Proteínas e Sistemas de expressão I

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Estágios no processo produtivo

Aula 2 - Profa Dra Ilana L. B. C. CamargoCiências Físicas e Biomoleculares

IFSC - USP

1- Os três estágios do bioprocesso

2- Biorreatores

3- Upstream

3.1– Escolha do Biocatalisador

3.2 – Obtenção do Biocatalisador

3.3 – Conservação do Biocatalisador

Estágios no processo produtivo

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1. Os três Estágios do bioprocesso

Biotecnologia do bioprocesso tem três estágios:

Processo “Upstream”

Biorreatores e biorreação

Processo “Downstream”

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Upstream

Biorreação/Biorreator

Downstream

Bioprocesso – aplicação industrial de reações ou vias biológicas

mediadas por células vivas inteiras de animais, plantas,

microrganismos ou enzimas sobre condições controladas para a

biotransformação de matérias primas em produtos

Bioprocesso também pode ocorrer sem resultar em um

produto direto – biorremediação, desintoxicação de resíduos

ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados

Produto – alimento, medicamento ou composto industrial

Escala laboratorial Escala industrial

Estágios do processo produtivo

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2. Biorreatores

Biorreator ou fermentador

Biorreatores, reatores

bioquímicos, reatores biológicos

são os reatores químicos nos

quais ocorrem uma série de

reações químicas catalisadas por

biocatalisadores

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Biorreator de 90L

Biorreator de bancada

http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930

Biorreator ou fermentador

http://en.wikipedia.org/wiki/Bioreactor

3- Processo Upstream

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c7/Pg166_bioreactor.jpg

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• Escolha do biocatalisador

• Preparo da matéria prima ou substrato a ser processado

• Preparação de meio e sua esterilização

• Alimentação do biorreator

• Regulação de temperatura, pH e pressão

• Inoculação da cultura no meio assepticamente

Biorreação

Características gerais desejáveis de microrganismos para aplicação industrial:

1. Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato

em produto;

2. Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter

elevada concentração do produto no caldo fermentado;

3. Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;

4. Apresentar constância quanto ao comportamento

fisiológico;

5. Não ser patogênico

6. Não exigir condições de processo muito complexas;

7. Não exigir meios de cultura dispendiosos;

8. Permitir a rápida liberação do produto para o meio.


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1 - Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em

produto;

Matérias-primas incidem pesadamente no custo do produto final

(38 a 73% do custo total de produção)

C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2

1 g glicose 0,511g de etanol

S. cerevisiae rendimento de 90% da reação de fermentação anaeróbia

Destilação - perda

Quando o produto é produzido em menor quantidade em relação ao açúcar

consumido (enzimas ou antibiótico) o custo com a recuperação dos

produtos são mais onerosas


2 - Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se terelevada concentração do produto no caldo fermentado;

Sem sofrer inibição mais acentuada em virtude deste acúmulo

3 -Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;

Sem produzir proteases extracelulares

Linhagens que crescem relativamente menos, ou que acumulemmenos compostos intermediários incrementam a síntese doproduto


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3 -Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;

Exemplo:

Aspergillus produz glicoamilase

glicoamilaseAmido Glicose

Várias aplicações (xaropes de glicose na indústria de alimentos)

Alguns microrganismos também sintetizam transglicosidase que polimeriza a glicose novamente, porém de uma forma que

não são mais hidrolisadas pela glicoamilase


Característica importante: Estabilidade fisiológica da linhagem

Não basta uma linhagem hiperprodutora de uma substância,

mas que se conheça as técnicas mais adequadas para sua

conservação e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente

produtora da substância de interesse ao longo de todas as

etapas envolvidas desde sua proliferação no laboratório,

germinadores e biorreator principal


4. Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico

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Para a célula há sempre a tendência de otimizar o crescimento,

em detrimento da síntese do produto, motivo pelo qual não

basta verificar se a célula cresce, mas se ela continua a

acumular o produto de maneira eficaz!!

Durante a proliferação da célula há sempre chances de

mutações naturais!!

