Universidade de Lisboa 

Faculdade de Ciências 

Departamento de Biologia Animal 

UNDERSTANDING THE ROLES OF PIWIL3 AND 

TACC3 PROTEINS DURING BOVINE OOCYTE 

DEVELOPMENT 

 

 

 

 

ANA RITA CANHOTO LEITOGUINHO 

 

 

 

Dissertação 

Mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento 

2012

Universidade de Lisboa 

Faculdade de Ciências 

Departamento de Biologia Animal 

UNDERSTANDING THE ROLES OF PIWIL3 AND 

TACC3 PROTEINS DURING BOVINE OOCYTE 

DEVELOPMENT 

 

 

ANA RITA CANHOTO LEITOGUINHO 

 

 

Dissertação 

Mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento 

 

Dissertação orientada por: 

Professora Dra. Maria Gabriela Rodrigues (DBA/FCUL) 

Professor Dr. Bernard Roelen (BRC/UU) 

2012

I 

Acknowledgements  

 

 

I would like to express my deep and sincere gratitude to Bernard for this opportunity 

and  for  being  always  there  when  I  needed.  Also  a  special  thanks  to  the  entire  lab,  in 

particular to Mahdi for his patience, help and great talks, to Eric for the tips on music and to 

Leni for her constant guidance and assistance in the Lab.  

From the warm and dry part of Europe, my sincere thanks to Gabriela for her support 

and great advices. 

 

Para a minha mãe, pai e irmã um muito obrigado por me providenciarem tudo o que 

sempre precisei, mesmo nestes tempos difíceis. Nunca teria conseguido sem a vossa ajuda.  

 

To all my  friends, can’t  thank you enough. Thank you  to Nuno, Luís, Silvia, Yuri and 

Filipa for your help during rough times and for your friendship. Also, to all Utrecht friends, a 

big cheers for your welcoming feeling.  

Last but not  least, a  loving gratitude to Stephin  for his boundless wisdom, smile and 

company. 

 

 

This thesis is for all of you.  

 

Ana Rita Leitoguinho / Toga 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

In loving memory of my grandfather 

II 

Abstract 

 

In  order  to  achieve  a  healthy  embryo,  the  germline  needs  to  properly  develop  while 

protecting  its genome against endogenous and exogenous adversities. The PIWI proteins, a 

subgroup  of  Argonaute  proteins,  are  involved  in  the  search  and  silencing mechanism  of 

transposons  ‐  genetic  transposable  elements‐  through  a mechanism  of  complementarity 

with piRNAs (Piwi‐interacting RNAs). These proteins are germline‐specific and are thought to 

be also male‐specific in mammals. PIWIL3 (Piwi‐like 3) is part of this family and it is present 

in the human and bovine genome, while rodents have PIWIL1, PIWIl2 and PIWIL4, but lack a 

gene  for PIWIl3. Recent  findings on bovine cells suggested a  role  for PIWIL3  in  the  female 

germline, the oocyte. Here, PIWIL3 protein was detected both  in the bovine oocyte and  in 

somatic  cells  surrounding  it,  using  an  antibody  directed  against  the  Human  PIWIL3 

suggesting a role for this protein in protecting the oocyte genome. 

Besides protecting the genome, the oocyte also needs to enroll meiosis. Transforming 

acidic  coiled‐coil  3  (TACC3)  acts  in  a  complex with  ch‐TOG  and  clathrin  to  ensure mitotic 

spindle stability and organization. TACC3 is phosphorylated and activated by Aurora‐A kinase 

and  it  is  responsible  for  TACC3’s  proper  placement  in  the  centrosomes.  The  order  of 

recruitment of these proteins to the spindle is still open for debate, as it is the role of TACC3 

during meiosis. Our  antibody  designed  to  identify  bovine  PIWIL3 was  in  fact  recognizing 

TACC3 and we could therefore study the spatiotemporal localization of TACC3 in the oocyte 

and  during  embryo  development.   When  bovine  oocytes  are matured with MLN8054,  an 

Aurora‐A  inhibitor,  they  exhibit  (i)  dispersion  of  TACC3  protein  in  the  cytoplasm  (ii) 

formation of an abnormal meiotic spindle (ii) meiotic arrest in the metaphase I stage and (iii) 

decreased percentage of blastocyst formation suggesting a role of TACC3 in meiotic spindle 

assembly, vital for oocyte and early embryo development.  

 

Keywords: Bovine, Oocyte, Piwi‐like 3 (PIWIL3), TACC3 and Aurora‐A kinase 

III 

Resumo em Português  

 

Todos os  indivíduos que se reproduzem sexualmente combinam a sua  informação genética 

para criar um novo ser e apesar de todas as células possuírem esta  informação, apenas as 

células  sexuais  são capazes de a  transmitir à descendência. É por  isso vital proteger estas 

células  de  fatores  externos  ou  internos  que  possam  afetar  o  seu  genoma  bem  como 

certificar  um  correto  desenvolvimento  do  oócito  com  o  intuito  de  formar  um  embrião 

saudável.  

O processo de maturação do oócito envolve o desenvolvimento da célula bem como a 

criação de estruturas de suporte que o protegem de agressões externas. A Foliculogénese é 

processo  responsável  pelo  suporte  físico  do  oócito,  altamente  regulado  hormonalmente 

pelo  ovário,  onde  várias  camadas  celulares  são  formadas  consecutivamente  em  volta  do 

oócito, contribuindo para que o resultado final seja uma célula sexual protegida, formando o 

folículo  antral.  Concomitantemente,  também  a  própria  célula  sofre  alterações  críticas. 

Durante  a maturação nuclear do oócito, ou oogénese,  é essencial que  este  reduza o  seu 

número  de  cromossomas  a  metade,  formando  um  gameta  haplóide  (com  metade  da 

informação genética). Após  fertilização, este resultará num zigoto diplóide  (com o  total da 

informação  genética)  com  informação  materna  e  paterna  que  diferem  não  apenas  na 

informação genética mas  também em  fatores associados que são transmitidos não por via 

genética, mas por via epigenética. 

Para  além  dos  rearranjos  nucleares  acima  referidos,  também  o  genoma  da  célula 

sexual  está  sujeito  a  agressões  endógenas,  como  os  transposões,  elementos móveis  do 

genoma que se podem  inserir em diversas zonas, podendo  interferir com a  transcrição de 

genes vitais para a célula. Existem vários mecanismos de defesa celular que silenciam estes 

elementos,  um  destes  é  o  RNA  de  interferência  (RNAi)  que,  com  ajuda  de  proteínas 

Argonautas,  consegue  localizar  e  silenciar  RNA  mensageiro  (mRNA)  através  de  um 

mecanismo de complementaridade, evitando a sua propagação pelo genoma. Esta família de 

Argonautas contém o grupo de proteínas PIWI cuja expressão é restrita às células da  linha 

germinal.  Recentemente  descobriu‐se  que  estas  proteínas  PIWI  são  alvo  de  um  tipo 

particular  de  RNAi,  os  piRNAs  (Piwi‐interacting  RNAs)  cuja  principal  função  é  silenciar 

elementos transponíveis na linha germinal. Tendo como base mutantes PIWI em Drosophila 

que ativam  transposões, o estudo de proteínas PIWI e piRNA  tem avançado bastante nos 

últimos  tempos  revelando  também  em  C.  elegans,  Zebrafish  e  ratinho  o  papel  destas 

IV 

proteínas na  formação da  linha  germinal. No  ratinho  existem  três  genes da  família  PIWI: 

Miwi  (Piwi‐like 1), Mili (Piwi‐like 2) e Miwi2  (Piwi‐like 4) e mutantes destes genes resultam 

em esterilidade masculina, em contraste com Drosophila e Zebrafish onde ambas as  linhas 

germinais  masculina  e  feminina  são  afetadas.  Até  à  data  não  se  sabe  a  função  destas 

proteínas  na  linha  germinal  feminina de mamíferos,  razão pela qual  a  descoberta  de  um 

quarto gene Piwi‐like (PIWIL3) em mamíferos que não o ratinho suscitou bastante interesse. 

Recentemente, este gene foi descrito em oócitos de bovinos e a facilidade em obter oócitos 

de  vaca  fizeram  com que este organismo  fosse o escolhido para o estudo desta proteína 

PIWIL3.  

Os  nossos  resultados  revelaram  primeiro  que  tudo  que  o  anticorpo  e  primers 

construídos  anteriormente  para  a  proteína  PIWIL3  em  vaca  estavam  mal  construídos. 

Propomos aqui um padrão de expressão proteico diferente do anteriormente documentado. 

Com  o  uso  de  anticorpos  anti‐humano  dirigidos  a  PIWIL3,  identificou‐se  a  proteína  nas 

células de suporte que rodeiam o oócito, sugerindo que a expressão desta proteína PIWI em 

vaca não é específica para a  linha germinal. Esta presença de PIWIL3 na  linha somática que 

rodeia o oócito pode ser essencial para a proteção do genoma do oócito, essencial para a 

correta propagação da informação genética à descendência.  

 

Aquando do estudo de PIWIL3, descobriu‐se que o anticorpo estava a reconhecer uma 

outra proteína em vez de PIWIL3, a TACC3 (Transforming Acidid Coiled‐Coil protein 3), o que 

fez  com que  este projeto  se  começasse  a  focar no papel  desta outra proteína durante o 

desenvolvimento do oócito. 

Também uma correta divisão celular é essencial para uma célula sexual e as proteínas 

TACC (Transforming acidic coiled‐coil proteins) estão de mãos dadas com esta prática. Estas 

proteínas estão presentes em diferentes organismos e  localizam‐se tanto nos microtúbulos 

que se formam durante o processo de separação dos cromossomas como nos centrossomas, 

estruturas  que  se  localizam  nos  dois  pólos  opostos  do  fuso  mitótico.  Em  ratinho  são 

conhecidas três proteínas TACC ‐ TACC1, TACC2 e TACC3 ‐ e sabe‐se que TACC3 é essencial 

para a correta formação do fuso mitótico durante uma mitose. Mutantes TACC3 revelaram 

um  fuso  mitótico  anormal  que,  juntamente  com  cromossomas  desalinhados  na  placa 

metafásica, originam  incorreta  segregação  cromossómica,  resultando em  células‐filha  com 

diferente  conteúdo  cromossómico.  O  recrutamento  de  TACC3  para  os microtúbulos  que 

formam o fuso é regulado por uma kinase, a Aurora‐A, que é responsável pela fosforilação e 

ativação  desta  proteína  em  diversas  espécies  como  Drosophila,  C.elegans,  Xenopus  e 

V 

Humanos. Quando esta  kinase é  inibida, por exemplo pelo  composto MLN8054,  a mitose 

falha  de  forma  semelhante  aos mutantes  de  TACC3,  contudo  alguma  células  conseguem 

dividir‐se, ainda que originando células aneuplóides ou tetraplóides. Porém, TACC3 não atua 

sozinha e  recentemente  foi descoberto que o  faz em conjunto com outras duas proteínas 

num  complexo  proteíco  denominado  TACC3/ch‐TOG/clatrina.  TACC3,  clatrina  e  ch‐TOG 

(Colonic‐hepatic  Tumour Overexpressed Gene)  atuam  como  pontes  entre microtúbulos  e 

têm como função estabilizar estas fibras. Apesar de se saber que todos os intervenientes do 

complexo são  importantes, a ordem de recrutamento dasdiferentes proteínas ainda é alvo 

de uma acesa discussão entre defensores que afirmam que clatrina recruta TACC3 e outros 

que defendem ser TACC3 o primeiro componente do complexo, recrutando clatrina. 

Apesar  de  ter  sido  estudada  em  oócitos de  ratinho,  informação  sobre  a  função da 

proteína TACC3 durante a meiose de mamíferos é quase nula, o que  realça a  importância 

deste  estudo. Os  nossos  resultados  demonstram  que  a  proteína  se  encontra  rodeando  a 

cromatina do oócito e no  fuso meiótico do mesmo durante a meiose, sugerindo um papel 

semelhante ao documentado no  ratinho quanto à manutenção dos microtúbulos do  fuso. 

Quanto à sua  função,  foi utilizado um  inibidor de Aurora‐A, MLN8054, que  resultou numa 

paragem no desenvolvimento do oócito na metafase  I, efeito semelhante aos previamente 

descritos em células humanas. Também o fuso meiótico revelou sérias perturbações quando 

os  oócitos  maturam  num  meio  com  o  inibidor  o  que,  juntamente  com  a  dispersão  da 

proteína  TACC3  no  citoplasma  e  a  diminuição  da  percentagem  de  blastocistos  formados, 

sugere que este  inibidor estará a  influenciar a expressão ou ativação de TACC3. Apesar de 

não conseguirmos saber ao certo com este estudo se TACC3 esta de fato inibida, é essencial 

averiguar o padrão de fosforilação desta proteína para poder estabelecer uma ligação causa‐

efeito entre o  inibidor e a fosforilação/correta  localização de TACC3. Também nesta tese é 

proposto um modelo de  recrutamento do complexo que se baseia na possibilidade de ser 

TACC3 o primeiro e talvez principal interveniente. 

 

Em suma, os resultados desta tese referentes a TACC3 e a PIWIL3 revelam que ambas 

aparentam  ter  uma  função  durante  o  desenvolvimento  da  linha  sexual  feminina  e  é 

considerado  de  extrema  importância  estudar  ambas. Quanto  aos  entraves  que  o  projeto 

PIWIL3 sofreu, apesar de ter afetado parte da  investigação da PIWIL3, serviu também para 

conhecer  esta  nova  proteína,  a  TACC3,  em  oócitos.  Esta  tese  propõe  um  padrão  de 

expressão diferente de PIWIl3 com uma possível função também na linha somática em redor 

do oócito. Quanto a TACC3 os nossos resultados revelaram que quando a sua ação é inibida, 

VI 

os oócitos não progridem na oogénese e revelam anomalias no fuso. Assim é sugerido que 

esta proteína  tenha um papel crucial no processo de  formação e correto alinhamento dos 

cromossomas na placa metafásica durante o desenvolvimento do oócito de vaca.  

