Produção de Proteínas com

Ação Terapêutica, com Foco em

Cultura de Células Animais

Ricardo Medronho

Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)

Escola de Química

Departamento de Engenharia Química

13/11/2008

Resumo da apresentação

� Uma visão global da área

� O processo de produção de biofármacos

� Os desafios de Engenharia Bioquímica

� Linhas de pesquisa em desenvolvimento no Laboratório de Engenharia de Cultivos Celulares-LECC e no Laboratório de Fluidodinâmica Computacional-Lab CFD, ambos da UFRJ

� Principais temas em estudo

� Exemplos de resultados obtidos

Produtos derivados do cultivo de células animais

Sistemas com células animais in vivo

Sistemas com células animais in vitro

Células animais - HistóricoAno Evento

1949 Crescimento de vírus em cultivo de células (Enders e col.)

1954 Vacina inativada Salk contra a poliomielite (cél. rim de macaco)

1955 Vacina atenuada Sabin contra a poliomielite (cél. rim de macaco)

1963 Vacina contra o sarampo (células de embrião de galinha)

1964-69 Vacinas contra raiva, caxumba e rubéola (cél. WI-38)

1975 Produção de anticorpos monoclonais (Köhler e Milstein)1975 Produção de anticorpos monoclonais (Köhler e Milstein)

1979 Primeira linhagem de célula recombinante

1980 Ampliação para escala de produção de 8.000 L (vac. febre aftosa)

1981 Primeiro kit diagnóstico com anticorpo monoclonal

1982 1° fármaco oriundo da tecnologia do rDNA (insulina; microrganismo)

1986 1° biofármaco produzido em células animais (CHO): t-PA recombin.

1986 1° AM de uso terapêutico: OKT3 (rej. a transplante; produz. camund.)

> 1990 Testes clínicos e aprovação de diversos produtos oriundos da tecnologia do DNA recombinante e tecnologia de hibridomas

> 2000 Intensificação de estudos com células-tronco visando a terapias celulares

Por que células de mamíferos?

� Microrganismos

� Ausência de maquinaria metabólica capaz de realizar as complexas modificações pós-tradução

� Bactéria: incapazes de realizar a glicosilação

� Leveduras: padrão diferente de glicosilação

� Normalmente não são capazes de secretar a proteína de interesse

� Corpos de inclusão

� Processos de purificação mais complexos

� Usados para proteínas relativamente simples (por ex. insulina e hormônio do crescimento)

Por que células de mamíferos?

� Células animais (especialmente de mamíferos)

� Modificações pós-tradução adequadas

� Secretam as proteínas recombinantes para o meio de cultivo

� Linhagens celulares mais empregadas:

� Células de ovário de hamster chinês (CHO.K1, CHO dhfr -)

� Células de rim de bebê de hamster (BHK-21)

� Células de hibridoma (mieloma + limfócitos-T)

� Células de mieloma de camundongo (NS0, Sp2/0)

� Proteínas terapêuticas são, em geral, proteínas complexas e com várias modificações pós-tradução

� Atividade biológica

� Estabilidade

� Imunogenicidade

� Por isso � células de mamíferos

Por que células de mamíferos?

� Por isso � células de mamíferos

Anticorpo C225C6466 H9982 N1726 O2024 S40

(fórmula da sequência de aminoácidos)

(MM = 146000)

Alguns exemplos deprodutos comerciais

Produto Indicação Célula Aprov.

Avonex (β-interferon) esclerose múltipla CHO 1996

Benefix (fator IX) hemofilia B CHO 1997

Epogen (EPO) anemia CHO 1989

Activase/Alteplase (t-PA) infarto CHO 1986

Humulin (insulina) diabetes E. coli 1982

Herceptin/Trastuzumab (MAb) câncer de seio CHO 1998

Refacto (fator VIII) hemofilia A CHO 2000

ProstaScint (MAb, diagn. in vivo) câncer de próstata hibridoma 1996

Simulect/Basiliximab (MAb) rejeição de órgãos Sp2/0 1998

Campath (MAb) leucemia CHO 2001

Avastin/Bevacizumab (MAb) câncer coloretal CHO 2004

Xolair/Omalizumab (MAb) asma CHO 2003

Soliris/Eculizumab (MAb) hemoglobinuria (PNH) NS0 2007

O processo de produção

Desenvolvimento daDesenvolvimento dalinhagem celularlinhagem celular

Cultivo celularCultivo celularem biorreatoresem biorreatores

Downstream processingDownstream processing(separação das células, (separação das células, purificação do produto)purificação do produto)

FormulaçãoFormulação

Os desafios de Engenharia Bioquímica…

Desenvolvimento de linhagens alta-mente produtoras

Estabelecimento de processos de cultivode alta produtividade

Desenvolvimento de processos de purifica-çãodealto rendimento

�������� pg cel-1 dia-1

Desenvolvimento de linhagens alta-

mente produtoras

Os desafios de Engenharia Bioquímica…

Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade

Desenvolvimento de processos de purifica-çãodealto rendimento

Os desafios de Engenharia Bioquímica…

Desenvolvimento de linhagens alta-

mente produtoras

Estabelecimento de Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade

Desenvolvimento de processos de

purificaçãodealtorendimento

Biorreatores

�� CélulasCélulas aderentesaderentes

Biorreatores

�� Células adaptadas a crescimento em suspensãoCélulas adaptadas a crescimento em suspensão

Modos de operação

O objetivo final: um proces-so economicamente viável

Trabalhos de pesquisa em andamento Trabalhos de pesquisa em andamento no Lab CFD e no LECC

Principais linhas de pesquisa do LECC e Lab CFD da UFRJ

�Clonagem e expressão de proteínas� Clonagem e expressão: proteínas terapêuticas, enzimas envolvidas no processamento pós-tradução, proteínas anti-apoptóticas

� Construção de um sistema de vetores para integração sítio-dirigida, para acelerar a geração de linhagens recombinantes

�Desenvolvimento de processos de cultivo celularDesenvolvimento de um meio livre de soro para células CHO� Desenvolvimento de um meio livre de soro para células CHO

� Desenvolvimento de equipamentos para retenção de células em processos em perfusão (hidrociclone, filtro de disco rotativo, módulo de fibras ocas)

� Estudo da produção de vírus em células Vero� Cultivo de células-tronco embrionárias murinas e humanas em sistemas agitados utilizando microcarregadores

�Desenvolvimento de processos de purificação dos produtos� Uso de cromatografia com membranas e processos integrados