RNA-SEQ: CONCEITO E APLICAÇÕES

Ana da Rocha KurataKatie Cristina Takeuti Riciluca

Disciplina BMP 5762 – Bioinformática Aplicada ao Estudo de Doenças

Parasitárias

RNA-seq• RNA-seq é uma abordagem recentemente desenvolvida,

para analisar o perfil de transcriptoma, que utiliza tecnologias de deep-sequencing.

• O transcriptoma é o conjunto completo de transcritos (RNAs) em uma célula, e sua quantidade, para um estágio de desenvolvimento específico ou condição fisiológica.

• * deep-sequencing = indica que a cobertura do processo é muito maior que o comprimento da sequencia em estudo.

• O entendimento do transcriptoma é essencial para:• Interpretar os elementos funcionais do genoma• Revelar os constituintes moleculares de células e

tecidos nos diferentes estágios de desenvolvimento• Compreender os elementos presentes no

desenvolvimento de doenças• O transcriptoma pretende catalogar todos os tipos de transcritos:• mRNAs• RNAs não codificadores• pequenos RNAs.

Porquê estudar o transcriptoma?

• Para determinar a estrutura transcripcional dos genes, em termos de seus sítios de início 5’ e final 3’;

• Padrões de splicing e outras modificações pós-traducionais;

• Quantificar os níveis de mudanças de expressão de cada transcrito durante o desenvolvimento e sob condições diferentes.

• Encontrar microRNAs que possuem função reguladora• Metagenômica

* Splicing = é um processo que remove os íntrons e junta os éxons depois da transcrição do RNA. O splicing só ocorre em células eucarióticas, já que o DNA das células eucarióticas não possui íntrons.

Criação da Biblioteca• Pode-se utilizar:

• Todo o RNA da célula• Possui 90-95% de rRNA

• Apenas mRNA selecionado pela cauda de poli-A• Perde-se microRNAs e mRNAs sem poli-A

• Retirando o rRNA• Por hibridização com sequencias específicas ligadas a biotina que

são retiradas com esferas ligadas a streptovidina• Quebra por uma exonuclease que age sobre RNAs que possuem

fosfato na extremidade 5' (apenas rRNAs possuem esse fosfato)• A remoção de rRNAs aumenta a detecção e a montagem de transcritos

raros.• Mas se o objetivo do estudo é a quantificação, é necessário uma

biblioteca não depletada.

Criação da Biblioteca

• Para a criação da biblioteca o RNA é transformado em cDNA por uma transcriptase reversa

• Para não se perder a direcionalidade do transcrito podem ser acrescentados adaptadores a uma extremidade do RNA

• isso é muito importante no estudo de espécies de genoma muito compactado onde o transcrito pode se sobrepor em fitas opostas

• O RNA pode ser fragmentado antes da formação de cDNA evitando a formação de estrutura secundária

• Cada molécula de cDNA, com ou sem amplificação, é então sequenciada com um método de alto rendimento para obter sequências curtas de um final (sequenciamento single-end) ou de ambos os lados (sequenciamento pair-end).

• As leituras são tipicamente 30 – 400 bp, dependendo da tecnologia usada para sequenciamento do DNA.

• Para esse método tem se usado plataformas tipo: Illumina IG, SOLiD e 454.

Considerações Prioritárias na montagem• Para garantir uma alta qualidade na montagem do transcriptoma, cuidados particulares devem ser tomados nos experimentos de RNA-Seq.

• Na fase de análise de dados, as leituras curtas são pré-processadas para remover erros de sequenciamento e outros artefatos.

• As leituras são subsequentemente montadas nos RNAs originais e então sua abundância é avaliada.

[Martin, J. A.; Wang, Z. 2011]

• Para evitar erros na montagem de RNA, é necessário retirar o passo de amplificação por PCR• Na etapa de amplificação por PCR alguns fragmentos

podem ser melhor amplificados que outros prejudicando os dados

• Já é possível fazer o sequenciamento sem amplificação usando as plataformas Helicos e Pacific Biosciences,

• O sequenciamento através de uma única molécula é possível, porém essas tecnologias ainda sofrem com a alta taxa de erro.

Estratégias de Montagem do Transcriptoma

• Baseado em três categorias :

- Etratégia baseada em referência

- Estratégia de novo

- Estratégia combinada

Estratégia baseada em Referência• Quando existe um genoma de referência o transcriptoma

pode ser construido a partir dele.

• Esse método inclui três passos:• Alinhamento das leituras sobre o genoma de referência• As leituras sobrepostas em cada locus são agrupadas para

construir um gráfico de todas as isoformas possíveis.• O gráfico é analisado para resolver isoformas individuais.

