Soluções

BIOLOGIA CELULAR I BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR Procedimentos experimentais e folhas de apoio s aulas prticas

2005/2006

BCM / BCI 2005/06

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BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR BIOLOGIA CELULAR I Programao das aulas prticas 2005/2006

28 Set 30 Out

Material de laboratrio. Normas de segurana. Solues. Concentrao de solues. Problemas. Tcnicas de pesagem. Preparao de solues.

3 7 Out Continuao da mesma aula.

4 feriado, 5 e 6 no h aulas

10 14 Out Mtodos de determinao do pH. Sistemas tampo.

17 21 Out

Microscopia ptica de campo claro. Iluminao de Khler. Observao de diferentes tipos de clulas: clula animal, vegetal e procaritica. Microscpio de contraste de fase, campo escuro e fluorescncia.

24 28 Out Medio de clulas e estruturas observadas ao microscpio ptico.

31 Out 4 Nov Discusso de resultados e dvidas. (3 feira, 1 de Outubro, feriado)

7 11 Nov Espectro de absoro de um composto em soluo. Espectrofotometria.

14 18 Nov Electroforese de protenas ponto isoelctrico.

21 25 Nov Extraco de DNA e amplificao de um fragmento de DNA por PCR.

28 Nov 2 Dez Anlise de DNA com enzimas de restrio (5 feira, 1 de Dezembro feriado) (alunos de 5 feira distribuem-se pelas outras turmas).

5 Dez 9 Dez Electroforese em gel de agarose. Discusso de resultados (5 feira, 8 de Dezembro feriado) (alunos de 5 feira distribuem-se pelas outras turmas).

12 - 16 Dez Apresentaes feitas pelos alunos.

N de aulas previstas: 11

Limite de faltas : 4

Exames - poca normal: 9 a 28 de Janeiro

- poca de recurso: 30 de Janeiro - 11 de Fevereiro Dispensas: s tm direito a dispensa os alunos que obtiveram frequncia nas aulas prticas

do ano lectivo transacto de 2004-05.

Incio das aulas 4 feira 28 de Setembro

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1 - Bibliografia especfica para as aulas prticas

Boyer, R. F. 1986. Modern Experimental Biochemistry. Addison-Wesley Pub. Comp.,

Massachussets. Bradbury, S. 1976. Optical Microscope in Biology. Studies in Biology n 59. Edward

Arnold Ed., London. Choinski, J. S. 1992. Experimental Cell and Molecular Biology. 2nd Edition. Wm. C.

Brown Publishers, Chicago. Lacey, A. J. 1989. Light microscopy in biology. A pratical approach. IRL Press at Oxford

University Press. Salema, R. e Santos, I. 1992. Microscopia electrnica de transmisso. Instituto Nacional de

Investigao Cientfica, Lisboa.

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Material de laboratrio 1

Material de laboratrio Ver: http://newton.dep.anl.gov/york/listing.html

Gobel Matrazes ou Erlenmeyers

- utilizados para colocar e armazenar solues (no so utilizados para medir volumes com rigor, a sua escala aproximada)

Pipeta Bales volumtrico Provetas

- utilizados para medio rigorosa de volumes preparao de solues, misturas, etc.

ao medir, alinhar a parte inferior do menisco com o trao da escala correspondente ao volume pretendido

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Tubos de ensaio Tubos Falcon Microtubos (Eppendorfs)

Micropipetas automticas Pontas para as micropipetas

- utilizadas para medir volumes pequenos com elevada preciso

Placa da Petri Almofarizes - utilizadas por ex. para cultura de clulas - para homogeneizar material biolgico Todas as solues devem ser convenientemente etiquetadas/identificadas com a seguinte informao:

Tampo fosfato 0.1 M pH 6,5

Turma 3

27 / 03 /2003

Composto(s) em soluo pH

Preparador da soluo

Concentrao

Data

Ajuste do volume

Mostrador do volume

Manuseamento das micropipetas : (http://www.fhcrc.org/education/hutchlab/lessons/use.html)

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Material de laboratrio - 4

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Material de laboratrio - 5

Manejo da micropipeta (http://www.fhcrc.org/education/hutchlab/lessons/use.htm)

1 Seleccione a micropipeta correcta para o volume a pipetar

2 Ajuste para o volume desejado

3 Ajuste uma ponta micropipeta sem tocar na ponta

4 Pressione o mbolo at ao primeiro STOP

5 Coloque a extremidade da ponta dentro do lquido

6 Liberte o mbolo lentamente

7 Coloque a ponta prxima do fundo do novo tubo

8 Pressione o mbolo at ao segundo e ltimo STOP

9 Retire a ponta do tubo e depois liberte a presso no mbolo

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Normas de segurana 1

Sigma Product Labels

Sigma product labels are designed to provide complete, up-to-date information on our products ... Information available when and where you need it most.

On our labels, you can find:

Complete product name and description Health and safety hazard information Lot-specific analytical data on many types of products Pictograms for instant hazard recognition Useful data for reference, CAS (Chemical Abstracts Service) number, chemical formula

Key to Sigma Product Labels:

A Product Name and Description B Product Number C Further Descriptive Information D Recommendations on Handling and Storage

Storage temperatures indicated are for long-term storage of products. Products may be shipped under different conditions to reduce shipping costs, while still ensuring product quality.

E Hazard Statement Indication of danger.

F Lot Analysis Data on activity, purity, degree of hydration, etc., for this lot.

G Package Size Unless the material is described as pre-weighed, the package will normally contain at least the indicated quantity, and usually somewhat more. For some products, the actual quantity at time of packaging is also shown. The user should always measure the amount needed from the container.

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Normas de segurana 2 H Lot Number I Hazard Pictogram

Lets you know at a glance what safety hazards are involved in the use of this product. J Further Hazard Information

More complete description of actual hazards, handling precautions, and emergency management procedures.

K CAS Number Chemical Abstract Service number shown wherever available. CAS numbers vary in how specifically they define the material. We make every effort to provide the most specific CAS number which applies. Where a CAS number is provided for a mixture or solution, it is usually the CAS number of the solute or component referred to in the main label name.

L Chemical Formula and Formula Weight Unless water of hydration is indicated in the formula, the formula weight is for the anhydrous material.

M Bar Code and Eye Readable Equivalent The bar code and the eye readable equivalent of the bar code are for Sigma internal use and label identification.

N Risk and Safety Numbers O Material Safety Data Sheet Available

A Material Safety Data Sheet is available for this product. P EC Number

This product has been identified with an EC number (EINECS or ELINCS). Those products without an EINECS number will carry the warning statement, "Caution-Substance Not Yet Fully Tested."

Pictograms Pictograms are based on widely accepted standards.

Explosive Oxidizing Flammable Toxic

Harmful or Irritant Corrosive Biohazard

Dangerous for the

Environment Hazard Codes

B C E F+ F Xn Xi

Biohazard Corrosive Explosive Extremely Flammable Highly Flammable Harmful Irritant

N O R T T+

Dangerous for the enviromentOxidizing Radioactive Toxic Very Toxic

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Solues e concentrao de uma soluo 1

Solues

Uma soluo uma mistura homognea de duas ou mais substncias qumicas puras, entendendo-

se por homogneo uma aparncia uniforme ao microscpio ptico.

Numa soluo considera-se o(s) soluto(s) e o solvente. O soluto apresenta as suas molculas

dispersas no solvente. Considera-se como solvente a substncia que confere o estado fsico

soluo, a substncia que estiver em maior proporo caso o estado fsico de soluto e solvente seja

o mesmo, ou a substncia mais voltil se para alm do mesmo estado fsico as duas substncias

estiverem na mesma proporo. Se a gua estiver presente, esta sempre considerada como

solvente.

Uma soluo caracterizada pela natureza de soluto e solvente - propriedades qualitativas, e pelas

propores relativas de soluto e solvente - propriedades quantitativas ou concentrao.

A concentrao de uma soluo consiste na relao entre a quantidade de soluto e solvente

presentes na soluo e pode exprimir-se em:

Percentagem (p/p, p/v ou v/v)

% (p/p) gramas de soluto por 100 gramas de soluo

% (p/v) gramas de soluto por 100 mililitros de soluo

% (v/v) mililitros de soluto por 100 mililitros de soluo

Molaridade (M)

M n de moles de soluto por litro de soluo

Molalidade (m)

m n de moles de soluto por quilograma de solvente

Partes por milho (ppm)

ppm partes de soluto por 1 milho de partes de soluo ( mg L-1) __________________________________________________________________________ 1 L = 103 mL (1000 mL) 1 L = 106 L 1 L = 109 nL 1 mL = 10-3 L 1mL = 103 L 1mL = 106 nL 1 L = 10-6 L 1 L = 10-3 mL 1 L = 103 nL 1 nL = ___ L 1 nL = ___ mL 1 nL = ___ L (COMPLETE)

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Exemplos de clculos para a preparao de algumas solues

1 Como procederia para preparar 20 mL de H2 SO4 10 % (v/v)?

10% (v/v) = 10 mL H2 SO4 / 100mL de soluo

10 mL H2 SO4 ------------100 mL de soluo

X mL H2 SO4------------- 20 mL de soluo que se quer preparar

X x 100 = 10 x 20 X = (10 x 20) / 100 = 2 mL

Seria necessrio colocar 5 a 10 mL de gua destilada numa proveta, pipetar 2 mL de H2 SO4

com a ajuda de uma propipeta e perfazer o volume de 20 mL com gua destilada.

