Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição de...
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Enzimas de restrição ou Enzimas de restrição ou endonucleasesendonucleases de restrição de de restrição de
tipo IItipo IIDescoberta
Sistemas de modificação restriçãoComo actuam
Aplicações
Lise de bactérias após infecção fágica
Sistemas de Restrição-Modificação
Modificação e restrição de um vírus, controlado pel o hospedeiro
X
Y
X
X Y
YY
YX
X
X
Modificação do DNA Modificação do DNA METILAÇÃOMETILAÇÃO
2) Principal dador dos grupos metilo: SAM (S-adenos il metionina)
1) Modificação do DNA- METILAÇÃO
SAM
S-adenosil-homocisteína
Homocisteína
Metionina
H2OCH3
ATP CH3 activo
Exemplo de Exemplo de metilaçãometilação
MetilaçõesMetilações mais frequentesmais frequentes
• m6A- N6-metiladenina• m5C- C5-metilcitosina• m4C- N4-metilcitosina• hm5C- C5-hidroximetilcitosina
Tipo I- ex sistema EcoKI, que só clivam DNA NÃO METILADOTipo II- consoante a enzima podem clivar DNA METILADO ou NÃO METILADOTipo III
Sistemas de Restrição-Modificação
Sistemas de Modificação (metilases sítio-específicas)
Dam (N6) G*ATCDcm (C5) C*CAGG e C*CTGG
Só METILAM
Sistemas de Restrição (endonucleases)
McrA- C*CGGMcrB- G*CMrr- C*AC e C*AG
Só clivam sequências METILADAS
Características das enzimas dos Sistemas de Características das enzimas dos Sistemas de ModificaçãoModificação --RestriçãoRestrição
de tipo I, II e IIIde tipo I, II e III
Sequências de reconhecimentoSequências de reconhecimentodas enzimas de restriçãodas enzimas de restrição
Tipo I
EcoAI GAGNNNNNNNGTCAEcoKI AACNNNNNNGTGCStySPI AACNNNNNNGTRC
Tipo II
EcoRI G/AATTCBalI TGG/CCAPstI CTGCA/G
Tipo III
EcoP151 CAGCAGEcoPI AGACCHinfIII CGAAT
Locais de corte, se^quências de reconhecimento, loca is de restrição
N- A, C, G ou T; R- G ou A
Corte na, ou muito próximo da sequência de reconhecimento que é PALINDRÓMICA e de 4 a 8 pb
Corte na mais de 1000 pb da sequência dereconhecimento que é bipartida e assimétrica
Corte a 24-26 pb a jusante da sequência dereconhecimento que é assimétrica e de 5 a 7 pb
PalíndromosPalíndromos
RADAR
MADAM IN EDEN I’AM ADAM
ESOPE RESTE ICI ET SE REPOSE
5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’
Endonucleases de tipo II
• AccI Acinetobacter calcoaceticus• AluI Arthrobacter luteus• BamHI Bacillus amyloliquefaciens H• EcoRI Escherichia coli• HaeIII Haemophilus aegyptius• Sau3AI Staphylococcus aureus 3A
Type II restriction enzymes
Natureza das extremidades geradas após corte com as enzimas de restrição, é determinada pelo lado da ligação fosfo diéster onde ocorre o
corte
3’-OH5’-P
Resultado da digestão do DNA com diferentes enzimas de Resultado da digestão do DNA com diferentes enzimas de restriçãorestrição
Extremidades cegas e coesivas (ou salientes)
Extremidades 5’ e 3’projectadas
As mesmas extremidades coesivas, produzidas pordiferentes enzimas de restrição
a 5’ do eixo de simetria a 3’ do eixo de simetria
Sistema de Sistema de modificaçãomodificação --restriçãorestrição das enzimas de tipo das enzimas de tipo IIII
(Exemplo)
A metilase de EcoRI (M.EcoRI), cataliza a transferência de grupos metilo de
SAM para as adeninas marcadas com * na sequência de reconhecimento