• Programas: Blat, TopHat, SpliceMap, MapSplice, GSNAP

[Martin, J. A.; Wang, Z. 2011]

[Martin, J. A.; Wang, Z. 2011]

• Após as leituras serem alinhadas ao genoma, dois métodos são usados para a construção dos gráficos:

- Cufflinks - cria um gráfico de sobreposição de todas as leituras que alinham com um único locus para montar isoformas encontrando o mínimo de transcritos que explicam os introns dentro da leitura.- é mais conservativo na escolha de quais os transcritos são re-

construidos

- Scripture - cria um gráfico que une cada base de um cromossomo e adiciona nas laterais (conexões) entre as bases se existe uma leitura que liga duas bases.- pode produzir um grande conjunto de transcritos de um locus.

Vantagens • Pode montar transcritos de baixa abundância;• Pode usar computação paralela• Pode ser feita em máquinas com poucos gb de RAM;• Descobrir novos transcritos que não estão em anotações

já existentes;• Descarta artefatos e contaminantes (que não alinham)• Usado para transcriptomas simples:

• bactérias, archeaeal, eucarióticos simples• com poucos introns• pouco splicing alternativo

Desvantagens

• Não é possível sem um genoma de referência;

• Depende da qualidade do genoma de referência ;

• Genomas podem não ser completos, ter regiões não

agrupadas e parcialmente montadas.

• Genes que se encontram muito próximos ou sobrepostos

podem ser interpretados com um único transcrito

• Não une leituras que esteja muito distantes no genoma

ou em cromossomos diferentes

Estratégia de novo• Não utiliza um genoma de referência;

• Se utiliza da redundância das leituras para encontrar sobreposições entre as leituras

• Programas usam o gráfico De Brujin para reconstruir transcritos de uma ampla faixa de níveis de expressão e então processar a montagem de contigs e remover redundancias.

• Semelhante à montagem de genoma

[Martin, J. A.; Wang, Z. 2011]

[Martin, J. A.; Wang, Z. 2011]

Vantagens• Não depende de um genoma de referência;

• Pode providenciar um novo conjunto de dados de transcritos para

genomas que não apresenta alta qualidade;

• Pode ser usado para encontrar transcritos exógenos ou que estão

faltando no genoma;

• Não é influenciado por longos introns

• Encontra transcritos trans-spliced, resultantes de rearranjos

cromossomais

• Pode ser utilizado para o transcriptoma de organismos complexos

Desvantagens• A montagem de organismos eucariotos complexos pode

consumir muita memória RAM• Grande quantidade de dados• Complexidade dos gráficos de Brujin nescessários para analizar

os possíveis splicings• Consome dias ou semanasde processamento

• Exige maior cobertura(30x)• Suscetível a erros de leitura, pode não diferenciar um erro

do sequenciamento de um splicing• Trechos similares(como parálogos) ainda podem ser

considerados um só transcrito

Estratégia Combinada• A combinação dos dois métodos pode ser utilizada

• O alinhamento tem a vantagem da sensibilidade• O De Novo para encontrar transcritos novos e trans-spliced

• Realizando o alinhamento primeiro podemos descartar as sequências já conhecidas• Fazendo a montagem De Novo com uma quantidade muito menor

de dados• Quando o genoma de referência tem baixa qualidade a

montagem De Novo pode ser feita primeiro• Os contigs e singlets são alinhados no genoma e as lacunas

podem ser preenchidas com informações do genoma

[Martin, J. A.; Wang, Z. 2011]

Cobertura x Custo• Uma questão importante é a cobertura da sequência ou a

porcentagem dos transcritos pesquisados, os quais implicam no custo.

• Grandes coberturas requerem mais sequenciamento.

• Em transcriptomas simples, como da levedura S. cerevisiae, que não tem evidência de splicing alternativo, 30 milhões de leituras de 35 nucleotídeos são suficientes para observar a transcrição de mais de 90% dos genes de células em crescimento sob uma condição unica

•RNA-Seq revela a localização precisa dos limites da

transcrição, com a resolução base a base.

•Além disso, pequenas leituras de 30 pb de RNA-Seq nos

mostra informação como 2 exons estão conectados,

enquanto leituras longas ou leituras curtas por pair-ends

poderiam revelar conectividade entre exons múltiplos.

•Os resultados de RNA-Seq também mostram alto nível

de reprodutibilidade, para ambas as técnicas e replicatas

biológicas.

Utilizações

• Descoberta de pequenos RNAs

• Quantificação da expressão em diferentes

momentos

• Fusão de genes em câncer

• Identificação de mutações

• Metagenômica

Obrigada!