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Resumão – Perito

Conteúdo1 - QUÍMICA ANALÍTICA...............................................................................................................1

1.1. Preparo de soluções..............................................................................................................1

1.2. Titulometria...........................................................................................................................1

1.3. Complexometria....................................................................................................................1

1.4. Espectroscopia de absorção na região do ultravioleta, visível e infravermelho....................3

1.5. Espectroscopia de absorção atômica....................................................................................4

1.6. Espectrometria de massa......................................................................................................5

1.7. Processos de extração (Líquido-Líquido, Extração em Fase Sólida, Extração de Voláteis por “Headspace”)...............................................................................................................................6

1.8. Técnicas cromatográficas......................................................................................................6

2 – BIOLÓGIA................................................................................................................................8

2.1. Biologia molecular.................................................................................................................8

2.1.1. Replicação......................................................................................................................8

2.1.2. Mutação, recombinação e reparo do DNA...................................................................10

2.1.3. Expressão gênica..........................................................................................................13

2.2. Técnica de biologia molecular.............................................................................................13

2.2.1 Sequenciamento do DNA..............................................................................................13

2.2.2. Técnica de PCR.............................................................................................................14

3 – NOÇÕES DE DIREITO PROCESSUAL PENAL............................................................................15

3.1. Sistemas Processuais...........................................................................................................15

3.2. Investigação Criminal..........................................................................................................16

3.3. Do Inquérito Policial............................................................................................................16

3.4. Da Prova..............................................................................................................................18

3.5. Do Juiz, do Ministério Público, do Acusado e seu Defensor, dos Assistentes e Auxiliares da Justiça.........................................................................................................................................18

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3.6. Processos dos crimes de responsabilidade dos funcionários públicos................................19

4 – LEGISLAÇÃO EXTRAVAGANTE...............................................................................................20

4.1 10. Código de Trânsito Brasileiro (Lei n° 9.503/97)..............................................................20

1 - QUÍMICA ANALÍTICA

1.1. Preparo de soluções 1.2. Titulometria

Titulação: É o método pelo qual se determina uma quantidade desconhecida de uma substância particular, mediante a adição de um reativo-padrão que reage com ela em proporção definida e conhecida.

Exemplo: Vejamos como é feita a titulação da solução de ac. Sulfúrico de concentração X mol/L por meio de uma solução de hidróxido de sódio de concentraçao 0,10 mol/L. 1. Por meio de uma pipeta ou de uma buretamedimos o volume de 25,00mL da solução de ac. Sulfúrico e transferimos essa solução para um erlenmeyer, adicionando algumas gotas de solução alcoólicas de fenolftaleína, que ira atuar como indicador. A solução no erlenmeyer ficará incolor, pois a fenolftaleína em meio ácido permanece incolor. 2. Colocamos a solução de hidróxido de sódio de concentração 0.10 mol/L no interior de uma bureta e fazemos o nível dessa solução coincidir com o zero da bureta. Agora, iniciamos a titulação propriamente dita. Gotejamos a solução de hidróxido de sódio no interior do erlenmeyer, sob agitação continua. À medida que a solução de hidróxido de sódio vai sendo introduzida no frasco, a quantidade de ac. Sulfúrico no seu interior vai diminuindo, porque há neutralização do ácido pela base. 3. Enquanto houver ac. Sulfúrico no erlenmeyer, a solução no seu interior permanecerá incolor. Num dado instante, ao cair uma gota de hidróxido de sódio no erlenmeyer , a solução ficará avermelhada. Nesse instante fecha-se a torneira da bureta e esta terminada a titulação. A última gota de NaOH que caiu contem excesso de NaOH, pois apareceu a coloração avermelhada, porém esse excesso é desprezível. Qiando a solução passa de incolor a avermelhada , significa que o ac. sulfúrico reagiu completamente com o NaOH (fim da titulação) Volume de NaOH gasto na titulação: 22,50 mL. Portanto, 25,00 mL de sol. De ac. Sulfúrico de concentração X mol/L exigiram na titulação 22,50 mL de NaOH de concentração 0.10 mol/L

1.3. ComplexometriaAs titulações complexométricas baseiam-se na formação de um complexo solúvel. São reações

extremamente comuns, mas poucas satisfazem as condições para serem usadas em química analítica: na sua maioria, os complexos não são estáveis bastante para permitir uma titulação. Os complexosque podem ser usados são quase sempre agentes quelatantes, sendo o reagente mais comum o sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Quase todos os metais podem ser titulados pelo EDTA ou reagentes semelhantes, e essas titulações representam um dos maiores desenvolvimentos da química analítica clássica nos últimos anos.

A titulação de complexação, titulação complexométrica, complexometria, compleximetria, ou ainda quelatometria, é uma técnica de análise volumétrica na qual a formação de um complexo colorido entre o analito e o titulante é usado para indicar o ponto final da titulação. Titulações complexométricas são particularmente úteis para a determinação de deferentes íons metálicos em solução. Um indicador capaz de produzir uma ambígua mudança de cor é usualmente usado para detectar o ponto final da titulação.

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Qualquer reação de complexação pode em teoria ser usada como técnica volumétrica desde que:

a reação alcance o equilíbrio rapidamente a cada adição de titulante. situações de interferência não se manifeste, (tais como passos nos quais a formação de

vários complexos resultantes na presença de mais do que um complexo em solução em concentração significativa durante o processo de titulação).

um indicador complexométrico capaz de apresentar o ponto de equivalência com significativa precisão esteja disponível.

Na prática, o uso de EDTA como um titulante está bem estabelecido.

Titulação complexométrica com EDTA

Complexo metal-EDTA

EDTA, ácido etilenodiaminotetracético, tem quatro grupos carboxila e dois grupos amina que podem atuar como doadores de pares de elétrons, ou bases de Lewis. A habilidade do EDTA para potencialmente doar estes seis pares de elétrons para a formação de ligações covalentes coordenadas a cátions metálicos faz do EDTA um "ligante hexadentado". Entretanto, na prática o EDTA é usualmente somente parcialmente ionizado, e então ele forma menos que seis ligações covalentes coordenadas com cátions metálicos. O EDTA dissódico, comumente usado na padronização de soluções aquosas de cátions metálicos de transição, somente forma quatro ligações covalente a cátions metálicos em valores de pH menores ou iguais a 12 como nesta faixa de valores de pH os grupos amina mantem-se protonados e então inábeis para doar elétrons para a formação de ligações covalentes coordenadas.

