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TOP2A IQFISH pharmDx Referência K5733

3ª edição

Para utilização em diagnóstico in vitro

O kit contém reagentes suficientes para 20 testes.

101752-001 / 20-01-03

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Índice Página

Finalidade ............................................................................................................. 3 Resumo e explicação ........................................................................................... 3 Princípio do procedimento .................................................................................... 4 Reagentes ............................................................................................................ 4

Materiais fornecidos ......................................................................................... 4 Materiais necessários, mas não fornecidos...................................................... 5

Precauções ........................................................................................................... 6 Conservação ........................................................................................................ 9 Preparação das amostras..................................................................................... 9

Secções impregnadas em parafina .................................................................. 9 INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO ........................................................................ 10 A. Preparação dos reagentes ............................................................................. 10

A.1 Solução de pré-tratamento ................................................................. 10 A.2 Tampão de lavagem adstringente ...................................................... 10 A.3 Tampão de lavagem ........................................................................... 10 A.4 Série de etanol .................................................................................... 10 A.5 Solução de pepsina ............................................................................ 10

B. Procedimento de coloração ............................................................................ 11 B.1 Notas do procedimento ....................................................................... 11 B.2 Tratamento dos tecidos antes da coloração ....................................... 11 B.3 Protocolo de coloração ....................................................................... 12

Controlo de qualidade ........................................................................................ 15 Interpretação da coloração ................................................................................. 15 Limitações .......................................................................................................... 17

Limitações gerais ........................................................................................... 17 Características de desempenho ......................................................................... 17

Sensibilidade analítica .................................................................................... 17 Especificidade analítica .................................................................................. 17 Estudos de robustez ....................................................................................... 18 Repetibilidade ................................................................................................. 19 Reprodutibilidade ........................................................................................... 19 Utilidade clínica .............................................................................................. 20 Estudo piloto ................................................................................................... 20 Estudo de confirmação - DBCG 89D/TOP2A ................................................. 20 Concepção do estudo .................................................................................... 20 Metodologia estatística ................................................................................... 21 Resultados ..................................................................................................... 22 Discussão e conclusão ................................................................................... 29

Resolução de problemas .................................................................................... 30 Apêndice 1 .......................................................................................................... 32 Apêndice 2 .......................................................................................................... 33 Apêndice 3 .......................................................................................................... 34 Bibliografia .......................................................................................................... 35 Explicação dos símbolos .................................................................................... 38

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Finalidade Para utilização em diagnóstico in vitro. O TOP2A IQFISH pharmDx foi concebido para a detecção de amplificações e eliminações (alterações no número de cópias) do gene TOP2A utilizando a técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) em amostras de tecido de cancro da mama humano fixado em formol e impregnado em parafina. As eliminações e amplificações do gene TOP2A servem de marcador para um mau prognóstico em doentes com cancro da mama de elevado risco. A amplificação do gene TOP2A detectada pelo ensaio TOP2A IQFISH pharmDx está adicionalmente indicada como auxiliar na previsão de sobrevivência sem recorrência em doentes com cancro da mama de elevado risco tratados com quimioterapia adjuvante baseada em epirrubicina.

Os resultados do ensaio TOP2A IQFISH pharmDx destinam-se a ser utilizados como complemento das informações clínicas e patológicas existentes.

Resumo e explicação O gene TOP2A codifica-se para a enzima topoisomerase IIα (topo IIα), que catalisa a separação e reunião de ADN de cadeia dupla, originando o relaxamento dos sobre-enrolamentos de ADN. As topoisomerases de tipo II são enzimas essenciais, que inter-convertem formas topológicas de ADN ao criar quebras transitórias na cadeia dupla da estrutura base do ADN (1). Estas enzimas desempenham papéis importantes numa série de processos nucleares fundamentais, (2) incluindo a repetição, transcrição, estrutura cromossómica, condensação e segregação do ADN (3). O gene topoisomerase IIα, TOP2A, está presente em 2 cópias em todas as células diplóides normais e localiza-se no cromossoma 17q21 (4). O gene TOP2A cobre uma área de aproximadamente 27,5 kb e contém 35 exões que codificam uma proteína 170 kDa (5).

A proteína topo IIα foi reconhecida como um marcador de proliferação e a expressão da topo IIα varia durante o ciclo celular, tanto em células normais como cancerígenas (6). A expressão da topo IIα em tumores da mama está correlacionada com a expressão da Ki-67 (7-10). Não foi detectada qualquer relação simples para a topo IIα ao nível da proteína e do gene (7, 9, 10). Apenas 20% dos casos de sobrexpressão da proteína topo IIα apresentam uma amplificação do gene TOP2A, no entanto, entre os casos de amplificação do gene TOP2A, 93% apresentaram uma sobrexpressão da proteína topo IIα (11). A sobrexpressão da topo IIα parece compor-se por vários factores contributivos, a amplificação específica do cancro e a taxa de proliferação celular elevada. As proteínas Ki-67 e topo IIα são expressas paralelamente, o que pode ser interpretado como uma confirmação da influência da taxa de proliferação celular na expressão da topo IIα, mesmo nos casos com amplificação do TOP2A (12). As topoisomerases de tipo II são alvos para antraciclinas como a doxorrubicina e a epirrubicina, também designadas por inibidores da topoisomerase (13-15). O estado da HER2 como marcador preditivo das antraciclinas é uma questão controversa, tendo sido apontada a ausência de fundamento biológico para esta ligação. Além disso, discutiu-se se a HER2 deve ser vista como um marcador substituto ou “pseudo-marcador” para o verdadeiro alvo da antraciclina, a topoisomerase II (16-18). Demonstrou-se que o número de cópias do TOP2A influencia a sensibilidade do tumor aos inibidores da topoisomerase (16-28). O desempenho clínico do kit TOP2A FISH pharmDx da Dako foi investigado em dois estudos realizados pelo Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) em Copenhaga (21, 29, 30). O estudo mais recente (21, 30) relata a amplificação do gene TOP2A em aproximadamente 10% dos cancros da mama e eliminações com uma frequência idêntica quando são incluídos nos estudos tanto tumores HER2 positivos como negativos. Inicialmente, partiu-se do princípio de que os

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números anormais de cópias do gene TOP2A, como resultado da amplificação ou eliminação, se limitavam a tumores com amplificação do HER2 (16, 31). Mais recentemente, foram detectadas alterações no número de cópias do gene TOP2A em amostras de tumores com um estado do gene HER2 normal (21, 23, 29, 30, 32, 33). No estudo do DBCG, foram detectadas alterações no TOP2A em quase 60% dos tumores primários da mama com amplificação do HER2, enquanto 20% dos tumores com TOP2A anormal apresentaram um estado do HER2 normal (21, 23, 29, 30, 32). O estudo foi confirmado por um estudo canadiano que demonstra que o estado do gene TOP2A (amplificação ou eliminação) é um factor preditivo significativo do benefício do tratamento com quimioterapia baseada em epirrubicina (23). Aproximadamente 35% dos doentes participantes neste estudo apresentaram tumores com amplificação do HER2, tendo sido detectada uma associação estatisticamente significativa entre o estado HER2 e as aberrações do TOP2A (23, 34).

A vasta maioria dos estudos sobre aberrações do gene TOP2A tem sido consistente relativamente ao valor preditivo dos testes com TOP2A (21-25, 30), o que contrasta com os resultados mais divergentes dos testes com HER2 (35). Embora os genes HER2 e TOP2A se localizem no mesmo amplicon e alguns estudos se tenham concentrado na co-amplificação dos genes (22, 24, 25), o DBCG 89D e outros estudos demonstraram que os genes devem ser encarados independentemente e testados separadamente (10, 20, 21, 26-30).

Princípio do procedimento O TOP2AIQFISH pharmDx contém todos os reagentes essenciais necessários para executar um procedimento FISH para secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina processadas rotineiramente.

Após a desparafinação e reidratação, as amostras são aquecidas em Solução de pré-tratamento, seguida de digestão proteolítica utilizando Pepsina. Após as etapas de aquecimento e pré-tratamento proteolítico, este kit emprega uma Mistura de sondas FISH não tóxica e pronta a utilizar baseada numa combinação das tecnologias de APN (ácido péptido nucleico) (36) e ADN. Esta Mistura de sondas consiste numa mistura de clones cosmídeos de ADN marcados com Texas Red, cobrindo uma região total de 228 kb do amplicon de TOP2A, e uma mistura de sondas de APN marcadas com fluoresceína, dirigidas à região centromérica do cromossoma 17. A hibridização específica dos dois alvos resulta na formação de um sinal fluorescente vermelho distinto em cada amplicon de TOP2A e um sinal fluorescente verde distinto em cada região centromérica do cromossoma 17. Após uma lavagem adstringente, as amostras são montadas com meio de montagem de fluorescência contendo DAPI e cobertas com uma lamela. Os resultados são interpretados utilizando um microscópio de fluorescência equipado com filtros adequados (consultar o Apêndice 3). As células cancerígenas são localizadas e avaliadas relativamente à razão de sinais de TOP2A/CEN-17. As células normais contidas na secção de tecido analisado servirão como controlo positivo interno de eficiência de pré-tratamento e hibridização. Para obter mais informações, consultar a secção de Interpretação da coloração.

O TOP2A IQFISH pharmDx, referência K5733, é aplicável para coloração manual.

Reagentes Materiais fornecidos Os materiais abaixo indicados são suficientes para 20 testes (define-se um teste como uma área alvo de 22 mm x 22 mm). O número de testes baseia-se na utilização de 250 µL por lâmina de Frasco 2A (5–8 gotas), 10 µL por lâmina de Frasco 3 e 15 µL por lâmina de Frasco 5. As soluções no Frasco 3 e no Frasco 5 são viscosas e poderão ter de ser centrifugadas por breves momentos numa microcentrífuga para reunir todo o reagente fornecido. O kit fornece materiais suficientes para 10 processos de coloração individuais (quatro processos separados quando se utiliza o método de imersão em pepsina). O TOP2A IQFISH pharmDx é expedido em gelo seco. Para garantir que os componentes do kit não foram expostos a temperaturas elevadas durante o transporte, deve verificar-se se o

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gelo seco ainda se encontra presente aquando da recepção do kit. Observar que certos componentes do kit poderão permanecer descongelados, o que não afectará o desempenho do TOP2A IQFISH pharmDx. Frasco 1

Solução de pré-tratamento (20 x) 150 mL, concentrado 20 x Tampão MES (ácido 2-[N-morfolino]etanossulfónico).

Frasco 2A Frasco 2B

Pepsina 4 x 6,0 mL, pronto a utilizar Solução de pepsina, pH 2,0; contém um estabilizador e um agente antimicrobiano.

Diluente de pepsina (10 x) 24 mL, concentrado 10 x Tampão de diluição, pH 2,0; contém um agente antimicrobiano.

