Síntese e avaliação de polímeros molecularmente impressos ...€¦ · macromoléculas (RAM-MIP,...
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Luis Felipe Rodríguez Cabal
Síntese e avaliação de polímeros molecularmente impressos restritos a interação
com macromoléculas para determinação analítica de sulfonamidas em matrizes complexas
São Carlos
2014
Luis Felipe Rodríguez Cabal
Síntese e avaliação de polímeros molecularmente impressos restritos a interação com
macromoléculas para determinação analítica de sulfonamidas em matrizes
complexas.
Dissertação apresentada ao Instituo de Química
de São Carlos da Universidade de São Paulo
como parte dos requisitos para obtenção do
título de mestre em ciências.
Área de concentração: Química Analítica e
Inorgânica
Orientador: Prof. Dr. Álvaro José dos Santos
Neto
São Carlos
2014
DEDICATÓRIA
Aos meus pais e irmãos pelo amor e apoio incondicional
A Erika pelo amor e a cumplicidade
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Deus por me dar força nos momentos difíceis e pelas pessoas e
oportunidades que colocou no meu caminho.
A minha família pelo amor e apoio incondicional.
A Erika pelo amor, companhia e cumplicidade.
Ao povo brasileiro que me aceitou como mais um brasileiro.
A Universidade de São Paulo e ao Instituto de Química de São Carlos pela
oportunidade e pelos anos maravilhosos em suas instalações.
Ao meu orientador, Álvaro Jose dos Santos Neto, pela oportunidade, conhecimentos
transmitidos, confiança, respeito, pelas aulas de português e especialmente pela sua
dedicação. Obrigado por tudo professor.
Ao professor Fernando Mauro Lanças pelo apoio à pesquisa e por ter disponibilizado
toda infraestrutura do CROMA para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos membros da banca por aceitar e contribuir com a minha formação.
A Elaine Alves e ao Guilherme Titato, pela sua amabilidade, apoio e conselhos.
Aos meus amigos do grupo de Cromatografia. Especialmente ao Weliton pela
paciência nas aulas de português e a irmandade, a Tanare e a Scarlet pela amizade
e imensa colaboração neste trabalho e ao Rodrigo por não me deixar aposentar do
futebol.
Ao Felipe, Adriel, Maura, Meire, Bruno, Arley, Maraissa, Leticia, Diego, Rose e Lucas,
pelas risadas, companhia, amizade e os excelentes momentos de convivência.
Aos meus amigos Cristian, Irwin, Monica, Julio, David e Cesar.
Ao CNPq pela bolsa e apoio financeiro
A FAPESP (processo 2010/19910-9) e a CAPES
E mais uma vez, OBRIGADO BRASIL!!!!!!
“Viver e não ter a vergonha de ser feliz
Cantar e cantar e cantar
A beleza de ser um eterno aprendiz”
RESUMO
As sulfonamidas são antibióticos amplamente utilizados na medicina humana e animal.
Por apresentarem um custo relativamente baixo, além de seu uso medicinal são comumente
utilizadas como aditivos nos alimentos para promover o crescimento de animais. O alto
consumo das sulfonamidas é preocupante, pois grandes quantidades desses compostos são
descartadas no ambiente por meio de excreções humanas, excreções animais e por águas
residuárias industriais e hospitalares. A presença de sulfonamidas no ambiente, mesmo em
níveis de traços, pode gerar uma toxicidade direta nas espécies expostas bem como a
proliferação seletiva de bactérias resistentes, que podem transferir os genes de resistência
para outras espécies bacterianas. O impacto ambiental negativo ocasionado por esse tipo de
composto exige o monitoramento adequado e o consequentemente desenvolvimento de
técnicas e métodos de análise e de preparo de amostra que consigam atingir suficientes
intervalos e limites de detecção.
Na atualidade a SPE é uma técnica bastante utilizada para extração de analitos em
amostras ambientais, pois permite trabalhar com um consumo de solvente reduzido, sua
reprodutibilidade é alta, o tempo de preparo de amostra é curto e permite a automatização.
No formato automatizado on-line a fase extratora é empacotada em uma pré˗coluna e ligada
ao sistema cromatográfico geralmente por meio de uma válvula de seis pórticos. Dentre as
possíveis fases para a SPE os polímeros molecularmente impressos (MIP) têm tornado-se
atrativos por causa de sua alta seletividade em comparação com as fases extratoras
tradicionais; além disso, permitem, mediante procedimentos simples, associar a tecnologia
MIP com a tecnologia de materiais de acesso restrito - RAM (do inglês: restricted access
media) obtendo assim os materiais RAM˗MIP.
Nesse trabalho foi sintetizado e avaliado o desempenho de um polímero de impressão
molecular (MIP), e três polímeros de impressão molecular restritos à ligação de
macromoléculas (RAM-MIP, BSA-MIP e RAM-MIP-BSA) para a pré-concentração seletiva de
sete sulfonamidas (SNs) em amostras complexas para análise em sistema HPLC-
bidimensional.
Os materiais obtidos foram avaliados em termos de fator de retenção, seletividade,
seletividade competitiva e capacidade de eliminação de macromoléculas. O polímero BSA-
MIP apresentou os melhores resultados, demonstrando-se muito mais seletivo para
sulfonamidas do que para alguns interferentes como fluoroquinolonas, cafeína, ácido
acetilsalicílico entre outros, também demonstrou uma capacidade de exclusão de
macromoléculas de 97,63% ao ser testado com uma solução de 44 mg mL-1 de BSA.
ABSTRACT
Sulfonamides are antibiotics widely used in human and veterinary medicine.
Due to their relatively low cost and their therapeutic effects, they are frequently
employed as growth promoting additive in animal food. This high consumption causes
that high amounts of them are being ejected to the environment through the animal
and human excrements or industrial and hospital wastewater. Even in trace amount,
these compounds can produce direct toxicity in several species and the selective
spread of the antibiotic resistant bacteria that can transfer the resistance genes to
others bacteria species. This negative impact has to be adequately monitored and,
thus, there is a claim to the development of analytical and sample preparation
techniques and methods that permit reaching to very low detection limits and intervals.
Currently solid phase extraction (SPE) is the technique commonly used for
isolation of analytes from environmental samples, since it allows working with smaller
volumes of solvent, shorter sample preparation times, achieving high reproducibility
and allowing automation. In automated on-line SPE the extracted phase is packed into
a precolumn and linked to the chromatographic system, generally by a 6-port valve.
Among the possible phases for SPE the molecular imprinted polymer (MIP) has
become interesting because it is more selective than traditional extraction; moreover,
through simple procedure it can be associated with the restricted acess media (RAM)
producing the RAM-MIP and the MIP-BSA materials.
Here we synthesized and evaluated the performance of one MIP and three
molecular imprinted polymers linked to macromolecules (RAM-MIP, BSA-MIP e RAM-
MIP-BSA) for a selective preconcentration of seven sulfonamides in complex samples
for two-dimensional HPLC analysis.
The synthesized materials was evaluated regarding the retention factor,
competitive selectivity and elimination capacity of macromolecules. The BSA-MIP
option showed the best results, achieving high selectivity for sulfonamides against
others interferences such as fluoroquinolone, caffeine and acetylsalicylic acid;
additionally presenting an exclusion capacity of 97,63% of macromolecules when was
tested with a BSA solution at 44 mg ml-1.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Possíveis rotas de contaminação por resíduos de antibióticos e transferência dos
genes de resistência. ......................................................................................................................... 15
Figura 2 - (a) Estrutura do Ácido p-amino benzoico (b) Estrutura geral das sulfonamidas. .. 16
Figura 3 – Comparação das etapas no preparo de amostra off-line e on-line ........................ 18
Figura 4 - Esquema geral da síntese do MIP ................................................................................ 20
Figura 5 - Funcionamento sistema Column Switching ................................................................ 23
Figura 6 - Representação do mecanismo de ação de uma partícula RAM. ............................ 24
Figura 7 - Sistema cromatográfico com duas etapas de pré˗tratamento. ................................ 26
Figura 8 - Representação de uma partícula RAM-MIP ............................................................... 26
Figura 9 – Representação de uma partícula BSA-MIP ............................................................... 27
Figura 10 - Representação de uma partícula RAM-MIP-BSA .................................................... 27
Figura 11 - (a) Ácido metacrílico (b) Etilenoglicol dimetacrilato (c) 2,2’-azo-bis-iso-butironitrila
(d) Hidróxi etilmetacrilato (e) Glicidil dimetacrilato (mistura de isômeros) ............................... 33
Figura 12 - Foto da montagem empregada na síntese dos polímeros ..................................... 35
Figura 13 - Sistema de pressurização dos reagentes para recobrimento in situ dos polímeros.
............................................................................................................................................................... 37
Figura 14 – Esquema da configuração do cromatógrafo nos testes de eliminação de
macromoléculas sem a pré-coluna .................................................................................................. 40
Figura 15 - Esquema da configuração do cromatógrafo nos testes de eliminação de
macromoléculas contendo a pré-coluna ......................................................................................... 41
Figura 16 - Perfil da adsorção da sulfadimetoxina no MIP ao decorrer do tempo .................. 50
Figura 17 - Cromatogramas dos testes de seletividade.1- Sulfadimetoxina vs cafeína; 2-
Sulfadimetoxina vs norfloxacino; 3- Sulfadimetoxina vs sulfacetamida; 4- Sulfadimetoxina vs
sulfametoxazol; 5- Sulfacetamida vs Cafeína ................................................................................ 54
Figura 18 - Comparação da exclusão do MIP com a “re-injeção” do padrão .......................... 55
Figura 19 - Comparação da exclusão do RAM-MIP com a “re-injeção” do padrão ................ 56
Figura 20 - Cromatogramas obtidos durante os testes de exclusão. a- RAM-MIP-BSA e
padrão; b- MIP-BSA e padrão e c- Sobreposição de todos os cromatogramas advindos dos
testes de exclusão. ............................................................................................................................. 57
Figura 21 – Isoterma de Langmuir na adsorção de sulfadimetoxina no MIP sintetizado por
precipitação ......................................................................................................................................... 58
Figura 22 – Isoterma linearizada de Langmuir na adsorção de sulfadimetoxina no MIP
sintetizado por precipitação .............................................................................................................. 59
Figura 23 - Microscopia eletrônica de varredura dos polímero MIP. A - MIP em batelada; B -
MIP precipitação. ................................................................................................................................ 60
Figura 24 - Microscopia de varredura eletrônica do polímero RAM-MIP. ................................ 61
Figura 25 - Microscopia de varredura eletrônica dos polímeros. A - RAM-MIP-BSA; B – MIP-
BSA. ...................................................................................................................................................... 61
Figura 26 – Arranjo instrumental utilizado no sistema on-line (Carregamento-configuração 1).
............................................................................................................................................................... 62
Figura 27 - Arranjo instrumental utilizado no sistema on-line (Lavagem-configuração 2). .... 63
Figura 28 - arranjo instrumental utilizado no sistema on-line (Dessorção-configuração 3). .. 63
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Estrutura e massa molar dos compostos utilizados neste projeto (Continua ) 31
Tabela 1 – Estrutura e massa molar dos compostos utilizados neste projeto (Conclusão) 32
Tabela 2 – Tempos de retenção das sulfonamidas em tampão amônio pH 9,0. 44
Tabela 3 - Tempos de retenção das sulfonamidas em tampão fosfato pH 7. 44
Tabela 4 - Tempos de retenção das sulfonamidas utilizando tampão acetato pH 4,5 e 30% de
metanol como fase móvel. 45
Tabela 5 - Tempos de retenção das sulfonamidas utilizando tampão acetato pH 4,5 e 10% de
metanol como fase móvel 45
Tabela 6 - Tempos de retenção das sulfonamidas utilizando tampão fosfato pH 2,0 e 30% de
metanol como fase móvel 46
Tabela 7 - Tempos de retenção das sulfonamidas utilizando tampão fosfato pH 2,0 e 10% de
metanol como fase móvel 47
Tabela 8 - Tempo de retenção para as sulfonamidas mais retidas no MIP e NIP sintetizados
por precipitação 48
Tabela 9 –Valores de K e S para as sulfonamidas mais retidas 49
Tabela 10 - Tempo de retenção para as sulfonamidas menos retidas no MIP e NIP sintetizados
por precipitação 49
Tabela 11 - Valores de K e S para as sulfonamidas menos retidas 49
Tabela 12 - Valores de Kd, k e k’ para sulfadimetoxina vs cafeína 51
Tabela 13 – Valores de Kd, k e k’ para sulfadimetoxina vs norfloxacino 51
Tabela 14 - Valores de Kd, k e k’ para sulfadimetoxina vs sulfacetamida 52
Tabela 15 - Valores de Kd, k e k’ para sulfadimetoxina vs sulfametoxazol 52
Tabela 16 - Valores de Kd, k e k’ para sulfacetamida vs cafeína 52
Tabela 17 - Dados da linearidade para as sulfonamidas avaliadas 64
Tabela 18 - Dados obtidos para estudo da precisão intra-dia e inter-dia das sulfonamidas 65
Tabela 19 - Recuperação relativa 66
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIBN ......................................... 2,2-azoisobutironitrila ACN........................................... Acetonitrila AAS .......................................... Ácido acetilsalicílico AS.............................................. Ácido salicílico ANVISA ..................................... Agência Nacional de Vigilância Sanitária BSA .......................................... Albumina bovina sérica CAF............................................ Cafeína
CAQI/IQSC/USP........................ Central de Análise Química Instrumental/ Instituto de Química de São Carlos/ Universidade de São Paulo
ENR........................................... Enrofloxacino HPLC......................................... Cromatografia líquida de alta eficiência EGDMA...................................... Etileno glicol dimetacrilato FDA............................................ Food and Drug Administration GDMA........................................ Glicidil dimetacrilato GMMA........................................ Glicidil monometacrilato MAA ........................................... Ácido metacrílico HEMA........................................ Hidróxi etil metacrilato MeOH......................................... Metanol MEV........................................... Microscopia eletrônica de varredura MIP............................................ Polímero de impressão molecular
MIP-BSA .................................... Polímero de impressão molecular revestido com albumina sérica bovina
NIP............................................. Polímero não impresso NOR........................................... Norfloxacino RAM........................................... Material de acesso restrito
RAM-MIP................................... Polímero de impressão molecular restrito à ligação com macromoléculas
RAM-MIP-BSA .......................... Polímero de impressão molecular restrito à ligação com macromoléculas e revestido com albumina bovina sérica
SPE.............................................