Em química analítica a abreviatura "Na2H2Y" é tipicamente usada para designar EDTA dissódico. Esta abreviatura pode ser usada para denominar qualquer espécie de EDTA. O "Y" representa a molécula de EDTA, e o "Hn" designa o número de prótons ácidos ligados à molécula de EDTA.

EDTA forma um complexo octaédrico com a maioria do cátions metálicos 2+, M2+, em solução aquosa. A principal razão pela qual o EDTA é usado tão extensivamente em padronização de cátions metálicos é que a constante de formação para muitos complexos de cátion metálico-EDTA é muito alta, mantendo que o equilíbrio para a reação:

M2+ + H4Y → MH2Y + 2H+tenda para a direita.

Realizar a reação em uma solução tampão básica remove H+ assim que ele é formado, o que favorece a formação de complexo EDTA-cátion metálico como produto da reação. Para a maioria dos propósitos pode ser considerado que a formação do complexo EDTA-cátion metálico chegará ao término, e isto é o principal motivo pelo que EDTA é usado em titulações / padronização deste tipo.

Para conduzir titulações de cátion metálico usando EDTA é quase sempre necessário usar um indicador complexométrico, usualmente um corante orgânico tal como Preto sulfon rápido, Preto de eriocromo T, Vermelho de eriocromo B ou Murexida, para determinar quando o ponto final tenha sido

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alcançado. Estes corantes ligam-se aos cátions metálicos em solução e formam complexos coloridos. Entretanto, desde que EDTA liga-se aos cátions metálicos muito mais fortemente que o fazem tais corantes usados como um indicador, o EDTA irá substituir o corante junto ao cátion metálico à medida que é adicionado à solução de analito. Uma mudança de cor na solução sendo titulada indica que todo o corante tenha sido substituido nos cátions metálicos em solução, e que o ponto final foi alcançado.

1.4. Espectroscopia de absorção na região do ultravioleta, visível e infravermelhoA espectrofotometria é o método de análises óptico mais usado nas investigações biológicas e

fisico-químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância.

Todas as substâncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visível. A água absorve fortemente na região do infravermelho.

A absorção das radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem das estruturas das moléculas, e é característica para cada substância química.

Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida (absorbância): a energia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida.

A cor das substâncias se deve a absorção (transmitância) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas não absorvidos.

Em Química e Física o termo espectroscopia é a designação para toda técnica de levantamento de dados físico-químicos através da transmissão, absorção ou reflexão da energia radiante incidente em uma amostra. Por extensão, o termo espectroscopia ainda é usado na técnica de espectroscopia de massas, onde íons moleculares monovalentes são defletidos por um campo magnético.

O resultado gráfico de uma técnica espectroscópica qualquer, a resposta como uma função do comprimento de onda - ou mais comumente a frequência - é chamado espectro. Sua impressão gráfica pode ser chamada espectrograma ou, por comodidade, simplesmente espectro; ver também largura de linha espectral

Originalmente o termo espectropia designava o estudo da interação entre radiação e matéria como uma função do comprimento de onda (λ). De fato, historicamente, espectroscopia referia-se a ao uso de luz visível dispersa de acordo com seu comprimento de onda, e.g. por um prisma.

Posteriormente o conceito foi expandido para compreender qualquer medida de uma grandeza como função tanto de comprimento de onda ou frequência. Assim, este termo também pode se referir a uma resposta a um campo alternado ou freqüência variável (ν). Uma posterior extensão do escopo da definição adicionou energia (E) como uma variável, dada quando obtido o relacionamento muito próximo expresso por E = hν para fótons (h é a constante de Planck).

A espectroscopia no ultravioleta visível (UV/VIS) envolve a espectroscopia de fótons (espectrofotometria). Ela utiliza luz na faixa do visível, do ultravioleta (UV) próximo e do infravermelho próximo. Nessas faixas de energia as moléculas sofrem transições eletrônicas moleculares.

Lei de Beer-Lambert

O método utilizado para determinar de um modo quantitativo a concentração de substâncias em solução que absorvem radiação, é usando a Lei de Beer-Lambert:

,onde A é a absorvância medida, I0 é a intensidade da luz incidente a um dado comprimento de

onda, I é a intensidade transmitida pela amostra, L é o caminho óptico pela amostra (distância que a luz percorreu por ela), ε é uma constante conhecida como absorbtividade molar (a qual varia de substância para substância), e c é a concentração da substância em (mol/L).

A absorvância e ε às vezes são definidos em termos do logaritmo natural em vez do logaritmo na base 10.

A concentração também pode ser dada em (g/L) onde em vez de ε e utilizado a (absorbtividade), onde temos a relação entre ε e a dada pela formula:

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onde MM é a massa molecular da substancia analisada

O instrumento usado na espectroscopia UV/VIS é chamado de espectrofotômetro. Para se obter informação sobre a absorção de uma amostra, ela é inserida no caminho óptico do aparelho. Então, luz UV e/ou visível em um certo comprimento de onda (ou uma faixa de comprimentos de ondas) é passada pela amostra. O espectrofotómetro mede o quanto de luz foi absorvida pela amostra. A intensidade da luz antes de passar pela amostra é simbolizada por I0, e a intensidade da luz depois de passar pela amostra é simbolizada por I. A transmitância da amostra é definida pela razão (I / I0), a qual normalmente é expressa em porcentagem de transmitância (%T). A partir dessa informação, a absorvância da ambos é determinada para esse certo comprimento de onda ou como uma função de uma faixa de comprimentos de onda. Os espectrofotômetros mais sofisticados normalmente fazem isso automaticamente. Existem dois tipos de espectofotometros: de feixe simples e de feixe duplo.

