RFLP Restriction Fragment Lenght

Polymorphism

Juiz de Fora, 09 de dezembro de 2011.

UNIVERSIDADE PRESIDENTE ANTÔNIO CARLOS

Grupo

• Bárbara Tuâne;• Carlos Eduardo Cardoso;• Marina Cognalato;• Poliane Lopes.

Introdução

• A técnica de RFLP foi descrita inicialmete por Botstein em 1980; RFLP é um dos muitos tipos de marcadores moleculares, e são capazes de detectar variações em sequências de DNA de 4 a 8 pares de base, reconhecidas por enzimas de restrição, capazes de clivar DNA por reconhecimento de sequências.

Marcadores Genéticos

• Qualquer característica morfológica ou molecular que diferencia indivíduos, e que seja facilmente detectável é um potencial marcador genético.

Marcadores Genéticos

Morfológicos Bioquímicos DNA

Marcadores moleculares

Marcadores Dominantes

Marcadores Codominantes

RFLP

• São fragmentos de DNA obtidos de enzimas de restrição, separados por eletroforese e visualizados por meio de hibridizações com sondas marcadas com radioatividade ou fluorescência.

Etapas para aquisição de RFLP’s

• Extração do DNA;• Digestão com endonucleases de restrição (cortam a

molécula de DNA através do reconhecimento de sequências nucleotídicas específicas);

• Eletroforese;• Transferência dos fragmentos para uma membrana de

nitrocelulose;• Hibridização dos fragmentos com sondas marcadas;• Visualização dos polimorfismos através de auto-

radiografia.

Base Genéticas dos Marcadores RFLP’s

• O polimorfismo observado na técnica de RFLP ocorre porque o DNA de indivíduos geneticamente distintos difere na sequência de nucleotídeos ao longo da fita.

Interpretação

Autoradiografia de uma membrana de hibridização revelando marcadores RFLP. Indivíduos homozigotos para o alelo A1(3,5,6,7,8,9) e homozigotos para os alelos A2(1,2,4).

Vantagens e Desvantagens

• Reprodutível;• Marcadores co-dominantes;• Simples.

• Trabalhoso;• Caro;• Uso de sondas radioativa.

Aplicações

• Mapeamento do Genoma;• Genotipagem;• Ciência forense;• Teste de paternidade;• Detecção de doenças hereditárias, etc.

Análise do RFLP para a Fibrose Cística

PCR-RFLP (AFLP- Amplified Fragment

Length Polymorphisms)

• Isolamento de DNA suficiente para a análise RFLP é demorado e trabalhoso. No entanto, a PCR pode ser usado para amplificar pequenas quantidades de DNA, geralmente em 2-3 horas, para os níveis exigidos para a análise de RFLP. Portanto,mais amostras podem ser analisadas em um curto tempo.

Artigo: Identification of a criminal by DNA typing in a rape case in Rio de Janeiro, Brazil.

A identificação humana por DNA é uma ferramenta poderosa para casos de paternidade, assim como investigação criminal pela tipagem de evidências biológicas coletadas em cenas de crime e identificação de restos mortais. 

OBJETIVO: Identificação de criminoso em caso de estupro com quatro suspeitos. 

PARTICIPANTES: Sangue de quatro suspeitos e vítima e pele do feto. 

PROCEDIMENTOS: Reação em cadeia da polimerase (PCR) e polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP).  

RESULTADOS: Três suspeitos foram excluídos e um suspeito foi incluído como pai biológico do feto.

Um teste complementar com 3 loci VNTR também foi realizado.

O suspeito foi incluído como pai biológico apresentando Índice de Paternidade de 412.860 (probabilidade de paternidade: 99,9997%).  

Conclusão

O desenvolvimento de técnicas baseadas na hibridização de sequências de DNA abriu novas opções para o estudo de variações . A descoberta de enzimas de restrição, a possibilidade de transferência de fragmentos de DNA para membranas e o desenvolvimento de novos métodos de marcação radioativa e luminescente para fins de hibridização de fragmentos de DNA determinaram o emprego eficiente de RFLP em análise genética.

Bibliografia

• Artigo: GOES, Andréa Carla de Souza et al . Identification of a criminal by DNA typing in a rape case in Rio de Janeiro, Brazil. Sao Paulo Med. J.,  São Paulo,  v. 120,  n. 3, maio  2002 .   Disponível em <http://www.scielo.br/scielo>

• Livro: “Marcadores Genéticos Moleculares” – Fábio Gelape Faleiro (2007);

• Livro: “Introdução ao Uso de Marcadores Moleculares em Análise Genética” – Márcio Elias Ferreira & Dário Grattapaglia (1996);

• Livro: “Marcadores Moleculares em Plantas” – Sandra Milach (1998);• Site: http://www.e-escola.pt/biologia;• Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov;• Site: http://www.sciencedirect.com/

Obrigado!