TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: PESQUISA NEONATAL · 7) Contar con un sistema adecuado de recolección,...

Química Biológica Patológica 2017 Licenciatura en Bioquímica

Área de Química Biológica 102

TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: PESQUISA NEONATAL

Dra. Mariana Ferramola Dra. Gabriela Lacoste

Objetivos: - Definir lo que es un Programa de Pesquisa Neonatal en los Programas de

Prevención de la salud. - Conocer los requisitos que debe cumplir un error congénito del metabolismo

para ser objeto de estudio por parte de un Programa de Detección Neonatal. - Conocer el fundamento de las reacciones de pesquisa utilizadas en Argentina.

Introducción La Detección Neonatal de Errores Congénitos del Metabolismo conocida también

como Screening o Pesquisa Neonatal, constituye una de las herramientas más contundentes que ha desarrollado la Profilaxis Pediátrica Moderna.

La Detección Neonatal de Errores Congénitos del Metabolismo consiste en la búsqueda de desórdenes difíciles de reconocer clínicamente en el neonato, sobre una muestra no seleccionada de la población. Por esta razón, resulta de fundamental importancia en aquellas enfermedades que carecen de síntomas específicos tempranos, que producen daño severo e irreversible, y que son pasibles de tratamiento.

En países desarrollados, la Pesquisa Neonatal forma parte esencial de los Programas de Prevención de la salud. Las estrategias con que se ejecutan los mismos, varían de un país a otro; sin embargo, en todos los casos se plantea un objetivo común, que es la identificación y prevención de desórdenes de la salud que pueden conducir a problemas potencialmente catastróficos.

De esta manera, hablar de Pesquisa Neonatal es equivalente a hablar de Medicina Preventiva. El éxito de un programa de screening se basa en la disponibilidad de métodos bioquímicos adecuados y en la correcta información y concientización de la población en general, y en particular de padres, pediatras, médicos especialistas, bioquímicos, asistentes sociales, nutricionistas, enfermeras y autoridades competentes.

Para que un Error Congénito del Metabolismo sea objeto de estudio por parte de un Programa de Detección Neonatal, debe cumplir con los siguientes requisitos:

1) Causar daños graves e irreversibles. 2) Carecer de signos clínicos en el período neonatal. 3) Poseer un tratamiento efectivo ante la instalación precoz 4) Poseer una incidencia suficientemente alta para justificar su investigación. 5) Existir un conocimiento acabado del curso clínico de la enfermedad. 6) Contar con métodos bioquímicos de diagnóstico y confirmación sensibles,

específicos, sencillos y de bajo costo. 7) Contar con un sistema adecuado de recolección, transporte y almacenamiento

de muestras. Hasta la fecha, se han descrito más de 4000 Errores Congénitos del Metabolismo,

de los cuales aproximadamente 70 conducen a un daño cerebral leve o severo, disponiendo 50 de ellos de tratamiento efectivo. Estos últimos resultan clínicamente importantes, si su incidencia también lo es.

Resulta un tema de continua discusión por parte de los especialistas, si se justifica desde el punto de vista médico, social y económico, la implementación de un Programa



de Detección Neonatal en aquellos errores congénitos del metabolismo donde no existe un tratamiento efectivo. Sin embargo, en estos casos, la utilización de los mismos tiene implicancias relacionadas con el cuidado general de los pacientes, consideraciones, pronósticos y consejo genético. Existen Errores Congénitos del Metabolismo tales como las Hemoglobinopatías y Talasemias donde sólo se recomienda el screening neonatal masivo de acuerdo a los grupos étnicos que constituyen la población y otros como las Hiperlipidemias y Distrofia Muscular Duchenne donde sólo está indicado el screening selectivo.

Desde 1986 la pesquisa neonatal de la fenilcetonuria es obligatoria en nuestro país por la ley 23.413, por su parte la ley 23.874 (1990) incorporó la investigación del hipotiroidismo congénito y en enero de 1995 al sancionarse la ley 24.438 se incorporó la Pesquisa de Fibrosis Quística al recién nacido. El Poder Ejecutivo reglamentó las dos primeras normas a través del Decreto 1316/94 y dispuso que la toma de muestra para la detección precoz de Fenilcetonuria e Hipotiroidismo congénito en los niños recién nacidos deberá realizarse en un plazo no mayor de los siete (7) días de producido el nacimiento y que no sea anterior a las veinticuatro (24) horas de iniciarse la alimentación láctea.

La referida norma reglamentaria también fijó que los jefes de servicio, los médicos obstetras, los médicos neonatólogos y las parteras y profesionales especializados encargados de atender al recién nacido serán los responsables de la realización de las pruebas de rastreo y, además, que las referidas pruebas deberán considerarse como pruebas de rutina tanto por parte de los establecimientos privados o estatales como por obras sociales o seguros médicos. Sin embargo, no es obligación del Estado la cobertura integral del tratamiento médico y nutricional que finalmente impedirá las deficiencias mentales e incapacidades en el niño. Por lo tanto, en rigor, la Argentina no cuenta con un programa integral de pesquisa, ya que solamente diagnostica las enfermedades mencionadas. De este modo, el test de detección del hipotiroidismo y de la fenilcetonuria y el test del sudor para la fibrosis quística apenas tienen un valor estadístico. Según la Academia Americana de Pediatría, un programa de pesquisa neonatal no es un mero análisis bioquímico, sino un programa integrado por varios componentes para la sistemática detección y tratamiento de todos los pacientes afectados. Este programa debería comprender la educación de los padres y pediatras sobre la pesquisa; la pronta ubicación y el seguimiento del individuo con las citadas enfermedades; la educación, el consejo genético y el apoyo psicológico de las familias con niños afectados; el manejo y el tratamiento adecuado de los pacientes y la evaluación sistemática de la evolución.

La galactosemia, la hiperplasia suprarrenal congénita y la deficiencia de biotinidasa son también enfermedades hereditarias que han sido incorporadas a la pesquisa neonatal obligatoria que debe hacerse en nuestro país. La prevención de cualquiera de estas enfermedades será siempre más económica que los costos derivados de su falta de atención. Por tal motivo es importante generar conciencia en la sociedad y en las autoridades sobre la importancia de que se cree un programa integral que contemple no sólo la identificación de estas enfermedades en todo recién nacido, sino también la ayuda necesaria al grupo familiar del niño afectado para hacer frente a un tratamiento que, en muchos casos, no puede ser afrontado por los padres.

