Rio de Janeiro Outubro de 2018 - Oswaldo Cruz Foundation · Prof. Dra. Sima Esther Ferman (INCA/RJ)...
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MINISTÉRIO DA SAÚDE FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ INSTITUTO OSWALDO CRUZ Doutorado em Biologia Celular e Molecular CARACTERIZAÇÃO DO GENE RB1 E DA REGIÃO CROMOSSÔMICA 13q14 EM PORTADORES DE DELEÇÕES EM RB1, E ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DO GENE CDKN1B EM PORTADORES DE RETINOBLASTOMA RENATA MENDES DE FREITAS Rio de Janeiro Outubro de 2018
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MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Doutorado em Biologia Celular e Molecular
CARACTERIZAÇÃO DO GENE RB1 E DA REGIÃO CROMOSSÔMICA 13q14 EM PORTADORES DE DELEÇÕES EM RB1, E ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE
POLIMORFISMOS DO GENE CDKN1B EM PORTADORES DE RETINOBLASTOMA
RENATA MENDES DE FREITAS
Rio de Janeiro
Outubro de 2018
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Programa de Pós-Graduação em Biologia celular e molecular
RENATA MENDES DE FREITAS
CARACTERIZAÇÃO DO GENE RB1 E DA REGIÃO CROMOSSÔMICA 13q14 EM PORTADORES DE DELEÇÕES EM RB1, E ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE
POLIMORFISMOS DO GENE CDKN1B EM PORTADORES DE RETINOBLASTOMA
Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz
como parte dos requisitos para obtenção do título
de Doutor em Ciências
Orientador: Dr. Fernando Regla Vargas
RIO DE JANEIRO
Outubro de 2018
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Programa de Pós-Graduação em Biologia celular e molecular
AUTOR: RENATA MENDES DE FREITAS
CARACTERIZAÇÃO DO GENE RB1 E DA REGIÃO CROMOSSÔMICA 13q14 EM PORTADORES DE DELEÇÕES EM RB1, E ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO
DE POLIMORFISMOS DO GENE CDKN1B EM PORTADORES DE RETINOBLASTOMA
ORIENTADOR: Dr. Fernando Regla Vargas
Aprovada em: 29/10/2018
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EXAMINADORES:
Prof. Dra. Luciana Lopes de Almeida Ribeiro Garzoni - Presidente (IOC/FIOCRUZ)
Prof. Dra. Cibele Rodrigues Bonvicino (INCA/RJ)
Prof. Dra. Sima Esther Ferman (INCA/RJ)
Prof. Dr. Pedro Hernan Cabello Acero (IOC/FIOCRUZ)
Prof. Dra. Cynthia Chester Cardoso (UFRJ/RJ)
Rio de Janeiro, 29 de outubro de 2018
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7
Dedico este trabalho a todos os pacientes de retinoblastoma e seus familiares.
8
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus sempre em primeiro lugar. Ele me permitiu percorrer toda esta trajetória;
Aos meus amados pais, Wilson e Maria José, que sempre investiram na minha educação e me
deram todo amor;
Ao meu querido William Domingues por sempre acreditar na minha intelectualidade e me fazer
pensar que tudo é possível quando acreditamos; obrigada por todo amor e carinho nesses
anos de abdicação e dedicação;
Aos meus amigos e familiares que torcem por meu sucesso e que estiveram comigo mesmo
nos momentos de ausência;
A todo o grupo do Laboratório de Genética Humana da Fiocruz/ RJ pelo apoio e ensinamentos,
em especial a Gaby, Amanda e Carol que tornaram meus dias mais alegres; agradeço também
em especial ao Dr. Mário Campos Júnior que foi extremamente importante na concretização e
finalização deste trabalho.
Aos pesquisadores do Laboratório Epidemiológico de Malformações Congênitas da Fiocruz/ RJ
pela convivência durante esses quatro anos, em especial ao Dr. Fernando Vargas que me
oportunizou realizar meu sonho em fazer o doutorado na Instituição Oswaldo Cruz;
Agradeço a Dra. Ivna Carvalho pela cooperação, amizade e ensinamentos que muito
contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho;
Aos médicos pediatras que colaboraram na construção da pesquisa, em especial a Dra. Anna
Claudia Evangelista, médica pediatra do INCA, que sempre esteve integrada às nossas
necessidades e dificuldades;
À Dra. Ana Carolina Guimarães pela parceria e aprendizado que permitiram engrandecer meu
trabalho;
Aos pacientes com retinoblastoma que doaram seu próprio “sangue” para a pesquisa científica
e contribuíram muito para a aquisição de novos conhecimentos e um futuro melhor;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES pelo auxílio
financeiro.
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Uma vitória precisa ser conquistada...
Objetivo nenhum é alcançado se não por sacrifícios!
(Renata Mendes de Freitas)
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
CARACTERIZAÇÃO DO GENE RB1 E DA REGIÃO CROMOSSÔMICA 13q14 EM PORTADORES DE DELEÇÕES EM RB1, E ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE
POLIMORFISMOS DO GENE CDKN1B EM PORTADORES DE RETINOBLASTOMA
RESUMO
TESE DE DOUTORADO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
Renata Mendes de Freitas
O retinoblastoma se inicia, na grande maioria dos casos, a partir de dois
eventos mutacionais no gene RB1 nos retinoblastos. O rastreamento desse
gene em portadores da doença e em seus familiares torna-se importante para
caracterizar mutações germinativas causadoras da tumorigênese e promover o
acompanhamento genético das famílias. Porém, a doença pode ser modulada
pela presença de diversos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). No
presente estudo foi realizado o rastreamento do gene RB1 em 11 probandos
diagnosticados com retinoblastoma através de sequenciamento Sanger e a
caracterização genômica, através de PCR em tempo real e array-CGH, de
cinco portadores de retinoblastoma com deleção do gene RB1 previamente
identificados por Sena (2013), sendo que dois probandos apresentam deleção
parcial e três com deleção completa do gene RB1. Foram identificadas duas
variantes em regiões exônicas e 18 em regiões intrônicas, sendo seis ainda
não descritas (c.848 g>T; c.380+145 T>A; c.1216-28 C>T; c.1389+134 A>T;
c.1389+143 C>T; c.1814+72 T>A). Três mutações germinativas identificadas
no gene RB1 foram analisadas por modelagem comparativa, para verificar os
domínios alterados pelas mutações e correlacioná-las com o comprometimento
da funcionalidade da proteína retinoblastoma. As mutações do tipo stop códon,
que afetam o domínio pocket da proteína, são associadas com a forma bilateral
11
da doença. Uma metodologia em PCR em tempo real foi desenvolvida para
dosar o número de cópias gênicas do RB1, SUCLA2 e MED4, localizados na
região 13q14, em 5 probandos diagnosticados com retinoblastoma investigados
para deleções. Foi detectada a presença de deleções completas e intragênicas
no RB1, SUCLA2 e MED4, de forma a validar os resultados obtidos
previamente pela técnica de MLPA. Entre os probandos com deleção completa,
o tamanho da deleção variou de 12 a 42 Mb. Foi realizada uma revisão
sistemática da literatura para investigar associação entre tamanho da deleção
do gene RB1 e lateralidade tumoral. Foram incluídos, além do presente estudo,
outros 11 estudos, totalizando 112 probandos com deleção parcial ou completa
do gene RB1. A forma bilateral da doença foi mais prevalente no grupo de
probandos portadores de deleções parciais do gene RB1, quando comparado
com probandos com deleção completa (p=0,00007). Em função do pequeno
número de estudos disponíveis, não foi possível analisar a correlação entre
tamanho da deleção, e a deleção concomitante dos genes adjacentes MED4 e
SUCLA2. O polimorfismo rs2066827 no gene CDKN1B, importante regulador
do ciclo celular, codificador da proteína p27, foi avaliado em 72 portadores do
retinoblastoma como um possível modificador do fenótipo. Não se verificou
associação desse SNP como agente de susceptibilidade ao desenvolvimento
do retinoblastoma, nem efeito protetor. Observou-se maior proporção do
genótipo heterozigótico entre os controles avaliados neste estudo, mas sem
significância estatística. As frequências alélicas também não apresentaram
associação estatística. Contudo, a comparação da distribuição de genótipos
dos 72 probandos analisados com outro grupo controle retirado da população
brasileira para o mesmo polimorfismo investigado por Longuini et al. (2014)
mostrou diferença significativa (p=0,03).
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
CHARACTERIZATION OF THE RB1 GENE AND THE 13q14 CHROMOSOMAL REGION IN
CARRIERS OF DELETIONS IN RB1, AND THE ASSOCIATION STUDY OF CDKN1B GENE
POLYMORPHISMS IN RETINOBLASTOMA BEARERS
ABSTRACT
PHD THESIS IN PHD THESIS IN CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY
Renata Mendes de Freitas
Retinoblastoma begins, in the vast majority of cases, from two mutational
events in the RB1 gene in retinoblasts. The screening of this gene in patients
with the disease and its relatives becomes important to characterize germ
mutations that cause tumorigenesis and to promote the genetic follow-up of the
families. However, the disease can be modulated by the presence of several
single nucleotide polymorphisms (SNPs). In the present study, the RB1 gene
was screened in 11 probands diagnosed with retinoblastoma through Sanger
sequencing and the genomic characterization, through real-time PCR and
array-CGH, of five RB1 deletion retinoblastoma carriers previously identified by
Sena (2013), with two probands presenting partial deletion and three with
complete deletion of the RB1 gene. Two variants were identified in exonic
regions and 18 in intronic regions, of which six were not yet described (c.848 g>
T; c.380 + 145 T> A; c.1216-28 C> T; c.1389 + 134 A > T; c.1389 + 143 C> T;
c.1814 + 72 T> A). Three germline mutations identified in the RB1 gene were
analyzed by comparative modeling to verify the domains altered by the
mutations and to correlate them with the impairment of the functionality of the
retinoblastoma protein. The stop codon mutations, which affect the pocket
domain of the protein, are associated with the bilateral form of the disease. A
real-time PCR methodology was developed to measure the number of gene
13
copies of RB1, SUCLA2 and MED4, located in the region 13q14, in 5 probands
diagnosed with retinoblastoma investigated for deletions. The presence of
complete and intragenic deletions was detected in RB1, SUCLA2 and MED4, in
order to validate the results previously obtained by the MLPA technique. Among
the fully deleted probands, the size of the deletion ranged from 12 to 42 Mb. A
systematic review of the literature was conducted to investigate the association
between size of the RB1 deletion and tumor laterality. In addition to the present
study, 11 other studies were included, totaling 112 probands with partial or
complete deletion of the RB1 gene. The bilateral form of the disease was more
prevalent in the group of probands with partial deletions of the RB1 gene when
compared to probands with complete deletion (p = 0.00007). Due to the small
number of available studies, it was not possible to analyze the correlation
between size of the deletion, and the concomitant deletion of adjacent genes
MED4 and SUCLA2. The polymorphism rs2066827 in the CDKN1B gene, an
important cell cycle regulator, encoding the p27 protein, was evaluated in 72
retinoblastoma carriers as a possible phenotype modifier. There was no
association of this SNP as an agent of susceptibility to the development of
retinoblastoma, nor a protective effect. A higher proportion of the heterozygous
genotype was observed among the controls evaluated in this study, but without
statistical significance. Allele frequencies were also not statistically associated.
However, the comparison of genotype distribution of the 72 probands analyzed
with another control group from the Brazilian population for the same
polymorphism investigated by Longuini et al. (2014) showed a significant
difference (p = 0.03).
14
ÍNDICE
RESUMO 10
ABSTRACT 12
1 INTRODUÇÃO 23
1.1 Retinoblastoma – um câncer ocular infantil ........................................... 23
1.1.2 Retinoblastoma Trilateral ...................................................................... 29
1.1.3 Testes genéticos .................................................................................... 30
1.2 Genética do retinoblastoma ..................................................................... 32
1.3 O gene supressor tumoral RB1 ............................................................... 37
1.4 A proteína RB e o controle do ciclo celular ............................................ 40
1.5 Deleções do gene RB1 e região cromossômica 13q14 ......................... 47
1.6 O gene CDKN1B: um inibidor de quinase dependente de
ciclina ............................................................................................................... 51
1.6.1 Polimorfismos no gene CDKN1B ......................................................... 54
2. HIPÓTESES 57
3. OBJETIVOS 58
3.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 58
3.2 Objetivos Específicos ............................................................................... 58
4. MATERIAL E MÉTODOS 60
4.1 Caracterização da amostra ...................................................................... 60
4.1.1 Estimativa da concentração e integridade do DNA ............................ 62
4.2 Rastreamento de mutações germinativas em RB1 ................................ 63
4.3 Predições in silico de variantes no gene RB1 ........................................ 63
4.4 Modelagem molecular de mutações na proteína
retinoblastoma ................................................................................................ 64
4.5 Revisão sistemática da literatura de casos com a síndrome
da deleção 13q14 com retinoblastoma ......................................................... 65
4.6 PCR em Tempo Real ................................................................................. 66
4.6.1 Desenho dos oligonucleotídeos ........................................................... 68
15
4.6.2 Teste de otimização da concentração dos
oligonucleotídeos ........................................................................................... 70
4.6.3 Teste de diluição de DNA ...................................................................... 73
4.6.4 Ensaio de dosagem do número de cópias gênicas ............................ 76
4.7 Array-CGH ................................................................................................. 78
4.8 Análise do polimorfismo rs2066827 no gene CDKN1B ......................... 79
5. RESULTADOS 82
5.1 Características clínicas de pacientes com retinoblastoma................... 82
5.2 Rastreamento do gene RB1 em pacientes com
retinoblastoma ................................................................................................ 84
5.3 Predições in silico de variantes do gene RB1: ....................................... 95
5.4 Modelagens moleculares de mutações na proteína RB: ....................... 96
5.5 Revisão sistemática da literatura de casos da síndrome
13q14 com retinoblastoma ........................................................................... 107
5.6 Dosagem do número de cópias gênicas dos genes SUCLA2,
MED4 e RB1 ................................................................................................... 113
5.7 Validação das deleções em genes da região cromossômica
13q14 por Array-CHG: .................................................................................. 115
5.8 Genotipagem do polimorfismo rs2066827 no gene CDKN1B ............. 116
6 DISCUSSÃO 120
6.1 Características clínicas de pacientes com retinoblastoma................. 120
6.2 Alterações no rastreamento do gene RB1 ............................................ 123
6.3 Modelagens moleculares das mutações na proteína RB .................... 127
6.4 Revisão sistemática da literatura para os casos da síndrome
13q14 com retinoblastoma ........................................................................... 128
6.5 Dosagens gênicas dos genes SUCLA2, MED4 e RB1 ......................... 129
6.6 Genotipagem do polimorfismo rs2066827 no gene CDKN1B ............. 134
7 CONCLUSÃO 137
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 139
9 APÊNDICES 156
9.1 TCLE (Termo de Consentimento Livre e Esclarecido)......................... 156
16
9.2 Aprovação do comitê de ética para o desenvolvimento da
pesquisa ........................................................................................................ 160
9.3 Genotipagem dos pacientes com retinoblastoma para o
polimorfismo rs2066827 161
9.4 Genotipagem de grupo controle para o polimorfismo rs2066827 164
9.5 Revisão de literatura dos casos de retinoblastoma com deleção
no gene RB1 e região 13q14 167
9.6 Artigo publicado 177
17
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Representação de um fundo de olho humano normal. ................................................ 24
Figura 2: A) Imagem de um fundo de olho humano normal. B) Presença de massa tumoral. 26
Figura 3: Cromossomo 13, Homo sapiens. ................................................................................. 32
Figura 4: A) Retinoblastoma não hereditário. B) Retinoblastoma hereditário. ........................... 34
Figura 5: O funcionamento adequado da p53 ............................................................................. 39
Figura 6: Estrutura das proteínas membro da família pocket. .................................................... 41
Figura 7: Ação das proteínas pRB e E7 viral no ciclo celular. .................................................... 43
Figura 8: A pRB hipofosforilada associa-se a promotores gênicos e ao E2F, inibindo a
transcrição através do domínio pocket. ...................................................................................... 44
Figura 9: Representação das classes e dos tipos de quinases dependentes de ciclinas (CDKs)
..................................................................................................................................................... 45
Figura 10: A regulação do ciclo celular mediante a fosforilação da pRB permite a divisão celular
e transcrição gênica mediante liberação do fator E2F. ............................................................... 46
Figura 11: Cromossomo 13. Em destaque, as regiões envolvidas na síndrome 13q e seus
principais fenótipos. ..................................................................................................................... 48
Figura 12: Representação da proteína inibidora de quinase, dependente de ciclina p27 .......... 51
Figura 13: A proteína p27 inibe o complexo ciclina-CDK ........................................................... 52
Figura 14: Representação gráfica das interações nucleares e citoplasmáticas de p27. ............ 53
Figura 15: A diminuição dos produtos proteicos p27 interfere na inativação dos complexos
ciclina-CDK .................................................................................................................................. 54
Figura 16: Fluxograma da metodologia utilizada para o rastreio de mutações no gene RB1. ... 61
Figura 17: A) Esquema representativo das fases exponencial e platô da reação de qPCR. A
fase de platô corresponde a PCR convencional. B) Curvas de amplificação que na fase
exponencial ultrapassa a linha de threshold ............................................................................... 67
Figura 18: Desenho esquemático da localização genômica dos genes SUCLA2, MED4 e RB1,
localizados no cromossomo 13, avaliados na técnica de qPCR. ............................................... 68
Figura 19: Curvas de dissociação (curvas de Melting) dos genes alvo e controle da reação de
PCR em tempo real. ................................................................................................................... 71
Figura 20: Gráfico CT versus Concentração dos oligonucleotídeos do gene referência (ALB). 72
Figura 21: Gráficos do teste de diluição de DNA. ....................................................................... 74
Figura 22: Etapas da técnica de array-CGH. .............................................................................. 78
Figura 23: Esquema do gene CDKN1B, localizado na região cromossômica 12p13, com seus
codificadores, tamanhos e localização do polimorfismo avaliado neste estudo. ........................ 79
Figura 24: Esquema representativo das técnicas utilizadas neste estudo. ................................ 81
Figura 25: Eletroferograma mostrando a posição genômica g. 48362944 ................................. 88
Figura 26: Eletroferograma mostrando a posição genômica g. 48955473 ................................. 88
Figura 27: Eletroferogramas das variantes intrônicos encontradas no rastreamento do gene
RB1 no grupo prospectivo. .......................................................................................................... 94
18
Figura 28: Alinhamento múltiplo contendo a sequência alvo (P06400) e as sequências moldes
(4elj e 4ell) utilizadas para a modelagem comparativa. .............................................................. 98
Figura 29: Domínios da proteína retinoblastoma. ....................................................................... 99
Figura 30: Resultado das análises de Ramachandran plot (A) e ERRAT (B) do modelo gerado
para a mutação c.751C>T – p.R251X. ...................................................................................... 101
Figura 31: Resultado das análises de Ramachandran plot (A) e ERRAT (B) do modelo gerado
para a mutação c.763C>T - p.R255X. ...................................................................................... 102
Figura 32: Resultado das análises de Ramachandran plot (A) e ERRAT (B) do modelo gerado
para a mutação c.1574C>G – p.A525G. ................................................................................... 103
Figura 33: Alinhamento estrutural do modelo gerado para a mutação c.751C>T – p.R251X
(verde) com a proteína selvagem (rosa - azul). ........................................................................ 104
Figura 34: Alinhamento estrutural do modelo gerado para a mutação c.763C>T - p.R255X (azul
turquesa) com a proteína não mutada (rosa - azul). ................................................................. 105
Figura 35: Alinhamento estrutural do modelo gerado para a mutação c.1574C>G - p.A525G
(cinza) com a proteína não mutada (rosa - azul). ..................................................................... 106
Figura 36: Resultados das dosagens gênicas nos genes SUCLA2, MED4 e RB1 (éxons 3,10,
20 e 24) em pacientes com retinoblastoma. ............................................................................. 114
Figura 37: Imagens da técnica de array-CGH dos cinco probandos avaliados. ....................... 115
19
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Complexos RB-E2F prevalentes durante cada fase do ciclo celular .......................... 42
Tabela 2: Mutações selecionadas para a realização de modelagem comparativa. ................... 64
Tabela 3: Critérios para desenho dos oligonucleotídeos para PCR em tempo real. .................. 69
Tabela 14: Mutações germinativas selecionadas para modelagem molecular. ......................... 96
Tabela 15: Resultados de avaliação dos modelos e dos moldes utilizando os programas
ERRAT e PROCHECK. ............................................................................................................. 100
Tabela 16: Trabalhos publicados com ênfase na deleção 13q14 em pacientes com
retinoblastoma. .......................................................................................................................... 108
Tabela 17: Teste do qui-quadrado (χ2) aplicado aos casos de deleções completas e parciais de
pacientes com retinoblastoma identificados na literatura quanto à lateralidade da doença. ... 109
Tabela 18: Pontos de quebra de deleções envolvendo o gene RB1 em pacientes com
retinoblastoma encontrados na literatura. ................................................................................. 110
Tabela 19: Distribuição genotípica do rs2066827 no gene CDKN1B em 72 pacientes com
retinoblastoma que pertencem a coorte e 134 indivíduos sem o tumor. .................................. 116
Tabela 20: Teste do qui-quadrado (χ2) para os genótipos dos 72 pacientes com retinoblastoma
e de 134 indivíduos do grupo controle para o polimorfismo rs2066827 a fim de verificar o
equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). ....................................................................................... 116
Tabela 21: Teste do qui-quadrado (χ2) aplicado aos grupos de pacientes com retinoblastoma
(72) e controles (134) deste estudo. ......................................................................................... 117
Tabela 22: Teste do qui-quadrado (χ2) para as frequências alélicas dos grupos (pacientes com
RB e controles). ......................................................................................................................... 118
Tabela 23: Teste do qui-quadrado (χ2) para o grupo de pacientes com retinoblastoma (72) e o
grupo controle (885) utilizado no estudo de Longuini et al. (2014) para o polimorfismo
rs2066827. ................................................................................................................................. 119
Tabela 24: Teste do qui-quadrado (χ2) para as frequências alélicas dos grupos de pacientes
com retinoblastoma e controles de Longuini et al., 2014. ......................................................... 119
20
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
RB – Retinoblastoma
NCBI – National Center of Biotechnology Information
mm – Milímetro
PCR – Polymerase Chain Reaction
NGS – Next-Generation Sequencing
RBT – Retinoblastoma Trilateral
CpG – Citosina – fósforo – Guanina
kb – Quilo Bases
pRB – Proteína Retinoblastoma
E2F – Elongation Factor 2
HPV – Vírus do Papiloma humano
CDK – Quinases Dependentes de Ciclinas
CDKI – Inibidoras de Quinases Dependentes de Ciclinas
mt-DNA – DNA mitocondrial
Mb – Mega Base
FISH – Fluorescence In Situ Hydrization
MLPA – Multiplex Ligation-Probe Amplification
QMFPCR – Quantitative Multiplex Fluorescence PCR
ATP – Adenosina Trifosfato
SNP – Single Nucleotide Polymorphism
MAF – Minor Allele Frequency
INCA – Instituto Nacional do Câncer
21
HSM – Hospital Santa Marcelina
IFF – Instituto Fernandes Figueira
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
PDB – Protein Data Bank
CT – Cycle Threshold
NRC – Número Relativo de Cópias
TM – Temperatura de Melting
ALB – Albumina
ɳmol – Nanomolar
ng – Nanograma
pb – Pares de Bases
μM – Micromolar
mM – Minimolar
ExAC – Exome Aggregation Consortium
LOVD – Leiden Open Variation Database
dbSNP – Short Genetic Variations
HWE – Equilíbrio de Hardy-Weinberg
Tyr – Tirosina
Leu – Leucina
Phe – Fenilalanina
Glu – Glicina
Asp – Asparagina
22
cm – centímetro
cDNA – DNA complementar
23
1 INTRODUÇÃO
1.1 Retinoblastoma – um câncer ocular infantil
O câncer constitui, entre as crianças e adolescentes, a primeira causa
de óbito, por doença. O câncer infanto-juvenil envolve de 1% a 4% de todos os
tumores malignos, na maioria da população, sendo a leucemia o tipo tumoral
mais recorrente seguido dos linfomas e tumores do sistema nervoso central
(Galindo et al., 2015).
