Impact Factor: 3.065Engenharia: A1Biotecnologia: B1

Recuperação e Purificação de Biomoléculas

Professor: Dr. Everaldo Silvino dos Santos

Doutorando: Francinaldo Leite da Silva

Introdução

Os Sistemas de Duas Fazes Aquosas (SDFA):

• Baixa tensão interfacial;• Alto conteúdo de água nas duas fases;• São adequados para a separação e purificação de proteínas,

antibióticos, aminoácidos, ácidos orgânicos e produtos naturais.

Introdução

Obstáculos do SDFA:• Recuperação dos polímeros;• Custo elevado da recuperação;• Poluição ambiental.

Introdução

Como remover os obstáculos?

R: Desenvolvimento de polímeros formadores de SDFA com potencial de recuperação.

A recuperação de polímeros de formadores de SDFApoderia ser conseguida através do ajuste da temperatura, pH,

força iônica e potencial elétrico.

Introdução

O que são copolímeros?

Copolímeros de óxido de etileno-óxido de propileno termossensíveis (EO-PO) foram primeiramente relatados no início de 1990 e que poderia formar SDFA com dextrana. ( Berggren et al., 1990)

Os polímeros termossensíveis

Os polímeros com resposta térmica exibem uma transição de fase acima de uma determinada temperatura crítica, provocando uma alteração súbita no estado de solvatação. Assim, existem dois tipos principais de polímeros termossensíveis, o primeiro apresenta uma temperatura crítica da solução mínima (LCST), enquanto que o segundo apresenta uma temperatura de solução crítica máxima (UCST).

Objetivo

Estudar a eficiência dois novos polímeros (PNDB e PNBAa) termossensíveis na formação de SDFA, bem como a sua reciclagem.

Metodologia

1.Síntese dos copolímeros PNBAa e PNDB.

2. Caracterização dos copolímeros (MAGNA-IR 550 e DRX500 NMR).

3. Lower Critical Solution Temperature (LCST) de

PNBAa e PNDB.

4. Teste de formação de fases.

5. O diagrama de fases.

6. Reciclagem de copolímeros

7. Efeitos de pH e sais sobre a recuperação de polímeros e reciclagem de polímeros recuperados.

Metodologia

1.Síntese dos copolímeros PNBAa e PNDB

PNBAa

PNDB

3,0 g de N-isopropil acrilamida (NIPA, 26,5 Mmol)0,12 mL de butil metacrilato (BMA, 0,76 Mmol)0,05 mL de álcool alílico (Aa, 0,74 Mmol)

3,0 g de N-isopropil acrilamida (NIPA, 26,5 Mmol)0,4 mL de butil metacrilato (BMA, 0,76 Mmol)0,6 mL de 2- (dimetilamino) -etilmetacrilato (DMAEMA,3,56 Mmol)

Resultado

PNBAa

ChemBioDraw Ultra 11.0.

N-isopropil acrilamida

butil metacrilato

Aa

Copolímero

Resultado

PNDB

ChemBioDraw Ultra 11.0.

N-isopropil acrilamida

butil metacrilato

2-(dimetilamino) -etilmetacrilato

Copolímero

Metodologia

Determinação da LCST através da temperatura mínima no ponto de nuvem. (C. Boutris et. al, 1997).

LCST: temperatura crítica da solução mínima

“A temperatura no ponto de nuvem corresponde a temperatura em que acima dela corre a formação de duas fases.”

ResultadoLCST de PNBa e PNDB

31.3 °C

25.5 °C

• Copolímeros termossensíveis apresentam natureza hidrofóbica/hidrofílica.

• A temperatura superior de PNDB é atribuída a DMAEMA.

Metodologia

Teste de formação de fases:

• Diferentes concentrações de PEG 1000, PEG 20000, Dextran 20000, polipropileno glicol (PPG), (NH4) 2SO4, PNBC, PNNC, PABC e PADB foram usadas para testar possibilidade de formação de ATPS com os dois copolímeros.