 

Palavras‐chave: Bovino, Oócito,  Piwi‐like 3 (PIWIL3), TACC3, Aurora‐A 

VII 

Table of Contents 

 

Acknowledgements ............................................................................................................ I 

Abstract ............................................................................................................................. II 

Resumo em Português ...................................................................................................... III 

Table of Contents ............................................................................................................. VII 

Index of Figures .............................................................................................................. IX 

Index of Tables ................................................................................................................ X 

Index of Supplementary Tables ....................................................................................... X 

 

Introduction ...................................................................................................................... 1 

Follicle development protects the cell from outside adversities .................................... 1 

Oocyte Development and Maturation ............................................................................ 2 

Protecting germ cell’s integrity via Argonaute proteins ................................................. 5 

Unraveling PIWI proteins in germ cells throughout species ........................................... 6 

Disclosures in the PIWIL3 former research ..................................................................... 7 

Transforming Acidic Coiled‐Coil (TACC) Proteins ............................................................ 9 

Phosphorylation and activation of TACC3 by Aurora‐A kinase ..................................... 11 

TACC3/ch‐TOG/clathrin  complex  stabilizes  kinetochore  fibers  by  inter‐microtubule 

bridging .................................................................................................................................... 12 

TACC3/ch‐TOG/clathrin complex activation, two hypotheses ..................................... 13 

 

Material and methods ..................................................................................................... 15 

Oocyte collection and in vitro maturation .................................................................... 15 

In vitro fertilization and embryo culture ....................................................................... 15 

Immunocytochemistry .................................................................................................. 16 

Immunofluorescence .................................................................................................... 17 

Western blotting ........................................................................................................... 18 

Aurora‐A inhibition experiment .................................................................................... 19 

 

Results ............................................................................................................................. 20 

Sorting out the bovine Piwi‐like 3 antibody and unraveling Transforming Acidic Coiled‐

Coil protein 3 (TACC3) ............................................................................................................. 20 

VIII 

Detection of  PIWIL3  expression  in bovine oocytes using  antibodies directed  against 

the human sequence ............................................................................................................... 22 

TACC3’s expression pattern during oocyte and early zygote development: its presence 

surrounding chromatin and the meiotic spindle ..................................................................... 24 

TACC3’s presence surrounding the metaphase plate in the metaphase II ................... 26 

TACC3 partially overlaps with α‐tubulin during oocyte and early zygote development

 ................................................................................................................................................. 27 

Discerning  TACC3  function:  using  MLN8054  compound,  an  Aurora‐A  inhibitor, 

decreases oocyte developmental progress and causes spindle anomalies ............................ 29 

Effects of MLN8054 on TACC3 protein expression ....................................................... 31 

 

Discussion ........................................................................................................................ 33 

PIWIL3 during bovine oocyte development .................................................................. 33 

TACC3 protein in bovine oocyte development ............................................................. 35 

Future perspectives ....................................................................................................... 39 

Concluding remarks ....................................................................................................... 39 

 

References ....................................................................................................................... 40 

 

Supplementary Information .............................................................................................. XI 

 

IX 

Index of Figures 

 

Figure 1‐ Schematic representation  of bovine folliculogenesis. .............................................. 2 

Figure 2‐ Schematic representation of bovine oogenesis ......................................................... 3 

Figure 3 ‐ Schematic representation of siRNA‐guided mRNA cleavage. ................................... 5 

Figure 4 ‐ Homology between mammalian PIWI proteins. ....................................................... 7 

Figure 5 ‐ mRNA quantification of PIWIl3 and PIWIL3 expression pattern ............................... 8 

Figure  6  ‐  Centrosome  and  spindle  localization  of  TACC  proteins  in  C.  elegans,  D. 

melanogaster, X. laevis and Human. ............................................................................. 10 

Figure 7 ‐ Depletion of Xenopus’ TACC3 (xTACC3): effects on the spindle. ............................ 11 

Figure 8 ‐ Two models representing the recruitment of  the complex TACC3/ch‐TOG/clathrin 

to the spindle. ............................................................................................................... 13 

Figure 9 ‐ Schematic representation of two Piwi‐like 3 aminoacid sequences ....................... 20 

Figure 10 ‐ Double stainings TACC3 and ’TACC3’ during oocyte maturation and blastocyst.  21 

Figure  11  ‐ Merge  channels  of  (A) DAPI  and  PIWIL1  and  (B) DAPI  and  PIWIL2  expression 

patterns during metaphase II. ....................................................................................... 22 

Figure  12  ‐  Schematic  representation  of  the  human  Piwi‐like  3  aminoacid  sequence  and 

bovine Piwi‐like 3 aminoacid sequences ....................................................................... 22 

Figure 13 ‐ HPIWIL3‐A and HPIWIL3‐B stainings on different staged oocytes and blastocysts.

 ....................................................................................................................................... 23 

Figure  14  ‐  Immunocytochemistry  results  for  HPIWIL3‐A  and  PIWIL3‐B  in  human  testis, 

bovine testis and bovine ovary. .................................................................................... 24 

Figure 15 ‐ ‘TACC3’ expression pattern during oocyte development and early embryogenesis.

 ....................................................................................................................................... 25 

Figure 16 ‐ Microfilament and microtubule stainings on metaphase II oocytes .................... 26 

Figure 17 ‐ Double stainings ‘TACC3’ and actin on metaphase II oocytes. ............................. 27 

Figure 18 – Double stainings  of ‘TACC3’ and microtubules on oocytes and early zygotes. ... 29 

Figure 19 ‐Effect of MLN8054 throughout oocyte developmental progress .......................... 30 

Figure  20  –  Effect  of  MLN8054  on  oocyte  polar  body  percentage  and  percentage  of 

blastocyst formation from cleaved embryos ................................................................ 30 

Figure 21 ‐ Effects of MLN8054 on oocyte meiotic spindle during oocyte maturation process

 ....................................................................................................................................... 31 

Figure 22 ‐ Effects of MLN8054 on TACC3 protein expression pattern during metaphase I and 

II oocytes. ...................................................................................................................... 32 

X 

Figure 23 ‐ Western Blot on TACC3 protein and β‐actin in four different groups .................. 32 

Figure 24 – Proposed TACC3/ch‐TOG/clathrin  recruitment  to  the  spindle and centrosomes 

during bovine oocyte development .............................................................................. 38 

 

Index of Tables 

 

Table 1  ‐ Composition of multiple culture mediums used during oocyte  in‐vitro maturation 

and fertilization and embryo culture. ........................................................................... 15 

Table 2 ‐ Detailed description of the antibodies used. ........................................................... 17 

Table 3 ‐ Detailed description of the Buffers used on the Western Blot. ............................... 19 

Table 4 ‐ Experimental design for the MLN8054 experiment. ................................................ 19 

 

Index of Supplementary Tables 

 

Supplementary Table 1 ‐ Effect of MLN8054 during oocyte meiosis progression .................. XI 

Supplementary Table 2 ‐ Effect of MLN8054 during polar body extrusion. ............................ XI 

Supplementary Table 3 ‐ Effect of MLN8054 on blastocyst formation. .................................. XI 

1 

Introduction 

 

For  centuries,  the  question  of  how  a  new  being  comes  into  existence  has  provided  a 

constant  intellectual  challenge  and,  since  ancient  Greece,  several  philosophers  have 

attempted to connect fertilization events with the creation of a new being. Once the in vivo 

fertilization mechanism was understood, the molecular mechanisms underlying the process 

presented  the  subsequent  challenge.    In  1978,  the  first  human  birth  originating  from  a 

successful  in‐vitro‐fertilization  (IVF)  was announced  1,  an  accomplishment  which  earned 

Robert Edwards the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 2010.

The process of embryonic development goes through distinct stages with specific cell 

types, which differ from somatic ones in their capacity to pass our genetic code to the next 

generation. These are called germ cells and give rise to gametes  in organisms with a sexual 

reproductive system. Germline development  involves specification of primordial germ cells 

(PGCs) and their migration to special regions which will develop into the gonads, where the 

germ  cells  can  be  stored  and  preserved.  The  PGCs  in mammals  arise  through  a  complex 

signaling  process  that,  together  with  transcriptional  regulators,  inhibit  somatic  gene 

expression while  activating  germline  genes,  thereby  preserving  germ  cell  pluripotency  2. 

Later on,  the  germ  cells undergo  two divisions,  a  reductional  and  a non  reductional one, 

after which they can be called either an oocyte or a sperm cell. Despite oocyte development, 

also  the  outside  of  the  cell  has  to  be  protected  and  so,  a  follicle  is matured  in  order  to 

protect the oocyte integrity. 

 

Follicle development protects the cell from outside adversities  

 

Whilst  oocyte  maturation  is  taking  place,  also  the  exterior  of  the  oocyte  undergoes 

significant changes inside the ovarium through a process termed folliculogenesis (Fig. 1). 

Coincident with  the  start  of meiosis, oocytes become  enclosed by  a  single  layer of 

somatic cells, the so‐called pre‐granulosa cells 3, thus forming the primordial follicles (Fig. 1) 

that are thought to comprise the pool of resting follicles which defines postnatal ovarian life 

span  4.  When  the  follicles  are  recruited  to  undergo  meiosis,  the  pre‐granulosa  cells 

surrounding  the oocyte  change  from  a  flattened  to  a  cuboidal  shape  and  are  then  called 

granulosa cells 5.   

2 

Moreover,  both  the  oocyte  and  the  granulosa  cells  grow  further  and  the  primary 

follicle (Fig. 1) becomes surrounded by a multiple layer of stroma cells 5, forming the theca. 

The oocyte becomes  involved by  the  zona  pellucida,  characterizing  the  secondary  follicle, 

and during  this phase,  it builds up a  store of mRNAs proteins,  crucial  for  its development 

competence  6.  A  subsequent  tertiary  follicle  has  a  complete  zona  pellucida  and  starts  to 

develop an antral cavity  (Fig. 1). The antral  follicle  is characterized by  further proliferation 

and differentiation, where  internal and external  theca  layers can be distinguished and  the 

internal cavity is filled with follicular fluid (Fig.1). This cavity pushes the oocyte to one side of 

the  follicle  and  it  becomes  surrounded  by  cumulus  cells,  forming  the  cumulus‐oocyte 

complex  (COC) 7.  In cattle, a tight communication between the cumulus cells, the  follicular 

fluid and the oocyte is crucial for the oocyte’s proper development and is thought to directly 

influence its developmental competence both in vivo and in vitro 7,8. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Oocyte Development and Maturation  

 

During oocyte development, two distinct maturation processes can be distinguished, nuclear 

maturation  and  cytoplasmic maturation.  At  the  stage  of  cytoplasmic maturation, mRNA, 

proteins  and  nutrients  accumulate  in  the  cytoplasm,  thus  allowing  the  oocyte  to  sustain 

early embryonic development 9. 

Figure 1‐ Schematic representation of bovine folliculogenesis. Five phases are represented from primordial follicle to antralfollicle. In bovine oocytes, primordial follicle reaches 30µm, primary follicle reach between 30‐60µm, secondary follicle 60µm,tertiary follicle 100µm and antral follicle may reach 120µm.  O‐ Oocyte; ZP‐ Zona pellucida, GV‐Germinal vesicle, CC‐ Cumuluscells, GC‐ Granulosa cells, IT‐ Internal theca, ET‐ External theca.  

Bovine Folliculogenesis

3 

All  through  mammalian  nuclear  maturation,  the  oocyte  undergoes  meiotic  cell 

division,  which  implies  a  reduction  in  chromosome  number,  accomplished  through  two 

consecutive nuclear divisions termed meiosis I II. This process arrests in two distinct phases, 

the prophase I and the metaphase II stage, and it is unique to diploid germ cells. The process 

of oocyte meiosis, can be described through different stages 2,10 (Fig. 2). 

 

 

 

 

Meiosis starts with the prophase I, the longest and most complex phase of the meiotic 

cell  division.  This  phase  can  be  divided  into  five  distinct  stages:  leptotene,  zygotene, 

pachytene, diplotene and diakinesis. At  leptotene (Fig. 2, stage 1), the chromosomes, which 

at this stage already consist of two sister chromatids, thicken and become visible while the 

centrosomes begin to move toward opposite poles. During zygotene  (Fig. 2, stage 2), each 

chromosome seeks out its homologous partner and both are “zipped” together by a protein 

structure  called  synaptonemal  complex,  in  a process  known  as  synapsis. This will only be 

completed  at  the  pachytene  stage  (Fig.  2,  stage  3) where  Crossing‐over  occurs,  i.e.,  the 

genetic exchange between non‐sister chromatids of a homologous pair.  In the penultimate 

stage, termed diplotene (Fig. 2, stage 4), the synaptonemal complex dissolves and a tetrad of 

four  chromatids  becomes  visible.  Additionally,  the  former  crossing‐over  points  appear  as 

chiasmata, which hold nonsister chromatids together.Diplotene is the first regulatory check‐

point in oocyte meiosis, which can result in a meiotic arrest in a variety of species, including 

cow and human. Prophase I is then completed by the diakinesis stage (Fig. 2, stage 5), which 

Figure 2‐  Schematic  representation of bovine oogenesis.  The different  phases  are divided  in 12  steps  in which  the  first 5belong to the prophase I stage. The arrests represented in the figure concern the two known meiotic arrests known in bovineduring prophase I and metaphase II.  A‐ First polar body B‐ Sperm cell C‐ Second polar body D‐ Male and female pronuclei. 

4 

is characterized by  further chromatid condensation  (Germinal Vesicle  (GV)), breakdown of 

the  nuclear membrane  ‐  in  a  process  termed Germinal  Vesicle  Breakdown  (GVBD)  ‐  and 

spindle formation 2,10. 

Subsequently,  the  cells  enter  metaphase  I,  when  the  tetrad  lines  up  along  the 

metaphase plate and each chromosome of a homologous pair attaches to microtubule fibers 

from  opposite  poles.  This  is  accomplished  through  the  fusion  of  both  sister  chromatids’ 

kinetochore, thus providing each chromosome with only one  functional kinetochore which 

attaches to opposite spindles. Simultaneously, sister chromatids attach to microtubules from 

the  same  pole  (Fig.  2,  stage  6)  2,10.  At  the  onset  of  the  next  stage,  the  anaphase  I,  the 

chiasmata dissolves, allowing the homologous to move towards opposite spindle poles. The 

centrosome, however, does not divide, meaning that homologous chromosomes with sister 

chromatids   move towards opposite sides (Fig. 2, stage 7) 2,10. Succeeding anaphase I  is the 

telophase  I,  at  the  end  of meiosis  I.  During  this  reductional  division,  each  daughter  cell 

receives  half  the  number  of  chromosomes,  all  consisting  of  two  sister  chromatids, 

culminating with an asymmetric cell division and the extrusion of the first polar body, which 

usually does not undergo the second meiotic division (Fig. 2, stage 8) 2,10.  

The oocyte now enters the second division process, meiosis II. Starting the metaphase 

II, the chromosomes align at the metaphase plate and the kinetochores of sister chromatids 

attach to opposite microtubule spindle  fibers. Most vertebrate oocytes arrest again at this 

stage, where  they can  remain  for a  long  time until  fertilization occurs  (Fig. 2, stage 9)  2,10. 

Upon  fertilization, the kinetochore of sister chromatids  is disrupted and microtubule  fibers 

can attach to each centrosome of each sister chromatid, therefore pulling them on opposite 

directions (Fig. 2, stage 10) 2,10. This stage is termed anaphase II and after it is completed, the 

telophase II takes place, where another asymmetrical division is complete and the oocyte is 

provided  with  the  second  polar  body.  The  larger  cell,  the  oocyte,  occupies  95%  of  the 

cytoplasm and is now a functional female pronuclei (Fig. 2, stage 11) 2,10. 

By  the  end  of  oocyte meiosis,  the  zygote  is  formed  (Fig.  2,  stage  12)  and  the  two 

pronuclei,  arising  from  the  female  and  male  progenitor,  approach  each  other.  Their 

membranes break down and DNA  replication  takes place as  they  form a  common mitotic 

spindle and align in a common metaphase plate. A true diploid nucleus is first seen not in the 

zygote but at  the 2‐cell  stage, after  the  first of many mitotic divisions  that will ultimately 

originate a  full  individual. Besides ascending  from different genders,  the pronuclei are not 

equivalent  and  if  the  zygote’s  genetic material  is  derived  solely  from one parent, normal 

development  will  not  take  place.  Different  methylation  patterns  and  epigenetic  events 

5 

contribute to the difference in both genomes 2,11. Although interchange of the genome such 

as  the  one  that  occurs  during  meiosis  is  important  for  evolutionary  success,  it  is 

simultaneously  important  to  protect  the  germ  cell  genome  from  potentially  precarious 

mutations, particularly since these would be carried out throughout generations.  

 

Protecting germ cell’s integrity via Argonaute proteins  

 

In  addition  to  follicular  and  cytosolic,  also  the  nuclear  environment  is  vital  for  a  proper 

oocyte  formation.  Germ  cells  exhibit  an  unforeseen  diversity  of  RNA  interference  (RNAi) 

mechanisms  that  are  caught  up  in many  gene‐regulatory mechanisms,  such  as  genome 

defense  against  viruses  and  transposable  elements,  developmental  competence  and 

silencing activity 12,13. 

Small  interference RNA (siRNA)  is a 20‐30 base‐pair double stranded fragment 14 and 

one strand, the guide RNA, can be incorporated into the protein complex RISC (RNA‐Induced 

Silencing Complex). The nuclease component of RISC known as Argonaute (AGO) uses these 

small RNAs  to  select mRNA  for degradation  12,14–16 and  these proteins are  central  in RNA‐

mediated gene silencing processes.  

 

 

 

 

 

 

 

The AGO proteins  consist of  four domains  (Fig. 3):  the N‐terminal domain;  the PAZ 

domain;  the MID domain; and  the PIWI domain, which has  the  important endonucleolytic 

activity  in some AGOs  17,18. Hence, Argonaute,  the signature component of RISC, seems  to 

have slicer activity 16. 

