8, 17, 44, 88, 132, 176 e 260 ppm. Os óleos essenciais foram diluídos em solução aquosa de dimetil sulfóxido 2% (DMSO) e distribuídos nos copos contendo as larvas. O percentual de mortalidade das larvas foi verificado após 1h, 2h, 4h, 6h, 12h e 24h da exposição aos óleos. Paralelamente foram feitos controle negativo com água e DMSO 2%. Para analisar o efeito do tratamento e a porcentagem de mortalidade foi utilizado o software Prisma 5.0. Na análise da caracterização química dos óleos, em L. camara foram identificados 9 componentes

químicos tendo como compostos majoritários o -cariofileno (12,49%) e davanona B (16,55%), em M. alternifolia foram detectados 15 constituintes químicos, dos quais

destacam 2 compostos majoritários: -felandreno (17,67%) e o terpinen-4-ol

(40,69%), em P. emarginatus foram identificados 7 componentes tendo o -cariofileno (30,23%) como majoritário e em T. vulgaris foram verificados 21

constituintes químicos, tendo como compostos majoritários: o -cimeno (21,22%) e o timol (22,53%). Com relação à atividade inseticida, verificou-se que o óleo de L. camara nas concentrações de 260 ppm e 350 ppm ocasionou mortalidade para larvas do A. aegypti de 60% e 90%, respectivamente, em 24 horas. A concentração

80

de 440 ppm em 24 horas eliminou 100% das larvas. O óleo de M. alternifolia, nas concentrações de 267 ppm e 350 ppm ocasionou mortalidade para larvas do A. aegypti acima de 75%, em 24 horas. Na concentração de 445 ppm em 24 horas, a atividade larvicida foi de 100%. O óleo de P. emarginatus, em todas as concentrações (14, 70, 140, 210, 280, 350 e 420 ppm) apresentou mortalidade de larvas para o A. aegypti menor que 25% em 24 horas. A atividade larvicida para A. aegypti do óleo de T. vulgaris na concentração de 44 ppm foi de 55%, na de 88 ppm foi de 70%, as concentrações de 132 ppm e 176 ppm tiveram uma mortalidade acima de 75% e na concentração de 260ppm, a mortalidade foi de 100% em 1 hora. A partir desses resultados é possível concluir que os óleos essenciais de L. camara, M. alternifolia e T. vulgaris apresentam atividade inseticida sobre o A. aegypti.

Palavras-chave: Mosquitos. Controle. Fitoterápicos.

81

CHEMICAL CHARACTERIZATION AND INSECTICIDAL ACTIVITY OF

ESSENTIAL OILS OF Lantana camara, Melaleuca alternifolia, Pterodon emarginatus AND Thymus vulgaris AGAINST Aedes aegypti (Diptera:

CULICIDAE).

ABSTRACT

NANI, R.E. Chemical characterization and insecticidal activity of essential oils of Lantana camara, Melaleuca alternifolia, Pterodon emarginatus and Thymus vulgaris against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). 2016. Dissertation (Master

Animal Bioscience) - University of Cuiabá, Cuiabá, 2016. The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) is the vector of

viruses responsible for the diseases known as dengue, chikungunya, and zika, and

also of the nematode Dirofilaria immitis, which causes the Heartworm Disease. The

control of A. aegypti using physical and chemical methods such as the use of

organophosphates and pyrethroids are being used for decades. However, the

overuse of these products has been accelerating the development of mechanisms of

resistance in several populations of A. aegypti. Consequently, new alternative A.

aegypti control methods are being researched, for instance, the utilization of

essential oils. For this reason, the purpose of this paper was to characterize the

chemical composition and evaluate the insecticidal effect of the essential oils of the

plants Lantana camara, Melaleuca alternifolia, Pterodon emarginatus, and Thymus

vulgaris. Therefore, the extraction of these essential oils was conducted using the

GC-MS (Gas Chromatography – Mass Spectrometry) procedure, and then the

insecticidal activity against the larvae of A. aegypti was performed in plastic cups,

where 10 third-stage larvae were added in 10 mL of dechlorinated water. The oil of L.

câmara was tested with the concentrations of 17, 88, 176, 220, 260, 350 and 440

parts per million (ppm), the oil of M. alternifolia with 17, 89, 178, 267, 350 and 445

ppm, the oil P. emarginatus with 14, 70, 140, 210, 280, 350 and 420 ppm, and finally,

the oil of T. vulgaris with 8, 17, 44, 88, 132, 176 and 260 ppm. The essential oils

were diluted in an aqueous solution of 2% dimethyl sulfoxide (DMSO) and distributed

into the plastic cups containing the larvae. The larvae’s mortality rate was verified for

1, 2, 4, 6, 12 and 24 hours after exposure to the oils. At the same time, the negative

control was performed with water and 2% DMSO. The analysis of the effect of the

treatment and the mortality rate were conducted using the software Prisma 5.0. In the

analyses of the chemical characterization of the oils, 9 chemical compounds were

identified in L. camara, and the most representatives were -caryophyllene (12,49%)

and davanon B (16,55%); 15 chemical constituents were detected in M. alternifolia,

with two of them being the majority: -phellandrene (17,67%) and terpinen-4-ol

(40,69%); 7 compounds were identified in P. emarginatus, which presented -

caryophyllene (30,23%) as the main constituent; and 21 chemical compounds were

verified in T. vulgaris, which presented two main constituents: -cymene (21,22%)