Apesar de as amostras poderem ser sólidas (ou mesmo gasosas), elas usualmente são líquidas. Uma cela transparente (ou seja, que não absorve radiação na faixa de comprimentos de onda usada), comumente chamada de cuvete, é enchida com a amostra líquida e inserida no espectrofotómetro. O caminho óptico L pela a amostra é então a largura da cuvete. Espectrofotómetros mais simples (económicos) usam cuvetes com a forma cilíndrica (tubos de ensaio), porém, os mais sofisticados usam cuvetes retangulares, geralmente com uma largura de 1 cm. Para espectroscopia apenas no visível, simples cuvetes de vidro podem ser usadas, porém a espectroscopia no ultravioleta requer cuvetes especiais feitas de um material que (ao contrário do vidro) não absorva luz UV, como o quartzo.

A espectroscopia de infravermelho (espectroscopia IV) é um tipo de espectroscopia de absorção a qual usa a região do infravermelho do espectro eletromagnético. Como as demais técnicas espectroscópicas, ela pode ser usada para identificar um composto ou investigar a composição de uma amostra.

A espectroscopia no infravermelho se baseia no fato de que as ligações químicas das substâncias possuem freqüências de vibração específicas, as quais correspondem a níveis de energia da molécula (chamados nesse caso de níveis vibracionais). Tais freqüências dependem da forma da superfície de energia potencial da molécula, da geometria molecular, das massas dos átomos e eventualmente do acoplamento vibrônico.

Se a molécula receber radiação eletromagnética com 'exatamente' a mesma energia de uma dessas vibrações, então a luz será absorvida desde que sejam atendidos a determinadas condições. Para que uma vibração apareça no espectro IV, a molécula precisa sofrer uma variação no seu momento dipolar durante essa vibração. Em particular, na aproximação de Born-Oppenheimer e aproximações harmônicas, isto é, quando o hamiltoniano molecular correspondente ao estado padrão eletrônico pode ser aproximado por um oscilador harmônico quântico nas vizinhanças da geometria molecular de equilíbrio, as freqüências vibracionais de ressonância são determinadas pelos modos normais correspondentes à superfície de energia potencial do estado eletrônico padrão. Não obstante, as freqüências de ressonância podem ser em uma primeira aproximação relacionadas ao comprimento da ligação e às massas dos átomos em cada ponta dela. As ligações podem vibrar de seis modos: estiramento simétrico, estiramento assimétrico, tesoura, rotação, wag e twist.

A espectroscopia no infravermelho é largamente usada tanto na indústria quanto na pesquisa científica pois ela é uma técnica rápida e confiável para medidas, controle de qualidade e análises dinâmicas. Os instrumentos agora são pequenos, e podem ser transportados, mesmo para medidas de campo. Com a crescente tecnologia em filtragem computacional e manipulação de resultados, agora as amostras em solução podem ser medidas com precisão (a água produz uma banda larga de absorbância na faixa de interesse, o que daria um espectro ilegível sem esse tratamento computacional). Algumas máquinas até mesmo dirão automaticamente que substância está sendo analisada a partir de milhares de espectros de referência armazenados na memória.

Medindo-se a uma freqüência específica ao longo do tempo, mudanças no caráter ou na quantidade de uma ligação em particular podem ser medidas, isso é especialmente útil na medida do grau de polimerização na manufatura de polímeros. As máquinas modernas podem tirar medidas na faixa de interesse freqüentemente, como 32 vezes por segundo. Isso pode ser feito enquanto se fazem medidas simultâneas com outras técnicas. Isso faz com que as observações de reações químicas sejam processadas mais rapidamente, de forma mais precisa e mais exata.

1.5. Espectroscopia de absorção atômica

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Espectroscopia de absorção atômica, também chamada de espectrofotometria de absorção atômica, é o método de análise usado para determinar qualitativamente e quantitativamente a presença de metais. O método consiste em determinar a presença e quantidade de um determinado metal em uma solução qualquer (embora possam ser usadas amostras sólidas), usando como princípio a absorção de radiação ultravioleta por parte dos elétrons. Os elétrons ao sofrerem um salto quântico depois de devidamente excitados por uma fonte de de energia, que pode ser a chama de um gás e um comburente, como o acetileno a 3.000 graus Celsius, no caso da espectroscopia de absorção atômica de chama, devolvem a energia recebida para o meio, voltando assim para a sua camada orbital de origem.

Como comburente pode ser usado o ar ou o óxido nitroso (N2O).A energia devolvida na forma de um fóton de luz, por sua vez, absorve a radiação ultravioleta

emitida pela fonte específica (cátodo ôco) do elemento químico em questão. Dessa forma, elétrons que estão contidos na solução, e que sofrem também um salto quântico e que não pertencem ao mesmo elemento que constitui o cátodo ôco que está sendo usado no momento, não serão capazes de causar uma interferência, isso porque eles absorverão apenas radiação com comprimento de onda referente ao elemento químico do qual fazem parte.

Quase todas as interferências encontradas na espectrocospia de absorção atômica podem ser reduzidas ou completamente eliminadas pelos seguintes procedimentos:

1 - Usar se possível, padrões e amostras de decomposição semelhante para eliminar os efeitos de matriz (ajuste de matriz).

2 - Alterar a composição da chama ou sua temperatura para reduzir a formação de compostos estáveis na chama

3 - Selecionar raias de ressonância que não sofram interferência espectral de outros átomos ou moléculas e de fragmentos moleculares.

4 - Separar por extração com solventes ou processos de troca iônica o elemento interferente. Este procedimento é mais necessário na espectroscopia de emissão de chama.

5 - Usar um método de correção de radiação de fundo.Entre os elementos analisados principais encontram-se: Ca, Na, K, Mn, Fe, Zn, Se e Cu.[1]É tratada muitas vezes entre os profissionais do meio de química analítica como AAS, do inglês

Atomic Absorption Spectroscopy.

1.6. Espectrometria de massaA espectrometria de massa é um método para identificar os diferentes átomos que compõe

uma substância. Um espectrômetro de massa bombardeia uma substância com elétrons para produzir íons, ou átomos eletricamente carregados. Os íons atravessam um campo magnético que curva suas trajetórias de modos diferentes, dependendo de suas massas. O campo separa os íons em um padrão chamado espectro de massa. A massa e a carga dos íons podem ser medidas por sua posição no espectro. Os cientistas identificam assim os elementos e isótopos presentes na amostra.

Francis Aston foi quem inventou o espectrômetro de massa, em 1919.Dentre os vários tipos de espectrômetros, o TIMS, o SIMS e o LA-ICP-MS são os mais utilizados.