The PIWI subclass of Argonaute proteins has recently emerged in model organisms as 

a  target  for a  special kind of  small RNAs:  the Piwi‐interacting RNAs  (piRNAs)  19. The main 

currently known function of piRNAs is to silence transposable elements (TEs) in the germline, 

and  this  role  is  highly  conserved  across  animal  species.  Association  of  piRNAs with  PIWI 

proteins  forms an active piRNA‐Induced Silencing Complex  (piRISC)  that can  recognize and 

Figure  3 ‐ Schematic  representation  of  siRNA‐guided  mRNAcleavage. The siRNA (yellow) binds with its 3’ end in the PAZ cleftand the 5’ is predicted to bind near the other end of the cleft. ThemRNA  (brown)  comes  in  between  the  N‐terminal  and  PAZdomains and out between the PAZ and middle domain. The activesite  in  the  PIWI  domain  (shown  as  scissors)  cleaves  the mRNAopposite the middle of the siRNA guide

18 

 

6 

silence complementary mRNA targets. Genetic evidence has demonstrated that, in addition 

to piRNAs,  PIWI proteins  are necessary  for  TE  silencing  and have  crucial  roles  in  gonadal 

development 20,21.  

 

Unraveling PIWI proteins in germ cells throughout species 

 

Two  Piwi  family  members  in  Drosophila,  Aubergine  and  Piwi,  were  found  to  bind  with 

piRNAs  in ovaries  22,23. Transposition of  telomeric  retroelements  is enhanced  in aubergine 

mutants whereas piwi mutants mobilized the endogenous retrovirus gypsy 24. Both mutants 

demonstrated derepression of retrotransposons 23. Mutations in piwi and aubergine lead to 

severe defects  in gametogenesis and piwi  is essential  in the asymmetrical division essential 

for  the  renewal of  germline  stem  cells  (GSCs).  Indeed  adult piwi mutant  gonads  lack  any 

GSCs and gametes 25.   

The  Xenopus  PIWI  protein  Xiwi  is  expressed  in  germ  cells  and  piRNAs  are  the 

predominant class of  small RNAs  in Xenopus  sperm and oocytes. These piRNAs  can  target 

retrotransposons in a similar manner as they do in Drosophila 26.  In Zebrafish, the two PIWI 

homologs  Ziwi  and  Zili were  also  characterized  27.  Loss of  Ziwi  leads  to  germ  cell  loss, an 

increase  in apoptosis of pre‐meiotic cells and abnormal sex determination. Similar  to Ziwi, 

expression of Zili is also specific to testis and ovary and Zili mutants are agametic. However, 

the observed germ cell loss of is not caused by an increase in apoptosis but rather due to an 

inability to differentiate, probably instigated by defects in meiosis.  

In mice, 3 Piwi‐like proteins have been identified, coded by 3 genes:  Miwi (or Piwi‐like 

1), Mili  (Piwi‐like  2)  and Miwi2  (Piwi‐like  4)  28.  Interestingly, mutations  in  any  of  these  3 

mouse PIWI genes lead to degradation of only the male germline, whereas in Drosophila and 

Zebrafish both  the  female and  the male germline are affected after PIWI  inactivation. Mili 

and Miwi2 mutants lead to the activation of retrotransposons in the male germline, arrest of 

gametogenesis  and  complete  sterility  in males  20,29,30. Miwi2 mutants  showed  increased 

retrotransposon  expression  in  testes,  accompanied  by  decreased  DNA  methylation 

machinery. Only Mili expression has been identified in PGCs, despite the mutants’ apparent 

null  effect  in  female  germline.  This  gene was  recently  proposed  to mediate  DNA  repair 

through chromatic  relaxation  in mice  31. These evidences,  together with  the  implication of 

piRNA  in de novo methylation of TE sequences during spermatogenesis 20, suggest that the 

role of PIWI proteins and piRNAs extends beyond post‐transcriptional silencing.  

7 

Sasaki and colleagues in 2003 identified a Piwi‐like gene in human cells 32 , Piwi‐like 3 

(PIWIL3), which does not have a murine homolog, but is present in other mammals such as 

cattle (Fig. 4).  

 

 

 

 

 

 

 

 

PIWIL3’s absence  in  the rodent genome  jeopardizes the  identification of  its  function 

by gene knockout technology. A proper model to study the functions of this Piwi‐like 3 gene 

is  lacking  in mammals, however  the bovine  reveals an easy and  straightforward model  to 

approach this challenge. 

 

Disclosures in the PIWIL3 former research  

 

Some aspects of PIWIL3 protein were addressed recently  in bovine oocytes which provided 

new  understandings  into  the  function  of  this  protein  in mammalian  germ  cells.  Bernard 

Roelen’s lab developed a custom‐made rabbit‐anti‐PIWIL3 polyclonal antibody and one year 

later  we  came  to  knowledge  that  it  was  not  recognizing  the  protein  (will  be  further 

discussed).  Still,  a  piRNA‐like  population  is  present  in  bovine  oocytes  (Ketting &  Roelen, 

unpublished results) suggesting a unique function of PIWIL3 in oogenesis. 

Preliminary  results  identified  PIWIL3 mRNA  in  bovine  ovaries,  testes,  cumulus  cells 

and  oocytes  33  and  also  in  bovine  oocytes  during  oocyte maturation  but  not  during  pre‐

implantation  development  (Fig.  5,  A),  suggesting  a  protein  maternal  supply  already 

documented in Drosophila 33,34. With the PIWIL3 custom‐made antibody, co‐localization with 

the meiotic spindle was suggested, after GVBD stage (Fig. 5, B) which ultimately lead to the 

hypothesis that PIWIL3 has a role in oocyte maturation, especially during meiosis. 

Figure  4 ‐  Homology  betweenmammalian  PIWI  proteins. Mm=Mus  musculus  (mouse),  Hs=Homo  sapiens  (human);  Bt=  Bostaurus  (cattle).  (Ketting,  R.Roelen, B., unpublished results). 

 

8 

 

 

 

 

The sea urchin PIWI homolog Seawi presents a similar localization pattern 35 and it has 

been  suggested  that  Seawi  associates  with  a  complex  of  microtubule‐associated 

ribonucleoproteins  (MT‐RNP), providing a  route  for  the  spatial  segregation of  factors  that 

are  important to establish morphogenetic gradients. Also  in Xenopus oocytes, Xiwi protein 

and piRNAs  associate with microtubules of  the meiotic  spindle  26. However no defects  in 

spindle  assembly  were  detected  after  depletion  of  Xiwi,  suggesting  that  it  is  a  mere 

passenger of the microtubule network.   

The idea of PIWIL3 localization in the spindle was an unexpected and interesting result 

because no function of PIWI proteins in the meiotic spindle of mammalian oocytes had been 

documented.  So  far,  Piwi‐like  3  seemed  to  have  a  particular  purpose,  especially  during 

meiosis  and we  could  speculate  about  the possibility of  the protein  and  the piRNA being 

maternally  accumulated,  suggesting  their  active  participation  in  the  transport  and 

localization of mRNA.   

In  the meantime, whilst  studying  PIWIL3,  Transforming  Acidic  Coiled‐Coil  protein  3 

(TACC3) was identified in metaphase II oocytes (will be further discussed).  Since the PIWIL3 

results were compromised, we became interested in TACC3’s function during bovine oocyte 

development. 

 

 

 

  A   B 

Figure 5 ‐ mRNA quantification of PIWIl3 and PIWIL3 expression pattern. (A): Relative mRNA expression levels of PIWIL3 duringoocyte maturation and early embryo development. X‐axis: developmental stages. Y‐axis: relative PIWIL3 amounts normalized tothe  reference gene SDHA. Error bars  represent  standard deviation.  (B): merge  channel of DAPI and Piwi‐like 3 protein on ametaphase II oocyte, with metaphase plate magnified. Scale bar = 20 μM 

33 

9 

Transforming Acidic Coiled‐Coil (TACC) Proteins 

 

While  trying  to protect  the genome against adversities  that could endanger  the upcoming 

generations, cell division is also one of the most important processes the cell needs to face. 

In  order  to  accomplish  it,  the  spindle  needs  to  recruit microtubule  fibers  that  are  tightly 

regulated by a main microtubule‐organizing center (MTOC), the centrosome  in animal cells 

36.  A  family  group  of  proteins  known  to  interact with  centrosomal  activity  are  the  TACC 

proteins.  

TACC proteins were initially identified as a group of proteins implicated in cancer and 

the first protein member was discovered whilst searching  for amplified genomic regions  in 

breast cancer 37.  These highly acidic proteins have, in contrast to a very diverse N‐terminus, 

a predicted coiled‐coil domain on  its C‐terminus, known as the TACC domain, the signature 

of  this  protein  family  that  is  thought  to  carry most  of  the  functional  properties  38,39.    In 

Drosophila, the TACC domain provides the protein its correct localization on the spindle 39,40.   

Being present in different organisms such as Schizosaccharomyces pombe, Drosophila 

melanogaster,  Caenorhabditis  elegans,  Xenopus  laevis  and mammals,  TACC  proteins  have 

different  names.  In  some  species  there  is  only  one  TACC  protein  such  as  in 

Schizosaccharomyces  pombe  (Alp7  also  known  as  Mia1p),  Drosophila  melanogaster  (D‐

TACC), Caenorhabditis elegans (TAC‐1) and Xenopus laevis (Maskin or xTACC3). On the other 

hand, mammals have three TACC proteins: TACC1, TACC2 (also known as AZU‐1 and ECTACC) 

and TACC3 (also known as AINT and ERIC1)39,41–43. TACC1 and TACC2 protein are  implicated 

in breast cancer 37 while TACC3 is associated with multiple myeloma and several cancer lines 

44,45  (http://www.proteinatlas.org/ENSG00000013810). TACC3  is expressed  in relatively  few 

adult tissues but it shows high  levels  in testis, ovary and  in hematopoietic tissues. Together 

with TACC3‐deficient mice displaying embryonic lethality, a reduced cell number and mitotic 

defects, these data suggest an important role of TACC3 during early cell division 44,46,47. 

Concerning  the  three mammalian TACC proteins,  its expression pattern depends on 

the cell phase cycle. At the  interphase stage, TACC2 associates with centrosomes   whereas 

TACC1 and TACC3 are diffused both  in the cytoplasm and  in the nucleus, with TACC3 being 

to  some  extent  concentrated  in  the  nucleus  38,39.  During mitosis,  TACC1  and  TACC2  are 

present  in  centrosomes  while  TACC3  is  present  in  a  more  diffuse  region  around  the 

centrosomes 38,48. 

 

10 

Besides  its centrosomal  localization, TACC proteins are also present on microtubules 

during cell division 49. C. elegans’ TAC‐1 and X. laevis’ Maskin are present in the spindle and 

Drosophila’s    D‐TACC  is  associated with  both  spindle  and  astral microtubules  (fibers  not 

connected to kinetochores) (Fig. 6) 39. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Regarding the protein’s role in the cell, all mutant phenotypes described to date seem 

to indicate microtubule rearrangement and instability. In C. elegans, embryos without TAC‐1 

exhibit  defects  in  pronuclear migration  and  a  phenotype  of  both  shorter  and  defective 

spindle in anaphase. However, despite the spindle‐positioning defects, embryos are still able 

to assembly microtubules, suggesting that TAC‐1 protein is not required for its formation 41.   

Also  in  Drosophila melanogaster, mutants  in  D‐TACC  show  incomplete  pronuclear 

separation 39. Most of the mutant embryos exhibit an arrest in the first mitotic division and 

those  that  can  divide  have  abnormally  short  centrosomal  microtubules,  culminating  in 

mitotic  defects  that  lead  to  embryo  lethality.  In  Xenopus,  Maskin  is  not  required  for 

microtubule  stability  but  is  required  for  its  anchoring  to  the  centrosome.  In  embryos 

depleted with Maskin  (xTACC3),  the microtubule content was  reduced  in size and number 

and cells exhibited an abnormal spindle  (Fig. 7)  40,50,51.  It was also demonstrated that RNAi 

downregulation of TACC3  in HeLa cells  leads to arrest at G1 checkpoint, prior to anaphase, 

with  aberrant  spindle  morphology  and  severely  misaligned  chromosomes  40,52.  

Overexpression  studies  of D‐TACC, Maskin  and  TACC3  show  protein  accumulation  on  the 

spindle poles leading also to an increase in microtubule length and number38.   

 

C. elegans 

TAC‐1 D. melanogaster

D‐TACC X. laevis 

Maskin H. sapiens 

TACC3

Figure 6  ‐ Centrosome and spindle  localization of TACC proteins  in C. elegans, D. melanogaster, X.  laevisand Human. The upper row shows, in the first three organisms, overlay images with microtubules in green,DNA  in blue and  the corresponding TACC proteins  in  red. The  lower  row  shows  the distribution of eachTACC protein alone

49. H. sapiens column exhibits TACC protein in green and α‐tubulin in red, bar: 10 µm 

48.  

11 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

The rationale is that flaws in kinetochore‐microtubule attachment can lead to spindle 

checkpoint activation and TACC3 regulates chromosome alignment by ensuring both proper 

kinetochore microtubule attachment and spindle assembly checkpoint. 53 

 

Phosphorylation and activation of TACC3 by Aurora‐A kinase 

 

Recruitment of TACC3 proteins  to microtubules  is  regulated by Aurora‐A  kinase‐mediated 

phosphorylation and this  function appears to be conserved  in Human, Xenopus, C. elegans 

and Drosophila 41,48,54–56.  

It has been proposed that Aurora‐A is vital during mitosis through phosphorylation of 

a series of substrates that promote diverse critical events to maintain cell integrity 57. During 

mitosis,  Aurora‐A  kinase  associates  with  centrosomes  and  spindle,  independently  of 

microtubules  and  D‐TACC    and  mutations  of  Aurora‐A  lead  to  metaphase  arrest  and 

decreased  length  of  astral  microtubules  as  well  as  prevention  of  D‐TACC  centrosomal 

association 54,56.  Aurora A interacts with TACC3, phosphorylating it and allowing its targeting 

to  centrosomes  55.  For  Xenopus  and Human  TACC3,  the  exact phosphorylation  sites  have 

already been identified 40,48,55. Suppression of Aurora‐A by siRNA caused mitosis failure, with 

incorrect separation of centriole pairs, chromosome misalignment on the metaphase plate 

and  incomplete  cytokinesis.  Despite  spindle  abnormalities  and  unaligned  chromosomes, 

some cells lacking functional Aurora‐A are still able to divide, however segregation defects in 

anaphase  and  chromatin bridges  further develop  into  aneuploidies or  tetraploidies which 

ultimately lead to cell death 57. 

Figure  7  ‐ Depletion  of  Xenopus’  TACC3  (xTACC3):  effects  on  the  spindle.  The  upper  row  shows  the  controlsituation  and  the  lower  one  shows  abnormal  spindle  and  chromosome  abnormalities  in  result  if  xTACC3depletion with RNAi

40.  

12 

Besides TACC3 vital  interaction with Aurora‐A kinase, also  its  involvement with  two 

other other proteins,  ch‐TOG and  clathrin,  is essential  to a proper  complex assembly  and 

function. 

 

TACC3/ch‐TOG/clathrin complex stabilizes kinetochore  fibers by  inter‐

microtubule bridging 

 

In higher organisms, the chromosome’s kinetochores are attached to the spindle via parallel 

microtubules,  named  kinetochore  fibers  (K‐fibres)  58.  The  microtubules  of  K‐fibers  are 

connected  by  inter‐microtubule  bridges  that  are  thought  to  stabilize  the  fiber  during 

chromosome movement 59.   

Clathrin  interacts with  these  inter‐microtubule  bridges  in  order  to  stabilize  K‐fibers 

60,61. Apart  from being  involved  in coating vesicles during  interphase, during cell division  it 

seems  to  target microtubule  spindles  62.  It acts as part of a  complex  involving    two other 

proteins:  TACC3  and  Colonic‐Hepatic  Tumour Overexpressed Gene  (ch‐TOG),  forming  the 

TACC3/ch‐TOG/clathrin complex  61,63,64.   ch‐TOG, or XMAP215, was  identified as having an 

essential  role  in  spindle  organization  in  Human  during mitosis  65.  Recently,  clathrin  was 

identified as a binding protein for TACC3, and ch‐TOG was found to be associated with both 

clathrin  and  TACC3  66.  Depletion  of  clathrin,  ch‐TOG  or  TACC3  result  always  in  a mitotic 

defected phenotype  in different species, suggesting a consensus  interaction across species 

40,61,63,65.  