2 Como procederia para preparar 500 mL de NaOH 0,1 M (M = 40 g/mol)?

0,1 M = 0,1 mol / 1 L (=1dm3=1000mL)

0,1 mol ------------1000 mL de soluo

X mol ------------- 500 mL de soluo que se quer preparar

X x 1000 = 0,1 x 500 X = (0,1 x 500) / 1000 = 0,05 mol

So necessrias 0,05 mol de NaOH para preparar 500 mL de uma soluo 0,1 M. Agora

necessrio calcular as gramas que ser preciso pesar.

1mol ------------- 40 g

0,05 mol --------- Y g

Y x 1 = 40 x 0,05 Y = (40 x 0,05) / 1 = 2 g

Seria necessrio pesar 2 gramas de NaOH e dissolver bem num volume de gua destilada

inferior a 500 mL num gobel ou matraz. De seguida, esta mistura deveria ser vertida para

uma proveta ou balo volumtrico, sendo adicionada gua destilada at perfazer o volume de

500 mL.

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3 Como procederia para preparar 500 mL de CH3COOH 0,1 M. (M = 60,05 g/mol).; 1L =

1,05 kg; pureza = 95% p/p)?

CH3COOH = cido actico um lquido e, por isso, a maneira de o medir no pesando mas usando uma pipeta

0,1 M = 0,1 mol / 1 L (=1dm3=1000mL) 0,1 mol ------------1000 mL de soluo X mol ------------- 500 mL de soluo que se quer preparar X x 1000 = 0,1 x 500 X = (0,1 x 500) / 1000 = 0,05 mol So necessrias 0,05 mol de CH3COOH para preparar 500 mL de uma soluo 0,1 M. Agora necessrio calcular as gramas correspondentes a esse n de moles. 1 mol ------------- 60,05 g 0,05 mol --------- Y g Y x 1 = 60,05 x 0,05 Y = (60,05 x 0,05) / 1 = 3,00 g Como o cido actico de que dispomos no totalmente puro, temos de calcular qual a quantidade de produto presente no frasco (CH3COOH 95%) que possui as gramas de CH3COOH que ns pretendemos. Pureza = 95% (p/p) = 95 g CH3COOH / 100 g de soluo (=produto que est no frasco) 95 g CH3COOH ------------- 100 g de produto do frasco 3,0025 g CH3COOH ---------- Z g de produto do frasco Z x 95 = 3,0025 x 100 Z = (3,0025 x 100) / 95 = 3,16 g Como o cido actico um lquido, temos que calcular qual o volume do cido actico 95% que corresponde aos 3,16 gramas. 1L = 1,05 kg (significa que a densidade = 1,05) se 1L = 1,05 kg ento 1 mL = 1,05 g 1 mL ---------1,05g V mL --------3,16 g V x 1,05 = 1 x 3,16 V = (1 x 3,16) / 1,05 = 3 mL Para preparar 500 mL de CH3COOH 0,1 M a partir de CH3COOH 95% seria necessrio colocar um pouco de gua destilada numa proveta ou balo volumtrico de 500 mL, pipetar 3 mL de CH3COOH 95% com a ajuda de uma propipeta e perfazer o volume de gua destilada com gua destilada.

OU:

d = 1,05 = massa (g) / volume (mL)

1,05 = 3,16 g / V

1,05 x V = 3,16 g

V = 3,16 / 1,05 = 3 mL

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4 Como procederia para preparar 50 mL de EDTA 0,2 M a partir de uma soluo 1M?

0,2 M = 0,2 mol / 1 L (=1dm3=1000mL)

0,2 mol ------------1000 mL de soluo

X mol ------------- 50 mL de soluo que se quer preparar

X x 1000 = 0,2 x 50 X = (0,2 x 50) / 1000 = 0,01 mol

So necessrias 0,01 mol de EDTA para preparar 50 mL de uma soluo 0,2 M. Agora

necessrio calcular qual o volume de uma soluo 1 M que contm esse n de moles.

1 M =1 mol / 1 L

1 mol ----------- 1000 mL

0,01 mol ------- Y mL

Y x 1 = 0,01 x 1000 Y = (0,01 x 1000) / 1 = 10 mL

OU encarar a situao como uma diluio de uma soluo com concentrao 1 M para obter

50 mL com concentrao 0,2 M.

Para diluies: Ci x Vi = Cf x Vf (C concentrao, V volumoe, i inicial, f

final)

Logo: 1 M x X mL = 0,2 M x 50 mL X = (0,2 x 50) /1 = 10 mL

Para preparar 50 mL de EDTA 0,2 M a partir de uma soluo 1M, pipetaria 10 mL de EDTA

1 M para uma proveta ou balo volumtrico com 50 mL e adicionaria gua destilada at

perfazer o volume de 50 mL.

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5 - Calcule a molalidade de uma soluo de H2 SO4 20% (p/v) sabendo que a densidade da

soluo 1,09 e que M H2 SO4 = 98 g/mol.

Molalidade = n de moles de soluto por quilograma de solvente

H2 SO4 20% (p/v) significa 20 g H2 SO4 / 100 mL de soluo

- ser necessrio calcular i) a quantas moles correspondem os 20 g de H2 SO4 e ii) quantos

kG de soluto estaro presentes em 100 mL de soluo

i)

1mol ------------- 98 g

X mol ------------ 20 g

X x 98 = 1 x 20 X = (1 x 20) / 98 = 0,204 moles

ii)

d = 1,09 = massa (g) / volume (mL)

1,09 = Y g / 100 mL

1,09 x Y = 100

Y = 100 / 1,09 = 91,743 g ou seja: 100 mL de soluo = 91,743 g de soluo

logo: 20 g H2 SO4 / 100 mL de soluo correspondem a 20 g H2 SO4 / 91,743 g de soluo

e a quantidade de solvente ser de 91,743 20 g = 71,743 g

ento temos 20 g H2 SO4 (= 0,204 moles) / 71,743 g de solvente e queremos saber as moles

para 1 kg de solvente (=1000 g)

0,204 mol ---------- 71, 34 g solvente

X mol --------------- 1000 g solvente

X x 71,34 = 0,204 x 1000

X = (0,204 x 1000) / 71,34 = 2,86 mol / 1 kg de solvente = 2,86 m

Uma soluo de H2 SO4 20% (p/v) tem uma molalidade de 2,86 molal (m).

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6 - A 4 mL de gua juntou-se 16 mL de H2 SO4 2,5 M. Calcule a molaridade da soluo

resultante.

Calculamos o n de moles presentes em 16 mL da soluo, esse n de moles passa a existir

num volume de 16 + 4 = 20 mL e calcula-se a molaridade desta nova soluo.

2,5 M = 2,5 mol / 1 L (=1dm3=1000mL)

2,5 mol ------------1000 mL de soluo

X mol ------------- 16 mL de soluo

X x 1000 = 2,5 x 16 X = (2,5 x 16) / 1000 = 0,04 mol

0,04 mol ------------20 mL da nova soluo

Y mol ------------- 1000 mL da nova soluo

Y x 20 = 0,04 x 1000 Y = (0,04 x 1000) / 20 = 2 mol / 1 L

OU encaramos a situao como uma diluio de 16 mL de uma soluo com concentrao

2,5 M para obter 20 mLde uma nova soluo de concentrao mais diluida e a determinar.

Para diluies: Ci x Vi = Cf x Vf (C concentrao, V volumoe, i inicial, f

final)

Logo: 2,5 M x 16 mL = X M x 20 mL X = (2,5 x 16) / 20 = 2 M

A soluo obtida a partir da adio de 4 mL de gua a 16 mL de H2 SO4 2,5 M possui uma

concentrao de 2 molar (M).