Tumores embrionários, como o retinoblastoma, neuroblastoma e tumor
de Wilms, são responsáveis por cerca de 20% de todas as ocorrências de
tumores infanto-juvenis (Instituto Nacional do Câncer – INCA, 2018), sendo
estimado em torno de 400 novos casos de retinoblastoma por ano no Brasil
(Sociedade Brasileira de Pediatria, 2018; Tucca, 2018).
O retinoblastoma (RB) é um tumor ocular que afeta células da retina,
podendo ser hereditário ou esporádico, diagnosticado, geralmente, em crianças
até os 5 anos de idade. A prevalência é de 1 em cada 15.000-20.000 nascidos,
sendo considerado um tipo neoplásico raro, apesar de ser o câncer de olho
mais frequente na infância (Aerts et al., 2006; Khalid et al., 2015; Scollon et al.,
2017).
Nos Estados Unidos e na Europa, a incidência do retinoblastoma, em
crianças de 0 - 4 anos de idade, é de 10 a 12 casos por milhão. No Brasil, a
incidência é variável, de acordo com cada região. Curitiba-PR é a capital
brasileira que apresenta a mais baixa taxa de incidência (3,5 por milhão),
enquanto Natal-RN apresenta a maior taxa de incidência (12,7 por milhão),
conforme descrito por De Camargo et al., 2010.
Há hipóteses de que o retinoblastoma possa ser mais frequente nos
países da América Latina, na África e Índia (Chantada et al., 1999; De
24
Camargo et al., 2010). Alguns estudiosos tentam associar a maior incidência
em países em desenvolvimento, ao grau de instrução dos pais, ao perfil
socioeconômico das famílias, à qualificação profissional da equipe de
assistência à saúde e às condições nutricionais materna, ressaltando, por
exemplo, a quantidade de ácido fólico consumido durante a gravidez (Orjuela et
al., 2012; Galindo et al., 2015). A relação entre raça, sexo e lateralidade ocular,
nos casos de retinoblastoma, não é encontrada nos estudos conduzidos
(Selistre et al., 2016).
Xu et al. (2009) sugerem que o retinoblastoma se desenvolve a partir de
alterações genéticas que ocorrem em células precursoras do cone da retina,
presentes em maior abundância na região da mácula ocular (Figura 1) (Kapatai
et al., 2013).
Figura 1: Representação de um fundo de olho humano normal. Em evidência, as regiões da mácula e do nervo óptico. Fonte: http://www.isaacramos.com.br/2013/10/19/degeneracao-macular/, 30/08/2018.
A doença pode afetar apenas um dos olhos, caracterizando-se como
unilateral e não hereditária; ou pode afetar ambos os olhos ou apenas um dos
olhos, mas com vários pontos multifocais, considerada bilateral e hereditária,
(Aerts et al., 2006).
Os principais sinais clínicos da doença são a leucocoria (60% dos
casos), o estrabismo (20%) e outros sinais como hiperemia, febre intermitente,
25
secreção, dor, lacrimejamento, pupila dilatada e perda da visão (Pandey et al.,
2014).
Contudo, a apresentação clínica da doença depende do padrão de
crescimento tumoral, do grau de vascularização, da presença de calcificações,
de sementes vítreas, do deslocamento da retina ou de ocorrência de
hemorragia (Balmer et al., 2006).
No entanto, lesões como hemorragia vítrea, deslocamento da retina,
catarata congênita, coloboma, toxocaríase e doença de Coats podem ser
confundidas com o retinoblastoma e são conhecidas como
pseudoretinoblastoma, demandando o exame diferencial, para o correto
diagnóstico (Rao e Hovonar, 2017).
A leucocoria apresenta-se como uma mancha esbranquiçada no fundo
do olho, identificada com a incidência de uma luz branca durante o teste do
reflexo vermelho (ou teste do olhinho) em recém-nascidos. Esse exame baseia-
se na percepção do reflexo vermelho, ao ser incidido um feixe de luz sob a
superfície retiniana. Quando a retina é atingida, normalmente, o reflexo
apresenta tons avermelhados. Isso significa que as principais estruturas
internas do olho estão transparentes. Assim, na presença de massa tumoral ou
de outra alteração, é possível observar o reflexo em tonalidades
esbranquiçadas (Sociedade Brasileira de Pediatria, 2018). Entretanto, é
importante salientar que esse teste pode não diagnosticar pequenas lesões e
aquelas localizadas na periferia retiniana, não substituindo a oftalmoscopia em
recém-nascidos, objetivando ao diagnóstico precoce do retinoblastoma (Ali et
al., 2018).
Na Figura 2, apresenta-se o fundo do olho humano sem a doença, com
a presença de massa tumoral e a leucocoria no olho de uma criança.
26
Figura 2: A) Imagem de um fundo de olho humano normal. B) Presença de massa tumoral. C) Leucocoria percebida mediante a incidência de luz.
Fonte: Ortiz e Dunkel, 2015.
Raramente, o retinoblastoma ocorre em adultos. Segundo Zafar et al.
(2013), até o ano de publicação de seu estudo, apenas 26 casos foram
publicados na literatura; após 5 anos, esse número não apresentou aumento
considerável (NCBI, 2018).
Esse tipo da doença em adultos difere da pediátrica, sendo
caracterizada por inflamação ocular, hemorragia vítrea e catarata, que são os
sinais clínicos mais comumente associados ao retinoblastoma em adultos
(Zafar et al., 2013). Algumas hipóteses tentam esclarecer a apresentação tardia
do retinoblastoma; a rara persistência de células retinianas embrionárias, que
podem gerar uma transformação maligna tardia, ou sugerir que o tumor possa
ter regredido de forma espontânea, sem ter sido diagnosticado, sendo,
posteriormente, reativado (Sharifzadeh et al., 2014).
Por ocasião deste estudo, três sistemas de classificação são utilizados
para avaliar o estadiamento do retinoblastoma. O estadiamento fundamenta-se
em imagens de tomografia computadorizada ou imagem de ressonância
magnética, que descreve aspectos do tumor como a localização, a
disseminação e o comprometimento de outros órgãos, dentre outras
27
particularidades. Conhecer esses aspectos ajuda a definir o tipo de tratamento
e a estimar o prognóstico do paciente (Aerts et al., 2006).
A classificação Reese-Ellsworth, elaborada em 1960, quando a maioria
do tratamento era feito com radioterapia externa, classifica o retinoblastoma
intraocular com o objetivo de preservar o olho e a visão. Esse sistema classifica
a doença em cinco grupos de estadiamento, conforme o tamanho, a extensão e
o foco tumoral (Aerts et al., 2006; Instituto Oncoguia, 2018):
Grupo I: muito favorável para a preservação do olho;
Grupo II: Favorável para a preservação do olho;
Grupo III: Duvidoso para a preservação do olho;
Grupo IV: Desfavorável para a preservação do olho;
Grupo V: Muito desfavorável para a preservação do olho.
A classificação internacional é o sistema mais recente para tumores
intraoculares e dividido em cinco estádios que considera a preservação dos
olhos com base nas atuais formas de tratamento (Aerts et al., 2006; Ortiz e
Dunkel, 2015; Instituto Oncoguia, 2018):
Grupo A: Tumores com até 3 mm de diâmetro confinados à retina,
próximos à região do disco óptico, onde entra o nervo óptico, e a
fovéola, centro de visão;
Grupo B: Tumores maiores que 3 mm, mas que ainda estão
próximos às estruturas citadas acima;
Grupo C: Tumores bem definidos, com pequena dispersão sob a
retina ou humor vítreo, material gelatinoso que preenche toda a
cavidade intraocular;
Grupo D: Tumores grandes com comprometimento do humor
vítreo ou acometimento sub-retiniano.
Grupo E: Tumor bastante grande, que se estende por toda a parte
frontal do olho, podendo ser hemorrágico ou causar glaucoma,
indicando a possibilidade de perda do olho.
28
A terceira classificação, Cancer Childhood Study Group (CCSG), avalia
o estadiamento do tumor extraocular, dividido em 5 grupos descritos abaixo
(Lira et al., 1995):
Grupo I: Presença de células tumorais na emissária esderal ou
em qualquer tecido episderal no momento da enudeação.
Grupo II: Presença de células tumorais ao nível da secção
cirúrgica do nervo óptico.
Grupo III: Tumor orbitário comprovado por biópsia.
Grupo IV: Células tumorais no líquor ou evidência de infiltração do
sistema nervoso central.
Grupo V: Metástase em medula óssea, em nódulos cervicais ou
em qualquer região do sistema nervoso central.
O manejo de uma criança diagnosticada com retinoblastoma envolve,
além da identificação do tumor e o estadiamento da doença, a tomada de
decisão sobre o tratamento adequado, o acompanhamento cuidadoso do
paciente e constatação de qualquer recorrência, inclusive de surgimento de
tumores secundários em casos bilateral ou unilateral multifocal (Rao e
Honavar, 2017).
As modalidades terapêuticas buscam salvar a vida da criança, preservar
o olho afetado e otimizar a função visual (Ali et al., 2018). As terapias
disponíveis para o tratamento deste tipo de tumor são: enucleação,
termoterapia transpupilar (conhecida como TTT, é uma radiação infravermelha
que provoca a hipertermia do tecido do tumor), crioterapia (substâncias que
rebaixam a temperatura do tecido), laser, braquiterapia (terapia por
aproximação ou inserção da fonte de radiação no paciente), radioterapia
externa e quimioterapia intra-arterial (Rao e Honavar, 2017; Ali et al., 2018).
Em países desenvolvidos a taxa de cura é de 90% e nos países em
desenvolvimento essa taxa vem atingindo 80% (Antoneli et al., 2003; Houston
29
et al., 2011). Essa menor taxa de cura pode ser explicada pelo diagnóstico
tardio. O atraso no diagnóstico por mais de 6 meses após o aparecimento dos
primeiros sinais da doença está associado a 70% de mortalidade em países em
desenvolvimento (Dimaras et al., 2008; Li et al., 2016).
1.1.2 Retinoblastoma Trilateral
O retinoblastoma trilateral (RBT), inicialmente descrito em 1971, é
definido como um retinoblastoma bilateral ou unilateral hereditário, associado
ao desenvolvimento tumoral na região intracranial média, onde se localiza a
glândula pineal ou, menos frequentemente, nas regiões suprasselar e
parasselar (Jurkiewicz et al., 2010; Jong et al., 2015).
Cerca de 5% das crianças com retinoblastoma, de origem mutacional
germinativa do gene RB1, apresentam risco de desenvolver o tipo trilateral da
doença (Jong et al., 2014), além de a possibilidade de ocorrência nos
descendentes variar em torno de 1% a 7%, dependendo do histórico familiar
(Cho et al., 2001).
O pinealoblastoma é uma forma maligna de tumor da região pineal, que
se desenvolve em paciente com retinoblastoma hereditário bilateral,
representando um tumor adicional ao retinoblastoma (Bader et al., 1980). Uma
variante benigna é descrita por Beck et al. (2006), denominada de cisto pineal,
identificada em pacientes com retinoblastoma trilateral, associada a casos
hereditários da doença (Beck et al., 2006).
O retinoblastoma trilateral é detectado por exames de ressonância
magnética, o que pode contribuir para o diagnóstico precoce, sendo o
prognóstico bastante insatisfatório, com média de sobrevida em torno de 9
meses (Jurkiewicz et al., 2010; Dimaras e Corson, 2017). No entanto, a
sobrevida de pacientes portadores do tipo trilateral da doença vem aumentando
30
nos últimos anos, mais notadamente com a introdução de novas terapias para
o retinoblastoma (Dimaras e Corson, 2017).
Popovic et al. (2007) identificaram uma variação genotípica em um
paciente do sexo masculino, aos 12 meses de idade, com retinoblastoma
trilateral na região suprasselar e com disseminação leptomeningeal espinhal,
cisto pineal e múltiplas deficiências hormonais, porém, sem sinais clínicos de
outra deficiência visual (Popovic et al., 2007). Essa variação corresponde a
uma mutação sem sentido (nonsense) g.64248C>T no éxon 10 do gene RB1,
causando a alteração de uma arginina para um códon de parada (stop códon)
na posição 320 (R320X); no entanto, essa alteração não foi identificada em
familiares do portador (Popovic et al., 2007).
São escassos os dados genéticos a respeito do tipo trilateral na literatura
(D’Elia et al., 2013).
1.1.3 Testes genéticos
Com o objetivo de confirmar o diagnóstico clínico do retinoblastoma, são
utilizados vários testes genéticos, como o sequenciamento Sanger, PCR
quantitativa, testes citogenéticos, Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification (MLPA) e array-CGH (Devarajan et al., 2015; Grotta et al., 2015).
O sequenciamento Sanger é muito usado para detectar mutações
pontuais ao longo do gene RB1 e pequenas deleções e inserções, sendo
considerado técnica rotineira para diagnóstico de retinoblastoma (Devarajan et
al., 2015). Quando esse rastreio inicial é negativo, são utilizados outros
métodos para identificar grandes deleções e inserções, a exemplo da técnica
de MLPA, PCR quantitativa multiplex e array-CGH (Devarajan et al., 2015;
Galindo et al., 2015; Grotta et al., 2015).
31
Deleções e inserções encontradas em pacientes com retinoblastoma são
investigadas por cariotipagem e Fluorescence In Situ Hydrization – FISH para
as grandes deleções, e Quantitative Multiplex Fluorescence PCR -QMFPCR,
MLPA e PCR em tempo real investigam pequenas, médias e grandes deleções
(Kirchhoff et al., 2009; Stofanko et al., 2013). No entanto, cada técnica possui
suas vantagens e limitações. A cariotipagem e o FISH podem detectar somente
grandes rearranjos, maiores que 1 kb, incluindo a deleção gênica completa
(Lakatosová e Holecková, 2007). Outros métodos como MLPA e PCR, em
tempo real, baseiam-se na quantificação de produtos amplificados por PCR,
sensíveis a baixas concentrações de DNA e permitem a detecção de deleções
completa e parcial do gene (Ahani et al., 2013).
Atualmente, pacientes com baixo nível de mosaicismo podem ser
identificados por meio do sequenciamento completo do genoma a partir de
células do sangue (McEvoy e Dyer, 2015).
Com o desenvolvimento e avanço do sequenciamento de nova geração
(NGS – Next-Generation Sequencing), é possível rastrear todo o gene e
detectar todos os tipos de mutações, incluindo as grandes deleções (Singh et
al., 2016). A vantagem do uso de NGS tem sido a rápida realização dos
ensaios a partir de várias amostras, sequenciamento de vários genes ao
mesmo tempo e elevada geração de dados (Devarajan et al., 2015; Grotta et
al., 2015). Essa técnica permite, ainda, a detecção de baixos níveis de células
em mosaico, em amostras de sangue, que podem não ser detectadas pelo
método de sequenciamento Sanger (Li et al., 2016). No entanto, esse
procedimento pode não ser economicamente acessível em todos os países.
32
1.2 Genética do retinoblastoma
O retinoblastoma é frequentemente ocasionado pela inativação de
ambos os alelos do gene supressor tumoral RB1, localizado na região
cromossômica 13q14.2 (Knudson, 1971; Rushlow et al., 2013).
Figura 3: Cromossomo 13, Homo sapiens. Em destaque, a região onde se localiza o gene
supressor tumoral RB1.
Fonte: NCBI, 2018.
Sessenta por cento (60%) dos casos são esporádicos, não hereditários,
provenientes de mutações somáticas em células da retina. Possuem
manifestação unilateral da doença e diagnóstico mais tardio, ocorrendo até aos
24 meses de idade (Mateu et al., 1997; Frenkel et al., 2016).
Os casos hereditários correspondem a 40%, apresentando-se de forma
bilateral ou unilateral, com a presença de múltiplos focos tumorais, dadas as
mutações germinativa e somática, diagnosticados mais precocemente até os
18 meses de idade e com possíveis manifestações tumorais extraoculares ao
longo da vida (Mateu et al., 1997; Frenkel et al., 2016). Há uma predisposição
especial ao desenvolvimento de sarcoma osteogênico (François, 1980).
Segundo Thomas et al. (2001), a proteína RB, codificada pelo gene RB1,
funciona como um coativador transcricional que promove a diferenciação e
perda da capacidade proliferativa de osteoblastos, podendo contribuir para o
direcionamento do osteossarcoma como neoplasias extraoculares em
33
pacientes com retinoblastoma hereditário (Thomas et al., 2001; OMIM
#180200, 2018).
Um quarto das mutações germinativas (25%), que ocorrem nos casos
bilaterais, é de origem familial, com herança autossômica dominante e
penetrância de 90%. As outras 75% de mutações germinativas são mutações
de novo, não familial, mas que podem ser herdadas pelos descendentes
(Dommering et al., 2014; Galindo et al., 2015; Rao e Hononar, 2017).
Em todos os casos de retinoblastoma bilateral, os descendentes
possuem 50% de chance de herdar o alelo mutado de um progenitor. Portanto,
indivíduos com mutações germinativas possuem predisposição hereditária ao
retinoblastoma. Assim, a detecção de mutações causadoras da doença é
importante para estimar o risco de desenvolver o tumor na família do paciente
(Parma et al., 2017).
Nos casos unilaterais, 90% correspondem a mutações não hereditárias e
cerca de 10% a 15% dos casos decorrem das mutações de novo em células
germinativas adquiridas durante a gametogênese, podendo ocorrer a forma
unilateral multifocal (Dommering et al., 2014; Price et al., 2014; Ortiz e Dunkel,
2015).
Knudson (1971) postulou a hipótese para o desenvolvimento do
retinoblastoma, conhecida como Teoria dos dois-eventos (Two-hit hypothesis),
em que ambos os alelos do gene supressor tumoral estariam inativados (Figura
4). Na forma esporádica da doença, são necessários dois eventos mutacionais
em uma mesma célula da retina; já na forma hereditária, o primeiro evento
mutacional ocorre nas células germinativas, durante o desenvolvimento
embrionário, e o segundo evento ocorre em uma célula da retina
(Knudson,1971).
34
Figura 4: A) Retinoblastoma não hereditário: células não cancerosas, somáticas, não apresentam defeito em nenhuma cópia do gene RB1. O primeiro evento mutacional ocorre, inativando um dos alelos; posteriormente, um segundo evento mutacional ocorre na mesma célula somática, inativando o outro alelo RB1. B) Retinoblastoma hereditário: todas as células do organismo possuem a inativação de um dos alelos RB1, que sofreu o primeiro evento mutacional em uma das células germinativas; o desenvolvimento tumoral ocorrerá, quando o segundo evento mutacional ocorrer em uma célula somática da retina. Fonte: Adaptado de Benavante e Dyer, 2015.
A base genética para o desenvolvimento do retinoblastoma é
principalmente aquela postulada por Knudson (1971). No entanto, mais
recentemente, Rushlow et al. (2013) identificaram uma segunda forma genética
para o desenvolvimento da doença, iniciado por amplificação do gene MYCN,
observado em casos de retinoblastoma esporádicos, unilaterais. Esse proto-
oncogene localiza-se na região cromossômica 2p24.3. Cerca de 1,5% a 2%
dos casos unilaterais esporádicos podem ser explicados pela amplificação
desse gene no tecido tumoral (Rushlow et al., 2013), sugerindo que MYCN
A)
B)
35
possa ser um importante direcionador da malignidade em casos esporádicos
da doença (Dimaras e Corson, 2017).
Esse mecanismo de iniciação do retinoblastoma por MYCN, na ausência
de inativação de RB1, foi demonstrado por sequenciamento completo do
genoma, Fluorescence In Situ Hybridization - FISH e imunohistoquímica
(McEvoy et al., 2014).
Além da inativação dos alelos do gene RB1, alterações genômicas
adicionais estão relacionadas à progressão tumoral (Dimaras et al., 2008). Mais
de 1.900 mutações em RB1 são documentadas em banco de dados, incluindo
mutações missense, nonsense, splicing, frameshifts, micro e macrodeleções, e
metilação na região do promotor (Lohmann e Gallie, 2004; Nguyen et al., 2018;
LOVD database, 2018).
As mutações no gene RB1 são, principalmente, dispersas pelos seus 27
éxons, localizadas, também, em junções de união íntron-éxon, região
promotora e em regiões intrônicas profundas (Lohmann, 1999). Mutações que
resultam em códons de parada (mutações nulas ou nonsense) são,
geralmente, associadas ao retinoblastoma de alta penetrância e acometem
90% de todas as mutações em RB1, enquanto mutações do tipo sentido
trocado (missense), inserções, deleções e mutações em sítios de splicing estão
associadas ao fenótipo de baixa expressividade e penetrância incompleta da
doença (Lohmann, 1999; Kalsoon et al., 2015; Parma et al., 2017).
As mutações que ocorrem dentro de regiões intrônicas podem afetar
sítios de splicing, resultando em retenção intrônica, perda de éxons e
deslocamento de quadros de leitura (frameshift), resultando em uma proteína
RB não funcional (Li et al., 2016).
Grandes deleções e duplicações em RB1 representam 10% a 20% de
mutações patogênicas encontradas em retinoblastoma. Normalmente, tais
mutações necessitam de uma metodologia independente do sequenciamento
por Sanger, tais como as técnicas de MLPA, PCR quantitativa, array-CGH ou
NGS (Li et al., 2016). A hipermetilação de ilhas CpG, na região promotora do
gene RB1, é observada em cerca de 10% dos casos de retinoblastoma
36
atuando como primeiro evento mutacional para o desenvolvimento do tumor
(Lohmann, 1999). Trabalhos recentes demonstram dados de expressão gênica
por desregulação epigenética de vários oncogenes e supressores tumorais em
cânceres, bem como em retinoblastoma (Benavante e Dyer, 2015; McEvoy e
Dyer, 2015).
O retinoma é considerado uma lesão benigna da retina, associada ao
retinoblastoma, mas sem características malignas. Essas lesões foram
inicialmente consideradas uma regressão espontânea do retinoblastoma. No
entanto, evidências clínicas e histopatológicas não confirmam essa hipótese e
sugerem que o retinoma representa um estágio anterior ao retinoblastoma e
que pode conduzir ao desenvolvimento do tumor (Sampieri et al., 2009).
Kalsoon et al. (2015) explicam que mutações na forma hereditária da
doença possuem expressividade variável e apresentam variabilidade
fenotípica. Dada a baixa penetrância, um portador de mutação germinativa
pode não desenvolver a doença. Em alguns casos, a expressividade reduzida
poderia resultar no desenvolvimento do tipo unilateral do tumor ou em
retinoma, em vez do retinoblastoma bilateral. Segundo os pesquisadores, a
justificativa dessa baixa penetrância e menor expressividade seria uma
alteração no sítio de tradução, ocasionado por uma mutação no domínio
carboxi-terminal (C-terminal) da proteína em alelos de baixa penetrância que
parcialmente inativam a proteína RB (Kalsoon et al., 2015).
Como em outros cânceres, vários micro-RNAs também são
desregulados em retinoblastoma (Carvalho et al., 2016), incluindo os miR-
17~92 e miR-106b~25 (Conkrite et al., 2011).
No tópico seguinte, são apresentadas as características associadas ao
gene RB1, principal gene relacionado ao desenvolvimento do retinoblastoma.
37
1.3 O gene supressor tumoral RB1
Em 1986, o gene RB1 foi identificado e clonado como o primeiro
supressor tumoral por Friend et al. (Benavante e Dyer, 2015). Esse gene
compreende mais que 178.143 kb do DNA genômico e é composto por 27
éxons que transcrevem um RNA mensageiro de 4.772 kb. A sequência
completa do gene foi relatada por Toguchida et al. (1993) (Toguchida et al.,
1993; Mateu et al., 1997; Kalsoon et al., 2015).
O gene RB1 codifica uma proteína nuclear denominada pRB de 928
aminoácidos, pertencente à família pocket, que tem papel na regulação do ciclo
celular (Toguchida et al., 1993; Mateu et al., 1997; Kalsoon et al., 2015).