Massa pequena de células no inóculo

Biorreatores de dezenas de milhares de litros10g de matéria seca de células/ L


5. Não ser patogênico!!

Sem riscos ambientais, particularmente nas etapas

seguintes ao término da fermentação (downstream)

Se manuseasse microrganismos patogênicos em reatores de

dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de ser bastante

aumentados, o que incidiria em custos adicionais

São utilizados patógenos para produção de vacinas em reatores de

pequeno porte (poucos milhares de litros), porém confinados em

câmaras assépticas, tomando-se precauções necessárias para a não

contaminação do meio ambiente


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Técnicos do Instituto Butantan trabalham na área de fermentação da linha de produção de vacinas

http://planetasustentavel.abril.com.br/album/albumFotos_301191.shtml?foto=3

http://www.leptospirosenobrasil.com.br/index.php

Fort Dodge (Pfizer)

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6. Não exigir condições de processo muito complexas

pH e Temperatura: em reatores de grande porte não há controle

preciso, por isso o ideal é que o microrganismo tenha uma faixa

de valores ótimos dessas grandezas e não valores pontuais,

particularmente no que se refere ao acúmulo do produto


Heterogeneidade ao longo da altura do reator

Reatores de grandes portes (dezenas de milhares de L)

Importante: células devem manter seu

desempenho dentro de uma faixa de

valores ótimos!!

pH e oxigênio

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Biotecnologia do bioprocesso


Tensão de oxigênio: os microrganismos que conseguem manter

um bom desempenho quando cultivados em baixas concentrações

de oxigênio são muito interessantes

Há maior gasto de energia para

a agitação e aeração do meio!



Tensão de oxigênio:


Microrganismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por

exemplo) são evitados, pois a concentração de oxigênio no meio de

cultivo terá de ser mais elevada, a fim de que as células mais internas

destes aglomerados tenham acesso a este oxigênio, quando

comparadas às células que crescem isoladamente

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Não é conveniente trabalhar com linhagens que excretam uma

quantidade exagerada de proteínas para o meio

Geração de espuma.

Isso torna complexo os processos aeróbios

devido à necessidade de aerar e agitar o

conteúdo do biorreator




7. Não exigir meio de cultura dispendioso

1. Ser o mais barato possível;

2. Atender às necessidades nutricionais do microrganismo;

3. Auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser

ligeiramente tamponado, o que evita variações drásticas do

pH, ou evitar uma excessiva formação de espuma;

4. Não provocar problemas na recuperação do produto;

5. Os componentes devem permitir algum tempo de

armazenagem, a fim de estarem disponíveis o tempo todo;

6. Ter composição razoavelmente fixa;

7. Não causar dificuldades no tratamento final do efluente.


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Meios sintéticos ou definidos podem ser onerosos, mas tem composição

conhecida e podem ser reproduzidos a qualquer instante.

Para células que apresentam bom desempenho em meios desse tipo,

espera-se a ocorrência de um sistema produtivo muito estável, além de

não apresentarem problemas quanto à recuperação e purificação do

produto final.

Meios definidos ou sintéticos podem ser preferidos se permitirem uma

maior economia nas etapas de recuperação do produto




Algumas linhagens precisam de fatores de crescimento como aminoácidos ou vitaminas (biotina, timina, riboflavina etc)

Adiciona-se as substâncias puras para manter o meio em sua forma mais definida – No entanto... Isso pode se tornar inviável

financeiramente quando as instalações são de grande porte.

Alternativa: adicionar materiais complexos como extrato de levedura (autolisado de levedura), extrato de carne, extrato de malte, peptona (hidrolisado de proteínas) etc

Problema: substâncias caras, composição variável (ao longo do tempo de armazenagem e na dependência do fabricante e do lote empregado) – oscilação no processo fermentativo!!!


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Meios mais complexos e menos caros empregados na maioria dos processos fermentativos em grande escala:

Matérias-primas naturais: caldo de cana-de-açúcar, melaços, farinhas diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), água de maceração de

milho (Corn Steep Liquor) etc

•Composição química desconhecida

•Pode-se conhecer os teores de açucares disponíveis, nitrogênio, fósforo,

mas não se conhecem os teores dos sais minerais

•Sempre são completados com alguns sais (contento nitrogênio e fósforo)

Variação conforme: solo, variedade do vegetal, safra, clima, processamento durante colheita e estocagem etc – oscilações no processo fermentativo!!




Empresas que produzem antibióticos ou enzimas e que utilizam essas

matérias primas naturais, principalmente a água de maceração de milho,

devem manter uma planta piloto para o ajuste da composição do meio a

cada novo lote de matéria-prima recebida para evitar surpresas nos

biorreatores de grande porte

Por serem as mais baratas são as mais utilizadas

Porém podem causar problemas adicionais na recuperação e purificação

do produto final, bem como problemas nos tratamentos das águas

residuárias


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8. Permitir a rápida liberação do produto para o meio

•Se o produto é liberado no meio, ele poderá ser recuperado nas

etapas seguintes de uma forma mais simples, sem a necessidade de

lise celular e outras reações que elevam o custo

•Se algum produto permanecer dentro das células ele poderá ser

perdido após a separação das células do meio após a fermentação

•Pode haver uma eventual inibição do próprio microrganismo pela

retenção de um dado produto do metabolismo

•Retenção de certos produtos nas células depende entre outros

fatores de: linhagem empregada, da composição do meio de cultura e

das condições impostas (pH, temperatura, etc)


3.2. Obtenção de Biocatalisadores


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3.2. Obtenção de Biocatalisadores

Biocatalisadores que possam ter interesse industrial podem ser

obtidos basicamente das seguintes formas:

• Isolamento a partir de recursos naturais

• Compra em coleções de culturas (ATCC, NCTC...)