De esta manera, actualmente hay la ley 26.279 establece seis enfermedades congénitas que son diagnosticadas obligatoriamente por pesquisa neonatal:

1) Fenilcetonuria. 2) Hipotiroidismo congénito. 3) Fibrosis Quística.



4) Galactosemia. 5) Hiperplasia suprarrenal congénita. 6) Deficiencia de Biotinidasa.

Instrucciones para la recolección de las muestras

Momento de recolección: Se tomará la muestra mediante punción del talón a todo niño recién nacido vivo,

entre las 48 horas y el 5º día de vida. En casos especiales, tales como la necesidad de efectuar el alta del paciente, aunque no es recomendable, se podrá contemplar el límite inferior de 36 horas. No obstante haberse establecido como momento ideal de extracción el período 48 hs - 5º día de vida, no existe límite superior de edad para la exclusión del procedimiento de pesquisa neonatal. Por esta razón, si por cualquier motivo la muestra no fue oportunamente obtenida, ésta deberá ser tomada, aun superado el 5º día de vida, ya que su valor diagnóstico está conservado y el niño, aún con un eventual diagnóstico demorado, se verá beneficiado con la pesquisa neonatal.

Registro de datos: Antes de la toma de la muestra, se deberá llenar la tarjeta recolectora con los datos

de la madre y del recién nacido, asegurándose la veracidad de la información, especialmente en la dirección, teléfono, fecha de nacimiento del recién nacido y día de toma de muestra, el peso al nacer, la edad gestacional, el tratamiento con antibiótico. Son importantes para evaluar el resultado obtenido al realizar la detección de las enfermedades que incluye este Programa. Se deberá aclarar a la madre que dicha información se requiere con el único y exclusivo fin de localizar y dar tratamiento a su bebé en caso de verificarse una patología. Se deberá evitar manipular la porción absorbente de la tarjeta recolectora, a fin de no contaminarla o alterarla. La tarjeta se debe tomar por la porción donde está el formulario. Completar todos los datos de la tarjeta. En caso de que el personal que extrae la muestra visualiza la tarjeta incompleta, solicitar al médico los datos.



Técnica: Confirmar la identidad del infante y proceder al llenado completo del formulario

impreso en la tarjeta de recolección sanguínea, con letra clara y legible. Previo al proceso de extracción sanguínea se procederá al lavado de manos. Se deberán usar guantes (sin polvo), los que se deben cambiar y descartar entre infante e infante.

LA TOMA DE MUESTRA SE REALIZARÁ POR PUNCIÓN DEL TAL ÓN DEL RECIÉN NACIDO, EN LA ZONA PLANTAR EXTERNA POSTE RIOR.

La punción NUNCA se debe realizar en el área central del talón por los posibles

riesgos de lesionar nervios, tendones y cartílago presentes en dicha zona. Es recomendable entibiar el sitio de la punción con agua tibia (a fin de no quemar la

piel), o bien masajeando el talón. Esto ayuda a la vasodilatación de la zona, facilitando la salida de la sangre.

Al colocar la pierna del niño a un nivel más bajo que el corazón, se aumenta la presión venosa, lo que ayuda a obtener una mejor gota de sangre.

Limpiar la zona de punción con alcohol. El exceso de alcohol se debe secar con una gasa estéril o secar al aire, ya que este líquido hemolisa y diluye la sangre, afectando el resultado final.

Realizar la punción utilizando una lanceta estéril, descartable, con una punta de 2 mm de profundidad.

La primera gota de sangre no debe ser aplicada al papel de filtro y debe ser limpiada con gasa estéril. Posteriormente, se debe dejar formar en el talón una gota abundante, la que debe ser recogida directamente del talón a la tarjeta, colocando una única gota de sangre por círculo.

Se debe evitar el apilamiento o aplicación de sucesivas gotas en un mismo punto, ya que esta práctica puede producir muestras no uniformes o sobre impregnadas que alteran el dosaje.

Llenar completamente cada círculo con una gota en cada uno, verificando que la sangre sea visible al reverso de la tarjeta.

Para ayudar a la formación de la gota de sangre en el talón del bebé, el extraccionista podrá aplicar una presión suave e intermitente con el pulgar. Este procedimiento no debe ser muy intenso a fin de no contaminar (por hemólisis) o diluir la muestra con líquidos tisulares.



Evite presionar el talón contra la tarjeta, ya que altera la absorción de la sangre. Una vez recolectada la muestra de sangre, elevar el talón del recién nacido por

sobre el cuerpo y presionar la zona de punción con una gasa limpia, hasta que deje de sangrar. Colocar una cinta adhesiva, si es necesario.

La toma de muestra de sangre venosa obtenida del dorso de la mano del recién nacido, no es una práctica recomendada. Sin embargo, es aceptable cuando al Recién Nacido se le debe tomar otro examen de sangre, (en ese caso usar una aguja 25/G), si cumple con la edad (horas de vida 48 hs - 5 días).

Calidad de la muestra: Muestra satisfactoria: Se debe asegurar que cada círculo de la tarjeta quede completamente cubierto con

una cantidad uniforme de sangre a fin de que la calidad y confianza de los ensayos no se vea comprometida por problemas en la muestra.

Muestras no satisfactorias: Problemas comunes en la obtención de muestras adecuadas: Los problemas más frecuentes que exigen la toma de una nueva muestra son los

siguientes: a) Volumen insuficiente de sangre: Ocurre cuando hay una cantidad insuficiente de sangre, por lo que no hay material

suficiente para realizar todas las pruebas necesarias. En el caso de la figura, sólo un círculo fue completado con sangre.

b) Falta de sangre: La sangre se deposita sobre el papel en forma de pequeños puntos. Este tipo de

muestras se obtienen cuando el extraccionista no es experimentado, o cuando, por



temor, la punción del talón no fue lo suficientemente profunda, por lo que no fluirá una cantidad suficiente de sangre; o cuando se intentó colectar la sangre muy rápidamente, no permitiéndose entonces la obtención de gotas de sangre de volumen adecuado.

c) Apilamiento o coagulación de sangre: La muestra aparenta tener coágulos o capas sucesivas. Se observan áreas oscuras y

falta de uniformidad dentro de los círculos. Esto indica que el operador ha depositado una gota sobre otra (parcialmente seca).