O rastreamento de mutações no gene RB1 deve ocorrer em todos os
éxons, sendo as substituições de bases únicas e grandes deleções as
mutações mais recorrentes. Muitas dessas mutações são do tipo sem sentido
(nonsense) e frameshift (alteração no quadro de leitura dos nucleotídeos)
(Ottaviani et al., 2015).
A maioria das substituições origina-se da transição de uma citosina para
timina (C>T) no códon CGA no aminoácido arginina, gerando um códon de
parada UGA, resultando em perda de função da pRB (Mateu et al., 1997;
Khalid et al., 2015).
Mutações detectadas no gene RB1 podem elevar a qualidade do
gerenciamento clínico do retinoblastoma e permitir previsões de risco para
todos os membros da família (Ahani et al., 2013).
A depleção completa do gene RB1 leva a um aumento da instabilidade
cromossômica, manifestado em aneuploidia ou poliploidia (Huang et al., 2015).
Esse fenômeno é atribuído a uma disfunção centromérica e ao insucesso no
recrutamento de componentes do complexo condensina II, que são proteínas
responsáveis por manter as duas cromátides-irmãs unidas, levando ao defeito
de separação cromossômica durante a mitose (Huang et al., 2015).
38
No entanto, a tumorigênese acontece quando vias de vigilância são
inativadas, a exemplo da proteína p53 que impede a indução de apoptose na
perda de função da pRB (Di Fiore et al., 2013).
A via de sinalização da proteína p53, codificada pelo gene TP53,
localizado no cromossomo 17, é normalmente inativada em vários tipos de
cânceres; aproximadamente, 50% de todos os tipos tumorais apresentam
mutações no gene TP53, e aqueles que possuem o tipo selvagem da proteína
p53 frequentemente apresentam mutações em outros genes da via de
sinalização que permitem a vigilância do ciclo celular (McEvoy e Dyer, 2015).
Durante uma resposta de dano ao DNA, o gene TP53 previne a
proliferação celular através de vários mecanismos, como parada do ciclo
celular e ativação da apoptose (Jiao et al., 2016).
Em retinoblastoma, é comum o gene TP53 não ser mutado, e sim outros
genes associados (Kato et al., 1996; McEvoy et al., 2012), em que a
desregulação da p53 provém do aumento de expressão de genes reguladores
como MDM2 e MDM4 (Figura 5) (Reis et al., 2013). As proteínas mdm2 e
mdm4 podem impedir o efeito da p53, exercendo papel de reguladoras da p53,
inibindo o controle do ciclo celular e impedindo a apoptose (Jiao et al., 2016).
39
Figura 5: O funcionamento adequado da p53 é comprometido mediante o aumento da expressão de proteínas mdm2 e mdm4, em retinoblastoma, que inibem o controle da divisão celular e a indução à apoptose, promovendo a perda do controle da divisão celular e bloqueia a indução da apoptose. Fonte: Dados da autora, 2018.
O aumento da expressão dos genes MDM2 e MDM4 pode ser ativado
pelas amplificações somáticas em tumores ou polimorfismos germinativos,
conduzindo a uma predisposição dos indivíduos ao câncer (Reis et al., 2013).
Além do aumento de expressão dos genes antagonistas da via de
sinalização da p53, há diversas variantes de splicing na formação de RNAs
mensageiros dos genes MDM2 e MDM4 que levam à repressão da p53
(McEvoy e Dyer, 2015).
No tópico seguinte, aborda-se a proteína RB, codificada pelo supressor
tumoral RB1, como protagonista do ciclo celular. Ademais, esclarece-se a
relação dessa proteína com o complexo formado por proteínas ciclinas e
quinases, dependentes de ciclinas na condução e manutenção do ciclo celular
em retinoblastoma.
40
1.4 A proteína RB e o controle do ciclo celular
A tumorigênese resulta do descontrole na proliferação das células e de
danos a genes envolvidos diretamente na regulação do controle do ciclo celular
(Ma et al., 2006).
A parada do ciclo celular permite que reparos no DNA e erros de
replicação sejam realizados, a fim de evitar o desequilíbrio entre crescimento e
diferenciação terminal, e também a instabilidade genômica, que podem facilitar
o surgimento de cânceres (Ma et al., 2006).
A proteína RB (pRB) atua como reguladora das fases G1/S do ciclo
celular e possui a habilidade em regular a transcrição gênica de genes que
participam da apoptose, diferenciação e adesão celular (Dyson, 2016; Vélez-
Cruz e Johnson, 2017).
Essa proteína pertence a uma família de proteínas, codificadas por três
diferentes genes: o gene RB1, que codifica a pRB; o gene RBL1, localizado na
região cromossômica 20q11.2, que codifica a p107e o gene RBL2, localizado
no braço longo do cromossomo 16, que codifica a p130 (Henley e Dick, 2012;
Di Fiore et al., 2013). Todos os membros da família de proteínas RB possuem
uma região conservada, denominada ‘pocket’, que interage com o motivo
LXCXE, encontrado em proteínas virais, utilizado para se ligar a pRB. Deleções
ou mutações pontuais nesse domínio tornam as oncoproteínas incapazes de
inativar a pRB e potencializam células em alvos tumorais (Dahiya et al., 2000).
Essas proteínas, conhecidas como “pocket”, são formadas por 3
domínios: N-terminal, A/B pocket e C-terminal (Henley e Dick, 2012). A
funcionalidade das proteínas está relacionada aos domínios de ligação ao fator
transcrional E2F (elongation fator 2) (Kalsoon et al., 2015). Na Figura 6, é
mostrada a localização de cada domínio que estrutura a proteína.
41
Figura 6: Estrutura das proteínas membro da família pocket. Os éxons 12- 25 estão localizados na região de ligação ao fator transcricional E2F (elongation fator 2).
Fonte: Dados da autora, 2018.
Células que expressam a pRB mutante, sem o domínio de interação
LXCXE, mostraram estruturas da cromatina anormais, incluindo
descondensação da cromatina e cromossomos frouxos (Uchida, 2016). Esses
dados indicam que a pRB também regula a remodelagem da cromatina,
predominantemente nas fases G0 e G1 do ciclo celular (Longworth e Dyson,
2010).
As proteínas p107 e p130 exercem a função de reguladoras da
repressão de genes alvo do E2F. No entanto, tais proteínas são pouco
mutadas em cânceres humanos (Vélez-Cruz e Johnson, 2017). Estudos em
camundongos mostraram que o RB1 é um gene essencial às células, sendo
que camundongos knockout morrem durante o desenvolvimento embrionário.
Por outro lado, camundongos knockout, para os genes das proteínas p107 e
p130, desenvolvem-se, normalmente, sugerindo que tais proteínas não podem
substituir todas as funções da pRB e que esta de fato é vital para a
sobrevivência do organismo (Vélez-Cruz e Johnson, 2017).
Na fase quiescente das células (G0), a proteína mais abundante é a
p130; posteriormente, as células são estimuladas a iniciar o ciclo celular, e as
proteínas pRB e p107 são induzidas (Henley e Dick, 2012). Com isso, quando
as duas começam a ter seus níveis aumentados de expressão, os níveis da
p130 vão reduzindo (Tabela 1). Alguns estudos apontam p130 como um
repressor transcricional parcial denominado DREAM, e funciona para reprimir
42
as funções de genes alvo do E2F durante a fase G0 (Henley e Dick, 2012;
Engeland, 2018).
Tabela 1: Complexos RB-E2F prevalentes durante cada fase do ciclo celular
Membro da família RB Fatores de transcrição Estágio do ciclo celular
pRB 1, 2, 3 G0, G1, S
p107 4, 5 G1, S, G2
p130 4, 5 G0, G1
Fonte: Adaptada de Henley e Dick, 2012.
O início da transcrição gênica em eucariotos requer que fatores
proteicos transcricionais, juntamente com a RNA polimerase, formem um
aparato de transcrição basal para dar início à transcrição gênica (Pimentel et
al., 2013).
O fator de transcrição E2F foi, inicialmente, identificado como
componente celular necessário para a região anterior (região E1A) da proteína
de adenovírus, com a finalidade de mediar a ativação transcricional da região
promotora viral (região E2) (Yee et al., 1987).
Chellappan et al. (1991) deduziram o mecanismo de regulação do E2F
por ativação da região E1A de adenovírus, possibilitando o entendimento de
que o fator de transcrição é inibido, quando associado à proteína RB. Essa
observação foi a primeira a sugerir que o E2F poderia estar relacionado com o
desenvolvimento do câncer (Chellappan et al., 1991). Identificou-se,
posteriormente, que a pRB é alvo de outras oncoproteínas virais, incluindo
SV40 de antígeno T e proteínas E6 e E7 do Papilomavírus humano (HPV)
(Sellers e Kaelin, 1997; Bell et al., 2004).
Estudos subsequentes demonstraram que o E2F controla a transcrição
de genes que são fundamentais para a divisão celular (Bell et al., 2004).
43
Isso significa que a proteína viral E7, do HPV, é capaz de se ligar a pRB
e torná-la inativa; com isso, o fator E2F fica livre, gerando um estímulo para a
proliferação celular (Figura 7 – B). Acresce-se que a associação da proteína E7
com a pRB leva ao aumento da p53 que causa a parada do ciclo celular ou
induz à apoptose (Fischer et al., 2017). No contexto da infecção com HPV, a
oncoproteína E6 inicia a degradação da p53, proporcionando a perda do
controle da proliferação celular e o bloqueio na ativação da apoptose (Fischer
et al., 2017). Na Figura 7, demonstra-se a associação da proteína RB com o
fator E2F e também com a oncoproteína viral (Figura 7 – B).
Figura 7: Ação das proteínas pRB e E7 viral no ciclo celular. A) A ligação da pRB ao fator E2F resulta na parada do ciclo celular. A fosforilação da pRB libera o fator E2F que ativa a transcrição gênica para a replicação do genoma. B) A proteína viral E7 se liga a pRB, deixando o fator E2F livre, causando o estímulo constante à divisão celular. Fonte: http://bioqdocancer.blogspot.com.br, 2018.
A relação da pRB na progressão do ciclo celular é associada a oito
membros da família de fatores transcricionais E2F (E2F1 a E2F8) que são
reguladores centrais da progressão do ciclo celular. As pRB formam
heterodímeros com uma subunidade codificada por membros da família DP –
DP1 e DP2, gerando uma especificidade de ligação ao DNA, determinada,
principalmente, pela subunidade de E2F (Figura 8) (Dyson, 2016; Vélez-Cruz e
Johnson, 2017).
44
Figura 8: A pRB hipofosforilada associa-se a promotores gênicos e ao E2F, inibindo a transcrição através do domínio pocket. Fonte: Joaquin et al., 2017.
Os fatores E2F1, E2F2 e E2F3 são associados à ativação transcricional
e possuem a pRB como alvo; E2F4 e E2F5 são repressores transcricionais e
são alvos da p107 e p130, enquanto E2F6, E2F7 e E2F8 são repressores
independentes de pRB (Longworth e Dyson, 2010). O fator E2F1 desenvolve
importante papel na indução de apoptose e é encontrado frequentemente
amplificado em cânceres humanos (Vélez-Cruz e Johnson, 2017).
Embora o modelo aceito para o complexo pRB-E2F preveja que pRB
fosforilada por quinases dependentes de ciclinas (CDKs) libere os fatores de
transcrição E2F, durante a transição do ciclo celular G1/S, observou-se que os
complexos pRB-E2F1 persistem associados além da fase S,
independentemente da fosforilação de pRB. Esse complexo ocupará regiões
promotoras de genes apoptóticos de células em proliferação (Indovina et al.,
2015).
Assim, essas observações indicam que a fosforilação de pRB por CDKs,
durante a transição G1/S, causa a liberação da maioria dos fatores E2F para
induzir a transcrição de genes do ciclo celular, mas os complexos pRB-E2F1
permanecem estáveis graças à interação desse complexo às regiões
promotoras de genes apoptóticos, reprimindo sua expressão (Dick e Rubin,
2013; Indovina et al., 2015).
DeGregori (1997) sugere que a apoptose induzida por E2F1 não seja
simplesmente uma consequência de anormalidade na fase S, mas que
representa uma propriedade intrínseca do E2F1 em ativar genes que iniciam a
45
morte celular programada. É possível que essa habilidade do E2F1 faça com
que ocorra interação, direta ou indireta, com outras proteínas que participam da
via apoptótica, incluindo a p53. Assim, os resultados apresentados por
DeGregori (1997) sugerem a capacidade do E2F1 em induzir um acúmulo de
p53, atuando na fase G1 do ciclo celular, promovendo o controle e a
diferenciação das células (Perri et al., 2016).
As proteínas da família RB são ativadas por fosforilação de quinases
dependentes de ciclinas (CDKs), que se dividem em três classes - CDK2,
CDK4 e CDK6. As CDK2 associam-se a ciclinas do tipo A e E; as classes
CDK4 e CDK6 são associadas às ciclinas do tipo D (D1, D2 e D3), sendo
responsáveis por iniciar a fosforilação da pRB (Henry e Dick, 2012). Estas
atuam na manutenção das células na fase G1 do ciclo celular, pois favorecem
a manutenção do complexo pRB-E2F (Henry e Dick, 2012). O complexo
CDK2/ciclina E promovem a progressão do ciclo da fase G1 para a fase S, e a
CDK2/ciclina A é responsável por manter a progressão do ciclo celular após a
fase S (Figura 9) (Knudsen et al., 2008).
Figura 9: Representação das classes e dos tipos de quinases dependentes de ciclinas (CDKs) que são fosforiladas, quando associadas às ciclinas em cada etapa do ciclo celular. O complexo CDK2/ciclina E (destaque com a seta verde) tem atuação fundamental na progressão de G1 para a fase S. O complexo CDK2 / ciclina A mantém a progressão após a fase S. Fonte: Dados da autora, 2018.
46
Em sua forma ativa, a pRB é hipofosforilada em G0/G1 e associada ao
fator transcricional E2F, bloqueando o ciclo celular (Figura 9). Fatores
extracelulares que direcionam a mitogênese das células induzem a ativação de
quinases dependentes de ciclinas (CDKs) das classes CDK2 e CDK4/CDK6
que promovem a fosforilação da pRB (Sellers e Kaelin, 1997).
Uma vez fosforilada, a proteína RB tem sua ligação ao fator E2F
enfraquecido e ocorre a dissociação dessas moléculas, permitindo, assim, o
início e a progressão para a fase S do ciclo celular (Bell et al., 2004; Ganguly et
al., 2010).
Com a progressão do ciclo celular, a atividade das CDKs é diminuída ou
inibida por outro grupo de proteínas denominadas de inibidoras de quinases
dependentes de ciclinas (CDKI), permitindo que a pRB seja hipofosforilada e
formado um novo complexo pRB-E2F, capaz de reprimir a transcrição gênica e
a progressão do ciclo celular (Vélez-Cruz e Johnson, 2017). Na Figura 10,
estão demonstradas as CDKIs, dentre elas a p27 e p21, inibindo as CDKs e
restabelecendo o complexo pRB-E2F com a hipofosforilação da proteína.
Figura 10: A regulação do ciclo celular mediante a fosforilação da pRB permite a divisão celular e transcrição gênica mediante liberação do fator E2F. As CDKIs bloqueiam o complexo ciclina-CDK, interrompendo o ciclo celular, levando à hiposfosforilação da pRB e ao restabelecimento do complexo pRB-E2F. Fonte: Adaptada de Aguilar e Fajas, 2010.
47
Essa regulação desencadeada por CDKIs na progressão do ciclo celular
é o principal mecanismo pelo qual a pRB reprime o desenvolvimento tumoral
(Vélez-Cruz e Johnson, 2017). No entanto, a pRB interage com centenas de
proteínas que são fundamentais para múltiplos processos, além do controle do
ciclo celular (Vélez-Cruz e Johnson, 2017).
Estudos sugerem que o E2F também pode ligar-se a múltiplos sítios
promotores, regulando dinamicamente a codificação de genes importantes para
o reparo de DNA, remodelagem da cromatina e segregação cromossômica
(Crosby et al., 2004).
Os genes que contribuem para a síntese de proteínas que permitem a
divisão celular funcionam como proto-oncogenes, e aqueles que inibem a
divisão das células funcionam como genes supressores de tumor. Dessa
forma, as proteínas E2F e as CDKs são transcritas a partir de oncogenes,
enquanto a pRB e as CDKIs são codificadas por supressores tumoral (Alberts
et al., 2010).
Segue-se a apresentação de outro fenótipo relacionado ao
retinoblastoma, denominado de síndrome 13q, que envolve deleções na região
cromossômica 13q14, incluindo o gene RB1.
1.5 Deleções do gene RB1 e região cromossômica 13q14
Deleções envolvendo o gene RB1, localizado na região cromossômica
13q14, são conhecidas por serem relacionadas a uma síndrome que envolve
genes contíguos, caracterizada por anormalidades neurológicas e
psicomotoras (Albrecht et al., 2005).
A síndrome da deleção 13q, como é conhecida, pode envolver outros
genes além do RB1, e anormalidades de desenvolvimento neurológico, em
48
associação com fenótipos faciais distintos, são correlacionadas com o tamanho
da deleção 13q. No entanto, pequenas deleções limitadas à banda 13q14 são
associadas ao desenvolvimento neurológico normal durante a infância (Baud et
al., 1999).
Duas formas sindrômicas são associadas com deleções, envolvendo
regiões diferentes do braço longo do cromossomo 13; uma delas é causada por
uma deleção distal que envolve a banda q32 e é fenotipicamente caracterizada
pela presença de retardo mental severo, malformações e anomalias digitais. A
outra decorre da deleção proximal que envolve a banda q14 e é associada ao
retinoblastoma e retardo mental (Figura 11) (Caselli et al., 2007).
Figura 11: Cromossomo 13. Em destaque, as regiões envolvidas na síndrome 13q e seus principais fenótipos. Fonte: Dados da autora, 2018.
Cerca de 5% a 10% de pacientes com retinoblastoma possuem deleções
no braço longo do cromossomo 13 (Brennan et al., 2016). A distribuição das
deleções ao longo do gene RB1 não mostra ocorrências repetidas de deleções
específicas com pontos de quebras intragênicos (Albrecht et al., 2005).
Motegi (1983) foi o primeiro autor a sugerir fenótipos faciais específicos
para caracterizar a deleção 13q14; Baud et al. (1999) definiram as principais
características dismórficas da síndrome da deleção 13q14, a partir de um
estudo em uma coorte de 22 pacientes com anormalidades variadas que
incluía testa alta e larga, lóbulos grossos da orelha, nariz curto, linha mediana
49
do lábio superior proeminente e lábio inferior espesso (Baud et al., 1999;
Caselli et al., 2007).
Em 1980, Matsunaga et al. correlacionaram a maior proporção de casos
de retinoblastoma unilateral com aqueles que carregavam a deleção 13q
comparada a outros pacientes com retinoblastoma hereditário (Albrecht et al.,
2005). Seguindo o mesmo entendimento, Bunin (1989) identificou pacientes
com deleções no gene RB1 na linhagem germinativa, tendo sido mais
recorrente o retinoblastoma unilateral, comparando-se a outros pacientes com
retinoblastoma hereditário, que normalmente desenvolvem a forma bilateral da
doença (Dehainault et al., 2014).
O gene SUCLA2, localizado na região cromossômica 13q14.2, codifica a
subunidade beta da succinil-CoA sintetase (SCS-A), presente na matriz
mitocondrial (OMIM #603921). Essa enzima faz parte do ciclo do ácido
tricarboxílico (ou do ácido cítrico), descrito pela primeira vez por Hans Krebs,
em 1937. Mutações homozigóticas em SUCLA2 foram identificadas pela
primeira vez em uma família israelense com encefalomiopatia mitocondrial
recessiva, associadas à depleção de mtDNA, levando a um comprometimento
multissistêmico (Lamperti et al., 2012).
A proximidade entre os genes SUCLA2 e RB1 pode levar a ocorrência
de encefalomiopatia mitocondrial e retinoblastoma bilateral, conforme
constatado no estudo de Maitilainen et al. (2015). Em um grupo de 42
pacientes com retinoblastoma e fenótipos variados devido à deleção 13q, 27
pacientes tiveram deleção, envolvendo os genes RB1 e SUCLA2. Dessa forma,
os autores propuseram que o SUCLA2 pode ser considerado uma causa para
deficiências neurológicas em pacientes com retinoblastoma e deleções na
região 13q14, especialmente nos casos em que há comprometimentos
psicomotores e neurológicos (Maitilainen et al., 2015).
Outro gene adjacente à região 13q14, MED4, é um mediador do
complexo multiproteico, requerido por fatores de transcrição e pela RNA
polimerase II para ativação gênica, funcionando como um coativador nuclear
(OMIM #605718). O fenótipo moderado para a síndrome 13q foi visto em
pacientes com retinoblastoma e deleções maiores que 1 Mb (Mitter et al.,
50
2011). No referido estudo, foram observados 27 probandos com deleção,
envolvendo os genes MED4 e SUCLA2 com 9 casos (33%) de deleções
associadas à forma unilateral do retinoblastoma ou sem a doença. Assim,
deleções incluindo o MED4 estão associadas a uma manifestação fenotípica
moderada das características da síndrome 13q (Mitter et al., 2011). No mais,
esse gene tem sido considerado um gene de sobrevivência ao
desenvolvimento do retinoblastoma (Eloy et al., 2016), contribuindo para a
baixa penetrância em pacientes com grandes deleções, incluindo os genes
MED4 e RB1 (Dehainault et al., 2014).
Contudo, as patologias causadas por alterações no gene RB1,
associadas ao retinoblastoma, podem ser resumidas em três grupos distintos:
Fonte: Adaptado de Rao e Honavar, 2017.
51
1.6 O gene CDKN1B: um inibidor de quinase dependente de
ciclina
O gene CDKN1B, também conhecido como p27/Kip1 (p27), localizado
na região cromossômica 12p13, codifica o inibidor de quinase p27. Essa
proteína tem a função de regular a progressão do ciclo celular, mantendo as
células na fase G1, impedindo o avanço do ciclo (Cheng et al., 2017). Nesse
sentido, a p27 inibe diretamente as quinases dependentes de ciclinas do tipo
CDK4/6 e CDK2/E, que atuam na progressão da fase G1 para a fase S,
mantendo o complexo pRB-E2F. A p27 é uma CDKI, mostrada na Figura 10.
Desse modo, não ocorre a liberação do fator de transição E2F que não permite
o avanço das células pelo ciclo celular (Figura 12) (Cheng et al., 2017).
Figura 12: Representação da proteína inibidora de quinase, dependente de ciclina p27, codificada pelo gene CDKN1B, bloqueando a fosforilação das CDK4/6 e CDK2. O avanço pelo ciclo celular é impedido, pois o complexo pRB-E2F é mantido. Fonte: https://geneticaufc.wordpress.com, 03-05-2018.
A ativação e repressão do complexo ciclina-CDK são reguladas pelo
sítio N-terminal da p27 (CDKI), que impede a ligação da molécula de adenosina
trifosfato (ATP), ao bloquear fisicamente e alterar estruturalmente o sítio
catalítico da CDK, evitando a fosforilação do complexo ciclina-CDK e
subsequentemente o rompimento do complexo pRB - E2F (Lee e Kim, 2009).
52
Na Figura 13, apresenta-se o funcionamento desse mecanismo de regulação
pela p27.
Figura 13: A proteína p27 inibe o complexo ciclina-CDK por alterar e bloquear o sítio catalítico de ativação da CDK, impedindo a fosforilação do complexo. Fonte: Dados da autora, 2018.
Desse modo, a ativação do complexo ciclina-CDK é regulada pelo
acúmulo de ciclinas e pela fosforilação e defosforilação de componentes
específicos desse complexo que permitem o controle de todo o ciclo celular
(Lee e Kim, 2009). A ausência da p27 durante a fase G1 permite que os
complexos de ciclinas e quinases sejam ativados na transição das fases G1/S
e ocorra a progressão do ciclo celular (Wander et al., 2012; Freitas et al., 2018
No prelo).
Em G1, os níveis de expressão da p27 são relativamente altos e a
atividade da CDK2/E é baixa. Isso previne a síntese de DNA e
consequentemente a divisão celular (Henry e Dick, 2012). A perda do controle
do ciclo celular é extremamente alarmante por contribuir para o
desenvolvimento de malignidades como o câncer (Cheng et al., 2017).