Extração em fase sólida SCT............................................ Sulfacetamida SCZ............................................ Sulfacloropiridazina SDX............................................ Sulfadimetoxina SDZ............................................ Sulfadiazina SMR........................................... Sulfamerazina SMT........................................... Sulfametazina SMX........................................... Sulfametoxazol STZ............................................ Sulfatiazol UV..............................................
Ultravioleta
UV/Vis ......................................
Ultravioleta/visível
SUMÁRIO
1 Introdução ............................................................................................................ 13
1.1 Sulfonamidas ....................................................................................................... 15
1.2 Técnicas de preparo de amostra ......................................................................... 17
1.3 Polímeros molecularmente impressos ............................................................... 19
1.4 Materiais de acesso restrito (RAM) ..................................................................... 23
1.5 Polímeros de impressão molecular restritos à ligaçã o com macromoléculas 25
1.6 Validação de métodos analíticos ........................................................................ 28
1.6.1 Precisão ................................................................................................................ 28
1.6.2 Linearidade (curva de calibração) ....................................................................... 29
1.6.3 Recuperação (eficiência de extração) ................................................................ 29
2 Objetivos ............................................................................................................... 30
2.1 Objetivos específicos .......................................................................................... 30
3. Parte experimental ............................................................................................... 31
3.1 Materiais e reagentes ........................................................................................... 31
3.2 Equipamentos ...................................................................................................... 33
3.3 Sínteses dos polímeros de impressão molecular .............................................. 34
3.3.1 Sínteses do MIP e NIP .......................................................................................... 34
3.3.2 Sínteses do RAM-MIP e RAM-NIP ....................................................................... 36
3.3.3 Síntese do BSA ˗MIP e BSA˗NIP .......................................................................... 36
3.3.4 Síntese do RAM-MIP-BSA e RAM-NIP-BSA ........................................................ 37
3.3.5 Retirada da molécula-molde ................................................................................ 38
3.3.6 Caracterização dos polímeros ............................................................................ 38
3.3.6.1 Microscopia eletrônica de varredura .................................................................. 38
3.3.6.2 Estudos de seletividade em coluna .................................................................... 38
3.3.6.3 Estudo cinético .................................................................................................... 39
3.3.6.4 Estudos de seletividade competitiva .................................................................. 39
3.3.6.5 Teste de eliminação de macromoléculas ........................................................... 40
3.3.6.6 Isoterma de adsorção .......................................................................................... 41
3.3.7 Empacotamento das colunas .............................................................................. 41
3.3.8 Montagem do sistema bidimensional ................................................................. 42
3.3.9 Validação do método ........................................................................................... 42
4.1 Avaliação das metodologias sintéticas – testes de s eletividade em coluna ... 43
4.2 Retirada da molécula molde ................................................................................ 47
4.3 Preenchimento das colunas ................................................................................ 48
4.4 Testes de seletividade em coluna ....................................................................... 48
4.5 Estudo cinético .................................................................................................... 50
4.6 Testes de seletividade competitiva ..................................................................... 51
4.7 Exclusão de macromoléculas ............................................................................. 55
4.8 Isoterma de adsorção .......................................................................................... 57
4.9 Microscopia eletrônica de varredura .................................................................. 60
4.10 Otimização do sistema bidimensional ................................................................ 61
4.11 Validação .............................................................................................................. 63
5 Conclusão ............................................................................................................. 67
13
1 Introdução
A produção e consumo de produtos farmacêuticos têm aumentado muito nos
últimos anos. Estudos confirmam que a velocidade de consumo e produção mundial
está aumentando a uma taxa maior do que ao crescimento populacional. Na União
Europeia até o ano de 2006, eram usadas aproximadamente 300 sustâncias na
medicina humana, entre estas, analgésicos, anti-inflamatórios, anticoncepcionais,
antibióticos, betabloqueadores, reguladores lipídicos, sustâncias psicoativas entre
outras. Em alguns países como Alemanha, Inglaterra e Austrália as quantidades de
substâncias farmacêuticas mais usadas estão na ordem de cem toneladas por ano.
(1,2)
A medicina veterinária também faz uso dos produtos farmacêuticos e geralmente
a utilização destes em animais é pouco fiscalizada pelos órgãos de controle.
Consequentemente, grandes quantidades de medicamentos são administrados e
também acumulados no corpo dos animais, de modo a contribuir com a presença de
compostos químicos indesejáveis na cadeia alimentar, tanto de animais quanto de
humanos. (3)
No ano 2004, a morte inusitada de três espécies de abutres na Índia e Paquistão
despertou o interesse da comunidade científica. A população de abutres indianos de
dorso branco (Gyps bengalensis) diminuiu mais que 95% a partir da década de 1990.
Esse fenômeno foi percebido no parque nacional de Keoladeo (Rajasthan, Índia).
Desde então, declínios catastróficos envolveram outras duas espécies de abutres
(Gyps indicus e Gyps tenuirostris). A causa da morte foi associada com insuficiência
renal e gota visceral. As análises por cromatografia líquida de alta eficiência e
espectrometria de massas (LC-MS) permitiram a detecção de concentrações entre
0,051 e 0,643 µg g-1 de diclofenaco nos rins dos 25 animais estudados. O anti-
inflamatório diclofenaco foi a única droga associada a esse tipo de toxicidade
encontrada na pesquisa. Estudos posteriores demonstraram que o diclofenaco,
administrado para tratar doenças em animais domésticos foi a causa da deficiência
renal nos abutres. (4)
Os medicamentos são planejados para ter um modo específico de ação e a maior
parte deles não sofrem alterações no organismo, portanto depois do uso, grandes
14
quantidades desses produtos são excretadas no ambiente ou descartadas
incorretamente nos esgotos domésticos e hospitalares. (2)
Os produtos farmacêuticos presentes no meio ambiente representam um risco
potencial para a saúde de pessoas e animais. Mesmo em quantidades traço, podem
causar muitas doenças nos seres humanos, entre elas, câncer e mutações genéticas.
Por outro lado, são numerosos os casos nos quais os produtos farmacêuticos
colocaram em risco a saúde animal. Além da toxicidade direta (como foi relatado
anteriormente no caso dos abutres), podem acorrer fenômenos como o da
feminilização de peixes por hormônios sexuais. (2,3)
O impacto ambiental negativo produzido pela presença de produtos
farmacêuticos tem despertado o interesse da comunidade científica. Assim, esses
compostos começaram a ser monitorados na década de setenta e já nas primeiras
pesquisas as quantidades detectadas no meio ambiente mostraram-se preocupantes.
Uma classe importante de fármacos são os antibióticos, eles são empregados
para combater infecções bacterianas nos seres humanos e nos animais. São
numerosos os estudos que demonstraram a presença de antibióticos em diferentes
fontes de água, incluindo efluentes municipais, águas residuárias e águas superficiais.
Tong et al. relataram níveis de contaminação superiores a 20 µg L-1 em alguns
efluentes de agricultura animal, enquanto os níveis gerais oscilam na ordem de
dezenas a centenas de ng L-1, sendo encontrados níveis mais altos nos efluentes
hospitalares e industrias. No Brasil, um estudo recente demonstrou a presença de
antibióticos na bacia do rio Atibaia, região de Campinas (SP). A maior parte dos
antibióticos apresentou concentrações na ordem de ng L-1 ou menos, no entanto, a
região com maior atividade antropogênica chegou a apresentar contaminações de 1,3
e 2,4 µg L-1 para dois dos antibióticos. (5,6,7,8,9)
Do mesmo modo que outros medicamentos mencionados anteriormente,
grandes quantidades de antibióticos não são completamente metabolizados durante
o uso terapêutico, e assim, entram no ambiente de forma inalterada. Esse tipo de
fármaco além de apresentar toxicidade direta pode conduzir a proliferação seletiva de
bactérias resistentes quando há uma exposição prolongada a essas substâncias,
mesmo em concentrações traço (Figura 1).
15
Figura 1 - Possíveis rotas de contaminação por resíduos de antibióticos e transferência dos genes de resistência.
Fonte: Adaptado de Baran et al., 2011.
1.1 Sulfonamidas
As sulfonamidas (SNs) são uma família de antibióticos administradas com muita
frequência e em grandes quantidades nos seres humanos, plantas e animais para o
tratamento de infecções. As SNs foram os primeiros agentes microbianos utilizados
clinicamente, sendo a sulfacrisoidina a primeira a ser utilizada (1935) na era moderna
da quimioterapia antimicrobiana.(10,11)
As sulfonamidas são antibióticos considerados de amplo espectro, por serem
ativas para a maioria das bactérias gram-negativas e também para muitas bactérias
gram-positivas. Além da sua eficiência para tratar doenças bacterianas, também são
usadas como aditivos em alimentos para auxiliar no crescimento de animais.
Adicionalmente, são fármacos de baixo custo. Tudo isso contribui para que cerca de
2,3% do consumo mundial de antibióticos seja de sulfonamidas. (3,12,13)
Uma parte da estrutura das sulfonamidas que apresenta atividade
antimicrobiana é análoga à estrutura do ácido p-aminobenzóico (Figura 2a). Tais
moléculas são amidas do ácido sulfônico, e contém um grupo amino livre ao final
16
(Figura 2b). A ampla variedade de radicais (R) permite que a essa família apresente
um amplo espectro de ação. (2)
Figura 2 - (a) Estrutura do Ácido p-amino benzoico (b) Estrutura geral das sulfonamidas.
Fonte: Autoria própria.
O mecanismo de ação das SNs está baseado na competição com o ácido p-
aminobenzóico (PABA) pela enzima dihidropteroato sintetase, impedindo assim a
síntese de ácido dihidropteróico. Desta maneira, as SNs inibem por mecanismos
competitivo o metabolismo de ácido fólico e consequentemente a síntese de ácidos
nucleicos nas bactérias. As células bacterianas dependem da produção endógena de
ácido fólico para viver, enquanto as células humanas conseguem aproveitar o folato
exógeno. (10,12)
A resistência a esse tipo de composto é gerada porque quando um
microrganismo é exposto a concentrações traço de SNs ele procura rotas diferentes
para a síntese de ácido fólico e diminui a permeabilidade da parede celular às SNs.
Além disso, o microrganismo pode aumentar a produção de PABA ou produzir enzima
dihidropteroato sintetase que apresenta pouca afinidade pelo antimicrobiano. Essa
resistência pode ser transferida a outras gerações através de plasmídeos ou por
transposons. (10,12)
Devido aos efeitos das SNs no ambiente, o monitoramento adequado dessa
família de compostos é necessário. Porém, as sulfonamidas são compostos de baixa
massa molar (entre 170 e 400 Da), com uma alta solubilidade em água,
17
consequentemente, são pouco adsorvidas na maioria das fases extratoras comerciais
(para preparo da amostra) que existem na atualidade. Desta forma, o desenvolvimento
de um procedimento analítico capaz de quantificar o analito em diferentes matrizes,
tais como: esgoto, solo, sangue, entre outras, é de suma importância. Esse método
deve incluir uma técnica de preparo de amostra capaz de extrair, limpar e concentrar
as SNs efetivamente nas diferentes matrizes para a posterior análise cromatográfica.
1.2 Técnicas de preparo de amostra
As técnicas de preparo de amostra (técnicas de extração) permitem separar os
compostos de interesse, reduzindo ou eliminando os interferentes da matriz. O
preparo de amostra tem uma grande influência sobre o tempo necessário para se
completar a análise. Fatores como a amostragem e o preparo de amostra podem
representar até 80% do tempo das análises, além de influenciar na qualidade dos
resultados obtidos. Assim, torna-se necessário desenvolver técnicas de preparo de
amostra rápidas, simples, seletivas e de baixo custo, além de técnicas que minimizem
a manipulação da amostra. (14)
Dentre as técnicas de extração mais tradicionais encontram-se a extração
líquido-líquido (LLE) e a extração por Soxhlet. As principais desvantagens dessas
técnicas são o alto consumo de solventes, a formação de emulsões, a falta de
reprodutibilidade, além de serem técnicas muito laboriosas e realizadas geralmente
no modo off˗line (ou seja manual). Por outro lado, as técnicas modernas, permitem
trabalhar com um consumo de solvente muito menor, não permitem a formação de
emulsões, possuem alta reprodutibilidade com menos tempo de preparo de amostra,
e permitem o trabalho on-line (automatizado). Com relação às análises on-line, a fase
extratora é preenchida numa pré˗coluna e comutada ao sistema cromatográfico,
geralmente por meio de uma válvula de seis pórticos. A Figura 3 compara as etapas
de preparo de amostra no sistema off-line e on-line. (15)
São consideradas técnicas modernas de preparo de amostra: a extração em fase
sólida (SPE), dispersão da matriz em fase sólida (MSDP), extração com fluido
supercrítico (SFE), extração acelerada com solvente (ASE), extração com solvente
subcrítico (SWE), extração assistida por micro-ondas (MAE) e as técnicas
miniaturizadas como, a microextração em fase sólida (SPME), extração por barra de
18
sorção (SBSE), microextração por sorvente empacotado (MEPS) e microextração em
fase líquida (LPME), entre outras. (14,16,17)
Figura 3 – Comparação das etapas no preparo de amostra off-line e on-line
Fonte: Autoria própria.