Frasco 3

Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH 0,2 mL, pronto a utilizar Mistura de sondas de ADN TOP2A marcadas com Texas Red e sondas de APN CEN-17 marcadas com fluoresceína; fornecidas em tampão de hibridização IQISH.

Frasco 4 Tampão de lavagem adstringente (20 x) 150 mL, concentrado 20 x Tampão SSC (citrato sódio-salino) com detergente (Tween20).

Frasco 5 Meio de montagem de fluorescência 0,4 mL, pronto a utilizar Meio de montagem de fluorescência com 500 µg/L de DAPI (4’,6-diamidina-2-fenilindol).

Frasco 6 Tampão de lavagem (20 x) 500 mL, concentrado 20 x Tampão Tris/HCl.

Vedante de lamelas 1 tubo, pronto a utilizar Solução para a selagem amovível de lamelas.

NOTA: Os seguintes reagentes do kit: Solução de pré-tratamento (20 x), Pepsina, Diluente de pepsina (10 x), Tampão de lavagem adstringente (20 x), Meio de montagem de fluorescência, Tampão de lavagem (20 x) e vedante de lamelas podem ser substituídos pelos reagentes correspondentes do Dako Histology FISH Accessory Kit, referência K5799. Materiais necessários, mas não fornecidos

Reagentes de laboratório Água destilada ou desionizada Etanol, 96%

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Xileno ou substitutos de xileno

Equipamento de laboratório Panos absorventes Pipetas ajustáveis Termómetro de imersão parcial calibrado (intervalo de 37–100 °C) Termómetro de superfície calibrado (intervalo de 37–100 °C) Lamelas de cobertura (22 mm x 22 mm) Dako Hybridizer (referência S2450/S2451)* Bloco térmico ou estufa de hibridização* Câmara húmida de hibridização* Fórceps Campânula de extracção de fumos Microcentrífuga, Lâminas, Dako Silanized Slides, referência S3003, ou lâminas revestidas com poli-L-lisina (consultar a secção de Preparação de amostras) Frascos ou banhos de coloração Cronómetro (com intervalos de 2–15 minutos) Agitador tipo vórtex Banho de água com tampa (com capacidade para manter uma temperatura de 37 (±2) °C, 63 (±2) °C e de 95 °C a 99 °C) Forno de microondas com capacidade de detecção se o pré-tratamento for efectuado utilizando um forno de microondas (consultar B3. Protocolo de coloração. Etapa 1: Pré-tratamento, Método B) * Pode utilizar-se um bloco térmico ou estufa de hibridização para desnaturação (66 (±1) °C) e hibridização (45 (±2) °C) juntamente com uma câmara húmida de hibridização.

Equipamento e acessórios de microscópio Filtros para microscópio de fluorescência: filtro duplo DAPI e FITC/Texas Red ou filtro individual FITC e Texas Red - consultar o Apêndice 3 para mais detalhes. Deve ser utilizado um microscópio de fluorescência com uma lâmpada de mercúrio de 100 watts como fonte de luz. Não se recomendam outras fontes de luz com estes filtros. Dobrador de lâminas de microscópio (tabuleiro de cartão para 20 lâminas com tampa articulada ou dispositivo semelhante).

Precauções 1. Para utilização em diagnóstico in vitro. 2. Para utilizadores profissionais. 3. O frasco 1, Pre-Treatment Solution (20x), não requer rotulagem de substâncias perigosas. A

Ficha de dados de segurança (FDS) encontra-se disponível para utilizadores profissionais, mediante pedido.

4. O frasco 2A, Pepsin, contém ≥5-<10% de propan-2-ol, ≥0,1-<0,3% de pepsina A e ≥0,011-<0,1% de 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona e 2-metil-2H-isotiazol-3-ona. O frasco 2A apresenta a seguinte rotulagem:

Perigo H314 Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves. H317 Pode provocar uma reação alérgica cutânea. P280 Usar luvas de proteção. Usar proteção ocular ou facial. Usar

vestuário de proteção. P304 + P340 + P310 EM CASO DE INALAÇÃO: retirar a pessoa para uma zona ao ar

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livre e mantê-la numa posição que não dificulte a respiração. Contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico.

P301 + P310 + P331 EM CASO DE INGESTÃO: contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. NÃO induzir o vómito.

P303 + P361 + P353 + P310

SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água ou tomar um duche. Contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico.

P305 + P310 SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: contacte imediatamente um CENTRO DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico.

P405 Armazenar em local fechado à chave. P501 Eliminar o conteúdo/recipiente em conformidade com as

regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. 5. O frasco 2B, Pepsin Diluent (10x), contém ≥50-<75% de propan-2-ol e ≥5-<10% de 2-amino-2-

(hidroximetil)propano-1,3-diol cloridrato. O frasco 2B apresenta a seguinte rotulagem:

Perigo H225 Líquido e vapor altamente inflamáveis. H319 Provoca irritação ocular grave. H336 Pode provocar sonolência ou vertigens. P280 Usar luvas de proteção. Usar proteção ocular ou facial. P210 Manter afastado do calor, superfícies quentes, faísca, chama

aberta e outras fontes de ignição. Não fumar. P241 Utilizar equipamento elétrico, de ventilação, de iluminação e todo o

material de manuseamento à prova de explosão. P304 + P340 EM CASO DE INALAÇÃO: retirar a pessoa para uma zona ao ar

livre e mantê-la numa posição que não dificulte a respiração. P303 + P361 + P533 SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): retirar

imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água ou tomar um duche.

P235 Conservar em ambiente fresco. P501 Eliminar o conteúdo/recipiente em conformidade com as

regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. 6. O frasco 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, contém ≥10-<25% de carbonato de etileno e ≥3-

<5% de cloreto de sódio. O frasco 3 apresenta a seguinte rotulagem:

Aviso H319 Provoca irritação ocular grave. P280 Usar proteção ocular ou facial. P264 Lavar cuidadosamente as mãos após manuseamento. P305 + P351 + P338 SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar

cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar.

7. O frasco 4, Stringent Wash Buffer (20x), contém ≥10-<25% de cloreto de sódio e ≥10-<20% de 2-amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol cloridrato. O frasco 4 apresenta a seguinte rotulagem:

Aviso H319 Provoca irritação ocular grave. H315 Provoca irritação cutânea.

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P280 Usar luvas de proteção. Usar proteção ocular ou facial. P264 Lavar cuidadosamente as mãos após manuseamento. P305 + P351 + P338 SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar

cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar.

8. O frasco 6, Wash Buffer (20x), contém ≥10-<25% de cloreto de sódio e ≥10-<20% de trometamol. O frasco 6 apresenta a seguinte rotulagem:

Aviso H319 Provoca irritação ocular grave. H315 Provoca irritação cutânea. P280 Usar luvas de proteção. Usar proteção ocular ou facial. P264 Lavar cuidadosamente as mãos após manuseamento. P305 + P351 + P338 SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar

cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar.

9. O vedante de lamelas contém 100% de nafta (petróleo), luz tratada com hidrogénio e está rotulado como:

Perigo H225 Líquido e vapor altamente inflamáveis. H304 Pode ser mortal por ingestão e penetração nas vias respiratórias. H411 Tóxico para os organismos aquáticos com efeitos duradouros. P280 Usar luvas de proteção. Usar proteção ocular ou facial. P210 Manter afastado do calor, superfícies quentes, faísca, chama

aberta e outras fontes de ignição. Não fumar. P241 Utilizar equipamento elétrico, de ventilação, de iluminação e todo o

material de manuseamento à prova de explosão. P273 Evitar a libertação para o ambiente. P301 + P310 + P331 EM CASO DE INGESTÃO: contacte imediatamente um CENTRO

DE INFORMAÇÃO ANTIVENENOS ou um médico. NÃO induzir o vómito.

P303 + P361 + P353 SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água ou tomar um duche.

P235 Conservar em ambiente fresco. P501 Eliminar o conteúdo/recipiente em conformidade com as

regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. 10. As amostras, antes e depois da sua fixação, bem como todos os materiais expostos às

mesmas, devem ser manipulados tal como potencialmente infeciosos, e devem ser descartados com as devidas precauções (37). Nunca pipetar os reagentes com a boca e evitar o contacto da pele e membranas mucosas com os reagentes e as amostras. Se os reagentes entrarem em contacto com áreas sensíveis, lavar com grandes quantidades de água.

11. Minimizar a contaminação microbiana dos reagentes para evitar resultados incorretos. 12. Tempos e temperaturas de incubação ou métodos diferentes dos especificados podem originar

resultados erróneos. 13. Métodos de fixação dos tecidos e espessura das amostras diferentes dos especificados

poderão afetar a morfologia dos tecidos e/ou a intensidade do sinal. 14. Evitar a evaporação da TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix durante a hibridização, assegurando

para tal a presença de suficiente humidade na câmara de hibridização. 15. Os reagentes apresentam uma diluição ideal. Uma maior diluição poderá resultar numa quebra

do desempenho.

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16. Utilizar equipamento de proteção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. Consultar a Ficha de dados de segurança (FDS) para obter informações adicionais.

17. Deve utilizar-se apenas frascos de coloração limpos para o método de imersão em Pepsin (Etapa 2, método C).

Conservação Conservar a Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH (Frasco 3) a -18 °C em local escuro. Todos os restantes reagentes podem ser conservados a 2–8 °C em local escuro. Todos os reagentes toleram ser conservados congelados. A congelação e descongelação dos reagentes até 10 vezes não afecta o seu desempenho.

Os componentes Pepsina pronta a utilizar, Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH e Meio de montagem de fluorescência (Frascos 2A, 3 e 5) poderão ser afectados negativamente pela exposição ao calor. Não deixar estes componentes à temperatura ambiente.

Os componentes Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH e Meio de montagem de fluorescência (Frascos 3 e 5) poderão ser afectados negativamente pela exposição a níveis de luz excessivos. Não conservar estes componentes nem realizar a análise sob luz forte como, por exemplo, luz solar directa.

Não utilizar o kit após o fim do prazo de validade inscrito na caixa do kit. Caso os reagentes sejam conservados noutras condições para além das especificadas neste folheto informativo, o utilizador deve verificar o desempenho dos reagentes (38).

Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto. Portanto, convém avaliar células normais na secção de tecido analisado. Caso se observe algum padrão de fluorescência inesperado que não possa ser explicado por variações dos procedimentos laboratoriais e se suspeite de um problema com o TOP2A IQFISH pharmDx, contactar imediatamente o Serviço Técnico da Dako.

Preparação das amostras As amostras resultantes de biopsias devem ser manuseadas de modo a preservar o tecido para a análise FISH. Devem empregar-se em todas as amostras métodos padrão de processamento de tecidos para a coloração imunohistoquímica (39).