O papel fundamental do gene CDKN1B na regulação da proliferação
celular e como supressor tumoral foi demonstrado em camundongos knockout
que apresentaram gigantismo por causa do aumento do número celular e
aumento da tumorigênese (Chang et al., 2004).
53
A inativação da p27 não provém de mutações no gene CDKN1B ou
silenciamento epigenético, como ocorre tipicamente em genes supressores
tumorais. A p27 é inativada em tumores por modificações pós-traducionais que
resultam em uma regulação alterada da proteína (Vervoots e Lüscher, 2008).
Em células normais, os níveis da proteína p27 são controlados por
proteólise e dependem de ubiquitinação. Após estímulo mitogênico, a p27 é
liberada dos complexos CDK2/E, e essa dissociação ativa a CDK2, a qual, por
sua vez, fosforila a pRB (Pellegata, 2012). Após a dissociação da p27 com o
complexo CDK2/E no início de G1, uma porção de p27 é fosforilada em serina
10 e exportada para o citoplasma através da interação com a exportina (CRM1)
(Hnit et al., 2015). Uma vez no citoplasma, a p27 é ubiquitinizada pelo
complexo KPC1/KPC2 e degradada pelo proteassoma (Figura 14) (Pellegata,
2012; Wander et al., 2012).
Figura 14: Representação gráfica das interações nucleares e citoplasmáticas de p27. Fonte: Pellegata, 2012.
A p27 é raramente mutada em cânceres (Li et al., 2004). Baixos níveis
de expressão do gene CDKN1B estão relacionados com a tumorigênese e o
avanço do estágio clínico em vários tumores, tais como, de próstata, gástrico,
laríngeo, colorretal, carcinoma medular da tireoide e mama. Na Figura 15,
54
estão descritos os baixos níveis proteicos da p27 que interferem no
funcionamento adequado do ciclo celular.
Figura 15: A diminuição dos produtos proteicos p27 interfere na inativação dos complexos ciclina-CDK, em cada fase do ciclo celular, reduzindo os níveis de controle de cada etapa e resultando em uma divisão celular desregulada. Fonte: Dados da autora, 2018.
1.6.1 Polimorfismos no gene CDKN1B
Os polimorfismos são variações genéticas encontradas no genoma
humano, em pelo menos 1% da população, sendo os polimorfismos de base
única (SNPs – Single Nucleotide Polymorphism) a classe mais frequente de
polimorfismos que surgem de alterações em um único nucleotídeo de uma
determinada sequência de DNA, a partir de mutações pontuais que são
seletivamente mantidas em uma determinada população. Os SNPs estão
distribuídos por todo o genoma, o que os torna excelentes marcadores
biomoleculares (Alberts et al., 2010). Por definição, um SNP apresenta MAF
(minor allele frequency, frequência do alelo minoritário) maior que 1%, em pelo
menos uma população (Risch et al., 2000). O MAF é calculado com base no
tempo em que ocorreu a determinada mutação, a pressão evolutiva que
depende do significado biológico da variação, a deriva genética e eventos do
tipo “gargalo de garrafa” (Erichsen, 2004; Carvalho, 2017).
55
Alguns SNPs nesse gene estão associados à reduzida taxa de
transcrição e baixos níveis de expressão proteica, levando à desregulação do
ciclo celular e a um comportamento neoplásico das células (Li et al., 2004;
Barbieri et al., 2014; Lu et al., 2015). Polimorfismos de base única, como os
rs2066827 (109 T/G) e rs34330 (-79 C/T) no gene CDKN1B, foram
identificados e são estimados por conferir susceptibilidade ao risco de câncer
(Wei et al., 2012; Xiang et al., 2013; Lu et al., 2015; Cheng et al., 2017).
O polimorfismo rs2066827, localizado no éxon1 do gene CDKN1B,
resulta em uma transversão de timina para guanina (T>G) no códon 109 que
causa uma alteração na sequência de aminoácidos de valina para guanina
(T326G, V109G), podendo alterar a eficiência da transcrição e níveis proteicos,
levando à desregulação do ciclo celular e à correlação com susceptibilidade ao
desenvolvimento de tumores (Lu et al., 2015). Landa et al. (2010) sugerem que
o polimorfismo rs2066827 esteja associado à reduzida taxa de transcrição e
aos baixos níveis proteicos de p27 com susceptibilidade ao desenvolvimento
dos cânceres de tireoide e próstata (Chang et al., 2004; Landa et al., 2010).
Atualmente, outros estudos têm demonstrado esse aumento à
susceptibilidade ao câncer do polimorfismo rs2066827 (Lu et al., 2015; Hossian
et al., 2017). Por outro lado, a perda da expressão de p27 tem sido descrita
como evento frequente em vários cânceres humanos, conferindo uma
vantagem proliferativa que pode levar à formação do tumor (Landa et al.,
2010).
Em alguns tipos de tumores, a p27 não apresenta seus níveis reduzidos
apenas no núcleo das células, mas também exibem localização citoplasmática,
podendo adquirir uma função oncogênica, independentemente do ciclo celular
para promover a invasão de células cancerígenas (Chu et al., 2008; Wander et
al., 2012). De acordo com Vervoorts e Lüscher (2008), o decaimento no
acúmulo de p27, no citoplasma, poderia reduzir a ativação do complexo
CDK4/6-ciclina D e, em paralelo, poderia inibir o outro complexo CDK2-ciclina
E, e, desse modo, evitar a progressão do ciclo celular (Vervoorts e Lüscher,
2008).
56
Por outro lado, a concentração de p27 no citoplasma aumenta a
metástase tumoral em modelos murinos e promove a invasão de células de
glioma. De tal modo, enquanto a p27 nuclear inibe os complexos CDK – ciclina,
para conter o ciclo celular, a p27 em excesso no citoplasma pode ter um efeito
oncogênico e promover a invasão e metástase celular (Chu et al., 2008;
Wander et al., 2012).
Essa proteína foi identificada na associação da síndrome da neoplasia
endócrina múltipla (MENX), uma doença autossômica dominante, com
mutações de perda de função germinativa no gene CDKN1B em camundongos.
Estudos de expressão para a p27 mostraram ausência ou redução da presença
em tecidos normais e patológicos desses camundongos (Tonelli et al., 2014).
Estudos in vitro em culturas celulares demonstraram, além disso, que a
proteína p27 mutante mantém algumas propriedades da proteína selvagem,
como a localização nuclear e a interação com CDK2, mas é altamente instável
e degrada rapidamente (Tonelli et al., 2014).
Como a p27 tem sido alvo de vários estudos em cânceres (Cheng et al.,
2017), no presente estudo, avaliou-se o polimorfismo rs2066827, em
portadores de retinoblastoma, pois não se encontram na literatura estudos
relacionados.
57
2. Hipóteses
A partir do conhecimento da doença do retinoblastoma e da literatura
bibliográfica disponível, buscamos não apenas detectar as deleções
envolvendo o gene RB1, mas revisar os casos descritos na literatura a fim de
compreender como as deleções em genes da região 13q14 interferem no
fenótipo do paciente com retinoblastoma. Ainda, buscamos avaliar neste
trabalho o possível efeito no fenótipo de portadores com retinoblastoma
associado a um polimorfismo de base única, localizado no gene CDKN1B, que
possa indicar uma associação de susceptibilidade ou efeito protetor em relação
ao SNP e ao desenvolvimento ou manifestação do retinoblastoma. Logo, nosso
trabalho se apoia com base em duas hipóteses:
1. A bilateralidade é um fenótipo marcadamente presente nas deleções
intragênicas envolvendo o gene RB1?
2. O polimorfismo rs2066827, localizado no éxon1 do gene CDKN1B,
altera a manifestação fenotípica em portadores de retinoblastoma, como
sugere alguns trabalhos para outros tipos tumorais?
58
3. Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Realizar caracterização genotípica e fenotípica de portadores de
retinoblastoma com deleção parcial ou completa do gene RB1 e da
região 13q14, e investigar a contribuição de polimorfismos no gene
CDKN1B como modificadores de fenótipo em portadores de
retinoblastoma.
3.2 Objetivos Específicos
Rastrear mutações germinativas no gene RB1 em portadores de
retinoblastoma por meio da técnica de sequenciamento automático
Sanger, e associar os achados genotípicos identificados com
variáveis fenotípicas, tais como lateralidade do tumor, idade ao
diagnóstico, histórico familiar, estadiamento da doença, principais
sinais e sintomas.
Avaliar os efeitos in silico de variantes identificadas no rastreamento
do RB1.
Realizar modelagens moleculares comparativas para as mutações
germinativas identificadas nesses pacientes, a fim de investigar quais
estruturas da proteína retinoblastoma (pRB) são alteradas nesses
pacientes.
Desenhar e validar por meio da técnica de PCR quantitativa as
deleções parciais e completas, identificadas previamente em
pacientes com retinoblastoma, por meio da técnica de MLPA (Multiple
Ligation Probe Amplification) no gene RB1 e nos genes adjacentes –
SUCLA2 e MED4, localizados na região cromossômica 13q14.
59
Observar a proporção de casos com deleção completa e parcial,
buscando rastrear os pontos de quebra neste último caso. Além disso,
estabelecer possíveis associações entre a extensão das deleções
genômicas com a lateralidade tumoral envolvendo os genes
investigados.
Estimar a prevalência do polimorfismo rs2066827, localizado no
éxon1 do gene CDKN1B, em portadores de retinoblastoma.
Observar se a coorte de portadores da doença e o grupo controle
estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg e se as frequências alélicas
de cada um são significativas, estatisticamente, que possa indicar
uma associação com a manifestação do retinoblastoma.
60
4. Material e Métodos
4.1 Caracterização da amostra
Nosso estudo foi realizado em uma coorte de 148 pacientes
diagnosticados com retinoblastoma, divididos em dois grupos amostrais: um
grupo retrospectivo - composto por 98 amostras de DNA de pacientes
diagnosticados com retinoblastoma pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA)
coletas entre 2011 a 2014 e 39 amostras de DNA provenientes do Hospital
Santa Marcelina (HSM) / São Paulo, totalizando 137 amostras de DNA no
grupo retrospectivo. O grupo prospectivo é composto por 11 amostras de DNA
provenientes de pacientes com retinoblastoma atendidos no serviço de
aconselhamento genético do Instituto Fernandes Figueira (IFF/ Fiocruz)
coletadas entre 2015 a 2017 (Figura 16).
A partir do grupo retrospectivo que compõe a coorte, cinco amostras de
DNA foram utilizadas para desenvolver a técnica de PCR quantitativa relativa,
avaliando o número relativo de cópias do gene RB1 e genes adjacentes a
região cromossômica 13q14.2, para a detecção de grandes deleções ou
inserções, com o objetivo de validar a técnica de MLPA realizada por Sena
(2013). A técnica de array-CGH foi também utilizada para confirmar esses
dados.
Abaixo temos o fluxograma das metodologias utilizadas no rastreio de
mutações no gene RB1 em pacientes diagnosticados com retinoblastoma
(Figura 16).
61
Figura 16: Fluxograma da metodologia utilizada para o rastreio de mutações no gene RB1.
Além do rastreio de mutações e deleções no gene RB1, realizamos a
identificação e análise do polimorfismo rs2066827 no gene CDKN1B. Setenta e
duas amostras, oriundas da coorte (72/148), foram inseridas no estudo. O
menor número amostral para a análise polimórfica deve-se ao fato de haver
algumas amostras com DNA degradado e outras sem material disponível para
pesquisa. Também utilizamos 134 amostras de DNA de indivíduos não
portadores de retinoblastoma, oriundos de um laboratório privado do Estado de
Minas Gerais, de ambos os sexos, sem histórico de câncer, considerados
grupo controle do nosso estudo para a análise comparativa do polimorfismo.
Para caracterizar o perfil clínico da coorte, dados dos pacientes foram
coletados de seus prontuários médicos, e através de informações extraídas de
questionário aplicado aos responsáveis dos pacientes do Hospital Santa
62
Marcelina/ SP. As informações coletadas foram: nome completo, data de
nascimento, sexo, idade ao diagnóstico, principais sintomas ou sinais da
doença, tempo de encaminhamento, lateralidade do tumor, histórico familiar de
retinoblastoma ou outros tumores, estadiamento, localização tumoral e
enucleação.
Este projeto foi apresentado e aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa com seres humanos e o termo de consentimento livre e esclarecido
(TCLE) foi obtido de todos os indivíduos ou de seus responsáveis legais
incluídos neste estudo (Apêndices).
4.1.1 Estimativa da concentração e integridade do DNA
Para avaliar a integridade do DNA, as amostras foram submetidas à
eletroforese em gel de agarose 0,8% diluída em tampão TAE 1x (40 mM de
Tris, 20 mM de ácido de acético, 1 mM de EDTA em pH 8.4) (Thermo Fisher®)
e corado com brometo de etídio a 0,5 ug/mL, visualizado em um
transiluminador de luz ultravioleta.
A quantidade de DNA foi estimada em espectrofotômetro NanoDrop2000
(Thermo Fisher®) nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm colocando-se 1
uL da amostra para a leitura. As amostras com alta concentração foram
diluídas com água MilliQ para a concentração de uso de 100 ng/uL.
63
4.2 Rastreamento de mutações germinativas em RB1
O método de extração de DNA do sangue total foi do tipo salting out
(Miller et al., 1988) a partir de sangue periférico dos pacientes com
retinoblastoma coletados em dois tubos a vácuo com EDTA (8 mL).
O material genético de cada paciente foi quantificado através de
NanoDrop2000 (Thermo Fisher ®), utilizando 1uL da solução.
A verificação de mutações nos 27 éxons do gene RB1 foi realizada a
partir de oligonucleotídeos (ou iniciadores), condições de PCR (Polymerase
Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase) e sequenciamento são
descritas por Barbosa et al. (2013). As sequências foram analisadas no
software Sequencher™ demoversion 4.1.4 (Gene Codes Corporation 2005 –
775 Technology Drive, Ann Arbor, Michigan, USA) e comparadas com a
sequência referência depositada no GenBank sob número de acesso
NG_009009.1.
4.3 Predições in silico de variantes no gene RB1
Para avaliar o efeito das variantes identificadas no rastreamento do gene
RB1 foram realizadas predições in silico utilizando os seguintes programas:
SIFT, PolyPhen-2 e TANGO Aggregation Tendency (Adzhubei et al., 2010; De
Baets et al., 2012).
64
4.4 Modelagem molecular de mutações na proteína
retinoblastoma
Três mutações germinativas no gene RB1 de pacientes com
retinoblastoma foram identificadas anteriormente por Carvalho (2017) (Tabela
2). Para avaliarmos os domínios alterados na estrutura da proteína
retinoblastoma (pRB) nestes probandos utilizamos dos conhecimentos em
modelagem molecular comparativa.
Para a geração dos modelos tridimensionais da pRB mutada, codificada
pelo gene RB1, foi realizada uma busca por similaridade de sequências,
usando o programa Blast (Altschul et al., 1990) contra o banco de dados
Protein Data Bank - PDB (https://www.rcsb.org/), a fim de identificar o melhor
molde para a realização de modelagem comparativa da proteína selvagem e as
mutações identificadas.
Tabela 2: Mutações selecionadas para a realização de modelagem comparativa.
Posição genômica Posição cDNA (éxon) Posição da proteína
g.59695C>T c.763c>T (éxon 8) p.R255X
g.64101C>T c.751C>T (éxon 8) p.R251X
g.82576C>G c.1574C>G (éxon 17) p.525A>G
A sequência utilizada como entrada na busca por similaridade foi obtida
do Uniprot (http://www.uniprot.org/), sob código de identificação P06400. Os
modelos foram construídos utilizando o programa Modeller - versão 9.16 (Webb
B & Sali, 2016) e o melhor modelo para cada proteína mutada foi escolhido
com base no valor da pontuação DOPE.
Os modelos de proteína gerados usando modelagem comparativa
frequentemente produzem comprimentos de ligação, ângulos de ligação,
ângulos de torção e contatos desfavoráveis. Portanto, cada modelo foi
65
otimizado no próprio Modeller para regularizar a geometria local e relaxar
contatos de ligações próximos.
Os modelos foram validados através dos programas ERRAT
(http://servicesn.mbi.ucla.edu/ERRAT/) e PROCHECK
(http://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/).
Esta etapa do trabalho foi realizada em colaboração com a Dra. Ana
Carolina Guimarães do Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática da
Instituição Oswaldo Cruz / FIOCRUZ / Rio de Janeiro.
4.5 Revisão sistemática da literatura de casos com a síndrome
da deleção 13q14 com retinoblastoma
A revisão foi realizada a partir de pesquisa em banco de dados (NCBI,
acesso em 10/02/2017) utilizando as seguintes palavras-chave: "13q14 deletion
syndrome", "RB1 gene" e "retinoblastoma", onde nós inicialmente encontramos
31 estudos publicados que atendiam aos critérios pesquisados. No entanto, 21
trabalhos foram excluídos desta revisão devido a ausência de lateralidade para
os casos de deleção, não verificação dos pontos de quebra nas deleções
parciais e também os estudos de caso relato.
Finalmente, 11 estudos satisfizeram os critérios de busca e possuíam
informações relevantes, como lateralidade, sexo e idade ao diagnóstico dos
casos investigados que poderiam contribuir para nossos questionamentos.
Aqueles que ainda não possuíam registro do sexo do paciente, mas possuía os
demais critérios, foram mantidos.
66
4.6 PCR em Tempo Real
A PCR em tempo real ou PCR quantitativa (qPCR) é assim denominada
por permitir a verificação da amplificação em tempo real. Esta amplificação é
visualizada pela presença de compostos fluorescentes, monitorada por um
detector de fluorescência, localizado no termociclador. A emissão dos
compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta na proporção direta da
quantidade de produto da PCR (Applied Biosystems®; Ponchel et al., 2003).
O CT (cycle threshold) é o número de ciclos que uma reação leva para
atingir uma determinada quantidade de fluorescência, denominada de linha de
threshold (Figura 17- A) (Applied Biosystems®). Neste estudo, a linha de
threshold foi posicionada automaticamente pelo equipamento na fase
exponencial das reações de todos os experimentos. Após 30 – 35 ciclos, a
intensidade do sinal de fluorescência geralmente começa a se estabilizar,
indicando que a PCR atingiu a saturação, representada pela fase de platô
(Figura 17- A) (Dorak, 2007).
O valor de CT depende do número de moléculas de DNA disponíveis
para amplificação, o que significa que quanto maior for o número de moléculas
inicial, menor será o número de ciclos (CT) necessários para que seja gerado
proporcionalmente um valor exponencial do sinal de fluorescência (Rn)
(superior à baseline) (Figura 17). Esse sinal de fluorescência gera as curvas de
amplificação, conhecido como fase exponencial da reação de PCR, com CT
específico (Figura 17- B).
67
Figura 17: A) Esquema representativo das fases exponencial e platô da reação de qPCR. A fase de platô corresponde a PCR convencional. O CT (cycle threshold) localiza-se na intersecção entre a curva de amplificação da reação e a linha de threshold. B) Curvas de amplificação que na fase exponencial ultrapassa a linha de threshold (traço horizontal que representa o limiar de detecção da fluorescência) e o CT, necessário para cada alvo atingir determinado nível de fluorescência (Rn). Fonte: Dados da autora, 2018.
A comparação das curvas de amplificação detectadas pelo equipamento
é utilizada na quantificação relativa do número de cópias gênicas nas amostras
de interesse. Essa comparação foi realizada através da adição de Sybr Green,
um composto que se intercala na dupla fita de DNA e emite fluorescência, e os
valores de CT foram utilizados (Ponchel et al., 2003).
Um gene com número de cópias conhecido e invariável (house keeping
gene) é utilizado como controle interno em todas as reações. Desta forma, a
diferença entre os CTs calculados para as amostras de interesse e o gene
controle gera um valor, denominado de ΔCT, necessários para atingir o mesmo
nível de fluorescência (Rn), podendo ser comparado com outras amostras de
indivíduos diferentes (Dorak, 2007).
Após obter o ∆CT da amostra alvo e também do gene controle, é
possível calcular o ∆∆CT utilizando-se a fórmula: [∆CTamostra - ∆CTcontrole]. Este
procedimento é conhecido como método ΔΔCT (Livak, 2001; Dorak, 2007).
Na fase exponencial da reação de PCR a concentração de DNA é
duplicada a cada ciclo, formando uma função exponencial de base 2, cujo CT
maior significa mais quantidade de produto amplificado em relação ao CT
menor, visto que este precisou de ciclos a mais para ser detectado. Nesse
sentido, o valor de ΔΔCT igual a 1 representa uma diferença de duas vezes o
número de cópias gênicas de um indivíduo em relação a outro (Livak, 2001;
Baseline
68
Campos Jr, 2009). Assim, a relação do número relativo de cópias de um
determinado gene em um indivíduo em comparação ao número relativo de
cópias deste mesmo gene, em outro indivíduo, pode ser calculada pela
fórmula:
*NRC = 2 (-ΔΔCT)
*número relativo de cópias.
4.6.1 Desenho dos oligonucleotídeos
Os oligonucleotídeos selecionados para o desenho e desenvolvimento
da técnica de PCR quantitativa relativa para as amostras de retinoblastoma
objetivaram detectar deleções no gene RB1 (éxons 3, 10, 20 e 24) e genes
adjacentes – SUCLA2 e MED4, todos localizados na região cromossômica
13q14. A figura 18 ilustra a localização genômica dos genes avaliados nesta
técnica. Os genes ITM2B, RCBTB2 e DLEU1 estão localizados na mesma
região cromossômica e fazem parte das análises da técnica de MLPA.
Figura 18: Desenho esquemático da localização genômica dos genes SUCLA2, MED4 e RB1, localizados no cromossomo 13, avaliados na técnica de qPCR. Fonte: Dados da autora, 2018.
69
Seis ferramentas disponíveis online foram utilizadas: o Primer3, para a
construção dos iniciadores, seguindo critérios para a obtenção correta de
oligonucleotídeos para PCR quantitativa (Dorak, 2007). A tabela abaixo mostra
os critérios utilizados (Tabela 3). As ferramentas UCSC In Silico, OligoCalc,
PCR Start e BLAST foram úteis na conferência e avaliação da especificidade
dos segmentos obtidos.
Tabela 3: Critérios para desenho dos oligonucleotídeos para PCR em tempo real.
Tamanho do oligonucleotídeo entre 18 – 24 nucleotídeos;
Amplicon com tamanho menor que 250 pb;
Fitas sense e antisense com Tm ≤ 2ºC diferente para cada uma;
Oligonucleotídeos com Tm entre 50 – 60ºC;
Oligonucleotídeo deve conter %GC em 50%, não menos que 35%, não mais que 65%;
Não deve haver grampo GC na ponta 3’ (ou seja, GG, CC, CG ou GC);
Na extremidade 3’ do oligonucleotídeo deve haver ≤ 2 GC nos últimos cinco nucleotídeos.
*Tm: temperatura de Melting
As regiões exônicas do gene RB1 foram selecionadas, em princípio,
através dos resultados obtidos pela técnica de MLPA que apontou casos de
retinoblastoma com deleções parciais (intragênica) envolvendo a região
promotora e éxons de 1 a 7, e deleções nos éxons 10 e 11, além de deleções
completas no gene. Após realizar uma revisão sistemática de literatura dos
casos de retinoblastoma com deleções parcial e/ou completa do gene RB1,
identificamos que 61% de todos os casos relatados são de deleção completa.
Desta forma, além dos éxons 3 e 10, selecionamos os éxons 20 e 24 que
aparecem citados como pontos de quebra e contemplam regiões exônicas
finais do gene RB1. O iniciador para o gene controle, referência (ALB) foi o
mesmo utilizado por Meins et al. (2005). A Tabela 4 mostra as sequências dos
oligonucleotídeos desenhadas e utilizadas neste experimento.
70
Tabela 4: Oligonucleotídeos desenhados para o ensaio de qPCR em pacientes com retinoblastoma e o gene controle ALB, obtido a partir de Meins et al. (2005).