A SPE, do inglês “solid phase extraction”, está entre as técnicas modernas mais
utilizadas e importantes. Seu mecanismo de ação está baseado na afinidade que
apresentam os analitos pela fase extratora (fase sólida) e a fase móvel. As amostras
líquidas são forçadas a passar pela fase extratora e os analitos ficam retidos no
material por meio de suas interações com a fase estacionária, enquanto os
interferentes são eliminados. (14)
A SPE pode apresentar diferentes formatos, tais como: discos, cartuchos,
bandejas perfuradas, ponteiras, colunas, e as diferentes formas miniaturizadas
(SPME, SBSE, MEPS). Em relação aos tipos de fases extratoras "tradicionais"
utilizadas, têm-se as de grupos hidrofóbicos de octadecil (C18) e octil (C8) ou de grupos
polares como ciano (CN) e amino (RNH2), além das trocadoras catiônicas e aniônicas.
Entretanto, essas fases não possuem alta seletividade e alguns interferentes
19
presentes podem ser co-eluídos. A fim de solucionar esse problema, polímeros
molecularmente impressos (MIP) têm demonstrado várias vantagens em relação às
fases tradicionais, principalmente quando se procura maior seletividade para um
composto ou classe de compostos em uma análise cromatográfica. (14)
1.3 Polímeros molecularmente impressos
Os polímeros de impressão molecular (MIP) são materiais sintéticos com sítios
de reconhecimento gerados artificialmente. São polímeros rígidos e tridimensionais,
sintetizados ao redor de uma molécula-molde. Após a síntese, a molécula-molde é
retirada o que resulta em sítios de reconhecimento molecular. A cavidade impressa
permite a ligação com uma molécula-alvo ou com moléculas estruturalmente
semelhantes. Esse fato permite um grau de seletividade muito superior quando
comparado com as fases extratoras "tradicionais" anteriormente referidas. (18)
A impressão molecular é um método simples e rápido que permite sintetizar
novos materiais utilizados na detecção de drogas, toxinas, pesticidas, componentes
de alimentos e outras moléculas difíceis de serem isoladas. Diversos métodos de
polimerização têm sido desenvolvidos, entre eles, a polimerização em batelada
(“bulk”), polimerização por precipitação, polimerização por suspensão, polimerização
por emulsão e polimerização em duas etapas. Sendo as mais importantes a
polimerização em batelada e a polimerização por precipitação. Cada um destes
procedimentos envolve o controle de diferentes parâmetros durante a síntese e produz
polímeros com propriedades diferentes. (19,20)
Cronologicamente, o primeiro método para a síntese de MIP foi o método de
polimerização em batelada. Esse método consiste basicamente, na mistura de todos
os componentes: a molécula-molde, o monômero, o agente de ligação cruzada, o
iniciador radicalar e o solvente são adicionados a uma ampola de síntese. Em seguida,
o oxigênio presente no sistema deve ser retirado borbulhando-se argônio, nitrogênio
ou empregando-se ultrassom. Posteriormente, a ampola é lacrada e submetida a
aquecimento ou radiação UV para iniciar o processo (Figura 4). O resultado é uma
massa rígida que necessita ser triturada, peneirada e lavada com solvente para a
retirada da molécula-molde e de outros reagentes remanescentes da síntese. As
partículas obtidas pelo método em batelada apresentam uma forma irregular e o
tamanho depende do processo de trituração. Além disso, cerca do 70% do polímero
20
é perdido na trituração e algumas áreas de heterogeneidade são produzidas na matriz
polimérica. (18,20,21)
A síntese pelo método de precipitação difere daquela do método em batelada
pela maior quantidade de solvente utilizado (geralmente o dobro do solvente
empregado no método em batelada) resultando em partículas mais regulares
(estrutura globular). Além disso, o polímero não precisa ser triturado, somente
peneirado para obter o tamanho da partícula de interesse. Na Figura 4 é apresentado
o esquema geral da síntese dos polímeros molecularmente impressos. (22,23)
Figura 4 - Esquema geral da síntese do MIP
Fonte: Autoria própria.
Para o melhor rendimento na produção do MIP pelos métodos em batelada e por
precipitação, a seleção dos reagentes bem como suas concentrações e volumes
devem ser ajustados de forma criteriosa. A seleção do solvente é muito importante e
influencia diretamente nas características morfológicas do polímero. Ele deve ser
capaz de solubilizar todos os reagentes da síntese e permitir as interações entre a
molécula-molde e o monômero funcional. Os monômeros funcionais são os
responsáveis pela formação da rede polimérica. Esses são capazes de formar
ligações covalentes com uma sequência de moléculas iguais ou similares, formando
assim, moléculas maiores chamadas de polímeros. O responsável pela rigidez do
polímero é o agente de ligação cruzada, promovendo a interligação das cadeias
poliméricas formadas pelos monômeros funcionais. (21)
21
A molécula-molde é o analito usado para moldar estereoquimicamente os sítios
de ligação. Para que esta etapa seja bem sucedida é necessário tomar alguns
cuidados na escolha da molécula-molde, pois esta não pode ter grupos envolvidos na
polimerização, além de manter a estabilidade química do polímero e apresentar
grupos funcionais bem adaptados para a ligação com o monômero funcional.
As interações entre a molécula-molde e monômero pode ser de três formas
diferentes: interação covalente, semicovalente e não covalente. Nas interações
covalentes, ligações covalentes reversíveis existem entre o monômero e a molécula-
molde, depois da polimerização a molécula-molde é retirada por quebra das ligações
existentes. A vantagem da ligação covalente reversível é sua alta seletividade. A forte
ligação da molécula molde ao monômero produz uma quantidade elevada de sítios de
reconhecimento, garantindo assim uma maior seletividade do polímero impresso.
Porém, essa forte ligação dificulta o processo de eluição dos analitos na análise
cromatográfica. (21)
As interações semicovalentes são a opção intermediária na preparação de MIP.
Nesse caso, a molécula-molde é ligada covalentemente ao monômero, mas a
religação baseia˗se apenas em interações não covalentes. Já nas interações não
covalentes, interações relativamente fracas (por exemplo, ligação de hidrogênio)
existem entre o molde e o monômero. Essa abordagem é a mais utilizada na
preparação de MIP, pois sua síntese é de fácil realização, e uma grande variedade de
monômeros pode interagir com diferentes tipos de moldes. No entanto, nesse método
a formação de sítios de reconhecimento não seletivos é considerável. (18,20)
Devido à variedade de procedimentos poliméricos o desempenho dos MIP é
relatado na literatura em termos de parâmetros relativos à seletividade. Tais como:
fator de retenção (k) e a seletividade (S). Para determinar k e S os polímeros
sintetizados são preenchidos em colunas cromatográficas que são acopladas no
sistema cromatográfico. Posteriormente, compostos de interesse são injetados no
sistema cromatográfico e os tempos de retenção são obtidos. O cálculo do coeficiente
de retenção e da seletividade dá-se de acordo com as seguinte equações: (24)
(Equação 1)
Onde: tR= tempo retenção analito; t0= tempo de eluição de um composto não retido
� =�� � ��
��
22
(Equação 2)
Outros pesquisadores preferem os testes de “seletividade competitiva” para
conhecer o efeito de impressão dos polímeros. Neste tipo de teste, uma determinada
quantidade do polímero entra em contato com uma solução que contém
concentrações conhecidas de dois analitos. A solução junto com o polímero é agitada
por um tempo determinado. Posteriormente, a concentração dos analitos é
determinada por cromatografia e o desempenho dos polímeros avaliado pelas
equações 3, 4 e 5, onde são determinados o coeficiente de distribuição (Kd),
coeficiente de seletividade (K) e o coeficiente de seletividade relativa (K’). (25)
(Equação 3)
Onde Ci = concentração inicial, Cf = concentração final, Vs = volume da solução
(Equação 4a)
(Equação 4b)
(Equação 5)
Embora os MIP sejam materiais robustos e de alta seletividade, são materiais
suscetíveis à ligação com macromoléculas (por exemplo, proteínas e lipídios) o que
impede seu uso direto em amostras biológicas ou ambientais. Isso se deve à forte
adsorção de macromoléculas na superfície dos polímeros interferindo negativamente
nas capacidades de reconhecimento. Pensando em solucionar este problema,
Haginaka et al. (2007) propuseram um material que associa as características
vantajosas dos RAM (materiais de acesso restrito) e dos MIP em um único polímero
capaz de reter seletivamente um tipo de moléculas e eliminar quantitativamente as
macromoléculas. Esse tipo de polímero é conhecido como RAM-MIP. (26)
K =C� � C
C�
X V��mL�
massa do MIP ou NIP �g�
23
1.4 Materiais de acesso restrito (RAM)
Os materiais (ou meios) de acesso restrito têm se destacado na literatura
científica nas últimas duas décadas, e são utilizados geralmente na análise de
substâncias com baixa massa molar em matrizes complexas. Esse tipo de material
exclui as moléculas de alta massa molar concentrando simultaneamente o analito. Os
RAM permitem a injeção direta e repetitiva de amostras biológicas e ambientais sem
tratamento prévio no sistema cromatográfico. Essa injeção ocorre frequentemente por
meio de um sistema bidimensional que utiliza válvulas de seis pórticos no
acoplamento das colunas RAM com os demais componentes do sistema
cromatográfico (bombas, sistema de injeção, coluna e detector) (Figura 5). (27,28,29)
Inicialmente a amostra injetada passa por uma pré˗coluna preenchida com o
material do tipo RAM, que retém os analitos de baixa massa molar e descarta as
macromoléculas. A seguir, a posição da válvula de seis pórticos é trocada, permitindo
que uma fase móvel apropriada elua os analitos da pré˗coluna RAM, direcionando-os
para a coluna analítica. Essa troca de colunas no sistema cromatográfico é geralmente
denominada column switching. A Figura 5 ilustra um esquema representativo do
funcionamento do sistema column switching. (30,31)
Figura 5 - Funcionamento do sistema de column switching
Fonte: adaptado de Santos-Neto, A., 2007
24
Os materiais de acesso restrito podem possuir estruturas diferentes, porém o
mecanismo fundamental de ação é idêntico. Este consiste em uma barreira repelente
que permite a permeação das moléculas pequenas, garantindo o acesso delas à
interação com a fase estacionária; enquanto essa barreira exclui as macromoléculas
por meio de impedimentos físicos, químicos, ou uma combinação de ambos. A Figura
6 ilustra um esquema representativo do funcionamento do mecanismo de ação de
uma partícula RAM. (29)
Figura 6 - Representação do mecanismo de ação de uma partícula RAM.
Fonte: MULLETT, W. M., 2007.
Alguns materiais RAM utilizam poros (geralmente de 60 Å), que atuam como
barreira repelente. Os poros só permitem a entrada de moléculas pequenas, excluindo
assim, macromoléculas como proteínas, lipídios, ácidos nucleicos entre outros
interferentes. Outros materiais aproveitam a presença de grupos funcionais
hidrofílicos na superfície externa da fase estacionária, esses grupos funcionais
também agem como uma barreira, desta vez química, para as macromoléculas
hidrofóbicas. (28,29)
A tecnologia dos polímeros molecularmente impressos pode ser agregada à dos
materiais RAM, obtendo-se assim polímeros de impressão molecular restritos a
ligações com macromoléculas. O resultado é um material altamente seletivo para a
extração de compostos de interesse e, ao mesmo tempo, compatível com amostras
cuja matriz apresenta alto grau de complexidade.
25
1.5 Polímeros de impressão molecular restritos à ligaçã o com macromoléculas
Os primeiros trabalhos que tentaram aliar as características seletivas dos MIP e
a capacidade de eliminar as macromoléculas dos materiais RAM, integrados em um
sistema cromatográfico, utilizaram duas colunas onde os materiais ficam separados,
e requerendo assim duas etapas de pré˗tratamento (Figura 7).
A amostra é injetada diretamente (sem tratamento prévio) no sistema
cromatográfico e passa pela coluna RAM, os analitos e alguns interferentes de baixa
massa molar ficam retidos e as macromoléculas são excluídas (Figura 7a). Depois, os
compostos retidos na coluna RAM são eluídos e levados para a coluna MIP, havendo
então adsorção seletiva (Figura 7b). Por último, os analitos retidos são separados na
coluna analítica e seguem para a detecção. Apesar da efetividade no tratamento da
amostra, a implantação desse sistema é complexa e requer várias bombas e válvulas.
Dessa forma surgiram os RAM-MIP, como uma alternativa para utilizar um único
material que integre as características vantajosas dos RAM e dos MIP na mesma fase.
(29,31)
Os RAM˗MIP são polímeros que apresentam sítios de reconhecimento molecular
e grupos hidrofílicos externos, impedindo a ligação com macromoléculas. Para
sintetizar materiais com essas características é realizada a inserção de um monômero
hidrofílico como o 2-hidroxietil metacrilato (HEMA) na mistura de pré-polimerização.
Esse composto é conhecido por aumentar a compatibilidade dos sistemas RAM˗MIP
com amostras aquosas. Adicionalmente é capaz de interferir na formação de sítios de
reconhecimento na polimerização, formando ligações de hidrogênio com vários
analitos. (26,32)
Outra abordagem envolve um processo de polimerização em duas etapas, e
inclui a modificação da superfície do MIP, adicionando HEMA e glicidil dimetacrilato
(GDMA) após um certo tempo da polimerização. Esses co˗monômeros têm grupos
vinil que podem integrar a rede polimérica e grupos hidroxila que darão a restrição a
macromoléculas hidrofóbicas (Figura 8). Assim, é possível evitar a deposição de
macromoléculas sobre a superfície polimérica o que melhora o processo de
reconhecimento. A Figura 8 ilustra um esquema representativo de uma partícula RAM-
MIP. (26,27,32)
26
Figura 7 - Sistema cromatográfico com duas etapas de pré˗tratamento.