Additionally, TACC3/ch‐TOG/clathrin bridges also protect  the  fiber  from microtubule 

loss  67  and  promote  growth  by  antagonizing  the  mitotic  centromere‐associated  kinesin 

(MCAK) that promotes microtubule depolymerization 55,68.   

Despite  recent  progresses  in  TACC3  research  during mitosis,  its  role  in mammalian 

meiosis is relatively unknown. In mouse oocytes, TACC3 was identified during meiotic oocyte 

maturation  and  the  phosphorylated  form  of  TACC3  accumulated  from  GVBD  to  the 

metaphase  II  arrest.  The  phosphorylated protein was  restricted  to  the  spindle poles.  The 

effect of TACC3 depletion by  siRNA was  (i)  inhibition of polar body extrusion  (ii)  arrested 

meiosis I with spindle defects and (iii) lack of phosphorylated TACC3 labeling at the poles 69.  

 

 

13 

TACC3/ch‐TOG/clathrin complex activation, two hypotheses  

 

The  correct order of  recruitment of  these  three proteins  to  the  complex  is  yet unknown, 

however two major ones were proposed during the last three years (Fig. 8).  

In  2010,  three  teams  40,63,66  claimed  that  clathrin  recruits phosphorylated  TACC3  to 

spindle poles (Fig. 8, A), however other findings point to a different direction. In 2011, Booth 

et al. demonstrated that TACC3 and ch‐TOG bind to the spindle microtubules under Aurora‐

A regulation, followed by recruitment of clathrin to the microtubules forming complex with 

TACC3 or TACC3/ch‐TOG subcomplex (Fig. 8, B). Furthermore, it was also proposed that the 

complex is spindle‐specific 61.   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

According to Booth et al., clathrin cannot bind microtubules while maskin (TACC3) and 

ch‐TOG  can,  therefore,  clathrin  would  require  an  additional  factor  to  bind  these  fibers, 

however no such  factor was  identified. Also,  the majority of clathrin  in mitotic cells  is not 

restricted to the spindle whereas TACC3 and ch‐TOG are predominantly spindle‐associated. 

In agreement with Booth’s theory, (i) overexpression of GFP‐CHC (Clathrin Heavy Chain) did 

not cause more clathrin to accumulate at the spindle and did not  influence TACC3 nor ch‐

Figure  8 ‐  Two  modelsrepresenting  the  recruitment  ofTACC3/ch‐TOG/clathrin complex tothe  spindle.  (A)  Clathrin  recruitsTACC3:   Aurora‐A  kinase activatesTACC3 by phosphorylating it in twosites  (Ser620  and  Ser626  inXenopus)  and  enables  it  to  bindwith  clathrin  to  form  theclathrin/TACC3  complex.  Finally,the  clathrin‐associated  TACC3  istargeted  to  spindle  poles  andspindle  microtubules  for  properspindle  assembly.  Along  withTACC3,  ch‐TOG  also  targets  tospindles  to  regulate  spindlestability.  (B)  TACC3  recruitsclathrin.    First,  TACC3  alone  orcomplexed  with  ch‐TOG  isrecruited  to  the  spindlemicrotubules in a phosphorylation‐dependent  manner  regulated  byAurora‐A.  Then,  clathrin  isrecruited  to  the  spindle by TACC3or  TACC3/ch‐TOG.  Finally,  clathrinforms an  inter‐microtubule bridgeby  interacting  with  additionalTACC3  or  TACC3/ch‐TOG  onadjacent microtubules  to  stabilizethe spindle microtubules. 

89 

14 

TOG spindle  localization (ii) overexpressing TACC3  increased the spindle  location of ch‐TOG 

and clathrin and (iii) inhibiting TACC3 spindle recruitment via inhibition of Aurora‐A kinase or 

TACC3 mutation inhibited recruitment of clathrin to the spindle. 

Taken  together,  recruitment  of  clathrin  and  TACC3  to  the mitotic  spindle  remains 

controversial, however  in unanimity  it  is suggested that this complex stabilizes kinetochore 

fibers by physically bridging between adjacent microtubules.    In  the  light of  these  results, 

TACC3 has an  important  role  in mitosis as a  controlled adaptor  that  can  integrate  several 

other  mitotic  proteins  into  a  complex  on  microtubules  which  holds  kinetochore  fibers 

together. 

TACC3 function during mammalian meiosis has already been documented 69; however 

its role during bovine oocyte development is still blurred. Besides having clear implication in 

human cancer lines, understanding its role during cell‐division is crucial when the matter of 

mammalian oocyte developmental competence is addressed. The aim of this project will be 

to  get  insights  into  TACC3’s  function  during meiosis  and  early  embryo  development  and 

ultimately propose a model for TACC3/ch‐TOG/clathrin complex regulation and recruitment 

in cattle, which may mimic the Human situation.  

15 

 Material and methods 

 

Oocyte collection and in vitro maturation  

Bovine ovaries were obtained from a local slaughterhouse and transported in thermal flasks. 

Excess  tissue was  cut off and  the ovaries were  collected  in  flasks  containing NaCl at 30ºC 

supplemented with penicillin/streptomycin (1ml/L). Cumulus oocyte complexes (COCs) were 

removed  from  the ovaries by suction of  follicular  fluid  from antral  follicles  ranging 2‐8mm 

and  only  those  with  reasonable  cumulus  investment  were  selected  under  a  dissecting 

microsope. The COCs were  rinsed with medium B  (Table 1)  to avoid agglomeration. COCs 

were transferred to 4‐well plates, each containing 500µL of maturation medium (Table 1) or 

different  concentrations of  the  inhibitor MLN8054  (by  selleckchem®, 25 mM  in DMSO)  in 

maturation  medium.  Between  the  wells,  1mL  of  sterile  water  was  added  to  prevent 

evaporation. After 22‐24 H of  incubation at 39ºC with 5% CO2,  the  cultured oocytes were 

either selected for in‐vitro fertilization or fixed in 4% paraformaldehyde. 

 

In vitro fertilization and embryo culture 

 

A  straw  of  cryopreserved  bull  sperm was  thawed  in  a  37ºC waterbath  and  the  content 

layered on a Percoll gradient and centrifuged  for 30 minutes at 700G. The sperm’s correct 

Medium  Ingredients

B  MilliQ water, M199 with Earle's salts, HEPES and glutamine 

C  LAL water, M199 with Earle's salts and glutamine, NaHCO3 

PHE  Penicillamine, hypotaurine and epinephrine

Maturation  Medium C, Fetal Calf Serum, Pen/Strep, recombinant FSH 

Fertilization LAL water, NaCl, KCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na pyruvate, phenolred, CaCl2.2H2O, 

MgCl2.6H2O, Pen/Strep, BSA 

RD MilliQ water NaCl, KCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na Lactate, HEPES, phenolred, 

CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, Na Pyruvate, Pen/Strep, BSA 

SOF A LAL water, NaCL, KCl, KH2PO4, Na Lactate, MgSO4.7H2O, NaHCO3, CaCl2.2H2O, 

phenolred, Non‐essential aminoacid solution 

SOF B  LAL water, Pen/Strep, Na‐pyruvate, L‐glutamine, BSA 

SOF  8ml SOF A : 2ml SOF B

Table 1 ‐ Composition of multiple culture mediums used during oocyte in‐vitro maturation and fertilization and embryo culture. 

16 

concentration  was  determined  by  sampling  a  small  volume  of  the  sperm  solution  and 

counting the number of sperm heads  in a Bürker Turk chamber. Taking  into account which 

bull was used,  the dilution  factor was calculated and sperm was added  to  the  fertilization 

medium  (Table  1).  The  COCs  and  sperm were  incubated  for  22  hr  at  39ºC,  5%  CO2  after 

which the presumptive zygotes were stripped of cumulus cells by vortexing for 3 min  in RD 

medium  (Table  1).  Following  denudation,  the  presumptive  zygotes were  transferred  to  a 

new  4‐well  plate with  Synthetic Oviductal  Fluid  (SOF medium,  Table  1)  and  incubated  at 

39ºC,  in a 5% CO2 and 7% O2 environment70.   At day 5 after culture, cleaved embryos were 

scored  and  transferred  to  fresh  SOF  medium  and  at  day  8,  embryo  development  was 

determined.  

 

Immunocytochemistry 

Sections of bovine testis, bovine ovaries and human testis  (provided by University Medical 

Center Utrecht) were  used.    To  de‐paraffinise  sections,  slides were  immersed  2x5min  in 

xylene and 2x5min  in 100% ethanol followed by 20 min  incubation  in methanol‐3% H2O2 to 

block endogenous peroxidase and  reduce non‐specific background  staining. Samples were 

then  rehydrated  in 2 minutes  series of 96/80/70% ethanol,  rinsed  shortly  in distilled H2O.  

For antigen  retrieval,  sodium‐citrate buffer  (0.01M, pH 6.0) was heated until boiling point 

and samples were boiled for 3 min. After a 30 min cool‐down, sections were washed in TBST 

(0.05% Tween) for 2x5min, blocked with 5% NGS (Normal Goat Serum) in TBS for 30 minutes 

at 37 ºC and  left to  incubate overnight with the  first antibody  (1:100)  in 2% NGS  in TBS at 

room temperature.  The three samples were each stained with Human anti‐PIWIL3 antibody 

(ab77088), anti‐PIWIL3 antibody  (ab93709) and  IgG  for control purposes  (Table 2). On  the 

second day, after washing in TBS (0.05 M, pH 7.6) on the shaking table, incubation with the 

second antibody  (1:200)  took place  for 40 min at 37ºC  followed by another washing step. 

The samples were then incubated with ABC complex reagent (Vector elite kit 10µl A + 10µl B 

+ 980 µl TBS) for 30 min at RT (ABC made 30 min prior to use). Sections were then washed in 

TBS,  incubated with DAB  (diaminobenzidinetetrahydrochloride, mutagenic, photosensitive) 

in  TBS  for  5‐10 min  and washed  again  in  distilled  H2O.  For  counterstaining,  slides were 

stained with haematoxylin for 10 seconds and then washed thoroughly with H2O. Series of 

70/80/96% ethanol were executed (2x 10 sec each) followed by xylene (2x2min). Lastly, the 

samples were embedded in DEPEX.  

 

17 

 Anti‐PIWIL3 antibody (ab77088) 

Anti‐PIWIL3 antibody (ab93709) 

Anti‐TACC3 antibody (ab56595) 

Anti‐PIWIL3 

antibody* (custom) 

Anti‐PIWIL1 antibody (custom) 

Anti‐PIWIL2 antibody (custom) 

Description Mouse 

polyclonal to PIWIL3 

Rabbit polyclonal to 

PIWIL3 

Mouse monoclonal to TACC3 

Rabbit polyclonal to PIWIL3 

Rabbit polyclonal to PIWIL1 

Rabbit polyclonal to PIWIL2 

Host species  Mouse  Rabbit  Mouse  Rabbit  Rabbit  Rabbit 

Tested applications 

WB  IHC‐P  WB, IHC‐P  ‐  ‐  ‐ 

Cross Reactivity 

Reacts with Human 

Reacts with Human 

Reacts with Human 

Reacts with 

bovine* 

Reacts with bovine 

Reacts with bovine 

Positive control 

PIWIL3 transfected 

293T cell lysate 

Human testis tissue. 

‐  ‐  ‐  ‐ 

Immunogen 

Recombinant full length 

human PIWIL3 (NP_001008496, 

aa 1‐882) 

Synthetic peptide from 

intermediate residues of Human PIWIL3 

100aa recombinant fragment 

15aa long fragment 

15aa long fragment 

15aa long fragment 

 

Immunofluorescence 

Oocytes were stripped of cumulus cells before staining and fixed for a minimum of 15 min in 

4% paraformaldehyde (PFA). After fixation the oocytes were briefly washed with 0.1% Triton 

X‐100 and 10% FCS in PBS (PBST) and permeabilized for 30 min using 0.5% Triton X‐100 and 

PBST. The oocytes were subsequently blocked for 1h in PBST and incubated with the primary 

antibody overnight at 4ºC.  For the immunofluorescence, all antibodies described in Table 2 

were used. The oocytes were washed three times in PBST (15 min) followed by incubation in 

the secondary antibody for 1 h  in the dark. After several washes, the oocytes were stained 

with 4',6‐diamidino‐2‐phenylindole  (DAPI, 5min)  and mounted on a  slide with Vectashield 

and isolated with Vaseline.  

For  α‐tubulin  staining  oocytes  were  incubated  first  for  30‐60  min  in  microtubule 

stabilizing solution71 at 37 ºC and then fixed in 4% PFA. After fixation, oocytes were washed 

in PBS with 0.1%  (v/v) Tween‐20,  incubated 5min  in PBS with 2%  (v/v) goat serum  (Sigma‐

G6767)  followed by 60 min  incubation with mouse‐anti‐tubulin primary antibody at 37 ºC. 

After washing, the oocytes were incubated in PBS + serum for 1 hour at 37 ºC, washed and 

Table 2 ‐ Detailed description of the antibodies used. The (*) regarding the bovine PIWIL3 symbolizes the predicted details on theonset of this project. All the custom antibodies are thought not to be specific and further tests have to be done to address thisquestion. 

18 

incubated  with  the  second  antibody  for  1  h.  For  microfilament  staining,  an  additional 

incubation  of  30 min with  phalloidin was  performed.  After  DNA  staining with  DAPI,  the 

oocytes were mounted as mentioned before.  

 Slides were examined with Leyca® Confocal  laser microscopy.  Images were analyzed 

with ImageJ® software and Adobe Illustrator®. 

Western blotting 

 

Cells were collected and frozen  in ‐80ºC after which they were  lysed with sample buffer 4x 

diluted  in RIPA buffer (table 3) and 1% protease  inhibitor cocktail (table 3). Afterwards the 

lysates were boiled at 100 ºC for 5 min and briefly centrifuged. The samples were resolved 

by an SDS‐PAGE 8% running gel and 5% stacking gel (Table 3), while sponges, filter paper and 

membrane were left for 10 min at 4 ºC in Blotting buffer. The proteins were then blotted on 

nitrocellulose membranes (Trans‐Blot®, Bio‐Rad Laboratories) at 100V (±180mA) during 1H. 

The membranes were  incubated with blocking buffer (Table 3) for 1h under gentle shaking. 

The membranes were incubated with mouse‐anti‐TACC3 (Table 2) diluted in blocking buffer 

(1:1000) O/N at 4 ºC. After washing  in TBS‐Tween (TBS with 0.05% Tween‐20) (3x5min) the 

membranes were  incubated with goat‐anti‐Mouse  (sc‐2005, Santa Cruz Biotechnology  Inc) 

(1:5000)  for 1H at RT; washed with TBS‐Tween and  lastly with TBS. Finally the membranes 

were placed between a plastic  sheet under  the  SuperSignal® Chemiluminescent Substrate 

(West  Dura  Extended  Duration  Substrate,  Thermo  scientific)  consisting  of  600µL  of 

Horseradish peroxidase (HRP) and phosphatase (PO) (1:1).   The membrane was exposed to 

X‐ray film (Fuji®) and the film was developed.  

After developing the film, the membrane was stripped in stripping buffer for 5 min at 

RT and  the blot was  incubated  for 1H at 37 ºC   with Goat‐anti‐β‐actin  (1:5000, Santa Cruz 

Biotechnology®,  sc‐47778)  and  for  1H  at  RT  with  Rabbit‐anti‐Goat  (1:10000,  Santa  Cruz 

Biotechnology®,sc‐2768) just as described above.  

 

 

 

 

 

 

 

19 

 

 

Aurora‐A inhibition experiment  

 

Oocytes  were  matured  as  described  in  table  4  and  the  small  molecule  MLN8054 

(Selleckchem®, dissolved in DMSO) was added to the medium with the purpose if inhibiting 

Aurora‐A function 72.   MLN8054 stock (250 µM) and DMSO (2µl/200µl maturation medium) 

were used to achieve a maturation medium with an increased drug concentration. Because 

the drug was dissolved  in DMSO, a control with no DMSO neither drug  (normal  IVM) was 

added.    