d) Saturación incompleta de sangre: En este caso una cara de la tarjeta parece aceptable, pero el lado opuesto muestra

que la saturación del papel no ha sido adecuada. El papel no ha sido impregnado completamente de sangre, pudiendo llevar a errores en los resultados de laboratorio. Es necesaria la toma de una segunda muestra.

e) Contaminación: La contaminación de la muestra puede ocurrir durante su obtención,

almacenamiento o transporte al laboratorio. La exposición de la muestra con potenciales agentes interferentes tales como agua, alcohol, soluciones jabonosas, o cualquier líquido, etc. puede inutilizar una muestra para su análisis.

f) Condiciones inapropiadas de secado: El frío excesivo separa las células rojas del suero, mientras que el calor excesivo y

la exposición directa a la luz solar puede “cocinar” la muestra. Todas las muestras deben secarse en posición horizontal a temperaturas no superiores a 30º C, por un mínimo de 4 horas.



g) Separación: Cuando una muestra que no ha secado completamente es puesta prematuramente en

un sobre para su envío al laboratorio, no culmina su secado y ocurre una separación de los glóbulos rojos del suero. En la figura se observa claramente, en la periferia de los círculos, la separación de los glóbulos rojos del suero. Otra posibilidad, es que la muestra aparente estar diluida, desteñida o contaminada. Esto ocurre cuando no se secó el alcohol del área antes de efectuar la punción cutánea, o cuando se apretó excesivamente el área de punción, diluyendo la muestra, diluyendo la muestra con líquidos tisulares. Aquellas muestras con evidencias de separación deben ser repetidas.

h) Muestra húmeda: Ocurre cuando se envió la muestra por correo antes de dejarla secar. Una muestra

de estas características debe ser repetida, debido a que en dichas condiciones de humedad se producen fenómenos degradativos que invalidan su valor analítico.

i) Muestra sobresaturada: Ocurre cuando un exceso de sangre fue aplicado sobre el papel, probablemente con

una jeringa.

j) Muestra desgastada o rayada: Suele ocurrir cuando la sangre fue aplicada desde un tubo capilar, erosionando la

superficie del papel y alterando el material analítico. Precauciones a tomar con la tarjeta y el papel filtro: Se deberá dejar secar cada tarjeta colocándola en posición horizontal (para que la

gota de sangre se distribuya de manera uniforme), y dejándola reposar a temperatura ambiente, al menos por 4 horas, lejos de la luz directa del sol.

Mientras transcurre el secado de las tarjetas, éstas no deben ser apiladas, evitando que una tarjeta toque la otra a fin de prevenir la contaminación cruzada.

Existen gradillas de cartulina ranuradas, conformadas de modo que pueden acomodar las tarjetas durante su secado (ver figura), siendo conveniente utilizar las



mismas o elementos semejantes que permitan el correcto secado y NUNCA se deben secar las tarjetas por medios artificiales (hornos microondas, estufas y otros).

Una vez secas (NUNCA ANTES), colocarlas ordenadamente dentro de una caja destinada a este propósito y almacenar en lugar limpio, alejadas de soluciones antisépticas u otro material que pudiera contaminar o humedecer las tarjetas.

Es conveniente apilarlas rotadas 180º alternadamente entre sí, de modo que la zona de las gotas de sangre no tome contacto directo con la zona correspondiente en la tarjeta inmediatamente superior e inferior.

No se requiere que las tarjetas sean almacenadas en heladera siempre y cuando sean enviadas al laboratorio dentro de los dos días que fueron tomadas siempre y cuando se queden en un lugar seco y fresco sin exposición al calor o la luz solar. Colocarlas en el sobre en que se enviaran.

Si por cualquier motivo se demora el envío, proteger con un plástico herméticamente cerrado y guardar en la heladera hasta el envío. Evitar que se afecte la calidad de la muestra.



Programa de Pesquisa Neonatal en Argentina

Hiperplasia Suprarrenal Congénita La hiperplasia suprarrenal congénita (HSC), también conocida como síndrome

adrenogenital, es una enfermedad causada por el déficit congénito de alguna de las enzimas necesarias para la esteriodogénesis suprarrenal del cortisol. Se hereda en forma autosómica recesiva, con una frecuencia de 1/12.000 nacidos vivos a nivel mundial, mientras que en Argentina (Bs As) la misma es de 1/8937. El déficit de cortisol es la característica común entre ellas, y genera un aumento de la producción de ACTH, con la consecuente hiperestimulación e hipertrofia/hiperplasia de la corteza adrenal, dando lugar a un incremento de los esteriodes previos al bloqueo metabólico. En función del déficit enzimático, se conocen cinco formas clínicas de HSC, cada una de las cuales se manifiesta por los hallazgos clínicos debidos al déficit de un producto final (déficit de cortisol, aldosterona y/o esteriodes androgénicos) y al acúmulo de los precursores (exceso de esteroides con acción mineralocorticoide y/o de esteriodes androgénicos).

La forma más frecuente de HSC es la deficiencia de 21-hidroxilasa (21-OH), la cual presenta como características fundamentales insuficiencia suprarrenal e hiperandrogenismo. Esto deriva de la incapacidad de transformar la 17-hidroxiprogesterona en 11-desoxicortisol (provocando un déficit en la secreción de costisol) y la progesterona en desoxicorticosterona (déficit de secreción de aldosterona), dando lugar a la acumulación de esteriodes androgénicos. La variabilidad clínica de la deficiencia de 21-OH se caracteriza por un espectro muy amplio de síntomas, cuya gravedad depende de la intensidad del déficit enzimático. A su vez, el mismo depende del tipo de mutación presente en el gen CYP21. Se habla entonces de un espectro contínuo de manifestaciones clínicas, que se manifiestan en tres grandes categorías: a) clásicas, que representan las formas más severas, y a su vez se distinguen en la forma con pérdida salina (75%), siendo la de mayor gravedad, y la forma virilizante simple; b) no clásicas, cuyo principal signo clínico es la aparición de hirsutismo en la adolescencia; c) forma asintomática o críptica, que carece de manifestaciones clínicas. Los pacientes del primer grupo pueden parecer normales al nacimiento, pero, entre los 7 y 30 días de vida, desarrollan una crisis salina que puede llevarlos a la muerte si no son diagnosticados y tratados adecuadamente. El exceso de andrógenos que se produce en los pacientes de las tres primeras formas determina que las niñas afectadas presenten al nacimiento genitales ambiguos, con distintos grados de virilización. Si este exceso de andrógenos no es corregido, traerá aparejado en ambos sexos un aceleramiento del crecimiento óseo con cierre temprano de las epífisis y desarrollo de pu-bertad precoz. Debido a que es la 17-alfa-Hidroxiprogesterona (17-OHP) el principal precursor que se acumula en sangre, este es el parámetro bioquímico de elección para la detección de HSC en Programas de Pesquisa Neonatal.