Fonte: MULLETT, W. M., 2007.
Figura 8 - Representação de uma partícula RAM-MIP
Fonte: Autoria própria.
Grupos hidroxila
27
Outra possibilidade surge com a imobilização da albumina sérica bovina (BSA)
na superfície do MIP por meio de reações de entrecruzamento, após a percolação
prévia de uma solução de BSA pelo MIP. Assim, são obtidos os polímeros do tipo MIP-
BSA. Dessa maneira é impedida a deposição de macromoléculas hidrofílicas sobre o
MIP. A Figura 9 ilustra um esquema representativo de uma partícula MIP-BSA.
(33,34,35)
Figura 9 – Representação de uma partícula BSA-MIP
Fonte: Autoria própria.
Finalmente, também é possível modificar a superfície do MIP com HEMA, GDMA
e em seguida, com BSA, obtendo-se dessa maneira um polímero de impressão
molecular com alta restrição à ligação de macromoléculas. Esse tipo de material é
geralmente chamado de RAM˗MIP˗BSA. A Figura 10 ilustra um esquema
representativo de uma partícula RAM-MIP-BSA. (28,33)
Figura 10 - Representação de uma partícula RAM-MIP-BSA
Fonte: Autoria própria.
BSA
28
Essas novas tecnologias de preparo de amostra devem ser submetidas a uma
série de avaliações experimentais para garantir que o novo material seja capaz de
gerar informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra. Essa série de
avaliações é denominada validação. (36)
1.6 Validação de métodos analíticos
A validação tem como objetivo demonstrar que um método ou material de análise
é adequado para o proposito pretendido. Quando um método é desenvolvido deve-se
providenciar uma adequada validação para que ele possa ser usado na rotina de um
laboratório. A validação de um método é um processo contínuo que começa no
planejamento da estratégia analítica e continua ao longo de todo seu desenvolvimento
e aplicação. (36)
Diversos órgãos de controle no Brasil como: a Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA), o Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
(INMETRO), o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) e outros
órgãos internacionais como a Food and Drug Administration (FDA) nos Estados
Unidos, a Eurachem na União Europeia, além de outros órgãos de controle e diversos
artigos e revisões fornecem regulamentações ou guias, que estabelecem uma série
de parâmetros que compõem o processo de validação. Alguns parâmetros avaliados
nesse trabalho são abordados a seguir. (37)
1.6.1 Precisão
A precisão é a medida da dispersão dos resultados obtidos a partir de medidas
independentes de amostragens múltiplas de uma amostra homogênea. Em outras
palavras, é a concordância entre múltiplas medidas de uma única e homogênea
amostra. Este parâmetro que possibilita ao analista decidir se o método é confiável ou
não para o objetivo da análise. (36)
A precisão intra-dias (repetibilidade) mede a capacidade do método em repetir,
em um intervalo de tempo pequeno, os resultados obtidos nas mesmas condições de
análise, em outras palavras com o mesmo analista, o mesmo equipamento, no mesmo
laboratório e fazendo uso dos mesmos reagentes.
29
A precisão inter-dias (intermediária) é utilizada para demonstrar a capacidade do
método em fornecer os mesmos resultados quando as análises são conduzidas no
mesmo laboratório, mas em diferentes dias, por diferentes analistas ou diferentes
equipamentos. (37)
1.6.2 Linearidade (curva de calibração)
A linearidade é a habilidade de um método em descrever a função de resposta
(y) e a concentração (x). Ou seja a linearidade corresponde à capacidade do método
em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em
exame, dentro de uma determinada faixa de aplicação. (38)
A linearidade deve ser avaliada idealmente usando no mínimo 6 a 8
concentrações diferentes do analito (padrões de calibração) adicionadas à mesma
matriz para o qual o método foi desenvolvido e será aplicado. Esse parâmetro é
avaliado pela construção de um gráfico de resposta (y) vs. concentração do analito
(x), usando o método dos mínimos quadrados para obter uma função do tipo y = ax+b.
Onde a é o coeficiente angular ou inclinação da reta e b é o coeficiente linear ou
intercepto.
A curva de calibração deve contemplar a faixa de aplicação para a qual o ensaio
será utilizado. A maioria dos órgãos de controle recomendam que a curva de
calibração seja preparada na matriz e que a concentração mais esperada da amostra
deve, sempre que possível, se encontrar no centro da faixa linear. (36,37)
1.6.3 Recuperação (eficiência de extração)
A recuperação refere-se à capacidade que tem um método em retirar o analito
do seio da matriz. No cálculo da eficiência de extração compara-se a resposta do
analito adicionado na matriz e extraído com a resposta do extrato da amostra
fortificado com o analito após a extração.
Na maioria dos casos, a dispersão dos resultados aumenta com a diminuição da
concentração e a recuperação pode diferir consideravelmente a altas e baixas
concentrações. Por esse motivo, a recuperação deve ser avaliada em três níveis:
baixo, médio e alto, de acordo com a curva de calibração. (37)
30
2 Objetivos
O trabalho tem como objetivo sintetizar e avaliar o desempenho de um polímero
de impressão molecular (MIP), e três polímeros de impressão molecular restritos à
ligação de macromoléculas (RAM˗MIP, BSA˗MIP e RAM˗MIP˗BSA) para a pré-
concentração seletiva e análise de sete sulfonamidas (SNs) em amostras complexas
(esgoto suíno) utilizando um sistema HPLC-bidimensional.
2.1 Objetivos específicos
� Sintetizar os materiais MIP, RAM˗MIP, BSA˗MIP e RAM˗MIP˗BSA para
sulfonamidas e os equivalentes polímeros não impressos NIP, RAM˗NIP,
BSA˗NIP e RAM˗NIP˗BSA.
� Avaliar os materiais obtidos em relação a seletividade e capacidade de
eliminação de macromoléculas.
� Caracterizar os materiais por microscopia eletrônica de varredura e construir a
isoterma de adsorção da sulfadimetoxina (molécula-molde).
� Avaliar o potencial dos materiais sintetizados quanto à pré-concentração e
eliminação do efeito de matriz para a melhoria da sensibilidade em análises por
cromatografia líquida bidimensional.
� Avaliar as condições experimentais para a extração seletiva das sulfonamidas
em amostra de esgoto suíno.
� Validar o método de acordo com as recomendações pertinentes a análises
ambientais de traços em matrizes complexas.
31
3. Parte experimental
3.1 Materiais e reagentes
Os padrões analíticos de sulfadimetoxina (SDX) (≥98,5%), sulfametoxazol (SMX)
(99%), sulfacloropiridazina (SCZ) (99%), sulfadiazina (SDZ) (99%), sulfamerazina
(SMR) (99%), sulfametazina (SMT) (99%), sulfacetamida (SCT) (98%), sulfatiazol
(STZ) (98%), sulfametoxazol-(fenil13C6) (99%), cafeína (CAF) (98%), ácido salicílico
(AS) (99%), ácido acetilsalicílico (AAS) (99%), norfloxacino (NOR) (99%), e
enrofloxacino (ENR) (99%), foram adquiridos de Sigma–Aldrich. Utilizou-se água
deionizada purificada do sistema Milli-Q da Millipore. Os solventes orgânicos metanol
(MeOH) e acetonitrila (ACN) (grau HPLC) e ácido fórmico (96%) foram adquiridos da
Tedia. A Tabela 1 indica a estrutura e a massa molar dos padrões analíticos utilizados
neste projeto.
Tabela 1 – Estrutura e massa molar dos compostos utilizados neste projeto (Continua )
Composto Estrutura Massa molar (g mol -1)
Sulfadimetoxina
310,3
Sulfametoxazol
253,3
Sulfacloropiridazina
284,7
Sulfadiazina
250,3
32
Tabela 1 – Estrutura e massa molar dos compostos utilizados neste projeto (Conclusão)
Sulfamerazina
264,3
Sulfametazina
278,1
Sulfacetamida
214,2
Sulfatiazol
255,3
Cafeína
194,19
Ácido salicílico
138,12
Ácido acetilsalicílico
180,16
Norfloxacino
319,33
Enrofloxacino
359,39
Fonte: Autoria própria.
33
Os MIP foram sintetizados a partir do ácido metacrílico (MAA) 99% (monômero),
etileno glicol dimetacrilato (EGDMA) 98% (agente de ligação cruzada),
azoisobutironitrila (AIBN) 98% (iniciador radicalar), sulfadimetoxina sal de sódio (≥
98,5%) (molécula-molde) e ACN 99,8% (solvente). Na síntese dos RAM-MIP além dos
reagentes anteriormente mencionados, foram empregados os co-monômeros hidróxi
etil metacrilato (HEMA) 97% e glicidil dimetacrilato – mistura de isômeros (GDMA)
(Figura 11).
Figura 11 - (a) Ácido metacrílico (b) Etilenoglicol dimetacrilato (c) 2,2’-azo-bis-iso-butironitrila
(d) Hidróxi etilmetacrilato (e) Glicidil dimetacrilato (mistura de isômeros)
Fonte: Autoria própria.
Nas reações de imobilização da albumina sérica bovina (BSA) sobre as
superfícies dos polímeros, empregou-se além da proteína, uma solução aquosa de
glutaraldeído 25% e borohidreto de sódio 98%. As soluções de BSA foram preparadas
em tampão fosfato 0,01mol L-1 pH 7,0.
3.2 Equipamentos
Para as análises foi utilizado um sistema de cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC) da série 20A Prominence, Shimadzu, contendo bombas LC-20AD,
amostrador automático SIL-20A, forno para colunas CTO-20A e detector UV/Vis SPD
20A. Este sistema foi equipado com uma coluna analítica Poroshell 120 EC-C18 (100
mm x 3,0 mm; 2,7 µm) adquirida da Agilent Technologies.
34
Para a validação do método analítico objetivando o acoplamento da coluna com
os polímeros em um sistema on-line com detecção por espectrometria de massas
empregou-se o sistema LC-ESI-QtoF/MS compreendido por um HPLC Shimadzu série
20A Prominence, equipado com uma coluna analítica Poroshell 120 EC-C18 (100 mm
x 3,0 mm; 2,7 µm) e espectrômetro Bruker Daltonics modelo microTOF-Q II. Os
compostos foram analisados por electrospray (ESI), operando no modo positivo com
temperatura de dessolvatação de 200°C, voltagem do capilar a 4,5 kV, fluxo do gás
de secagem de 8 mL min-1 e pressão do nebulizador de 1,6 bar. Intervalo de m/z
monitorado de 50 a 3000 u, taxa de aquisição de espectros a 2 Hz no modo full MS
Nos estudos onde foi necessário manter a temperatura constante além de
agitação (estudo cinético e construção da isoterma de absorção) foi utilizada uma
câmara incubadora com agitação orbital marca Marconi, modelo MA1415.
As fotomicrografias de MEV foram obtidas na Central de Análises Químicas
Instrumentais do Instituto de Química de São Carlos (CAQI/IQSC/USP) em um
equipamento ZEISS LEO 440 (Cambridge, England) com detector OXFORD (modelo
7060), operando com feixe de elétrons de 15 kV, corrente de 2,82 A e I probe de 200
pA. Previamente à obtenção das fotomicrografias, as amostras foram recobertas com
uma superfície nanométrica de ouro em um metalizador Coating System BAL-TEC
MED 020 (BAL-TEC, Liechtenstein).
As medidas de massa foram realizadas em uma balança analítica Mettler Toledo,
modelo AG285. Do mesmo modo, as medições de pH foram realizadas em um
potenciômetro Qualxtron, modelo 8010. Quando necessário, foram utilizadas as
centrífugas Celm, modelo LS-3 Plus e Eppendorf do tipo MiniSpin.
3.3 Sínteses dos polímeros de impressão molecular
3.3.1 Sínteses do MIP e NIP
O polímero MIP foi sintetizado pelo método em batelada e de precipitação. Para
o método em batelada foram misturados inicialmente 1 mmol de sulfadimetoxina
(molécula-molde), 5 mL de etilenoglicol dimetacrilato (agente de ligação cruzada) e
4 mmol de ácido metacrílico (monômero) em 24 mL de acetonitrila (solvente), e
levados ao ultrassom durante 20 minutos. Em seguida, foram adicionadas 120 mg do
iniciador radicalar AIBN e a solução foi submetida a mais 20 minutos ao ultrassom.
35
Finalmente, o sistema foi lacrado, purgado com nitrogênio, mantido a 60°C e com
agitação constante durante 24 horas. A escolha dos reagentes e suas proporções
baseou-se nos resultados apresentados no trabalho de Shi et al. (24)
A mistura dos reagentes foi realizada em um balão de duas bocas de fundo
redondo e aquecida em um banho de óleo a 60°C. A temperatura foi mantida constante
por meio de um banho termostatizado, pelo qual se faz circular água na camisa de
vidro que continha o banho de óleo. As bocas do balão foram lacradas com septos o
que permitiu purgar o sistema com nitrogênio e a adição de reagentes quando
necessário. A Figura 12 é uma foto real da montagem empregada na síntese.
Figura 12 - Foto da montagem empregada na síntese dos polímeros
Fonte: Autoria própria.
Para a síntese do MIP pelo método de precipitação foram empregadas as
mesmas quantidades da molécula-molde, monômero, agente de ligação cruzada e
iniciador radicalar anteriormente mencionadas, porém a quantidade de solvente foi
36
acrescentada até 48 mL. Nos dois casos, um polímero não impresso molecularmente
(NIP) (polímero controle) foi sintetizado da mesma forma, entretanto sem a presença
da molécula molde.