82

and thymol (22,53%). In relation to the insecticidal activity, it was verified that the oil

of L. câmara with concentrations of 260 and 350 ppm caused the death of 60 and

90% of A. aegypti larvae, respectively, in 24 hours period. The concentration of 440

ppm eliminated 100% of the larvae in 24 hours. The oil of M. alternifólia with the

concentrations of 267 and 350 ppm caused a mortality rate higher than 75% in 24

hours. The larvicidal activity of this oil with the concentration of 445 ppm was 100%,

also in 24 hours. The oil of P. emarginatus presented a mortality rate lower than 25%

for all concentrations (14, 70, 140, 210, 280, 350 and 420 ppm) in 24 hours. The

larvicidal activity of the oil of T. vulgaris with the concentration of 44 ppm for A.

aegypti larvae was 55%, with 88 ppm the mortality was 70%, with concentrations of

132 and 176 ppm the oil presented a mortality rate higher than 75% and with the

concentration of 260 ppm, the mortality rate was 100% one hour later. As a result, it

is possible to conclude that the essential oils of L. camara, M. alternifolia, and T.

vulgaris present insecticidal activity against the mosquito A. aegypti.

Keywords: Mosquitoes. Control. Phytotherapy.

83

INTRODUÇÃO

Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) é originário da África, predomina florestas das

regiões tropicais e subtropicais no mundo inteiro, alimentando-se de roedores e

animais selvagens. Com o aumento da concentração humana, a espécie tornou-se

doméstica seguindo as migrações do homem. Atualmente é definido como um

mosquito doméstico, antropofílico e com atividade hematofágica diurna (BRAGA et

al., 2007).

É vetor de vírus causadores das enfermidades conhecidas como dengue,

chikungunya e zika (VASCONCELOS, 2015). A dengue e a chikungunya têm

sintomas e sinais semelhantes, enquanto a dengue se destaca pelas dores nos

corpo, a chikungunya é caracterizada por dores e inchaço nas articulações. Já a

zika, apresenta febre mais baixa (ou ausência de febre), manchas na pele e coceira

no corpo (SESAB, 2016). E mais recentemente, estudos demonstraram que o vírus

da zika pode ocasionar também hidrocefalia em humanos, quando mulheres

gestantes são infectadas pelo agente (BRASIL, 2015). Nas Américas, este mosquito

é responsável por frequentes epidemias, garantindo a circulação dos quatro

sorotipos do vírus no continente (WHO, 1997).

Dengue é uma doença infecciosa causada por um arbovírus e a transmissão

ocorre através da picada de uma fêmea de Aedes adulta infectada. Uma única

fêmea de A. aegypti é capaz de transmitir o vírus da dengue até 12 vezes ou mais,

ao longo de sua vida (MARÇAL JUNIOR et al., 2004) sendo que, uma vez infectada,

a fêmea de Aedes permanece assim por toda sua vida.

Na tríade epidemiológica dessas arboviroses, o esforço ao controle é intenso

no combate ao vetor. As medidas de controle de A. aegypti, podem ser: controle

físico, químico e biológico, sendo os dois primeiros grupos mais utilizados. As

medidas adotadas no controle físico são direcionadas à população como, por

exemplo: evitar acúmulo de água em recipientes como pratos de vasos, pneus

vazios e garrafas, manter as caixas de água, calhas e cisternas vedadas, evitar o

acúmulo de lixo, entre outros (SUCEN, 2002).

Pelo controle químico há utilização de inseticidas destacando os

organofosforados (OP), como o temephós, e os piretróides (P), como a cipermetrina

(LUNA et al., 2004).

84

As ações para o seu controle populacional são realizadas principalmente nas

fases larvais, quando se encontra mais vulnerável. O inseticida organofosforado

temephós têm sido o produto recomendado e utilizado pelo Programa Nacional de

Prevenção à Dengue no Brasil e pela Organização Mundial da Saúde (CARVALHO

et al., 2004; CRIVELENTI et al., 2011; DIVE, 2014). No entanto, já foram

identificadas populações de mosquitos resistentes ao inseticida na Colômbia

(MAESTRES et al., 2009) e em diversos estados do Brasil, como Ceará, Distrito

Federal, Minas Gerais e Paraíba (CARVALHO et al., 2004; LIMA et al., 2006;

BESERRA et al., 2007; HORTA et al., 2011).

Alternativas como o uso de óleos essenciais como bioinseticidas no

combate de várias espécies de mosquitos e larvas estão se tornando cada vez mais

promissores, uma vez que eles são eficazes, favoráveis ao meio ambiente,

facilmente biodegradáveis e, muitas vezes de baixo custo (CHENG et al., 2003;

DHAMAGADDA et al., 2005).

Fitoquímicos extraídos de diversas fontes botânicas, foram relatados para

terem efeitos prejudiciais sobre mosquitos (ANSARI et al., 2000). Óleos essenciais

de plantas, têm sido reconhecidos como uma importante fonte natural de inseticidas

(PRAJÂPATI et al., 2005). A sua utilização como agentes no controle de mosquitos

demonstrou minimizar o impacto que a maioria dos pesticidas sintéticos causam

sobre o meio ambiente (CHENG et al., 2009b).

Estudos apontam para ação efetiva de óleos essenciais no controle de

mosquitos como o de Ansari et al (2000), que estudaram a ação larvicida do óleo de

Dalbergia sissoo em Anopheles stephensi, A. aegypti e Culex quinquefasciatus.

Pathak e Dixit (1988), mostraram a atividade larvicida do óleo essencial de Ocimum

sanctum contra essas três espécies supracitadas. Já o óleo de nim apresentou

atividade larvicida contra C. quinquefasciatus (SHANMUGASUNDARAM et al.,

2001). Carvalho et al. (2003), relataram a atividade larvicida do óleo essencial de

Lippia sidoides em A. aegypti. E Dharmagadda et al (2005), relatou que as larvas de

A. aegypti demonstraram maior sensibilidade seguido de A. stephensi e C.

quinquefasciatus, quando em expostos em contato com o óleo essencial de Tagetes

patula.

Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo fazer a extração e

identificação dos constituintes químicos de óleos essenciais de plantas medicinais e

aromáticas de Lantana camara Linn (Verbenaceae), Melaleuca alternifolia Chell

85

(Myrtaceae), Pterodon emarginatus Vogel (Fabaceae) e Thymus vulgaris Linn

(Lamiaceae) bem como avaliar a atividade inseticida sobre o mosquito A. aegypti.

MATERIAL E MÉTODOS

Etapa 1 – Coleta, transporte e extração das plantas medicinais e aromáticas

As plantas utilizadas no experimento foram coletadas no cerrado, na MT 010,

Km 19, 15°26'27.4"S 56°10'52.9"W, próximo a região de Cuiabá; na MT 060, Km 14,

16°18'16.2"S 56°38'06.3"W, próximo a região de Poconé e no Horto Florestal Tote

Garcia, Mato Grosso, Brasil. Foram escolhidas as plantas medicinais, L camara

devido ao potencial de ação larvicida (KUMAR, 2008) e anti-filariose (MISRA, 2006),

a M. alternifolia com ação antimicrobiana, antiviral, antifúngica, antisséptica, anti-

inflamatória e cicatrizante (HAMMER, 2004; MONDELLO, 2006) P. emarginatus

pela atividade anti-reumática, anti-inflamatória e analgésica (CORREA, 1975) e T.

vulgaris com forte atividade anti-bacteriana e anti-fúngica (MALUF, 2008). Os

espécimes foram coletadas nos meses de julho, agosto, setembro e outubro de 2015

no período matutino, acondicionadas em sacos plásticos à temperatura de 25 ºC, e

encaminhadas ao laboratório de Farmacognosia da Universidade de Cuiabá–MT. As

folhas e sementes das espécies vegetais foram selecionadas, lavadas, secadas,

trituradas e acondicionadas em recipientes de polietileno.

Os óleos essenciais foram extraídos das folhas secas das plantas L. camara,

M. alternifolia e T. vulgaris, e das sementes de P. emarginatus previamente

trituradas. Para obtenção do óleo essencial foi utilizado 100 g em 1000 mL de água

destilada, para obtenção do óleo essencial. A extração do óleo foi feita por

hidrodestilação (BAKKALI et al., 2008) em processo contínuo por período de 4,0

horas, usando-se sistemas de vidro do tipo Clevenger modificado (figura 1),

acoplados a sistemas de refrigeração, com temperatura da água de condensação

em torno de 10 ºC (SILVA et al., 2010). Os óleos obtidos foram coletados com

auxílio de uma pipeta e armazenados em microtubos, identificados, protegidos da

luz sob ausência de oxigênio e conservados em ambiente refrigerado de 5 – 10 ºC.

86

Figura 1. Processo de extração de óleos essenciais, hidrodestilação, método Clevenger modificado. Fonte: Nani, R. E., 2015

Etapa 2 – Análises cromatográficas dos óleos essenciais (CG-EM)

As análises qualitativas dos óleos essenciais foram realizadas usando um

sistema de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-

EM), utilizando um equipamento Shimadzu, modelo GC-17A, com detector seletivo

de massa, modelo QP2010 Plus (Shimadzu). As análises foram realizadas em

coluna capilar HP-5 (30 m x 0,25 nm de diâmetro interno x 0,25 mm de espessura de

filme, Agilent); com programação de temperatura de 60°C a 260°C (3°C min-1),

depois 10°C/min até 290°C e temperatura do injetor a 220ºC. O gás carreador

utilizado foi o hélio com vazão de 1,0 mL min-1, razão de split 1:30 e volume injetado

de 1,0 µL (óleo essencial solubilizado em diclorometano). As condições do

espectrômetro de massa foram: interface de 310ºC, fonte de íons a 220ºC, energia

de impacto de 70 eV e fragmentos detectados na faixa de varredura de 40-500 u.m.a

no modo scan.

As análises quantitativas foram realizadas em um cromatógrafo em fase

gasosa equipado com um detector de ionização de chamas (CG-DIC), utilizando-se

um equipamento Agilent HP-5890-Série II, com a mesma coluna e as mesmas

condições experimentais, porém com temperatura do detector de 280oC. A

87

quantidade relativa (%) de cada componente no óleo foi expressa como

percentagem da área do pico em relação à área total dos picos no extrato.

A identificação das substâncias do óleo essencial foi realizada por meio de

seus índices de retenção (IR), calculados para cada constituinte a partir da injeção

de uma mistura de padrões de hidrocarbonetos lineares (C8-C20) nas mesmas

condições da amostra, e comparados com o valor tabelado e com os modelos de

fragmentação da literatura (ADAMS, 2007), bem como pela comparação dos

espectros de massas das amostras com os existentes no banco de dados do

aparelho (biblioteca Nist08). Foram utilizados os tempos de retenção da amostra e

de uma série homóloga de n-alcanos (C8 – C40), onde os valores de LRI foram

obtidos pela seguinte equação:

LRI = 100*[n+(Tr-Trn)/(TrN - Trn)]

Onde:

LRI = índice de retenção linear

n = número de carbonos da série de n-alcanos com tempo de retenção anterior ao

do composto de interesse

Tr = tempo de retenção do composto de interesse

Trn = tempo de retenção da série de n-alcanos anterior ao do composto de interesse

TrN = tempo de retenção da série de n-alcanos posterior ao do composto de

interesse

Experimento 3 - Ensaio de atividade inseticida sobre A. aegypti

Os bioensaios foram desenvolvidos usando metodologia recomendada pela

Organização Mundial de Saúde (WHO 2005, 2009). A população de A. aegypti cepa

Rockfeller foi mantida em laboratório a 27 ± 1 ºC e umidade relativa de 70 ± 5 %. Os

ovos foram colocados para eclodir em pote de plástico com 1,0 L de água

desclorada, após a eclosão, as larvas foram alimentadas diariamente com ração

para peixe (Nutriflakes, Nutriconpet). A atividade larvicida foi realizada em

quadruplicata em copos plásticos de 50 mL onde foram adicionadas 10 larvas de 3º

estádio em 10 mL de água desclorada. Foram testados óleos de L. camara (17, 88,

176, 220, 260, 350 e 440 ppm), T. vulgaris (8, 17, 44, 88, 132, 176 e 260 ppm), M.