Gene Forward (5’- 3’) Reverse (5’- 3’) Tm (°C)
SUCLA2 GCCATCTAGGCACACAAACA GCTGCGACAAAAGAAAGAAGA
52
MED4 AACTGGCAGTGGATGACTGA CCTCCAACAGAAGCCAAGAG 54
RB1E3 GCAGCAGTTGACCTAGATGAGA TTCGTTTCCTTTTATGGCAGA 59
RB1E10 TTGCATGCGAACTCAGTGTAT
CAGCACACAGAGGCACAGA 53.2
RB1E20 CACTTTGTGAACGCCTTCTG GGTCCAAATGCCTGTCTCTC 59
RB1E24 TTCGGGGTGAGTATTTTCTTTC GCCTGGATGAGGTGTTTGA 59
ALB12 AATGCTGCACAGAATCCTTGGT TCATCGACTTCCAGAGCTGAAA 53
*Tm: temperatura de Melting
4.6.2 Teste de otimização da concentração dos
oligonucleotídeos
Para o cálculo da dosagem gênica foi necessário aperfeiçoar alguns fatores,
considerando o Sybr Green como meio de detecção. Como esse composto se
intercala em dupla fita de DNA em um processo independente da sequência
gênica, a sensibilidade deste método pode ser comprometida pela formação de
dímeros de oligonucleotídeos e também pela inespecificidade da reação.
A formação de produtos inespecíficos na reação pode ser detectada
através de uma curva de dissociação (curva de Melting), que mostra a
dinâmica da dissociação do fluoróforo e das fitas de DNA através do
aquecimento gradual da amostra. Assim, os produtos da PCR perdem o sinal
da fluorescência causada pela desnaturação da dupla fita de DNA. Esta
diminuição de sinal se concentra em uma determinada temperatura única, se a
reação tiver produzido um único produto (Figura 19). Caso a desnaturação
aconteça em temperaturas variadas, gerando 2 picos ou mais, significa que
amplicons de diferentes sequências estão presentes naquele produto, gerando
uma amplificação inespecífica.
71
Figura 19: Curvas de dissociação (curvas de Melting) dos genes alvo e controle da reação de PCR em tempo real. A presença de um único pico demonstra a especificidade da reação.
Na dosagem do número de cópias dos genes RB1, SUCLA2, MED4
utilizamos oligonucleotídeos específicos para cada gene alvo (Tabela 5) e,
como controle interno, oligonucleotídeos para o gene ALB (albumina)
localizado no cromossomo 4 (Meins et al., 2005; Ottaviani et al., 2015)
detectados pelo termociclador StepOne Plus (Applied Biosystems®) e, em
alguns experimentos, pelo termociclador 7500Fast (Applied Biosystems®).
72
As concentrações ótimas dos oligonucleotídeos para o ensaio de PCR
em tempo real são as que apresentaram a melhor performance reacional, isto
é, com menor valor de CT, e com ausência de amplificação inespecífica. As
concentrações testadas foram de 50, 100, 300 e 500 ɳmolar em reações com
amostra de DNA controle, isto é, indivíduo não portador de retinoblastoma, em
placas de 96 poços com volume final de 25 uL com todas as amostras em
triplicatas. A figura abaixo (Figura 20) mostra a performance das reações para
o gene referência (ALB) com concentração ótima em 300 ɳmolar. As
concentrações ótimas dos demais genes são apresentadas na tabela 17.
Figura 20: Gráfico CT versus Concentração dos oligonucleotídeos do gene referência (ALB). Os dados demonstram a performance das reações nas diferentes concentrações (50, 100, 300 e 500 ɳmolar) e os respectivos CTs atingidos na reação . Em destaque, a concentração ótima utilizada nos ensaios para este gene.
Tabela 5: Concentrações ótimas dos genes alvo para os ensaios, obtidas do teste de concentrações de oligonucleotídeos.
Genes Concentração ótima (ɳmolar)
SUCLA2 300
MED4 100
RB1E3 300
RB1E10 100
RB1E20 300
RB1E24 300
73
4.6.3 Teste de diluição de DNA
Com o objetivo de aperfeiçoar a quantificação, verificamos a eficiência
das reações de PCR e se a mesma é influenciada pela concentração inicial de
DNA utilizado. Os pares de oligonucleotídeos foram testados em reações
contendo concentrações variadas de DNA, diluídas em 1, 2, 4, 10, 100 e 1000
vezes da amostra de DNA controle. A curva de diluição foi baseada na
comparação dos dados obtidos do gene de referência (ALB) e das amostras de
DNA com concentração desconhecida.
Os resultados analisados serão apresentados em um gráfico do log do
fator de diluição versus o CT de cada concentração.
A eficiência das reações foi realizada a partir de cada par de
oligonucleotídeos em reações contendo concentrações variadas de DNA,
diluídas em 1, 2, 4, 10, 100 e 1000 vezes da amostra de DNA controle.
A curva de diluição foi baseada na comparação dos dados obtidos do
gene de referência (ALB) e das amostras de DNA com concentração
desconhecida. Com a Figura 21 observamos um crescimento linear dos CTs
em relação ao fator Log das diluições e um paralelismo entre os dois padrões.
Estes resultados demonstram que a reação manteve a sua eficiência em
variadas concentrações de DNA.
74
Figura 21: Gráficos do teste de diluição de DNA. As diferentes diluições (1, 2, 4, 10, 100 e 1000) representadas pelo Fator Log de diluição vs o CT de cada oligonucleotídeo alvo comparado ao gene de referência ALB. Observa-se um crescimento linear dos CTs em relação ao Log das diluições. O paralelismo de ambas as retas demonstra que a reação mantém a sua eficiência em variadas concentrações de DNA.
Juntamente com o gráfico, obtivemos a equação da reta (y= ax+b) mais
o valor de R2 e calculamos a eficiência de cada reação através da fórmula:
E= 10 (-1/slope) – 1
Slope: inclinação da reta referente à curva padrão (valor de ‘a’ na equação da reta).
A eficiência (E) é a medida que corresponde à taxa de amplificação da
PCR, permitindo determinar o sucesso da técnica (Dorak, 2007).O ângulo da
reta (slope) indica a eficiência da amplificação para o teste; um valor próximo
75
de 3,32 representa uma eficiência de 100% (Dorak, 2007). Geralmente, uma
eficiência entre 90% - 110% é considerada aceitável e um R2 > 0,99 fornece
boas concentrações na correlação de dois valores (Applied Biosystems®). A
tabela abaixo apresenta as eficiências obtidas para cada gene testado (Tabela
6).
Tabela 6: Eficiências obtidas para cada gene nas reações de concentração de DNA aplicando-se a fórmula (E) a partir da equação da reta de cada reação.
Genes R2
Inclinação
(slope) Eficiências
ALB 0,998 3,31 100%
SUCLA2 0,992 3,40 96%
MED4 0,999 3,21 100%
RB1E3 0,997 3,22 100%
RB1E10 0,993 3,31 100%
RB1E20 0,994 3,40 94%
RB1E24 0,997 3,28 100%
Após estabelecer as concentrações ideais de cada oligonucleotídeo e a
curva de diluição de DNA ter sido confirmada, a validação das amostras de
retinoblastoma com deleções parcial ou completa dos genes SUCLA2, MED4 e
RB1 foram realizadas.
76
4.6.4 Ensaio de dosagem do número de cópias gênicas
Nove amostras de DNA obtido de pacientes diagnosticados com
retinoblastoma, que pertencem ao grupo retrospectivo de nossa coorte,
apresentaram deleções parciais do gene RB1 ou completa para RB1 e genes
adjacentes (SUCLA 2 e MED4), localizados no cromossomo 13, detectados
pela técnica de MLPA (Sena, 2013). No entanto, devido a falta de material
genético disponível, apenas 5 amostras foram utilizadas nesse ensaio (Tabela
7).
Tabela 7: Probandos da coorte (148) de retinoblastoma com mutação germinativa identificados com deleção parcial do gene RB1 ou completa dos genes RB1, SUCLA2 e MED4 pela técnica de MLPA (Sena, 2013).
Todas as amostras estudadas foram comparadas com o mesmo indivíduo
controle. Assim, todos os valores de ΔΔCT foram transformados em valores de
número relativo de cópias, sendo o intervalo entre 0,4 – 0,6 referente a uma
cópia gênica e o intervalo entre 0,8 – 1,0 referente a 2 cópias gênicas. Um
intervalo entre 1,2 – 1,6 representa uma aneuploidia. Em nosso estudo
utilizamos uma amostra de DNA proveniente de um paciente com trissomia do
cromossomo 21 (Síndrome de Patau) para demonstrar o ganho cromossômico,
detectado pela dosagem do número de cópias gênicas.
As reações foram feitas em triplicata utilizando o kit Sybr Green PCR
Master Mix (Thermo Fisher®). Para uma reação de volume final de 25 ul foram
adicionados 12,5 ul de Master Mix 2X, 0,25 uL [100 חmolar] e 0,75 uL [300
,molar] de oligonucleotídeos (dependendo da concentração cada gene alvo)ח
Amostras Encaminhamento
probando 1 INCA/ RJ
probando 3 HSM/ SP
probando 5 INCA/ RJ
probando 8 HSM/ SP
probando 9 HSM/ SP
77
6 uL de DNA (contendo aproximadamente 50 ng) e água MilliQ para completar
o volume final. As reações foram executadas no equipamento de PCR em
tempo real StepOne Plus ou 7500Fast (Applied Biosystems®) sendo
submetidas à ciclagem padrão do equipamento (95ºC por 10 minutos e 40
ciclos com desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento a 60°C por 1
minuto, extensão a 95°C por 15 segundos, 60°C por 1 minuto e 95°C por 15
minutos).
Os resultados serão apresentados em gráfico de barras, demonstrando
o número relativo de cópias gênicas para cada gene alvo, em cada probando.
78
4.7 Array-CGH
O array-CGH é uma técnica capaz de identificar alterações no número
de cópias. Esta técnica baseia-se numa comparação entre o genoma da
amostra do indivíduo afetado com uma amostra controle, permitindo identificar
alterações de tamanho reduzido (50 a 100 kb) que são difíceis de ser
identificados por citogenética convencional (Colombo e Rahal, 2010).
As etapas dessa técnica são ilustradas na figura abaixo (Figura 22).
Figura 22: Etapas da técnica de array-CGH. Fonte: www.hermespardini.com.br, 13/06/2018.
Os mesmos probandos avaliados no ensaio de dosagem gênica por
PCR em tempo real, com deleção heterozigótica parcial ou completa do gene
RB1, foram avaliados também pela técnica de array-CGH.
As análises para deleção em regiões heterozigóticas foi realizada por
hibridização de 200 ng de DNA genômico de portadores de retinoblastoma para
Illumina Infinium Omni2.5 Exome-8 v1.2 (2.5 M probes) BeadChip, de acordo
com recomendações do fabricante (Illumina®).
Essa etapa foi realizada em colaboração com o Dr. Julian Nevado do
INGEMM, Hospital La Paz, Universidade de Madrid, Madrid, Espanha.
79
4.8 Análise do polimorfismo rs2066827 no gene CDKN1B
Para identificar e avaliar o polimorfismo rs2066827 no gene CDKN1B,
localizado no éxon 1, utilizamos oligonucleotídeos descritos por Pasquali et al.
(2011). A figura abaixo (Figura 23) demonstra as características genômicas do
gene investigado.
Figura 23: Esquema do gene CDKN1B, localizado na região cromossômica 12p13, com seus codificadores, tamanhos e localização do polimorfismo avaliado neste estudo. Fonte: Dados da autora, 2018.
A padronização da técnica de PCR foi feita através da PCR touchdown
conforme descrito na tabela 8 segundo Khalid et al. (2015). Para cada reação
de amplificação em um volume total de 25 μL foram utilizados: 2,0 μM de cada
dNTP, 10 pmol de cada iniciador, 1,5 mM de MgCl2, 1x do tampão de PCR, 1 U
de Taq DNA polimerase Gold (Invitrogen®) e DNA genômico (100 ng).
As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1,5%,
corado com brometo de etídio, e quando devidamente amplificadas foram
purificadas com o kit Exo-SAP-IT (Thermo Fisher®) de acordo com instruções
do fabricante.
As reações de sequenciamento Sanger foram feitas utilizando-se o
BigDyeTM Terminator v1.1Sequencing Kit (Thermo Fisher®). Em cada reação
80
de 10 uL foram utilizados 100 ng de produto purificado, 1,5 μL do kit BigDye e
10 pmol dos iniciadores (senso e antisenso). A ciclagem utilizada foi de 30
ciclos compostos por desnaturação a 95ºC por 20 segundos, anelamento a
50ºC por 15 segundos e extensão a 60ºC por 1 minuto. Em seguida, foi feita a
precipitação das amostras. O sequenciamento foi realizado com o uso do
sequenciador automático 3730xl DNA Analyzer. A análise das sequências foi
feita utilizando-se o programa Sequencher™ demoversion 4.1.4 (Gene Codes
Corporation 2005 –775 Technology Drive, Ann Arbor, Michigan, USA) e
comparado com a sequência referência NC.12.12.
Tabela 8: Ciclagem para amplificação do gene CDKN1B – p27, éxon 1.
Passos Temperatura Tempo
1 95° C 12 min
2 94° C * 1 min
3
60° C (redução da temperatura
em -0,5° C a cada ciclo) * 1 min
4 72° C * 1 min
5 94° C ** 1 min
6 55° C ** 1 min
7 72° C ** 1 min
8 72° C 10 min
* Repetir os passos em 10 ciclos; ** Repetir os passos em 25 ciclos.
Os cálculos de frequências alélicas entre a coorte de pacientes com
retinoblastoma e grupo controle, bem como a observação do equilíbrio de
Hardy-Weinberg para ambos os grupos serão realizados pelo teste qui-
quadrado admitindo-se um valor de p significativo quando menor que 0,05 (p <
0,05).
81
Figura 24: Esquema representativo das técnicas utilizadas neste estudo.
82
5. Resultados
5.1 Características clínicas de pacientes com retinoblastoma
Os dados clínicos dos 148 pacientes com retinoblastoma que compõem
nossa coorte foram obtidos de prontuários médicos no momento da coleta de
sangue periférico do paciente (Tabela 9).
Nossa coorte não demonstrou associação entre sexo e desenvolvimento
do retinoblastoma. Quarenta por cento (40%) dos pacientes apresentaram a
doença bilateral, 58% unilateral e 2% da nossa coorte apresentou o
retinoblastoma trilateral. O histórico familiar da doença foi observado em
apenas 10% dos casos e o sintoma mais comumente relatado foi a leucocoria
(73%), seguida do estrabismo (12%). Outros sintomas observados em 6% da
coorte foram hiperemia, febre intermitente, secreção, dor, lacrimejamento,
pupila dilatada e perda da visão.
A média de aparecimento dos primeiros sintomas foi 17 meses, sendo
que nos casos bilaterais a média de idade para o aparecimento dos primeiros
sintomas foi de 9 meses e 22 meses para os casos unilaterais, conforme
previsto pela teoria de Knudson (1971). Oitenta e três por cento (83%) dos
pacientes que tiveram o olho afetado pelo tumor foram enucleados. A opção de
tratamento é feita de acordo com o estadiamento (Ali et al., 2018).
Neste trabalho, tumores dos grupos IV/V e D/E (sistemas de
classificação R-E e internacional) foram considerados avançados (De Potter,
2002) em 32% dos pacientes e a manifestação extraocular identificada na
coorte baseou-se no protocolo de estadiamento CCSG (Cancer Childhood
Study Group) envolvendo pacientes que se inserem nos grupos II, III e IV.
Dessa coorte, 6% dos probandos foram a óbito.
83
Tabela 9: Características clínicas da coorte de 148 pacientes com retinoblastoma.
Características N (%)
Sexo
Feminino 72 (49%)
Masculino 76 (51%)
Histórico familiar de retinoblastoma Presente 15 (10%)
Ausente 133 (90%)
Lateralidade Unilateral 86 (58%)
Bilateral 59 (40%)
Trilateral 3 (2%)
Manifestação extraocular Presente 40 (27%)
Ausente 108 (73%)
Sinais/ Sintomas Leucocoria 108 (73%)
Estrabismo 18 (12%)
Leucocoria e estrabismo 3 (2%)
Outros 9 (6%)
Não informado 13 (9%)
Média do aparecimento dos sintomas 17.0 (meses) ± 3.0
Média do tempo de encaminhamento 6.3 (meses) ± 1.7
Enucleação Sim 123 (83%)
Não 25 (17%)
Estádio tumoral Avançado 48 (32%)
Não avançado 35 (24%)
Desconhecido 65 (44%)
Status Vivo 139 (94%)
Óbito 9 (6%)
84
5.2 Rastreamento do gene RB1 em pacientes com
retinoblastoma
Dentre os 148 pacientes, 137 tiveram o rastreamento do gene RB1
realizado em trabalhos anteriores (Braggio et al., 2004; De Andrade et al.,
2006; Reis et al., 2012; Barbosa et al., 2013; Carvalho et al., 2013; Carvalho,
2017) e 11 tiveram seu status avaliado nesse estudo – grupo prospectivo. A
Tabela 10 sumariza as variantes encontradas em cada probando.
Tabela 10: Variantes encontradas nos 11 probandos que compõem o grupo prospectivo rastreados neste estudo.
Probando
Idade ao
diagnóstico
(meses)
Lateralidade Variantes identificadas
1 15 U rs2252544; rs2854351; rs198617; rs185587; rs2070752.
2 48 U rs2252544; rs2854351; rs198617; rs185587; rs2070752; rs198580; rs3020646.
3 12 B rs2252544; rs2854351; rs198617; rs185587; rs198580; rs3020646; c.1216-28C/T (IVS12).
4 19 B rs2854351; rs520342; rs198617; rs3020646; rs3092904; c.380+145T/A (IVS3); c.1216-28C/T (IVS12); c.1814+72T>A (IVS 18).
5 28 B rs2854351; rs520342; rs198617; rs198580; rs3020646; rs3092883; c.1216-28 C/T (IVS12); c.1814+72T>A (IVS 18).
6 36 U rs520342; rs198617; rs191504668; rs2070752; rs145544222; rs3020646; c.380+145 T/A (IVS3).
7 32 U c.848G>T (éxon 8); rs2252544; rs2854351; rs198617; rs549786289; rs3020646.
8 36 U rs2252544; rs2854351; rs520342; rs3092904; rs198580; rs3020646; c.1389+134 A/T (IVS14-15).
9 51 U rs3020646; rs2854351; rs198617; rs2252544; rs198580; rs520342; rs2070752.
10 36 U rs198617; rs3092883; rs191504668; rs147342515; rs198580;; rs3020646; c.1389+143C/T (IVS14-15); c.1814+72T>A (IVS 18).
11 10 B cm942038 (éxon 17); rs2854351; rs198617; rs185587; rs3020646; c.380+145 T/A (IVS3).
85
Ao todo identificamos 20 variantes no rastreamento do gene RB1. Duas
delas estão localizadas em regiões exônicas, sendo que uma é tida como não
descrita (c.848G>T) (Tabela 11). Entre as 18 variantes intrônicas, encontramos
5 novas variantes, não depositadas em bancos de dados e não observadas na
literatura científica (Tabela 12).
Tabela 11: Variantes encontradas em éxons do gene RB1 de 11 amostras de pacientes com retinoblastoma (grupo prospectivo).
dbSNP Posição
genômica
posição
cDNA
Posição
na
proteína
éxon Nº de
casos
MAF Gobal*
ClinVar Ref.
(LOVD) ExAC 1000G Ensem
- g. 48362944 c.848 G>T C283F 8 1 - - - - -
CM942038** g.48955473 c.1589 A>G K530R 17 1 - - - -
Cowell
et al.,
1994
NC_000013.11
*Acesso em 24/09/2018.
**Human Gene Mutation Database (HGMD).
86
Tabela 12: Variantes intrônicas encontradas no rastreio do gene RB1 do grupo prospectivo.
dbSNP posição
genômica posição cDNA
Íntron
(IVS)
Nº de
casos
MAF Global**
ClinVar Ref. (LOVD)
ExAC ExAC-L 1000G Ensem
rs2854351 g.48304135 c.137+86 T>C 1 9 - - T=0,009 T=0,009 - -
rs2252544 g.48304156 c.137+107 G>A 1 6 - - G=0,49 G=0,49 -
Dommering et al., 2014; Mol et al., 2015;
Oliveira et al., 2016
rs520342 g.48342759 c.380+45 C>T 3 5 T=0,24 T=0,21 T=0,20 T=0,20 Ben
Blanquet et al., 1995; Mateu et al., 1997;
Sivakumuran et al., 2005; Barbosa et al.,
2013
rs198617 g.48345222 c.500+23 T>G 4 10 T=0,04 T=0,05 T=0,09 T=0,09 Ben Mateu et al., 1997; Sivakumuran et al.,
2005; Barbosa et al., 2013
rs3092883 g.48367661 c.1049+58 G>A 10 2 - - A=0,03 A=0,03 - Sivakumuran et al., 2005; Kalsoon et al.,
2015
rs185587 g.48373333 c.1128-72 G>T 11 4 - - G=0,08 G=0,08 -
Sivakumuran et al., 2005; Varley e Mitra,
2008; Kalsoon et al., 2015
rs191504668 g. 48379754 c.1389+104 C>T 14-15 2 - - T=0,002 T= 0 - -
rs2070752 g.48379885 c.1390-168 G>C 14-15 4 - - G=0,27 G= 0,27 - Barbosa et al., 2013
87
rs147342515 g. 48380118 c.1421+34 C>T 15-16 1 - - - - - -
rs145544222 g. 48381465 c.1695+22 G>A 17 1 - - - - - -
rs198580 g.48459611 c.1961-77 G>A 19 6 - - G=0,13 G=0,13 -
Sivakumuran et al., 2005; Barbosa et al.,
2013
rs3092904 g.48477345 c.2664-10 T>A 25 2 A=0,26 A=0,22 A=0,19 A= 0,19 Ben
Sivakumuran et al., 2005; Barbosa et al.,
2013
rs3020646 g.48476876 c.2663+33 C>T 25 10 C=0,04 C=0,05 C=0,11 C=0,11 Ben Sivakumuran et al., 2005; Varley e Mitra,
2008; Barbosa et al., 2013
Variantes não descritas
- g.48342859 c.380+145 T>A 3-4 3 - - - - - -
- g.48376890 c.1216-28 C>T 12 3 - - - - - -
- g.48379784 c.1389+134 A>T 14-15 1 - - - - - -
- g.48379793 c.1389+143 C>T 14-15 1 - - - - - -
- g.48453183 c.1814+72 T>A 18 3 - - - - - -
NC_000013.11
**Acesso em 24/09/2018.
88
As variantes localizadas nos éxons 8 e 17 do gene RB1, g.48362944 e
g.48955473 (CM942038), respectivamente, podem ser observadas nos
eletroferogramas abaixo (Figuras 25 e 26).
Figura 25: Eletroferograma mostrando a posição genômica g. 48362944, em negrito, com uma heterozigose G/T no éxon 8 do gene RB1. NC_000013.11
Figura 26: Eletroferograma mostrando a posição genômica g. 48955473, em negrito, com uma heterozigose A/G no éxon 17 do gene RB1. NC_000013.11
Os eletroferogramas das variantes intrônicas encontram-se na Figura 27.
89
rs2854351 g.48304135 c.137+86T>C (IVS1): homozigose T>C
rs2252544 g.48304156 c.137+107G>A (IVS1): homozigose G>A
rs520342 g.48342759 c.380+45C>T (IVS3): heterozigose C/T
90
rs198617 g.48345222 c.500+23T>G (IVS4): homozigose T>G
rs3092883 g.48367661 c.1049+58 (IVS 10) G>A :heterozigoto G/A
rs185587 g.48373333 c.1128-72G>T (IVS11): heterozigose G/T
91
rs191504668 g.48379754 c.1389+104 C>T (IVS 14-15): heterozigose C/T
rs2070752 g.48379885 c.1389+235G>C (IVS14): homozigose G>C
rs147342515 g.48380118 c.1421+34 C>T (IVS 15-16): heterozigose C/T
92
rs145544222 g.48381465 c.1695+22 G>A: heterozigose G/A
rs198580 g.48459611 c.1961-77G>A (IVS19): homozigose G>A
rs3092904 g.48477345 c.2664-10T>A (IVS 25): homozigose T>A
93
rs3020646 g.48476876 c.2663+33 C>T (IVS25): homozigose C>T
g.48342859 c.380+145 T/A (IVS3)* NÃO DESCRITA : heterozigose T/A
g.48376890 c.1216-28 (IVS 12 )* NÃO DESCRITA : heterozigoto C/T
94
g.48379784 c.1389+134 (IVS 14-15)* NÃO DESCRITA :heterozigoto A/T
g.48379793 c.1389+143 (IVS 14-15)* NÃO DESCRITA :heterozigose C/T
g.48453183 c.1814+72 T>A (IVS 18)* NÃO DESCRITA : heterozigose T/A
Figura 27: Eletroferogramas das variantes intrônicos encontradas no rastreamento do gene RB1 no grupo prospectivo.NC_000013.11.