3.3.2 Sínteses do RAM-MIP e RAM-NIP
Antes de prosseguir com a sínteses dos polímeros RAM-MIP. Optou-se em
submeter os polímeros MIP descritos no item anterior, a testes de seletividade e
determinação do fator de retenção para 8 sulfonamidas e uma série de compostos
considerados interferentes (ácido salicílico, ácido acetilsalicílico, norfloxacina,
enrofloxacina e cafeína), os testes são descritos na seção 3.3.6.2.
Baseado nos resultados desses testes, optou-se por sintetizar os polímeros
RAM-MIP pelo método de precipitação, pois foi a síntese do polímero que apresentou
os melhores valores de seletividade e fator de retenção. Assim, para a síntese dos
polímeros RAM-MIP, empregou-se as mesmas quantidades de reagentes descritas
na síntese do polímero MIP realizado pelo método de precipitação, no entanto depois
de duas horas de reação foram adicionados os co-monômeros HEMA e GDMA (7,5
mmol e 0,5 mmol respectivamente) no balão de reação, a escolha das quantidades
dos co-monômeros foi baseada no trabalho de Moraes et al. Ao adicionar esses
reagentes procurou-se conferir o caráter hidrofílico do polímero e restringir assim a
sua ligação com macromoléculas hidrofóbicas. Nos dois casos um polímero não
impresso molecularmente (polímero controle) foi sintetizado da mesma forma,
entretanto sem a presença da molécula molde.
3.3.3 Síntese do BSA ˗MIP e BSA˗NIP
O revestimento do polímero MIP e NIP com BSA foi realizado in situ, de maneira
similar ao processo descrito por dos Santos e Menezes (39,40). Para isso os
polímeros foram preenchidos em pré-colunas cromatográficas de aço inoxidável com
diâmetro interno de 4,6 mm e comprimento de 40 mm aproximadamente. O processo
de empacotamento das colunas será descrito em maior detalhe no item 3.3.7. (40,41)
Depois de preenchidas, as colunas foram acopladas a um sistema de
pressurização (Figura 13). O sistema é composto por cilindro de gás nitrogênio,
válvula agulha, reservatório, coluna empacotada e descarte. Os reagentes usados no
37
revestimento dos polímeros foram pressurizados diretamente por nitrogênio. A vazão
dos reagentes foi ajustada para aproximadamente 1 mL min-1. Inicialmente, a coluna
foi condicionada com 25 mL de tampão fosfato 20 mmol L-1 pH 6,0, seguido por um
fluxo de solução 1 mg mL-1 de BSA (preparada no mesmo tampão), por 20 minutos.
Em seguida, percolou-se solução aquosa de glutaraldeído 25% (v/v), deixando-se o
sistema em repouso por 5 horas. Finalmente, foi passado pela pré-coluna 5 mL de
borohidreto de sódio 1 mg mL-1 e, depois de duas horas de repouso a coluna foi
retirada do sistema de pressurização, acoplada a uma bomba cromatográfica e lavada
por aproximadamente 10 horas com água ultrapura.
3.3.4 Síntese do RAM-MIP-BSA e RAM-NIP-BSA
Para a síntese do polímero RAM-MIP-BSA utilizou-se o mesmo método descrito
no item 3.3.3, entretanto o polímero revestido foi o RAM˗MIP. Para obter o
RAM˗NIP˗BSA recobriu-se o RAM˗NIP com BSA, conforme mencionado
anteriormente.
Figura 13 - Sistema de pressurização dos reagentes para recobrimento in situ dos polímeros.
(1) Cilindro gás nitrogênio, (2) válvula agulha, (3) reservatório, (4) coluna empacotada (5)
descarte.
Fonte: adaptado de Santos-Neto,A., 2007
38
3.3.5 Retirada da molécula-molde
Depois de sintetizados os polímeros, foi necessário retirar a molécula-molde dos
MIP. Para a retirada da molécula-molde foram testadas duas metodologias. A primeira
delas foi colocar as partículas dos polímeros em um recipiente de reação e lavagem
com a solução metanol/ácido fórmico (90:10). (42,43)
Na segunda metodologia empacotou-se os polímeros em colunas
cromatográficas (conforme item 3.3.7), seguido por acoplamento em um sistema
cromatográfico e lavagem dos polímeros com acetonitrila/agua, por meio de um
gradiente com intervalos de 0 a 100% de solvente orgânico (Foram testados ACN e
metanol).
3.3.6 Caracterização dos polímeros
3.3.6.1 Microscopia eletrônica de varredura
Com o objetivo de verificar o tamanho e a forma das partículas dos polímeros,
estes foram submetidos à análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV).
Desta forma as amostras foram recobertas com 6 nm de ouro em um metalizador e
mantidas em dessecador até o momento da análise. As condições de metalização
foram as seguintes: pressão na câmara: 2,00x10-2 mbar; corrente: 60 mA; taxa de
deposição 0,60 nm/s).
3.3.6.2 Estudos de seletividade em coluna
Depois de sintetizados, os MIP (sintetizados pelo método em batelada e de
precipitação), foram submetidos a testes de seletividade em coluna. O objetivo destes
testes foi determinar a seletividade e o fator de retenção, em relação aos analitos e os
interferentes e, assim, determinar qual método de síntese apresenta os melhores
resultados.
Para isso os polímeros foram empacotados em colunas cromatográficas de
4,6 mm de diâmetro interno e comprimento de 40 mm (conforme item 3.3.7). As
colunas preenchidas foram acopladas ao HPLC. Posteriormente, foram injetados os
analitos e os “interferentes” de modo a determinar o fator de retenção e os valores de
39
seletividade. É importante mencionar que estes parâmetros estão relacionados com o
pH do meio, assim como o solvente utilizado. Portanto, foram testados diferentes
solventes (metanol e acetonitrila) e diferentes valores de pH (2,0; 4,5; 7,0 e 9,0). Para
a fase aquosa com pH 2,0 e 7,0 foi utilizado tampão fosfato 20 mmol L-1, para o pH
4,5 foi empregado tampão acetato 20 mmol L-1 e para o pH 9,0 tampão amônio 20
mmol L-1.
3.3.6.3 Estudo cinético
O tempo necessário para que a interação entre a sulfadimetoxina (molécula-
molde) e o MIP chegue ao equilíbrio (estudo cinético) foi determinado. Para isso, oito
tubos de ensaio contendo 10 mg de MIP (cada) foram adicionados de 2 mL de uma
solução tamponada (tampão fosfato 20 mmol L-1 pH 2,0) de sulfadimetoxina (300
mg L-1). Esses tubos foram mantidos sob agitação constante a temperatura ambiente.
Assim, alíquotas do sobrenadante de cada tubo foram coletadas em tempos pré-
determinados (5, 10, 20, 25, 30, 40, 45 e 60 minutos). A sulfadimetoxina remanescente
foi quantificada por HPLC usando uma coluna analítica Poroshell 120 EC-C18 (100
mm x 3,0 mm; 2,7 µm), fase móvel de acetonitrila/agua acidificados com 0,1% de ácido
fórmico.
3.3.6.4 Estudos de seletividade competitiva
Para os testes de seletividade competitiva foram formadas cinco combinações
(soluções binárias) do tipo sulfonamida A/sulfonamida B e sulfonamida/interferente.
50 mg do MIP foram adicionados a um frasco de polietileno e agitado durante 20
minutos com 10 mL da solução binária contendo 1 mg mL-1 de cada analito e
tamponada (pH 2,0) com fosfato 20 mmol L-1 (o pH e concentração do tampão adotado
foram extraídos do procedimento de seletividade em coluna). Seguidamente, as
quantidades de sulfonamida e interferente adsorvidos pelo MIP foram determinadas
pela diferença entre a concentração inicial e a concentração do sobrenadante. A
concentração do sobrenadante foi determinada conforme relatado na seção anterior.
Finalmente, foram determinados o coeficiente de distribuição (Kd), o coeficiente de
seletividade (K) e o coeficiente de seletividade relativo (K’).
40
3.3.6.5 Teste de eliminação de macromoléculas
Para avaliar a capacidade dos polímeros sintetizados quanto a eliminação de
macromoléculas, foram injetados 100 µL de soluções aquosas de albumina sérica
bovina com concentrações de 11, 22, 33 e 44 mg mL-1. Os 100 µL das soluções de
BSA foram injetados em um sistema de cromatografia líquida sem nenhuma coluna e
com o detector operando em 280 nm, no lugar da coluna foi colocado uma união para
fechar o “circuito” cromatográfico (Figura 14). A fase móvel empregada foi tampão
fosfato pH 2,0 (20 mmol L-1) e vazão de 1 mL min-1. Imediatamente depois da injeção
foi coletado tudo o que saía do detector em um balão volumétrico de 5 mL durante 4
minutos. Posteriormente, o volume do balão foi completado até 5 mL e a solução foi
injetada novamente, com as bandas cromatográficas obtidas foi construída uma curva
de calibração.
Figura 14 – Esquema da configuração do cromatógrafo nos testes de eliminação de macromoléculas sem a pré-coluna
Fonte: Autoria própria.
Posteriormente, foram colocadas as colunas MIP, RAM-MIP, RAM-MIP-BSA e
BSA-MIP no percurso analítico (uma de cada vez) e 100 µL do padrão BSA de 44 mg
mL-1 (mesma concentração média de albumina encontrada no plasma humano) foram
injetados no sistema cromatográfico. Do mesmo modo, foi coletado o que saiu do
detector em um balão volumétrico de 5 mL durante 4 minutos (Figura 15). O volume
do balão foi completado até 5 mL e a solução foi injetada novamente. As bandas
cromatográficas obtidas foram comparadas com as advindas da injeção do padrão de
44 mg mL-1 sem coluna e dessa forma foi avaliado o porcentual de BSA eliminado
pela coluna.
41
Figura 15 - Esquema da configuração do cromatógrafo nos testes de eliminação de macromoléculas contendo a pré-coluna
3.3.6.6 Isoterma de adsorção
Para a obtenção da isoterma de adsorção realizou-se um experimento em
batelada. Assim, aos tubos de ensaio com soluções tamponadas (tampão fosfato 20
mmol L-1, pH 2,0) de sulfadimetoxina nas concentrações de 125, 150, 175, 200, 225,
250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 e 1000 mg L-1 foram adicionados
10 mg de MIP. Os tubos foram agitados por 20 minutos (tempo determinado no estudo
cinético) e a uma temperatura constante de 35°C. A temperatura (parâmetro muito
importante nesse experimento) foi controlada com ajuda da câmara incubadora com
agitação. Finalmente, as suspensões foram centrifugadas e a sulfadimetoxina
presente no sobrenadante foi quantificada por HPLC, do mesmo modo relatado na
seção 3.3.6.3. A quantidade de sulfadimetoxina adsorvida pelo MIP foi determinada
pela diferença entre a concentração inicial e a concentração do sobrenadante.
3.3.7 Empacotamento das colunas
Para o empacotamento das colunas, primeiramente, selecionou-se as partículas
com tamanhos entre 38 e 75 µm. Para isso, os polímeros foram peneirados utilizando-
se peneiras granulométricas de aço inox de 400 e 200 mesh. O processo de
peneiramento foi realizado manualmente. Em seguida, suspendeu-se as partículas
em acetona e aguardou-se um determinado tempo até que as partículas de maior
massa sofressem a decantação. O sobrenadante foi descartado e com ele as
partículas mais leves. Este procedimento foi realizado sucessivas vezes até que o
tempo para decantação total fosse de 2 a 3 minutos.
As colunas foram manualmente empacotadas com as partículas selecionadas.
O material empacotado foi preenchido usando uma bomba cromatográfica LC˗20D e
metanol como solvente propulsor.
42
3.3.8 Montagem do sistema bidimensional
Na montagem do sistema bidimensional foram acoplados um cromatógrafo
Shimadzu da série 20A, 4 bombas de alta pressão, uma coluna analítica Poroshell
120 EC-C18 (de Agilent Technologies), duas válvulas de seis pórticos e duas posições
e um espectrômetro da Bruker do tipo QToF. O sistema foi controlado pelo software
HyStar da Bruker.
3.3.9 Validação do método
O protocolo de validação foi desenvolvido com a adaptação de diferentes guias
de validação aceitos por diferentes agências: EPA, FDA, ANVISA, INMETRO, AOAC
e FDA. Adaptações foram necessárias devido à inexistência de guias específicos para
as análises de antibióticos em amostras aquosas e com ênfase ambiental.
Na validação foram avaliados os seguintes parâmetros: linearidade, precisão,
recuperação e o limite de quantificação. Uma curva analítica foi construída com
quintuplicatas de análises de amostra de esgoto sintético (composição - vide Anexo
3) em seis concentrações diferentes: 100, 200, 400, 600, 800 e 1000 µg L-1.
A curva de calibração foi obtida plotando-se a divisão da área da banda
cromatográfica do analito pela área do padrão interno (área relativa da banda
cromatográfica) versus a concentração do analito no padrão de calibração. O isótopo
sulfametoxazol-(fenil13C6) foi usado como padrão interno nas análises e o esgoto
sintético como branco.
A precisão intra-dia foi avaliada em cinco replicatas em três níveis diferentes 100
ng L-1 (baixo), 600 ng L-1 (médio) e 1000 ng L-1 (alto) analisados no mesmo dia. A
precisão inter-dias foi calculada com as mesmas concentrações em cinco replicatas e
analisadas no dia seguinte.
Para avaliar a recuperação relativa foram fortificados em água os pontos baixo,
médio e alto (100, 600 e 1000 ng L-1) e injetados no sistema bi-dimensional. As áreas
obtidas foram comparadas com as áreas dos mesmos pontos fortificados em esgoto
sintético. O limite de quantificação foi definido utilizando a razão 10:1 para o
sinal/ruído.