TIMSO Espectrometro de Massa de Ionização Térmica ou TIMS (Thermal Ionization Mass

Spectrometer) tem maior precisão analítica e os métodos analíticos são sustentados pelas amplas experiências acumuladas. Podem-se analisar elementos terras raras e a razão isotópica de urânio, chumbo e tório, a partir de um grão de zircão. Esta tecnologia viabilizou a datação U-Pb em zircão desde a década de 1980. As análises consomem completamente os grãos de minerais devido à ionização. Com a utilização do isótopo artificial, chamado de spike, o TIMS realiza análises primárias, sem necessidade de padrão. Tal método é denominado ID-TIMS e pode analisar aproximadamente 10 amostras por dia. O custo para aquisição do aparelho e as despesas para sua operação são muito altos.

SIMSO Espectrômetro de Massa por Ionização Secundária ou SIMS, chamado também de ion prove,

é o espectrômetro de massa para análise de pequenas áreas na superfície polida de um grão de mineral, com um diâmetro de 20 a 30 micrômetros. A ionização é realizada com o auxílio do impacto do feixe de íons de oxigênio. Portanto, são possíveis as análises de elementos ultra-traços e razões isotópicas de

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uma pequena parte do grão de mineral. Os operadores miram nos pontos a serem analisados ao microscópio óptico. A operação similar à microssonda eletrônica permite as análises sem destruição total das amostras. Entretanto, não há precisão comparável com o ID-TIMS. Para as análises, é necessário um padrão. O SIMS fabricado e calibrado exclusivamente para datações de U-Pb é chamado de SHRIMP e, realizam-se em torno de 50 datações U-Pb por dia.

LA-ICP-MSO LA-ICP-MS (laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometer), ou seja,

espectrômetro de massa por ionização acoplada por plasma com ablação a laser, utiliza feixe de laser de diâmetro de 20 a 30 micrômetros (spot analyses) para ionização da superfície de amostra. As seções polidas e lâminas delgadas de 100 micrômetros de espessura podem ser analisadas sem necessidade de pré-tratamentos químicos. Sendo similar ao SIMS, os operadores miram os pontos a serem analisados ao microscópio óptico. As análises precisam do padrão e, a precisão analítica não chega ao nível do SIMS. Por outro lado, as preparações de amostras, operações e manutenção são extremamente simples e práticos, conseguindo no máximo 300 datações U-Pb por dia. Além disso, sua aplicabilidade é muito ampla, desde a datação de U-Pb até a determinação de metais pesados poluidores nos estudos ambientais. O custo para aquisição do aparelho e sua operação é muito mais baixo do que o TIMS e SIMS.

1.7. Processos de extração (Líquido-Líquido, Extração em Fase Sólida, Extração de Voláteis por “Headspace”)

Extração líquido-líquido (ELL), também conhecida como extração por solvente e partição, é um método para separar compostos baseado em suas diferentes solubilidades em dois líquidos diferentes imiscíveis, normalmente água e um solvente orgânico. É um processo de separação que objetiva a extração de uma substância de uma fase líquida em outra fase líquida. Extração líquido-líquido é uma técnica básica em laboratórios químicos, onde é realizada usando-se um funil de separação. Este tipo de processo é comumente realizado após uma reação química como parte de work-up (rotina de trabalho em laboratório de química visando isolar e purificar o(s) produto(s) de uma reação química).

Em outras palavras, é a separação de uma substância de uma mistura por preferencialmente dissolver esta substância em um solvente adequado. Por este processo, um composto solúvel é normalmente separado de um composto insolúvel. Extração de solvente é utilizado no reprocessamento nuclear, processamento de minérios, a produção de compostos orgânicos finos, o processamento de perfumes e outras indústrias.

Por exemplo, em uma situação onde temos dois líquidos, A e B, miscíveis entre si, e queremos separar A de B, podemos usar um terceiro líquido, C, que seja mais miscível com A do que com B. A separação entre o extrato, A e C, e o rafinado, A e B, é feita com uma ampola de decantação ou um funil separador, em escala laboratorial, e em equipamentos de extração industriais como colunas de extração [1] ou misturadores-decantadores.[2] O rafinado pode ser mais purificado com etapas adicionais sucessivas de extração líquido-líquido. A recuperação de A a partir do extrato é geralmente feita por destilação.

Extração líquido-líquido é possível em sistemas não aquosos: Em um sistema consistindo de um metal fundido (ou líquido) em contato com sal fundido, metais podem ser xtraídos de uma fase para a outra. Isto é relacionado ao eletrodo de mercúrio electrode onde um metal pode ser reduzido, o metal irá frequentemente dissolver-se no mercúrio formando uma amálgama que modifica grandemente sua eletroquímica. Por exemplo, é possível para cátions sódio serem reduzidos em um cátodo de mercúrio para formar amálgama de sódio, enquanto em um eletrodo inerte (tal como a platina) os cátions sódio não são reduzidos. Em vez disso, água é reduzida a hidrogênio. Um detergente ou sólido fino pode ser usado para estabilizar uma emulsão, ou uma terceira fase.

1.8. Técnicas cromatográficasA cromatografia (do grego χρώμα:chroma, cor e γραφειν:"grafein", grafia) envolve uma série de

processos de separação de misturas. A cromatografia acontece pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel. A grande variabilidade de combinações entre a fase móvel e estacionária faz com que a cromatografia tenha uma série de técnicas diferenciadas.

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Cromatografia é uma técnica de separação de misturas e identificação de seus componentes. Esta separação depende da diferença entre o comportamento dos analitos entre a fase móvel e a fase estacionária. A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, bipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade.

Uma analogia que é as vezes útil é a suposição da mistura de abelhas e moscas passando sobre uma flor. As abelhas serão atraídas pela flor e serão separadas das moscas por esta atração. Se observarmos esta passagem sobre a flor, as moscas irão passar antes seguidas pelas abelhas. Nesta anologia, as abelhas e as moscas são os analitos, as flores representariam a fase estacionária e o ar onde as duas espécies passam seria a fase móvel. A chave da separação está na diferença de afinidade entre o analito, a fase móvel e a fase estacionária. O observador seria representado pelo detector usado em uma série de formas de cromatografia. Todavia os valores determinados podem sofrer mudanças.