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PROBLEMAS 1 - Que massa de hidrxido de sdio necessria para preparar 500 mL de uma soluo 0,3 M? (M =

40g/mol). 2 - Uma soluo 0,25 M num certo soluto em que volume de soluo existem 3,75 milimoles desse

soluto? 3 - A massa especfica de uma soluo de cido sulfrico concentrado a 91,33% (p/p)

aproximadamente 1,813g/mL. Calcule a concentrao em g/L (M = 98 g/mol). 4 - Determine o volume de uma soluo de cido sulfrico 0,2 M que contm 2,5 g de H2SO4. 5- Uma soluo de sulfato de sdio 0,1 M em anio sulfato. Calcule a concentrao do catio sdio

em g/L. (Na2SO4: M = 142,04 g/mol). 6 Qual o volume a adicionar a 1 mL de cloreto de hidrognio 2 M para se obter uma soluo 0,4 M? 7 - a) Pretende-se preparar 100 mL de uma soluo de NaOH a 40% (p/p) (d = 1,44). Qual a

quantidade de NaOH que se deve utilizar? b) Qual o volume de soluo de NaOH a 40% necessrio para preparar 1 L de NaOH 0,5 M. c) Calcule a concentrao de NaOH correspondente soluo preparada na alnea b), expressa em g/mL.

8 - Como procederia para preparar 200 mL de uma soluo 0,2 M em io clcio, se s possusse no seu laboratrio 100 mL de uma soluo 0,2 M em sulfato de clcio (CaSO4) e 2,5 g de hidrxido de clcio [Ca(OH)2].

9 - Adicionaram-se 6 gramas de KCl a 80 g de uma soluo de KCl a 12% (p/p). Determine a concentrao da soluo resultante expressa em: a) % (p/p) e b) molalidade.

(KCl: M = 74,56 g/mol). 10 - Qual a molaridade e a molalidade de uma soluo de cido sulfrico que contm 410,3g de

H2SO4 por L de soluo e cuja densidade 1,243? 11 - Calcule quantos mL de cido sulfrico concentrado a 96% (p/p), cuja densidade 1,84, so

necessrios para preparar 5 L de uma soluo 0,05 M. 12 - Que volume de uma soluo 1M contm a mesma quantidade de uma dada substncia dissolvida

que 30 mL de uma soluo 0,2 M? 13 - A densidade do cido sulfrico de uma bateria de automvel 1,23. Sabendo que a concentrao

desta soluo 4 M, calcule a concentrao em a) molalidade e b) % (p/p). 14 - Calcule a massa de nitrato de prata (AgNO3) que necessrio dissolver em 250 g de gua para

obter uma soluo 5 x 10-3 molal (AgNO3: M= 170 g/mol). 15 - A 50 mL de uma soluo aquosa 0,1 M de um determinado composto, adicionou-se 150 mL de

gua. Supondo no haver contraco de volume, qual a concentrao da soluo resultante? 16 - De uma soluo de tampo fosfato a 5% (p/v) foram retirados 2 mL aos quais se adicionaram 5

mL de gua. Indique a concentrao final do tampo. 17 - Calcule a molalidade e a molaridade de uma soluo de cido sulfrico a 20% (p/v) (d = 1,09). Solues dos problemas: 1 - 6 g. 2 - 15 mL. 3 - 1655,8 g/L. 4 - 127,5 mL. 5 - 4,6 g/L. 6 - 4 mL. 7 - a) 57,6 g. b) 34,7 mL. c) 0,02 g/mL. 8 - 100 mL de CaSO4 0,2 M + 1,48 g de Ca(OH)2 + H2O at 200 mL

9 - a) 18,1% b) 2,967 m. 10 - 4,18 M; 5,019 m. 11 - 13,86 mL. 12 - 6 mL. 13 - a) 4,77 m; b) 68,1%. 14 - 212 mg. 15 - 0,025 M. 16 - 1,43%. 17 - 2,292 m; 2,040 M.

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Preparao de solues 1. Preparar 250 mL de dihidrogeno fosfato de sdio (NaH2PO4) 0,1M. Grupo 1 2. Preparar 300 mL de hidrogeno fosfato de sdio (Na2HPO4) 0,1M. Grupo 2 3. Preparar 200 mL de hidrxido de sdio (NaOH) 0,2M. Grupo 3 4. Preparar 100 mL de cido actico 0,1M. Todos os grupos Material e procedimento:

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pH e solues tampo - 1

pH O solvente no interior das clulas e em todos os fludos intercelulares a gua. Uma das caractersticas principais de qualquer soluo aquosa a concentrao dos produtos de dissociao da gua - os ies H+ e OH- . As caractersticas da molcula da gua e especificamente a concentrao dos seus produtos de dissociao influencia de uma forma determinante as propriedades das molculas orgnicas e a forma como elas interagem.

Equao da dissociao da gua

H2O H+ + OH-

A 25 C

[H+] x [OH-] = 10-14 M2

Numa soluo aquosa pura

[H+] = [OH-] = 10-7 M

Um mtodo convencional de expressar a concentrao do io H+ a escala de pH:

pH = - log [H+] = log 1 / [H+] A escala de pH varia de 0 a 14. Numa soluo aquosa pura [H+] = 10-7 M, logo pH = - log 10-7 = 7 , a soluo diz-se neutra ([H+] = [OH-] ). Valores de pH inferiores a 7 indicam uma soluo cida ([H+] > [OH-] ) e valores de pH superiores a 7 indicam uma soluo bsica ou alcalina ([H+] < [OH-] ). Tabela 1 Escala de pH e exemplos com diferentes valores de pH (adaptado de Loddish et al. 2000).

Concentrao de H+ (M)

pH Exemplo

10-0

0

10-1 1 Fludos gstricos 10-2 2 Sumo de limo Acidez crescente 10-3 3 Vinagre 10-4 4 Solos cidos 10-5 5 Lisossomas e Vacolos 10-6 6 Citoplasma de msculo em contraco Neutro 10-7 7 gua pura e citoplasma 10-8 8 gua do mar 10-9 9 Solos alcalinos 10-10 10 Lagos alcalinos Basicidade crescente 10-11 11 Detergentes com amnia 10-12 12 Cal (soluo saturada) 10-13 13 10-14 14

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Medio do pH de uma soluo Mtodos para medio do pH: 1 Mtodo colorimtrico

Este mtodo utiliza compostos designados indicadores de pH compostos que apresentam uma cor diferente consoante o valor de pH da soluo em que se encontram. Um indicador universal uma mistura de indicadores de pH que assumem um leque de cores diferentes consoante o valor de pH. Utiliza-se sob a forma de uma tira de papel, impregnada com a mistura de indicadores, que acompanhada de uma escala de cor e correspondentes valores de pH. 2 Mtodo electromtrico ou potenciomtrico aparelho de pH O aparelho de pH constitudo por um voltmetro que mede as diferenas de potencial entre um elctrodo de referncia e um elctrodo indicador (de vidro) associados numa s pea elctrodo combinado. O elctrodo indicador sensvel concentrao de H+ da soluo na qual se encontra submerso, desenvolvendo-se uma diferena de potencial directamente proporcional concentrao de H+. A calibrao do aparelho com solues padro de pH conhecido permite ao aparelho efectuar a converso da voltagem medida em valores de pH. Procedimento experimental

Medir o pH das solues preparadas anteriormente (pp7) utilizando:

1 o indicador de pH fenolftalena - colocar 5 mL de cada uma das solues num tubo de ensaio e adicionar 3 gotas de fenolftalina

2 um indicador universal de pH mergulhar a fita de IU na soluo 3 o aparelho de pH mergulhar o elctrodo e a sonda da temperatura em cerca de 20 mL da

soluo colocada num pequeno gobel (proceder previamente calibrao do aparelho). Resultados:

pH

Solues Fenolftalena Indicador universal Elctrodo de pH

NaH2PO4 0,1 M

Na2HPO4 0,1 M

NaOH 0,2 M

CH3COOH 0,1 M

Figura 1 Cores assumidas por vrios indicadores de pH ao longo da escala de pH.

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Nota: As constantes dos indicadores so dadas para meio aquoso

Tabela 2 Indicadores de pH com as suas zonas de viragem e cores respectivas.

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Solues tampo Uma soluo tampo uma soluo que possui uma capacidade superior gua pura para resistir alterao de pH por adio de cido ou base. A capacidade tamponante da soluo resulta da presena de um cido fraco e da sua base conjugada ou da presena de uma base fraca e do seu cido conjugado. Todas as clulas e fludos extracelulares possuem pares conjugados cido/base que funcionam como sistemas tampo garantindo a homeostasia do pH. A capacidade tamponante de um cido fraco e da sua base conjugada torna-se evidente quando se procede curva de titulao do cido (fig. 1). A dissociao de um cido fraco HA na sua base conjugada A- e em H+ vai ocorrendo progressivamente ao longo da titulao:

HA H+ + A-

A constante de equilbrio Ka para esta reaco :

Ka = [H+] x [A-] a

[HA] Aplicando a funo logartmo a ambos os lados da equao e arranjando o resultado possvel derivar uma relao muito importante designada equao de Henderson Hasselbalch:

log Ka = log [H+] x [ A-] a [HA]

log Ka = log [H+] + log _[ A-] a [HA]

- log [H+] = - log Ka + log _[ A-] a [HA]

substituindo - log [H+] por pH e - log Ka por pKa temos a equao de Henderson Hasselbalch

pH = pKa + log _[ A-]_ [HA]

O pKa de um cido igual ao valor de pH para o qual [HA] = [ A-], ou seja, o pH para o qual o cido e a sua base conjugada esto presentes em concentraes iguais. No intervalo de pH igual a pKa1 a pKa+1 o par conjugado confere capacidade tamponante soluo como ilustra a curva de titulao.

pH

Figura 2 - Curva de titulao do cido actico CH3COOH.