• Manipulações genéticas:

1. Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais

2. Fusão de protoplastos

3. Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de

engenharia genética


Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais

•Solo•Água•Plantas

Atividade de grande importância para obtenção de novas

linhagens de interesse industrial como linhagens melhor

produtoras de um dado produto. Além disso, pode conduzir

à descoberta de novos produtos, o que confere a esta

prática uma relevância inequestionável

Muito trabalho experimentalCusto relativamente elevado



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Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais

Santuário do Caraça

Compra em coleções de culturas

Agricultural Research Service Culture Collection - (EUA)

American Type Culture Collection (ATCC) - (EUA)http://www.atcc.org/

Coleção de Culturas Tropical – (Campinas-SP)http://www.cct.org.br

National Collection of Type Cultures (NCTC) - (Reino Unido)http://www.hpacultures.org.uk/aboutus/nctc.jsp

German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Alemanha)

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde - INCQSLab. de Microrganismos de Referência - Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ

•Disponíveis em vários países •Compra bastante viável•Facilidade através dos recursos da Internet

Microrganismos produtores de antibióticos, em geral, não estão disponíveis em uma coleção de culturas

Oriundos de programas de melhoramento genético

http://www.atcc.org/

http://www.cct.org.br/

http://www.hpacultures.org.uk/aboutus/nctc.jsp

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Manipulações genéticas

1. Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais

2. Fusão de protoplastos

3. Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de

engenharia genética



Obtenção de mutantes induzidos por

métodos convencionais

Proliferação celular mutação natural

Isolados

Potencialidade de produção

- Mutantes naturais – muito tempo

- Métodos que forçam a mutação: radiações ultra-violeta, substâncias químicas (nitrosoguanidina)

Destrói-se a maioria das células e recuperam-se as mutadas

Verifica-se se a mutação ocorreu na direção desejada

Mutação – deleção ou adição de uma ou mais partes químicas

da molécula do DNA

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Penicillium chrysogenum NRRL 1951Modificada por mutações

Produção de penicilina aumentou de 120 UI para 2658 UI (~20x)

Mutação pode levar à perda da função de

características indesejadas ou aumento da

produção por perda das funções de controle

Raramente leva ao aparecimento de novas

funções ou propriedades

Utilizar em microrganismo com a

característica desejada para melhoramento

Fusão de protoplastos ProtoplastosFrágeis – sem parede celularSem capacidade reprodutiva

Sem parede celular, a probabilidade de fusão celular entre diferentes

espécies aumenta

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Protoplasto

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Protoplast_fusion.jpg

Protoplastos de células das folhas de petúnias

Protoplasto de fusão da célula da folha com a da pétala

Digestão da parede celular

Meio isotônico

Fusão de protoplastos

Muito utilizados com leveduras, fungos filamentosos e plantas

1. Protoplastos são preparados cultivando as células em meios

isotônicos enquanto tratam-nas com enzimas;

2. Os protoplastos são regenerados usando estabilizadores osmóticos

como a sacarose;

3. Se a fusão ocorre para formar híbridos, os recombinantes desejados

são identificados através de meios seletivos;

4. Após a regeneração da parede celular, o microrganismo pode ser

utilizado para futuros estudos.

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Protoplasts_Petunia_sp.jpg

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Protoplast_fusion.jpg

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ae/Plant_cell_structure_svg.svg

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- Fusão pode ser realçada usando polietileno glicol e

tratamento das preparações com irradiação ultravioleta

- Fusão de células humanas ou de animais

-Usado para o melhoramento da produção de antibióticos por

combinar mutações de diferentes linhagens ou até mesmo

espécies

-Facilita a transferência de DNA recombinante

-Método de associar grupos inteiros de genes entre diferentes

linhagens de macro- e microrganismos


Fusão de células de mamíferos que levam à produção deanticorpos monoclonais.

Anticorpos são a principal defesa dos mamíferos. Uma célula de linfócito B produz um único tipo de anticorpo

A produção de linfócitos B em meios de cultura não teve sucesso pois eles ou morriam ou paravam de produzir anticorpos

1975 – Georges Köhler e Cesar Milsteindemonstraram a produção de anticorpos monoclonais de um hibridoma (produto de fusão) de Linfócitos B (células produtoras de anticorpos) e

células tumorais de mieloma

1984 – Prêmio Nobel

1990’s – o valor comercial de terapias por anticorpos sozinha valia US$ 6 bilhões!!!