Secções impregnadas em parafina Apenas os tecidos conservados em formol tamponado neutro e impregnados em parafina são adequados para serem utilizados. As amostras de biopsias devem, por exemplo, ser bloqueadas a uma espessura de 3 ou 4 mm e fixadas durante 18–24 horas em formol tamponado neutro. Os tecidos devem então ser desidratados fazendo-os passar por uma série de concentrações de etanol e xileno, seguindo-se a infiltração com parafina derretida, mantida a uma temperatura não superior a 60 °C. Se forem mantidos em local fresco (15–25 °C), os tecidos devidamente fixados e impregnados conservar-se-ão por um período indefinido antes de serem seccionados e montados em lâminas (39, 40). Os outros fixadores não são apropriados.

As amostras de tecido devem ser cortadas em secções de 4–6 µm.

As lâminas necessárias para a análise de aberração do gene TOP2A e para a verificação da presença do tumor devem ser preparadas ao mesmo tempo. Recomenda-se um mínimo de 3 secções em série, 1 secção para a presença do tumor corada com hematoxilina e eosina (coloração H&E), 1 secção para a análise de aberração do gene TOP2A e 1 secção de reserva. Recomenda-se que as secções de tecido sejam montadas em lâminas Dako Silanized Slides, referência S3003, lâminas SuperFrost Plus ou em lâminas revestidas com poli-L-lisina. As amostras devem ser analisadas no prazo de 4–6 meses após o seccionamento quando conservadas à temperatura ambiente (20–25 °C) ou no prazo de 2 anos quando conservadas a 2–8 °C.

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INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO

A. Preparação dos reagentes Antes da coloração, é conveniente preparar os seguintes reagentes:

A.1 Solução de pré-tratamento Podem formar-se cristais no Frasco 1, mas estes dissolver-se-ão à temperatura ambiente. Certificar-se de que os componentes não contêm cristais antes de preparar o reagente. Diluir uma quantidade suficiente do Frasco 1 (Solução de pré-tratamento 20 x) a 1:20 em água destilada ou desionizada. O tampão diluído não utilizado pode ser conservado a 2–8 °C durante um mês. Eliminar o tampão caso tenha um aspecto turvo.

A.2 Tampão de lavagem adstringente Diluir uma quantidade suficiente do Frasco 4 (Tampão de lavagem adstringente 20 x) a 1:20 em água destilada ou desionizada. O tampão diluído não utilizado pode ser conservado a 2–8 °C durante um mês. Eliminar o tampão caso tenha um aspecto turvo.

A.3 Tampão de lavagem Diluir uma quantidade suficiente do Frasco 6 (Tampão de lavagem 20 x) a 1:20 em água destilada ou desionizada. O tampão diluído não utilizado pode ser conservado a 2–8 °C durante um mês. Eliminar o tampão diluído caso tenha um aspecto turvo.

A.4 Série de etanol A partir de uma solução de etanol a 96%, preparar 3 frascos com etanol a 70%, 85% e 96%, respectivamente. Conservar os frascos tapados à temperatura ambiente ou a 2–8 °C e utilizá-los para um máximo de 200 lâminas. Eliminar as soluções caso tenham um aspecto turvo.

A.5 Solução de pepsina A solução de pepsina é necessária apenas quando é utilizado o método de imersão em pepsina (Método C).

Preparar a solução de pepsina do seguinte modo: Para um recipiente com capacidade para seis lâminas, preparar 60 mL de solução de pepsina:

Adicionar ao recipiente 48 mL de água destilada ou desionizada à temperatura ambiente (20–25 °C).

Adicionar ao recipiente 6 mL de Diluente de pepsina (10 x) (Frasco 2B) frio (2–8 °C).

Adicionar ao recipiente 6 mL de Pepsina (Frasco 2A) fria (2–8 °C).

Colocar a tampa no recipiente e equilibrar a solução a 37 (±2) °C num banho de água. Para um recipiente com capacidade para 24 lâminas, preparar 240 mL de solução de pepsina:

Adicionar ao recipiente 192 mL de água destilada ou desionizada à temperatura ambiente (20–25 °C).

Adicionar ao recipiente 24 mL de Diluente de pepsina (10 x) (Frasco 2B) frio (2–8 °C).

Adicionar ao recipiente 24 mL de Pepsina pronta a utilizar (Frasco 2A) fria (2–8 °C).

Colocar a tampa no recipiente e equilibrar a solução a 37 (±2) °C num banho de água. A solução de pepsina equilibrada deverá ser utilizada no prazo de 5 horas.

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B. Procedimento de coloração

B.1 Notas do procedimento O utilizador deve ler atentamente estas instruções e familiarizar-se com todos os componentes antes da utilização (consultar a secção de Precauções).

Equilibrar todos os reagentes à temperatura pertinente antes de os utilizar do modo seguinte:

Frasco 1: A Solução de pré-tratamento diluída deve ser equilibrada a 95–99 °C caso se utilize um banho de água para o pré-tratamento (B3. Protocolo de coloração, Etapa 1: Pré-tratamento, Método A). Caso se utilize um forno de microondas com capacidade de detecção para o pré-tratamento (B3. Protocolo de coloração, Etapa 1: Pré-tratamento, Método B), a solução de pré-tratamento diluída deve ser equilibrada à temperatura ambiente de 20–25 °C. Frasco 2A: A Pepsina deve ser aplicada a 2–8 °C (B3, Protocolo de coloração, Etapa 2: Método A e B) e deve ser constantemente mantida fria.

Frasco 2B: O Diluente de pepsina (10x) deve ser aplicado a 2–8 °C (B3, Protocolo de coloração, Etapa 2: Método C).

Frasco 3: A Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH separa-se em duas fases quando conservada a -18 °C. Antes de utilizar o Frasco 3, garantir que apenas uma fase está presente equilibrando a mistura de sondas à temperatura ambiente (20–25 °C), seguindo-se a mistura. Descongelar o Frasco 3 à temperatura ambiente (20–25 °C) durante um máximo de 30 minutos (proteger da luz forte) e, em seguida, agitar bem o frasco durante 15 segundos a 2500 rpm utilizando um agitador tipo vórtex. Conservar o Frasco 3 a -18 °C imediatamente após a utilização.

Frasco 4: Tampão de lavagem adstringente; um frasco deve ser equilibrado à temperatura ambiente, outro a 63 (±2) °C antes da utilização.

Frasco 5: O Meio de montagem de fluorescência pode ser aplicado a qualquer temperatura entre 2–25 °C.

Frasco 6: O Tampão de lavagem diluído deve ser equilibrado à temperatura ambiente de 20–25 °C. O vedante de lamelas pode ser aplicado a qualquer temperatura entre 2–25 °C. Todas as etapas devem ser efectuadas com as temperaturas indicadas. O procedimento inclui uma série de processos de desidratação, seguindo-se a secagem das secções de tecido. Certificar-se de que as secções de tecido se encontram completamente secas antes de prosseguir para a etapa seguinte. Não deixar que as secções de tecido sequem durante as outras etapas do procedimento.

Se o procedimento de coloração tiver de ser interrompido, as lâminas podem ser mantidas em Tampão de lavagem após a etapa de desparafinação durante o máximo de 1 hora, à temperatura ambiente (20–25 °C), sem que os resultados sejam afectados.

B.2 Tratamento dos tecidos antes da coloração Desparafinação e reidratação: Antes de se efectuar a análise, as lâminas de tecido devem ser desparafinadas para remover o meio de impregnação e devem ser reidratadas. Evitar a remoção incompleta da parafina. A presença de resíduos de meio de impregnação aumentará a coloração não específica. Esta etapa deve ser realizada à temperatura ambiente (20–25 °C).

1. Colocar as lâminas num banho de xileno e incubar durante 5 (±1) minutos. Mudar os banhos e repetir uma vez.

2. Dar pancadas leves para remover o excesso de líquido e colocar as lâminas em etanol a 96% durante 2 (±1) minutos. Mudar os banhos e repetir uma vez.

3. Dar pancadas leves para remover o excesso de líquido e colocar as lâminas em etanol a 70% durante 2 (±1) minutos. Mudar os banhos e repetir uma vez.

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4. Dar pancadas leves para remover o excesso de líquido e colocar as lâminas em Tampão de lavagem diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.3) durante um mínimo de 2 minutos. Iniciar o processo de coloração conforme delineado na Secção B.3, Etapa 1, Pré-tratamento.

As soluções de xileno e álcool devem ser mudadas ao fim de 200 lâminas ou menos.

Podem utilizar-se substitutos de xileno.

NOTA: Os reagentes e instruções fornecidos neste kit foram concebidos para se obter um desempenho ideal. A diluição subsequente dos reagentes ou a alteração das temperaturas de incubação podem originar resultados erróneos ou discordantes. As diferenças no processamento de tecidos e procedimentos técnicos no laboratório do utilizador poderão invalidar os resultados do ensaio.

B.3 Protocolo de coloração Etapa 1: Pré-tratamento O pré-tratamento pode ser efectuado usando um banho de água conforme descrito no método A) ou, em alternativa, mediante a utilização de um forno de microondas com capacidade de detecção conforme descrito no método B). Método A: Pré-tratamento utilizando um banho de água Encher um frasco de coloração com a Solução de pré-tratamento diluída (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.1). Colocar o frasco de coloração contendo a Solução de pré-tratamento diluída num banho de água. Aquecer o banho de água e a Solução de pré-tratamento a 95–99 °C. Medir a temperatura dentro do frasco com um termómetro calibrado para assegurar a temperatura certa. Cobrir o frasco com uma tampa a fim de estabilizar a temperatura e evitar a evaporação.

Mergulhar as secções desparafinadas à temperatura ambiente na Solução de pré-tratamento previamente aquecida contida no frasco de coloração. Medir novamente a temperatura e incubar durante 10 (±1) minutos a 95–99 °C. Retirar completamente da água o frasco contendo as lâminas. Remover a tampa e deixar arrefecer as lâminas na Solução de pré-tratamento durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferir as lâminas para um frasco com Tampão de lavagem diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.3) durante 3 minutos à temperatura ambiente (20–25 °C). Substituir o Tampão de lavagem e embeber as secções durante outros 3 minutos. NOTA: A Solução de pré-tratamento foi concebida para uma única aplicação. Não reutilizar.

Método B: Pré-tratamento utilizando um forno de microondas com capacidade de detecção Encher um frasco de plástico com Solução de pré-tratamento diluída à temperatura ambiente (20–25 °C). Mergulhar as secções desparafinadas em Solução de pré-tratamento, tapar o frasco com uma tampa perfurada e colocar no forno de microondas. Escolher a função de sensor de ebulição e um programa que corra durante 10 minutos depois que atingida a temperatura de ebulição*. Depois da incubação de 10 minutos, retirar o frasco com as lâminas do forno, remover a tampa e deixar arrefecer durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transferir as lâminas para um frasco com Tampão de lavagem diluído e embeber durante 3 minutos à temperatura ambiente (20–25 °C). Substituir o Tampão de lavagem e embeber as secções durante outros 3 minutos. * A utilização de um forno de microondas com capacidade de detecção significa que o forno tem de incluir um sensor e

programas que inicialmente aqueçam a Solução de pré-tratamento até ao ponto de ebulição e, subsequentemente, mantenham a temperatura necessária para o pré-tratamento (acima de 95 ºC) enquanto se efectua a contagem decrescente do tempo predefinido (10 (±1) minutos). Alguns modelos de fornos de microondas com capacidade de detecção podem não incluir a possibilidade para definir livremente um tempo de contagem decrescente. Se o modelo incluir apenas programas predefinidos, certificar-se de que é seleccionado um programa que mantenha a temperatura necessária para o pré-tratamento (acima de 95 ºC) durante pelo menos 10 (±1) minutos e interrompa manualmente o programa após 10 (±1) minutos.