8

6

4

2

pKa = 4,75

Zona tamponante = pKa + 1 (3,75 5,75)

Zona tamponante (pKa + 1)

pH 3,75 a 5,75

Moles de NaOH adicionadas

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Efeito tamponante e preparao de uma soluo tampo Objectivos: construir a curva de titulao do cido fraco H2PO4- para observao do efeito

tamponante do par conjugado H2PO4- / HPO42-. Preparar uma soluo tampo com um pH

determinado.

1. Colocar num gobel 30 mL da soluo de NaH2PO4 0,1 M e uma barra magntica.

2. Medir o pH da soluo colocando o gobel sobre um agitador. Adicionar NaOH 0,2 M mL a

mL e efectuar a leitura de pH aps cada adio. Registar os valores de pH na tabela.

3. Construir um grfico com os valores obtidos.

4. Indicar no grfico o pKa, a zona tamponante e onde se verificam as seguintes relaes:

[H2PO4-] = [HPO4 2-] [H2PO4-] < [HPO4 2-] [H2PO4-] > [HPO4 2-] 5. Utilizando as solues de NaH2PO4 0,1 M e Na2HPO4 0,1 M, prepare 20 mL de trs solues

tampo fosfato 0,1 M com os seguintes valores de pH: 6, 6,5 e7,2 (uma por grupo). Recorra

tabela 3 e acerte depois para o pH desejado utilizando a soluo adequada.

Tabela 3 - Preparao de tampo fosfato 0,1M.

Na H2 PO4 0,1M (mL)

Na2 HPO4 0,1M (mL)

pH

9,7 0,3 5,30

9,5 0,5 5,59

9,0 1,0 5,91

8,0 2,0 6,24

7,0 3,0 6,47

6,0 4,0 6,64

5,0 5,0 6,81

4,0 6,0 6,98

3,0 7,0 7,17

2,0 8,0 7,38

1,0 9,0 7,73

0,5 9,5 8,04

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pH e solues tampo - 6 Resultados: Tabela 4 __________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

NaOH 0,2M

(mL) pH NaOH 0,2M

(mL) cont. pH

cont.

Figura 3 __________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

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pH e solues tampo 7

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pH e solues tampo 8

Alguns sistemas tampo e respectivas zonas tamponantes

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pH e solues tampo 9

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Microscopia ptica - 1

Microscpio ptico de campo claro

Microscopia ptica-2

Ampliao total do microscpio = ampliao da objectiva x ampliao da ocular

A qualidade final da imagem ampliada vai depender da resoluo do microscpio, ou seja, da

sua capacidade para distinguir pontos muito prximos. O poder resolvente de um microscpio

depende das caractersticas do seu sistema de lentes. A menor distncia entre dois pontos do

objecto que permite que eles apaream individualizados na imagem ampliada designada por

limite de resoluo. O limite de resoluo (d) quantificado pela equao de Abbe:

d = k

AN

comprimento de onda da luz incidente AN abertura numrica da objectiva (AN = n sen ) n ndice de refraco do meio entre o objecto e a objectiva sen seno do semi ngulo de abertura da objectiva k = 0,61

coluna

parafusos macromtrico e micromtrico

lentes oculares

revlver e lentes objectivas

Platina com rguas graduadas

Condensador, diafragma ris e parafusos de alinhamento

Fonte luminosa e respectivo diafragma restato

tubo

parafusos para movimentar a preparao

Figura 4 Micorscpio de campo claro utilizado nas aulas prticas.

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Microscopia ptica-2

Algumas instrues para o manuseamento do microscpio Focagem - ajuste da desigualdade de viso entre os dois olhos Observe a preparao s com o olho esquerdo e foque com o parafuso micromtrico um ponto de referncia localizado prximo do centro do campo de observao. Seguidamente observe s com o olho direito e foque o mesmo ponto na ocular direita. Assim obter uma imagem focada para ambos os olhos. Iluminao Antes de iniciar a observao de uma preparao dever sempre proceder correcta iluminao do microscpio (ver iluminao de Khler). Mudana de objectiva: Quando iniciar a observao de uma preparao deve comear sempre pela objectiva de menor ampliao e focar de seguida a imagem. Pode depois passar para objectivas de ampliao progressivamente maior procedendo focagem para cada ampliao. Se necessitar usar a objectiva de imerso lembre-se que no final do trabalho ter sempre que limpar a objectiva e a preparao com um papel macio embebido em etanol. Iluminao de Khler

O sistema de iluminao do microscpio ptico a utilizar incluiu: fonte de iluminao, condensador e diafragma da fonte de iluminao; o condensador e o diafragma de ris do microscpio. Um microscpio iluminado pelo mtodo de Khler tem um campo de iluminao uniforme e apresenta a mxima resoluo para o sistema de ampliao.

1. Colocar uma preparao na platina do microscpio

2. Ligar a luz e deslocar a preparao at observar o objecto com a objectiva de menor ampliao.

3. Focar o objecto utilizando os parafusos macromtrico e micromtico. 4. Abrir completamente o diafragma do condensador e o diafragma da fonte de iluminao. 5. Olhar atravs da ocular e fechar devagar o diafragma da fonte de iluminao at o campo de

observao ficar reduzido a cerca de metade. 6. Focar a margem do diafragma ajustando a posio do condensador. 7. Abrir novamente o diafragma da fonte de iluminao at todo o campo estar iluminado.

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Microscopia ptica-3 Medio de objectos

Utilizando uma escala graduada em m, montada numa lmina de vidro micrmetro objectivo e uma escala associada a uma lente ocular micrmetro ocular - possvel efectuar a medio de objectos ou estruturas observados ao microscpio ptico. Procedimento 1. Colocar o micrmetro objectivo na platina do microscpio e focar a escala com a objectiva

de 10x. 2. Deslocar o micrmetro objectivo at fazer coincidir o zero da escala do micrtomo objectivo

com o zero da escala do micrtomo ocular (pontos 0 e 0na figura). 3. Determinar outro ponto de coincidncia entre as duas escalas (pontos B e B na figura). 4. Calcular a distncia entre os pontos 0 e B no micrmetro objectivo multiplicando o nmero

de divises entre os 2 pontos pelo valor conhecido de cada diviso. Exemplo da figura:

1 div (microt. objectivo) =10 m distncia 0-B no micrmetro objectivo = 8 div. x 10 m = 80 m

5. Determinar o valor de cada diviso do micrmetro ocular dividindo o valor da distncia 0-

B, calculada em 4, pelo n. de divises correspondentes distncia 0-B no micrmetro ocular.

Exemplo da figura:

distncia 0-B no micrmetro ocular = 5 div = 80 m 1 diviso no micrmetro ocular = 80/ 5= 16 m

6. Repetir o procedimento para cada objectiva . 7. Determinar as dimenses dos diferentes tipos de clulas observadas. Figura 5 Exemplo de calibrao do micrmetro ocular Escala do micrmetro ocular Escala do micrmetro objectivo 1 div. = 10 m

0

0 B

B

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Observao de imagens de microscopia - 1

Observao de diferentes tipos de clulas ao microscpio ptico a) Observe cada tipo de material biolgico ao microscpio ptico utilizando diferentes ampliaes e

proceda medio das clulas utilizando o micrmetro.

b) Faa um esquema legendado das clulas incluindo todos os detalhes que possvel observar e incluindo as dimenses calculadas.

Observao de clulas da epiderme da cebola no microscpio ptico de campo claro e de contraste de fase:

1. Colocar uma gota de gua numa lmina de vidro. 2. Destacar um pequeno pedao da epiderme da cebola e colocar sobre a gota de gua. 3. Cobrir com uma lamela e observar no microscpio ptico de campo claro. 4. Observar a mesma preparao no microscpio de contraste de fase e registar as diferenas

relativamente ao tipo de informao que este dois tipos de microscpios podem fornecer . Observao de clulas da epiderme da cebola no microscpio ptico de fluorescncia:

1. Colocar uma gota de DAPI (5 g / ml em tampo acetato 0,1 M pH 5,0) numa lmina de vidro protegida com papel de alumnio para evitar exposio luz.

2. Destacar um pequeno pedao de epiderme da cebola e coloc-lo sobre a gota de DAPI. 3. Cobrir com lamela e de novo com papel de alumnio. Esperar 5 minutos. 4. Observar no microscpio de fluorescncia.