UMELISA 17OH Progesterona NEONATAL: fundamento y consideraciones El UMELISA 17OH Progesterona NEONATAL ha sido concebido para el

pesquisaje de la Hiperplasia Suprarrenal Congénita en recién nacidos. Fundamento del ensayo. El UMELISA 17OH Progesterona NEONATAL es un

ensayo inmunoenzimático competitivo para la determinación cuantitativa de 17OHP en muestras de sangre seca sobre papel de filtro, donde el antígeno natural y el antígeno marcado con una enzima compiten por una cantidad limitada de sitios de unión a los anticuerpos. El ensayo utiliza como fase sólida, placas de ultramicroELISA revestidas



previamente con anticuerpos policlonales anti-17OHP, lo cual garantiza la especificidad del ensayo.

Las muestras, los calibradores y el control en manchas de sangre seca sobre papel de filtro, se eluyen con una solución que contiene el conjugado 17OHP/Fosfatasa Alcalina (F.A.). Este eluato se deposita en los pocillos de las tiras para permitir la formación del complejo anticuerpo-17OHPenzima. La realización de un lavado posterior elimina los componentes no fijados. Al añadir el sustrato fluorigénico (4-Metilumbeliferil fosfato) en los pocillos de las tiras, éste resultará hidrolizado por la enzima del conjugado y la intensidad de la fluorescencia emitida será inversamente proporcional a la concentración de 17OHP presente en la muestra. Los valores calculados de las muestras se interpolan en un gráfico de F/Fo (%) contra la concentración de 17-OHP correspondiente a la Curva de Calibración, obteniéndose los valores de concentración en nmol/L de sangre y ng/mL de suero.

Valor de referencia. Se utiliza un límite de corte de 105.7 nM en sangre entera,

para un recién nacido (RN) a término. Falsos positivos Los RN pretérmino tienen normalmente niveles más elevados de 17-OHP, así

como otros esteroides que interfieren en la medición, aumentando falsamente los niveles de 17-OHP.

En los enfermos críticos también suelen obtenerse niveles elevados de 17-OHP. Por lo tanto si el bebe no tiene signos clínicos que sugieran el diagnóstico de HSC y tiene pesquisa 17-OHP patológica probablemente no se deba a HSC. En estos casos, se sugiere repetir la pesquisa en papel de filtro cada 2 semanas. En pacientes no afectados de HSC, los valores de 17-OH-P, disminuyen a lo largo del tiempo, no así en los pacientes con HSC, en quienes se observa aumento de los mismos. En caso de que el RN requiera ser transfundido, tratar de tomar la muestra previamente o en su defecto, 4 días luego de la transfusión.

Falsos negativos El tratamiento con corticoides a la mama y/o al bebe provoca un descenso de los

esteroides adrenales originando falsos negativos por eso es importante consignar en la tarjeta si recibió tratamiento prenatal y/o postnatal con corticoides.



Fibrosis Quística

La fibrosis quística (FQ) o mucoviscidosis se caracteriza por enfermedad pulmonar crónica, insuficiencia pancreática exócrina e incremento de electrolitos en el sudor. Es una de las enfermedades genéticas mortales más frecuentes en la raza caucásica, con una incidencia estimada entre 1 por cada 2,500 a 3,500 recién nacidos vivos. Es una enfermedad de transmisión autosómica recesiva; se calcula que 1 de cada 25 personas es portadora del gen defectuoso de la FQ. Es una enfermedad que ataca las células epiteliales exocrinas, las personas afectadas producen un moco espeso y viscoso, que provoca una obstrucción de los conductos de los órganos donde se localiza, siendo el páncreas y los pulmones los órganos más comprometidos, aunque se trata de una entidad multisistémica. De hecho, la enfermedad pulmonar y la insuficiencia pancreática determinan de una forma esencial la evolución, gravedad y mortalidad en la FQ. Actualmente se sabe que el canal afectado en la FQ es el CFTR, cuyo gen pertenece a la superfamilia de genes ABC. Hasta el momento más de 1.600 variaciones de secuencia han sido identificadas en el gen, y la lista se encuentra continuamente actualizada en una base de datos.

En los últimos años la pesquisa neonatal de FQ experimentó un cambio muy significativo, motivado por las evidencias disponibles acerca de los beneficios resultantes, especialmente sobre el estado nutricional y el crecimiento de los individuos afectados, vinculados con el acceso a un diagnóstico precoz e implementación inmediata de un tratamiento apropiado. Así, la identificación de pacientes con FQ a través de programas de Pesquisa Neonatal, cuando se acompañan de un tratamiento precoz, logra limitar el daño pulmonar en niños, reduce el peso del cuidado y el estrés de la familia y mejora la sobrevida. La detección precoz produce efectos beneficiosos en el estado nutricional, mejorando el aumento de peso y de talla y permite prevenir la deficiencia de vitaminas liposolubles y la malnutrición proteica. El cribado neonatal para FQ se lleva a cabo mediante la determinación de Tripsina Inmunoreactiva (TIR). Esta se encuentra elevada en el RN debido a la obstrucción de los conductos pancreáticos exocrinos, que provoca un reflujo de la tripsina a la sangre. Las cifras se mantienen altas al cabo de los primeros 28 días de vida en los pacientes afectados por la enfermedad. Los valores de TIR se normalizan cuando se produce la destrucción de los acinos pancreáticos, habitualmente hacia los 6 meses de edad.



IRT ELISA para screening neonatal: fundamento y consideraciones Inmunoensayos enzimáticos para la determinación cuantitativa de tripsina

inmunoreactiva (TIR) en manchas de sangre humano del recién nacido, para el cribado neonatal de la FQ.