95
5.3 Predições in silico de variantes do gene RB1:
Diante de duas variantes exônicas identificadas no rastreio dos 11
probandos de pacientes com retinoblastoma, utilizamos ferramentas de análise
in silico para prever os possíveis efeitos das variantes na proteína (pRB)
(Tabela 13). A predição da primeira variante, tida como nova, nos mostra um
efeito deletério na proteína; o mesmo é observado na variante g.48955473
(CM942038) que confirma os achados da literatura.
As variantes não descritas de regiões intrônicas do RB1 não
apresentaram efeito nos preditores utilizados (dados não mostrados).
Tabela 13: Variantes exônicas encontradas no grupo prospectivo (N=11) de pacientes com retinoblastoma.
Preditores in silico
Posição
genômica
TANGO
Aggregation
Tendency
SIFT PolyPhen-2 Consequência
g.48362944 - Efeito deletério Efeito deletério substituição
g.48955473
Reduz a
atividade da
proteína
Efeito deletério Efeito deletério substituição
96
5.4 Modelagens moleculares de mutações na proteína RB:
Três mutações germinativas, identificadas por Carvalho (2017), foram
utilizadas para realizar modelagens moleculares comparativas, com o objetivo
de demonstrar como tais alterações modificam a estrutura dos domínios da
proteína retinoblastoma e consequentemente a sua função.
A Tabela 14 mostra as mutações germinativas encontradas por Carvalho
(2017) no gene RB1 utilizadas para a modelagem molecular comparativa.
Tabela 4: Mutações germinativas selecionadas para modelagem molecular.
Caso Lateralidade
Posição
genômica
Posição do
transcrito
(éxon)
Posição da
Proteína Referência
24 bilateral g.59695C>T c.763C>T
(éxon 8)
p.R255X Blanquet et al.,
1994
28 bilateral g.64101C>T c.751C>T
(éxon 8)
p.R251X Cowell et al., 1994
38 unilateral g.82576C>G c.1574C>G
(éxon 17)
p. A525G Richter et al., 2003
Os moldes selecionados e utilizados para a construção dos modelos por
modelagem comparativa, são resultado da busca por similaridade no banco de
97
dados do PDB, com estruturas tridimensionais depositadas sob códigos 4elj e
4ell.
O primeiro resultado (4elj) representa a cadeia A da estrutura do cristal
da pRB inativa, de Homo sapiens expressa em um sistema de Escherichia coli,
tendo 95% de identidade e 73% de cobertura com a proteína de interesse. O
segundo molde selecionado (4ell) representa a estrutura do domínio pocket da
pRB inativa de Homo sapiens, também expressa em um sistema de
Escherichia coli, com 99% de identidade e 44% de cobertura com a proteína
alvo. Ambas as estruturas foram obtidas por difração de raio-X, sendo a
resolução de cada uma 2.7 Å e 1.98 Å. O alinhamento entre as sequências da
proteína alvo (P06400) e seus respectivos moldes (4elj e 4ell) é mostrado na
figura 28.
98
Figura 28: Alinhamento múltiplo contendo a sequência alvo (P06400) e as sequências moldes (4elj e 4ell) utilizadas para a modelagem comparativa. O alinhamento foi realizado com o programa clustal ômega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) e visualizado no ESPript (http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php). Hélices são representadas por α e π, Voltas são representadas pela letra T.
99
Foram retiradas parte da região N-terminal (resíduos 1 a 52) e a região
C-terminal (resíduos 787 a 928) para as modelagens. Estas regiões foram
retiradas, pois não tiveram suas estruturas determinadas em nenhum dos
moldes escolhidos e, portanto, não poderiam ser resolvidas por modelagem
comparativa. A Figura 29 representa os domínios da pRB com os resíduos de
aminoácidos. Cada domínio esta representado por cores que serão
visualizados na modelagem dos modelos.
Figura 29: Domínios da proteína retinoblastoma. A modelagem estrutural comparativa ocorreu apenas nos domínios N-terminal e Pocket, uma vez que não foram encontrados moldes de similaridade para a proteína completa. Fonte: Adaptado de Burke et al., 2012.
Foram gerados 50 modelos por modelagem comparativa com o
programa Modeller (versão 9.16) para cada proteína mutada. O melhor modelo
para cada proteína mutada foi escolhido com base no valor da pontuação
DOPE (dados não mostrados).
Tanto os modelos gerados quanto os moldes utilizados foram avaliados
pelo ERRAT e PROCHECK (geração dos gráficos de Ramachandran plot). A
avaliação do ERRAT analisa as estatísticas de interações não relacionadas
entre diferentes tipos de átomos através de uma comparação com estatísticas
de estruturas altamente refinadas, podendo assim, diferenciar regiões
100
incorretas. Este método leva em consideração que diferentes tipos de átomos
são distribuídos não aleatoriamente em relação aos outros e erros na
construção de modelos levam a distribuições mais aleatórias dos diferentes
tipos de átomos, que podem ser distinguidos de distribuições corretas por
métodos estatísticos. Os resultados obtidos para os dois programas mostram
que os modelos gerados têm boa qualidade e são confiáveis. Estes resultados
estão resumidos na tabela 15.
Tabela 5: Resultados de avaliação dos modelos e dos moldes utilizando os programas ERRAT e PROCHECK.
MODELOS/MOLDES ERRAT
PROCHECK (Gráfico de
Ramachandran)
Aminoácidos
em regiões
favoráveis
Aminoácidos em
regiões
permitidas
4ell 100 93,0% 6,7%
4elj 100 90.9% 8,7%
Modelo c.751C>T-p.R251X 93,6 95,1% 3,3%
Modelo c.763C>T-p.R255X 83,8 95,7% 3,2%
Modelo c.1574C>G-p.A525G 79,6 91,8% 6,7%
Os dados expostos na tabela acima são verificados nos gráficos de
Ramachandran plot gerados pelo programa PROCHECK para cada modelo
abaixo.
101
Figura 30: Resultado das análises de Ramachandran plot (A) que define 4 regiões no diagrama de Ramachandran: região permitida (indicada em vermelho), região adicionalmente permitida (indicada em amarelo), região generosamente permitida (indicada em amarelo claro) e região proibida (indicada em branco) e ERRAT (B) do modelo gerado para a mutação c.751C>T – p.R251X. No eixo de erro (Error value), duas linhas são desenhadas para indicar a confiança com a qual é possível rejeitar regiões que estejam fora do valor de restrição.
A) B)
102
C) D)
Figura 31: Resultado das análises de Ramachandran plot (A) e ERRAT (B) do modelo gerado para a mutação c.763C>T - p.R255X.
103
E) F)
Figura 32: Resultado das análises de Ramachandran plot (A) e ERRAT (B) do modelo gerado para a mutação c.1574C>G – p.A525G.
Os modelos obtidos para cada mutação são expostos a seguir. O
primeiro modelo consiste em uma mutação stop códon que gera uma proteína
truncada. Em verde temos a estrutura da proteína mutada (c.751C>T –
p.R251X) e os domínios N-terminal e pocket da proteína não mutada são
representados pelas cores rosa e azul, respectivamente (Figura 33). É possível
observar que grande parte da proteína é perdida, o que está relacionado com a
perda de função, uma vez que a região do domínio pocket é perdida.
104
Figura 33: Alinhamento estrutural do modelo gerado para a mutação c.751C>T – p.R251X (verde) com a proteína selvagem (rosa - azul). Grande parte da proteína foi perdida, o que está relacionado com a perda de função, uma vez que a região do domínio pocket é perdida.
No modelo representativo da mutação c.763C>T - p.R255X (Figura 34)
também é possível observar que o stop códon prematuro leva a uma
diminuição considerável no tamanho da proteína, excluindo regiões de extrema
importância para a função da mesma.
105
Figura 34: Alinhamento estrutural do modelo gerado para a mutação c.763C>T - p.R255X (azul turquesa) com a proteína não mutada (rosa - azul). Grande parte da proteína foi perdida, o que está relacionado com a perda de função, uma vez que a região do domínio pocket é perdida.
O modelo da mutação pontual c.1574C>G - p.A525G é exposto na
Figura 35. Em destaque, os aminoácidos alterados (Alalina para Glicina). A
diferença entre eles é de um grupamento CH2, o que torna a mutação não
perceptível no modelo molecular.
106
Figura 35: Alinhamento estrutural do modelo gerado para a mutação c.1574C>G - p.A525G (cinza) com a proteína não mutada (rosa - azul). Em destaque, os aminoácidos alterados (Alanina para Glicina). A diferença entre eles é de um grupamento CH2, o que torna a mutação não perceptível no modelo molecular.
107
5.5 Revisão sistemática da literatura de casos da síndrome
13q14 com retinoblastoma
A revisão sistemática da literatura foi motivada com base em quatro
questionamentos levantados durante o desenvolvimento do estudo:
(1) Qual a proporção de casos com deleções completas e parciais do
gene RB1 ?
(2) Há maior frequência de bilateralidade em portadores de deleção do
gene RB1 quando pelo menos um dos pontos de quebra está dentro do gene?
(3) Dentre os casos com deleção completa do gene RB1 há maior
frequência de bilateralidade em portadores de deleção com tamanho maior que
1 Mb ?
(4) Há maior frequência de bilateralidade quando portadores de deleção
do RB1 também têm deleção dos genes SUCLA2 e/ou MED4 ?
A revisão dos 11 trabalhos publicados entre 2003 e 2018 que atenderam
aos critérios de busca nos bancos de dados (NCBI) nos permitiu observar
casos de deleção envolvendo o gene RB1, com deleção completa ou parcial do
gene, sexo, lateralidade e idade ao diagnóstico de cada probando. Esses
dados estão sumarizados na tabela 16.
108
Tabela 6: Trabalhos publicados com ênfase na deleção 13q14 em pacientes com retinoblastoma. O total de deleções identificadas e aquelas que correspondem à deleção completa e parcial do gene RB1 foram observados. Na tabela encontram-se também os casos referentes a este trabalho.
País
N
Total
Deleção RB1 Sexo Lateralidade do tumor Ref.
N (%) completa parcial M F U B
T
Argentina 144 8 (5%) 6 2 NI NI 4 6 -
Ottaviani
et al., 2013
Brasil 64 9 (14%) 5 4 4 5 2 7 - Este trabalho,
2018
China 85 8 (9%) 5 3 3 5 - 8 - He et al., 2014
França 192 18 (9%) 6 12 NI NI 1 17 - Houdayer et al.,
2014
Índia
50 5 (10%) 1 4 NI NI 1 4 - Singh et al.,
2016
33 4 (12%) 1 3 0 4 0 4 - Devarajan et al.,
2015
Itália 65 10 (17%) 6 4 6 4 5 4 1 Grotta et al.,
2015
Malásia 19 3 (16%) 2 1 0 3 1 2 - Khalid et al,
2015
Países
Baixos 529 12 (2%) 12 - 7 5 5 7 -
Dommering et
al., 2014
EUA
30 4 (13%) 3 1 NI NI - 4 - Li et al., 2016
358 25 (7%) 16 9 NI NI 5 20 - Richter et al.,
2003
109
Vietnã 34 6 (18%) 5 1 2 4 - 6 - Nguyen et al.,
2018
Total 1.603 112 (7%) 68 (61%) 44 (39%) 22 30 24 87 1
A partir de 1.603 casos de pacientes diagnosticados com retinoblastoma
nas referências citadas, 112 casos são de deleções envolvendo o gene RB1 e
demais genes da região 13q14, uma proporção de 7% para tais casos. Este
dado fortalece nossos achados referenciais que prevêem cerca de 5% - 10%
de casos com deleção na região 13q14 em pacientes com retinoblastoma.
Sessenta e oito (61%) correspondem a deleções completas do gene RB1 e 44
casos (39%) são de deleções parciais com os pontos de quebras definidos.
Observamos também haver mais casos do sexo feminino, mas sem diferença
estatisticamente significante para ambos os grupos (χ2= 2,83, p=0,09).
Em relação à segunda pergunta, o maior número de casos registrados é
da forma bilateral da doença para a presença de deleções completas e
parciais. O teste do qui-quadrado (χ2) apresenta valor de χ2= 15,80, p=
0,000071 apresentando diferença significativa entre as formas unilaterais e
bilaterais da doença nos casos de deleção (Tabela 17).
Tabela 7: Teste do qui-quadrado (χ2) aplicado aos casos de deleções completas e parciais de
pacientes com retinoblastoma identificados na literatura quanto à lateralidade da doença. Unilateral Bilateral Total
Deleção
completa 23 45 68
Deleção
parcial 1 43 44
Total 24 88* 112 (Total Geral)
*O caso trilateral foi inserido no grupo de bilaterais.
110
Ainda foi possível verificarmos os pontos de quebra relatados em cada
caso apresentado nos estudos. A tabela abaixo (Tabela 18) mostra os casos de
deleções parciais do gene RB1 encontrados na revisão sistemática da literatura
e seus pontos de quebra.
Tabela 8: Pontos de quebra de deleções envolvendo o gene RB1 em pacientes com retinoblastoma encontrados na literatura.
Referência Casos Sexo Lateralidade Deleção
Parcial M F U B T
Devarajan et al., 2015 1 + + E4-6
2 + + E24-25
3 + + E10-12
Grotta et al., 2015 1 + + E1
2 + + E17
3 + + E3-6
4 + + E7
He et al., 2014 1 + E13-16
2 + E7-17
3 + E7-9
Houdayer et al., 2014 1 + P-E6
2 + P-E2
3 + P-E2
4 + E2
5 + E2
6 + E3
111
7 + E8
8 + E18-27
9 + E19-20
10 + E24-27
11 + P-E17
12 + P-E17
Khalid et al., 2015 1 + + P-E3
Li et al., 2016 1 + P-E17
Nguyen et al., 2018 1 + + E4-27
Ottaviani et al., 2013 1 + E1-17
2 + E18-27
Richter et al., 2003 1 + E18-27
2 + P-E2
3 + P-E2
4 + E17
5 + E17
6 + E17
7 + P-E17
8 + E13
9 + E13
Singh et al., 2016 1 + + E8-11
2 NI + E24-27
3 + + E25
4 + + E25-27
Nosso estudo, 2018 1 + + E10-11
2 + + E18-27
112
3 + + E1-7
4 + + P-E1
Total 44 4 12 1 43 0 -
A partir da observação dos pontos de quebra identificados nesses
estudos, é possível concluir que os éxons 2, 17 e 27 são mais envolvidos em
quebras nos casos de deleções parciais do gene RB1.
Em nossa coorte, os probandos com deleção completa, variando de 12 a
15.4 Mb, além de serem bilaterais possuem deleção também dos genes
SUCLA2 e MED4. Não foi possível encontrar uma relação para os
questionamentos sobre a lateralidade e deleções maiores que 1 Mb e para os
casos envolvendo os genes SUCLA2 e MED4, uma vez que apenas Mitter et
al. (2011) e Matilainen et al. (2015) relacionaram retinoblastoma e deleções
envolvendo estes genes.
Todos os dados encontrados nas referências bibliográficas da revisão
podem ser apreciados nos Apêndices deste trabalho.
113
5.6 Dosagem do número de cópias gênicas dos genes SUCLA2,
MED4 e RB1
Dos cinco probandos com retioblastoma avaliados, foram identificados 2
pacientes com deleções intragênicas envolvendo o gene RB1, na região
cromossômica 13q14, e 3 pacientes com deleção completa envolvendo os
genes dessa mesma região cromossômica – SUCLA2, MED4 e RB1 (éxons 3,
10, 20 e 24). Os resultados da PCR em tempo real destes probandos foram
comparados com os resultados de um indivíduo não portador de retinoblastoma
(controle), com dosagem gênica referente a duas cópias dos genes avaliados
neste estudo, e também uma amostra de um indivíduo com trissomia do
cromossomo 13 – síndrome de Patau, que nos apresentou dosagem gênica
compatível a uma trissomia.
Utilizando a média dos CTs da amostra controle com o gene ALB como
referência para o cálculo do número relativo de cópias (NRC) gênicas, pelo
método ∆∆CT, observamos a presença de deleção no intervalo entre 0,4 – 0,6
e uma dosagem gênica normal entre o intervalo 0,8 – 1,0; o intervalo de 1,5 –
1,7 representa três cópias gênicas comparadas ao indivíduo referência
(controle) (Figura 36).
114
Figura 36: Resultados das dosagens gênicas nos genes SUCLA2, MED4 e RB1 (éxons 3,10, 20 e 24) em pacientes com retinoblastoma. As setas em negrito indicam a deleção do éxon10 no probando 1 e do éxon 3 no probando 3. Os demais probandos (5, 8 e 9) possuem deleção completa de todos os genes avaliados. Intervalo da deleção 0,4 – 0,6; trissomia 1,5 – 1,7.
A técnica de PCR em tempo real desenhada neste estudo pôde ser
utilizada para fortalecer os achados da técnica de MLPA e poderá ser útil no
aprimoramento da técnica para práticas rotineiras no rastreio de deleções no
gene RB1 e genes adjacentes em casos de retinoblastoma e/ou com a
síndrome 13q, já que grandes deleções contemplam 5% - 10% dos casos de
retinoblastoma.
115
5.7 Validação das deleções em genes da região cromossômica
13q14 por Array-CHG:
Os probandos com deleção completa e parcial do gene RB1 e genes
adjacentes foram também confirmados pela técnica de Array-CHG. As imagens
da figura 37 mostram a região e o tamanho da deleção de cada probando.
Figura 37: Imagens da técnica de array-CGH dos cinco probandos avaliados. A) Probando 1 possui uma deleção dos éxons 10 - 11, mostrada em detalhe, com tamanho de 1,1 kb; B) Probando 3 possui uma deleção dos éxons 1 – 7 com tamanho de 276 kb; C) Probando 5 possui uma deleção completa do gene RB1 e região cromossômica 13q, com tamanho de 15,4 Mb; D) Probando 8 possui uma deleção completa do gene RB1 e região cromossômica 13q, com tamanho de 12,0 Mb; E) Probando 9 possui deleção completa do gene RB1 e região cromossômica 13q, com tamanho de 27 Mb.
116
5.8 Genotipagem do polimorfismo rs2066827 no gene CDKN1B
As análises dos sequenciamentos do polimorfismo rs2066827
identificaram os genótipos discriminados na tabela 19.
Com o teste do qui-quadrado, verificamos que ambos os grupos
encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). O valor de χ2 = 3,83, p=
0,14 para a coorte de pacientes com retinoblastoma e χ2 = 0, p= 1 para o grupo
dos controles, sem valor significativo para p (Tabela 20).
Tabela 9: Distribuição genotípica do rs2066827 no gene CDKN1B em 72 pacientes com retinoblastoma que pertencem a coorte e 134 indivíduos sem o tumor.
Genótipos Pacientes (%) Controles (%) Total
TT 36 (50%) 53 (40%) 89
TG 22 (30%) 62 (46 %) 84
GG 14 (20%) 19 (14 %) 33
Total 72 134 206
Tabela 10: Teste do qui-quadrado (χ2) para os genótipos dos 72 pacientes com retinoblastoma
e de 134 indivíduos do grupo controle para o polimorfismo rs2066827 a fim de verificar o equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW).
Pacientes com RB – EHW
TT TG GG Total
RB 36 (50%) 22 (30%) 14 (20%) 72
EHW 30 (42%) 33 (46%) 9 (12%) 72
Total 66 (46%) 55 (38%) 23 (16%) 144
117
Controles – EHW
TT TG GG Total
Controles 53 (40%) 62 (46%) 19 (14%) 134
EHW 53 (40%) 62 (46%) 19 (14%) 134
Total 106 124 38 268
O mesmo teste foi aplicado para verificar significância estatística entre a
coorte e os controles deste trabalho (Tabela 21), obtendo-se χ2 = 4,83, p= 0,09
não havendo diferença estatística entre os grupos para o polimorfismo.
Tabela 11: Teste do qui-quadrado (χ2) aplicado aos grupos de pacientes com retinoblastoma
(72) e controles (134) deste estudo.
Pacientes com RB x Grupo controle
TT TG GG Total
Pacientes com RB
36 (50%) 22 (30%) 14 (20%) 72
Controles (2018)
53 (40%) 62 (46%) 19 (14%) 134
Total 89 84 33 206
As frequências alélicas obtidas para os grupos avaliados apresentaram
valor de χ2= 0,27, p= 0,60 com p não significativo (Tabela 22).
118
Tabela 12: Teste do qui-quadrado (χ2) para as frequências alélicas dos grupos (pacientes com
RB e controles). Frequência alélica: pacientes com RB x controles
T G Total
Pacientes com RB
94 (65%) 50 (35%) 144
Controles
(2018) 168 (63%) 100 (37%) 268
Total 262 150 412
A presença do alelo minoritário (alelo G), com valores de MAF 0,35 no
grupo de pacientes com retinoblastoma e 0,37 nos controles, não alterou a
chance de desenvolver retinoblastoma ou de conferir um efeito protetor no
modelo genético testado.
Longuini et al. (2014) investigaram o polimorfismo rs206687 e a
associação com o fenótipo em pacientes brasileiros que possuem síndrome de
Neoplasias Endócrinas Múltiplas tipo 1 (NEM1) e mutação germinativa no gene
MEN1, onde foi incluído no estudo um grupo controle com 885 indivíduos
idosos sem tumor, distribuídos em 54% de mulheres e 46% de homens, com
idade média de 65,2 anos, sendo da mesma demografia e etnia. Nós utilizamos
este mesmo grupo controle para fazer uma comparação com nosso grupo de
pacientes com retinoblastoma, e verificamos uma diferença estatisticamente
significativa para p <0,05 (χ2= 6,75 e p= 0,03) (Tabela 23).
119
Tabela 13: Teste do qui-quadrado (χ2) para o grupo de pacientes com retinoblastoma (72) e o
grupo controle (885) utilizado no estudo de Longuini et al. (2014) para o polimorfismo rs2066827.
TT TG GG Total
Pacientes com RB
36 (50%) 22 (30%) 14 (20%) 72
Controles
Longuini et al., 2014
363 (41%) 406 (46%) 116 (13%) 885
Total 399 428 130 957
As frequências alélicas avaliadas para ambos os grupos, utilizando o
mesmo teste estatístico, não demonstrou significância estatística (χ2= 0,10 e p=
0,75) (Tabela 24).
Tabela 14: Teste do qui-quadrado (χ2) para as frequências alélicas dos grupos de pacientes com retinoblastoma e controles de Longuini et al., 2014.
Frequência alélica: pacientes com RB x controles Longuini et al. (2014)
T G Total
Pacientes com RB 94 (65%) 50 (35%) 144
Controles
Longuini et al., 2014 1132 (64%) 638 (36%) 1770
Total 1226 688 1914
120
6 Discussão
6.1 Características clínicas de pacientes com retinoblastoma
As informações clínicas coletadas dos 148 pacientes com retinoblastoma
foram resumidas e estão mostradas na tabela 9. A proporção de casos com a
forma unilateral e bilateral ficou próxima à da análise estimada por Knudson
(1971), que menciona 60% para os casos de retinoblastoma unilateral e 40%
para os casos bilaterais (Knudson, 1971; Mateu et al., 1997; Frenkel et al.,
2016). Não se observou predominância de sexo entre os pacientes, nem
realizada associação com a lateralidade da doença, conforme a literatura,
também, tem sugerido nos últimos anos (Balmer et al., 2006; Selistre et al.,
2016).