43
4. Resultados e discussão
4.1 Avaliação dos métodos de síntese – testes de se letividade em coluna
Inicialmente foram utilizados dois métodos para a síntese dos MIP, a síntese
pelo método em batelada e a síntese pelo método de precipitação. Após as sínteses
os dois polímeros obtidos foram avaliados quanto a sua seletividade e fator de
retenção para sulfonamidas e “interferentes”. Para a determinação destes parâmetros
os polímeros foram empacotados em pré-colunas cromatográficas (4,6 mm x 40 mm)
e a molécula molde foi retirada (seção 4.2 e 4.3 respectivamente). Posteriormente, as
pré-colunas foram acopladas ao sistema cromatográfico. Sulfonamidas e
“interferentes” foram injetados no sistema cromatográfico empregando como fase
móvel soluções tampão de pH 2,0, 4,5, 7,0 e 9,0.
Os interferentes escolhidos foram enrofloxacino, norfloxacino, ácido
acetilsalicílico, ácido salicílico e cafeína. Esses compostos podem ser encontrados em
matrizes biológicas como o sangue e ambientais como o esgoto, por isso esses
compostos foram escolhidos. O enrofloxacino e o norfloxacino são geralmente os
fluoroquinolonos mais e menos retidos, respectivamente, nas fases extratoras
comerciais. Portanto, testando esses dois compostos espera-se cobrir o
comportamento dos fluoroquinolonos nos MIP.
Os primeiros resultados mostraram que as sulfonamidas apresentaram pouca
afinidade pelos polímeros quando a fase móvel estava composta pela solução
tamponada (tampão amônio 20 mmol L-1) em pH 9,0. A Tabela 2 apresenta os tempos
de retenção quando as oito sulfonamidas estudadas foram injetadas nas condições
anteriormente descritas. A vazão da fase móvel foi 2,0 mL min-1.
Com pH 7 as sulfonamidas apresentaram maior afinidade pelos polímeros. A
Tabela 3 apresenta os tempos de retenção para três das sulfonamidas avaliadas nos
dois polímeros sintetizados, uma mais retida (sulfadimetoxina), a que apresentou uma
retenção intermediária (sulfamerazina) e uma menos retida (sulfacetamida). A ordem
nos tempos de retenção foi a mesma do que nos ensaios com pH 9,0, porém os
tempos de retenção foram um pouco maiores.
44
Tabela 2 – Tempos de retenção das sulfonamidas em tampão amônio pH 9,0.
Composto Tempo retenção (min)
MIP em batelada
Tempo retenção (min)
MIP precipitação
Sulfadimetoxina 0,511 0,682
Sulfametoxazol 0,422 0,492
Sulfacloropiridazina 0,420 0,433
Sulfamerazina 0,400 0,411
Sulfadiazina 0,373 0,486
Sulfametazina 0,355 0,370
Sulfatiazol 0,344 0,352
Sulfacetamida 0,341 0,343
Fonte: Autoria própria
Tabela 3 - Tempos de retenção das sulfonamidas em tampão fosfato pH 7.
Composto Tempo retenção (min)
MIP em batelada
Tempo retenção (min)
MIP precipitação
Sulfadimetoxina 1,388 4,648
Sulfamerazina 0,411 1,611
Sulfacetamida 0,398 0,432
Fonte: Autoria própria
Com os pH 4,5 e 2,0 os polímeros apresentaram os melhores resultados. Sendo
o pH mais ácido o que apresentou a melhor relação referente ao tempo de retenção
das sulfonamidas e interferentes. É valido lembrar que esses experimentos estavam
focados em encontrar condições cromatográficas ideais onde as sulfonamidas
ficassem retidas e os interferentes excluídos da pré-coluna.
Devido aos altos tempos de retenção nestes pH os ensaios foram realizados com
uma porcentagem de fase orgânica (10 e 30%), desta maneira os tempos foram
adequados para este tipo de teste. Para as fases orgânicas foram testados metanol e
acetonitrila. A ACN apresentou uma força de eluição elevada e com uma pequena
porcentagem na fase móvel os analitos e interferentes foram eluídos do sistema. Já
com o metanol, que apresentou uma força de eluição menor, foi possível realizar os
experimentos de maneira satisfatória.
45
Sulfadimetoxina, sulfametoxazol e sulfacloropiridazina foram os compostos mais
retidos pelos polímeros. A Tabela 4 apresenta os tempos de retenção destas
sulfonamidas e os “interferentes” no pH 4,5, usando 30% de metanol na fase móvel e
uma vazão de 2 mL min-1. Do mesmo modo, a sulfamerazina, sulfadiazina,
sulfametazina, sulfatiazol e sulfacetamida foram as SN menos retidas. A Tabela 5
apresenta os tempos de retenção para o último grupo, usando 10% de metanol na
fase móvel. Evidentemente o polímero sintetizado pelo método de precipitação
apresentou a maior afinidade pelas sulfonamidas, porém nestas condições o polímero
também apresentou uma alta afinidade pelos fluoroquinolonos, evidenciando uma
perda de seletividade.
Tabela 4 - Tempos de retenção das sulfonamidas utilizando tampão acetato pH 4,5 e 30% de metanol como fase móvel.
Composto Tempo retenção (min)
MIP em batelada
Tempo retenção (min)
MIP precipitação
Sulfadimetoxina 1,183 12,752
Sulfametoxazol 0,864 5,606
Sulfacloropiridazina 0,799 6,664
Enrofloxacino 0,534 2,009
Norfloxacino 0,445 3,403
Ácido acetilsalicílico 0,399 0,470
Ácido salicílico 0,333 0,416
Cafeína 0,373 0,664
Fonte: Autoria própria
Tabela 5 - Tempos de retenção das sulfonamidas utilizando tampão acetato pH 4,5 e 10% de metanol como fase móvel (continua)
Composto Tempo retenção (min)
MIP em batelada
Tempo retenção (min)
MIP precipitação
Sulfamerazina 3,734 10,909
Sulfadiazina 2,800 8,118
Sulfametazina 4,245 9,805
Sulfatiazol 2,772 9,974
Sulfacetamida 1,496 3,457
Enrofloxacino 1,325 5,364
Norfloxacino 0,828 4,991
46
Tabela 5 - Tempos de retenção das sulfonamidas utilizando tampão acetato pH 4,5 e 10% de metanol como fase móvel (conclusão)
Ácido acetilsalicílico 0,620 0,949
Ácido salicílico 0,589 0,766
Cafeína 0,739 1,832
Fonte: Autoria própria
Com pH 2,0 o comportamento das sulfonamidas foi similar ao descrito
anteriormente. Sulfadimetoxina, sulfametoxazol e sulfacloropiridazina foram os
compostos mais retidos. Do mesmo modo, a sulfamerazina, sulfadiazina,
sulfametazina, sulfatiazol e sulfacetamida foram as sulfas menos retidas. Porém,
desta vez os interferentes ficaram pouco retidos e o tempo de retenção das
sulfonamidas aumentou ainda mais. Com isso é possível analisar uma amostra em
condições onde as sulfonamidas ficariam retidas e os interferentes seriam excluídos.
As tabelas 6 e 7 apresentam os tempos de retenção para sulfonamidas e interferentes
usando 30 e 10% de metanol (respectivamente), além de tampão fosfato pH 2,0 (20
mmol L-1) na fase móvel.
Tabela 6 - Tempos de retenção das sulfonamidas utilizando tampão fosfato pH 2,0 e 30% de metanol como fase móvel
Composto Tempo retenção (min)
MIP em batelada
Tempo retenção (min)
MIP precipitação
Sulfadimetoxina 1,209 13,045
Sulfametoxazol 0,902 5,788
Sulfacloropiridazina 0,886 7,727
Enrofloxacino 0,351 0,575
Norfloxacino 0,376 0,393
Ácido acetilsalicílico 0,897 1,034
Ácido salicílico 0,561 0,961
Cafeína 0,444 0,759
Fonte: Autoria própria
47
Tabela 7 - Tempos de retenção das sulfonamidas utilizando tampão fosfato pH 2,0 e 10% de metanol como fase móvel
Composto Tempo retenção (min)
MIP em batelada
Tempo retenção (min)
MIP precipitação
Sulfamerazina 2,653 7,738
Sulfadiazina 2,320 7,169
Sulfametazina 2,616 5,241
Sulfatiazol 2,102 7,277
Sulfacetamida 1,629 4,039
Enrofloxacino 1,325 1,112
Norfloxacino 0,828 0,766
Ácido acetilsalicílico 0,620 1,534
Ácido salicílico 0,589 1,166
Cafeína 0,748 1,436
Fonte: Autoria própria
Os testes de seletividade anteriormente descritos permitiram demonstrar que o
polímero sintetizado pelo método de precipitação é mais eficiente do que o polímero
sintetizado pelo método em batelada. Também, foi possível conhecer que em uma
solução de tampão fosfato pH 2 (20 mmol L-1) o polímero sintetizado por precipitação
apresenta um comportamento seletivo ideal, quanto a retenção das sulfonamidas e
eliminação de interferentes. O comportamento resulta ideal porque as sulfonamidas
são bem retidas pelo polímero e os interferentes são excluídos com pequena
retenção.
Com base nos resultados apresentados acima, definiu-se que o polímero que
apresentou os melhores resultados foi o sintetizado pelo método de precipitação
sendo este o escolhido para prosseguir com os testes de seletividade, exclusão de
macromoléculas e a aplicação no sistema on-line.
4.2 Retirada da molécula molde
A primeira metodologia empregada para retirar a molécula molde foi colocar as
partículas dos polímeros em um recipiente de reação e lavar com a solução
metanol/ácido fórmico (90:10). Por meio desta metodologia conseguiu-se a retirada
da molécula-molde, porém é uma técnica muito laboriosa, demorada e dispendiosa,
48
pois apresenta um alto consumo de solventes, além de uma perda elevada do
polímero.
Na segunda metodologia empregada, empacotou-se os polímeros em colunas
cromatográficas, seguido pelo acoplamento em um sistema cromatográfico e lavagem
dos polímeros com acetonitrila/agua, por meio de um gradiente com intervalos de 0 à
100% de solvente orgânico (foram testados ACN e metanol). Desta maneira o
consumo de solvente e o tempo de lavagem foi significativamente inferior, além disso
observou-se que não houve a perda do polímero.
4.3 Preenchimento das colunas
A seleção de partículas maiores que 38 µm foi de extrema importância para o
empacotamento, pois materiais de tamanho muito inferior apresentam elevada
pressão na coluna cromatográfica, o que pode comprometer com o sistema de HPLC.
Portanto, o empacotamento de partículas maiores que 38 µm apresentaram bons
resultados em relação as pressões nas colunas para o sistema HPLC bidimensional.
4.4 Testes de seletividade em coluna
Na Tabela 8, são apresentados os tempos de retenção para as sulfonamidas do
primeiro grupo (mais retidas), no polímero impresso e não impresso (NIP) para testes
de seletividade em coluna iguais às descritas anteriormente, empregando metanol
(30%) e uma solução de tampão fosfato pH 2 (20 mmol L-1) como fase móvel. Com
estes tempos foi possível determinar o fator de retenção (k) e a seletividade (S) do
MIP em relação ao NIP. Os valores de k e S para o primeiro grupo são apresentados
na Tabela 9.
Tabela 2 - Tempo de retenção para as sulfonamidas mais retidas no MIP e NIP sintetizados por precipitação
Composto Tempo retenção (min)
MIP precipitação
Tempo retenção (min)
NIP precipitação
Sulfadimetoxina 13,045 5,040
Sulfametoxazol 5,788 2,800
Sulfacloropiridazina 7,727 3,168
Fonte: Autoria própria
49
Tabela 9 –Valores de k e S para as sulfonamidas mais retidas.
Composto
Sulfadimetoxina 37,37 13,82 2,70
Sulfametoxazol 16,02 7,23 2,21
Sulfacloropiridazina 21,73 8,32 2,61
Fonte: Autoria própria
Do mesmo modo, são calculados k e S para as sulfonamidas menos retidas
empregando metanol (10%) e uma solução de tampão fosfato pH 2 (20 mmol L-1)
como fase móvel. Os resultados são apresentados nas Tabelas 10 e 11.
Tabela 10 - Tempo de retenção para as sulfonamidas menos retidas no MIP e NIP sintetizados por precipitação
Composto Tempo retenção (min)
MIP precipitação
Tempo retenção (min)
NIP precipitação
Sulfamerazina 7,738 3,414
Sulfadiazina 7,169 3,011
Sulfametazina 5,241 2,095
Sulfatiazol 7,277 3,716
Sulfacetamida 4,039 1,933
Fonte: Autoria própria
Tabela 3 - Valores de k e S para as sulfonamidas menos retidas
Composto
Sulfamerazina 21,76 9,04 2,40
Sulfadiazina 20,08 7,86 2,56
Sulfametazina 14,41 5,16 2,80
Sulfatiazol 20,40 9,93 2,05
Sulfacetamida 10,88 4,68 2,32
Fonte: Autoria própria
S =� �!
�"�!
�"�! =�� � ��
��
�"�! =�� � ��
��
S =K �!
K"�!
� �! =�� � ��
��
�"�! =�� � ��
��
50
É interessante conhecer os valores de k e S para cada analito, pois dessa
maneira é possível conhecer o efeito da impressão molecular no momento da síntese.
Esses parâmetros relacionam os tempos de retenção do polímero impresso e os do
polímero não impresso. Os valores de k obtidos mostraram que o polímero impresso
apresenta uma maior retenção de sulfonamidas do que o polímero não impresso. Já
os valores de S demonstraram que o MIP apresenta de 2 a 2,8 vezes mais afinidade
pelas sulfonamidas do que o respectivo polímero não impresso. Estes resultados
foram similares aos obtidos por Shi et al., (44). Entretanto os referidos autores
utilizaram o método de batelada para a síntese do polímero.
4.5 Estudo cinético
É importante conhecer o tempo de equilíbrio entre a molécula molde e o polímero
de impressão molecular, pois este tempo é utilizado nos testes de seletividade
competitiva e na determinação da isoterma de adsorção.