Fundamento del ensayo. La prueba ELISA de detección precoz de TIR neonatal es un inmunoensayo enzimático de fase sólida de tipo “sándwich”, basado en dos anticuerpos monoclonales biotinilados específicos de la tripsina 1 y la tripsina 2 y un anticuerpo policlonal específico de la tripsina, que está inmovilizado en la superficie interna de los pocillos. Las moléculas de tripsina de la muestra se unen al anticuerpo inmovilizado y a los conjugados anti-tripsina-biotina. La intensidad de color que se adquiere tras la incubación del substrato será proporcional a la cantidad de antígeno de la muestra. Los resultados de las muestras se pueden determinar directamente mediante una curva estándar. El valor de corte que establece la positividad de esta prueba es > 70 ng/ml.

Limitaciones del procedimiento. La toma y almacenamiento de las muestras tiene

un efecto importante en los resultados. Cualquier resultado con una concentración elevada debe ser indicado como “presunto positivo” y debe ser confirmado con tomas y ensayos posteriores. Un falso negativo en este ensayo no puede ser excluído con total certeza. Pueden observarse reusulados falsos negativos en pacientes con Ileo meconial, mientras que resultados falsos positivos pueden surgir a partir decuadros de obstruccion intestinal, agenesia de conductos pancreáticos e hipoxia y mala perfusion del páncreas.

La medida aislada de TIR no ofrece grandes ventajas puesto que presenta una muy baja especificidad y valor predictivo positivo. Por esta razón, se han diseñado diferentes estrategias para la confirmación de los casos positivos de TIR, que asocian la medida de TIR a otro marcador como puede ser la misma TIR en una segunda muestra, ADN, test del sudor o Proteína Asociada a Pancreatitis (PAP) dando lugar así a diversas alternativas que difieren en su sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, tasa de recitación, aplicabilidad, complejidad operativa y costos.



Fenilcetonuria La Fenilcetonuria (PKU) es una enfermedad congénita del metabolismo de la

Fenilalanina, capaz de causar retraso mental irreversible en ausencia de tratamiento.Es una enfermedad genética, que se transmite de modo autosómico recesivo, estimándose que su incidencia en individuos caucásicos varía entre 1/4000 y 1/14000 recién nacidos. Hay dos tipos principales de PKU: la fenilcetonuria clásica, se produce por deficiencia de la enzima fenilalanina hidroxilasa, siendo la más frecuente; y la fenilcetonuria no clásica, en la que hay deficiencia del cofactor BH4. Existen rutas alternativas para el metabolismo de fenilalanina, que en los pacientes con PKU cobran gran importancia. La más conocida es la transaminación con α-cetoglutarato, produciendo ácido fenilpirúvico y otros compuestos (ácido fenilláctico, ácido fenilacético y fenilcetilglutamina). Estos productos se acumulan en sangre y aparecen en la transpiración y la orina. El ácido fenilacético es el responsable del olor característico a ratón que se percibe en la orina y la transpiración de estos pacientes.

En esta enfermedad, el cerebro es el órgano críticamente afectado. La fenilcetonuria produce retardo mental profundo si no es diagnosticada y tratada desde el período neonatal. Los síntomas iniciales aparecen en los primeros meses de vida con falta de interés por el medio, convulsiones, eccema rebelde al tratamiento y olor a humedad. Alrededor de los 6 meses se hace evidente la presencia de retraso en el desarrollo. En el niño mayor aparecen, además, graves trastornos de conducta como agresividad, hiperactividad, rabietas y actitudes autistas. Desde el inicio del diagnóstico neonatal, la restricción de Fenilalanina en la dieta se utiliza como el tratamiento clásico en PKU, previniéndose con ello las secuelas neurológicas que esta patología ocasiona.

Existen diversos métodos para la determinación de fenilalanina en el período neonatal utilizando tarjeta de papel filtro, con diferencias en sensibilidad, especificidad y costo. Técnicas bacterianas, fluorométricas, colorimétricas, enzimáticos u otras. Los métodos fluorométricos son usados en un gran número de laboratorios en el mundo.

UMTEST PKU

El UMTEST PKU es un ultramicroensayo fluorescente para la cuantificación de

Phe en sangre seca sobre papel de filtro de recién nacidos a partir de las 48 ó 72 horas de edad, obtenida del talón.



Fundamento. La prueba se basa en la reacción de la Phe presente en la muestra con la Ninhidrina, en condiciones óptimas de pH y temperatura, formando un complejo poco fluorescente. Con la adición de iones cobre, se produce la amplificación de la fluorescencia, aumentando su intensidad por la previa adición de L-Leucil-L-Alanina a la mezcla de reacción. La intensidad de la fluorescencia emitida es proporcional a la concentración de Phe presente en la mezcla. Los valores de fluorescencia de las muestras de concentración desconocida se interpolan en un gráfico de fluorescencia contra el logaritmo de la concentración de Phe correspondiente a la Curva de Calibración, obteniéndose los resultados en µmol de Phe/L de sangre total y en mg de Phe/dL de sangre total. Generalmente se acepta como valor límite 120 µmol de Phe/L o 2 mg/dl de sangre total.

Falsos positivos Muestra de sangre en papel filtro con doble gota; muestra contaminada con

soluciones alimentarias u otros que contengan proteínas; recién nacido patológico o prematuro alimentados con fórmulas hiperproteicas; muestra de sangre recogida en capilar y luego colocada en tarjeta papel filtro.

Falsos negativos Muestra de sangre en papel filtro insuficiente; muestra de sangre mal clasificada en

procesamiento; datos del recién nacido falsos, imposibilidad en su pesquisa; muestra de sangre en papel filtro de recién nacido con tratamiento de antibióticos; muuestra extraída precozmente.



Galactosemia Los errores congénitos en el metabolismo de la galactosa se transmiten como un

carácter autosómico recesivo y se caracterizan por altos niveles sanguíneos de galactosa y sus metabolitos, los cuales son tóxicos para el organismo. Existen tres enzimas que participan en el metabolismo de la galactosa: Galactoquinasa (GALK), Galactosa-1-fosfato Uridil Transferasa (GALT) y UDP-Galactosa 4-Epimerasa (GALE). La deficiencia en GALK impide la transformación de la galactosa a galactosa-1-fosfato, acumulándose galactitol, que es el metabolito causante de la formación de cataratas. La deficiencia en GALT es la causa de la galactosemia clásica, siendo esta la enfermedad más común y la más grave (con una incidencia de entre 1:40.000 a 1:60.000 recién nacidos vivos), que se caracteriza por una acumulación de galactosa-1-fosfato y galactitol. En la deficiencia de GALE, la sintomatología es muy variable, el paciente puede ser asintomático o presentar un cuadro similar a la galactosemia clásica.