NOTA: A Solução de pré-tratamento foi concebida para uma única aplicação. Não reutilizar.

Etapa 2: Pepsina pronta a utilizar ou solução de pepsina A incubação de pepsina pode ser efectuada pela aplicação directa de gotas de pepsina pronta a utilizar nas lâminas à temperatura ambiente (20–25 °C) (Método A) ou a 37 °C (Método B). Em alternativa, as lâminas podem ser mergulhadas numa solução de pepsina e incubadas a 37 (±2) °C (Método C).

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Método A) e Método B): Dar pancadas leves para remover o excesso de tampão. Utilizando um tecido sem fios (como um pano absorvente ou uma compressa de gaze), limpar cuidadosamente em redor da amostra para remover qualquer resto de líquido e manter os reagentes na devida área.

Aplicar 5–8 gotas (250 µL) de Pepsina (Frasco 2A) fria (2–8 °C) para cobrir a amostra. Conservar sempre a Pepsina a 2–8 °C.

Método A: Pepsina pronta a utilizar - Incubação a 20–25 °C Incubar à temperatura ambiente durante 5–15 minutos (20–25 °C). Um período de incubação de 5–15 minutos é adequado para a maioria das amostras, mas o período de incubação ideal pode depender da fixação do tecido e/ou da espessura da amostra, devendo ser determinado pelo utilizador.

Dar pancadas leves para remover o excesso de Pepsina e embeber as secções em Tampão de lavagem diluído (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.3) durante 3 minutos à temperatura ambiente (20–25 °C).

Substituir o Tampão de lavagem e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a desidratação.

Método B: Pepsina pronta a utilizar - Incubação a 37 °C Colocar a amostra com Pepsina num bloco térmico a 37 °C – por exemplo, Dako Hybridizer – e incubar durante 3–5 minutos. Um período de incubação de 3–5 minutos é adequado para a maioria das amostras, mas o período de incubação ideal pode depender da fixação do tecido e/ou da espessura da amostra, devendo ser determinado pelo utilizador. Dar pancadas leves para remover o excesso de Pepsina e embeber as secções em Tampão de lavagem diluído durante 3 minutos à temperatura ambiente (20–25 °C). Substituir o Tampão de lavagem e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a desidratação. Desidratar as secções de tecido fazendo-as passar por uma série de concentrações de etanol: 2 minutos em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 85% e 2 minutos em etanol a 96%.

Deixar que as secções de tecido sequem por completo ao ar. Método C: Solução de pepsina - Imersão das lâminas em solução de pepsina a 37 °C O kit contém reagentes suficientes para quatro processos separados (60 mL de solução de pepsina, recipiente pequeno para seis lâminas) ou um único processo (240 mL de solução de pepsina, recipiente grande para 24 lâminas). Preparar a solução de pepsina conforme descrito na secção A.5.

Colocar a tampa no recipiente e equilibrar a solução a 37 (±2) °C num banho de água. Certificar-se de que a temperatura se estabilizou. Medir a temperatura dentro do recipiente com um termómetro calibrado para assegurar a temperatura certa.

Dar pancadas leves para remover o excesso de tampão de lavagem. Imergir as lâminas na solução de pepsina a 37 (±2) °C e incubar durante 20–30 minutos. Um período de incubação de 20–30 minutos é adequado para a maioria das amostras, mas o período de incubação ideal pode depender da fixação do tecido e/ou da espessura da amostra, devendo ser determinado pelo utilizador.

Dar pancadas leves para remover o excesso de solução de pepsina e embeber as secções em Tampão de lavagem diluído durante 3 minutos à temperatura ambiente (20–25 °C). Substituir o Tampão de lavagem e embeber as secções durante outros 3 minutos. Prosseguir para a desidratação.

Desidratar as secções de tecido fazendo-as passar por uma série de concentrações de etanol: 2 minutos em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 85% e 2 minutos em etanol a 96%. Deixar que as secções de tecido sequem por completo ao ar.

Etapa 3: Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH

A Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH separa-se em duas fases quando conservada a -18 °C. Antes de utilizar o Frasco 3, garantir que apenas uma fase está presente equilibrando a mistura de sondas à temperatura ambiente (20–25 °C), seguindo-se a mistura. Descongelar o Frasco 3 à temperatura ambiente (20–25 °C) durante um máximo de 30 minutos (proteger da luz

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forte) e, em seguida, agitar bem o frasco durante 15 segundos a 2500 rpm utilizando um agitador tipo vórtex. Conservar o Frasco 3 a -18 °C imediatamente após a utilização.

Aplicar 10 µL da Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH (Frasco 3) no centro da secção de tecido. Colocar imediatamente uma lamela de vidro de 22 mm x 22 mm sobre a Mistura de sondas e deixar alastrar uniformemente sob a lamela. Evitar a formação de bolhas de ar. Caso se observem bolhas de ar, retirá-las do tecido com umas leves pancadas com o fórceps.

Não esquecer de conservar o Frasco 3 a -18 °C imediatamente após a utilização. Selar a lamela, aplicando vedante de lamelas no contorno da mesma. Deixar que o vedante de lamelas se sobreponha à lâmina e à lamela, formando assim uma camada de selagem em torno da lamela. Certificar-se de que o vedante de lamelas cobre todo o rebordo da lamela.

Preparar o Dako Hybridizer* (referência S2450/S2451) para um ensaio de hibridização. Certificar-se de que as Humidity Control Strips (referência S2452) estão saturadas e são ideais para utilização. Iniciar o Hybridizer e seleccionar um programa que realize as seguintes funções:

Desnaturar a 66 °C durante 10, seguido de hibridização a 45 °C durante 60–120 minutos.

Colocar as lâminas no Hybridizer, certificar-se de que a tampa está correctamente fechada e iniciar o programa. Consultar o Manual de Instruções do Dako Hybridizer para mais informações. *Para a desnaturação e hibridização, podem utilizar-se instrumentos que permitam estabelecer condições idênticas às descritas acima:

Colocar as lâminas numa superfície lisa metálica ou em pedra (bloco térmico ou bloco de uma estufa de hibridização) pré-aquecida a 66 (±1) °C. Desnaturar durante exactamente 10 minutos.

Colocar as lâminas numa câmara de hibridização humedecida e pré-aquecida. Cobrir a câmara com uma tampa e incubar a 45 (±2) °C durante 60–120 minutos. Observar que uma temperatura de hibridização de 37 °C não é adequada para as sondas contidas neste kit.

Etapa 4: Lavagem adstringente Encher dois frascos de coloração com a Solução de lavagem adstringente diluída (consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, Secção A.2). Recomenda-se a utilização de um volume mínimo, em cada frasco, de 100 mL ou 15 mL por lâmina.

Colocar um dos frascos de coloração contendo o Tampão de lavagem adstringente diluído, à temperatura ambiente, numa campânula de extracção de fumos e o outro num banho de água. Aquecer o banho de água e o Tampão de lavagem adstringente diluído até 63 (±2) °C. Certificar-se de que a temperatura estabilizou. Cobrir o frasco com uma tampa a fim de estabilizar a temperatura e evitar a evaporação. Medir a temperatura dentro do banho de água com um termómetro calibrado para assegurar a temperatura certa. O Tampão de lavagem adstringente contém um detergente e pode tornar-se turvo a 63 °C, o que não afectará o seu desempenho.

Empregando fórceps ou luvas, retirar as lâminas da câmara de hibridização e remover cuidadosamente o vedante de lamelas, bem como as próprias lamelas, colocando as lâminas, uma de cada vez, dentro do frasco de pré-lavagem à temperatura ambiente. Não colocar as lâminas em Tampão de lavagem adstringente antes de remover as lamelas.

Assim que tiverem sido removidas todas as lamelas, transferir as lâminas do frasco de pré-lavagem à temperatura ambiente para o frasco a 63 (±2) °C no banho de água.

Imediatamente após transferir as lâminas para o frasco a 63 (±2) °C no banho de água, deve ser iniciado o cronómetro. Efectuar a lavagem adstringente durante exactamente 10 minutos.

Remover as lâminas do Tampão de lavagem adstringente diluído e embeber as secções em Tampão de lavagem diluído durante 3 minutos à temperatura ambiente (20–25 °C).

Mudar o Tampão de lavagem diluído e embeber as secções durante outros 3 minutos.

Desidratar as secções de tecido fazendo-as passar por uma série de concentrações de etanol: 2 minutos em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 85% e 2 minutos em etanol a 96%.

Deixar que as secções de tecido sequem por completo.

Etapa 5: Montagem Aplicar 15 µL de Meio de montagem de fluorescência com DAPI (Frasco 5) na área alvo da lâmina e aplicar uma lamela de vidro.

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NOTA: As lâminas podem ser interpretadas passados 15 minutos ou no prazo de 7 dias após a execução da montagem. Contudo, se as lâminas ficarem expostas à luz ou a temperaturas elevadas, dar-se-á o enfraquecimento da amostra. Para minimizar o enfraquecimento, conservar as lâminas em local escuro, a -18–8 °C.

Controlo de qualidade 1. Os sinais devem ser vivos, distintos e fáceis de interpretar. 2. As células normais permitem efectuar um controlo interno do ensaio de coloração.

• As células normais devem ter 1-2 sinais verdes claramente visíveis, o que indica que a Sonda de APN CEN-17 se hibridizou efectivamente na região centromérica do cromossoma 17.

• As células normais devem ter ainda 1-2 sinais vermelhos claramente visíveis, indicando que a Sonda de ADN TOP2A se hibridizou efectivamente na região alvo de TOP2A.

• Devido ao seccionamento do tecido, algumas células normais terão menos do que os 2 sinais de cada cor antecipados.

• As células normais submetidas a divisão celular podem ter menos do que os 1-2 sinais de cada cor normais.

• A não detecção de sinais nas células normais indica falha do ensaio e os resultados devem ser considerados inválidos.

3. A morfologia nuclear deve estar intacta quando avaliada com um filtro DAPI. A presença de numerosas células tipo fantasma e de uma morfologia nuclear geralmente deficiente indicam a digestão excessiva da amostra, resultando na perda ou fragmentação dos sinais. As amostras desse tipo devem ser consideradas inválidas. 4. Quaisquer diferenças na fixação, processamento e impregnação dos tecidos no laboratório do utilizador podem produzir uma variabilidade nos resultados, sendo necessária a execução regular de controlos internos.