Different groups were used in different sets of experiments. When the percentage of 

blastocyst  formation  was  evaluated,  it  was  scored  on  the  8th  day  of maturation,  being 

relative to the amount of embryos cleaved on day five. This percentage  is thus referring to 

the  blastocysts  that  were  both  properly  matured  and  fertilized,  providing  embryo 

development information.  

 

 

 

Buffers  Composition

Running gel SDS‐PAGE 8% gel (for 

10ml) 

4.6ml H2O; 2.7ml 30% acryl‐bisacrylamide mix; 2.5ml 1.5 M Tris (PH=8.8); 0.1ml 10% SDS, 0.1ml 10% ammonium persulfate; 0.008ml TEMED 

Stocking gel 5% (for 10 ml) 

6.8ml H2O; 1.7ml 30% acryl‐bisacrylamide mix; 1.25ml 1.5 M Tris (PH=8.8); 0.1ml 10% SDS, 0.1ml 10% ammonium persulfate; 0.01 TEMED 

Blocking buffer  5% (w/v) non‐fat dry milk powder in TBS‐Tween 

RIPA buffer 1% Nonidet P‐40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.004% sodium azide, 1% PMSF solution, 1% protease inhibitor solution, 1% sodium orthovanadate 

solution in TBS (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) Halt Protease 

Inhibitor Cocktail Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X), EDTA Solution, 0.5M 

(100X), 1mL 

Oocytes  Maturation medium MLN8054  DMSO 

Matured with 0 µM MLN8054 490 µl 0  10 µlMatured with 1.25 µM MLN8054 490 µl 2.5 µl  7.5 µlMatured with 2.5 µM MLN8054 490 µl 5 µl  5 µlMatured  with 5 µM MLN8054 490 µl 10 µl  0 

Matured under normal IVM procedure 500 µl 0  0 Denuded and matured under normal IVM 500 µl 0  0 

Denuded and matured with 2.5 µM MLN8054 490 µl 5 µl  5 µl

Table 3 ‐ Detailed description of the Buffers used on the Western Blot. 

Table 4 ‐ Experimental design for the MLN8054 experiment. Maturation medium was previously described in table 1. 

20 

Results 

 

Sorting  out  the  bovine  Piwi‐like  3  antibody  and  unraveling 

Transforming Acidic Coiled‐Coil protein 3 (TACC3) 

 

In  order  to  detect  bovine  Piwi‐like  3  expression  in  oocytes  a  polyclonal  antibody  was 

generated  directed  against  a  15  aminoacid  long  fragment  (Table  2).  This  peptide  was 

designed  based  on NCBI’s  predicted  991aa  bovine  Piwi‐like  3  protein  sequence  and was 

identical  to  the  NH2  part  of  the  predicted  sequence.  However,  the  ENSEMBL  database 

provides another predicted sequence for the PIWIL3 bovine protein. Besides having 88.2 % 

similarity with the NCBI sequence, the ENSEMBL predicted sequence  is shorter (875aa) and 

lacks  the  fragment  to  which  the  antibody  was  directed  (illustrated  in  Fig.  9). We  have 

reasons  to believe  that neither  the ENSEMBL nor  the NCBI protein  sequences are  correct 

based  on  recent  5  prime  race  analyses  and  further  sequencing  (Roelen  &  Mahdipour, 

unpublished results).  

 

 

 

 

 

 

 

A mass  spectrometry  analysis was  performed  to  evaluate  potential  PIWIL3  binding 

proteins.  For  that  purpose  an  Immunoprecipitation  experiment was  conducted  using  the 

bovine PIWIL3 antibody followed by mass spectrometry (Roelen & Mahdipour, unpublished 

results).  Among  the  proteins  expected  to  be  detected  were  Argonaute  proteins  already 

described  as  being  associated  with  PIWI  proteins.  Interestingly  the  mass  spectrometry 

analysis revealed no proteins known to  interact with PIWI proteins and, most  importantly, 

PIWIL3 itself was also not detected. Instead, TACC3 was identified as a prominent protein in 

the IP fraction. It was proposed that the antibody used does not recognize bovine PIWIL3 but 

instead bovine TACC3.  

Figure 9 ‐ Schematic representation of two Piwi‐like 3 aminoacid sequences, one provided by NCBI database and the other by ENSEMBL database with 88.2% identity. Red represents the target sequence of our PIWIL3 custom made bovine antibody.  

21 

To  test whether  indeed  the antibody  that was designed  to  recognize bovine PIWL3 

would  recognize  TACC3  instead,  oocytes  and  blastocysts  were  double‐stained  with  the 

custom‐made  antibody  and  an  antibody  directed  against human  TACC3  (Table  2).  Indeed 

similar patterns of  expression were  identified  (Fig. 10), being  the human  TACC3  antibody 

more sensitive that the PIWIL3 antibody, particularly at the GV and blastocyst stage (Fig. 10, 

A‐D and Q‐T).  

 

Figure  10  ‐  Double  stainings  TACC3  and  ’TACC3’  during  oocyte maturation  and  blastocyst.  ‘TACC3’  refers  to  the  antibody designed against PIWIL3. Images (A‐D) represent a germinal vesicle stage, (E‐H) a metaphase I stage, (I‐L, M‐P) a metaphase II stage and (Q‐T) a blastocyst stage. Scale bar: 10µm. 

  DAPI A  TACC3B  ‘TACC3’ C DAPI  TACC3 ‘TACC3’ D

E  F  G H

I  J  K L

M  N  O P

Q  R  S T

22 

Detection  of  PIWIL3  expression  in  bovine  oocytes  using  antibodies 

directed against the human sequence 

 

Preliminary  findings  suggested  that  in  bovine  oocytes  PIWIL3  was  localized  around 

chromatin during meiosis  33,  in  contrast with our  results on  the expression of PIWIL2 and 

PIWIL1 (table 2) that appeared to be rather diffuse throughout the cytoplasm (Fig. 11, A and 

B).  

 

 

 

 

 

 

 

 

In order to characterize PIWIL3 expression  in bovine oocytes, commercially available 

Piwi‐like  3  antibodies  directed  against  human  PIWIL3 were  used  on  bovine  oocytes.  The 

human  PIWIL3 protein  sequence  is  significantly  different  from  the  predicted  bovine NCBI 

and ENSEMBL  sequences, with  just 54 and 52% of  similarities,  respectively. Two different 

antibodies  were  available,  one  directed  against  the  whole  protein  sequence  of  human 

PIWIL3 (denominated αHPIWIL3‐A) and another one directed against a short 100aa fragment 

(denominated αHPIWIL3‐B) (Fig. 12; Table 2).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Figure 12 ‐ Schematic representation of the human Piwi‐like 3 aminoacid sequence and bovine Piwi‐like 3 aminoacid sequences.The  percentages  indicate  degrees  of  similarities  between  sequences.  Red  represents  target  sequences,  the  epitopes,  ofrepresented antibodies.  

 DAPI PIWIL2

 

DAPI PIWIL1

 

A  B Figure 11 ‐ Merge channels of (A) DAPI and PIWIL1 and (B)DAPI and PIWIL2 expression patterns during metaphase II. Oocyte  limits  are  represented  by  the  dashed  circle  line. Scale bar: 10µm. 

23 

Using  the  αHPIWIL3A  antibody,  no  localized  expression  was  detected  in  bovine 

metaphase  II staged oocytes  (Fig. 13, A‐F) nor  in blastocysts  (Fig.13, G‐I).  Instead,  staining 

was  observed  in  a  punctate  pattern  throughout  the  oocyte,  similarly  to  the  patterns 

observed with bovine PIWIL1 and PIWIL2 (Fig 11). HPIWIL3‐B displayed a different pattern in 

MII stage where  its fluorescence was almost absent (Fig.13, M‐O), similar to the blastocyst 

stage  (Fig. 13, P‐R).  Interestingly,  cytoplasmic  staining was observed  in  cumulus  cells  that 

remained attached to the oocyte (Fig.13, J‐L).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

In  paraffin  section  of  human  testis,  αHPIWIL3‐A  revealed  no  staining  whilst  the 

αHPIWIL3‐B was able to stain some cells (Fig. 14). These positive results are  in consistence 

with the positive control already documented and displayed (Fig. 14, Human testis and Table 

2).  In  paraffin  sections  of  bovine  testis,  αHPIWIL3‐A  antibody  only  stained  blood  vessels, 

whereas  αHPIWIL3‐B  stained  the  cytoplasm  of  cells  at  the  final  spermatogenesis  stages 

(Fig.14,  bovine  testis).  In  bovine  ovarian  sections,  no  staining  was  observed  with  the 

αHPIWIL3‐A antibody. In contrast, the HPIWIL3‐B antibody stained (i) both the external and 

internal  theca  (ii)  granulosa  cells  (iii)  cumulus  cells  surrounding  the  oocyte  and  (iv)  the 

oocyte itself (Fig. 14, bovine ovary). 

 

F 

I 

DAPI 

A 

HPIWIL3‐A 

B 

DAPI HPIWIL3‐A

C 

E D 

G  H 

    HPIWIL3‐B

K

DAPI HPIWIL3‐B 

L 

M N O 

P Q R 

DAPI

J

Figure  13  –  HPIWIL3‐A  and  HPIWIL3‐B  stainings  on  different  staged  oocytes  and  blastocysts.  (A‐I) displays  staining  withHPIWIL3‐A and  (J‐R) displays  staining with HPIWIL3‐B.  (A‐C) displays a germinal vesicle  stage,  (D‐F)  zoom of a metaphase  IIplate, (G‐I) a blastocyst, (J‐L) displays two cumulus cells still attached to the outside of the oocyte (M‐O) displays a metaphase IIstage and (P‐R) a blastocyst.  Scale bar: 10 µm. 

24 

 

TACC3’s  expression  pattern  during  oocyte  and  early  zygote 

development:  its  presence  surrounding  chromatin  and  the  meiotic 

spindle 

 

Because the custom‐made antibody doesn’t recognize bovine PIWIL3 but instead TACC3, we 

chose  to  interpret  the  immunofluorescence  results performed with  this antibody as being 

TACC3’s.  

Oocytes were collected 12 and 23 H after in vitro maturation process and 6, 12 and 22 

H after in vitro fertilization and images were selected to construct a time‐lapse figure ranging 

oocytes from germinal vesicle up until blastocyst stage (Fig.15). TACC3 was first detected in a 

condensed matter around the genetic material 12 H after maturation, when the chromatin 

started  displaying  some  degree  of  condensation  (Fig.15,  D‐F).  Prior  to  this  phase,  TACC3 

expression  was  not  detected  (Fig.15,  A‐C).  TACC3  was  specifically  localized  around  the 

Bovine Ovary 

Bovine Testis

IgG  HPIWIL3‐A HPIWIL3‐B

Human

 Testis

ET

IT 

BM

GC

CC 

CC 

BM 

GC 

IT 

ET

AA

O 

Figure 14 ‐ Immunocytochemistry results for IgG, HPIWIL3‐A and PIWIL3‐B in human testis, bovine testis and bovine ovary. IgGis displayed as a negative control. Human and bovine testis row represent an epididymis tube cut transversely.  Bovine ovary inIgG displays ovarian cortex  (dashed circles represent primary follicles) and the other two pictures represent an antral folliclewith ET‐ External Theca; IT‐ Internal Theca; A‐ Antral cavity; CC‐ Cumulus Cells; GC‐ Granulosa Cells; BM‐ Basal Membrane; O‐Oocyte. Scale bar: 0.1mm. 

25 

metaphase plate,  in a spindle‐like manner at metaphase  I stage (Fig. 15, D‐I). After 23 H of 

maturation,  the majority  (>85%)  of  oocytes  had  reached  the metaphase  II  stage, where 

TACC3  protein  was  seen  to  localize  around  one  mass  of  DNA  (Fig.  15,  J‐L).  After  the 

maturation process, sperm was added to the medium and oocytes were collected 6, 12 and 

22 H post fertilization. It has to be noted that despite the fact the oocytes were all in contact 

with sperm cells, the exact moment of fertilization cannot be determined. 6 H after adding 

sperm, we could perceive an anaphase II stage (Fig. 15, M‐O) where the protein co‐localized 

with the meiotic spindle, exhibiting a microtubule‐like staining pattern. After this stage, the 

cell exhibits 4 different nuclei: 2 pronuclei and 2 polar bodies (Fig. 15, P‐R and S‐U). 12H after 

adding  sperm, we  could  observe  these  4  nuclei with DAPI  staining  yet  TACC3  expression 

pattern was extremely weak (Fig.15, P‐R) like what happens in 22H fertilized oocytes (Fig. 15, 

S‐U), suggesting a decrease in protein level following the first cleavage. In adition, no TACC3 

protein was detected at the blastocyst stage (Fig.15, V‐Z).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

In  conclusion,  the protein  recognized  by  the  antibody,  interpreted  as  TACC3,  is  co‐

localizing with  the meiotic spindle and  it  is absent  in  the GV stages and  in early phases of 

embryo  development.  However,  in  Fig  10,  where  the  TACC3  antibody  was  used,  we 

demonstrate  TACC3  expression  in  the  GV  and  blastocyst  stage.  Without  further 

Figure 15  ‐  ‘TACC3’ expression pattern during oocyte development and early embryogenesis. The oocyte progresses throughmeiosis displaying a (A‐C) germinal vesicle stage, a (D‐F, G‐I) metaphase I, 12H after maturation and a (J‐L) metaphase II stage,23H after maturation. After fertilization the oocyte undergoes, (M‐O) anaphase II, 6H after fertilization, (P‐R, S‐U) zygote stage,12H and 22H after fertilization respectively until it reaches (V‐Z) blastocyst stage. Oocyte limits are represented by the dashedcircle line. Scale bar: 10µm 

26 

characterization, it could only be speculated whether the protein was around the metaphase 

plate or the polar body during metaphase II.  .  

 

TACC3’s presence surrounding the metaphase plate in the metaphase II 

 

 

During meiosis, actin localizes specifically around the polar body 71 and a co‐staining of actin 

and TACC3 was performed in MII stages oocytes. First, microfilaments were stained (Fig. 16) 

to  check  whether  the  protocol  worked  for  bovine  oocytes.  Indeed  actin  filaments  were 

identified specifically surrounding the extruded polar body (Fig. 16, B and F) while α‐tubulin 

was  present  on  both  the  polar  body  and  the  metaphase  plate  (Fig.16,  C  and  G).  In 

metaphase  II  oocytes  a  distinct  pattern  was  observed  between  the  polar  body  and  the 

metaphase plate where  the actin was surrounding  the polar body on  the periphery of  the 

oocyte and TACC3 protein was  located specifically around the metaphase plate (Fig. 12, A‐

D). Later, at  the  zygote  stage,  two masses of DNA were enclosed by actin,  suggesting  the 

presence of the first and the second polar body, 6H after fertilization (Fig. 12, G) and TACC3 

expression  accumulated  in what,  based  on  the  actin  distribution,  is  proposed  to  be  the 

second polar body, while no protein was surrounding the female pronucleus (Fig.12, E‐H). 

  A  B C D

E  F G H

DAPI  Actin α‐tubulin DAPI Actin α‐tubulin 

Figure 16  ‐ Microfilament and microtubule staining with actin (phalloidin) and α‐tubulin on  (A‐H) metaphase  II oocytes, 23Hafter maturation; (D‐H) zoom on the metaphase plate and polar body. Columns are divided per staining, as indicated. Scale bar:10 µm. 

27 

  DAPI  A  ‘TACC3’ B actin C DAPI ‘TACC3’ actin  D

E  F G H

Bearing  in mind that the protein recognized by the antibody  is also expressed on the 

meiotic  spindle;  these  results  suggest  that  TACC3  could  be  tangled  with  tubulin  and/or 

involved with the process of asymmetric division. 

 

TACC3 partially overlaps with α‐tubulin during oocyte and early zygote 

development 

 

Oocytes were collected at 12 and 23 H and 3, 6 and 9H after adding sperm to the medium. 