La acumulación de galactosa-1-fosfato afecta particularmente el hígado y el cerebro. En todos los niños afectados se presentan signos y síntomas clínicos durante los primeros días de vida, tales como, vómito, rechazo alimentario, diarrea, perdida de peso, letargo, irritabilidad, convulsiones, hepatomegalia, ictericia y cataratas después de comenzar la alimentación con leche (lactosa), en los primeros días de vida. Si no se trata, la enfermedad avanza a la insuficiencia hepática y a la muerte. Las complicaciones tardías, como la insuficiencia ovárica y el deterioro en el desarrollo del lenguaje y del habla, pueden aparecer a pesar del buen cumplimiento del tratamiento.

El tratamiento consiste en excluir la galactosa de la dieta durante toda la vida. Su principal fuente en la dieta procede de la lactosa (galactosa + glucosa) en las leches y sus derivados. No pueden utilizarse preparados comerciales que sean derivados de la leche de vaca como son las leches rotuladas como “sin lactosa” y deben administrarse “fórmulas” de proteína de soja (tampoco productos de soja naturales en los que no está aislada la proteína porque pueden contener galactosa). Las fórmulas para lactantes están suplementadas con calcio, vitaminas y minerales. Algunos otros productos naturales contienen galactosa, tales como las legumbres y las vísceras y por lo tanto deben



evitarse. En general, debe evitarse el uso de productos alimenticios comerciales, ya que muchos contienen lactosa.

UMTEST GAL: fundamento y consideraciones

El UMTEST GAL ha sido concebido para la cuantificación de galactosa total

(galactosa y galactosa-1-fosfato) en muestras de sangre de recién nacidos colectadas en papel de filtro.

Fundamento del ensayo. El UMTEST GAL es un ensayo enzimático que mide la concentración de galactosa total presente en la muestra, a través de la fluorescencia emitida por el nicotinamida-adenín-dinucleótido en su forma reducida (NADH + H producto de la acción de la enzima β-galactosa deshidrogenasa. La adición de Fosfatasa Alcalina, permite la transformación de la galactosa-1-fosfato a galactosa. Ambas reacciones enzimáticas ocurren en condiciones óptimas de pH y temperatura. La intensidad de la fluorescencia emitida por el NADH + H es directamente proporcional a la concentración de galactosa total presente en la muestra.

Los valores de fluorescencia de los calibradores, el control del ensayo y las muestras de concentración desconocida se interpolan de forma lineal en un gráfico de fluorescencia contra la concentración de galactosa correspondiente a los calibradores de la curva. Los resultados se obtienen en mmol/L y en mg/dL de galactosa en sangre total.

Generalmente se acepta como nivel de corte de referencia 0,56 mmol/L (10

mg/dL) de galactosa total en sangre. Las muestras que presentan una concentración superior son consideradas como elevadas.

Para la determinación de galactosemia, el niño debe estar recibiendo alimentación láctea (materna o artificial), durante por lo menos 24 horas al momento del examen.

Falsos positivos Muestra expuesta al calor o humedad. Falsos negativos Transfusiones.



Hipotiroidismo Congénito Primario El Hipotiroidismo Congénito Primario es un desorden de la función tiroidea,

caracterizado por una producción reducida de hormonas tiroideas (T3 y T4), que consecuentemente genera niveles circulantes deficientes de las mismas. Las causas pueden ser agenesia, ectopia o hipoplasia tiroidea (85 a 90%) o dishormonogénesis. Se presenta con una frecuencia aproximada de entre 1:2.500 a 1:3.000 recién nacidos vivos. Dicha deficiencia en el período neonatal, es responsable de un importante retraso en el crecimiento y en el desarrollo mental.

Los pacientes que no se detectan y tratan precozmente en los primeros días de vida presentan un cuadro llamado cretinismo, caracterizado por retardo mental, grados variables de retardo de crecimiento, alteraciones neurológicas así como los síntomas clásicos de hipometabolismo del hipotiroidismo (llanto ronco, macroglosia, ojos abotagados, labios gruesos, piel seca y fría, bradicardia, hipotermia, letargo, ictericia prolongada, hernia umbilical y distensión abdominal, etc.).

El desarrollo de Hipotiroidismo Congénito puede evitarse sólo si el tratamiento substitutivo comienza en los primeros momentos de la vida, por lo cual el diagnóstico precoz constituye la clave para el tratamiento exitoso de la enfermedad. El marcador más sensible para el hipotiroidismo primario es la elevación de TSH en sangre.

El objetivo del tratamiento es alcanzar rápidamente valores normales de TSH y de T4, y mantenerlos dentro de los valores de referencia para la edad. La administración de Levotiroxina debe iniciarse idealmente a los 15 días de vida.

UMELISA TSH NEONATAL: fundamento y consideraciones

El UMELISA TSH NEONATAL ha sido concebido para el pesquisaje de

Hipotiroidismo Congénito en recién nacidos mediante la medición de TSH en muestras de sangre de recién nacidos colectadas en papel de filtro.

Fundamento del ensayo. La Hormona Estimulante de la Tiroides (TSH) es una hormona glicoproteica con un peso molecular de 28.000 Daltons. Está compuesta por dos cadenas polipeptídicas que se han denominado α y β. La cadena α muestra una gran similitud con las de las otras hormonas de estructura similar (FSH, HCG, LH) mientras que la cadena β confiere a la hormona su especificidad inmunológica y funcional.



El UMELISA TSH NEONATAL es un ensayo heterogéneo inmunoenzimático tipo sandwich, en el cual se utiliza como fase sólida, placas de tiras con pocillos revestidos previamente con anticuerpos monoclonales anti-cadena β de la TSH, lo cual garantiza la especificidad del ensayo.

Las muestras, los calibradores y el control en manchas de sangre seca se eluyen con un conjugado anti-TSH Humana (Carnero)/Fosfatasa Alcalina (F.A.). Este eluato se deposita en los pocillos de las tiras, permitiendo la formación del complejo anticuerpo/TSH/anticuerpo-enzima. La realización de un lavado posterior elimina los componentes no fijados. Al añadir un sustrato fluorigénico (4-Metilumbeliferil fosfato) en los pocillos de las tiras, éste resultará hidrolizado por la enzima del conjugado y la intensidad de la fluorescencia emitida será proporcional a la concentración de TSH presente en la muestra.