• Estes copolímeros foram dissolvidos em tampão Na2HPO4 / NaH2PO4 (pH 7,0) ou água destilada.

• A concentração inicial de copolímero escolhida foi 10%.

Resultado

MetodologiaO Diagrama de Fase• Medição da composição do sistema ternário PNBAa, PNDB e água

por APLC;• Coluna C18 da Phenomenex.• Fase móvel: metanol/tampão fosfato (1:1), fluxo de 1 mL/min.• Cromatogramas detectados por UV a 210 nm.• 20 amostras foram injetadas na HPLC.• Séries de misturas foram mantidas em temperatura ambiente entre

4-6h até formar a fase clara.

Amostras do fundo e da parte superior foram coletadas para determinar as concentrações dos polímeros PNDB e PNBAa.

Diferentes concentrações de PNDB e PNBAa foram testas em HPLC.

Resultado

Curva de equilíbrio/binodal

M: Total da composição de copolímeros

T: Concentração na fase de topo

B: Concentração na fase de fundoI

II

Metodologia

Reciclagem dos copolímeros

Foi observado que os polímeros são recicláveis a quase 10 °C acima da temperatura crítica da solução mínima (LCST), 40 ° C:

• Centrifugação a 8000 rpm, 30 min;• Secagem a vácuo ;• Quantificação dos dois polímeros;• Reciclagem 5 vezes para estimar a recuperação .

Análise do efeito do pH e de sais na recuperação foram investigados.

ResultadosReciclagem dos copolímeros

• A natureza hidrofóbica/hidrofílica dos copolímeros termossensíveis permitiram a precipitação.

• Os polímeros tornam-se insolúveis por causa das ligações de H.

• Se mantida a recuperação acima 95% os copolímeros teoricamente podem ser reciclados até 60 vezes.

ResultadoInfluência do pH e de sais na recuperação dos copolímeros

• Recuperação aumenta em certa de 1% entre o pH de 4 a 10. Pode ser atribuído às cargas positivas do grupo amina do PNDB.• Os copolímeros tem recuperação de 1 a 2% com a adição de 40mM de sais do que quando comparado sem ao sistema sem adição de sal.

Metodologia

Separação de democlociclina em PNBAa – PNDB SDFADemoclociclina - Antibiótico derivado da tetraciclina. Anfotérico e

estável em condição ácida• Foi estudado pH de 4 a 8, e diferentes sais no coeficiente de

partição. • As duas fases foram separadas com uma seringa e os copolímeros

recuperados induzidos por temperatura. • Os copolímeros foram novamente dissolvidos para formar SDFA e

repetido o processo anterior. • A concentração de democlociclina inicial foi de 2mg/mL.• Medição por UV: democlociclina (362 nm), PNBAa (210nM) e PNDB

(217).

Resultado

Partição de democlociclina em diferentes pH e tipos de sais.

• pH influenciou na partição de moléculas carregas no SDFA com polímeros termossensíveis (pH: 5,5, K=2,23).• O coeficiente de partição foi melhorado para K=2,61 a 80 Mmol/L de sulfato de amônio.

Conclusões• Dois novos copolímeros termossensíveis PNDB e PNBAa foram

sintetizada no presente estudo.

• Eles podem formar SDFA uns com os outros.

• Ambos polímeros são termossensíveis, e pode ser reciclado por uma única

condição de temperatura, com a recuperação de mais de 97%.

• Democlociclina foi separada nos sistemas de SDFA com PNBAa / PNDB.

O coeficiente de partição K de democlociclina atingiu 2,61 com 80 mM (NH4) 2SO4.

• O trabalho foi só uma investigação preliminar. Muito trabalho precisa ser feito no futuro. Acredita-se que a reciclagem de SDFA termossensível têm potenciais aplicações na indústria.