Observao de clulas da planta aqutica Elodea no microscpio ptico de campo claro e de

fluorescncia:

1. Colocar uma gota de gua numa lmina de vidro. 2. Destacar uma folha de Elodea e coloc-la sobre a gota de gua. 3. Cobrir com uma lamela e observar no microscpio ptico de campo claro. 4. Observar os movimentos de ciclose do citoplasma que ocorrem nestas clulas, principalmente

nas que se localizam junto nervura. Aquecer a lmina ligeiramente caso estes movimentos no sejam imediatamente evidentes.

5. Repetir a observao no microscpio ptico de fluorescncia e registar o tipo de informao que este tipo de microscopia fornece relativamente ao microscpio ptico de campo claro.

Observao das bactrias presentes nos iogurtes comerciais:

1. Com um palito coloque um pequeno pedao de iogurte comercial numa gota de gua previamente colocada numa lmina de vidro.

2. Mantendo a lmina bem assente sobre a mesa, homogenize o material com outra lmina, junte o material numa das extremidades da lmina de baixo e faa um esfregao fazendo deslizar a lmina que tem na mo rapidamente sobre a lmina de baixo, de forma a espalhar o iogurte numa camada muito fina.

3. Secar chama de uma lamparina. 4. Colocar uma gota de azul de metileno sobre o esfregao seco, cobrindo bem toda a lmina e

deixar actuar. Lavar o excesso de corante com gua destilada. 5. Observar as bactrias do iogurte com a objectiva de imerso.

Observao de clulas da cianobactria Anabaena:

1. Retirar uma gota do fundo do tubo da cultura e colocar sobre uma lmina. 2. Cobrir com uma lamela e observar no microscpio ptico de campo claro.

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Observao de imagens de microscopia 2

Material biolgico Ampliao Esquema Medies

Allium cepa

Elodea

Fgado

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Observao de imagens de microscopia -3 Material biolgico Ampliao Esquema Medies

Cortia

Bactrias do iogurte

Anabaena sp.

Bacillus subtilis

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Observao de imagens de microscopia - 4 Observao de imagens de Microscopia Electrnica de Transmisso Identifique as estruturas que possvel observar em cada imagem: Clula procaritica: __________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

Clula animal: __________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

Clula vegetal: __________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________

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Espectrofotometria 1

ESPECTROFOTOMETRIA

A espectrofotometria estuda as interaces entre a energia radiante e a matria, incidindo tanto nos aspectos qualitativos como nos quantitativos. Ou seja, a espectrofotometria permite tirar concluses sobre a natureza e composio de uma amostra desconhecida e permite, por outro lado, determinar a concentrao de uma substncia conhecida. Todas as substncias absorvem energia radiante, isto , radiaes electromagnticas, desde as ondas de rdio at s radiaes gama (Fig. 6), numa certa extenso. Mesmo materiais que so considerados transparentes para a vista tm espectro de absoro no ultravioleta ou no infravermelho - por exemplo o vidro e a gua respectivamente.

A absoro de energia por uma molcula apenas pode ocorrer quando a energia do foto incidente igual diferena de energia entre dois nveis electrnicos, promovendo assim a transio de um electro de um nvel de energia baixo para um mais elevado. Antes que um outro foto possa ser absorvido, o estado excitado deve perder esta energia e reverter ao estado de energia inicial.

Figura 6 O espectro electromagntico.

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Espectrofotometria 2 Um espectrofotmetro um aparelho concebido para medir a quantidade de energia radiante absorvida por molculas em soluo. Os componentes bsicos de um espectrofotmetro so (Fig. 7): i) uma fonte de luz policromtica, normalmente de tungstnio, para comprimentos de onda entre 350-900 nm, ou de deutrio para a regio dos UV (200-400 nm). ii) um prisma que decompe a luz e um filtro ptico que permite seleccionar os comprimentos de onda desejados. iii) um compartimento para alojar a amostra. iv) um detector, normalmente um tubo fotoelctrico ou um dodo de silicone, que mede a intensidade de luz transmitida pela amostra.

A razo entre a intensidade de luz transmitida depois de atravessar uma soluo colocada no aparelho - It - e a intensidade de luz na ausncia de amostra - I0 chama-se transmitncia (T):

T = It / I0

Ao log10 da razo inversa de T chama-se absorvncia - A:

A = log10 (I0 / It) = -log10 T A transmitncia pode ter um valor entre 0 e 1 e frequentemente multiplicada por 100 sendo assim indicada como uma percentagem . A absorvncia traduz a quantidade de luz absorvida pela substncia em soluo.

I0 It

Figura 7 Esquema do trajecto de luz num espectrofotmetro.

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Espectrofotometria - 3

Leis da Absoro Lei de Lambert Para uma concentrao baixa de soluto e para qualquer comprimento de onda de luz considerado, a absorvncia da soluo directamente proporcional espessura do compartimento que contm a soluo trajecto ptico da luz na amostra = l (expresso em cm).

A = k l

Lei de Beer Para uma concentrao baixa de soluto e para qualquer comprimento de onda de luz considerado, a absorvncia da soluo directamente proporcional concentrao do soluto = c. Lei de Lambert - Beer Combinando as duas leis, a equao fundamental para a absoro da luz passa a ser:

A = k l c Em que a constante de proporcionalidade k constitui o chamado coeficiente de extino e por isso representada por E:

A = E l c A absorvncia - no tem unidades pois uma razo entre valores diferentes do mesmo

parmetro (intensidade luminosa). l trajecto ptico da luz - representado em cm, corresponde largura da cuvete utilizada para a

medio de absorvncia que sempre igual a 1cm . E coeficiente de extino - as suas unidades tero que ser o recproco da concentrao e o

recproco do comprimento: - se a concentrao for expressa em g L-1, E vem expresso em L g-1cm-1. - se a concentrao for expressa em molaridade (mol L-1) o coeficiente de extino representado por e designa-se coeficiente de extino molar. vir expresso em L mol-1 cm-1.

A = kc

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Espectrofotometria 4 O coeficiente de extino uma constante caracterstica de cada espcie qumica dissolvida num determinado solvente e depende do comprimento de onda da radiao incidente e da temperatura. O coeficiente de extino mais vulgarmente utilizado o coeficiente de extino molar - . Neste caso a lei de Lambert-Beer corresponde a :

A = l c

Olhando para esta expresso pode verificar-se que o coeficiente de extino molar de uma substncia, para um determinado , corresponde absorvncia de uma soluo com a concentrao 1M: l = 1cm, c = 1M ento A = x 1 x 1 ou seja A =

O coeficiente de extino molar pode ser consultado em tabelas para inmeras substncias e assim, a partir da absorvncia de solues de concentrao desconhecida, pode-se determinar facilmente a respectiva concentrao utilizando a lei de Lambert-Beer.

Em determinadas situaes no conveniente a expresso da concentrao em molaridade e no possvel recorrer a um pre determinado: - para molculas polimricas de tamanho varivel ou de peso molecular indefinido - caso de

cadeias de DNA ou de polissacardeos - quando se deseja determinar a concentrao, no de uma espcie qumica, mas de uma classe de

compostos (por exemplo todos os lpidos presentes numa amostra) - quando se pretende medir uma concentrao indirectamente atravs de uma reaco

colorimtrica

Nestes casos, a constante de proporcionalidade k tem que ser determinada para cada situao. necessrio construir a recta que representa a lei de Lambert-Beer a partir dos valores de absorvncia obtidos para solues preparadas no laboratrio com concentraes conhecidas da substncia em estudo. Esta recta designada recta padro e a sua equao corresponde lei de Lambert Beer para essa situao. O declive da recta corresponde obviamente constante de proporcionalidade k. Para construir uma recta padro so, portanto, necessrias solues com concentraes conhecidas - normalmente designadas solues padro, e necessrio obter os respectivos valores de absorvncia. Estes valores so colocados num grfico no qual o eixo das abcissas representa a concentrao - varivel independente - e o eixo das ordenadas a absorvncia varivel dependente. Desenha-se ento a melhor recta que traduz a nuvem de pontos tomando como ponto fixo a origem das coordenadas (fig. 8). Alternativamente pode determinar-se a equao da melhor recta representada pelo conjunto de pontos atravs dum mtodo estatstico de regresso linear.

Figura 8 Recta padro para o doseamento de uma substncia de concentrao desconhecida. Aps ler o valor de absorvncia da soluo de concentrao desconhecida, pode ler-se na recta a concentrao respectiva.

Concentrao

Abs

orv

ncia

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Aplicaes da espectrofotometria As aplicaes da espectrofotometria podem ser divididas em duas categorias:

a) medio da absorvncia a um determinado comprimento de onda.

Exemplo: utilizao do coeficiente de extino molar ou construo de uma recta padro

para a determinao da concentrao de um determinado composto em soluo.

b) medio da variao da absorvncia num intervalo de comprimentos de onda.

Exemplo: obteno de um espectro de absoro para identificao de biomolculas.