88

alternifolia (17, 89, 178, 267, 350 e 445 ppm) e P. emarginatus (14, 70, 140, 210,

280, 350 e 420 ppm). Os óleos essenciais foram diluídos em solução aquosa de

dimetil sulfóxido 2% (DMSO, Isofar) e distribuídos nos copos contendo as larvas. A

mortalidade das larvas foi verificada após 1h, 2h, 4h, 6h, 12h e 24h após exposição

aos óleos. Paralelamente foram feitos controles com água e DMSO 2%.

Análise estatística

Para calcular a porcentagem de mortalidade utilizou-se o programa Prisma

5.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na análise da composição química e identificação dos constituintes dos óleos

essenciais através da CG-EM, em L. camara foram identificados nove componentes

químicos (figura 2, tabela 1), tendo como compostos majoritários: o -cariofileno

(12,49%; TR: 26,004) e davanona B (16,55%; TR: 32,767).

Figura 2. Cromatografia do óleo essencial de L. camara com seus respectivos picos.

89

Tabela 1. Componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Lantana camara, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção


6,217 890,8898305 tricicleno 5,07

7,555 931,483039 -pineno 3,61

9,473 985,2537146 1,8-cineole 4,36

12,244 1050,907029 linalool 3,92

24,142 1305,775541 -cubebeno 1,36

26,004 1346,51061 -cariofileno 12,49

27,374 1376,48217 epi--santaleno 7,36

29,116 1415,277142 -elemeno 4,32

32,767 1498,900596 davanona B 16,55

Segundo Zandi-Sohani et al. (2012), os principais constituintes do óleo

essencial de L. camara identificados por análise de GC-MS foram: α-humeleno, cis-

cariofileno, germacreno-D, biciclogermacreno, aromadendreno, β-curcumina, óxido

humuleno, sabineno, α-terpineol, cariofileno óxido, zingeberene, α-pineno, acetato

de geranilo e β-elemeno.

O óleo essencial de Lantana camara consiste de cariofileno, cineol e pineno.

Cineol é referido como tendo propriedades inseticidas sobre insetos (ABDEL-HADY

et al., 2005).

Deena e Thoppil (2000) analisando a atividade antimicrobiana para o óleo

essencial de L. camara, coletada em Calicut, Índia. Os constituintes majoritários

encontrados por estes autores foram (E)-cariofileno (35%), acetato de geranila

(22%), acetato de terpenila (6%) e acetato de bornila (4%).

Santos et al. (2007) avaliaram a composição química e ação antibacteriana da

L. camara, em 5 (cinco) linhagens. O cromatograma revelou 86,96% dos

constituintes químicos, tendo como majoritários: biclogermancreno (19,42%),

isocariofileno (16,70) e delta-guaieno (12,94%).

Costa et al. (2009) em seu experimento identificaram os seguintes

constituintes químicos majoritários no óleo de L. camara: biciclogermacreno

(19,42%), isocariofileno (16,70%), valenceno (12,94%) e germacreno D (12,34%).

As diferenças na qualidade e quantidade na composição do óleo essencial de

L. camara entre este estudo e outros podem ser devido a variação genética, clima,

distribuição geográfica e sazonal da planta, ciclo vegetativo, fatores extrínsecos e

processo de obtenção desses óleos (OHNO et al., 2003).

90

Na análise da CG-EM da M. alternifolia foram detectados 15 constituintes

químicos (figura 3, tabela 2), dos quais destacam quatro compostos majoritários: -

terpineno (9,38%; TR: 8,959), -felandreno (17,67%; TR: 10,624), terpinen-4-ol

(40,69%; TR: 15,715) e o -terpineol (9,31%; TR: 18,186), totalizando 77,05%.

Figura 3. Cromatografia do óleo essencial de Melaleuca alternifolia com seus respectivos picos.

Tabela 2. Componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Melaleuca alternifolia, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção


6,22 991,0169 Mirceno 3,77

8,492 957,7516 -pineno 0,29

8,959 970,8438 -terpineno 9,38

9,239 978,6935 -cimeno 4,14

9,394 983,038 limoneno 3,45

9,476 985,3378 1,8-cineole 1,53

10,624 1014,1723 -felandreno 17,67

11,758 1039,8866 trans--ocimeno 3,87

14,107 1093,1519 Linalool 0,24

15,715 1127,5701 terpinen-4-ol 40,69

16,186 1137,5131 -terpineol 9,31

26,737 1362,5464 -longipineno 1,66

27,624 1381,9514 longicicleno 0,39

29,034 1413,3989 -isocomeno 0,67

32,494 1492,6477 nerolidol 1,43

Os principais componentes ativos destes óleos são terpenóides oxigenados

(WALTON, et al., 2004), com a mais significativa o 1,8 cineol e o terpinen-4-ol. O

91

cineol é conhecido como irritante para a pele, enquanto o terpinen-4-ol possui uma

atividade antimicrobiana (SIMÕES, et al., 2002).