Interpretação da coloração Tecido avaliável Apenas devem ser analisadas amostras de doentes com carcinomas invasivos. Nos casos em que seja visível carcinoma in situ e carcinoma invasivo na mesma amostra, apenas a componente invasiva deve ser classificada. Evitar áreas com necrose e áreas onde as orlas nucleares estejam em estado ambíguo. Não incluir núcleos que exijam uma avaliação subjectiva. Não analisar os núcleos com sinais de fraca intensidade e um fundo elevado ou não específico. Utilizar o filtro DAPI para verificar a existência de coloração uniforme dos núcleos.

Contagem dos sinais: Localizar o tumor dentro do contexto da lâmina corada com H&E e interpretar a mesma área na lâmina corada com FISH. Examinar várias áreas de células tumorais a fim de detectar a possibilidade de heterogeneidade. Seleccionar uma área que apresente uma boa distribuição de núcleos. Iniciar a análise no quadrante superior esquerdo da área seleccionada e, examinando-a da esquerda para a direita, contar o número de sinais que se encontrem dentro dos limites nucleares de cada núcleo avaliado de acordo com as orientações fornecidas a seguir (consultar também o Apêndice 3).

• Mudar o foco para cima e para baixo até encontrar todos os sinais presentes dentro de cada núcleo individual.

• Contar dois sinais que sejam do mesmo tamanho e se encontrem separados por uma distância igual ou inferior ao diâmetro do sinal como apenas um sinal.

• Nos núcleos que contenham níveis elevados de amplificação do gene TOP2A, os sinais de TOP2A podem estar posicionados muito próximo uns dos outros, formando aglomerações de sinais. Nestes casos, o número de sinais de TOP2A não pode ser contado, devendo antes ser calculado. Deve prestar-se especial atenção aos sinais verdes, já que as aglomerações de sinais de TOP2A podem cobrir os sinais verdes, tornando impossível a sua visualização. Em caso de dúvida, examinar os sinais verdes com a ajuda de um filtro FITC específico.

• Não classificar núcleos sem sinais verdes. Classificar apenas os núcleos com um ou mais sinais de referência verdes.

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• Registar as contagens numa tabela, tal como indicado no Apêndice 2.

Guia de contagem de sinais

1

Não contar. Os núcleos encontram-se sobrepostos e nem todas as áreas dos núcleos se encontram visíveis.

2 Contar como dois sinais verdes

3

Dois sinais vermelhos: não classificar os núcleos com sinais vermelhos apenas

4

Contar como 3 sinais verdes e 12 vermelhos (estimativa da aglomeração).

5 Contar como 1 sinal verde e 1 vermelho. Dois sinais que sejam do mesmo tamanho e estejam separados por uma distância igual ou inferior ao diâmetro de um sinal contam-se como se fossem apenas um sinal.

6 Não contar (núcleos excessivamente ou insuficientemente digeridos). Sinais em falta no centro dos núcleos (núcleos de forma anelar).

7 Contar como 2 sinais verdes e 3 vermelhos. Dois sinais que sejam do mesmo tamanho e estejam separados por uma distância igual ou inferior ao diâmetro de um sinal contam-se como se fossem apenas um sinal.

8 Contar como 1 sinal verde e 5 vermelhos.

9 Contar como 3 sinais verdes (um verde desfocado) e 3 vermelhos.

10 Aglomeração de sinais vermelhos obscurecendo os sinais verdes: examinar os sinais verdes com um filtro FITC específico ou não contar.

Os sinais podem ser classificados através do método convencional (41) ou, em alternativa, através de um método que poupa tempo e trabalho (21, 29). Em vez do método convencional de contagem de sinais em 60 núcleos, é classificado um total de 60 eventos, em que um evento é um sinal vermelho de gene. Através deste método de contagem alternativo, é classificado um número de núcleos variável até alcançar 60 sinais vermelhos de TOP2A. Os sinais verdes de CEN-17 correspondentes nos mesmos núcleos são registados. O número mínimo de núcleos a classificar é de 6. Em amostras normais, uma média de 35 núcleos será suficiente para alcançar 60 sinais vermelhos. Nos casos de amplificação, serão incluídos 6-35 núcleos. Mesmo em casos com eliminações, menos de 60 núcleos será geralmente considerado suficiente. Se possível, contar os núcleos de 3 áreas tumorais diferentes (42). Calcular a razão TOP2A/CEN-17 dividindo o número total de sinais vermelhos de TOP2A pelo número total de sinais verdes de CEN-17. As amostras com uma razão TOP2A/CEN-17 superior ou igual a 2 devem ser consideradas como apresentando uma amplificação do TOP2A e as amostras com uma razão TOP2A/CEN-17 inferior a 0,8 devem ser consideradas como apresentando uma eliminação do TOP2A (18, 21, 29).

ou

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Os resultados que se situem no ponto de corte ou próximo (1,8–2,2 para amplificações e 0,7–0,9 para eliminações) devem ser interpretados com cuidado. Recomenda-se que se verifique se as classificações não incluem uma percentagem elevada de núcleos normais.

Se a razão recair em qualquer das duas zonas equívocas ou em caso de incerteza, recomenda-se que a classificação da amostra seja verificada efectuando uma nova classificação por outra pessoa e contando os núcleos de 3 ou mais áreas tumorais e/ou contando um total de 60 núcleos. Recomenda-se um critério de aceitação de ±10% de CV. A razão final deverá ser recalculada com base em todas as classificações. Em casos limite, justifica-se uma troca de impressões entre o patologista e o médico de tratamento.

Limitações

Limitações gerais 1. O FISH é um processo diagnóstico multi-etapas que requer uma formação especializada na

selecção dos reagentes apropriados, bem como na selecção, fixação e processamento dos tecidos, na preparação das lâminas de FISH e na interpretação dos resultados da coloração.

2. Os resultados do FISH dependem da manipulação e processamento dos tecidos antes da sua coloração. A fixação, lavagem, secagem, aquecimento, seccionamento incorrectos ou a contaminação com outros tecidos ou líquidos poderão influenciar a hibridização das sondas. Os resultados inconsistentes podem dever-se a variações nos métodos de fixação e impregnação ou a irregularidades inerentes aos tecidos.

3. Para obter resultados ideais e reprodutíveis, devem desparafinar-se por completo as lâminas de tecido. A remoção da parafina tem de ser concluída no início do processo de coloração. (Consultar as INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, secção B.2).

4. Devem utilizar-se apenas banhos de água, blocos térmicos e estufas de hibridização cuja temperatura possa ser calibrada. A utilização de outros tipos de equipamento pode resultar na evaporação da Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH durante a hibridização, devendo tal equipamento ser validado pelo utilizador.

Características de desempenho Sensibilidade analítica A sensibilidade da Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH foi investigada utilizando 18 amostras de epitélio da mama humano normal. A razão entre o número de sinais de TOP2A e o número de sinais de CEN-17 foi calculada com base numa contagem de 60 núcleos por amostra. As razões TOP2A/CEN-17 para as 18 amostras de epitélio da mama humano situaram-se entre 0,97–1,11.

Especificidade analítica As extremidades das sondas de ADN TOP2A na Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH foram identificadas em sequências e mapeadas de modo a confirmar uma cobertura total de 228 kb, incluindo o gene TOP2A. As sondas de ADN CEN-17 na Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 foram testadas individualmente e em combinação de modo a confirmar a sua hibridização específica à região centromérica do cromossoma 17. De forma a medir a capacidade do ensaio para identificar exclusivamente as substâncias alvo TOP2A e CEN-17 sem interferência de outras substâncias, foram realizados estudos em amostras de tecido de epitélio da mama humano normal utilizando o Frasco 3, que contém o tampão de hibridização, mas sem a mistura de sondas. Foram avaliadas no total 18 amostras para verificar a presença de sinais não relacionados com a mistura de sondas. Não foram detectados outros alvos cromossómicos ou interferências com substâncias proximamente relacionadas em nenhuma das 18 amostras.

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Estudos de robustez A robustez do ensaio TOP2A IQFISH pharmDx foi testada através da variação do tempo de pré-tratamento, temperatura e métodos de aquecimento do tampão de pré-tratamento (forno de microondas ou banho de água), tempo e método de incubação em pepsina (pepsina pronta a utilizar ou imersão), temperatura e tempo de desnaturação, tempo de hibridização e tempo e temperatura da lavagem adstringente. Não se observaram diferenças significativas nos resultados com as condições experimentais seguintes: • Método de pré-tratamento A) com banho de água durante 10 minutos, combinado com

cada uma das temperaturas de 95 °C, 95–99 °C e 99 °C, juntamente com 9, 10 e 11 minutos a 95–99 °C

• Método de pré-tratamento B) com forno de microondas durante 9, 10 e 11 minutos a > 95 °C.

• Método de digestão da pepsina A) com tempos de incubação de 5, 10 e 15 minutos à temperatura ambiente (20–25 °C).

• Método de digestão da pepsina B) com tempos de incubação de 3, 4 e 5 minutos a 37 °C).

• Método de digestão da pepsina C) com tempos de incubação de 20, 25 e 30 minutos, combinado com cada uma das temperaturas de 35, 37 e 39 °C.

• Desnaturação durante 10 minutos, combinada com cada uma das temperaturas de 65, 66 e 67 °C, juntamente com 9, 10 e 11 minutos a 66 °C. Tempo de hibridização de 60, 90 e 120 minutos a 45 °C.

• Lavagem adstringente durante 10 minutos, combinada com cada uma das temperaturas de 61, 63 e 65 °C, juntamente com 9, 10 e 11 minutos a 63 °C.

Algumas das combinações de tempo e temperatura nos extremos das tolerâncias resultaram numa qualidade da estrutura do tecido ligeiramente inferior, embora não se tenha observado qualquer diferença significativa na intensidade do sinal.

O procedimento de coloração para o TOP2A IQFISH pharmDx oferece variáveis de protocolo para o pré-tratamento aquecido, a digestão da pepsina e o tempo de hibridização. Cada opção combinatória isolada foi validada relativamente ao estado do gene TOP2A. A validação foi efectuada em 10 amostras FFPE de carcinoma da mama humano para cada uma das 12 opções combinatórias possíveis. O kit TOP2A FISH pharmDx (K5333) foi utilizado como referência. A razão TOP2A/CEN-17 para cada amostra individual é apresentada na Figura 1. As tabulações cruzadas entre os 12 testes e a coloração de referência demonstraram uma concordância global no estado do gene TOP2A de 100% (10/10), com limites bipartidos inferior e superior de confiança de 95% a 78,3% e 100%, respectivamente. O valor kappa foi de 1,00 e o teste de McNemars demonstrou a ausência de desvio (valor p bipartido de 1,00).