O espectro de absoro de um composto obtido medindo a absorvncia a vrios

comprimentos de onda e registando a absorvncia em funo do comprimento de onda (ver

Fig. 5).

Figura 9 - Espectro de absoro do alcalide anidrovinblastina

Bibliografia: Rodney F. Boyer (1986). Modern Experimental Biochemistry. Addisson-Wesley

Publishing Company. Massachusetts, USA.

Comprimento de onda (nm)

Abs.

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Doseamento espectrofotomtrico do azul de metileno A. Determinao do espectro de absoro do azul de metileno

1 - Encha uma cuvete de espectrofotmetro com uma soluo aquosa de azul de metileno a 0,005 mg/mL. Encha outro tubo com o solvente da soluo de azul de metileno - tubo branco.

2 - Regule o comprimento de onda da luz para 400 nm.

3 - Limpe o exterior dos tubos com papel absorvente. Insira o tubo branco e ajuste o boto de referncia de tal modo que o ponteiro indique 100% de transmitncia (T) ou 0 de absorvncia (A).

4 - Retire o tubo branco e insira o tubo com a soluo de azul de metileno.

5 - Registe a absorvncia.

6 - Mude o comprimento de onda para 425 nm, e repita os passos 4, 5 e 6. Continue as medies em intervalos de 25 nm at um comprimento de onda de 700 nm. Ateno: no se esquea de calibrar o aparelho com o tubo branco para cada novo valor de comprimento de onda.

7 - Construa um grfico com os valores de comprimento de onda (varivel independente) em abcissas, e os respectivos valores de absorvncia (varivel dependente) em ordenadas.

Tabela 5 _______________________________________________________________________

(nm) Absorvncia

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Figura 10 ______________________________________________________________

______________________________________________________________________

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Espectrofotometria - 7 B. Curvas-padro e a relao entre absorvncia e concentrao

1 - Prepare uma srie de diluies a partir da soluo de azul de metileno a 0,005 mg/mL, como esquematizado na tabela I.

2 - Regule o espectrofotmetro para o comprimento de onda de mxima absoro do azul de metileno.

3 - Registe a absorvncia para cada um dos 6 tubos.

4 - Calcule a concentrao de azul de metileno em cada tubo em mg/mL.

5 - Exprima graficamente a Abs. em funo da concentrao (lembre-se que a varivel independente sempre colocada em abcissas e a varivel dependente em ordenadas). Trace a recta que melhor representa o conjunto de pontos, fazendo-a passar pelo ponto zero/zero.

6 - Registe a absorvncia de uma soluocom concentrao desconhecida de azul de metileno.

7 - Calcule a concentrao de azul de metileno da soluo desconhecida, recorrendo ao grfico anteriormente construdo.

Tabela 6 Preparao de seis tubos com diferentes diluies de azul de metileno.

Tubo Azul metileno 5 g/mL

(mL)

Sol. conc. descon.

(mL)

gua

(mL)

1 0 --- 4

2 1 --- 3

3 2 --- 2

4 3 --- 1

5 4 --- 0

6 --- 3 0 Calcule a concentrao de azul de metileno nos tubos 1 a 6 e preencha a tabela 7 com esses valores.

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Tabela 7 Valores de concentrao das diferentes diluies de azul de metileno representadas na tabela 6 e respectivos valores de absorvncia lidos ao espectrofotmetro.

Tubo Concentrao (mg/mL)

Abs (= nm)

1 0,000

2

3

4

5 0,005

6 C. Determinao de coeficientes de extino do azul de metileno 1 - Determine o coeficiente de extino a partir do grfico A = f (c), determinando o declive da

recta (E mg/mL = y2 - y1 / x2 - x1 ). 2 - Calcule a concentrao expressa em molaridade para cada uma das diluies efectuadas

anteriormente - tubos 1 a 5. (Azul de metileno - 319, 86 g/mole). 3 - Coloque no eixo das abcissas do grfico A = f (c) os valores da concentrao expressos em

molaridade. 4 - Determine o coeficiente de extino molar a partir do grfico A = f (c), determinando o declive

da recta ( = y2 - y1 / x2 - x1 ). Em alternativa, calcule a equao da recta A = f (c) por regresso linear (pp 44-47).

Clculos:

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Espectrofotometria 9

Figura 11 ____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

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Regresso linear - 1

Regresso linear pelo mtodo do mnimos quadrados Regresso linear - obteno da equao da melhor recta que passa por uma nuvem de pontos

experimentais.

Figura 12 Nuvem de pontos experimentais que indicam a existncia de uma relao linear entre absorvncia e concentrao.

Para obviar subjectividade subjacente ao traado manual de uma recta que estabelea uma relao

linear numa representao grfica de uma nuvem de pontos, como a que est representada na Fig. 12,

mais apropriado efectuar o procedimento de regresso linear recorrendo a uma metodologia

estatstica como, por ex., o mtodo dos mnimos quadrados

Com este mtodo, depois de aceitar diversos pressupostos estatsticos, podemos obter a equao de

uma recta que represente a possvel relao linear entre as duas variveis, neste caso absorvncia e

concentrao.

Equao da recta: y = mx + b m = declive da recta b = valor da ordenada na origem Para obter estes dois parmetros necessrio proceder a uma srie de clculos uma vez que:

e xmyb =

Y = absorvncia X =

=

)(

)()(

22i i

ii ii

x x

n

yx y x

m

n

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Regresso linear - 2

Aps a determinao da melhor recta que passa por um conjunto de pontos experimentais pelo mtodo

dos mnimos quadrados, importante saber-se em que medida estes pontos tm ou no alguma

probabilidade de seguirem uma relao linear.

Tal estudo pode fazer-se atravs da determinao do coeficiente de correlao (r):

y

xmr =

- desvio padro dos valores experimentais (x,y) em torno dos seus valores mdios. Para o seu clculo podemos utilizar a expresso que nos fornece o valor da varincia (2) destes mesmos dados:

xnxi

x = 22 2 e

ynyi

y = 22 2

n nmero de pontos experimentais, incluindo o ponto (0,0)

x - valor mdio dos valores de x (incluir tambm o ponto (0,0)

y - valor mdio dos valores de y (incluir tambm o ponto (0,0)

O coeficiente de correlao pode tomar valores entre +1 e 1. Quando r = 1 isso exprime a existncia

de uma funo linear entre as duas variveis em causa; quando r = 0 isto significa que as duas

variveis so independentes.

Uma vez determinado o valor de r, para saber se os pontos experimentais tm uma probabilidade

superior ou inferior a 95% de estarem em linha recta, deve comparar-se o valor de r determinado

experimentalmente pela expresso acima com o valor terico tabelado para a probabilidade de 95% e

para um nmero de graus de liberdade N = n-1. Se o valor experimental for superior ao valor terico

tabelado, pode afirmar-se que os pontos tm uma probabilidade maior que 95% de seguirem uma

relao linear. Caso o valor de r experimental for inferior ao valor terico tabelado, os pontos

experimentais tero uma probabilidade inferior a 95% de seguirem tal relao (Tabela 8). O valor 95%

representa um limite de confiana que determinamos ser suficiente para cada caso experimental

figura 13.

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Regresso linear 3

Figura 13 Recta obtida por regresso linear a partir de um conjunto de pontos experimentais e que traduz a relao de proporcionalidade directa entre absorvncia e concentrao. A figura mostra ainda a representao grfica de um limite de confiana de 95%. Tabela 8 Coeficientes de correlao tericosentre duas variveis, expressos em mdulo, para 95 % de probabilidade e um dado n de graus de liberdade. ________________________________________________________________________ N Mdulo do coeficiente N Mdulo do coeficiente de correlao de correlao 1 0,997 16 0,468 2 0,950 17 0,456 3 0,878 18 0,444 4 0,811 19 0,433 5 0,754 20 0,423 6 0,707 21 0,413 7 0,666 22 0,404 8 0,632 23 0,396 9 0,602 24 0,388 10 0,576 25 0,38 1 11 0,553 26 0,374 12 0,532 27 0,367 13 0,514 28 0,361 14 0,497 29 0,355 15 0,482 30 0,349 _________________________________________________________________________

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Regresso linear - 4 Para facilitar os clculos dos diferentes parmetros deve-se comear por calcular cada uma das

variveis intervenientes nas diferentes frmulas:

Tabela 9 Valores de concentrao e absorvncia, e expresses parciais, a utilizar para efectuar regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados.