Na presente pesquisa, 10% dos pacientes apresentaram histórico
familiar para retinoblastoma, enquanto os casos bilaterais totalizaram 40%.
Frequentemente, a predisposição genética ao retinoblastoma comporta-se
como uma doença autossômica dominante com alta penetrância (90%) em que
pessoas com histórico familiar positivo para esta doença tenderiam a
desenvolver o retinoblastoma bilateral ou unilateral multifocal. Contudo, em
alguns casos, o retinoblastoma hereditário pode apresentar baixa penetrância e
variável expressividade. Assim, em uma família desse tipo, por exemplo, pode
ocorrer a forma unilateral do retinoblastoma, ou seja, reduzida expressividade
da doença (Kalsoon et al., 2015).
121
Os sintomas mais frequentemente observados foram a leucocoria (73%)
e o estrabismo (12%), conforme relatado anteriormente por Pandey et al.
(2014) que apontaram a presença de leucocoria e estrabismo em 60% e 20%,
respectivamente, nos casos estudados.
A maioria dos pacientes (32%) foi diagnosticada em estádios avançados
da doença (tumores dos grupos D/E e IV/V), o que também foi observado no
estudo de Selistre et al. (2016). A pesquisa conduzida neste trabalho mostrou
alta taxa de enucleação (83%) como forma terapêutica associada ao
estadiamento da doença. A enucleação é ainda muito utilizada, em razão do
avançado estádio da doença no momento do diagnóstico (Ali et al., 2018).
Contudo, as demais formas terapêuticas vêm sendo amplamente utilizadas e
com resultados satisfatórios.
Cabe ressaltar que o sucesso na abordagem do diagnóstico de
pacientes com retinoblastoma requer enfoque multidisciplinar. Shields et al.
(2013) relatam estudos em que foram avaliados diagnósticos pautados na
histopatologia de olhos enucleados, em 355 enucleações, sendo que 19 (5%)
não mostraram evidência de retinoblastoma. Isso significa que é preciso
atenção para os sinais e sintomas que se confundem com
pseudoretinoblastoma.
Os casos hereditários de retinoblastoma são frequentemente detectados
mais precocemente e, portanto, em estádios menos avançados. Esse
prognóstico favorável é, de certo modo, facilitado pela realização de exames
periódicos. Foi observado neste trabalho que a média de encaminhamento é de
6,3 meses. Palazzi et al. (2013) evidenciam que o tempo de encaminhamento
maior que 6 meses está associado ao risco de enucleação.
Ressaltaram-se na presente pesquisa três casos diagnosticados, entre
os anos de 2011 e 2014, com a forma trilateral da doença. Os três foram a
122
óbito, entre 28 a 43 meses de encaminhamento. Selistre et al. (2016)
descreveram dois desses casos encontrados em um total de 141 pacientes
com retinoblastoma, em um período de nove anos de estudo.
Mais de 50% dos casos do retinoblastoma trilateral são diagnosticados
com imagem de ressonância magnética, sugerindo-se que o rastreamento para
essa forma da doença pode ser muito útil (Jong et al., 2015). As ocorrências
são raras, razão de se encontrar na literatura poucos trabalhos que detalham a
genética molecular desses casos, o que evidencia a importância dessa
associação.
Nesta coorte, mesmo com alta taxa no estádio avançado da doença, 6%
probandos foram a óbito. A sobrevivência dos pacientes com retinoblastoma
tem aumentado gradativamente nos últimos anos, principalmente, pela
introdução de múltiplas modalidades de tratamento (Shields et al., 2013). A
mortalidade em países em desenvolvimento chegava a 70% após o
aparecimento dos primeiros sinais (Dimaras et al., 2008; Li et al., 2016), mas
no caso brasileiro essa taxa vem sofrendo redução devido as novas
modalidades terapêuticas disponíveis. O prognóstico, porém, permanece
relativamente insipiente para pacientes com disseminação da doença e para os
casos de retinoblastoma trilateral (Jurkiewicz et al., 2010; Dimaras e Corson,
2017).
Quanto mais precoce o diagnóstico, menor a extensão da doença,
maiores os índices de cura e há redução nos efeitos adversos decorrentes da
terapêutica, seja em curto ou em longo prazo. O diagnóstico precoce é um dos
principais aliados na determinação da cura do paciente portador de
retinoblastoma.
123
6.2 Alterações no rastreamento do gene RB1
A partir do rastreamento das 11 amostras de pacientes com
retinoblastoma, que compõem o grupo prospectivo, identificamos 20 variantes.
Neste grupo não foram detectadas mutações germinativas. Dehainault et al.
(2007) sugerem que, quando mutações em RB1 não são detectadas em casos
de retinoblastoma hereditário, o cDNA deve ser investigado, uma vez que foi
identificada uma inserção intrônica a 103 pb, entre os éxons 23 e 24 do gene
RB1, a qual gerou a criação de um sítio críptico, resultando na permanência do
íntron (Dehainault et al., 2007). Essa referência suscita um dado bastante
relevante, uma vez que diversas variantes intrônicas têm sido relatadas no
gene RB1 (Lohmann et al., 1996).
Duas variantes exônicas foram observadas no rastreamento dos 11
probandos, com efeito deletério para ambas conforme sugerido pelas análises
in silico (Tabela 13).
A variante c.848 G>T não é descrita previamente. Na posição c.848 do
transcrito, no banco de dados LOVD (http://www.lovd.nl/3.0/search) estão
descritas três mutações: uma deleção germinativa (c.848_852del), e duas
deleções somáticas (c.848_861del e c.848_861+5del). Não há outras
mutações descritas nesta posição, portanto, a alteração c.848 G>T é
considerada nova.
O polimorfismo rs2854351 T>C (íntron 1) foi encontrado em 9
probandos. No banco de dados, o alelo minoritário T apresenta frequências de
100% nas populações europeias, do Leste e Sul Asiático (NCBI, 2018).
124
O SNP rs2252544 G>A (íntron 1), detectado em 6 probandos, apresenta
frequência alélica, distribuída entre os alelos G e A nas diversas populações
continentais, exceto na África, onde o alelo A aparece em menor proporção
(9%). Dommering et al. (2014) detectaram em suas pesquisas 12 casos com
essa variante (12/ 1173), nos Países Baixos, em pacientes com retinoblastoma,
sendo 7 casos em homozigose e 5 em heterozigose. Além do retinoblastoma,
essa variante também foi observada em pacientes com câncer de próstata e
em indivíduos não portadores da doença (Oliveira et al., 2016), sem
demonstrar diferenças estatisticamente significantes para as frequências
alélicas observadas no estudo.
O alelo T do polimorfismo rs520342 C/T (íntron 3) foi encontrado em 5
probandos e possui efeito benigno. Outros pesquisadores também
identificaram essa variante em retinoblastoma (Blanquet et al., 1995; Mateu et
al., 1997; Barbosa et al., 2013). No entanto, 37 indivíduos não portadores da
doença foram identificados com esse polimorfismo na Índia (Sivakumaran et
al., 2005). O SNP rs198617 T>G (íntron 4), identificado em 11 probandos,
também possui efeito benigno com alelo minoritário T. Em populações da
América, Leste e Sul Asiático, e Europa o alelo selvagem T possui as menores
frequências alélicas, sendo o alelo G predominante nas populações dessas
regiões (NCBI, 2018). Em outros estudos visando ao retinoblastoma,
encontrou-se esse polimorfismo em indivíduos acometidos e no grupo controle
(Blanquet et al., 1995; Mateu et al., 1997; Sivakumaran et al., 2005).
No polimorfismo rs3092883 G/A (íntron 10), observado em dois
probandos, o alelo minoritário A não é encontrado em populações da Ásia e
Europa, enquanto o alelo selvagem G possui alta frequência em países da
África, nas Américas, na Ásia e Europa (NCBI, 2018). Estudos de Sivakumaran
et al. (2005) apontam este SNP para um indivíduo sem retinoblastoma, na
125
África; e Barbosa et al. (2013) observaram a mesma variante em um probando
(1/ 59) de uma coorte de retinoblastoma.
O alelo T da variante rs185587 G/T foi encontrado em quatro probandos,
sendo já identificado por Kalsson et al. (2015) em um probando (1/ 70) com
retinoblastoma. Varley e Mitra (2008) detectaram o mesmo SNP em tecidos de
adenocarcinoma de cólon e normal adjacente, não demonstrando diferenças
estatisticamente significativas para a variante nos dois grupos de análise
(Varley e Mitra, 2008). Nos controles populacionais de todos os continentes,
Sivakumaran et al. (2005) encontraram oito indivíduos não portadores de
retinoblastoma com a variante (8/ 137).
O polimorfismo rs2070752 G>C (íntron 14-15) foi observado em quatro
probandos e frequência alélica de G= 0,27 (1000Genomes) demonstrando
maior frequência para o alelo alterado. O SNP rs191504668 C/T (íntron 14-15),
detectado em dois probandos, possui frequência alélica de T igual a zero nas
diversas populações (NCBI, 2018).
As variantes rs145544222 G/A (íntron 17) e rs147342515 C>T (íntron
15-16), encontradas em um probando, não tiveram as frequências alélicas
populacionais informadas (NCBI, 2018).
A variante rs198580 G>A (íntron 19), identificada em 5 probandos, foi
detectada em estudos anteriores. Sivakumaran et al. (2005) detectaram a
presença do alelo A em 14 indivíduos de diferentes regiões geográficas, em um
grupo de 137 indivíduos, não portadores de retinoblastoma, provenientes da
Europa, África, Ásia, das Américas e da Oceania, com frequência alélica de
0,95 para o alelo A (Sivakumaran et al., 2005), sendo a ocorrência descrita,
também, no estudo de Barbosa et al. (2013), em uma coorte de retinoblastoma.
126
Outro SNP, rs3092904 T>A (íntron 25), presente em dois probandos do
presente estudo, apresenta efeito benigno e também frequências maiores que
1% nas diversas populações (ClinVar; Sivakumaran et al., 2005). Kalsoon et al.
(2015) identificaram esse SNP em um probando de retinoblastoma (1/ 70).
O SNP rs3020646 C>T (íntron 25) foi identificado em 10 probandos
desta pesquisa, sendo o alelo minoritário (C) frequente em menos que 1% da
população no Leste Asiático, e classificada como variante benigna (NCBI,
2018). Barbosa et al. (2013), igualmente, identificaram essa variante em sua
coorte de retinoblastoma. Esse mesmo SNP foi detectado em 13 indivíduos
não portadores de retinoblastoma na Índia, com frequência alélica 0,05 para o
alelo C (Sivakumaran et al., 2005) enquanto Varley e Mitra (2008) o detectaram
em tecido de adenocarcinoma de cólon e no tecido normal adjacente, não
representando um marcador para o tecido neoplásico (Varley e Mitra, 2008).
A variante c.1814+72 T>A (g.48453183), localizada no íntron 18, foi
detectada em três probandos em heterozigose neste estudo. Nos bancos de
dados, observou-se que o polimorfismo rs549786289 se encontra localizado na
mesma posição que a variante foi identificada com alterações de T > G e T > C,
mas não T > A indicando uma nova descrição, o que realça os achados deste
estudo.
As variações de sequência intrônica sem descrição prévia foram
verificadas em preditores in silico com o objetivo de observar sua possível
consequência na função da proteína, sugerindo um efeito neutro ou benigno.
127
6.3 Modelagens moleculares das mutações na proteína RB
O complexo formado pRB – E2F mantém-se unido por muitas interações
fracas, do tipo interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e uma ponte
salina. O sítio ativo da proteína retinoblastoma é composto pelos domínios A e
B mais o domínio C-terminal, que formam o pocket das proteínas pertencentes
à família RB, ao qual o fator E2F pode se ligar. Especificamente, o E2F liga-se
às hélices α4, α5, α6, α8 e α9 do domínio A; e liga-se apenas à hélice α11 do
domínio B (Chemes, 2010).
Apenas 18 resíduos (409 – 426) do E2F estão envolvidos no complexo
pRB – E2F, sendo essenciais somente estes cinco: Tyr411, Leu424, Phe425,
Glu419 e Asp423. Mutações em qualquer um desses resíduos poderiam causar
o comprometimento do complexo pRB – E2F, pois estão relacionados à
associação a pRB que, consequentemente, levaria à desativação da função
reguladora da proteína retinoblastoma e permitiria a dissociação do complexo e
promoveria a progressão do ciclo celular para a fase S (Chemes, 2010).
Contudo, observa-se, pelos modelos estruturais obtidos, que duas
mutações germinativas são causadoras de stop códon e ocasionam perda de
função da pRB, pois o domínio pocket é perdido, sendo associados com a alta
penetrância do retinoblastoma (Price et al., 2014). A mutação pontual
identificada no éxon 17 promove a alteração de uma alanina para uma glicina
na posição 525. Essa mutação não gera comprometimento da função proteica,
pois os resíduos de aminoácidos alterados possuem grupamentos químicos
muito parecidos, o que acaba suavizando a mutação. Por fim, cabe ressaltar
que mutações em RB1 que proporcionam mutações stop códon levam ao
128
retinoblastoma bilateral, na maioria dos casos, conforme observado na
casuística de Carvalho (2017) (Tabela 14) (Mitter et al., 2011).
6.4 Revisão sistemática da literatura para os casos da
síndrome 13q14 com retinoblastoma
A partir da revisão sistemática da literatura para os casos de deleção
13q14, em 61% dos casos observou-se deleção completa do gene RB1 e 39%
de deleções parciais. Em função dessa grande heterogeneidade no tamanho
das deleções, desenvolveu-se uma metodologia para quantificar o número de
cópias do gene RB1. Para tanto, foram desenhados iniciadores
correspondentes aos éxons 3, 10, 20 e 24 do RB1, além de iniciadores dos
genes SUCLA2 e MED4, localizados na região 13q14. A seleção dos referidos
éxons provém dos éxons observados nos casos de deleções avaliados, com
deleções parciais e pontos de quebra identificados nos estudos da literatura
(Tabela 18). Além disso, com uma representatividade de 61% dos casos de
deleção completa para os genes da região 13q14, o desenvolvimento da
padronização da técnica de PCR em tempo real, para o número relativo de
cópias gênicas, torna-se uma ferramenta útil para identificar pacientes com
deleções, que permitiram validar os casos de deleção em pacientes com
retinoblastoma, anteriormente detectados, sendo de fácil e rápida utilização.
Os casos com deleções parciais possuem prevalência de bilateralidade
com idade ao diagnóstico em torno dos 18 meses, o que corrobora a teoria de
129
Knudson (1971), em relação à lateralidade e a manifestação dos primeiros
sinais da doença.
6.5 Dosagens gênicas dos genes SUCLA2, MED4 e RB1
Para analisar a presença de deleções envolvendo os genes SUCLA2,
MED4 e RB1, localizados na região cromossômica 13q14, estabeleceu-se um
método de PCR quantitativa relativa, com base na detecção por Sybr Green.
Esse método possibilitou identificar precisamente indivíduos não portadores de
retinoblastoma em uma amostra controle, por meio do número de cópias
observado. Aplicando este método nas 5 amostras selecionadas, identificaram-
se três probandos com deleção completa de todos os genes avaliados –RB1,
SUCLA2 e MED4, representando 5% dos pacientes (3/ 64), e dois probandos
com deleção parcial do RB1 – éxons 10 e 11 e, éxons 1 – 7, que equivalem a
3% (2/ 64).
A técnica de array-CGH confirmou as deleções observadas nos métodos
de MLPA e PCR em tempo real. Os probandos 1 e 3 possuem deleção
intragênica do gene RB1 de aproximadamente 1 kb envolvendo os éxons 10 e
11, e 276 kb entre os éxons 1 – 7; os probandos 5, 8 e 9 com deleção completa
dos genes RB1, SUCLA2 e MED4 variam de 12 – 27 Mb.
Nos probandos aqui estudados, foram identificados mais casos com a
forma bilateral do retinoblastoma. Na literatura, constatou-se a descrição de
maior prevalência para os casos de retinoblastoma bilateral em relação à forma
130
unilateral com deleção completa e parcial no gene RB1 (Ahani et al., 2013).
Mitter et al. (2011), também encontraram maior frequência de tumores
bilaterais associados a deleções em 13q14, em detrimento de tumores
unilaterais em uma coorte de 63 pacientes diagnosticados com deleção,
envolvendo a banda 13q. Esses achados não estão em conformidade com a
hipótese de Matsunaga et al. (1980) e Bunin (1989) que correlacionaram a
maior proporção de casos de retinoblastoma unilateral em portadores de
deleção 13q14, comparada a outros pacientes com retinoblastoma hereditário.
Nesse sentido, Baud et al. (1999) relatam 22 pacientes com retinoblastoma e
deleção em 13q14, dos quais 13 casos são da forma unilateral da doença.
Sendo assim, o trabalho de Mitter et al. (2011) foi esclarecedor no que se
refere à prevalência da forma bilateral da doença, quando associada a
deleções na região 13q14.
Ainda, foi possível observar que os casos de deleção possuem uma
prevalência quanto à lateralidade, em relação à localização da quebra. Nesta
revisão sistemática da literatura a que se procedeu, em pacientes com
deleções intragênicas, parciais, 43 casos (98%) desenvolveram a forma
bilateral e apenas um probando (2%) a forma unilateral; enquanto, nas
deleções completas, 44 casos (65%) são bilaterais e 23 (34%) unilaterais.
Richter et al. (2013) observaram 15 probandos com deleção completa do RB1,
sendo 11 (73%) com a forma bilateral da doença (Richter et al., 2013).
No estudo de Mitter et al. (2011), todos os pacientes com um ponto de
quebra dentro do RB1 tiveram a forma bilateral da doença e, ao comparar os
tamanhos das deleções, observou-se o retinoblastoma unilateral em deleções
maiores que 1 Mb. O tamanho da deleção pode ainda ser associado aos
diferentes fenótipos encontrados para a síndrome 13q14.
131
No presente estudo, o probando 5 apresentou deleção maior que 1 Mb,
e mostrou desenvolvimento neurológico e psicomotor normais. Em geral,
conforme descrito por Brennan et al. (2016), pacientes com deleção 13q
possuem fenótipos variáveis, exibindo um espectro de características
dismórficas e neurológicas. Pequenas deleções limitadas à banda q14 são
associadas com o desenvolvimento neurológico normal durante a infância
(Baud et al., 1999). É o que mostra Caselli et al. (2007), em um probando com
retinoblastoma multifocal no olho esquerdo, diagnosticado aos 31 meses de
vida, e características clínicas normais com uma pequena deleção (1.7 Mb).
Além deste, três outros casos são apresentados. Um probando com deleção de
200 kb e a forma unilateral da doença no olho direito, diagnosticado aos 67
meses de idade e moderado retardo mental. Dois outros probandos com
grandes deleções (19 e 36 Mb) apresentaram fenótipos variados, incluindo
dismorfia craniofacial, decaimento psicomotor, hipotonia, baixa estatura e
anomalias nas falanges com retinoblastoma bilateral, diagnosticado aos 5
meses de idade e retinoblastoma unilateral no olho direito, aos 10 meses de
vida, respectivamente (Caselli et al., 2007).
Não se sabe exatamente se genes específicos da região 13q14 afetam
características fenotípicas específicas, encontradas em pacientes com
retinoblastoma (Caselli et al., 2007; Mitter et al., 2011). Ainda, em relação ao
fenótipo mais severo encontrado em pacientes com deleções na região
cromossômica 13q, Caselli et al. (2007) observaram que a deleção distal
envolvendo a banda q32 é fenotipicamente caracterizada por retardo mental e
malformações mais severas; a deleção proximal, envolvendo a banda q14,
poderia ser associada ao desenvolvimento de retinoblastoma e retardo mental
(Caselli et al., 2007). A gravidade associada à região q32 foi hipotetizada por
132
essa região conter genes que são fundamentais para a formação de tecidos e
órgãos cerebrais (Brown et al., 1995).
Em relação ao gene adjacente MED4, estudos conduzidos em linhagens
celulares de retinoblastoma consideraram esse gene como de sobrevivência da
célula, tendo sido demonstrado in vitro que células com a dupla inativação do
gene RB1 não sobreviveram na ausência homozigótica do gene MED4. Nesse
sentido, foi proposto que a perda desse gene poderia explicar a baixa
penetrância de retinoblastoma em pacientes com grandes deleções que
incluem as regiões dos genes RB1 e MED4. Em conclusão, o gene MED4 é
considerado extremamente relevante para o desenvolvimento do
retinoblastoma (Dehainault et al., 2014). Assim, os probandos com deleção
completa de genes na região cromossômica 13q14, também, são
heterozigóticos para este gene.
O gene MED4 foi identificado como gene de sobrevivência, explicando a
baixa penetrância da doença observada em uma família onde o pai e a filha
não são afetados pelo retinoblastoma enquanto o filho é afetado com a forma
bilateral da doença, sendo que os três possuem deleção completa do RB1,
demonstrando uma baixa penetrância associada à ausência do gene MED4,
que explicaria a baixa penetrância do retinoblastoma nesta família.
Por definição, um gene de sobrevivência precisa ser expresso,
codificado, para o tumor se desenvolver. Além do gene MED4, outro gene, o
NUDT15, que não foi investigado neste trabalho, é considerado vulnerável a
baixa penetrância, quando se encontra deletado. Essa hipótese foi
demonstrada em experimentos direcionados à perda de função desses genes
mediante RNAi em linhagens celulares de retinoblastoma –Y79 e WERI. O
gene NUDT15 em linhagens Y79 não induziram apoptose nem afetaram a
133
proliferação celular, indicando que esse gene não é essencial para o
desenvolvimento do retinoblastoma. Em contraste, o gene MED4 quando
expresso em baixos níveis é capaz de induzir apoptose em ambas as linhagens
celulares, comparado à cultura celular controle, indicando que MED4 é
necessário para o amparo do crescimento de células de retinoblastoma
(Dehainault et al., 2014).
Em relação ao segundo gene adjacente, SUCLA2, este pode ser
associado a encefalomiopatia e retinoblastoma bilateral. Em um grupo de 42
pacientes com retinoblastoma e fenótipos neurológicos variados, devido a
deleções 13q, 27 pacientes tiveram deleções envolvendo o SUCLA2
(Matilainen et al., 2015). Em nosso estudo, três probandos com deleção na
região 13q14 (probandos 5, 8 e 9) também mostraram deleção completa desse
gene, identificados pelas técnicas de MLPA e PCR em tempo real. De acordo
com Matilainen et al. (2015) o gene SUCLA2 pode ser a causa das deficiências
neurológicas, em pacientes com retinoblastoma e deleção na região 13q14
(Matilainen et al., 2015).
Neste estudo, os probandos com deleção completa, variando de 12 a
15.4 Mb, além de serem bilaterais, possuem deleção também dos genes
SUCLA2 e MED4, o que não vai ao encontro do estudo de Mitter et al. (2011),
para a prevalência de casos unilaterais de retinoblastoma, quando maiores que
1 Mb e penetrância incompleta da doença nos casos de deleção do MED4.
134
6.6 Genotipagem do polimorfismo rs2066827 no gene CDKN1B
O gene CDKN1B abriga numerosos polimorfismos que, em vários
tumores, têm sido variavelmente associados à progressão da doença e ao
desfecho clínico dos pacientes (Lu et al., 2015). Especificamente, o
polimorfismo rs2066827 demonstrou ter um efeito protetor na sobrevida global
dos pacientes com câncer pancreático esporádico (Chen et al., 2009).
Pesquisas posteriores em tumores de diferentes origens produziram resultados
conflitantes, deixando sem resposta conclusiva se o polimorfismo rs2066827
está associado a um melhor ou pior prognóstico.
O SNP rs2066827, localizado no éxon1 do gene CDKN1B, promove a
substituição de uma timina para uma guanina (T>G) na posição 326 e que
corresponde a uma alteração do aminoácido valina para glicina na posição 109
(V109G), com efeito benigno (Guan et al., 2010; Landa et al., 2010; Pasquali et
al., 2011).