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Figura 1. Razões TOP2A/CEN-17 individuais para 10 amostras de carcinoma da mama humano coradas utilizando as 12 variações de protocolos combinatórios possíveis com o TOP2A IQFISH pharmDx (referência K5733) (Teste 1-12) e o kit TOP2A FISH pharmDx (referência K5333, R). A linha horizontal superior ilustra o valor do ponto de corte de 2,0 e a linha horizontal inferior o de 0,8. Repetibilidade A repetibilidade da razão TOP2A/CEN-17 foi investigada com o ensaio TOP2A IQFISH pharmDx utilizando secções consecutivas de nove amostras de carcinoma da mama humano com um estado do gene TOP2A eliminado, normal ou amplificado. Foram testadas secções triplicadas de cada amostra no mesmo processamento. O coeficiente de variação médio foi de 3% (intervalo de 1% a 4%) para as amostras de TOP2A eliminado, 7% (intervalo de 2% a 10%) para amostras de TOP2A normal e 5,3% (intervalo de 4% a 7%) para amostras de TOP2A amplificado. Foram testadas no total cinco secções consecutivas de quatro amostras de carcinoma da mama humano com espessuras diferentes ( 3, 4, 5, 6 e 7 µm) com o TOP2A IQFISH pharmDx. O coeficiente de variação médio da razão TOP2A/CEN-17foi de 9,8% (intervalo de 6% a 13%).

Reprodutibilidade O ensaio TOP2A IQFISH pharmDx foi testado para verificar a reprodutibilidade de lote para lote e de observador para observador utilizando três lotes de TOP2A IQFISH pharmDx e três observadores. A reprodutibilidade foi testada em nove amostras de carcinoma da mama humano com um estado do gene TOP2A eliminado, normal ou amplificado. O coeficiente de variação médio de reprodutibilidade de lote para lote foi de 3,7% para as amostras de TOP2A eliminado (intervalo de 2% a 6%), 10,3% para as amostras de TOP2A normal (intervalo de 10% a 11%) e 9,3% para as amostras de TOP2A amplificado (intervalo de 5% a 12%).

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O coeficiente de variação médio de reprodutibilidade de observador para observador foi de 13,7% para as amostras de TOP2A eliminado (intervalo de 7% a 17%), 7% para as amostras de TOP2A normal (intervalo de 2% a 11%) e 12,7% para as amostras de TOP2A amplificado (intervalo de 10% a 15%).

Utilidade clínica A doxorrubicina e a epirrubicina são antraciclinas que se encontram entre os medicamentos anti-tumorais mais utilizados, tendo sido demonstrado que a topoisomerase IIα é o alvo molecular da acção farmacológica destes compostos (14, 15). Demonstrou-se que a doxorrubicina e a epirrubicina são eficazes numa série de doenças malignas diferentes, incluindo o cancro da mama, onde são utilizadas quer para a doença metastásica, quer no contexto adjuvante (15). Para o tratamento adjuvante do cancro da mama, os dados clínicos demonstraram que os regimes de quimioterapia que incluem doxorrubicina ou epirrubicina resultam numa melhoria da sobrevivência estatisticamente significativa em comparação com regimes que não contém antraciclinas (43, 44). O índice terapêutico das antraciclinas é reduzido e o aumento da eficácia dá-se às custas de uma maior toxicidade em comparação com outros regimes de quimioterapia como, por exemplo, o de CMF (ciclofosfamida/metotrexato/5-fluorouracil) (19, 45). Além da toxicidade aguda, o tratamento com doxorrubicina ou epirrubicina pode resultar em efeitos secundários a longo prazo de cardiotoxicidade e leucemia mielóide aguda (AML) secundária (6, 15). Frequentemente, a miocardiopatia induzida pela terapia é irreversível e pode desenvolver-se em insuficiência cardíaca congestiva vários meses ou anos após a conclusão do tratamento.

Para optimizar o tratamento médico com doxorrubicina e epirrubicina, é importante que os médicos disponham das ferramentas disponíveis para identificar os doentes com maiores probabilidades de beneficiar da terapia com doxorrubicina e epirrubicina. O desempenho clínico do kit TOP2A FISH pharmDx da Dako (referência K5333) foi investigado em dois estudos realizados pelo Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) em Copenhaga (21, 29, 30, 46).

Estudo piloto O desempenho clínico do kit TOP2A FISH pharmDx foi avaliado num estudo piloto em amostras de 120 doentes com cancro da mama (29) em colaboração com o DBCG. Um total de 20 tumores apresentou alterações no número de cópias de TOP2A, quase igualmente divididas entre amplificações (n=11) e eliminações (n=9). As alterações do TOP2A não foram detectadas exclusivamente em tumores HER2 positivos, uma vez que 4 tumores (20% dos casos de TOP2A anormal) eram HER2 negativos. Uma razão (sinais vermelhos/sinais verdes) igual ou superior a 2 discrimina entre casos amplificados e normais, enquanto uma razão inferior a 0,8 está associada à eliminação do gene. O estudo piloto demonstrou que 2 métodos de contagem diferentes originavam resultados idênticos: ou os sinais eram contados em 60 núcleos ou um total de 60 sinais vermelhos era contado juntamente com os sinais verdes nos mesmos núcleos. Este último método tem a vantagem de contar o maior número de células nos casos eliminados e normais, enquanto o menor número de células é contado nos casos amplificados. Frequentemente, os casos amplificados são de identificação óbvia pela mera observação pelo microscópio, mas exigem mais tempo para avaliar se os 60 núcleos deverão ser classificados.

Estudo de confirmação - DBCG 89D/TOP2A A uma maior escala, o desempenho clínico do kit TOP2A FISH pharmDx foi avaliado com base nas amostras de tumores colhidas prospectivamente pelo estudo adjuvante DBCG 89D (21, 30, 46, 47)

Concepção do estudo O objectivo primário do estudo DBCG 89D/TOP2A consistia em investigar se as aberrações (amplificação ou eliminação) do gene TOP2A poderiam servir como um marcador preditivo de sobrevivência sem recorrência e global em doentes com cancro da mama de elevado risco que se destinassem a tratamento com quimioterapia adjuvante baseada em epirrubicina. As propriedades de prognóstico das aberrações do gene TOP2A e a correlação entre TOP2A e HER2 foram estudadas enquanto objectivos secundários.

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O estudo DBCG 89D foi concebido como um estudo em aberto, prospectivo e aleatorizado. Após a cirurgia, 980 mulheres na pré e pós-menopausa com cancro da mama invasivo de elevado risco foram aleatorizadas para receber CMF ou CEF (ciclofosfamida/epirrubicina/5-fluorouracil). O resultado de eficácia primário foi a RFS (sobrevivência sem recorrência) com a OS (sobrevivência global) como parâmetro de avaliação final secundário. Para o sub-estudo biológico DBCG 89D/TOP2A, foram colhidos blocos de tecido das doentes que participaram no estudo DBCG 89D nos locais de estudo, tendo sido analisados central e retrospectivamente quanto a aberrações do gene TOP2A e HER2 (kit HER2 FISH pharmDx da Dako) e quanto à sobrexpressão do gene HER2 (Dako HercepTest™). Estavam disponíveis blocos de tecido de 806 das 980 doentes incluídas no estudo DBCG 89D.

Relativamente às aberrações do gene TOP2A e HER2, a razão foi calculada à medida que o número de sinais das sondas dos genes se dividiam pelo número de sinais do centrómero 17. Os casos foram classificados como FISH HER2 ou TOP2A amplificado quando a razão correspondia a ≥ 2. Considerou-se presente uma eliminação do TOP2A quando a razão correspondia a < 0,8.

O estado TOP2A foi categorizado nos seguintes grupos:

Eliminado: Razão TOP2A/CEN-17 < 0,8

Normal: 0,8 ≤ Razão TOP2A/CEN-17 < 2,0

Amplificado: Razão TOP2A/CEN-17 ≥ 2,0

Para o HercepTest™, todas as amostras positivas 1+, 2+ e 3+ foram submetidas a análise FISH HER2. A classificação de positividade para HER2 (48) no estudo foi a seguinte:

Positivo: HercepTest=3+ ou HercepTest=2+ e razão FISH HER2 ≥ 2,0

Negativo: HercepTest=0,1+ ou HercepTest=2+ e razão FISH HER2 < 2,0

O estudo clínico (DBCG 89D) e o sub-estudo biológico (DBCG 89D/TOP2A) foram realizados de acordo com a declaração de Helsínquia e aprovados pelas comissões de ética locais.

Metodologia estatística O parâmetro de avaliação final primário para o estudo foi a RFS, definida como o tempo decorrido desde a aleatorização até à ocorrência de um evento ou censura. O parâmetro de avaliação secundário foi a OS, definida como o tempo decorrido desde a aleatorização até à ocorrência de morte ou censura. O efeito do tratamento com CEF sobre CMF na RFS e na OS foi quantificado em termos da razão de perigo, estimada através do modelo de riscos proporcionais de Cox. O modelo de riscos proporcionais de Cox foi ajustado de acordo com os resultados dos procedimentos de boa qualidade do ajuste e da investigação de interacção, que definiram o modelo de multivariáveis de Cox básico para a análise de RFS e OS. A taxa de risco (HR), o intervalo de confiança de 95% e o valor p do teste de Wald foram fornecidos para cada covariável e termo de interacção do modelo de Cox. A HR para o tratamento com CEF vs. tratamento com CMF em cada subgrupo de TOP2A (e subgrupo de HER2) foi inferida a partir dos resultados e ilustrada num gráfico de Forrest. Depois de ajustado o modelo de riscos proporcionais de Cox relativo à RFS e OS de acordo com os resultados do procedimento de boa qualidade do ajuste e das investigações de interacção, realizaram-se 3 tipos de análises secundárias.

• Estimativa multivariáveis nos 3 subgrupos de TOP2A: Eliminado, Normal, Amplificado. • Estimativa multivariáveis nos 2 subgrupos de HER2: Negativo, Positivo. • Estimativa multivariáveis unificada para todas as doentes incluindo a interacção entre

TOP2A e HER2. As correlações entre o estado TOP2A e as variáveis clínicas e patológicas incluindo o estado HER2 foram testadas através do teste χ2.

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O tempo de seguimento foi quantificado em termos de uma estimativa de Kaplan-Meier do seguimento potencial. Realizaram-se análises quanto a um possível desvio de selecção utilizando o teste χ2 e o teste log-rank. As doentes com valores em falta, exceptuando o estado do receptor, foram excluídas das análises multivariáveis do modelo de riscos proporcionais de Cox.

Resultados A análise FISH TOP2A foi bem sucedida em 773 das 806 (96%) amostras de cancro da mama. A distribuição global do estado TOP2A entre as doentes elegíveis é apresentada na Tabela 1. Observou-se a amplificação do TOP2A em 92 (11,9%) das 773 doentes elegíveis e a eliminação em 87 (11,3%).