Valores

experimentais Parmetros necessrios ao clculo de m, b, e coeficiente de

correlao x

(Conc.) y

(Absrv.) x =

0 0 2x =

y = 2

y = yi = xi = yixi = 2)xi( = 2xi = )xiyi( =

Clculo de: a) m = b) b = c) Equao da recta: d) r = e) Valor terico de r, com limite de confiana de 95% = f) Comparao entre r experimental e r terico: Concluso:

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Ponto isoelctrico - 1

Electroforese e ponto isoelctrico de protenas Ponto isoelctrico de uma protena (pI) valor de pH para o qual a carga global da protena neutra e que, consequentemente, no permite que protena se mova num campo elctrico. Objectivo: Separar electroforticamente protenas de acordo com a sua carga. Determinar o pI ou intervalo em que se situa o pI das protenas em estudo citocromo c, mioglobina e albumina srica. Montagem do gel e electroforese Cada um dos grupos prepara um gel com um tampo diferente, a pH diferente: Grupo 1 tampo Acetato (pH=4,0); Grupo 2 - tampo Tris (pH=7,2); Grupo 3 tampo Tris-Glicina (pH=9,2) 1- Fechar as extremidades do suporte do gel e inserir o pente, no centro do tabuleiro, para definir os

poos.

2- Preparar 25 mL de agarose 1,2% (p/v) em tampo acetato (pH=4,0) ou tampo Tris (pH=7,2) ou Tampo Tris-Glicina (pH=9.2) num matraz de 200 mL. Dissolver a agarose em banho de gua a ferver ou no micro-ondas e arrefecer para cerca de 50C (Cuidado: a agarose muito quente deforma o suporte do gel).

3- Verter a agarose no suporte do gel e esperar que solidifique (~20 min.).

4- Retirar os suportes laterais e o pente.

5- Encher a tina com o tampo correspondente ao gel, at cobrir bem a superfcie do gel.

6- Preparar as amostras de protena como descrito no final do protocolo. Carregar 15 L de cada amostra pela seguinte ordem, da esquerda para a direita, tendo o nodo (polo positivo) em cima: citocromo c, mioglobina, albumina srica.

7- Fechar a cmara de electroforese e ligar os cabos a uma fonte de alimentao elctrica, de modo a que o ctodo da cmara fique ligado ao ctodo da fonte (preto-preto), assim como os nodos (vermelho-vermelho).

8- Ligar a fonte de alimentao, regular a voltagem para 60 V e deixar correr cerca de 30 minutos.

9- Medir a distncia percorrida por cada uma das protenas a partir do poo na direco do ctodo ou do nodo. Registar os resultados na tabela 1 e esquematizar na figura 1 as posies finais de cada uma das protenas em cada gel.

10- Registar a carga de cada protena para cada pH na tabela 2.

11- Estimar o pI, ou o intervalo em que se situa o pI, de cada uma das protenas em estudo com base

nos resultados obtidos. Comparar os pIs estimados com os valores da Tabela 3.

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Ponto isoelctrico - 2 Resultados: Tabela 1 -________________________________________________________________________

Distncia percorrida

pH 4,0

Distncia percorrida

pH 7,2

Distncia percorrida

pH 9,2

Protena ctodo nodo ctodo nodo ctodo nodo

Citocromo c

Mioglobina

Albumina srica

Figura 1 ____________________________________________________________________ Tabela 2 -______________________________________________________________________ _

Carga Protena pH 4,0 pH 7,2 pH 9,2

Citocromo c

Mioglobina

Albumina srica pI ou intervalo em que se situa o pI: citocromo c _____________ mioglobina ______________ albumina srica _____________

Poos e protenas carregadas

C M AS

pH 4,0 pH 7,2 pH 9,2

C M ASC M AS

+

-

Poos e protenas carregadas

C M ASC M AS

pH 4,0 pH 7,2 pH 9,2

C M ASC M ASC M ASC M AS

+

-

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Ponto isoelctrico - 3 Solues tampo: Tampo Acetato pH 4,0: adicionar 25,6 ml de cido actico glacial a cerca de 500 mL de gua destilada, adicionar 13,6 g de acetato de sdio (anidro), ajustar o pH para 4,0 e acertar o volume final para 1 Litro. Tampo Tris 50 mM pH 7,2: misturar 250 mL de Tris 0,2 M com 221 mL de HCl 0,2 M, ajustar o pH para 7,2 e acertar o volume final para 1 Litro. Tampo Tris-Glicina pH 9,2: disso l40 g de Tris e 15 gramas de glicina em cerca de 500 mL de gua destilada, ajustar o pH para 9,2 e acertar o volume final para 1 Litro. Solues de protenas: Citocromo c: preparar uma soluo com concentrao de 5 mg/mL em gua destilada. Para carregar no gel, misturar previamente, num tubo Eppendorf, 45 L da soluo de protena com 5 L de glicerol. Mioglobina: preparar uma soluo com concentrao de 5 mg/mL em gua destilada. Para carregar no gel, misturar previamente, num tubo Eppendorf, 45 L da soluo de protena com 5 L de glicerol. Albumina srica: preparar uma soluo com concentrao de 7 mg/mL em gua destilada. Para carregar no gel, misturar previamente, num tubo Eppendorf, 35 L da soluo de protena com 5 L de glicerol e com 10 L de uma soluo saturada de azul de bromofenol. Caractersticas das protenas em estudo: Citocromo c Est presente em tecidos animais e vegetais e faz parte da cadeia transportadora de electres das mitocndrias. O citocromo c consiste numa nica cadeia polipptidica enrolada em volta de um grupo heme. O Fe presente neste grupo heme o responsvel pela cor laranja/acastanhada da protena. In vivo, a protena bsica devido presena de uma grande quantidade de resduos de lisina. Mioglobina A mioglobina a responsvel pelo armazenamento de oxignio nas clulas musculares. Tem uma cor vermelha/acastanhada devido presena de um grupo heme cujo Fe tem a capacidade de ligar oxignio. Albumina srica a protena predominante no plasma sanguneo, ligando-se e transportando um grande nmero de pequenas molculas no sangue. No tem cor, mas pode ser corada com azul de bromofenol. uma protena relativamente acdica. Tabela 3 -Pontos isoelctricos de algumas protenas Protena pI Pepsina ~1,0 Albumina do ovo 4,6 Albumina srica 4,9 Urease 5,0 -lactoglobulina 5,2 Hemoglobina 6,8 Mioglobina 7,0 Quimotripsina 9,5 Citocromo c 10,7 Lisozima 11,0

Adaptado de Nelson & Cox (2000)

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DNA - 1

Reaco em cadeia da polimerase

A reaco em cadeia da polimerase (PCR do ingls polymerase chain reaction) permite uma

amplificao de bilies de vezes de uma poro especfica de DNA a partir de um genoma inteiro,

permitindo como que purificar essa sequncia de DNA do resto do genoma. Para poder efectuar

esta reaco necessrio, no mnimo, conhecer uma pequena parte da sequncia nas extremidades do

fragmento a amplificar. Sintetizam-se por mtodos qumicos dois oligonucleotdeos complementares

dessas extremidades (iniciadores ou primers) que so utilizados para iniciar a duplicao do DNA

do genoma depois de este ser desnaturado em cadeias simples atravs de aquecimento. A duplicao

catalisada in vitro por uma DNA polimerase resistente ao calor e purificada a partir da bactria

Thermus aquaticus (Taq polimerase). Ciclos consecutivos de 1) aquecimento do DNA para

separao das 2 cadeias (desnaturao), 2) descida da temperatura para permitir o emparelhamento

do iniciadores (emparelhamento), e 3) subida da temperatura para um valor intermdio ptimo para a

Taq polimerase catalisar a duplicao do DNA entre os dois iniciadores, vo permitir a amplificao

geomtrica da sequncia alvo definida pelos 2 iniciadores.

Figura 14 - Esquema representado um ciclo de PCR.

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DNA - 2

Purificao de DNA de folha de Catharanthus roseus (L.) G. Don Objectivo: Purificar DNA da planta C. roseus para utilizar como molde para uma reaco em cadeia

da polimerase (PCR do ingls polymerase chain reaction) com o objectivo de pesquisar a presena de

intres no gene de uma peroxidase vegetal (Crprx1) envolvida na biossntese de alcalides

anticancergenos das folhas de C. roseus. O mtodo utilizado uma adaptao do mtodo publicado

no seguinte artigo: Edwards K, Johnstone C, Thompson C 1991. A simple and rapid method for the

preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research 19: 1347

1 Destacar um disco foliar com o interior da tampa de um tubo de microcentrfuga esterilizado . 2 Macerar o material vegetal no interior do tubo com uma barra de vidro pontiaguda esterilizada. 3 Adicionar imediatamente 400 L de tampo de extraco e misturar com o vortex durante 5 seg. 4 Centrifugar os extractos a 13000 rpm durante 1 min. 5 Transferir 300 L do sobrenadante para um tubo de microcentrfuga novo. 6 Adicionar 300 L de isopropanol e deixar temperatura ambiente durante 2 min. 7 Centrifugar os extractos a 13000 rpm durante 1 min. 8 Remover o sobrenadante e secar o sedimento de DNA ao ar. 9 Ressuspender o sedimento seco em 100 L de gua esterilizada ou TE.