Ambos os grupos avaliados no estudo estavam em equilíbrio de Hardy-
Weinberg e as frequências alélicas entre eles se mantiveram constantes, não
havendo diferença significativa para p < 0,05. Assim, utilizando esses grupos
de análise, não houve evidência suficientemente forte para uma possível
associação do polimorfismo como potencializador do desenvolvimento de
retinoblastoma ou efeito protetor contra a doença. Uma justificativa poderia ser
em relação ao tamanho amostral dos casos de retinoblastoma, que poderá ser
ampliado em estudos subsequentes e reavaliado.
Por outro lado, quando extrapolamos nossa investigação para o grupo
controle de Longuini et al. (2014), observamos que o grupo encontra-se em
135
equilíbrio de Hardy-Weinberg e, ao comparar a distribuição de genótipos com
os pacientes diagnosticados com retinoblastoma, foi obtido um valor de p <
0,05 significante, com diferenças significativas no genótipo dos grupos de
portadores da doença e controles brasileiros do estudo de 2014. No entanto,
avaliando a frequência alélica de ambos os grupos, tal diferença torna-se não
significativa para p < 0,05. Nesse sentido, essa investigação não permite
associar a troca de bases T>G como condição que leva à susceptibilidade ou
efeito protetor no retinoblastoma.
Na investigação de Pasquali et al. (2011), em carcinoma medular
esporádico de tireoide, as frequências alélicas entre o tipo selvagem e o
polimórfico rs2066827 não demonstraram diferença significativa entre os
probandos e controles. A lei de Hardy-Weinberg é importante, porque permite
determinar quanto e como o equilíbrio de uma população está sendo afetado
pelos fatores evolutivos.
Neste trabalho, foram observados na coorte 50% (36/ 72) com o
genótipo TT, 30% (22/ 72) para o genótipo TG e 20% (14/ 72) para GG;
enquanto no grupo controle identificaram-se 40% (53/ 134) para o genótipo TT,
46% (62/ 134) TG e 14% (19/ 134) para o genótipo GG. Logo, a condição
heterozigótica TG foi encontrada em maior proporção no grupo controle em
relação ao grupo de indivíduos acometidos pela doença. Contudo, é válido
ressaltar que o teste estatístico não apontou significância, cabendo apenas a
observação destes dados. No entanto, Lu et al. (2015), ao realizar uma meta-
análise com 9.038 casos e 11.596 controles, envolvidos em 17 estudos,
apontam para um efeito protetor em câncer, quando presente o genótipo TG
em grupos controle de diferentes tipos de tumores.
136
O possível efeito protetor associado ao genótipo heterozigótico TG
observado na meta-análise de Lu et al. (2015) pode ser verificado em maior
casuística, como indica o presente estudo.
137
7 Conclusão
No presente estudo foi realizada a pesquisa de mutações germinativas
no gene RB1 em 11 probandos com retinoblastoma, onde foram identificadas
20 variantes, 6 delas não previamente descritas.
As ferramentas de modelagem molecular comparativa são muito úteis na
visualização de estruturas quaternárias que compõem a proteína. É o que se
observou com a pRB, mediante mutações do tipo stop códon (p.R255X,
p.R251X) que afetam o domínio pocket, responsável por interagir com o fator
de transcrição E2F, afetando o ciclo celular.
Foi desenhada uma metodologia para estimar o número de cópias
gênicas para os genes RB1, SUCLA2 e MED4 através de PCR em tempo real
e também realizamos o array-CGH para as mesmas amostras, que
conformaram os resultados prévios obtidos pela técnica de MLPA e foi possível
estimar o tamanho das deleções.
Com a revisão da literatura foi possível determinar a prevalência de
deleções do gene RB1 e sua correlação com lateralidade tumoral. A frequência
de deleções em diferentes coortes variou de 5% - 10%. Devido ao pequeno
número de estudos disponíveis para análise não foi possível determinar a
existência de possível associação entre lateralidade e tamanho da deleção,
assim como com a deleção concomitante dos genes adjacentes SUCLA2 e
MED4.
O polimorfismo rs2066827 localizado no gene CDKN1B não modificou o
fenótipo nos pacientes diagnosticados com retinoblastoma, não exercendo
138
efeito de susceptibilidade ou efeito protetor nos indivíduos acometidos pela
doença quando comparado com a amostra de controles investigada no
presente estudo. Contudo ao compararmos os indivíduos afetados com
retinoblastoma e uma amostra de controles brasileiros, descritos no trabalho de
Longuini et al. (2014) para o mesmo polimorfismo, houve uma diferença
estatisticamente significativa na distribuição dos genótipos. Porém, as
frequências alélicas foram não significativas. Além disso, essa análise nos
chamou a atenção para a maior prevalência do genótipo heterozigótico, alelos
T e G, em indivíduos controles em detrimento dos indivíduos acometidos pela
doença. Assim, alguns estudos apontam para um possível efeito protetor do
genótipo heterozigótico em indivíduos controles em diferentes tipos de
neoplasias.
139
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9 Apêndices
9.1 TCLE (Termo de Consentimento Livre e Esclarecido)
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Prezado voluntário(a) você está sendo convidado(a) a participar do trabalho de pesquisa que
tem como título:
IDENTIFICAÇÃO E VALIDAÇÃO DAS DELEÇÕES NA REGIÃO CROMOSSÔMICA 13q14 POR PCR EM TEMPO
REAL E CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DOS GENES RB1 E CDKN1B EM PACIENTES COM RETINOBLASTOMA
Nome do voluntário: ___________________________________ Idade: _____
Gênero: ( ) Masculino ( ) Feminino
O retinoblastoma é um tumor câncer ocular infantil, que tem frequência relativamente
baixa na população e seu aparecimento ocorre até os cinco anos de idade. Este tumor pode se
manifestar em um ou nos dois olhos e diferentemente de outros tipos de câncer, uma parte
significativa dos retinoblastoma é hereditária, ou seja, possui herança familiar. Alterações no
gene RB1, região localizada no DNA que é frequentemente responsável pelo desenvolvimento
do retinoblastoma, são os principais fatores genéticos que causam o retinoblastoma, mas
157
recentemente tem sido sugerido que outros genes possam estar envolvidos no
desenvolvimento do tumor, tais como MDM2, MDM4, CDKN1A, CDKN1B e NMYC. As análises
genéticas do DNA possibilita a identificação de indivíduos com maior risco para o
desenvolvimento de retinoblastoma. Desta forma, poderá ser realizado um acompanhamento
das famílias visando a detecção precoce de alterações oculares.
O paciente ou indivíduo sem a doença está sendo convidado (a) a participar, de um
estudo clínico que envolve a análise genética de parte do sangue coletado.
Para que você, ou responsável do menor, possa decidir se quer participar ou não deste
estudo, precisa conhecer seus benefícios, riscos e implicações.
OBJETIVO DO ESTUDO
Pesquisar alterações em regiões localizadas no DNA, tais como o gene RB1 ou na
região onde este gene se localiza e genes relacionados, tais como MDM2, MDM4 e NMYC,
CDKN1A, CDKN1B, em amostras de tumor e sangue de pacientes com retinoblastoma e
indivíduos não portadores da doença.
PROCEDIMENTOS DO ESTUDO
Se for autorizada a participação do paciente no estudo, será coletada uma amostra de
sangue (3 a 5 mL, ou menos, dependendo da idade do participante) utilizando material estéril e
descartável para ser analisado exclusivamente neste estudo.
RISCOS
O seu tratamento será exclusivamente o mesmo caso o paciente participe ou não deste
estudo. A coleta de sangue para a pesquisa coincidirá com a coleta do sangue para os exames
rotineiros, de forma a não ser prevista punção venosa adicional, sempre no horário e data
estabelecida pelo médico responsável pelo tratamento do paciente. Somente em raros casos,
poderá ser necessária uma nova coleta de sangue, que será avisada com antecedência e
mediante autorização e aceite do participante/responsável. A coleta de sangue, que é parte de
seu tratamento regular, pode gerar um pequeno desconforto local durante a punção ou o
surgimento de manchas roxas transitórias chamadas de equimoses devido à punção. Para
minimizar os possíveis incômodos, a coleta de sangue poderá ser substituído por amostra de
saliva, realizada com um coletor oral que causa menos desconforto ao paciente.
158
BENEFÍCIOS
Os benefícios esperados são o acompanhamento das famílias visando à detecção
precoce de alterações oculares e o aconselhamento genético destas famílias. Além disso, a
análise genética será de grande importância para a correlação com o desenvolvimento do
tumor, possibilitando, no futuro, novas estratégias de tratamento.
ACOMPANHAMENTO, ASSISTÊNCIA E RESPONSÁVEIS
Será oferecido suporte dos profissionais do grupo de aconselhamento genético a todas
as famílias dos indivíduos estudados, que terão a oportunidade de optar pelas condutas
preventivas. Quaisquer dúvidas podem ser esclarecidas com o pesquisador e médico
responsável pelo serviço de aconselhamento genético, Dr. Fernando Regla Vargas através do
telefone (21) 3865-8141.
Caso não deseje participar desta pesquisa, os exames solicitados por seu médico
agora e no futuro serão realizados normalmente.
CARÁTER CONFIDENCIAL DOS REGISTROS
Além da equipe de saúde que cuidará do paciente, os registros médicos poderão ser
consultados pelo Comitê de ética da Fundação Oswaldo Cruz e equipe de pesquisadores
envolvidos. O nome do paciente não será revelado ainda que informações de seu registro
médico sejam utilizados para propósitos educativos ou de publicação de caráter científico, que
ocorrerão independentemente dos resultados obtidos.
TRATAMENTO MÉDICO EM CASOS DE DANOS
Todo e qualquer dano decorrente do desenvolvimento deste projeto de pesquisa, e que
necessite de atendimento médico, ficará a carga da instituição. Seu tratamento e
acompanhamento médico independem de sua participação neste estudo.
CUSTOS
159
Não haverá qualquer custo ou forma de pagamento ao paciente/responsável pela sua
participação no estudo.
BASES DA PARTICIPAÇÃO
É importante que o paciente/responsável saiba que a participação do paciente neste
estudo é completamente voluntária e que você pode recusar-se a participar ou interromper sua
participação a qualquer momento sem penalidades ou perda de benefícios aos tratamentos
que o paciente tem direito. Em caso de você decidir interromper sua participação no estudo, a
equipe assistente deverá ser comunicada e a coleta de amostras para os exames relativos ao
estudo científico serão imediatamente interrompidos.
GARANTIA DE ESCLARECIMENTO
A equipe de pesquisadores envolvidos no estudo convida e incentiva aos
pacientes/responsáveis e seus familiares a fazerem perguntas a qualquer momento do estudo.
Neste caso, podem contactar o pesquisador e médico responsável pelo serviço de
aconselhamento genético, Dr. Fernando Regla Vargas no telefone (21) 3865-8141. Além disso,
todo o projeto científico é encaminhado para o Comitê de Ética em Pesquisa da Fiocruz (CEP
Fiocruz) que analisa e avalia projetos de pesquisa envolvendo seres humanos, a fim de
garantir que as pesquisas atendam aos fundamentos éticos, científicos e ao cumprimento das
Resoluções do Conselho Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP). Para informações e
dúvidas, contactar pelo telefone: (21) 3882-9000 (ramal 9011).
DECLARAÇÃO DE CONSENTIMENTO E ASSINATURA
Li as informações acima e entendi o propósito deste estudo assim como os benefícios
e riscos potenciais da participação no mesmo. Tive a oportunidade de fazer perguntas e todas
foram respondidas. Eu, por intermédio deste, dou livremente meu consentimento para
participar neste estudo.
Entendo que poderei ser submetido a exames de sangue adicionais necessários ao
meu tratamento e não receberei nenhum tipo de compensação monetária por minha
participação neste estudo.
160
Tal documento apresenta-se em duas vias de igual valor, onde uma se destinará ao
participante da pesquisa e outra ficará com o pesquisador, e declaro que recebi uma cópia
assinada deste formulário de consentimento.
______________________________________ ____/_____/_______
(Assinatura do paciente ou responsável) dia mês ano
__________________________________________________________
(Nome do paciente ou responsável em letra de forma)
________________________________________ ____/____/______
(Assinatura de testemunha, se necessário) dia mês ano
Eu, abaixo assinado, expliquei completamente os detalhes relevantes deste estudo ao
paciente ou seu responsável indicado acima para consentir pelo paciente.
__________________________________________,_____/____/____
(Assinatura da pessoa que obteve o consentimento) dia mês ano
9.2 Aprovação do comitê de ética para o desenvolvimento da
pesquisa
161
162
9.3 Genotipagem dos pacientes com retinoblastoma para o
polimorfismo rs2066827
ID LAT posição 402 V109G rs2066827 T>G
ID57 U TT HOMOZIGOSE NORMAL
ID146 /38 UMF TT HOMOZIGOTO ID153 U TT HOMOZIGOTO HSM6 B TG HETEROZIGOTO HSM7 B TG HETEROZIGOTO HSM8 U TT HOMOZIGOTO HSM9 B TG HETEROZIGOSE HSM10 U TG HETEROZIGOSE HSM11 U TT HOMOZIGOSE NORMAL
HSM17 U TG HETEROZIGOSE HSM20 B TG HETEROZIGOTO HSM21 U GG HOMOZIGOTO HSM22 U TT HOMOZIGOTO HSM23 B TT HOMOZIGOSE NORMAL
HSM24 B TT HOMOZIGOSE NORMAL
HSM25 U TG HETEROZIGOTO HSM28 B TT HOMOZIGOTO ID1 U GG HOMOZIGOTO ID4 - TT HOMOZIGOTO
ID6 U TT HOMOZIGOSE NORMAL
ID7 - TT HOMOZIGOSE NORMAL
F01 U TT HOMOZIGOTO ID125 - TT HOMOZIGOTO ID128 U TT HOMOZIGOTO ID131 B TG HETEROZIGOTO
ID134 U TG HETEROZIGOTO ID20 U TT HOMOZIGOTO ID127 B TT HOMOZIGOTO NORMAL
ID132 U TT HOMOZIGOTO G85/15 - TT HOMOZIGOTO
G44/17 U TT HOMOZIGOTO NORMAL
G22/16 ID77 B TT HOMOZIGOTO G40/17 ID71 U TG HETEROZIGOSE
G24/16 U TT HOMOZIGOTO ID129 B TG HETEROZIGOSE
ID135 U TT HOMOZIGOSE
ID188 U TG HETEROZIGOSE
163
ID187 U TG HETEROZIGOSE ID162 U GG HOMOZIGOTO ID185 U TT HOMOZIGOSE ID183 U TG HETEROZIGOSE ID181 U TT HOMOZIGOSE ID180 U TG HETEROZGOSE ID178 U TG HETEROZGOSE ID174 U GG HOMOZIGOSE/
ID167 U TG HETEROZGOSE ID154 B TT HOMOZIGOSE ID148 B GG HOMOZIGOTO ID152 B TG HETEROZIGOSE ID150 B GG HOMOZIGOTO ID149 B GG HOMOZIGOTO ID145 U TT HOMOZIGOSE ID140 U TG HETEROZIGOSE ID138 U TT HOMOZIGOSE ID137 U TG HETEROZIGOSE ID186 U TG HETEROZIGOSE ID135 U GG HOMOZIGOTO ID132 B GG HOMOZIGOTO ID121 B GG HOMOZIGOTO ID95 B TT HOMOZIGOSE ID81 U TT HOMOZIGOSE ID68 U TT HOMOZIGOSE ID151 U TT HOMOZIGOSE ID117 U GG HOMOZIGOTO ID113 U TT HOMOZIGOSE ID139 UMF GG HOMOZIGOTO ID110 B TG HETEROZIGOSE ID66 U GG HOMOZIGOTO ID*86 U TT HOMOZIGOTO ID*89 B TT HOMOZIGOTO ID*63 U GG HOMOZIGOTO ID*64 U TT HOMOZIGOSE
164
9.4 Genotipagem de grupo controle para o polimorfismo
rs2066827
ID genotipagem sexo
239 GG F
145 TT F
173 GG F
227 TT F
189 GG F
207 TG F
219 TT F
277 TT F
193 TT F
161 GG F
255 TG F
223 TT F
185 TT F
M TT M
275 TG F
105 GG F
233 GG F
201 GG F
217 TG F
237 TT F
235 TG F
251 TG F
281 TG F
291 TT F
279 TG F
187 TT F
273 TT F
209 TT F
149 TT F
253 TG F
267 TT F
263 TG F
165
171 TT F
283 TT F
289 TT F
91 TG F
125 TG F
127 TT F
129 TG F
259 TT F
257 TT F
157 GG F
205 TT F
247 GG F
181 TT F
159 TG F
241 GG F
243 TG F
175 TG F
177 GG F
155 TG F
229 TG F
167 TG F
215 TT F
285 TT F
225 TG F
265 TG F
269 TG F
197 TT F
131 TG F
271 TG F
203 TT F
151 GG F
249 TG F
191 TT F
261 TT F
179 TG F
245 TG F
123 TG F
213 TG F
166
231 GG F
195 TG F
153 TG F
221 TG F
199 TG F
106 - LHG TT F
117 – LGH TG F
118 - LGH TG M
6 – LGH TT M
25 – LGH TG F
29 – LGH GG F
34 – LGH TT F
69 – LGH TT M
70 – LGH TT F
71 – LGH TT M
72 – LGH GG M
73 – LGH TT F
75 – LGH GG F
76 – LGH TG F
77 - LGH TG M
80 – LGH TG M
81 – LGH TG F
82 – LGH TT M
83 – LGH TG M
84 – LGH TT F
89 – LGH TT M
90 – LGH TT F
91 – LGH TG F
92 – LGH TG M
133 – LGH TT F
134 – LGH TG M
135 – LGH TT M
137 – LGH TG F
156 – LGH TG F
157 – LGH TG M
162 – LGH TT M
165 – LGH TT M
166 – LGH TG M
167
9.5 Revisão de literatura dos casos de retinoblastoma com
deleção no gene RB1 e região 13q14
167 - LGH TG M
168 – LGH TG M
169 – LGH TG M
170 – LGH TG M
171 – LGH TT M
172 – LGH GG M
173 – LGH TG F
174 – LGH GG F
175 – LGH TG M
176 – LGH TT M
177 – LGH TG F
179 – LGH TT M
180 – LGH TG M
181 – LGH TT F
183 – LGH TG M
184 – LGH GG M
185 – LGH TG M
186 – LGH TG M
187 – LGH TT M
190 – LGH TT M
142 – LGH TG M
143 – LGH TT M
144 – LGH TG M
145 – LGH TT M
146 – LGH TT F
149 – LGH TG M
168
Referência Casos Sexo Idade ao
diagn.
(meses)
Lateralidade Deleção
M F U B T Comp. Parcial
Devarajan et al., 2015 1 + 33 + +
2 + 0 + E4-6
3 + 31 + E24-25
4 + 39 + E10-12
subtotal 0 4 0 4 0 1 3
Dommering et al., 2014 1 + NI + +
2 + + +
3 + + +
4 + + +
5 + + +
6 + + +
7 + + +
8 + + +
9 + + +
10 + + +
11 + + +
12 + + +
subtotal 7 5 5 7 0 12 0
Grotta et al., 2015 1 + NI + +
2 + + E1
3 + + E17
4 + + E3-6
5 + + E7
6 + + +
7 + + +
8 + + +
9 + + +
169
10 + + +
subtotal 6 4 5 4 1 6 4
He et al., 2014 1 + 1 + +
2 + 9 + +
3 + 12 + +
4 + 16 + +
5 + 8 + +
6 + 5 + E13-16
7 + 2 + E7-17
8 + 2 + E7-9
subtotal 3 5 0 8 0 5 3
Houdayer et al., 2014 1 NI NI + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 + +
6 + +
7 + P-E6
8 + P-E2
9 + P-E2
10 + E2
11 + E3
12 + E3
13 + E8
14 + E18-27
15 + E19-20
16 + E24-27
17 + P-E17
18 + P-E17
170
subtotal 1 17 0 6 12
Khalid et al., 2015 1 + + +
2 + 10 NI + P-E3
3 + 27 + +
subtotal 0 3 1 2 0 2 1
Li et al., 2016 1 NI NI + P-E17
2 + +
3 + +
4 + +
subtotal 0 4 0 3 1
Nguyen et al., 2018 1 + NI + +
2 + + +
3 + + +
4 + + +
5 + + +
6 + + E4-27
subtotal 2 4 0 6 0 5 1
Ottaviani et al., 2013 1 NI 12 + E1-17
2 18 + +
3 30 + +
4 11 + +
5 18 + E18-27
6 3 + +
7 48 + +
8 2 + +
subtotal 4 4 0 6 2
Richter et al., 2003 1 NI NI + +
2 + +
3 + +
171
4 + +
5 + +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 + +
15 + +
16 + +
17 + E18-27
18 + P-E2
19 + P-E2
20 + E17
21 + E17
22 + E17
23 + P-E17
24 + E13
25 + E13
subtotal 5 20 0 16 9
Singh et al., 2016 1 NI NI + E8-11
2 + E24-27
3 + E25
4 + E25-27
5 + +
subtotal 1 4 0 1 4
172
NI: não informado
Referência Casos Sexo Idade ao
diagn.
(meses)
Lateralidade Deleção
Parcial M F U B T
Devarajan et al., 2015 1 + 0 + E4-6
2 + 31 + E24-25
3 + 39 + E10-12
Grotta et al., 2015 1 + + E1
2 + + E17
3 + + E3-6
4 + + E7
He et al., 2014 1 5 + E13-16
2 2 + E7-17
3 2 + E7-9
Houdayer et al., 2014 1 NI + P-E6
2 + P-E2
3 + P-E2
Nosso estudo, 2018 1 + 8 + E10-11
2 + 10 + E18-27
3 + 5 + E1-7
4 + 4 + P-E1
5 + 8 + +
6 + NI + +
7 + 20 + +
8 + 12 + +
9 + 17 + +
subtotal 4 5 2 7 0 5 4
total 22 30 24 87 1 68 44
173
4 + E2
5 + E2
6 + E3
7 + E8
8 + E18-27
9 + E19-20
10 + E24-27
11 + P-E17
12 + P-E17
Khalid et al,. 201 1 + 10 + P-E3
Li et al., 2016 1 NI + P-E17
Nguyen et al., 2018 1 + NI + E4-27
Ottaviani et al., 2013 1 12 + E1-17
2 18 + E18-27
Richter et al., 2003 1 NI + E18-27
2 + P-E2
3 + P-E2
4 + E17
5 + E17
6 + E17
7 + P-E17
8 + E13
9 + E13
Singh et al., 2016 1 + + E8-11
2 NI + E24-27
3 + + E25
4 + + E25-27
Nosso estudo, 2018 1 + 8 + E10-11
2 + 10 + E18-27
174
3 + 5 + E1-7
4 + 4 + P-E1
Total 44 4 12 - 1 43 0 -
NI: não informado
Referência Casos Sexo Idade
ao
diagn.
(meses)
Lateralidade Deleção
Completa M F U B T
Devarajan et al., 2015 1 + 33 + +
Dommering et al., 2014 1 + NI + +
2 + + +
3 + + +
4 + + +
5 + + +
6 + + +
7 + + +
8 + + +
9 + + +
10 + + +
11 + + +
12 + + +
Grotta et al., .2015 1 + NI + +
2 + + +
3 + + +
4 + + +
5 + + +
6 + + +
175
He et al., 2014 1 + NI + +
2 + + +
3 + + +
4 + + +
5 + + +
Houdayer et al., 2014 1 NI NI + +
2 + +
3 + +
4 + +
5 + +
6 + +
Khalid et al., 2015 1 + NI + +
2 + + +
Li et al., 2016 1 NI NI + +
2 + +
3 + +
Nguyen et al., 2018 1 + NI + +
2 + + +
3 + + +
4 + + +
5 + + +
Ottaviani et al., .2013 1 NI 18 + +
2 30 + +
3 11 + +
4 3 + +
5 48 + +
6 2 + +
Richter et al., 2003 1 NI NI + +
2 + +
176
3 + +
4 + +
5 + +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
10 + +
11 + +
12 + +
13 + +
14 + +
15 + +
16 + +
Singh et al., 2016 1 + + +
2 + NI +
Nosso trabalho, 2018 1 + 8 + +
2 + NI + +
3 + 20 + +
4 + 12 + +
5 17 + +
Total 68 19 19 - 23 45 1 -
NI: não informado
177
9.6 Artigo publicado
