TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Prof. Victor Pessoa.
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TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Prof. Victor Pessoa
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
* O DNA era o componente celular mais difícil de ser analisado
(sequência de nucleotídeos de enorme tamanho e monotonia química
era geralmente analisada por meios indiretos como a sequência de
proteínas); * A partir da década de 70, novas tecnologias foram desenvolvidas
permitindo o isolamento e a purificação de genes específicos num
processo chamado de CLONAGEM GÊNICA (muitas dessas técnicas
são provenientes da Microbiologia, Bioquímica, Imunologia e Genética
Microbiana - permitiram que a análise do DNA ganhasse um novo
enfoque).
* A TECNOLOGIA DO DNA
RECOMBINANTE, como se
convencionou denominar este
conjunto de técnicas, tem uma
ampla aplicação:
a)Estudar mecanismos de
replicação e expressão gênica,
b)Determinar da sequência de um
gene e, consequentemente, da
proteína que ele codifica, ou no
desenvolvimento de culturas
microbianas capazes de produzir
substâncias úteis tais como a
insulina humana, hormônio de
crescimento, vacinas e enzimas
industriais em grandes quantidades.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO* Em 1953 foi descrito um estranho fenômeno no qual a eficiência da
replicação de um bacteriófago (vírus de bactérias) dependia da célula
hospedeira na qual ele estava inserido (percebeu-se que a inabilidade
de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas era
devido a presença de NUCLEASES altamente específicas que clivavam
o seu DNA).* As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são
divididas em várias classes (estrutura, atividade, sítios de
reconhecimento e clivagem);
* As enzimas do Tipo II (mais importantes na Tecnologia do DNA
Recombinante) são proteínas que clivam o DNA no mesmo sítio do seu
reconhecimento (o sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é
normalmente uma sequência palindrômica.
Clivagem no eixo de simetria
Clivagem simetricamente situada ao redor do eixo de simetria
Moléculas com extremidades abruptas Moléculas com extremidades
coesivasPodem se ligar, por complementaridade,
a outro DNA (DNA ligase)
A primeira letra representa
o gênero e as outras duas a
espécie, seguido de um
algarismo romano (ou outra
letra) que indica a ordem da
descoberta ou a linhagem
da qual ela foi isolada. Por
exemplo, a enzima de
restrição denominada de
EcoRI é purificada de uma
Escherichia coli que carrega
um fator de transferência de
resistência RI, enquanto que
a Hind III é isolada da
Haemophilus influenzae,
linhagem d III.
* Os fragmentos gerados por
digestão com enzima de restrição
são geralmente detectados pela
separação destes fragmentos por
ELETROFORESE EM GEL DE
AGAROSE. Os fragmentos migram
em função de seus pesos
moleculares, sendo que os
menores migram mais
rapidamente.
CONSTRUÇÃO DE UM DNA RECOMBINANTE
1 - Uma enzima de restrição particular reconhece somente uma
sequência única de bases;
2 - DNAs de origem diferente, sob a ação da mesma enzima de
restrição, produzem fragmentos com o mesmo conjunto de
extremidades fitas simples (portanto, fragmentos de dois diferentes
organismos - por exemplo, bactéria e homem - podem ser ligados por
renaturação das regiões de fita simples;
3 – Ligação dos fragmentos por meio da enzima DNA ligase (ligação
permanente).
Esquema representativo da
construção de uma molécula
de DNA recombinante
Construção de uma molécula de DNA recombinante portando o
gene humano da insulina a ser expresso em bactéria (produção em
larga escala)
VETORES DE CLONAGEM
* Após o isolamento de um determinado gene, obtido pela clivagem
com enzimas de restrição, este fragmento de DNA deverá ser inserido
numa outra molécula de DNA diferente, capaz de amplificar esta
informação genética em centenas de cópias. Este processo de
amplificação é obtido através do uso de moléculas de DNA que são os
chamados vetores de clonagem molecular.
PLASMÍDEOS = pequenas moléculas de DNA circular de fita dupla, presentes em algumas bactérias
BACTERIÓFAGOS OU FAGOS = desoxirribovírus (vírus de DNA) que infectam bactérias
Sítios de clivagem pelas enzimas
de restrição
Origem de replicação (sequência de DNA
que permite que o vetor seja replicado na
célula hospedeira)
gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina, o
qual distingue a célula transformada da célula não
transformada. As células transformadas com tais
vetores são capazes de crescer num meio contendo o
antibiótico, enquanto que as células não tranformadas
acabam morrendo.
Replicação do fago no interior da célula hospedeira. Após adsorção
(1) e injeção (2) do genoma do fago na bactéria, a via lítica indicada
pelos números 3, 4 e 5 leva a formação de novas partículas virais.
Alternativamente, a via lisogênica (6) pode ser ativada levando à
integração do material genético viral ao genoma da bactéria
hospedeira.
APLICAÇÕES DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBIANTE
* PCR – Polymerase chain-reaction (reação em cadeia da
polimerase)* Eletroforese
* DNA Fingerpinting
* Organismos geneticamente modificados e transgênicos
PCR – POLYMERASE CHAIN-REACTION (REAÇÃO EM CADEIA
DA POLIMERASE)
* A reação em cadeia da polimerase (PCR – sigla em inglês)
consiste em um método de amplificação de DNA (múltiplas cópias)
sem o uso de organismos vivos, bactérias ou leveduras, por exemplo.
* Não requer necessariamente o uso de radioisótopos ou outros
compostos tóxicos / envolve, essencialmente, a preparação de uma
mistura contendo uma amostra de DNA a ser amplificada e primers
(iniciadores) específicos;* Etapas:
1 – Desnaturação da dupla-hélice de DNA;
2 – Hibridização dos primers às fitas de DNA separadas;
3 – Polimerização (extensão) da fita complementar de DNA.
ELETROFORESE
* Eletroforese é a técnica pela qual fragmentos de DNA de diferentes
tamanhos, obtidos com o uso de enzimas de restrição, são separados
em um gel de agarose.1 - O DNA (amostra) é posto em um poço do gel de agarose;
2 – Amostra submetida a um campo elétrico;
3 – Migração do DNA na direção do pólo positivo (uma vez que a
molécula de DNA é negativa devido à presença de grupamentos
de fosfato);
4 – Separação dos fragmentos de acordo com o peso molecular
deste (quanto maior, mais lenta a migração e vice-versa).
Animação eletroforese
Perfil eletroforético dos lotes de mosquitos procedentes de bairros da
cidade de Fortaleza (janeiro de 2006 a março de 2009), e do Parque
Adahil Barreto (julho de 2007). [1 – Marcador de peso molecular (100
bp DNA ladder); 2, 3, 4, 5, 6 e 9 – lotes negativos para vírus dengue; 7
– Lote 35 exibindo banda de aproximadamente 290 pb (DENV-3); 8 –
Lote 35 exibindo banda de aproximadamente 119 pb (DENV-2); 10 –
Lote 34 exibindo banda de aproximadamente 290 pb (DENV-3); 11 –
Lote 35 exibindo bandas de aproximadamente 119 pb e 290 pb
(DENV-2 e DENV-3, respectivamente); 12 – Controle negativo; 13 –
Controle positivo