Quantificao do DNA 1 - Diluir as amostras 1/500 em gua. 2 - Medir a absorvncia a 260nm num espectrofotmetro de ultravioletas. Usar gua como branco.

E260nmDNA = 0,02 g-1cm-1 mL

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Tampo de Extraco 200 mM Tris-HCl pH 7,5 250 mM de NaCl 25 mM EDTA 0,5% SDS

TE 10 mM Tris-HCl pH 7,4 1 mM EDTA

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DNA - 3

Amplificao de uma regio especfica do gene da peroxidase 1 de Catharanthus roseus Objectivo: Amplificar uma zona do gene da peroxidase 1 de C. roseus (CrPrx1) onde o alinhamento

deste gene com o gene homlogo de Arabidopsis sugere que existe um intro.

Procedimento experimental Ateno: usar solues e material esterilizado, luvas, e trabalhar com os tubos em gelo.

1 - Pipetar para um tubo Eppendorf as seguintes solues: 2 L de DNA (0.1-10 ng)

2 L de Primer 1

2 L de Primer 2

14 L de Mistura de reaco *

Total = 20 L

aps pipetar todos os componentes agitar de forma a homogeneizar bem a mistura

2 - Colocar os tubos no termociclador e seleccionar o programa: 94C 0,5 min - desnaturao 35-40 ciclos: 55C 0,5 min - emparelhamento 72C 1 min - extenso Extenso final: 72C 7 min, 4C 3 - Observe os resultados correndo o(s) produto(s) de reaco em gel de agarose (pg. 54 e 55).

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- * Mistura de reaco:

Solues 1 reaco ___ reaces (complete)

Tampo PCR 10x 2.0 l

dNTPs 10 mM 0.4 l

H2O 11.5 l

Taq polimerase 0.1 l

Localizao putativa do intro

cDNA da CrPrx1

Forward primer

Reverse primer

aps pipetar todos os componentes agitar de forma a homogeneizar bem a mistura

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DNA - 4

Anlise de DNA por meio de enzimas de restrio

Nesta experincia, o DNA de bacterifago Lambda (48502 pares de bases - bp - de comprimento) cortado com enzimas de restrio e os fragmentos resultantes so separados por electroforese em gel de agarose. Duas amostras de DNA de Lambda so incubadas a 37C, cada uma delas com uma das seguintes endonucleases de restrio: EcoRI ou HindIII. Uma terceira amostra, que constitui o controlo negativo, incubada sem endonuclease.

As amostras de DNA so carregadas em poos de um gel de agarose e submetidas a electroforese. Um campo elctrico aplicado atravs do gel conduzindo a uma migrao dos diferentes fragmentos do DNA da amostra em direco ao polo positivo. As molculas de DNA mais pequenas migram mais rapidamente do que as de maiores dimenses, e assim os fragmentos de diferentes tamanhos ficam separados em bandas diferentes durante a electroforese. Para um determinado DNA, o nmero e o padro das bandas produzidas por cada enzima de restrio so caractersticos e constituem um DNA fingerprint. Os padres de restrio tornam-se visveis por colorao com um composto que se liga molcula de DNA.

Procedimento experimental:

Procedimento A: Reaces de restrio Notas: As DNAses so abundantes, nomeadamente nas mos. Usar s material esterelizado e no tocar com as mos nas pontas das pipetas e nas tampas e interior dos tubos Eppendorf. Ao pipetar olhar sempre para a ponta da pipeta para verificar se entrou lquido. Pegar no tubo Eppendorf com a mo e colocar o lquido no fundo deste. necessrio ter o mximo de cuidado com as enzimas de restrio para no desnaturarem: devem ser retiradas do frigorfico para um recipiente com gelo s no momemto da utilizao. 1 - Preparar trs tubos Eppendorf (1,5 mL) de acordo com a seguinte tabela:

Tubo DNA* Tampo 10x

HindIII EcoRI H2O

H 1 L 1 L 1 L --- 7 L E 1 L 1 L --- 1 L 7 L

Controlo 1 L 1 L --- --- 8 L * 1 g 2 - Misturar os reagentes batendo suavemente na extremidade do tubo. Se necessrio, centrifugar para

evitar que fique lquido nas paredes. 3 - Incubar todos os tubos de reaco por um perodo mnimo de 30 minutos a 37C.

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DNA - 5

Procedimento B: Montagem do gel.

1 - Fechar as extremidades do suporte do gel e inserir o pente para definir os poos. 2 - Preparar 50 mL agarose 1,2 % em tampo TAE (40 mM TRIS-Acetato, 2 mM EDTA, pH=8,3)

num matraz de 200 mL; dissolver a agarose em forno micro-ondas ou em banho de gua a ferver; depois de arrefecer para cerca de 50C, adicionar 3 L de uma soluo de brometo de etdio 10 mg/mL em gua (concentrao final de 1 mg/mL). Ateno: o brometo de etdio mutagnico usar luvas (ver recomendaes anexas).

3 - Verter a agarose no suporte do gel e deixar solidificar. Cuidado, a agarose muito quente deforma

o suporte do gel. 4 - Abrir as extremidades do suporte do gel, retirar o pente. Ateno: poos do lado do ctodo. 5 - Encher a tina com tampo TAE at cobrir a superfcie do gel. Verificar se os poos esto

preenchidos com tampo.

Procedimento C: Carregar o gel 1 - Adicionar 1 L do tampo da amostra (50% glicerol, 0,1% de azul de bromofenol, EDTA 100

mM) a cada tubo de reaco. Deixar ficar a ponta usada para pipetar o corante no tubo de reaco. 2 - Pipetar o contedo total de cada tubo de reaco para um poo do gel, usando a respectiva ponta.

- estabilizar a pipeta sobre o poo com ambas as mos - expelir o ar da ponta antes de carregar o gel - mergulhar a ponta da pipeta um pouco abaixo da superfcie do lquido (no necessrio

introduzir a ponta dentro do poo), posicion-la na direco do poo e expelir a amostra muito lentamente. Cuidado para no furar o gel com a ponta da pipeta.

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DNA - 6

Procedimento D: Electroforese

1 - Fechar a cmara de electroforese e ligar os cabos elctricos a uma fonte de alimentao elctrica de modo a que o ctodo da cmara fique ligado ao ctodo da fonte (preto preto), assim como o nodo (vermelho vermelho). Verificar se os poos com DNA esto do lado do ctodo (polo negativo).

2 - Ligar a fonte de alimentao e regular a voltagem para 70 V. Verificar a formao de pequenas

bolhas gasosas nos elctrodos da cmara. Passados alguns instantes de corrida, deve ver-se o corante azul deslocar-se no gel em direco ao polo positivo. O azul de bromofenol desloca-se mesma velocidade de um fragmento de DNA de aproximadamente 300 bp.

3 - Deixar de correr a electroforese at o azul de bromofenol se encontrar prximo do fim do gel. 4 - Desligar a fonte de alimentao, desligar os cabos de ligao e remover a tampa da cmara de

electroforese. 5 - Cuidadosamente, e usando luvas, retirar o gel com o respectivo suporte da cmara de electroforese. 6 - Examinar o gel com iluminao UV e registar o padro de bandas em fotografia ou desenhando

numa folha de acetato sobreposta ao gel. Neste caso, no esquecer de marcar a posio dos poos. Ateno: proteger os olhos da radiao UV por meio de culos adequados.

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DNA - 7

Resultados e Discusso

1 - Os fragmentos lineares de DNA migram a velocidades inversamente proporcionais ao log10 das suas massas moleculares. Para simplificar, substitui-se a massa molecular dos fragmentos pelo seu tamanho em pares de bases(bp).

2 - Na tabela seguinte esto os tamanhos de fragmentos de DNA de Lambda originados por digesto

com HindIII:

HindIII EcoRI

Distncia (mm) bp real Distncia (mm) bp calculado bp real

23130

9416

6682

4361

2322

2027

*564

*125

* estas bandas podem no ser visveis

3 -Medir a distncia, em mm, desde o bordo frontal do poo a cada uma das bandas e registar na tabela.

4 -Fazer corresponder a distncia a cada banda ao tamanho do respectivo fragmento. 5 - Usando papel semi-logartmico, marcar a distncia migrada no eixo dos xx e o logartmo de kbp no

eixo dos yy, para cada fragmento de HindIII. Unir os pontos. 6 - Usar a curva obtida para obter o tamanho, em kbp dos fragmentos obtidos coma EcoRI, a partir das

distncias migradas. 7 - Registar o valor obtido na tabela, na coluna correspondente a bp calculado. Comparar com os

valores reais conhecidos.

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DNA - 8

Figura 20 - ______________________________________________________________________

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DNA - 9

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DNA - 10

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Bibliografia: DNA Restriction Analysis Kit - Instructors Manual (1990). Carolina Biological Supply Company, USA.

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