Tabela 1. Distribuição do estado TOP2A Estado TOP2A n (%)

Eliminado Normal

Amplificado

87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9)

Total 773 (100) A distribuição de amplificações e eliminações do TOP2A em relação ao estado HER2 é apresentada na Tabela 2.

Tabela 2. Distribuição do estado HER2 em relação ao estado TOP2A

TOP2A N n (%)

Eliminado

n (%)

Normal n (%)

Amplificado

n (%)

Valor p χ2

Estado HER2

Negativo 527 (100) 26 (4,9) 487 (92,4) 14 (2,7) p< 0,0001 Positivo 246 (100) 61 (24,8) 107 (43,5) 78 (31,7)

Total 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) Observando o estado HER2, foram detectadas mais aberrações do TOP2A entre os tumores HER2 positivos. Foram detectadas aberrações do TOP2A em 139 (56,5%) dos 246 tumores HER2 positivos e em 40 (7,6%) dos 527 tumores HER2 negativos. Assim, 40 (22,3%) doentes com aberrações do TOP2A teriam sido ignoradas se apenas tivessem sido analisadas as amostras de HER2 positivo. A distribuição das aberrações do TOP2A em relação ao estado FISH HER2 é apresentada na Tabela 3. Quanto ao estado HER2, foi detectada uma correlação significativa com o estado TOP2A. Tabela 3. Distribuição do estado FISH HER2 em relação ao estado TOP2A

TOP2A N n (%)

Eliminado n (%)

Normal n (%)

Amplificado

n (%)

Valor p χ2

FISH HER2

Normal 539 (100) 31 (5,8) 493 (91,5) 15 (2,8) p< 0,0001 Amplificad

o 234 (100) 56 (23,9) 101 (43,2) 77(32,9)

Total 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) A distribuição das aberrações do TOP2A em relação à classificação do HercepTest™ é apresentada na Tabela 4. Quanto ao estado HER2, foi detectada uma correlação significativa com o estado TOP2A.

Tabela 4. Distribuição da classificação do HercepTest™ em relação ao estado TOP2A

TOP2A N n (%)

Eliminado

Normal n (%)

Amplificado

Valor p χ2

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n (%) n (%) HercepTest

0 209 (100) 11 (5,3) 192 (91,9) 6 (2,9) p< 0,0001

1+ 257 (100) 13 (5,1) 238 (92,6) 6 (2,3) 2+ 78 (100) 3 (3,9) 65 (83,3) 10 (12,8) 3+ 229 (100) 60 (26,2) 99 (43,3) 70 (30,6) Total 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9)

Seis das 773 doentes com dados de TOP2A disponíveis tinham dados clínicos em falta que as excluíram das análises multivariáveis. Para as doentes com resultados do teste de TOP2A disponíveis, o tempo de seguimento potencial da RFS foi de 9,4 anos e o número de eventos correspondentes foi de 371. A média do tempo de seguimento potencial da OS foi de 11,1 anos e o número de eventos foi de 336. Os gráficos de Kaplan‑Meier para a RFS relativamente aos 2 grupos de tratamento de cada um dos 3 grupos de TOP2A são apresentados nas Figuras 2-4.

Figura 2. RFS das doentes tratadas com CMF e CEF que apresentavam tumores TOP2A amplificados

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Figura 3. RFS das doentes tratadas com CMF e CEF que apresentavam tumores TOP2A normais

Figura 4. RFS das doentes tratadas com CMF e CEF que apresentavam tumores TOP2A eliminados

Tanto no grupo de doentes com TOP2A amplificado como no grupo de TOP2A eliminado, o tratamento com CEF revelou-se superior ao CMF. Para as doentes com TOP2A amplificado, a diferença foi significativa (p=0,037). Não foi possível detectar uma tal diferença no grupo de doentes com TOP2A normal. Para o parâmetro de avaliação final primário (RFS), as análises que utilizaram o modelo de riscos proporcionais de Cox demonstraram um valor preditivo de aberrações do gene TOP2A significativo (p=0,016). O grupo de doentes com amplificações do TOP2A apresentou uma redução do risco relativa superior a 60% quando tratado com CEF em comparação com o CMF (HR=0,389, Valor p=0,0017). Também se detectou uma redução do risco para as eliminações do TOP2A, não entanto, não foi estatisticamente significativa (HR=0,608, Valor p=0,0828). Na Figura 5 é apresentado o efeito relativo do CEF em cada um dos subgrupos de TOP2A e HER2 relativamente à RFS.

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Figura 5. Efeito relativo do CEF em cada um dos subgrupos de TOP2A e HER2 quanto à RFS (gráfico de Forrest).

Para a OS, foram demonstrados resultados semelhantes, mas não significativos (p=0,14). As doentes com amplificações do TOP2A apresentaram uma redução do risco superior a 50% quando tratadas com CEF em comparação com o CMF (HR=0,485, p=0,0142). Quanto à RFS, detectou-se uma redução do risco não significativa para as eliminações do TOP2A (HR=0,678, Valor p=0,155). Na Figura 6 é apresentado o efeito relativo do CEF em cada um dos subgrupos de TOP2A e HER2 relativamente à OS.

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Figura 6. Efeito relativo do CEF em cada um dos subgrupos de TOP2A e HER2 quanto à OS (gráfico de Forrest).

O valor preditivo do estado HER2 também foi investigado e os dados não demonstraram qualquer efeito significativo relativamente a interacções de tratamento, nem para a RFS nem para a OS. Uma análise da distribuição das aberrações do TOP2A relativamente às características da linha de base demonstrou uma associação significativa a vários factores de prognóstico histopatológico estabelecidos. Além disso, os dados demonstraram que a proporção de mulheres com aberrações do TOP2A aumentava com a idade, resultando numa maior frequência entre as mulheres na pós-menopausa do que na pré-menopausa. As análises de sobrevivência de variável única indicaram um efeito negativo significativo na RFS e na OS, à medida que as doentes com amplificações e eliminações apresentavam uma redução significativa da sobrevivência em comparação com as doentes com um estado TOP2A normal. As curvas de sobrevivência também indicaram que as doentes com eliminações apresentavam um prognóstico ainda pior do que as doentes com um estado TOP2A amplificado ou normal. As curvas de sobrevivência para as doentes com estado TOP2A amplificado, normal ou eliminado são apresentadas na Figura 7.

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Figura 7. Estado TOP2A relativamente à RFS e OS (N=767) Para além da associação aos factores de prognóstico clínico estabelecidos, demonstrou-se que as aberrações do TOP2A apresentavam um valor de prognóstico independente. Utilizando o modelo de riscos proporcionais de Cox, demonstrou-se que uma aberração do gene TOP2A estava associada a um prognóstico significativamente pior relativamente à RFS (p=0,0169) e OS (p=0,0118). A HR e os limites de confiança de 95% baseados no modelo de Cox para a RFS e OS são apresentados na Tabela 5 e 6.

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Tabela 5. HR para a RFS – TOP2A e interacção de tratamento incluídos

Variável Valor p HR IC de 95% Menopausa Pré Pós

0,0576 1

1,26

(0,99–1,60)

Tamanho do tumor antes do aumento cm

<0,0001 1,15

(1,09–1,22)

Nódulos linfáticos positivos 0 1-3 4-

<0,0001 1

2,01 4,16

(1,39–2,91) (2,88–6,02)

Estado TOP2A Eliminado Normal Amplificado

0,0169 1,66

1 1,56

(1,12–2,45)

(1,00–2,42)

Estado HER2 Negativo Positivo

0,2998 1

1,15

(0,88–1,49)

Tabela 6. HR para a OS – TOP2A e interacção de tratamento incluídos

Variável Valor p HR IC de 95% Menopausa Pré Pós

0,0124 1

1,37

(1,07–1,75) Tamanho do tumor antes do aumento cm

<0,0001 1,16

(1,10–1,23)

Nódulos linfáticos positivos 0 1-3 4-

<0,0001 1

2,62 5,50

(1,70–4,04) (3,58–8,45)

Estado TOP2A Eliminado Normal Amplificado

0,0118 1,82

1 1,37

(1,22–2,71)

(0,87–2,16)

Estado HER2 Negativo Positivo

0,0519 1

1,31

(1,00–1,72) Quando as HR das diferentes variáveis da Tabela 5 (RFS) são classificadas relativamente ao valor de prognóstico, a lista apresenta-se do seguinte modo: número de nódulos linfáticos positivos > estado TOP2A > estado da menopausa > estado HER2 e tamanho do tumor. Tal como indicado por esta classificação, o número de nódulos linfáticos positivos é a variável com maior impacto de prognóstico, seguida do estado TOP2A, o estado da menopausa, o tamanho do tumor e o estado HER2. Caso se repetisse a classificação para a OS (Tabela 6), os resultados seriam semelhantes aos da RFS, indicando um valor de prognóstico acentuado para o estado TOP2A. O valor de prognóstico do estado HER2 também foi investigado e as análises de sobrevivência de variável única indicaram um efeito negativo significativo na RFS e na OS, à medida que doentes com HER2 positivo apresentavam uma redução na sobrevivência em comparação com doentes

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com um estado HER2 normal. A análise primária da RFS utilizando a análise de regressão de riscos proporcionais de Cox não demonstrou qualquer efeito significativo no estado HER2. Ao repetir a análise relativamente à OS, o estado HER2 positivo apresentou um impacto negativo significativo na sobrevivência.

Discussão e conclusão O estudo DBCG 89D/TOP2A demonstrou um valor preditivo e de prognóstico significativo de aberrações do gene TOP2A. Com base nas comparações com o estado HER2, pode concluir-se que o estado HER2 e o estado TOP2A não são intercambiáveis quanto ao valor preditivo nem quanto ao valor de prognóstico.

TOP2A é o alvo molecular da acção farmacológica da epirrubicina e o estudo demonstrou que uma aberração do gene TOP2A, especialmente no caso das amplificações, é útil enquanto marcador preditivo da resposta a epirrubicina. A quimioterapia baseada em antraciclinas com doxorrubicina ou epirrubicina encontra-se entre os regimes mais activos para o cancro da mama. No entanto, estes compostos têm efeitos secundários agudos e de longo prazo graves, como a cardiotoxicidade e a leucemia.

Estudo comparativo entre o kit TOP2A FISH pharmDx e TOP2A IQFISH pharmDx O TOP2A IQFISH pharmDx da Dako (referência K5733) foi comparado com o kit TOP2 FISH pharmDx da Dako (referência K5333) num estudo de comparação com 80 amostras de tecido da mama para carcinoma da mama humano. A tabulação cruzada do estado do gene TOP2A obtida pelos dois ensaios apresentou uma concordância global de 100%, com limites inferior e superior para o intervalo de confiança de 95% correspondentes a 96,9% e 100%. O valor kappa foi de 1.

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Resolução de problemas Problema Causa provável Acção sugerida 1. Ausência de

sinais ou sinais fracos

1a. O kit foi exposto a temperaturas elevadas durante o transporte ou a conservação.