This approach was chosen in order to try to observe stages of meiosis in which the spindle is 

pronounced, such as anaphase and telophases  I and  II. At the metaphase  I stage of oocyte 

development, TACC3 and tubulin expression was partially overlapping, although quite some 

variation  was  observed  in  expression  between  different  oocytes  (Fig  18  A‐L).  At  the 

anaphase‐telophase  stage  (in  between metaphase  I  and metaphase  II  stages),  a  tubulin 

pattern representing the meiotic spindle was clearly visible while expression of TACC3 was 

almost  absent  (Fig. 18, M‐T). At  the metaphase  II  stage of meiosis TACC3 expression was 

readily observed, partially overlapping with the expression of tubulin (Fig. 18, A‐Z and a‐d). 6 

H  after  fertilization,  the  zygote  stage  displayed  a  TACC3  staining  on  the  residual  spindle 

separating what is suggested to be the future female pronucleus and the second polar body 

(Fig. 18, e‐h).  

Figure 17 ‐ Double stainings with ‘TACC3’ and actin on metaphase II oocytes. Actin stainings reveals the extruded polar body.(A‐D)  zoom on metaphase  II oocyte  exhibiting metaphase plate  and polar body,  (E‐H)  zoom on  a  zygote  stage, 6 H  afterfertilization, with two polar bodies and presumptive female pronuclei.  Scale bar: 10 µm. 

28 

 

 

 

  DAPI  ‘TACC3’ α‐tubulin DAPI ‘TACC3’α‐tubulin A  B C D

E  F G H

I  J K L

M  N O P

U 

R S T

V X Z

Q 

29 

 

 

 

Discerning  TACC3  function:  using MLN8054  compound,  an  Aurora‐A 

inhibitor, decreases oocyte developmental progress and causes spindle 

anomalies 

 

Aurora‐A  kinase,  responsible  for  TACC3  phosphorylation  and  activation  can  be  selectively 

inhibited using  a  small  compound,  the MLN8054  72,73.    This  small molecule demonstrated 

similar  results  to  those of RNAi directed against Aurora‐A,  including  chromosomal defects 

leading to aneuploidy 72.  To study Aurora‐A kinase activity in TACC3 function during bovine 

oocyte  meiosis,  oocytes  were  matured  in  the  presence  and  absence  of  this  Aurora‐A 

inhibitor (Table 4).  

23 h matured oocytes were  collected  and  scored  the ones  in  equal developmental 

stage with  an  increased  inhibitor  concentration  (Fig.  19,  Supplementary  Table  1).  Firstly, 

there were no significant differences between the normal IVM and maturation with 0 µM of 

MLN8054  (10  µM  DMSO),  so  DMSO  had  no  effect  on  the  oocyte.  Secondly,  oocytes 

(denuded  and  non‐denuded)  tend  to  arrest  in  metaphase  I  stage  in  a  concentration 

dependent matter, decreasing the percentage of oocytes at the metaphase II stage.  

 

Figure 18 – Double stainings of ‘TACC3’ and microtubules (α‐tubulin) on oocytes and early zygotes. Images (A‐L) demonstrate a3 metaphase  I  oocytes,  12  hours  after maturation  (M‐T)  anaphase  I/telophase  I  oocytes,  12  hours  after maturation  (U‐d)metaphase II oocytes, 23 hours after maturation, and (e‐f) zygote stage, 6 hours after adding sperm to the medium.  Scale bar:10 µm. 

 a  b c  d

e  f g  h

DAPI  ‘TACC3’ α‐tubulin DAPI ‘TACC3’ α‐tubulin 

30 

 

 

In the presence of the inhibitor the percentage of MII stage oocytes (identified by the 

presence of the first polar body) was reduced in a concentration dependent manner (Fig. 20, 

Supplementary  Table  2).  Similarly,  the  percentage  of  blastocyst  formation  after  embryo 

cleavage also decreased with an increased drug concentration (Fig. 20, Supplementary Table 

3).  Moreover, there were no differences concerning cumulus cells growth and expansion in 

the presence  or  absence  of  the  inhibitor,  however,  a higher  number  of  oocytes must  be 

analyzed to provide appropriate statistical conclusions. These results suggest that inhibition 

of Aurora‐A kinase is affecting cell division and/or the process of polar body extrusion.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

MLN8054 effect on oocyte developmental progress   

Metaphase II

Telophase I

Metaphase I

Figure 19 ‐ Stacked column graphic representing the effect of the small molecule MLN8054 throughout oocyte developmentalprogress, namely during metaphase I, telophase I and metaphase II oocytes in different conditions.  

 

82,98% 

40,48% 8,51%  6,12% 

R² = 0,8913 

‐20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

0 µM  MLN8054 1.25µM MLN8054 2.5µM  MLN8054 5µM MLN8054

Presence of polar body 

 

71% 53%  58% 

41%  38% 

R² = 0,8511 

0%

20%

40%

60%

80%

Normal IVM 0 µM MLN8054 1.25µM MLN8054 2.5µM MLN8054 5µM MLN8054

Blastocyst formation from cleaved embryos 

Figure  20  ‐.    Uppergraphic  represents  theeffect  of  MLN8054  onthe  percentage  ofoocytes  with  extrudedpolar body and the  lowerone  represents  thepercentage  of  blastocystformation  (day  8)  fromalready  cleaved  embryos(day 5) with an  increaseddrug concentration. Errorbars  are  indicated  andred  line  represents  alinear  trendline  with  R

2

value indicated above.    

31 

Bearing  in mind  last  results,  α‐tubulin  stainings  were  performed  on metaphase  I, 

telophase  I and metaphase II staged oocytes (Fig. 21). When Aurora‐A kinase was  inhibited 

during maturation, oocytes exhibited abnormal spindles with misaligned chromosomes (Fig. 

21, H and K). The  few oocytes  that did  reach  the metaphase  II stage displayed misaligned 

chromosomes (Fig.21, L). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

From  these  results,  it can be suggested  that Aurora‐A  inhibition disturbs  the spindle 

assembly and chromosome alignment. It should be further established how much Aurora‐A 

kinase inhibition affects TACC3 function in bovine oocytes. 

 

Effects of MLN8054 on TACC3 protein expression 

 

Oocytes matured with an  increased dosage of MLN8054 (Table 4) were stained with TACC3 

antibody  (Fig.  22). No  differences were  observed  on  the  expression  pattern  of  TACC3  in 

metaphase  I  oocytes  with  an  increased  drug  concentration  (Fig.  22,  A‐D). Metaphase  II 

oocytes  (Fig.  22,  E‐H), when matured  in  the  presence  of  the  inhibitor,  revealed  a  TACC3 

vesicle‐like pattern or a putative clustering of protein distributed around the DNA (Fig.22, G 

and H). Previous reports stated that MLN8054 action implicates inhibition of Aurora‐A kinase 

activity, therefore not phosphorylating TACC3. If TACC3  is unphosphorylated,  it  lacks a part 

of  its molecular weight which  in a Western blot might result  in a different sized band. Also 

whether the antibody is recognizing the phosphorylated or unphosphorylated protein might 

reveal different results on a blot.   

 

Figure 21  ‐ Effects of MLN8054 on oocyte meiotic spindle during oocyte maturation process. Each row represents a differentdrug concentration,  indicated on the left. Each column represents three different phases, as it  is indicated above. The imagesdisplay merged images of α‐tubulin and DAPI stainings. Scale bar: 10µm 

 

Control IVM 

0µM M

LN8054 

Metaphase I  Telophase I  Metaphase II

α‐tubulin DAPIα‐tubulin DAPI  α‐tubulin DAPI 

2.5µM M

LN8054 

5µM M

LN8054 

Metaphase I Telophase I Metaphase II 

α‐tubulin DAPIα‐tubulin DAPI α‐tubulin DAPI 

A  B 

D  E 

C 

F 

G  H 

J  K 

I 

L 

32 

 

To address this question, oocytes were matured with 0 µM MLN8054 and with 5 µM 

MLN8054 and 500 metaphase  II oocytes and  their cumulus cells were western blotted  for 

TACC3 (Fig. 23). Metaphase II oocytes matured with and without the drug displayed a band 

between 115 and 180KDa. Concerning cumulus cells, we perceive a band (around 170KDa) 

when matured with the drug, whilst no band  is detected on the control.   For quality check, 

β‐actin staining was performed on the same blot and only the oocytes revealed a band.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figure 22 ‐ Effects of MLN8054 on TACC3 protein expression pattern during metaphase I and II oocytes. TACC3 representedin green and DAPI  in blue. The  first row displays metaphase  I oocytes and the  lower row metaphase  II ones.   Columns aredivided according to the type of maturation process, as indicated on top. Scale bar: 10µm. 

Figure 23 ‐ Western Blot on TACC3 protein and β‐actin  in  four  different  groups.  First  film  reveals the  results  of  the  blot with  TACC3  protein with 1min  exposure  to  X‐ray  film,  second  reveals  β‐actin staining and some TACC3 left after 10 min of exposure. First lane represents lysates of cumulus cells  from  cells  matured  with  0µM  MLN8054, second  lane  represents  lysates  of metaphase  II oocytes matured also with 0µM MLN8054. Third and  fourth  lanes  represent  lysates  of  cumulus cells  and  metaphase  II  oocytes  respectively matured  with  5µM  MLN8054.  Ladder  is represented in blue. 

 

TACC3

β-actin

1min exposure  10min exposure 

 

B  D

F  HGE 

CA 

5µM MLN8054 Control IVM  0µM MLN8054

Metap

hase I 

Metaphase II 

1.25µM MLN8054

TACC3 DAPI  TACC3 DAPI TACC3 DAPI TACC3 DAPI 

33 

Discussion 

 

PIWIL3 during bovine oocyte development  

 

The  custom‐made  antibody  designed  to  recognize  bovine  PIWIL3  did  not  identify  bovine 

Piwi‐like 3 protein because of incorrect protein sequences predicted by ENSEMBL and NCBI. 

When the epitope peptide is blasted on the ENSEMBL protein database, no Piwi‐like protein 

is matching  whilst  the  NCBI  protein  database matches  the  peptide  to  the  NH2  part  of 

PIWIL3.  It  was  however  discovered  that  the  antibody  specifically  recognizes  another 

unrelated protein, TACC3. 

On the basis of this project was the assumption that PIWIL3 has a specific role during 

bovine  oocyte  development;  this  suggestion  came  from  RT‐PCR  experiments  by  which 

bovine Piwi‐like 3 mRNA expression was detected in germinal vesicle and metaphase II stage 

oocytes 33 (Fig. 5). When the expression patterns of Piwi‐like 1 and Piwi‐like 2 proteins were 

analyzed  (Fig. 11),  it  revealed a  cytoplasmic  staining  in  contrast  to  the  specific expression 

pattern  that PIWIL3 was  suggested  to exhibit around  the oocyte  chromatin  33. Subcellular 

localization of PIWIL1 and PIWIL2 in oocytes has not been documented, mostly because they 

are restricted to testis, particularly  in spermatocytes  32,74.   Besides 34.3%  identity between 

PIWIL1 and PIWIL2 32, only MILI (PIWIL2) and Zili (Zebrafish homolog of Mili) proteins were 

demonstrated to be also present in the female gonad 27,28 and PGCs of both sexes 28.  

It  can  be  suggested  that  the  cytoplasmic  expression  of  bovine  PIWIL1  and  PIWIL2 

presented  here  are  in  accordance  with  documented  cytoplasmic  localization  of  MIWI 

(PIWIL1)  and MILI  (PIWIL2)  in mouse  transfected  cells  28,75  and with  Ziwi  (MIWI)  protein 

during early oogenesis  in  Zebrafish  27,76. However  they differ  from  their human homologs 

that are expressed in the nucleoplasm 74. It is possible that Piwi‐like proteins in humans have 

different  functions  than  their mouse  homologs  and  the  different  subcellular  localization 

might  support  this  notion  which  increases  the  importance  of  having  a  proper  model‐

organism  to  study  PIWI  proteins  in mammals.  PIWI  proteins might  be  involved  in  post‐

transcriptional mRNA processing  in the nucleus and, alternatively, MIWI proteins might be 

involved in post‐transcriptional regulation of mRNA in the cytoplasm. Nevertheless whether 

the performed bovine PIWIL1 and PIWIL2 stainings are specific remains to be tested. 

 

34 

The  commercially  available  human  PIWIL3  antibodies  are  directed  against  different 

epitopes  (Fig.  12).  Although  cross‐reactivity  has  not  been  described  (Table  2)  the  human 

antibody’s  epitope  recognizes  bovine  Piwi‐like  3 when  blasted  against  the whole  bovine 

genome. The human antibody directed against the whole peptide sequence could stain the 

germ  and  somatic  line.  Besides  not  having  proper  positive  controls,  PIWI  presence  in 

germline was already documented as being important to both male and female germline in 

non‐mammalian organisms and  for stem‐cell  renewal  in non‐mammal cells  25,27,77–79.  It has 

also  been  demonstrated  that  PIWI  proteins  are  expressed  in  Drosophila melanogaster’s 

follicular cells of somatic origin, being responsible for maintaining  stemness of the germline 

through  a  signaling mechanism  25,78,80. Despite  PIWI presence  in  the  female  germline  and 

importance  in maintaining germline stemness  in other organisms,  this  relation has not yet 

been documented in mammalian species.   

If PIWIL3 is indeed present in bovine somatic tissues in close proximity to the oocyte, 

it  can  be  suggested  that  it  may  protect  the  germ  cell  line  as  described  by  controlling 

retrotransposons activity or epigenetic markers. About Piwi‐like 3 protein, very few data can 

be  found given  its absence  in mice, however PIWIL3 expression  in the   male germline  is  in 

agreement with previous reports 74. SNP (Small Nuclear polymorphisms) in this gene can be 

responsible for human oligozoospermia, increasing the urgency to study this protein 81. The 

different Piwi‐like proteins differ greatly in amino acid sequences 32 and the PIWIL1 has the 

highest  homology  with  PIWIL3  (Fig.  4)32.  Miwi  (PIWIL1)  is  a  key  regulator  of  

spermatogenesis,  particularly  during  later  stages  and  it  was  proposed  to  be  involved  in 

mRNA processing and stability as well as with translational regulation 28,82.  

 

Regarding the project aim to get new insights into PIWIL3 localization and function in 

bovine oocytes,  results with  the anti‐human PIWIL3 antibody  reveal expression  in oocyte‐

surrounding  cumulus  cells,  suggesting  that  its  expression  is  not  germline  specific.  Knock 

down and overexpression studies of  this protein with RNAi would contribute  to additional 

functional knowledge, and this can be achieved using transfection techniques described to 

be promising in bovine oocytes 33. Recently our lab has discerned the correct full‐length Piwi‐

like 3 mRNA sequence which will contribute greatly to discern the challenge presented here. 

 

 

 

 

35 

TACC3 protein in bovine oocyte development 

 

The mass  spectrometry data  together with  the double  staining  ‘TACC3’ + TACC3  revealed 

that  the  custom‐made antibody against PIWIL3  specifically binds  to TACC3.   Western blot 

analysis  revealed  that both  antibodies  recognize  an  equally  sized protein  in metaphase  II 

oocytes  (Roelen  &  Mahdipour,  unpublished  results).  The  reason  why  our  antibody 

recognized  TACC3  protein  remains  unknown.  The  Immunoprecipitation with  the  custom‐

made PIWIL3 antibody on metaphase II oocytes followed by mass spectrometry revealed no 

known PIWI binding proteins nor known TACC3 binding proteins such as clathrin or ch‐TOG, 

known  to  tightly  act  as  a  complex  61,63.  Immunoprecipitation  studies  have  previously  not 

detected  these proteins  in mitotic cytosol and  interphase cell stage, however  the complex 

was  detected  in  the mitotic  spindle  61,  suggesting  its  specificity  during  stages where  the 

spindle  is prominent, which can explain why we did not detect these protein complexes  in 

metaphase II oocytes. 