Classificação das técnicas cromatográficasDe acordo com o sistema cromatográfico

Em Coluna o Cromatografia Líquidao Cromatografia Gasosao Cromatografia Supercrítica

Planar o Centrífuga (Chromatotron)o Cromatografia em Camada Delgada (CCD)o Cromatografia em Papel (CP)

De acordo com a fase móvel Utilização de Gás

o Cromatografia Gasosa (CG) o Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)

Utilização de Líquido o Cromatografia Líquida Clássica (CLC)o Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

Utilização de Gás Pressurizado Cromatografia Supercrítica (CSC)

De acordo com a Fase Estacionária Líquida Sólida Quimicamente Ligadas

De acordo com o modo de separação Por adsorção Por partição Por troca iônica Por Afinidade

Principais técnicas cromatográficasCromatografia de adsorção

O mais utilizado. Duas substâncias ligadas por uma interface onde não ocorre solubilização. A fase estacionária é sólida e a fase móvel pode ser líquida ou gasosa. Baseia-se nas atrações eletrostáticas ou dipolares da superfície da fase estacionária pelas moléculas da substância a separar.

Cromatografia de partiçãoA fase estacionária é líquida. Este processo é baseado na diferente solubilidade dos

componentes da mistura nas duas fases líquidas.

Cromatografia PlanarNa cromatografia planar, a fase estacionária é suportada sobre uma placa plana ou nos poros

de um papel. Nesse caso, a fase móvel desloca-se através da fase estacionária por ação da capilaridade

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ou sob a influência da gravidade. Útil em separação de compostos polares. Encontra-se bastante difundida devido à sua facilidade experimental e ao seu baixo custo. Cromatografia em papel(CP) É uma técnica de partição, utiliza dois líquidos(líquido-líquido)sendo um fixado em um suporte sólido(papel de filtro).Um bom exemplo:a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.

Cromatografia em camada fina (CCD)Ou TLC, do inglês thin-layer chromatography. É uma técnica de adsorção, utiliza um líquido e

um sólido. Ocorre a retenção das substâncias devido a absorção sofrida na superfície da fase estacionária. Utiliza-se uma placa de vidro ou metal como suporte e geralmente sílica gel, alumina, terra diatomácea ou celulose como fase estacionária.

Exemplificando: a mistura é aplicada na placa de vidro coberta com sílica (fase estacionária), a placa de vidro é colocada em um cuba contendo a fase móvel. Esta fase móvel (solvente) sobe por capilaridade e arrasta a substância menos adsorvida separando-a das substâncias mais adsorvidas. Como a maioria das substâncias separadas são incolores, utiliza-se um revelador. As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade,etc.

Cromatografia em colunaÉ a técnica de separação cuja fase estacionária acontece dentro de um tubo. Utiliza-se uma

coluna de vidro aberta na parte superior e munida de uma torneira na extremidade inferior, por onde sai o líquido (eluído). Dentro da coluna encontra-se a fase estacionária constituída por um enchimento sólido no caso da cromatografia de adsorção, ou por uma fase líquida no caso da cromatografia de partição. A fase móvel é líquida em ambos os casos.A ordem das substâncias dependerá da sua polaridade.

Cromatografia de leito móvelA cromatografia de leito móvel verdadeiro (True moving bed, TMB) é uma forma de

transformar a cromatografia de leito fixo num processo contínuo em contracorrente, e desta forma maximizar as taxas de transferência de massa entre fases. Nesta técnica, o absorvente move-se no sentido oposto ao do eluente com uma velocidade compreendida entre as velocidades de migração dos dois componentes.

2 – BIOLÓGIA

2.1. Biologia molecular2.1.1. Replicação

A replicação é um processo no qual uma molécula de DNA dupla fita é duplicado. Devido ao fato do DNA conter a "informação" que é fundamental para codificar todas as proteínas e RNAs necessários para se "construir" um organismo, é através da replicação que os seres vivos conseguem dar origem a um novo ser que possui as mesmas características de quem o originou. A replicação também explica como nós, seres multicelulares, fomos formados a partir de uma única célula - o zigoto. Portanto a replicação do material genético é importante para todas as formas de vidas conhecidas. No entanto os mecanismos de replicação dos procariotos e eucariotos não são idênticos. Como cada fita de DNA contem a mesma informação genética, qualquer uma das duas fitas podem servir como molde por isso a replicação do DNA é dita semi-conservativa os detalhes serão abordados ao longo do texto.

Nas células a replicação deve acontecer antes da divisão celular. Em procariotos a replicação ocorre entre as divisões celular enquanto que nos eucariotos ocorre na fase S da interfase (para maiores detalhes veja ciclo celular). A replicação também pode ser reproduzida em laboratório através de um ensaio conhecido como PCR.

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Os nucleotídeos de uma fita da molécula de DNA pode interagir com os nucleotídeos da fita complementar através de ligações de hidrogênio entre suas bases nitrogenadas, sendo que a Adenina se liga por meio de duas ligações de hidrogênio à Timina, e a Citosina se liga através de três ligações com a Guanina.

A replicação do DNA é semi-conservativa porque na formação de uma nova cadeia nucleotídica tem-se como referência uma cadeia nucleotídica molde (ou mãe) do DNA que está sendo replicado.

O DNA não se replica sozinhoPara que o processo de replicação se inicie é necessário que a atuação de uma enzima,

a DNA helicase. A enzima liga-se à cadeia de DNA e desliza sobre esta, quebrando as ligações entre as duas cadeias de nucleótidos - ligações de hidrogênio - ficando então as duas cadeias de DNA separadas. Em seguida, os nucleotídeos livres existentes no núcleo ligam-se, por complementaridade de bases, às cadeias de DNA. De uma cadeia original de DNA formam-se duas novas cadeias. Replicação do DNA é o processo de auto-duplicação do material genético mantendo assim o padrão de herança ao longo das gerações.

Duas teorias tentaram explicar a replicação do DNA: Teoria conservativa: Cada fita do DNA sofre duplicação e as fitas formadas sofrem

pareamento resultando num novo DNA dupla fita, sem a participação das fitas "parentais" (fita nova com fita nova formam uma dupla hélice e fita velha com fita velha formam a outra dupla fita).