Brophy et al. (1989), afirma que os principais constituintes são o terpinen-4-

ol, 1,8-cineol, α-terpineno, γ-terpineno, α-pineno, β-pineno, α-terpineol, ρ-cimeno e

álcoois sesquiterpenos, representando cerca de 90% do óleo de M. alternifoilia.

Na análise das 12 amostras do óleo essencial foram identificados os

seguintes compostos majoritários: α-terpineno (7,1%), p-cimeno (5,5%), limoneno

(1,1%), 1,8-cineol (1,4%), γ-terpineno (18,2%), α-terpinoleno (3,0%), terpinen-4-ol

(36,6%) e α-terpineol (2,5%) (CASTELO, et al., 2013), confirmando os constituintes

químicos no presente trabalho.

Na análise CG-EM do P. emarginatus foram identificados sete componentes

químicos presentes no óleo (figura 4, tabela 3), como componente majoritário o -

cariofileno (30,23%; TR: 26,163), sendo todos hidrocarbonetos sesquiterpênicos.

Figura 4. Cromatografia do óleo essencial de Pterodon emarginatus com seus respectivos picos.

Tabela 3. Componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Pteredon emarginatus, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção

Tr KI calculado Nome % Área

24,171 1306,409976 Bicicloelemeno 4,29

24,915 1322,686502 -elemeno 9,68

26,163 1349,989061 -cariofileno 30,23

27,392 1376,875957 -humuleno 6,25

28,556 1402,450756 germancreno d 8,59

29,163 1416,353642 biciclogermancreno 8,39

30,25 1441,250573 cis-muurola-3,5-dieno 6,93

92

Na pesquisa de Teixeira (2003), no extrato hexânico foram caracterizados

ácidos graxos, sesquiterpenos (α-cariofileno, β-cariofileno, mirceno, α-pineno,

farnesene) e diterpenos tricíclicos furânicos com o isolamento do 6α,7β-

diacetoxivouacapan-17β-oato de metila.

Em estudo realizado por Polo et al. (2004), a análise qualitativa e quantitativa

do óleo essencial dos frutos de P. emarginatus evidenciou a presença dos

constituintes: α-pineno, mirceno, metil eugenol, etil eugenol, eugenol geraniol,

cariofileno.

Na análise da composição química do óleo essencial dos frutos de P.

polygalaeflorus obtido por Campos et al. (1990), foram identificados os seguintes

compostos químicos: ilangeno, α-capaeno, β-cariofileno, α-humuleno, γ-elemeno e

δ-cadineno, assemelhando-se à análise do óleo essencial das sementes de P.

emarginatus efetuada no presente trabalho.

O óleo de T. vulgaris apresentou concentrações de 21 constituintes químicos

(figura 5, tabela 4), tendo como compostos majoritários: o tricicleno (5,61%, TR:

6,229), o trieno santolina (7,67%; TR: 6,675), o -cimeno (21,22%; TR: 9,33), o

linalool (6,44%; TR: 12,265), o -terpineol (8,57%; TR: 16,161), o timol (22,53%; TR:

20,796) e o carvacrol (7,96%; TR: 21,117), representando um total de 80% dos

componentes detectados.

Figura 5. Cromatografia do óleo essencial de Thymus vulgaris e seus respectivos picos.

93

Tabela 4. Componentes identificados nos óleos essenciais das folhas de Thymus vulgaris, com as referidas porcentagens. *TR = Tempo de Retenção


6,229 891,3983 Tricicleno 5,61

6,675 906,8124 Trieno santolina 7,67

7,557 931,5391 -pineno 0,79

8,029 944,7715 Mirceno 2,55

8,478 957,3591 -meta-1(7),8-dieno 0,17

8,95 970,5915 -2-careno 0,38

9,33 981,2447 -cymene 21,22

9,424 983,88 Limoneno 1,75

9,5 986,0106 1,8-cineole 2,58

10,562 1012,7664 -3-careno 0,37

11,753 1039,7732 -meta-2,4(8)-dieno 0,29

12,265 1051,3832 Linalool 6,44

12,777 1062,9931 Endo-fenchol 0,38

13,679 1083,4467 1-terpineol 0,46

14,615 1104,3487 Isoborneol 0,6

15,009 1112,6662 Borneol 1,78

15,532 1123,7069 Terpien-4-ol 0,37

16,161 1136,9854 -terpineol 8,57

20,796 1234,8689 Timol 22,53

21,117 1241,6525 Carvacrol 7,96

Estudos realizados por Granger e Passet (1973), revelaram as seguintes

concentrações mínimas e máximas dos principais componentes em T. vulgaris

francês em diferentes condições ambientais: linalool (3-67%), acetato de terpenilo

(2-62%), o timol (0,2-65%) e carvacrol (0,2-72%) extraídos por hidrodestilação.

O óleo essencial de T. vulgaris obtido por extração com fluído supercrítico,

revelou a presença de p-cimeno e timol como componentes principais, além de

outros terpenóides como, por exemplo, carvacrol como menos de 1% (BLUM, et al.,

1997).

Guillén e Manzanos (1998), avaliaram a composição dos extratos obtidos das

folhas, flores e caules utilizando extração com diclorometano. Os autores

constataram que o extrato da folha é a mais rica em derivados terpênicos

oxigenados, um total de 50 foi detectado, em contraste com 38 e 43 em flores e

caules, respectivamente. Os principais componentes encontrados nas folhas foram:

1,8 cineol, linalool, β-pineno, canfeno, α-pineno. Nas flores, os principais foram:

linalol, elemol e trans-cariofileno. Enquanto que nas hastes os componentes

94

majoritários foram: hexacosanal, nonacosano, β-sitoesterol, sendo que nos três tipos

de amostras foram encontrados apenas traços o timol e o carvacrol.