Using the custom‐made antibody directed against PIWIL3 to describe TACC3, we could 

demonstrate  that  the protein was  surrounding  the  chromatin  in a  spindle‐like matter and 

that it was present in close association with the oocyte‐specific DNA, in the metaphase plate 

at  the metaphase  II  (Fig. 15).  If TACC3  is  indeed  associated with meiotic  cell division  and 

spindle assembly as  it was proposed before,  it  should be present within  the mass of DNA 

that will progress through cell division. In fact, our results display TACC3 stainings around the 

metaphase plate, which will divide originating the female pronucleus and the second polar 

body (Fig. 17).  Also TACC3 expression on the blastocyst, a stage of high proliferation rate, is 

in agreement with this hypothesis (Fig. 10). TACC3 is then proposed to be present in bovine 

oocytes  from  GV  up  until  blastocyst  stage,  which  is  in  agreement  with  previous  oocyte 

stainings  in mice  69.  It was also proposed that TACC3 might be associated with  the spindle 

microtubules and indeed its partial overlap with α‐tubulin and its spindle‐like pattern during 

telophase suggests so (Fig. 17).   

  TACC3 cDNA was observed in multiple tissues such as testis, ovary, uterus, cumulus 

cells,  granulosa  cells,  heart  and  lung  (Roelen & Mahdipour,  unpublished  results)  and  the 

presence  in  testis  and  lung,  organs  with  high  proliferation  rate,  are  in  accordance  with 

previous reports 46. Also, gene expression of TACC3 in ovary was also documented 83,84. qPCR 

analysis  on  TACC3  demonstrated  it  to  be  present  throughout  oocyte  development,  from 

germinal vesicle stage up until zygote (Roelen & Mahdipour, unpublished results), which is in 

accordance with previous reports 69 and with our immunofluorescence results obtained with 

36 

the  TACC3  antibody  (Fig. 10). However,  reaching  the morula  and blastocyst  stage,  TACC3 

quantification was almost null  (Roelen & Mahdipour, unpublished results), which contrasts 

with  the  TACC3  stainings  on  blastocysts.  This  decrease  was  also  documented  when  a 

quantitative PCR on bovine PIWIL3 was performed 33. In cattle, embryonic genome activation 

was reported to take place between the 6‐16 cell (morula) stages, where embryos overcome 

their  state  of  transcriptional  repression,  start  transcription  of  their  own  genes  while 

destroying maternally  inherited mRNAs  85. Due  to  its  presence  in  the oocyte  and  zygote, 

TACC3 is being maternally inherited and the protein expression seen in blastocyst stage can 

be endogenous protein already transcribed by the embryo’s genome. TACC3 is known to be 

important  for proper early  cell division  and  therefore  correct embryo development  44,46,47 

and its expression in bovine oocyte seems to be as equally important.   

 

It  is  known  that  TACC3  proper  phosphorylation  and  activation  is  essential  for  its 

correct location on the centrosomes throughout species 51,54,69,86. To address TACC3 function 

during  bovine  oocyte  development,  an  Aurora‐A  inhibitor  was  used,  the  MLN8054, 

recommended  as  an  attractive  therapeutic  intervention  regarding  cancer  73.  This  highly 

specific small molecule is an ATP‐competitive, reversible inhibitor of Aurora‐A kinase 73. Our 

results demonstrate a developmental arrest of oocytes in the meiosis I stage when matured 

with  increased concentration of MLN8054 (Fig. 19). A similar arrest was also demonstrated 

in  (i) cultured Human  tumor cells with MLN805473,  (ii) Hela cells deprived of TACC3  52,  (iii) 

Aurora‐A mutants in Drosophila 54,56 and (iv) TACC3 mutants  in Xenopus 39. The extrusion of 

the polar body  (an  important  factor when analyzing oocyte progression  69) and blastocyst 

formation  (Fig.  20)  also  points  to  a  cause‐effect  relation  between  the  drug  and  oocyte 

developmental progress and  indeed tubulin stainings revealed that abnormal spindles  (Fig. 

21) may  be  responsible  for  abnormal  oogenesis.    If  the  spindle  assembly  is  inadequate, 

chromosomes can become misaligned and,  if not pulled  correctly  towards opposite poles, 

cell  division  may  result  in  different  chromosome  numbers  in  each  end,  leading  to 

aneuploidies  52,54,72. This can explain why oocytes were arrested  in metaphase  I,  leading to 

fewer oocytes on metaphase  II  stage  (and  consequently  less polar body  extrusion)  and  a 

decrease in blastocyst formation. 

It is worth noting, however, that some oocytes are still able to proceed with oogenesis 

and embryo development, similar to what has been described for human cells 57. Regarding 

our results, this occurs probably because the oocyte can recover from the damages caused 

my MLN8054, since the oocyte is drug free after fertilization. Nevertheless, the drug causes 

37 

misalignment  of  chromosomes,  which  can  result  in  aneuploidies  in  daughter  cells  like 

previously  reported  72.  Microtubule  rearrangements  and  misaligned  chromosomes  were 

previously connected to TACC3 mutants in multiple species 39,40,50,51 which highlights TACC3’s 

evolutionary conserved function.  

The denuded and non‐denuded oocytes exhibited a similar drug‐response suggesting 

that cumulus‐cells have little or no effect on the oocyte response to the drug.  Also, judging 

by pictures taken before and after maturation, the growth and expansion of cumulus cells 

was not affected by the drug suggesting that cumulus cells could divide despite the drug.  

 

Our  results  point  to  a  proper  Aurora‐A  kinase  inhibition  with  MLN8054  when 

compared  to previous  reports on RNAi against  this kinase, however we did not  study  this 

kinase directly. TACC3 is known to be both centrosome, spindle and microtubule associated  

during mitosis  38–40,48,49,51,54,61, being  important  for proper cell division  46. Therefore, TACC3 

localization  can  be  used  to measure  Aurora‐A  activity  in mitotic  cells  48.  If MLN8054  is 

inactivating Aurora‐A, this protein will not phosphorylate TACC3 and the unphosphorylated 

protein  will  not  target  the  centrosomes  as  it  should,  being  diffusely  localized  in  cells, 

similarly to what happens in TACC3 mutants 48,54,55,63,87. Our results regarding TACC3 protein 

expression  in oocytes matured with MLN8054 revealed a clustering  in vesicles through the 

cytoplasm during metaphase  II  (Fig. 22), where no preference  for  centrosomes or  spindle 

was verified. This can be due to the fact the antibody is recognizing both the phosphorylated 

and non‐phosphorylated protein, being  therefore  impossible  to distinguish between  these 

two  forms  using  only  immunofluorescence. However  a  diffuse‐like  pattern  of  TACC3  has 

been described  in mitotic cells grown with MLN8054  48.  In addition, we were expecting  to 

see a  somehow different migration pattern of oocyte  lysates  incubated with  and without 

MLN8054,  after  electrophoresis.  If  indeed  TACC3  phosphorylation  pattern  was  being 

affected,  it  could  result  in a  reduced molecular weight of  the non‐phosphorylated protein 

and  therefore  longer  migration.  However  the  same  sized  band  on  both  lanes  (Fig.  23) 

revealed that there was no clear difference on the TACC3 molecular weight. β‐actin staining 

only on metaphase  II suggested that only these two  lanes were valid, therefore we cannot 

conclude anything from the cumulus cells.  

In mouse  oocytes  TACC3  is  present  during meiotic maturation  and  phosphorylated 

TACC3  is present on  the  spindle poles,  from GVBD  to metaphase  II,  suggesting a possible 

protein  substitution  69.  Our  Immunofluorescence  results  (Fig.  10)  agree  with  this  study, 

however  we  cannot  conclude  anything  on  TACC3  phosphorylation  pattern.  An  efficient 

38 

inactivation of TACC3 would  result  in  lack of P‐TACC3 on  the poles, and our analysis could 

not discern this 55,87.  

 

One of the aims of this project was also to try to understand whether TACC3 would be 

the  core effector on  the  complex TACC3/ch‐TOG/clathrin.  Since  the background  literature 

reveals  two different models, which can be applied  to cattle? We have  reasons  to believe 

that TACC3 is responsible for a proper spindle assemble in bovine meiosis, however whether 

it  recruits  the  other  two proteins  is  still  unknown. Depletion  of  both  TACC3  and  clathrin 

destabilizes mitotic  spindle  and  TACC3  strong  localization  to  the  spindles  and  binding  to 

microtubules suggest that TACC3 recruits ch‐TOG and clathrin to the spindle, stabilizing it by 

inter‐microtubule bridging 61. Depletion of clathrin does not prevent TACC3 recruitment to 

the  spindle;  instead  it  causes  a  reduction  in  TACC3  and  ch‐TOG  by  preventing  their 

accumulation. Our  results do not  contribute directly  to  this discussion, however,  a broad 

model  is proposed here where,  together with  literature  gathered  so  far,  it  illustrates  the 

function of the main players in this topic (Fig. 24). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figure  24  –  Proposed  TACC3/ch‐TOG/clathrin  recruitment  to  the  spindle  and  centrosomes  during  bovine  oocytedevelopment.  Black  box  represents  the  situation  in  the  spindle  and  red  one  represents  recruitment  of  phosphorylated TACC3 to the centrosomes. 1‐ TACC3 or TACC3/ch‐TOG is activated through Aurora‐A phosphorylation and is then recruited to the spindle. MLN8054 or TPX2 are Aurora‐A inhibitors that can inhibit TACC3 phosphorylation and activation. If so, TACC3 wont locate to the centrosomes, causing an oocyte arrest in the metaphase I stage. 2‐ Recruitment of Clathrin by TACC3 or by the complex TACC3/ch‐TOG to the spindle and centrosomes. 3‐ Clathrin forms an inter‐microtubule bridge together with ch‐TOG/TACC3 on adjacent microtubules to stabilize the spindle. 

39 

Future perspectives 

 

Besides MLN8054, Aurora‐A kinase action can also be  inhibited by TPX2  (Targeting Protein 

for the Xenopus kinesin xklp2) 88 and it was proposed to be necessary for spindle assembly in 

mouse  oocytes  via  phosphorylation  of  TACC3  at  the  MTOCs  69.  It  would  therefore  be 

interesting to investigate if TPX2 has the same effect in cattle as it has in mice, in respect to 

meiosis progression in oocytes. 

To properly address TACC3 phosphorylation, a Phos‐tag Western blotting is suggested 

for  detecting  stoichiometric  protein  phosphorylation  differences,  as  well  as  the  use  of 

phospo‐dependent antibodies. To acknowledge an association between the Aurora‐A kinase 

activity and TACC3,  spindle  length, assembly and/or number  could be examined,  together 

with quantitative analyses of TACC‐3 / P‐TACC3 and analysis of their expression pattern on 

oocytes. To test whether MLN8054 has the same effects as RNAi directed against TACC3 on 

bovine oocytes, TACC3 knock‐downs with these small RNAs are suggested.  

 

Concluding remarks 

 

This  thesis  demonstrated  a  clear  decrease  in  bovine  oocyte  developmental  progress 

throughout  oogenesis when  the  oocytes  are  cultured with  an  Aurora‐A  inhibitor.  To  our 

understanding, Aurora‐A  is being  inhibited with  the use of MLN8054 which  causes TACC3 

protein  to  diffuse  in  the  cytoplasm  and  cause  spindle  defects  responsible  for  oocyte 

developmental arrest.   Nevertheless we cannot yet settle a direct cause‐effect relationship 

between  the  drug,  Aurora‐A  activity,  TACC3  phosphorylation/activation  and  spindle 

assembly, however big steps were taken towards that direction.  

 

 

 

 

40 

References 

1. Edwards RG, Steptoe PC, Purdy JM. ESTABLISHING FULL‐TERM HUMAN PREGNANCIES USING CLEAVING 

EMBRYOS GROWN IN VITRO. BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology. 87(9). 

2. Gilbert SF. Developmental Biology. Ninth edit. SINAUER; 2010. 

3. Adams GP, Jaiswal R, Singh J, Malhi P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. 

Theriogenology. 2008;69(1):72–80. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17980420. Accessed 

September 21, 2012. 

4. Smitz JEJ, Cortvrindt RG. The earliest stages of folliculogenesis in vitro. Reproduction. 2002:185–202. 

5. Braw‐Tal R, Yossefi S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. 

Journal of Reproduction and Fertility. 1997;(July). 

6. Shard MA. RESUMPTION OF MEIOSIS : MECHANISM INVOLVED IN MEIOTIC PROGRESSION AND ITS 

RELATION WITH DEVELOPMENTAL COMPETENCE. Theriogenology. 2001;(418):1241–1254. 

7. Tol LV. Intra‐follicular interactions affecting mammalian oocyte maturation. 2009. 

8. A. Tsafriri ND and SB‐A. The role of oocyte maturation inhibitor in follicular regulation of oocyte 

maturation. Journals of Reproduction & Fertility. 1982. 

9. Watson a J. Oocyte cytoplasmic maturation: a key mediator of oocyte and embryo developmental 

competence. Journal of animal science. 2007;85(13 Suppl):E1–3. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17322120. Accessed September 14, 2012. 

10. Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver V. Genetics, From Genes to Genomes. Third edit. (Hill M, 

ed.).; 2008. 

11. Reik W, Dean W, Cell M. Epigenetic Reprogramming in Mammalian Development. Science. 

2001;293(August):1089–1093. 

12. Aravin AA, Hannon GJ. Small RNA Silencing Pathways in Germ and Stem Cells. Cold Spring Harbor 

Symposia on Quantitative Biology. 2008. 

13. Lau NC. Small RNAs in the animal gonad: Guarding genomes and guiding development. International 

Journal of Biochemistry. 2010;42(8):1334–1347. 

14. Chapman EJ, Carrington JC. Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways. Nature. 

2007;8:884–896. 

15. Nowotny M, Yang W. Structural and functional modules in RNA interference. NIH. 2009;19(3):286–

293. 

16. Tolia NH, Joshua‐tor L, Rnas BOXS. Slicer and the Argonautes REVIEW. Nature Chemical Biology. 

2006;3(1):36–43. 

17. Boland A, Huntzinger E, Schmidt S, Izaurralde E, Weichenrieder O. Crystal structure of the MID‐PIWI 

lobe of a eukaryotic Argonaute protein. PNAS. 2011;2011:1–6. 

18. Song J‐J, Smith SK, Hannon GJ, Joshua‐Tor L. Crystal Structure of Argonaute and Its Implications for 

RISC Slicer Activity. Science. 2004;1434. 

19. Aravin AA. The Piwi‐piRNA Pathway Provides an Adaptive Defense in the Transposon Arms Race. 

Science. 2007;761(2007). 

20. Aravin AA. Developmentally Regulated piRNA Clusters Implicate MILI in Transposon Control. Science. 

2007;744(2007). 

41 

21. Siomi MC, Sato K, Pezic D, Aravin AA. PIWI‐interacting small RNAs : the vanguard of genome defence. 

Nature. 2011;12(4):246–258. Available at: http://dx.doi.org/10.1038/nrm3089. 

22. Saito K, Nishida KM, Mori T, et al. Specific association of Piwi with rasiRNAs derived from 

retrotransposon and heterochromatic regions in the Drosophila genome. Genes & Development. 2006:2214–

2222. 

23. Vagin VV, Gvozdev V, Zamore PD. A Distinct Small RNA Pathway Silences Selfish Genetic Elements in 

the Germline. Science. 2006;320. 

24. Sarot E, Bucheton A, Pe A. Evidence for a piwi‐Dependent RNA Silencing of the gypsy Endogenous 

Retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco Gene. Genetics Society of America. 

2004;1321(March):1313–1321. 

25. Cox DN, Chao A, Baker J, et al. A novel class of evolutionarily conserved genes defined by piwi are 

essential for stem cell self‐renewal. Genes & Development. 1998:3715–3727. 

26. Lau NC, Ohsumi T, Borowsky M, Kingston RE, Blower MD. Systematic and single cell analysis of 

Xenopus Piwi‐interacting RNAs and Xiwi. The EMBO Journal. 2009;28(19):2945–2958. Available at: 

http://dx.doi.org/10.1038/emboj.2009.237. 

27. Houwing S, Kamminga LM, Berezikov E, et al. A Role for Piwi and piRNAs in Germ Cell Maintenance 

and Transposon Silencing in Zebrafish. Cell. 2007:69–82. 

28. Kuramochi‐miyagawa S, Kimura T, Yomogida K, Kuroiwa A. Two mouse piwi‐related genes : miwi and 

mili q. Mechanisms of Development. 2001;108:121–133. 