Teoria semi-conservativa: Cada fita do DNA é duplicada formando uma fita híbrida, isto é, a fita velha pareia com a fita nova formando um novo DNA; de uma molécula de DNA formam-se duas outras iguais a ela. Cada DNA recém formado possui uma das cadeias da molécula mãe, por isso o nome semi-conservativa.

A molécula do DNA vai-se abrindo ao meio, por ação de uma enzima chamada DNA helicase. Essa enzima quebra as ligações de hidrogênio existentes entre as duas bases nitrogenadas das cadeias complementares de nucleotídeos.

Ao mesmo tempo que o DNA helicase vai abrindo a molécula de DNA, outra enzima chamada polimerase vai ligando um grupo de nucleotídeos que se pareiam com os nucleotídeos da molécula mãe.

Além da capacidade de duplicação o DNA também é responsável pela síntese de outro ácido nucleico muito importante para a célula: o ácido ribonucleico ou RNA. Da mesma forma que o DNA, o RNA também é uma molécula grande formada por várias partes menores chamadas nucleotídeos. Por isso diz-se que tanto DNA como RNA são polinucleotídios.

Etapas da polimerização do DNAA replicação inicia-se numa zona da cadeia denominada tripleto de iniciação. Neste

local as helicases começam a abrir a cadeia para ambos os lados da origem quebrando as ligações de hidrogênio existentes entre as bases complementares, formando-se uma bolha de replicação que é constituído por duas forquilhas de replicação. Em seguida liga-se às cadeias de DNA a enzima RNA primase que vai sintetizar um primer que consiste numa sequência de bases de RNA que vão iniciar a síntese visto que a DNA polimerase III não tem a capacidade de o fazer, devido a ausência de grupos hidroxilos -OH expostos. Após a síntese do primer a DNA polimerase III vai continuar o processo que ocorre no sentido da extremidade 5' para a extremidade 3' da nova cadeia. Como a DNA polimerase vai atuar para ambos os lados da origem de replicação, por cada cadeia simples de DNA existente vai existir uma parte da nova cadeia que vai ser sintetizada na direção da replicação, essa cadeia é sintetizada de modo continuo e denomina-se cadeia contínua e existe uma outra parte da cadeia em que a direção da replicação é contrária à direção da síntese, esta cadeia vai ser sintetizada descontinuamente,

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isto é, a RNA primase vai sintetizar vários primers ao longo da cadeia começando o mais próximo da origem de replicação e terminando no mais distante e a partir daí vão formar-se fragmentos, denominados fragmentos de Okazaki constituídos pelo DNA, enquanto que entre estes fragmentos vão ainda existir os primers, que serão removidos e substituídos por DNA, pela ação de uma outra DNA polimerase, a DNA polimerase I. Como a DNA polimerase não consegue estabelecer a ligação entre esses nucleótidos e os que se encontram nas extremidades dos fragmentos de Okazaki, formam-se lacunas entre o grupo fosfato de um, e o carbono 3' do outro. Esses nucleótidos são posteriormente ligados pela DNA ligase. A esta cadeia chama-se cadeia descontínua. As partes finais da cadeia de DNA denominadas telômeros são sintetizadas pela RNA telomerase por um processo de transcrição inversa, isto é, esta enzima sintetiza DNA tendo por molde RNA. Durante todo o processo de replicação atuam outras enzimas entre elas as SSB e as topoisomerases que têm como função evitar o enrolamento da cadeia durante a síntese.

2.1.2. Mutação, recombinação e reparo do DNA

Em Biologia, mutações são mudanças na sequência dos nucleotídeos do material genético de um organismo. Mutações podem ser causadas por erros de copia do material durante a divisão celular, por exposição a radiação ultravioleta ou ionizante, mutagênicos químicos, ou vírus. A célula pode também causar mutações deliberadamente durante processos conhecidos como hipermutação. Em organismos multicelulares, as mutações podem ser divididas entre mutação de linhagem germinativa, que pode ser passada aos descendentes, e mutações somáticas, que não são transmitidas aos descendentes em animais. Em alguns casos, plantas podem transmitir mutações somáticas aos seus descendentes, de forma assexuada ou sexuada (em casos em que as gemas de flores se desenvolvam numa parte que sofreu mutação somática. Assim, essa classificação é pouco eficiente para plantas, se ajustando melhor a animais. Uma nova mutação que não foi herdada de nenhum dos pais é chamada de mutação de novo. A fonte da mutação não se relaciona com seus efeitos, apesar de seus efeitos estarem relacionados com quais células são afetadas pela mutação.

Mutações geram variações no conjunto de genes da população. Mutações desfavoráveis (ou deletérias) podem ter sua frequência reduzida na população por meio da seleção natural, enquanto mutações favoráveis (benéficas ou vantajosas) podem se acumular, resultando em mudanças evolutivas adaptativas. Por exemplo, uma borboleta pode produzir uma prole com novas mutações. A maioria dessas mutações não terá efeito. No entanto, uma delas pode mudar a cor dos descendentes desse indivíduo, tornando-os mais difíceis (ou fáceis) de serem vistos por predadores. Se essa mudança de cor for vantajosa, a chance dessa borboleta sobreviver e produzir sua própria prole será um pouco maior, e com o tempo o número de borboletas com essa mutação constituir formar uma maior proporção da população.

Mutações neutras são definidas como mutações cujos efeitos não influenciam a aptidão dos indivíduos. Essas mutações podem se acumular ao longo do tempo devido à deriva genética. Acredita-se que a imensa maioria das mutações não tem efeito significativo na aptidão dos organismos. Essa teoria neutralista foi desenvolvida por Motoo Kimura em seu livro "The Neutral Theory of Molecular Evolution". Além disso, mecanismos de reparo de DNA são capazes de corrigir a maior parte das mudanças antes que elas se tornem mutações permanentes, e muitos organismos têm mecanismos para eliminar células somáticas que sofreram mutações.

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As mutações são consideradas o mecanismo que permite a ação da seleção natural, já que insere a variação genética sobre a qual ela irá agir, fornecendo as novas características vantajosas que sobrevivem e se multiplicam nas gerações subsequentes ou as características deletérias que desaparecem em organismos mais fracos.