A enzima de restrição cliva na sequência de reconhecimento:
A modificação da adenina (A*) para 6-metiladenina, protege o DNA da
clivagem pela EcoRI
…aactGAATTCtcgac……ttga CTTAAGagctg…
…aactG AATTCtcgac……ttga CTTAA Gagctg…
…aact G A * A T T C tcgac……ttga C T T * A A G agctg…
Sistema de Sistema de ModificaçãoModificação --RestriçãoRestriçãoTipo ITipo I -- sistema sistema EcoKEcoK
HsdM DNA metilaseMetila na sequência AN6ACNNNNNNGTGC ou GCN6ANNNNNNGTTO DNA isolado numa estirpe hsdM- é clivado num hospedeiro HsdR
HsdR Enzima de restriçãoA ausência desta actividade permite a entrada de DNA propagado em estirpes ou fontes que não E. coli
HsdS Determinante da especificidade de HsdM e HsdRA mutação HsdS elimina a actividade de HsdM e HsdR
Enzimas de Tipo I ligam-se à sequência alvo, metila ndo-a, ou clivando o DNA, consoante o estado de metilação dest e
Cliva DNA não metilado
GenótiposGenótipos e e fenótiposfenótipos de de mutantesmutantes hsdhsd no sistema no sistema EcoEcoKK
GENÓTIPOFENÓTIPO
hsdS hsdR hsdM
+
++
+++
+
++-
--
r- m-
r- m-
r- m+
r+ m+
A subunidade HsdM é indispensável à função de restri ção por HsdR
Sistema de ModificaçãoSistema de ModificaçãoMetilaçãoMetilação DamDam
1- Enzimas de restrição de tipo II (ex.), bloqueadas por metilação Dam
ClaI G*ATCGAT
XbaI TCTAG*ATC
MboI G*ATC
Metilação Dam: G m6ATC (grupo metilo na posição N6 da adenina: N6-metiladenina )
2- Enzimas de restrição de tipo II (ex.), não bloqueadas por metilação Dam
BamHI GG*ATCC
PvuI CG*ATCG
Sau3AI G*ATCA negrito - a sequência de reconhecimento da enzima de restrição de tipo II
Uma sequência de DNA pode sofrer diferentes metilações, adquirindo diferentes padrões de metilação , consoante a especificidade das metilases da célulaEx.
Gm6ATC (Dam)GATm5CGATm4CGAThm5C
As enzimas de restrição podem apresentar diferentes sensibilidadesaos diversos padrões de metilaçãoEx: Sau3A1
CLIVA NÃO CLIVAGm6ATC
GATm5CGATm4CGAThm5C
Diferentes Diferentes padrões de padrões de metilaçãometilaçãovsvs
diferentes sensibilidadesdiferentes sensibilidades de clivagemde clivagem
Enzimas de restrição tipo II, Enzimas de restrição tipo II, com diferente sensibilidade à com diferente sensibilidade à metilaçãometilação
DpnII não CLIVA CLIVA DpnI
GATC Gm6ATC GATCCTAG CTm6AG CTAG
Sau3AI CLIVA
GATC Gm6ATCCTAG CTm6AG
DpnI só corta sequência de reconhecimento quando metiladaDpnII “ “ “ “ “ “ não metiladaSau3AI “ “ “ “ “ metilada e não metilada
CLIVA
DpnI DpnII GATC
SÓ CLIVA NÃO CLIVA
GATC G*ATC
Metilase
GAT C
Protecçãoda
Restrição
NÃOCLIVA
As estirpes de Diplococcus pneumoniae que produzem DpnI e DpnII terão que possuir padrões de metilação adequados à protecção da restriçãopor cada uma destas enzimas
G*AT C
Aplicação das enzimas de restrição de tipo II
DNA cloning
• One of the most important goals of recombinant DNA technology is to clone a particular gene of interest or otherDNA fragment of interest
• The approach used to clone a specific gene, depends to a largedegree on:– the gene– what is known about it– objective
• Among the several tools needed for cloning, lets consider :– restriction enzymes– vector DNA– DNA ligase– host cell
DNA cloning...