29. Carmell MA, Kant HJGVD, Bourc D, et al. MIWI2 Is Essential for Spermatogenesis and Repression of 

Transposons in the Mouse Male Germline. Developmental Cell. 2007:503–514. 

30. Kuramochi‐miyagawa S, Watanabe T, Gotoh K, et al. DNA methylation of retrotransposon genes is 

regulated by Piwi family members MILI and MIWI2 in murine fetal testes. Genes & Development. 2008;1:908–

917. 

31. Yin D, Wang Q, Chen L, et al. Germline Stem Cell Gene PIWIL2 Mediates DNA Repair through 

Relaxation of Chromatin. PloS one. 2011;6(11). 

32. Sasaki T, Shiohama A, Minoshima S, Shimizu N. Identification of eight members of the Argonaute 

family in the human genome . Genomics. 2003;82:323–330. 

33. Silva RAZ. PIWI PROTEINS IN MAMMALS: A COW’S PERSPECTIVE. 2011. 

34. Rouget C, Robine N, Lai EC, Papin C, Boureux A. Maternal mRNA deadenylation and decay by the 

piRNA pathway in the early Drosophila embryo ´. Nature. 2010. 

35. Rodriguez AJ, Seipel SA, Hamill DR, et al. Seawi − a sea urchin piwi / argonaute family member is a 

component of MT‐RNP complexes. RNA. 2005:646–656. 

36. Bettencourt‐Dias M, Glover DM. Centrosome biogenesis and function: centrosomics brings new 

understanding. Nature reviews. Molecular cell biology. 2007;8(6):451–63. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17505520. Accessed July 17, 2012. 

37. Still IH, Hamilton M, Vince P, Wolfman a, Cowell JK. Cloning of TACC1, an embryonically expressed, 

potentially transforming coiled coil containing gene, from the 8p11 breast cancer amplicon. Oncogene. 

1999;18(27):4032–8. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10435627. 

38. Gergely F, Karlsson C, Still I, et al. The TACC domain identifies a family of centrosomal proteins that 

can interact with microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 

42 

2000;97(26):14352–7. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=18922&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

39. Gergely F, Kidd D, Jeffers K, Wakefield JG, Raff JW. D‐TACC: a novel centrosomal protein required for 

normal spindle function in the early Drosophila embryo. The EMBO journal. 2000;19(2):241–52. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=305558&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

40. Fu W, Tao W, Zheng P, et al. Clathrin recruits phosphorylated TACC3 to spindle poles for bipolar 

spindle assembly and chromosome alignment. Journal of Cell Science. 2010;3:3645–3651. 

41. Bot NL, Tsai M, Andrews RK, Ahringer J. TAC‐1 , a Regulator of Microtubule Length in the C . elegans 

Embryo. Current Biology. 2003;13:1499–1505. 

42. Sato M, Vardy L, Garcia MA, Koonrugsa N, Toda T. Interdependency of Fission Yeast Alp14 / TOG and 

Coiled Coil Protein Alp7 in Microtubule Localization and Bipolar Spindle Formation □. Molecular Biology of the 

Cell. 2004;15(April):1609–1622. 

43. Still IH, Vettaikkorumakankauv AK, DiMatteo A, Liang P. Structure‐function evolution of the 

transforming acidic coiled coil genes revealed by analysis of phylogenetically diverse organisms. BMC 

evolutionary biology. 2004;4:16. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=441373&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

44. Still IH, Vince P, Cowell JK. The third member of the transforming acidic coiled coil‐containing gene 

family, TACC3, maps in 4p16, close to translocation breakpoints in multiple myeloma, and is upregulated in 

various cancer cell lines. Genomics. 1999;58(2):165–70. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10366448. 

45. Ulisse S, Baldini E, Toller M, et al. Transforming acidic coiled‐coil 3 and Aurora‐A interact in human 

thyrocytes and their expression is deregulated in thyroid cancer tissues. Endocrine‐related cancer. 

2007;14(3):827–37. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2216418&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

Accessed August 29, 2012. 

46. Sadek CM, Pelto‐huikko M, Tujague M, et al. TACC3 expression is tightly regulated during early 

differentiation. Gene Expression Patterns. 2003;3:203–211. 

47. Piekorz RP, Hoffmeyer A, Duntsch CD, et al. The centrosomal protein TACC3 is essential for 

hematopoietic stem cell function and genetically interfaces with p53‐regulated apoptosis. EMBO Journal. 

2002;21(4):653–664. 

48. Leroy PJ, Hunter JJ, Hoar KM, et al. Localization of Human TACC3 to Mitotic Spindles Is Mediated by 

Phosphorylation on Ser 558 by Aurora A : A Novel Pharmacodynamic Method for Measuring Aurora A Activity. 

Cancer Research. 2007:3–12. 

49. Peset I, Vernos I. The TACC proteins : TACC‐ling microtubule dynamics and centrosome function. Cell. 

2008;2:379–388. 

50. Albee AJ, Wiese C. Xenopus TACC3 / Maskin Is Not Required for Microtubule Stability but Is Required 

for Anchoring Microtubules at the Centrosome. Molecular Biology of the Cell. 2008;19:3347–3356. 

51. O’Brien LL, Albee AJ, Liu L, et al. The Xenopus TACC Homologue, Maskin, Functions in Mitotic Spindle 

Assembly. Molecular Biology of the Cell. 2005;16(June):2836–2847. 

52. Schneider L, Essmann F, Kletke A, et al. The Transforming Acidic Coiled Coil 3 Protein Is Essential for 

Spindle‐dependent Chromosome Alignment and Mitotic Survival. Journal of Biological Chemistry. 

2007;282(40):29273–29283. 

43 

53. Musacchio A, Salmon ED. The spindle‐assembly checkpoint in space and time. Nature reviews. 

Molecular cell biology. 2007;8(5):379–93. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17426725. 

Accessed July 13, 2012. 

54. Giet R, Mclean D, Descamps S, et al. Drosophila Aurora A kinase is required to localize D‐TACC to 

centrosomes and to regulate astral microtubules. Cell. 2002:437–451. 

55. Kinoshita K, Noetzel TL, Pelletier L, et al. Aurora A phosporylation of TACC3/maskin is required for 

centrosome‐dependent microtubule assembly in mitosis. Cell. 2005;170(7):1047–1055. 

56. Barr AR, Gergely F. Aurora‐A : the maker and breaker of spindle poles. Journal of Cell Science. 2007. 

57. Marumoto T, Honda S, Hara T, et al. Aurora‐A kinase maintains the fidelity of early and late mitotic 

events in HeLa cells. The Journal of biological chemistry. 2003;278(51):51786–95. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14523000. Accessed August 1, 2012. 

58. Rieder CL. Kinetochore fiber formation in animal somatic cells: dueling mechanisms come to a draw. 

Chromosoma. 2005;114(5):310–8. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2570760&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

Accessed August 30, 2012. 

59. Compton DA. SPINDLE ASSEMBLY IN ANIMAL CELLS. Annu. Rev. Biochem. 2000:95–114. 

60. OKAMOTO CT, MCKINNEY J, JENG YY. Clathrin in mitotic spindles. Am J Physiol Cell Physiol. 2000. 

61. Booth DG, Hood FE, Prior IA, Royle SJ. A TACC3/ch‐TOG/clathrin complex stabilises kinetochore fibres 

by inter‐microtubule bridging. The EMBO Journal. 2011;30(5):906–919. Available at: 

http://dx.doi.org/10.1038/emboj.2011.15. 

62. Brodsky FM, Chen CY, Knuehl C, Towler MC, Wakeham DE. Biological basket weaving: formation and 

function of clathrin‐coated vesicles. Annual review of cell and developmental biology. 2001;17:517–68. Available 

at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11687498. 

63. Lin C‐H, Hu C‐K, Shih H‐M. Clathrin heavy chain mediates TACC3 targeting to mitotic spindles to 

ensure spindle stability. The Journal of cell biology. 2010;189(7):1097–105. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2894451&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

Accessed August 28, 2012. 

64. Royle SJ. The role of clathrin in mitotic spindle organisation. Journal of Cell Science. 2012. 

65. Gergely F, Draviam VM, Raff JW. The ch‐TOG / XMAP215 protein is essential for spindle pole 

organization in human somatic cells. Genes & Development. 2003:336–341. 

66. Hubner NC, Bird AW, Cox J, et al. Quantitative proteomics combined with BAC TransgeneOmics 

reveals in vivo protein interactions. The Journal of cell biology. 2010;189(4):739–54. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2872919&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

Accessed July 25, 2012. 

67. Widlund PO, Stear JH, Pozniakovsky A, et al. XMAP215 polymerase activity is built by combining 

multiple tubulin‐binding TOG domains and a basic lattice‐binding region. Proceedings of the National Academy of 

Sciences of the United States of America. 2011;108(7):2741–6. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3041093&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

Accessed August 8, 2012. 

68. Holmfeldt P, Stenmark S, Gullberg M. Differential functional interplay of TOGp/XMAP215 and the KinI 

kinesin MCAK during interphase and mitosis. The EMBO journal. 2004;23(3):627–37. Available at: 

44 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1271808&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

Accessed August 31, 2012. 

69. Brunet S, Dumont J, Lee KW, et al. Meiotic Regulation of TPX2 Protein Levels Governs Cell Cycle 

Progression in Mouse Oocytes. PloS one. 2008;3(10). 

70. van Tol HT a, van Eerdenburg FJCM, Colenbrander B, Roelen B a J. Enhancement of Bovine oocyte 

maturation by leptin is accompanied by an upregulation in mRNA expression of leptin receptor isoforms in 

cumulus cells. Molecular reproduction and development. 2008;75(4):578–87. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17886271. Accessed November 22, 2011. 

71. Woudenberg ARB, Tol HTAV, Roelen BAJ, Colenbrander B, Bevers MM. Estradiol and Its Membrane‐

Impermeable Conjugate ( Estradiol‐Bovine Serum Albumin ) During In Vitro Maturation of Bovine Oocytes : 

Effects on Nuclear and Cytoplasmic Maturation , Cytoskeleton , and Embryo Quality. Biology of Reproduction. 

2004;1474(January):1465–1474. 

72. Hoar K, Chakravarty A, Rabino C, et al. MLN8054, a Small‐Molecule Inhibitor of Aurora A, Causes 

Spindle Pole and Chromosome Congression Defects Leading to Aneuploidy. MOLECULAR AND CELLULAR 

BIOLOGY. 2007;27(12):4513–4525. 

73. Manfredi MG, Ecsedy JA, Meetze KA, et al. Antitumor activity of MLN8054 , an orally active small‐

molecule inhibitor of Aurora A kinase. PNAS. 2006;104(10):1–6. 

74. Sugimoto K, Kage H, Aki N, et al. The induction of H3K9 methylation by PIWIL4 at the p16 Ink4a locus. 

Biochemical and Biophysical Research Communications. 2007;359(2007):497–502. 

75. Kuramochi‐Miyagawa S, Kimura T, Ijiri TW, et al. Mili, a mammalian member of piwi family gene, is 

essential for spermatogenesis. Development (Cambridge, England). 2003;131(4):839–49. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14736746. Accessed July 28, 2011. 

76. Huang HY. Functional analysis of Tudor‐domain‐containing proteins in the zebrafish germline. 2012. 

Available at: http://www.narcis.nl/publication/RecordID/oai:dspace.library.uu.nl:1874/221006. Accessed 

October 12, 2012. 

77. Donnell KAO, Boeke JD. Mighty Piwis Defend the Germline against Genome Intruders. Cell. 

2007;(2007):37–44. 

78. Cox DN, Chao a, Lin H. Piwi Encodes a Nucleoplasmic Factor Whose Activity Modulates the Number 

and Division Rate of Germline Stem Cells. Development (Cambridge, England). 2000;127(3):503–14. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10631171. 

79. Wilczynska A, Minshall N, Armisen J, Miska EA, Standart N. Two Piwi proteins , Xiwi and Xili , are 

expressed in the Xenopus female germline. RNA. 2009;(2009):337–345. 

80. Malone CD, Brennecke J, Dus M, et al. Specialized piRNA pathways act in germline and somatic tissues 

of the Drosophila ovary. Cell. 2009;137(3):522–35. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2882632&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

Accessed October 13, 2012. 

81. Gu A, Ji G, Shi X, et al. Genetic variants in Piwi‐interacting RNA pathway genes confer susceptibility to 

spermatogenic failure in a Chinese population. Cell. 2010;0(0):1– 7. 

82. Deng W, Lin H. Miwi, a Murine Homolog of Piwi, Encodes a Cytoplasmic Protein Essential for 

Spermatogenesis. Developmental cell. 2002;2(6):819–30. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12062093. 

45 

83. Adjaye J, Herwig R, Brink TC, et al. Conserved molecular portraits of bovine and human blastocysts as 

a consequence of the transition from maternal to embryonic control of gene expression. Physiological genomics. 

2007;31(2):315–27. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17595343. Accessed October 15, 2012. 

84. Hao Z, Stoler MH, Sen B, et al. TACC3 Expression and Localization in the Murine Egg and Ovary. 

Molecular Reproduction and Development. 2002;299(May):291–299. 

85. Memili E, Dominko T, First NL. Onset of transcription in bovine oocytes and preimplantation embryos. 

Molecular reproduction and development. 1998;51(1):36–41. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9712315. 

86. Hood FE, Royle SJ. Pulling it together: The mitotic function of TACC3. Bioarchitecture. 2011;1(3):105–

109. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3173962&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

Accessed July 13, 2012. 

87. Barros TP, Kinoshita K, Hyman A a, Raff JW. Aurora A activates D‐TACC‐Msps complexes exclusively at 

centrosomes to stabilize centrosomal microtubules. The Journal of cell biology. 2005;170(7):1039–46. Available 

at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2171528&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

Accessed July 18, 2012. 

88. Gruss OJ, Vernos I. The mechanism of spindle assembly: functions of Ran and its target TPX2. The 

Journal of cell biology. 2004;166(7):949–55. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2172015&tool=pmcentrez&rendertype=abstract. 

Accessed October 16, 2012. 

89. Fu W, Jiang Q, Zhang C. Novel functions of endocytic player clathrin in mitosis. Cell research. 

2011;21(12):1655–61. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21709692. Accessed July 14, 2012.  

 

 

 

XI 

 

Supplementary Information 

 

Stages Normal IVM 

0 µM MLN8054 

1.25 µM MLN8054 

2.5 µM MLN8054 

5 µM MLN8054 

Denuded normal IVM 

Denuded 2.5 µM 

MLN8054 

Metaphase I  14  8  10  34  37  4  13 

Telophase I  2  4  2  2 

Metaphase II  22  24  8  5  16  6 

N Total  38  36  18  41  39  20  19  Supplementary Table 1 ‐ Effect of MLN8054 during oocyte meiosis progress. Numbers (N) represent the oocytes scored in each phase and in each experiment. Results were are also illustrated in the Stacked column graphic in Fig. 19   

 

 

 

 

 

Drug Concentration Extruded polar bodies 

N  % 

0 µM MLN8054  39/47  82,98% 

1.25µM MLN8054  17/42  40,48% 

2.5µM MLN8054  4/47  8,51% 

5µM MLN8054  3/49  6,12% 

Supplementary Table 2 ‐ Effect of MLN8054 during polar body extrusion. N=Number of oocytes. Results are also illustrated in Fig. 20 

Drug Concentration 

Blastocyst formation on day 5 Blastocyst formation on day 8 

Percentage of 

Blastocysts from 

cleaved embryos  

N  %  N  % 

Normal IVM  17/20  85%  12/20  60%  71% 

0 µM MLN8054  19/20  95%  10/20  50%  53% 

1.25µM MLN8054  12/20  60%  7/20  35%  58% 

2.5µM MLN8054  17/20  85%  7/20  35%  41% 

5µM MLN8054  14/20  70%  5/20  25%  38% 

Supplementary Table 3 ‐ Effect of MLN8054 on blastocyst formation. N=Number of oocytes. Blastocysts were scored on day 5 and day 8 of maturation. The final percentage of blastocysts at day 8 is relative not to the total of oocytes (20) but to those that were cleaved on day 5. Results are also illustrated in Fig.20