A sulfadimetoxina e o MIP chegam ao equilíbrio rapidamente, quase 90% do
antimicrobiano é adsorvido nos dez primeiros minutos e manteve-se constante até os
60 minutos. Assim, o tempo de 20 minutos foi adotado como o tempo ideal e
consequentemente os testes de seletividade competitiva e a isoterma de adsorção
foram baseados neste tempo. O perfil da adsorção da sulfadimetoxina no MIP é
apresentado na Figura 16.
Figura 16 - Perfil da adsorção da sulfadimetoxina no MIP ao decorrer do tempo
Fonte: Autoria própria
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70
Per
cent
uals
orvi
do
Tempo (min)
51
4.6 Testes de seletividade competitiva
Além dos testes de seletividade em coluna, também foram realizados testes de
seletividade competitiva, nos quais foi comparada a adsorção da sulfadimetoxina com
a adsorção de outras sulfonamidas e alguns interferentes no polímero. Este teste foi
realizado com o polímero sintetizado pelo método de precipitação. Além disso,
comparou-se a adsorção da sulfonamida menos retida com a adsorção do interferente
mais retido. Para isso foram formadas cinco combinações:
1 Sulfadimetoxina (sulfonamida mais retida) vs Cafeína (interferente mais
retido)
2 Sulfadimetoxina vs Norfloxacino (interferente antimicrobiano)
3 Sulfadimetoxina vs Sulfacetamida (sulfonamida menos retida)
4 Sulfadimetoxina vs Sulfametoxazol (segunda sulfonamida mais retida)
5 Sulfacetamida vs Cafeína
Ao término dos experimentos foram obtidas as concentrações finais para cada
um dos analitos e desta forma foram calculadas as constantes de distribução (Kd),
seletidade (K) e seletividade relativa (K’). Os resultados estão apresentados nas
Tabelas 12 a 16. Os cromatogramas dos testes de seletividade competitiva são
apresentados na Figura 17.
Tabela 4 - Valores de Kd, K e K’ para sulfadimetoxina vs cafeína
Adsorvente
Concentração
inicial (mg L-1)
Concentração
final (mg L-1) Kd
K K’
SDM CAF SDM CAF SDM CAF
MIP 1,50 1,50 0,17 0,97 1564,70 108,00 14,49 48,30
NIP 1,50 1,50 1,40 1,22 14,30 45,90 0,30
Fonte: Autoria própria
Tabela 53 – Valores de Kd, K e K’ para sulfadimetoxina vs norfloxacino
Adsorvente
Concentração
inicial (mg L-1)
Concentração
final (mg L-1) Kd
K K’
SDM NOR SDM NOR SDM NOR
MIP 1,50 1,50 0,32 1,10 737,50 74,54 9,89 8,04
NIP 1,50 1,50 1,16 1,22 58,62 47,54 1,23
Fonte: Autoria própria
52
Tabela 64 - Valores de Kd, K e K’ para sulfadimetoxina vs sulfacetamida
Adsorvente
Concentração
inicial (mg L-1)
Concentração
final (mg L-1) Kd
K K’
SDM SCT SDM SCT SDM SCT
MIP 1,50 1,50 0,28 0,99 871,43 105,05 8,29 2,48
NIP 1,50 1,50 1,01 1,31 97,03 29,01 3,34
Fonte: Autoria própria
Tabela 75 - Valores de Kd, K e K’ para sulfadimetoxina vs sulfametoxazol
Adsorvente
Concentração
inicial (mg L-1)
Concentração
final (mg L-1) Kd
K K’
SDM SMX SDM SMX SDM SMX
MIP 1,5 1,5 0,25 0,81 1000 170,37 5,87 4,16
NIP 1,5 1,5 1,17 1,25 56,40 40,00 1,41
Fonte: Autoria própria
Tabela 86 - Valores de Kd, K e K’ para sulfacetamida vs cafeína
Adsorvente
Concentração
inicial (mg L-1)
Concentração
final (mg L-1) Kd
K K’
SCT CAF SCT CAF SCT CAF
MIP 1,5 1,5 0,73 0,94 210,96 119,15 1,76 3,60
NIP 1,5 1,5 1,12 0,89 67,86 137,08 0,49
Fonte: Autoria própria
O coeficiente de distribuição (Kd) indica a migração e a afinidade dos analitos
pelo polímero molecularmente impresso. (45) Os resultados obtidos mostram para as
sulfonamidas sempre valores maiores de Kd no MIP do que no NIP, o que é um
indicativo do sucesso da impressão molecular. Ao avaliar os interferentes, é possível
observar que os valores de Kd também foram maiores no MIP do que NIP mas o valor
de Kd no MIP aumento pouco com relação ao valor de Kd no NIP. Ou seja, a impressão
molecular aumenta também a afinidade do polímero pelos interferentes, mas esse
aumento é menos expressivo do que para as sulfonamidas.
53
A comparação dos valores dos coeficientes de seletividade (K), permite
confirmar a habilidade do polímero em reconhecer as sulfonamidas mesmo na
presença de interferentes. (44,45) Ao observar os valores de Kd e K para a cafeína é
evidente que o polímero apresenta uma afinidade “natural” por este composto.
Entretanto, depois da impressão o polímero apresenta maior afinidade pelas
sulfonamidas do que pela cafeína. Resumindo, a impressão molecular conseguiu
supera a afinidade “natural” do polímero pela cafeína, mesmo nos testes competitivos
com a sulfacetamida que é a sulfonamida que apresente menor afinidade pelo
polímero.
O coeficiente de seletividade relativa (K’) é o valor calculado para avaliar a
eficiência da impressão química do polímero, onde os valores mais elevados do que
uma unidade confirmam um efeito positivo. (45) Os valores de K’ obtidos permitem
observar que o polímero apresenta uma afinidade muito superior para sulfadimetoxina
do que para norfloxacino e cafeína. Também é evidente que apresenta maior afinidade
pela sulfadimetoxina do que para sulfametoxazol (segunda sulfonamida mais retida)
e sulfacetamida (sulfonamida menos retida) confirmando os resultados dos testes de
seletividade em coluna. O valor de K’ para sulfacetamida versus cafeína, confirma que
o polímero apresenta uma maior afinidade pela sulfacetamida do que para a cafeína,
mesmo sendo a sulfacetamida a sulfonamida que apresenta menor afinidade pelo
polímero.
54
-300
700
1700
2700
3700
4700
5 6 7 8 9 10 11 12 13
Inte
nsi
da
de
Tempo (min)
Adsorção no MIP
Adsorção no NIP
Sulfadimetoxina
Cafeina
0
1000
2000
3000
4000
5000
7 8 9 10 11 12 13
Inte
nsi
da
de
Tempo (min)
Sulfadimetoxina
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Inte
nsi
da
de
Tempo (min)
Sulfadimetoxina
Sulfacetamida
-500
0
500
1000
1500
2000
2500
3 4 5 6 7 8 9
Inte
nsi
da
de
Tempo (min)
Figura 17 - Cromatogramas dos testes de seletividade competitiva.1- Sulfadimetoxina vs
cafeína; 2- Sulfadimetoxina vs norfloxacino; 3- Sulfadimetoxina vs sulfacetamida; 4- Sulfadimetoxina vs
sulfametoxazol; 5- Sulfacetamida vs Cafeína
-500
500
1500
2500
3500
4500
5500
8 9 10 11 12 13
Inte
nsi
da
de
Tempo (min)
SulfadimetoxinaSulfametoxazol
Sulfacetamida
1
2
3
4
5
Norfloxacino
Cafeína
55
Após a comprovação da seletividade e afinidade do polímero MIP (sintetizado
por precipitação) pelas sulfonamidas, foram sintetizados os polímeros RAM-MIP,
RAM-MIP-BSA e MIP-BSA. Estas modificações foram realizadas para conferir ao
polímero MIP a capacidade de eliminar macromoléculas e, assim, serem usados em
análises on-line de sulfonamidas em amostras complexas. O desempenho desses
novos polímeros sintetizados quanto à seletividade, foi comprovado por testes de
seletividade em coluna, os mesmos analitos injetados no polímero MIP foram
injetados no sistema cromatográfico contendo a pré-coluna preenchida com os novos
polímeros obtendo-se os mesmos tempos de retenção ou com diferenças pouco
significativas.
4.7 Exclusão de macromoléculas
O primeiro polímero que foi avaliado quanto a sua capacidade em eliminar
macromoléculas foi o MIP. Como já foi descrito, a área da banda cromatográfica obtida
através da “re-injeção” de uma solução 44 mg mL-1 de albumina de soro bovino, foi
comparada com a área obtida da “re-injeção” dessa mesma solução injetada em um
sistema cromatográfico ao qual foi acoplada a pré-coluna preenchida com o MIP. Ao
comparar as áreas foi evidente a retenção das macromoléculas pelo polímero. O
polímero reteve 96% das macromoléculas, o que impossibilitaria a utilização desse
polímero em sistemas cromatográficos on-line ante amostras complexas em
macromoléculas. A Figura 18, apresenta a sobreposição dos cromatogramas obtidos
dos testes de exclusão para o padrão de BSA 44 mg mL-1 e para o MIP.
Figura 18 - Comparação da exclusão do MIP com a “re-injeção” do padrão
Fonte: Autoria própria.
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
0 0,5 1 1,5 2
Inte
nsi
da
de
Tempo (min)
Exclusão pelo MIP
Padrão BSA 44 mg/mL
56
Como era esperado o polímero RAM-MIP apresentou um melhor desempenho
quanto à eliminação de macromoléculas. O polímero conseguiu eliminar 39,4% das
proteínas o que confirma assim a funcionalização dos polímeros pela HEMA e GDMA.
Embora os resultados apresentem um melhor desempenho dos polímeros RAM-MIP
quanto à exclusão de macromoléculas, o polímero ainda reteve mais do que 60% das
proteínas injetadas o que potencializaria problemas de entupimento das colunas ao
serem acopladas no sistema cromatográfico. A Figura 19 ilustra a sobreposição dos
cromatogramas dos testes de exclusão para o padrão de BSA 44 mg mL-1 e para o
MIP.
Figura 19 - Comparação da exclusão do RAM-MIP com a “re-injeção” do padrão
Fonte: Autoria própria.
O melhor desempenho foi dos polímeros que foram recobertos com o BSA. Os
polímeros RAM-MIP-BSA e MIP-BSA conseguiram eliminar 64,3% e 97,93% das
macromoléculas, respectivamente. Esperava-se que o polímero RAM-MIP-BSA
apresentasse o melhor desempenho, entretanto, este polímero reteve uma elevada
porcentagem de macromoléculas, o que inviabiliza seu emprego em sistemas on-line.
O polímero MIP-BSA foi capaz de excluir as proteínas eficientemente
possibilitando seu uso em sistemas de preparo de amostra on-line. A alta capacidade
de eliminação do polímero MIP-BSA sugere que as reações de entrecruzamento
foram mais efetivas na superfície do MIP, consequentemente levando a melhor
exclusão de macromoléculas. Na Figura 20 são apresentados os cromatogramas dos
testes de exclusão, para o padrão de BSA 44 mg mL-1 ante o RAM-MIP-BSA e o MIP-
BSA. Também estão sobrepostos os cromatogramas obtidos nos testes de exclusão
para todos os polímeros avaliados.
57
Figura 20 - Cromatogramas obtidos durante os testes de exclusão. a- RAM-MIP-BSA e padrão; b- MIP-BSA e padrão e c- Sobreposição de todos os cromatogramas advindos dos testes de exclusão.
a-
b-
c-
Fonte: Autoria própria.
4.8 Isoterma de adsorção
Para avaliar a capacidade do polímero em adsorver a sulfadimetoxina e entender
as características deste processo foi realizada uma isoterma de adsorção.
Geralmente, são dois os modelos empregados para descrever em termos
quantitativos a adsorção de solutos por sólidos a temperatura constante, esses
modelos são o de Freundlich e o de Langmuir. A escolha do modelo a ser aplicado é
58
baseada no coeficiente de correlação das equações linearizadas, maiores coeficientes
indicam maior linearidade e assim maior adaptabilidade ao modelo.(46,47)
No presente trabalho, de acordo com o coeficiente de correlação das equações,
a adsorção adaptou-se melhor ao modelo de Langmuir. Este modelo já foi usado por
muitos pesquisadores para descrever a adsorção de solutos por polímeros
molecularmente impressos. (46,47,48,49)
O modelo de Langmuir baseia-se em três suposições: (a) a superfície de
adsorção é homogênea, isto é, a adsorção é constante e independente da extensão
da cobertura da superfície; (b) a adsorção ocorre em sítios específicos, sem interação
com as moléculas do soluto; (c) a adsorção torna-se máxima quando uma camada
monomolecular cobre totalmente a superfície do adsorvente. (27,50)
A isoterma de Langmuir é representada pela equação:
; Equação 6
Onde aeq é a quantidade de sulfadimetoxina adsorvida por grama de
adsorvente (polímero), Ka é a constante de Langmuir e Ceq é a concentração no
equilíbrio. Na Figura 21 são apresentados os dados experimentais do perfil de
adsorção da sulfadimetoxina pelo MIP sintetizado por precipitação, à medida que a
concentração de sulfadimetoxina foi aumentada. (47)
Figura 21 – Isoterma de Langmuir na adsorção de sulfadimetoxina no MIP sintetizado por precipitação
Fonte: Autoria própria.
0,00E+00
1,00E-04
2,00E-04
3,00E-04
4,00E-04
5,00E-04
6,00E-04
0,00E+00 2,00E-05 4,00E-05 6,00E-05 8,00E-05 1,00E-04 1,20E-04 1,40E-04
a eq
(mol
g -1
)
Ceq(mol l-1)
59
Ao plotar Ceq-1 versus aeq-1 obteve-se uma reta de acordo com a forma da
equação linear isotérmica de Langmuir (Equação 7). Na Figura 22 é apresentada a
isoterma linearizada de Langmuir na adsorção de sulfadimetoxina no MIP sintetizado
por precipitação.