Isolating and cloning a DNA fragment
Construction of a recombinant DNA molecule
Reacção de ligação entre duas moléculas de DNA
VECTORS
• Central component of gene cloning experiments
• Two types of naturally ocurring DNA molecules:– Plamids – Bacteriophages
• Properties– Self-replicating– Unique restriction enzymes cleavage sites– Selectable marker– Easy to recover
Marcas importantes de um Marcas importantes de um plasmídioplasmídio
Marca de resistência a um antibiótico para o qual a estirpehospedeiro é sensível
Clones de um Clones de um plamídioplamídio recombinanterecombinante
Bacteria cell transformation
• Introduction of recombinant DNA molecules into a host(ex. E. coli)
• Different procedures: – inducing competence (CaCl2, MgCl2, Licl)– electroporation
Transformed cells are isolated inSELECTION MEDIA
(a) Introduction of free DNA into bacterial cells (TRANSF ORMATION)
Competent bacterial cells + Recombinant DNA plasmid
SELECTION MEDIA
Recombinant DNA clones
Each colony, a large number of cells, results from one initial single cell
Cell divides and vectors are passed to progeny
Each colony is a CLONE, ie, contains identical copies of recombinant DNA molecules
Ex. ANTIBIOTIC selection ofplasmid DNA (recombinant and non-recombinant)
Non-recombinant DNA plasmid .Bacteria cells harbouring this plasmidwill grow, but won’t be recombinant clones
Within the host, vector directs the copy number of recombi nant DNA molecules.
Características dos hospedeirosCaracterísticas dos hospedeirosvsvs
metilaçãometilação
Ex.DNA recombinante amplificado numa estirpe Dam G*ATC
G*ATC G*ATC
CT*AG CT*AG
MboI GATC não cliva G*ATCCTAG sequências metiladas CT*AG
Sau3AI GATC cliva G*ATCCTAG sequências metiladas CT*AG
Características dos hospedeirosCaracterísticas dos hospedeirosvsvs
metilaçãometilação
Ex.DNA humano *CpG
Clonagem em estirpes (mutantes em Sistemas de Restrição)
mcrA - McrA- C m5CGG
mcrBC - McrBC- G m5CGh5CGN4C
IsoesquizómerosIsoesquizómeros1- Reconhecem a mesma sequência e clivam nos mesmos locais
AccIII TCCGGAAGGCCT Extremidades compatíveis com
XmaIBspEI TCCGGA
AGGCCT CCCGGGGGGCCC
2- Reconhecem a mesma sequência mas clivam em locais diferentes
Acc65I GGTACC XmaI CCCGGGCCATGG GGGCCC
KpnI GGTACC SmaI CCCGGGCCATGG GGGCCC
3- Reconhecem a mesma sequência mas apresentam diferente sensibilidade à metilação
DpnII e MboI não clivam G*ATC metilado vs Sau3AI cliva G*ATC metilado
DpnI cliva G*ATC metilado vs MboI não cliva G*ATC não metilado e ainda clivam emlocais diferentes
MspI e HpaII são isoesquizómeros , mas HpaII é bloqueada pela metilação em CG, realizada nos mamíferos e pelas enzimas de modificação Dcm.
MspI- não é sensível à metilação, Dcm ou metilação CpG dos mamíferos, ie, Cm5CGG. No entanto não cliva em m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG e hm5Chm5CGG
HpaII- não cliva em Cm5CGG, m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG e hm5Chm5CGG
Posso amplificar DNA humano numa estirpe de E. coli mcrA - e mcrBC -
e posteriormente clivá-lo com MspI? E com HpaII? Porquê?
Metilação em organismos eucariotas- um outro significado biológico
• Mto variável consoante o organismo em causa. Ex. Drosophila- DNA não metilado
• Geralmente a metilação está associada a mecanismos de silenciamento génico
REGULAÇÃO EPIGÉNICAAlteração da expressão génica que não se deve a alterações na sequênciade DNA, mas a algo que “a somar à sequência de DNA”, influi a expressãogénica, como seja:
- modificação de bases- factores proteicos que se ligam ao DNA