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Mudança:

Células secretoras de anticorpos

com tempo de vida limitado

Células com capacidade contínua de crescimento (imortais) que mantém o

potencial de secretar anticorpos


Hibridomas podem ser congelados e re-utilizados mais tarde

Aplicações do anticorpo monoclonal:

-Diagnóstico in vitro em saúde humana, plantas e agricultura

animal

-Futuro: terapia com anticorpos para carregar uma droga

citotóxica para o sítio de células cancerígenas

-Biotecnologia industrial: usados como ligantes de alta

afinidade para ligar e purificar produtos caros


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Obtenção de microrganismos recombinantes por

técnicas de engenharia genética

Linhagens instáveis limitam o emprego de sistemas de

fermentação mais eficientes, como processos contínuos, pois

poderá acontecer, ao longo do tempo, a seleção de células que

privilegiem o crescimento em detrimento do acúmulo do produto

•Linhagens naturais•Linhagens mutantes

Células recombinantes por introdução de plasmídeos podem ser instáveis

Obtenção de microrganismos recombinantes por

técnicas de engenharia genética

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3.3 - Conservação do Biocatalisador

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Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no bioprocesso, ela deve ser conservada

Técnicas de conservação:

1) Transferência ou sub-cultura periódica em tubos ou placas

de Petri com meio de cultura sólido (viabilidade: semanas)

2) Congelamento em freezers -20 ˚C ou -70 ˚C (anos)

3) Ultracongelamento: -196˚C, N líquido (anos)

4) Liofilização: desidratação por sublimação da água,

sob vácuo (anos ou décadas)

Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no bioprocesso, elas devem ser conservadas

Walsh G., Pharmaceutical Biotechnology, Willey ed., 2007

... 100

... 100

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Criotubos

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Lento

Rápido

Desequilíbrio osmótico

Fromação de cristais

intracelulares lise

Congelamento

Bactérias

Células de mamíferos

Manual de Criopreservação Nunc

Congelamento rápido minimiza os efeitos de concentração do soluto pois o gelo forma

uniformemente

Congelamento lento, por outro lado, resulta em grandes perdas de água da célula e

menos gelo intraceclular, mas aumenta os efeitos da solução

Congelamento

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Agente de criopreservação

agente químico que protege as células durante o

congelamento. Pode minimizar os efeitos prejudiciais do

aumento da concentração do soluto e formação de cristal

Congelamento

Mais comuns:Dimetilsulfóxido (DMSO) e glicerol (menos tóxico que DMSO).

Escolha – depende da célula!!

Agentes de criopreservação podem penetrar na célula e causar um congelamento lento intracelular e diminuir os efeitos de solução. DMSO - Diminui a temperatura de congelamento e permite melhor desitradação da célula antes do congelamento intracelular.

DMSO penetra melhor nas células e geralmente mais usado para células maiores, mais complexas como os protistas.

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4 - Produção de etanol

Upstream

Biorreação/Biorreator

Downstream

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Exemplo prático: Produção de etanol

Upstream

Downstream

Obtenção da matéria prima;

Tratamento/preparo

Escolha do microrganismo

Preparo do pré-inóculo e inóculo

Resíduos dos grãos


Smith J E, Biotechnology, ed. Cambridge, 2004

BiorreaçãoBiorreatores

Pré-inóculo

Inóculo

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Próximas aulas!!

- Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas deengenharia genética

- Biorreatores

- Biorreação

-Processo Downstream

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Referências para a próxima aula

• Competent Cells guide

• Gerhard Hannig and Savvas C. Makrides. Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. TIBTECH FEBRUARY 1998 (VOL 16)

• Sahdev S, Khattar SK, Saini KS. 2008. Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of existing biotecnology strategies.Mol Cell Biochem. 307:249-264.

Referências desta aula

Manual de criopreservação Nunc – ver site da disciplina

Capítulo 3 - Genetics and biotecnology (John Smith Biotechnology)

– ver site da disciplina

Prescott, Harley and Klein. 2002 Microbiology, 5th edition, The McGraw-Hill (Chapter 42- Biochemistry - Industrial Microbiology And Biotechnology) – ver site da disciplina

Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia

Industrial: Engenharia Bioquímica. Volume 2. Ed Edgard Blücher

LTDA, São Paulo, 2001. Cap. 2.

http://www.ifsc.usp.br/~ilanacamargo/FFI0740/1.pdf

Proteínas e Sistemas de expressão I

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