REAÇÃO DA POLIMERASE REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA - PCREM CADEIA - PCR

Polymerase Chain Reaction

O QUE É PCR?O QUE É PCR?

É uma metodologia que se baseia na É uma metodologia que se baseia na amplificação exponencial seletiva de uma amplificação exponencial seletiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma quantidade reduzida de DNA de uma única célula, sem o uso de um organismo única célula, sem o uso de um organismo vivo.vivo.

HISTÓRICOHISTÓRICO

Karys Mullis descreveu a PCR no final da Karys Mullis descreveu a PCR no final da década de 1980.década de 1980.

Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo . Corporation patenteou este processo .

O Prêmio Nobel da Química foi atribuído à O Prêmio Nobel da Química foi atribuído à Karys Mullis pelo seu trabalho em 1993.Karys Mullis pelo seu trabalho em 1993.

Atualmente, método PCR é usado Atualmente, método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de médica e biológica para uma variedade de tarefas.tarefas.

PARA QUE SERVE A PCR?PARA QUE SERVE A PCR?

Diagnóstico médico;Diagnóstico médico;Mapeamento genético;Mapeamento genético;Detecção de doenças hereditárias;Detecção de doenças hereditárias;Clonagem de genes;Clonagem de genes;Testes de paternidade;Testes de paternidade;Criação de organismos transgênicos;Criação de organismos transgênicos;

PARA QUE SERVE A PCR?PARA QUE SERVE A PCR?

Medicina Forense:Medicina Forense:pequenas amostras de DNA retiradas da pequenas amostras de DNA retiradas da

cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo amplificadas para serem analisadas pelo método de método de fingerprintingfingerprinting. .

PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS

Devem ser realizados com o maior cuidado para Devem ser realizados com o maior cuidado para evitar contaminações que possam alterar o evitar contaminações que possam alterar o resultado.resultado.

Em primeiro lugar, deve-se extrair o material Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo.(Normalmente o material extraído é o danificá-lo.(Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras desdobramento da PCR e possui outras aplicações). aplicações).

PROCEDIMENTOS:PROCEDIMENTOS:

Após a extração do DNA, adiciona-se uma Após a extração do DNA, adiciona-se uma mistura (conhecida como pré-mix) que mistura (conhecida como pré-mix) que contém:contém:dNTPs dNTPs Primers Primers (ou iniciadores)(ou iniciadores)Solução Tampão.Solução Tampão.Enzima Taq DNA polimeraseEnzima Taq DNA polimerase

Taq DNA polimeraseTaq DNA polimerase

A A Taq DNA polimeraseTaq DNA polimerase, também denominada , também denominada Taq polimeraseTaq polimerase ou apenas ou apenas TaqTaq, é uma DNA , é uma DNA polimerase termoestável, utilizada na polimerase termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA através da amplificação de fragmentos de DNA através da técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactéria identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticusThermus aquaticus, encontrada em fontes , encontrada em fontes hidrotermais. A Taq polimerase suporta as hidrotermais. A Taq polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 94ºC). 94ºC).

PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS

Toda esta mistura é colocada no Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado). reação (fragmento a ser amplificado).

TERMOCICLADORTERMOCICLADOR

PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS

O Ciclo da PCR, no termociclador, ocorre O Ciclo da PCR, no termociclador, ocorre em três fases:em três fases:Fase de Desnaturação (94-96ºC)Fase de Desnaturação (94-96ºC)Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC)Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC)Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)

Fase de DesnaturaçãoFase de Desnaturação

a temperatura é elevada de 94 a 96ºC por a temperatura é elevada de 94 a 96ºC por pouco tempo para que haja a separação pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação) da dupla cadeia de DNA (Desnaturação) através da quebra das pontes de através da quebra das pontes de hidrogênio, dando origem a duas fitas hidrogênio, dando origem a duas fitas simples de DNA sobre as quais a síntese simples de DNA sobre as quais a síntese posteriormente vai ocorrerposteriormente vai ocorrer

Fase de hibridização ou Fase de hibridização ou anelamentoanelamento

a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC dependendo da quantidade de C e G dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). DNA (anelamento).

Fase de Extensão do DNAFase de Extensão do DNA

a temperatura é elevada a 72ºC para que a temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima taq-polimerase possa funcionar a enzima taq-polimerase possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. em seguida um novo ciclo é iniciado.

PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS

O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.Duas cadeias são sintetizadas a partir de Duas cadeias são sintetizadas a partir de

cada cadeia molde em cada ciclo cada cadeia molde em cada ciclo completo de PCR, o que dá um completo de PCR, o que dá um crescimento EXPONENCIAL, havendo ao crescimento EXPONENCIAL, havendo ao fim de fim de nn ciclos 2 ciclos 2n n vezes mais cópias do vezes mais cópias do que no início.que no início.

RESULTADOSRESULTADOS

Nº de CiclosNº de Ciclos Nº de CópiasNº de Cópias

11 22

22 44

33 88

66 6464

2020 1.048.5761.048.576

3030 1.073.741.8241.073.741.824

RESULTADOSRESULTADOS

O resultado é analisado através de uma O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente. a ajuda de um profissional competente.

VANTAGENSVANTAGENS

Capacidade de amplificar uma sequência Capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA.precisa de DNA.

Simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e Simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade.especificidade.

Não é necessário isolar o DNA que se pretende Não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar, mesmo que se encontre misturado amplificar, mesmo que se encontre misturado com o DNA de outras espécies, uma vez que os com o DNA de outras espécies, uma vez que os primers primers definirão a especificidade.definirão a especificidade.

Técnica rápida, barata e segura.Técnica rápida, barata e segura.

LIMITAÇÕESLIMITAÇÕES

Necessidade de conhecer a sequência de Necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para sintetizar DNA a amplificar para sintetizar primers primers específicos.específicos.

Relativa facilidade com que ocorre a Relativa facilidade com que ocorre a contaminação por DNA estranho.contaminação por DNA estranho.

Limitada extensão da sequência.Limitada extensão da sequência. Incorporação errônea de bases durante a Incorporação errônea de bases durante a

replicação.replicação.

VARIAÇÕES DA TÉCNICA VARIAÇÕES DA TÉCNICA BÁSICA DE PCRBÁSICA DE PCR

Nested PCRNested PCRHot StartHot StartReal time PCRReal time PCRRAPD-PCRRAPD-PCREntre outras...Entre outras...

Nested PCRNested PCR

Para melhorar a especificidade e a Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e seqüências localizadas fora dela, e utilizando-se este primeiro produto, segue-utilizando-se este primeiro produto, segue-se à amplificação da real sequência-alvo. se à amplificação da real sequência-alvo.

Hot StartHot Start

Variação da PCR onde a reação de Variação da PCR onde a reação de amplificação é iniciada a temperaturas amplificação é iniciada a temperaturas elevadas.elevadas.

Atividade da Atividade da Taq Taq DNA polimerase é DNA polimerase é inibida durante a preparação da reaçãoinibida durante a preparação da reação

evitando a amplificação de produtos evitando a amplificação de produtos inespecíficos,aumentando a inespecíficos,aumentando a especificidade e melhorando o rendimento especificidade e melhorando o rendimento da reação.da reação.

Real time PCRReal time PCR

PCR em tempo real compreende uma PCR em tempo real compreende uma amplificação convencional de DNA, porém amplificação convencional de DNA, porém a detecção do resultado é feita a longo a detecção do resultado é feita a longo dos ciclos através de marcadores.dos ciclos através de marcadores.

O risco de contaminação se torna menor.O risco de contaminação se torna menor.

RAPD-PCRRAPD-PCR

Consiste na amplificação randômica do Consiste na amplificação randômica do DNA, por um par de iniciadores de baixa DNA, por um par de iniciadores de baixa especificidade para com o DNA molde, especificidade para com o DNA molde, gerando assim anelamentos inespecíficos.gerando assim anelamentos inespecíficos.

Essa técnica permite a tipagem do Essa técnica permite a tipagem do genoma de microorganismos, genoma de microorganismos, possibilitando sua comparação entre possibilitando sua comparação entre isolados de amostras clínicas.isolados de amostras clínicas.

BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAFIA

http://virtual.unipar.br/courses/GMBM/http://virtual.unipar.br/courses/GMBM/document/aula-PCR-MESTRADO.pdf?document/aula-PCR-MESTRADO.pdf?cidReq=GMBMcidReq=GMBM

http://www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htmhttp://www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htmhttp://pt.wikipedia.org/wiki/PCR http://pt.wikipedia.org/wiki/PCR

OBRIGADO!!!