Reparação de ADN é um processo em constante funcionamento nas células; sendo essencial para a sobrevivência das mesmas. A reparação protege o genoma de danos que podem levar a mutações nocivas. A reparação ocorre em todas as células e em todos os organismos. Em células humanas, tanto atividades metabólicas normais quanto fatores ambientais (como raios UV) podem causar danos no ADN, resultando em cerca de 500 000 lesões moleculares individuais por dia. Essas lesões causam danos estruturais à molécula de ADN, e podem dramaticamente alterar o resultado da transcrição gênica. Conseqüentemente, o processo de reparo de ADN precisa estar operando constantemente, para corrigir rapidamente qualquer dano a estrutura do ADN

Conforme as células envelhecem, a taxa de reparo de ADN decresce até que não mais possa reparar todos danos ocasionados na sequência de ADN. A célula então terá um dos três possíveis destinos:

1 - um irreversível estado de dormência, conhecido como senescência;2 - a célula se "suicida", o que é conhecido como apoptose, ou morte celular

programada;3 - carcinogênese, a formação de câncer.A maioria das células no corpo primeiramente tornam-se senescentes. Então, depois

de danos irreparáveis ao ADN, ocorre a apoptose. Nesse caso, a apoptose funciona como um "último recurso" prevenindo a célula de tornar-se carcinogênica ameaçando o organismo.

Quando as células tornam-se senescentes, alterações na biossíntese fazem com que funcionem menos eficientemente. A capacidade do reparo de ADN de uma célula é vital para a integridade do genoma e conseqüentemente para o seu funcionamento normal e o do organismo. Sabe-se que vários genes que inicialmente foram demonstrados como influentes na longevidade estão envolvidos em proteção e reparo aos danos no ADN.

Mecanismos de Reparo de DNACélulas não podem tolerar danos no DNA que comprometam a integridade e a

acessibilidade das informações essenciais do Genoma (mas, células remanescem superficialmente funcionais quando os então chamados genes não-essenciais são perdidos ou danificados.). Dependendo do tipo de dano infligido na estrutura duplo-helicoidal de DNA, uma variedade de estratégias de reparo tem sido envolvidos para restaurar informações perdidas. Como modelos de restauração, as células utilizam uma fita complementar não modificada de DNA ou do cromossoma-irmão. Sem acesso a informação modelo, o reparo de DNA é propenso a erros (mas isso pode ser uma via padrão: muitos danos na fita dupla nas células de mamíferos, e.g: são reparados sem ajuda de um modelo; veja a frente).

Danos ao DNA alteram a configuração espacial da hélice e tais alterações podem ser detectadas pela célula. Uma vez o dano seja localizado, moléculas específicas de reparo de DNA são enviadas ao local e se ligam à região ou nas proximidades do local do dano, incluindo outras moléculas para ligar e formar um complexo que habilita o reparo a agir no local. Os tipos de moléculas envolvidas e o mecanismo de reparo que é mobilizado depende:

1 - Do tipo de dano no DNA que está em jogo2 - Se a célula entrou no estado de senescência3 - A fase do ciclo celular que a célula esteja

Danos à fita simples

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Quando somente uma das fitas de um cromossomo tem defeito, a outra fita pode ser usada como modelo para guiar a correção da fita danificada. Para a reparação do dano de uma das fitas dos domínios helicoidais de DNA, são numerosos mecanismos para qual o reparo de DNA atue. Incluem:

1 - Reversão direta do dano pelos vários mecanismos que são especializados em inverter tipos específicos de dano. Exemplos incluem metil-guanina metil-transferase (MGMT) que remove especificamente grupamentos metila da guanina, e fotólise na bactéria, que, através da luz UV, quebra a ligação química entre bases de timidina 2 – 2 adjacentes. Uma fita-molde não é requerida para essa forma de reparo.2 - Reparo por mecanismos de excisão que removem o nucleotídeo danificado, recolocando em pareamento um nucleotídeo são na fita de DNA complementar sã.Esses incluem:

Reparo de excisão de bases (BER – Base excison repair, em inglês), que repara danos em nucleotídeos decorrentes de oxidação, alquilação, hidrólise ou desaminação;

Reparo por excisão de nucleotídeos (NER – Nucleotide excision repair, em inglês), que repara os danos, retirando os nucleotídeos em bloco. Esse reparo inclui vultosos mecanismos de distorção da hélice, assim como a dimerização de timidina causada por luz UV, bem como quebras em fitas-simples. Uma forma especializada de NER conhecida como Reparo de Transcrição Casada (TCR – Transcription-Coupled Repair) que descarrega prioritariamente enzimas de reparo NER em genes que estejam em atividade;

Reparo de pareamentos errados (MMR – Mismatch repair), que corrige erros da replicação do DNA e da recombinação gênica que resulta em pareamento errôneo em nucleotídeos seguindo a replicação do DNA.

Quebras em fitas duplasUm tipo perigoso em particular de dano em DNA às células que estão em divisão é a

quebra de ambas as fitas da dupla-hélice. Dois mecanismos existem para reparar esse dano. Eles são geralmente conhecidos como união terminal não-homóloga (em inglês, Non-Homologous End-Joining - NHEJ) e recombinação genética, reparo recombinante e reparo assistido por cópia, ou recombinação homóloga.

O reparo recombinante requer a presença de uma idêntica ou quase idêntica seqüência para ser usada como cópia para o reparo do dano. A maquinaria enzimática responsável para esse processo de reparo é quase idêntica àquela usada para o crossing-over (ou permuta) vista nas células germinativas durante a meiose. O reparo recombinante é predominantemente usado durante as fases do ciclo celular quando o DNA está em replicação ou está terminando a replicação do DNA. Isso permite que o cromossomo danificado seja reparado usando a nova cromátide-irmã como cópia, isto é, uma cópia idêntica que é, além disso, ordinariamente pareada à região danificada. Muitos genes no genoma humano são copiados várias vezes para prover muitas fontes de seqüências idênticas para suprir este mecanismo de reparo. Mas o reparo recombinante que confia nessas cópias como cópias de cada gene, é outra problemática porque isso leva a translocação cromossômica e outros tipos de rearranjos cromossômicos. A união terminal não-homóloga (em inglês, Non-Homologous End-Joining - NHEJ) reúne dois términos de uma quebra na falta de uma seqüência copiada. Porém, há freqüentemente seqüência de DNA perdida durante esse processo e então o reparo pode ser mutagênico. A NHEJ pode ocorrer em todos os estágios do ciclo celular, mas, nas células dos mamíferos é o principal mecanismo de reparo de DNA até que seja possível a