Los valores de fluorescencia de las muestras de concentración desconocida se interpolan en un gráfico de fluorescencia contra el logaritmo de la concentración de TSH correspondiente a la curva de calibración, obteniéndose los valores de concentración en mUI/L de sangre total.

Debido a las variaciones que experimentan los niveles de TSH en los primeros días de vida, se considera < 12 µUl/ml (10 µUI/ml sangre), como límite de normalidad, desde las 40 hs de vida del recién nacido. Las muestras que presentan una concentración igual o superior son consideradas como elevados.

Falsos positivos Muestra tomada precozmente (antes de las 40 horas de vida), exposición materna a

medicación con hormona antitiroidea, exposición del niño o la madre a yodo tópico (Tintura de yodo, povidona yodada)

Falsos negativos Recién nacidos pre-término (< 35 semanas), déficit de globulina ligadora de T4,

hipotiroidismo secundario o terciario, error de laboratorio.



Deficiencia de Biotinidasa La deficiencia de biotinidasa es un trastorno metabólico autosómico recesivo,

caracterizado por la deficiencia o ausencia de la enzima biotinidasa (biotina-amida amidohidrolasa), lo que provoca alteraciones en el metabolismo de la biotina (perteneciente al grupo de las vitaminas hidrosolubles del complejo B). Dicha enzima se encarga del reciclaje de la biotina, a partir de biocitina o pequeños péptidos biotinilados y de la liberación de la vitamina unida a proteínas de la dieta. De esta manera, la ausencia de la biotinidasa resulta en el déficit de biotina y la deficiencia múltiple de carboxilasas (propionil-CoA carboxilasa, 3-metil-crotonil-CoA carboxilasa, piruvato carboxilasa y acetil-CoA carboxilasa). Las carboxilasas, con importante participación en el metabolismo intermedio de grasas, carbohidratos y proteínas, son apoenzimas inactivas que deben ligarse a la biotina (como cofactor) para ser holoenzimas activas. La falta de actividad de las carboxilasas mitocondriales se traduce en un cuadro clínico caracterizado principalmente por síntomas neurológicos y alteraciones cutáneas. Esta enfermedad se presenta con una incidencia aproximada de entre 1:45.000 a 1:60.000 recién nacidos vivos, siendo el cuadro clínico y el tiempo de presentación de los síntomas muy variable.

Dentro de la sintomatología inicial suelen estar presentes las manifestaciones relacionadas con el sistema nervioso, siendo las más frecuentes la hipotonía muscular, la ataxia y el retraso en el desarrollo psicomotor. También se pueden presentar problemas respiratorios, como la taquipnea, causada por la severa acidosis metabólica, y apneas. Las manifestaciones cutáneas son muy frecuentes, e incluyen alopecía y la piel, que es muy fina, presenta enrojecimiento y descamación. Dentro de las manifestaciones bioquímicas más frecuentes se incluyen la acidosis cetoláctica y la aciduria orgánica (ácido láctico, 3OH isovalérico, metilcrotonilglicina, metilcítrico etc). Los sintomas en el recién nacido son tan inespecíficos que sino se realiza la pesquisa neonatal puede que la enfermedad no sea sospechada. En ausencia de tratamiento, el inicio de los síntomas se da dentro del primer trimestre de vida o puede retrasarse hasta los 2 años, dependiendo de la cantidad de biotina que el niño reciba en su alimentación.

El tratamiento consiste en administrar biotina por vía oral de por vida. El comienzo provisorio de la adición de un suplemento de biotina no interfiere con el dosaje de la enzima para confirmar el diagnóstico. La alimentación es la normal para cada edad.



UMTEST BIOTINIDASA: fundamento y consideraciones El UMTEST BIOTINIDASA ha sido concebido para la detección de la actividad

de la enzima biotinidasa en muestras de sangre de recién nacidos, colectadas en papel de filtro.

Fundamento del ensayo. El UMTEST BIOTINIDASA es un ultramicroensayo colorimétrico cualitativo para la detección de la deficiencia de biotinidasa en sangre seca sobre papel de filtro. El ensayo tiene como fundamento la medición de la actividad hidrolítica de la enzima biotinidasa, mediante la hidrólisis del sustrato biotin-ácido ρ-aminobenzoico (BPABA) en condiciones óptimas de pH y temperatura, obteniéndose como producto el ácido ρ-aminobenzoico (PABA). Este último, en medio ácido y en presencia de nitrito de sodio y sulfamato de amonio forma un complejo de color púrpura con la vitamina K6.

La intensidad del color obtenido es proporcional a la actividad de la enzima biotinidasa presente en la muestra.

Falsos positivos Exposicion al calor o humedad, recién nacido pre-termino e interferencia con

fármacos, como el cotrimoxazol (familia de las sulfonamidas) y la procaína/benzilpenicilina que interfieren con el ensayo, aumentando la señal de color. En aquellas muestras en las que se obtenga una señal de color muy intensa debe sospecharse la posible interferencia de fármacos.



Bibliografía: -UMELISA 17OH Progesterona NEONATAL -IRT ELISA para screening neonatal -UMTEST PKU -UMTEST GAL -UMELISA TSH NEONATAL - UMTEST BIOTINIDASA Guía de diagnóstico y tratamiento de pacientes con fibrosis quística. Actualización.

Consenso de la Sociedad Argentina de Pediatría, 2014. Ortigoza L (2007). Fibrosis quística. Aspectos diagnósticos. Colombia Médica,

Vol. 38 Nº 1 (Supl 1). Calderón López GM, Jiménez Parrilla F, Losada Martínez A (2008). Protocolos

Diagnóstico Terapeúticos de la Asociación Española de Pediatría: Neonatología. - Dr. Pablo Christian Barvosa. Pesquisa Neonatal. Congreso Nacional de Pediatría

2015 Mendoza. - Manual de Procedimiento. Pesquisa endócrinometabólica. Programa Nacional de

Fortalecimiento de la Detección Precoz de Enfermedades Congénitas. Ministerio de Salud. Presidencia de la Nación. Agosto de 2011. Argentina.



TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: DETERMINACIÓN DE FENILALANINA EN MUESTRAS DE SANGRE DE NEONATOS

Se realizará la determinación cuantitativa de fenilalanina en manchas de sangre

neonatal, como una pesquisa o screening de neonatos para detectar niveles elevados de fenilalanina. Se utilizará el kit ImmuChem Phenyalanine Microwell Enzyme Assay (PHE-MW EA). Las gotas de sangre obtenidas por punción del talón del recién nacido, son recogidas en un papel de filtro Schleicher and Schuell (S&S) N° 903. Se recomienda que se recoja en un círculo de un diámetro de 16 mm.