No óleo essencial de tomilho obtido por destilação de vapor de micro-extração

para solventes orgânicos mais leves do que a água, a partir de folhas secas foram

caracterizados a presença de γ-terpineno (4,3%), p-cimeno (23,5%), carvacrol

(2,2%), e timol (63,6%), que representava 93,6% do total do óleo (DAFERERA, et

al., 2000).

Ozcan e Chalchat (2004), na Turquia, extraíram por hidrodestilação o óleo

essencial de partes aéreas de T. vulgaris e identificaram 30 compostos. Os

componentes majoritários encontrados foram: timol (46,2%), γ-terpineno (14,1%), p-

cimeno (9,9%), linalool (4,0%), mirceno (3,5%), α-pineno (3,0%) e α-tujona (2,8%),

confirmando a composição química no presente estudo.

Furtado (2005), em sua pesquisa com a L. sidoides, relata que após a

extração do óleo essencial obteve como componente principal o timol, com

concentração de 73,1% em sua composição.

Com relação a atividade inseticida, os controles negativo não apresentaram

mortalidade, demonstrando que o solvente com água e o DMSO 2% são inofensivos,

e que as atividades apresentadas estão relacionadas somente às amostras

testadas.

No presente estudo, o óleo de L. camara nas concentrações de 260 ppm e

350 ppm resultou em mortalidade para larvas do A. aegypti de 60% e 90%,

respectivamente, em 24 horas. A concentração de 350 ppm eliminou em 1 hora 50%

das larvas. Na concentração de 440 ppm a mortalidade foi de 100% das larvas, em

24 horas (gráfico 1 e 2).

95

Gráfico 1. Comparação das diferentes concentrações do óleo essencial de Lantana camara com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti, com tempo de 1, 2, 4, 6, 12 e 24 horas. (ppm = partes por milhão).

Gráfico 2. Comparação da concentração do óleo essencial de Lantana camara com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti em 24 horas. (ppm = partes por milhão).

L. camara possui atividade inseticida contra pragas de grãos armazenados,

larvas de mosquitos, atividade antifúngica, repelente (SHARMA et al., 1988; TAOUBI

et al., 1997; CHHARBA et al., 1993; CHAVAN, NIKAM, 1982; DUA et al., 2003).

Dua et al (2010) em sua pesquisa, relatam a atividade adulticida do óleo

essencial de L. camara em 0,208 mg/cm2 de papéis impregnados contra diferentes

espécies de mosquitos. Valores de concentração letal (KDT50 e KDT90) do óleo

essencial ficaram por 20, 18, 15, 12 e 14 min e 35, 28, 25, 18 e 23 min,

respectivamente, em contato com A. aegypti, C. quinquefasciatus, Anopheles

96

culicifacies, Anopheles fluviatilis e Anopheles stephensi e a percentagem de

mortalidade foi de 93,3%, 95,2%, 100%, 100%, e 100% respectivamente.

Atividade larvicida de extratos metanólico e etanólico de folhas e flores de L.

camara foram relatados contra os 3º e 4º estádio de larvas do mosquito A. aegypti e

Cx. quinquefasciatus. Ambos os extratos exibiram atividade larvicida significativa

contra ambas as espécies de mosquitos, no entanto, os extratos com baixas

concentrações (1 mg/mL) foram altamente ativos contra A. aegypti do que a de Cx.

quinquefasciatus (KUMAR, MANEEMEGALAI, 2008).

O óleo de M. alternifolia, nas concentrações de 267 ppm e 350 ppm

apresentou uma mortalidade para larvas do A. aegypti acima de 75%, em 24 horas.

Na concentração de 445 ppm em 24 horas, a atividade larvicida foi de 100%

(gráficos 3 e 4).

Gráfico 3. Comparação das diferentes concentrações do óleo essencial de Melaleuca alternifolia com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti, com tempo de 1, 2, 4, 6, 12 e 24 horas. (ppm = partes por milhão).

97

Gráfico 4. Comparação da concentração do óleo essencial de Melaleuca alternifolia com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti em 24 horas. (ppm = partes por milhão).

No referido estudo, o óleo essencial de M. alternifolia e o seu componente

ativo, terpinen-4-ol, foram altamente eficazes na redução do tempo de sobrevivência

da larva do mosquito A. aegypti. A concentração de 267 ppm foi capaz de matar

mais de 75% das larvas em 24 horas.

Na pesquisa realizada por Park et al (2011), a Melaleuca spp. possui várias

espécies com atividade larvicida contra A. aegypti, dentre elas a Melaleuca

linariifolia, M. dissitiflora e a M. quinquenervia, cujos óleos essenciais obtiveram mais

de 80,0% de mortalidade na concentração de 0,1 mg/mL em 48h de exposição. No

entanto, em estudo larvicida realizado por Amer & Mehlhorn (2006), o óleo da M.

quinquenervia causou mortalidade de 30,0% das larvas de terceiro estádio de A.

aegypti após 24h de exposição em solução de 50 ppm.

De acordo com Conti (2014), os monoterpenos oxigenados presentes no óleo

essencial da M. alternifolia possuem atividade tóxica sobre larvas de Aedes

albopictus com concentração letal (CL50) de 267,13 ppm.

A composição química da M. alternifolia é bem caracterizada e definida,

sendo que o terpinen-4-ol pode constituir cerca de 40% da composição do óleo,

tornando-se o componente majoritário (COX et al., 2001), o que comprovado pelo

presente trabalho. Este componente químico é o principal responsável pelas

propriedades medicinais.