; Equação 7
Figura 22 – Isoterma linearizada de Langmuir da adsorção de sulfadimetoxina no MIP sintetizado por precipitação
Fonte: Autoria própria.
Observando a Figura 22 é possível concluir que os dados se ajustam (r2 = 0,989)
ao modelo de Langmuir. Consequentemente, a capacidade máxima adsortiva do MIP
sintetizado por precipitação ante a sulfadimetoxina pode ser calculado pelo inverso do
coeficiente angular da isoterma linearizada de Langmuir, o valor obtido foi 9,80 x 10-4
mol g-1. Resultados comparáveis foram obtidos por Valtchev et al. Os referidos autores
avaliaram a adsorção de sulfametoxazol em vários polímeros de impressão molecular
e obtiveram valores entre 2,3 x 10-5 e 6,5 x 10-5 mol g-1 (47). Os resultados obtidos no
presente trabalho apresentaram uma capacidade máxima de adsorção de uma ordem
de magnitude acima dos resultados de Valtchev.
y = 0,0751x + 1020,5
R² = 0,9891
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000
1/a
eq
1/Ceq
60
4.9 Microscopia eletrônica de varredura
As microscopias eletrônicas de varredura obtidas para o polímero sintetizado
pelo método em batelada mostraram que este não apresenta uma forma regular, já o
polímero sintetizado por precipitação apresenta partículas menores, estrutura globular
e uma maior macroporosidade. Essas caraterísticas do polímero sintetizado pelo
método de precipitação influenciaram a pressão e efetividade das pré-colunas.
Embora o procedimento para seleção das partículas e empacotamento das pré-
colunas tenha sido o mesmo empregado para os dois polímeros, a pré-coluna
empacotada como o polímero MIP sintetizado por precipitação suportou vazões de
até 10 mL min-1 (capacidade máxima da bomba) o que não foi possível com o polímero
obtido por batelada. Além disso, este polímero foi o mais eficiente, o que concorda
com a teoria, pois a diminuição do tamanho da partícula e a sua homogeneidade
resulta em colunas mais eficientes. (51) A Figura 23 apresenta as microscopias de
varredura para os polímeros feitos pelo método em batelada e precipitação.
Figura 23 - Microscopia eletrônica de varredura dos polímero MIP. A - MIP em batelada; B - MIP precipitação.
Fonte: Autoria própria.
A morfologia dos polímeros RAM-MIP também foi arredondada e com
porosidade elevada (Figura 24). O recobrimento com BSA deixou as partículas do
RAM-MIP-BSA e MIP-BSA um pouco rugosa, mas os polímeros apresentaram a
mesma eficiência e suportaram vazões de até 10 mL min-1 (Figura 25).
A B
61
Figura 24 - Microscopia de varredura eletrônica do polímero RAM-MIP.
Fonte: Autoria própria.
Figura 25 - Microscopia de varredura eletrônica dos polímeros. A - RAM-MIP-BSA; B – MIP-BSA.
Fonte: Autoria própria.
4.10 Otimização do sistema bidimensional
A pré-coluna preenchida com o polímero MIP-BSA foi a escolhida para as
análises on-line de sulfonamidas em amostras complexas. Esta coluna apresentou a
maior capacidade para excluir macromoléculas e demonstrou ser seletiva para
sulfonamidas. A matriz selecionada para a análise foi esgoto suíno, uma matriz
bastante complexa e ideal para testar os polímeros.
O sistema foi operado no arranjo backflush (ou seja, com inversão do sentido do
fluxo na coluna MIP-BSA). O sistema operou da seguinte forma: primeiro a bomba C
B A
62
impulsiona a solução de carregamento (tampão fosfato 20 mmol L-1, pH 2,0, 1 mL
min-1) através do amostrador e a coluna MIP-BSA, ao mesmo tempo as bombas A e
B condicionam a coluna analítica impulsionando a fase móvel com as condições
iniciais do gradiente para a eluição e separação dos analitos. Uma quarta bomba (D)
passa solvente diretamente para o espectrômetro de massas (Figura 26). Enquanto
as válvulas são mantidas na configuração 1, a amostra é injetada, os analitos são
retidos na pré-coluna e as macromoléculas e interferentes são excluídos da coluna
MIP-BSA. Após 4 minutos a válvula de carregamento foi girada e uma fase móvel
composta por 100% agua passou pela pré-coluna durante 3 minutos para tirar o
excesso de fosfato e evitar assim que este chegasse ao detector de massas (Figura
27). No minuto 7 as válvulas foram giradas novamente e os analitos foram eluídos da
pré-coluna e direcionados para a coluna analítica com um gradiente de acetonitrila
que começou em 5% e chegou a 100% depois de 3 minutos (Figura 28). Os analitos
foram separados pela coluna analítica e analisados por um espectrômetro de massas
baseado em tempo de vôo. Finalmente, após 21 minutos o sistema volta para a
configuração 1 (Figura 26) e fica pronto para uma nova injeção.
Figura 26 – Arranjo instrumental utilizado no sistema on-line (Carregamento-configuração 1).
Fonte: Autoria própria.
63
Figura 27 - Arranjo instrumental utilizado no sistema on-line (Lavagem-configuração 2).
Fonte: Autoria própria.
Figura 28 - Arranjo instrumental utilizado no sistema on-line (Dessorção-configuração 3).
Fonte: Autoria própria.
4.11 Validação
Os resultados do estudo de linearidade como: faixa linear, equações de reta,
coeficientes de correlação e de determinação, bem como os limites de detecção e
quantificação estão apresentados na Tabela 17. As curvas de calibração são
apresentadas no anexo 1.
64
Tabela 97 - Dados da linearidade para as sulfonamidas avaliadas.
Equação da reta Coeficiente de
correlação (r)
Sulfametazina Y=0,072x + 1,391 0,9973
Sulfadimetoxina Y=0,0086x + 2,4235 0,9879
Sulfadiazina Y=0,0051x + 0,3523 0,9917
Sulfametoxazol Y=0,0014x + 0,0079 0,9998
Sulfacloropiridazina Y=0,0007x + 0,0397 0,9988
Sulfamerazina Y = 0,036x + 0,8268 0,979
Sulfatiazol Y=0,0009 + 0,1375 0,992
Fonte: Autoria própria.
Os coeficientes de correlação foram maiores ou iguais a 0,99 e os coeficientes
de determinação maiores do que 0,98 para sulfametazina, sulfametoxazol,
sulfacloropiridazina, sulfadimetoxina, sulfadiazina e sulfatiazol demonstrando que o
método apresenta ajuste adequado para esses analitos. Segundo a recomendação
da Anvisa, para linearidade o critério mínimo de aceitação é coeficiente de correlação
(r) igual a 0,99. Portanto, se elevar ao quadrado deve dar um coeficiente de
determinação maior que 0,98. Para sulfamerazina o valor do coeficiente de correlação
foi abaixo de 0,98. Esse composto apresentou uma elevada intensidade de sinal o que
fez com que nos níveis superiores o detector provavelmente saturasse e assim a
resposta desse analito não fosse linear. Possivelmente o estreitamento do intervalo
linear estudado para esse analito resolveria o problema.
Os resultados da precisão intra-dias e inter-dias encontram-se sumarizados
na Tabela 18. Todas as sulfonamidas estudadas apresentaram desvio padrão
relativos abaixo de 15%, demonstrando precisão adequada do método para esses
analitos.
A Tabela19, apresenta os dados da recuperação relativa dos níveis baixo,
médio e alto. Os resultados obtidos indicam, para uma matriz complexa, um método
com eficiência relativamente próxima a 100% para todos os compostos estudados,
com valores de recuperação entre 91 e 118%.
65
Após a validação o sistema foi utilizado para quantificar sulfonamidas em
amostras reais de esgoto suíno. Não foram detectadas sulfonamidas em nenhuma
das amostras, provavelmente porque o limite de quantificação é relativamente alto
(100 µg L-1). Com intuito de obter limites de quantificação e detecção mais baixos
estão sendo implementados estudos de cromatografia on-line utilizando como
detector um espectrômetro de massas sequencial do tipo quadrupolo – “Ion trap
linear”, o qual apresenta melhor detectabilidade do que o sistema de tempo de voo
utilizado neste trabalho. Além disso, esse novo sistema permite injeções de volume
de amostra de até 1.500 µL, quinze vezes mais do que o permitido no sistema atual.
Tabela 18 - Dados obtidos para estudo da precisão intra-dia e inter-dia das sulfonamidas
Composto Níveis Intra-dia 1 (DPR %)
Intra-dia 2 (DPR %)
Inter-dia (DPR %)
Sulfametazina
Baixo 2 12,53 14,26
Médio 5,87 13,92 3,18
Alto 2,47 10,77 6,89
Sulfadimetoxina
Baixo 5,65 10,16 6,09
Médio 6,49 13,62 11,27
Alto 10,18 8,5 2,65
Sulfadiazina
Baixo 7,08 6,36 5,26
Médio 14,21 13,02 6,66
Alto 14,99 11,33 7,9
Sulfametoxazol
Baixo 11,41 10,49 8,29
Médio 4,49 9,83 6,89
Alto 4,62 11,47 6,9
Sulfacloropiridazina
Baixo 6,61 13,07 6,70
Médio 9,03 11,9 10,81
Alto 4,18 12,19 8,87
Sulfamerazina
Baixo 6,57 10,64 11,07
Médio 14,05 13,38 2,22
Alto 11,97 13,86 7,32
Sulfatiazol
Baixo 4,01 6,66 6,78
Médio 8,69 6,46 5,74
Alto 7,53 12,81 13,62
Fonte: Autoria própria.
66
Tabela 19 - Recuperação relativa
Composto
Recuperação relativa
Nível baixo
% recuperação
Nível médio
% recuperação
Nível alto
% recuperação
Sulfametazina 111,13 118,04 105,41
Sulfadimetoxina 108,57 117,30 102,49
Sulfadiazina 102,58 112,70 95,33
Sulfametoxazol 103,19 98,92 100,41
Sulfacloropiridazina 116,84 105,71 104,03
Sulfamerazina 114,86 120,04 103,35
Sulfatiazol 106,19 91,14 94,28
Fonte: Autoria própria.
67
5 Conclusão
Neste trabalho foram avaliadas duas metodologias de impressão molecular (em
batelada e precipitação). Os resultados de seletividade, fator de retenção e os
coeficientes de seletividade, demonstraram que o polímero sintetizado pelo método
de precipitação apresenta melhor desempenho na concentração de sulfonamidas e
eliminação de interferentes do que o análogo polímero obtido por batelada. Também,
foi demonstrado que em uma solução de tampão fosfato (pH 2,0) o polímero
sintetizado por precipitação apresenta um desempenho ideal. O comportamento
resulta ideal porque o polímero apresenta uma alta afinidade pelas sulfonamidas e
pouca ou nenhuma pelos interferentes avaliados.
O polímero MIP sintetizado pelo método de precipitação apresentou adsorção
compatível com o modelo de Langmuir, e sua capacidade máxima absortiva foi 9,80
x 10-4 mol de sulfadimetoxina por grama de polímero.
Além das sínteses dos polímeros mencionados anteriormente, foram
sintetizados 3 polímeros restrito a ligação com macromoléculas (MIP-BSA, RAM-MIP
e RAM-MIP-BSA), sendo o polímero MIP-BSA o que melhor desempenho apresentou
na exclusão de macromoléculas (97,9% de exclusão).
A validação demonstrou que método desenvolvido apresenta boa linearidade,
precisão e recuperação. Porém, para ser utilizado na determinação de sulfonamidas
em matrizes complexas ambientais é necessário usar um espectrômetro de massas
com melhor detectabilidade que o empregado neste trabalho, bem como um sistema
cromatográfico que permita a injeção de maiores volumes de amostra ou fator de pré-
concentração.
68
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73
Anexo 1: Curvas analíticas paras as sulfonamidas
y = 0,0086x + 2,4235
R² = 0,9759
0
2
4
6
8
10
0 200 400 600 800 1000
Are
a re
lati
va
Concentração µg L-1
SDX
y = 0,0072x + 1,391R² = 0,9947
0
2
4
6
8
0 200 400 600 800 1000
Are
a re
lati
va
Concentração µg L -1
SMT
y = 0,0014x - 0,0079R² = 0,9997
0
0,5
1
1,5
0 200 400 600 800 1000 1200
Are
a re
lati
va
Concentração µg L-1
SMX
y = 0,0051x + 0,3523
R² = 0,9836
0
1
2
3
4
0 200 400 600 800
Are
a re
lati
va
Concentração µg L-1
SDZ
y = 0,0007x + 0,0397
R² = 0,9978
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 200 400 600 800 1000
Áre
a re
lati
va
Concentração µg L -1
SCZ
y = 0,0036x + 0,8268
R² = 0,9589
0
1
2
3
4
0 200 400 600 800
Áre
a re
lati
va
Concentração µg L -1
SMR
y = 0,0009x + 0,1375R² = 0,9841
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 200 400 600 800 1000
Áre
a re
lati
va
Concentração µg L -1
STZ
74
Anexo 2: Cromatograma obtido no sistema on-line (ponto baixo)
Anexo 3: Composição do esgoto sintético.
Composição Quantidade para 1 L
Sacarose 35,0 mg
Amido 114,0 mg
Extrato de carne 208,0 mg
Óleo de soja 51,0 mg
NaCl 250,0 mg
MgCl2.6H2O 7,0 mg
CaCl2.2H2O 4,5 mg
NaHCO3 200,0 mg
Detergente 3 gotas
Fonte: TORRES, P., 1992.