1a. Verificar as condições de conservação. Verificar a presença de gelo seco aquando da recepção do envio. Certificar-se de que o Frasco 3 foi conservado a -18 °C em local escuro. Certificar-se de que os frascos 2A e 5 foram conservados, no máximo, a 2–8 °C e que os frascos foram guardados num local escuro.

1b. O microscópio não funciona devidamente

- Aparelho de filtro inapropriado

- Lâmpada inapropriada - Lâmpada de mercúrio

demasiado antiga - Lente do colector suja e/ou

rachada - Óleo de imersão

inadequado

1b. Examinar o microscópio e verificar se os filtros utilizados são próprios para usar com os fluorocromos do kit, e se a lâmpada de mercúrio é correcta e não está a ser utilizada para além do seu prazo de validade. (consultar o Apêndice 3). Em caso de dúvida, contactar o vendedor do microscópio.

1c. Sinais fracos

1c. Evitar exames prolongados no microscópio e minimizar a exposição a fontes de luz fortes.

1d. Condições de pré-tratamento incorrectas

1d. Certificar-se de que está a utilizar a temperatura e tempo de pré-tratamento recomendados.

1e. Evaporação da Mistura de sondas durante a hibridização

1e. Certificar-se de que a câmara de hibridização tem humidade suficiente

2. Ausência de sinais verdes

2a. Condições da lavagem adstringente incorrectas

2a. Certificar-se de que está a utilizar a temperatura e o tempo correctos para a lavagem adstringente e de que as lamelas são removidas antes de efectuar a lavagem adstringente

3. Ausência de sinais vermelhos

3a. Condições de pré-tratamento incorrectas

3a. Certificar-se de que está a utilizar a temperatura e tempo de pré-tratamento recomendados

4. Áreas sem sinais 4a. Volume da sonda demasiado reduzido

4a. Certificar-se de que o volume da sonda é suficiente para cobrir a área sob a lamela

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Problema Causa provável Acção sugerida 4b. Bolhas de ar retidas durante

a aplicação ou montagem da Mistura de sondas

4b. Evitar a formação de bolhas de ar. Caso tal aconteça, dar pancadas leves com um fórceps

5. Coloração de fundo excessiva

5a. Fixação inapropriada do tecido

5a. Certificar-se de que apenas são utilizadas secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina

5b. A parafina não foi completamente removida

5b. Seguir os procedimentos de desparafinação e reidratação delineados na Secção B.2

5c. Temperatura da lavagem adstringente demasiado baixa

5c. Certificar-se de que a temperatura da lavagem adstringente é de 63 (±2) °C

5d. Exposição prolongada da secção hibridizada a luz forte

5d. Evitar exames prolongados no microscópio e minimizar a exposição a fontes de luz fortes

6. Morfologia do tecido fraca

6a. Tratamento da pepsina incorrecto

6a. Cumprir os tempos de incubação recomendados para a pepsina. Consultar a secção B.3, Etapa 2.

Certificar-se de que a pepsina é manuseada à temperatura correcta. Consultar a secção B.1

6b. Condições de pré-tratamento incorrectas podem resultar num aspecto indistinto ou turvo

6b. Certificar-se de que está a utilizar a temperatura e tempo de pré-tratamento recomendados

6c. O tratamento demasiado prolongado com pepsina ou a espessura demasiado fina das secções pode causar o aparecimento de células fantasma ou células de forma anelar.

6c. Reduzir o tempo de incubação da pepsina. Consultar a secção B.3, Etapa 2. Certificar-se de que a espessura da secção é de 4–6 µm

7. Elevado nível de autofluorescência verde na lâmina incluindo áreas sem tecido FFPE

7. Utilização de lâminas de vidro fora do prazo de validade ou não recomendadas

7. Certificar-se de que a lâmina de vidro revestida (Dako Silanized Slides, referência S3003) ou as lâminas revestidas com poli-L-lisina não ultrapassaram o prazo de validade.

NOTA: Contactar o Serviço Técnico da Dako e solicitar assistência caso não seja possível atribuir o problema a uma das causas acima indicadas ou se a acção de correcção sugerida não solucionar o problema.

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Apêndice 1 TOP2A IQFISH pharmDx, referência K5733 Lista de verificação do protocolo

Identificação do registo do ensaio de coloração:______________

Data do processamento: __________________

TOP2A IQFISH pharmDx, K5733 Lote: ____________

Identificação da amostra:

Identificação do equipamento:

Data da diluição/prazo de validade do Tampão de lavagem 1 x (Frasco 6 diluído a 1:20): /

Tecido fixado em formol tamponado neutro Sim □ Não □

Etapa 1: Pré-tratamento Data da diluição/prazo de validade da Solução de pré-tratamento (Frasco 1 diluído

a 1:20) /

Temperatura medida da Solução de pré-tratamento (95–99 °C) °C Pré-tratamento (10 minutos) e arrefecimento (15 minutos) Lavar em Tampão de lavagem (Frasco 6 diluído a 1:20) (2 x 3 minutos) Etapa 2: Pepsina

Duração do tratamento com Pepsina (Frasco 2) a 37 °C ou Minutos Duração do tratamento com pepsina (Frasco 2) à temperatura ambiente ou Minutos Duração da imersão em Pepsina a 37 (±2) °C Minutos Lavar em Tampão de lavagem (Frasco 6 diluído a 1:20) (2 x 3 minutos) Desidratar as lâminas (3 x 2 minutos) fazendo-as passar por uma série de

concentrações de etanol e deixar secar ao ar

Etapa 3: Mistura de sondas TOP2A/CEN-17 IQISH

Aplicar a Mistura de sondas (Frasco 3), cobrir com a lamela e selar com vedante de lamelas

Temperatura de desnaturação medida (66 ±1 °C) °C Desnaturação durante 10 minutos Temperatura de hibridização medida (45 ±2 °C) °C Hibridização de um dia para o outro (proteger da luz) Etapa 4: Lavagem adstringente Data da diluição/prazo de validade do Tampão de lavagem adstringente (Frasco 4

diluído a 1:20) /

Temperatura medida do Tampão de lavagem adstringente (63 ±2 °C) °C Lavagem adstringente (10 minutos) após a remoção das lamelas Lavar em Tampão de lavagem (Frasco 6 diluído a 1:20) (2 x 3 minutos) Desidratar as lâminas (3 x 2 minutos) fazendo-as passar por uma série de

concentrações de etanol e deixar secar ao ar

Etapa 5: Montagem

Aplicar 15 µL de Meio de montagem de fluorescência (Frasco 5) e cobrir com lamela

Comentários:

Data e assinatura do técnico:

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Apêndice 2 TOP2A IQFISH pharmDx, referência K5733 Esquema de registo Identificação do registo do ensaio de coloração: _________

Data do processamento: __________________

TOP2A IQFISH pharmDx, K5733 Lote: __________ Identificação da amostra: ______________ Núcleo

n.º Classificação

de TOP2A Classificação

de CEN-17 Núcleo

n.º Classificação

de TOP2A Classificação

de CEN-17 Núcleo

n.º Classificação

de TOP2A Classificação

de CEN-17

1 21 41

2 22 42

3 23 43

4 24 44

5 25 45

6 26 46

7 27 47

8 28 48

9 29 49

10 30 50

11 31 51

12 32 52

13 33 53

14 34 54

15 35 55

16 36 56

17 37 57

18 38 58

19 39 59

20 40 60

Total (1-20) Total

(21-40) Total (41-60)

Para a determinação da razão TOP2A/CEN-17, contar o número de sinais de TOP2A e o número de sinais de CEN-17 em 60 núcleos ou o número de núcleos necessário para alcançar 60 sinais de TOP2A (consultar a secção de Interpretação da coloração). Dividir o número total de sinais de TOP2A pelo número total de sinais de CEN-17. Se a razão TOP2A/CEN-17 se encontrar no limite aceitável (0,7–0,9 ou 1,8–2,2), contar novamente a amostra e recalcular a razão com base em todas as células contadas.

Número de células contadas Sinais de TOP2A Sinais de CEN-17 Razão TOP2A/CEN-17

Eliminação do gene TOP2A (Razão < 0,8) Estado do gene TOP2A normal (0,8 ≤ Razão < 2)

Amplificação do gene TOP2A (Razão ≥ 2) Data e assinatura do técnico: Data e assinatura do patologista:

Comentários: _____________________________________________________ Para as orientações relativas ao registo: consultar a Interpretação da coloração.

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Apêndice 3 TOP2A IQFISH pharmDx, referência K5733 Especificações sobre o microscópio de fluorescência A Dako recomenda que se utilize o seguinte equipamento com o TOP2A IQFISH pharmDx, K5733: 1. Tipo de microscópio • Microscópio de epifluorescência.

2. Lâmpada • Lâmpada de mercúrio de 100 watts (manter um registo sobre o tempo de iluminação).

3. Objectivas • Para a análise do tecido, devem aplicar-se objectivas secas de fluorescência a 10X ou de imersão em óleo de fluorescência a 16X. • Para a ampliação a alta potência e registo de sinais, recomendam-se apenas objectivas de imersão em óleo de fluorescência, por exemplo, 100X.

4. Filtros Os filtros são individualmente concebidos para fluorocromos específicos e devem ser seleccionados conformemente. A Dako recomenda a utilização de um filtro DAPI específico, em combinação com um filtro duplo Texas Red/FITC de alta qualidade. • Filtro DAPI • Filtro duplo Texas Red/FITC • Podem ser utilizados filtros Texas Red e FITC individuais para confirmação.

Fluorocromo Comprimento de onda de excitação

Comprimento de onda de emissão

FITC 495 nm 520 nm

Texas Red 596 nm 615 nm

Os filtros são concebidos especificamente para cada tipo de microscópio, sendo a utilização de filtros apropriados essencial para a interpretação. Caso deseje obter informações detalhadas, o cliente deverá contactar o fornecedor do microscópio ou o representante da Dako.

5. Óleo • Óleo não fluorescente.

Precauções • Não se recomenda a utilização de uma lâmpada de mercúrio de 50 watts. • Não é possível utilizar filtros de rodamina. • Não se recomendam filtros triplos. Os microscópios não optimizados podem causar problemas durante a leitura de sinais fluorescentes. É importante que a fonte de luz não tenha ultrapassado o prazo de validade e que se encontre devidamente alinhada e focada. O cliente deve monitorizar e seguir as recomendações do fabricante relativamente à lâmpada de mercúrio. O microscópio deve ser mantido em condições e a lâmpada de mercúrio deve estar alinhada antes da interpretação dos resultados. Deve fazer-se um esforço para expor a amostra ao mínimo de luz de excitação possível a fim de minimizar o enfraquecimento da fluorescência. Recomendamos que o cliente discuta a preparação do seu microscópio específico com o fabricante antes de iniciar o processo de hibridização in situ fluorescente ou que consulte a literatura correspondente.

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Explicação dos símbolos Número de catálogo

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Utilizar até

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