A atividade do OEM, do terpinen-4-ol e de outros componentes deste óleo já

foram testadas em vários microrganismos. Existem relatos de atividade sobre

98

Sarcoptes scabiei, sendo que o terpinen-4-ol demonstrou maior atividade que o óleo

de melaleuca (WALTON, 2004). Em experimento semelhante, avaliando-se o efeito

sobre Candida albicans, também foi observada uma ação ligeiramente melhor no

seu componente majoritário, o terpinen-4-ol (NINOMIYA et al., 2012). No

experimento de James & Callander (2012), observaram a eficácia do óleo e do

terpinen-4-ol contra formas adultas e em ovos do piolho Bovicola ovis.

Em pesquisa realizada por Da Silva et al. (2014), no controle do Alphitobius

diaperinus, o terpinen-4-ol (principal composto do óleo) foi testado nas mesmas

concentrações do óleo puro, apresentou eficácia similar ao mesmo (superior a 10%

para larvas e 25% para adultos).

O óleo de P. emarginatus, em todas as concentrações (14, 70, 140, 210, 280,

350 e 420 ppm) ocasionou uma mortalidade de larvas para A. aegypti menor que

25% em 24 horas (gráficos 5 e 6).

Gráfico 5. Comparação das diferentes concentrações do óleo essencial de Pterodon emarginatus com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti, com tempo de 1, 2, 4, 6, 12 e 24 horas. (ppm = partes por milhão).

99

Gráfico 6. Comparação da concentração do óleo essencial de P. emarginatus com a taxa de mortalidade das larvas de A. aegypti em 24 horas. (ppm = partes por milhão).

O óleo de P. emarginatus não apresentou eficácia estatisticamente

siginificativa, sendo que a concentração utilizada do referido óleo de 420 ppm não foi

capaz de eliminar 25% das larvas do A. aegypti.

Vários estudos demonstram a ação larvicida utilizando apenas extratos.

Segundo Pimenta (2006), o extrato hexânico de P. polyglaeflorus nas concentrações

de 50, 100, 250 e 500 g/mL tiveram uma eficácia de 100% de mortalidade nas

larvas de A. aegypti. Testado o óleo essencial de Pterodon polyglaeflorus, a

mortalidade de 100% das larvas ocorreu somente nas concentrações de 250 e 500

ug/mL. Na pesquisa realizada por Santos (2009), que utilizou o extrato oleoso da

semente de Pterodon spp. contra larvas de A. aegypti, os resultados demonstraram

boa toxidez contra o vetor, alcançando mortalidade de 80% da população larval.

A atividade larvicida para A. aegypti do óleo de T. vulgaris na concentração de

44 ppm foi de 55%, na de 88 ppm foi de 70%, as concentrações de 132 ppm e 176

ppm tiveram uma mortalidade acima de 75%, em 24 horas, e na concentração de

260 ppm, a mortalidade foi de 100% em 1 hora. (gráficos 7 e 8).

100

Gráfico 7. Comparação das diferentes concentrações do óleo essencial de Thymus vulgaris com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti, com tempo de 1, 2, 4, 6, 12 e 24 horas. (ppm = partes por milhão).

Gráfico 8. Comparação da concentração do óleo essencial de Thymus vulgaris com a taxa de mortalidade das larvas de Aedes aegypti em 24 horas. (ppm = partes por milhão).

Os óleos essenciais atuam sobre os insetos, carrapatos, e em muitos outros

agentes patogénicos, principalmente devido ao seu efeito tóxico, interferindo com as

funções bioquímicas e fisiológicas dos mesmos (SALISBURY, ROSS, 1992).

O óleo essencial de T. vulgaris apresentou alta eficácia larvicida, por

apresentar em sua composição monoterpenos oxigenados (49,09%) e

monoterpenos hidrocarbonetos (42,93%) e como componenentes principais: o timol

(22,53%) e ο -cimeno (21,22%). A CL50 foi de 44 ppm, em 24 horas.

101

Vários estudos sobre óleos essenciais de T. vulgaris têm relatado atividades

diferentes contra insetos, incluindo atividade larvicida, repelente e de oviposição

contra algumas espécies de Culex, Anopheles e Aedes (PAVELA, 2009).

Em sua pesquisa, LOPEZ et al. (2015), o óleo essencial de T. vulgaris

apresentou atividade antilarval com valores de CL50 de 1,81 e 23,80 μg/mL para as

larvas de Nova Orleans e as populações locais (Nuevo Leon, México),

respectivamente, em 24 horas. Entre as seus principais componentes, o óleo

continha timol (39%) e carvacrol (3,5%), confirmando a constituição química no

presente estudo.

Na pesquisa de Young-Uk et al. (2012), a eficácia de uma mistura binária de

1:2 de timol e vanilina (0,05:0,1l por cm2) foi estudada para ser significativamente

mais eficaz do que o timol sozinho por um período de 120 min. Além disso, o timol,

α-terpineno e carvacrol mostraram elevada atividade larvicida sobre as larvas de

terceira fase de Aedes albopictus com valores de CL50 de 0,9 l/100mL.

Segundo Furtado (2005), em sua pesquisa, o óleo de L. sidoides obteve um

potencial efeito larvicida contra o A. aegypti, que apresentou uma CL50 de 45,5

mg/ml e CL90 de 48,3 mg/mL. A espécie L. sidoides é usada frequentemente na

medicina alternativa contra infecções em geral, ferimentos da pele e do couro

cabeludo (MATOS, 1994).

Os resultados apresentados estão de acordo com estudos de Carvalho et al.