Principio del Test: El kit de FENILALANINANILALANINE NEONATAL mw ha sido desarrollado

para screening de neonatos con elevados niveles de fenilalanina. El ImmuChem™ PHE-MW EA es un ensayo enzimático el cual consiste en una extracción ácida de la fenilalanina, contenida en una mancha de sangre de 5 mm. Una única mancha es extraída en el fondo de una placa con membrana semiporosa especial. Luego de la extracción, los 96 extractos son transferidos a una micro-placa convencional, por medio de una bomba de vacío. Luego se añade un buffer neutralizador (Buffer de carbonato de sodio), seguido de la adición de reactivo que contiene la enzima. Esto rápidamente oxida la fenilalanina a fenilpiruvato, reduce NAD+ a NADH. El NADH reduce un producto incoloro a un producto final coloreado que tiene una absorción máxima a 570 nm (figura 2). La absorbancia leída es directamente proporcional a la cantidad de fenilalanina en la muestra.

Componentes del kit y almacenamiento: 1. Placas de reacción. Conservar a temperatura ambiente o entre 2 y 8 ºC. 2. Tarjeta conteniendo 5 niveles de Estándares de FENILALANINA/GAL en

manchas de sangre entera (mg/dl). Conservar a –20 ºC. 3. Tarjeta conteniendo 3 niveles de controles de FENILALANINA/GAL en

manchas de sangre. Conservar a –20 ºC. 4. Solución de extracción Ácido tricloroacético (TCA). Almacenar entre 2 y 8 ºC. 5. Solución de neutralización. Conservar entre 2 y 8 ºC. 6. Reactivos A y B. Almacenar a –20 ºC.



Figura 2. Esquema de la reacción producida durante el ensayo de determinación de

fenilalanina en manchas de sangre Toma de muestra: Se sugiere trabajar con una muestra de una mancha de sangre recogida sobre un

papel de filtro Schleicher y Schuell #903, obtenida por adhesión al talón. a) Asegúrese que la información requerida en la tarjeta de muestra ha sido

completada, incluyendo el nombre del infante, fecha y hora de recolección. También indique pre, o post-término, el peso del neonato y el estado de la alimentación, y si el infante es o no gemelo.

b) Recoja la sangre del talón del infante, usualmente entre las 24-72 hs post-parto. El tiempo óptimo de toma de muestra es de tres a cinco días post-parto.

c) Lave el talón con agua y jabón, limpie con una gasa embebida en alcohol y permita secar al aire.

d) Pinche el talón del infante con una lanceta estéril y limpie eliminando la primera gota de sangre. Permita la formación de otra gota de sangre de un volumen adecuado y deje caer la misma en la porción central del círculo preimpreso en la tarjeta de papel de filtro. Evite presionar el talón, pues esto puede causar hemólisis, y también diluir la muestra con fluido tisular.

e) Ubique la tarjeta de papel de filtro horizontalmente sobre una superficie limpia y permita secar al aire, como mínimo durante 3 horas.

f) La muestra debe conservarse entre 2 y 8 ºC en un ambiente desprovisto de humedad, protegido de la luz directa. En caso de conservaciones por largo tiempo, realizarlas a –20 ºC, en ambiente desprovisto de humedad.



Protocolo de ensayo: 1- Para los estándares, controles y muestras: Corte con sacabocados una mancha de

sangre. En el caso de las muestras, elegir aquellas manchas que hayan impregnado la tarjeta también hasta la parte posterior. Pueden realizarse algunos estándares y controles por duplicado, como prueba de reproducibilidad.

2- Añada 100 µl de solución de extracción de fenilalanina (TCA) a cada pocillo. 3- Coloque la placa en un agitador durante 60 minutos. 4- Tome 90 μl de cada extracto y transfieralo al pocillo correspondiente de una

nueva placa. 5- Añada 50 µl de solución de neutralización a cada pocillo y agite suavemente

durante 10 segundos. 6- Coloque 100 µl de reactivo A-B (previamente combinados, en partes iguales), a

cada pocillo y agite la placa suavemente durante 10 segundos. 7- Incube 45 minutos a temperatura ambiente. 8- Lea en espectrofotómetro a 550 – 570 nm. El producto final es estable durante 10

minutos, por lo que la lectura deberá efectuarse dentro de este lapso de tiempo. 9- Cálculo de resultados: Realice una gráfica de absorbancia vs. concentración,

con los valores obtenidos de los estándares, para así extrapolar los datos de las muestras. Lea las muestras de los pacientes directamente de la curva como mg/dl de fenilalanina en sangre entera.

Valores de referencia: Neonatos (24-48 hs): 0.6 – 3.6 mg/dl de fenilalanina en sangre entera. Cut off: Valores inferiores a 2.8 mg/dl se consideran como valor negativo. Aquellas

concentraciones comprendidas entre 2.8 y 3.6 mg/dl son valores dudosos que deberán ser confirmados en suero.

Factores que afectan los valores normales: a) Recién nacidos: en pacientes afectados por PKU, las concentraciones de

fenilalanina comienzan a aumentar progresivamente en las primeras 6-12 horas después del nacimiento. Para identificar claramente los niveles elevados de fenilalanina es recomendable que el muestreo se efectúe después de las 24 horas del nacimiento.

b) Período de validez de la muestra: las muestras de manchas de sangre son estables por más de 6 meses bajo condiciones apropiadas de conservación. Una vez recogida la muestra debe ser secada completamente.

c) Dieta del recién nacido: Una dieta conteniendo proteína, tal como leche de pecho o leche sintética, es requerida para la acumulación de fenilalanina y subsecuente identificación de PKU en neonatos.

Limitaciones del procedimiento: � Variaciones demográficas, peso del neonato, edad, prematurez y gemelos,

puede afectar las concentraciones de fenilalanina. El laboratorio deberá estar enterado de todos estos factores.

� Los principales factores interferentes en la determinación son la tetraciclina y el ácido ascórbico, los cuales producen un aumento de la lectura.

� Hay factores que modifican el valor de fenilalanina, como ser: hematocrito, humedad del papel. Por ello se sugiere la recolección uniforme de las muestras

TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: PESQUISA NEONATAL · 7) Contar con un sistema adecuado de recolección,...

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