(2003), que demonstraram a propriedade larvicida desse óleo essencial. Os autores

consideraram o timol como componente ativo principal e altamente tóxico contra

larvas de A. aegypti sendo capaz de induzir 100% de mortalidade em 90 min., na

concentração 0,017% (água/ volume).

CONCLUSÕES

A utilização de óleos essenciais no combate à insetos é um grande avanço

no controle alternativo de pragas. São métodos para minimizar os efeitos nocivos no

ambiente de alguns compostos pesticidas. O presente estudo identificou mais óleos

essenciais como a L. camara, M. alternofilia e T. vulgaris, mostrando atividade

larvicida contra A. aegypti.

102

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108

CONCLUSÕES GERAIS

No estudo realizado, foi possível concluir que os óleos de C. sinensis, L.

camara, P. emarginatus e V. divergens avaliados não possuem eficácia carrapaticida

em larvas de R. microplus, portanto, não devem ser utilizados para o controle de R.

microplus, mas que através da identificação da composição química e conhecimento

dos seus constituintes, novos estudos poderão ser realizados para testar a atividade

sobre outros organismos.

Em contrapartida, têm sido desenvolvidas pesquisas para obtenção de

inseticidas naturais menos poluentes e mais seletivos para o controle populacional

de vetores como o Aedes aegypti. No presente estudo, os óleos de L. camara, M.

alternofilia e T. vulgaris, mostraram atividade larvicida contra A. aegypti. Estes

resultados sugerem que os óleos vegetais são promissores como biolarvicidas

contra o A. aegypti.

109

Anexos

Tabela 1. Identificação por GC-MS de constituintes químicos em Citrus sinensis,

Lantana camara, Pterodon emarginatus e Vochysia divergens obtidos por

hidrodestilação.

Citrus

sinensis Lantana camara


Vochysia divergens

Composição química % KI

calculado %

KI calculado

% KI

calculado %

KI calculado

Monoterpenos

1,8-cineole - - 4,36 985,25 - - - -

-pineno 0,97 942,83 3,61 931,48 - - - -

Carvona 0,18 1184,73 - - - - - -

Limoneno 88,25 986 - - - - - -

Tricicleno 1,38 890,93 5,07 890,88 - - - -

Mirceno 4,71 944 - - - - - -

Neral 0,25 1210,37 - - - - - -

Monoterpenos oxigenados

Linalool 1,4 1050,52 3,92 1050,90 - - - -

Mircenol 0,21 1135,78 - - - - - -

Sesquiterpenos

-humuleno - - - - 6,25 1376,87 - -

-cariofileno - - 12,49 1346,51 30,23 1349,98 - -

-elemeno - - - - 9,68 1322,68 - -

bicicloelemeno - - - - 4,29 1306,40 - -

Epi--santaleno - - 7,36 1376,48 - - - -

-elemeno - - 4,32 1415,27 - - - -

Germancreno D - - - - 8,59 1402,45 - -

Biciclogermancreno - - - - 8,39 1416,35 - -

-cubeneno - - 1,36 1305,77 - - - -

Cis-muurola-3,5-dieno - - - - 6,93 1441,25 - -

Sesquiterpenos oxigenados

-fenchocamphorone (acamphor)

0,05 1102,08 - - - - - -

Davanona B - - 16,55 1498,90 - - - -

Outros compostos químicos

2-cis-nonen-1-al 1,08 1150,41 - - - - - -

3-cis-hexenol - - - - - - 76,34 807,83

4-metil-pentanol - - - - - - 18,42 818,60

Benzaldeído - - - - - - 5,24 916,93

n – octanal 0,77 955 - - - - - -

(KI = Índice de Kovats)

110

Tabela 2. Identificação por GC-MS de constituintes químicos em Lantana camara,

Melaleuca alternifólia, Pterodon emarginatus e Thymus vulgaris obtidos por

hidrodestilação.

Lantana camara

Melaleuca alternifolia


Thymus vulgaris

Compostos químicos % % % %

Monoterpenos

1,8-cineole 4,36 1,53 - 2,58

-felandreno - 17,67 - -

Mirceno - 3,77 - 2,55

-pineno 3,61 0,29 - -

-terpineno - 9,38 - -

-pineno - - - 0,79

Limoneno - 3,45 - 1,75

Tricicleno 5,07 - - 5,61

Trieno santolina - - - 7,67

Trans--ocimeno - 3,87 - -

-2-careno - - - 0,38

-3-careno - - - 0,37

-cimeno - 4,14 - 21,22

Monoterpenos oxigenados

Borneol - - - 1,78

Carvacrol - - - 7,96

1-terpineol - - - 0,46

-terpineol - - - 8,57

-terpineol - 9,31 - -

Isoborneol - - - 0,6

Linalool 3,92 0,24 - 6,44

Endo-fenchol - - - 0,38

Terpien-4-ol - 40,69 - 0,37

Thymol - - - 22,53

Sesquiterpenos

-humuleno - - 6,25 -

Bicicloelemeno - - 4,29 -

Biciclogermancreno - - 8,39 -

-isocomeno - 0,67 - -

-longipineno - 1,66 - -

-elemeno - - 9,68 -

-cubebeno 1,36 - - -

-cariofileno 12,49 - 30,23 -

Cis-muurola-3,5-dieno - - 6,93 -

Epi--santaleno 7,36 - - -

Germancreno D - - 8,59 -

Longicicleno - 0,39 - -

-elemeno 4,32 - - -

-meta-1(7),8-dieno - - - 0,17

111

-meta-2,4(8)-dieno - - - 0,29

Sesquiterpenos oxigenados

Nerolidol - 1,43 - -

Davanona B 16,55 - - -

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