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utilização do reparo recombinante operado por cromátides-irmãs como cópias. Desde a vastidão do genoma humano até outros organismos multicelulares, o código genético é composto por regiões que não contém genes, chamadas então de DNA-lixo (sabe-se no entanto que essas regiões estão implicadas com o controle da expressão de vários genes, sendo importantes mecanismos de repressão e de ativação destes e até de mecanismos de reparo de outros genes que tenham sofrido danos eventuais), o potencialmente mutagênico NHEJ pode ser menos prejudicial do que mecanismos operados por cópias seqüenciais múltiplas, desde então nos casos que são indesejáveis os rearranjos de DNA são gerados com mais facilidade do que por NHEJ. A maquinaria enzimática usada pelo reparo NHEJ é também utilizadas em linfócitos-B para reunir quebrar decorrentes de proteínas RAG durante a recombinação VDJ, um passo crucial na geração de variedades de imunoglobulinas diversas pelo sistema imune.

2.1.3. Expressão gênica

Expressão gênica é o processo pelo qual a informação hereditária contida em um gene, tal como a seqüência de DNA, é processada em um produto gênico funcional, tal como proteínas ou RNA.

Vários passos no processo de expressão gênica podem ser modulados, incluindo a transcrição e a modificação pós-traducional de uma proteína. A regulação gênica dá à célula controle sobre sua estrutura e função e é a base para a diferenciação celular, morfogênese e para a versatilidade e adaptabilidade de qualquer organismo. A regulação gênica pode também servir como substrato para mudanças evolutivas, dado que o controle do timing, localização e quantidades de expressão gênica podem ter um efeito profundo nas funções (ações) do gene num organismo.

2.2. Técnica de biologia molecular 2.2.1 Sequenciamento do DNA

O sequenciamento ou sequenciação de DNA é uma série de métodos bioquímicos que têm como finalidade determinar a ordem das bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) da molécula de DNA.

O método tradicional de sequenciamento de DNA foi proposto por Frederick Sanger na década de 70 e consiste na adição de nucleotídeos modificados, chamados didesoxirribonucleotídeos, que impedem o crescimento de um fragmento de DNA em replicação pela DNA polimerase após sua adição. Tem sido largamente utilizado por centros de pesquisa ao redor do globo.

O método de pirosequenciamento consiste em uma nova abordagem molecular do sequenciamento e se beneficia de uma técnica capaz de captar a emissão de luz causada pela adição de uma luciferase, acoplada à polimerização do DNA previamente fragmentado e aderido a microesferas, com o uso de sequências adaptadoras.

Método de SangerPelo método de Sanger, uma fita simples de DNA que será sequenciada, é hibridizada

com um primer de desoxinucleotídeos marcado na ponta 5´ (cinco linha). Quatro misturas de reação são preparadas onde os primers utilizados serão elongados por uma DNA polimerase. Cada mistura contém os quatro desoxinucleosídeos trifosfato normais mais um dos quatro didesoxinucleosídeos trifosfato em uma razão de aproximadamente 1/100. Uma vez que um didesoxinucleotídeo não tem ponta 3´-OH, não é possível haver elongação a partir do nucleotídeo adicionado, parando a reação. Desta forma, cada mistura de reação produzirá cadeias prematuramente terminadas de acordo com toda ocorrência de um didesoxinucleotídeo adicionado. Cada mistura é então separada em um gel de sequenciamento por eletroforese para se detectar cada um dos nucleotídeos presentes na seqüência de DNA lida.

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Métodos modernos - 454Um novo método de sequenciamento de DNA, usualmente chamado de

pirosequenciamento, foi desenvolvido pela Roche Applied Sciences [1]. Através deste método, pode-se sequenciar genomas de organismos diversos de uma maneira muito mais rápida e barata.

2.2.2. Técnica de PCR

Reacção em cadeia da polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction - PCR) é um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras.

Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas para diversas tarefas, como o sequenciamento de genes e diagnóstico de doenças hereditárias, identificação de fingerprint genético (usado em testes de paterninade e na medicina forense), detecção de diagnóstico de doenças infecciosas e criação de organismos transgênicos.

Diversas técnicas de biologia molecular estão hoje disponíveis para a detecção de variabilidade genética ao nível de sequência de DNA, ou seja, para a detecção de polimorfismo genético. Estas técnicas permitem a obtenção de um número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares cobrindo todo o genoma do organismo. Tais marcadores podem ser utilizados para as mais diversas aplicações.

O desenvolvimento tecnológico na área de marcadores moleculares tem sido fascinante e extremamente rápido. A tecnologia de DNA recombinante e o desenvolvimento da amplificação dos segmentos de DNA viam PCR (“Polymerase Chain Reaction”, ou a reação de polimerase em cadeia), abriram o caminho para uma mudança no paradigma genético básico: da inferência do genótipo a partir do fenótipo, onde Mendel foi o pioneiro, para a análise genética direta da variação na seqüência de DNA. Tecnologias de análise moleculares mais acessíveis e eficientes estão constantemente sendo aprimoradas. Métodos estatísticos acompanham este desenvolvimento, e têm permitido a manipulação de enormes quantidades de dados.

PCR é uma técnica poderosa, que envolve a síntese enzimática in vitro de milhões de cópias de um segmento específico de DNA na presença da enzima DNA polimerase. A reação de PCR se baseia no anelamento e extensão enzimática de um par de oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA de fita simples) utilizados como iniciadores (primers), que delimitam a seqüência de DNA de fita dupla alvo da amplificação. Estes primers são sintetizados artificialmente de maneira que suas seqüência de nucleotídeos sejam complementares às seqüências específicas que flanqueiam a região alvo.

O PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações do PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting. O PCR também é rotineiramente utilizado em procedimentos científicos de Biologia Molecular como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizado para identificação de patógenos que estão presentes em amostras como por a exemplo identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do papiloma humano e seus genótipos, HBV Vírus da Hepatite B. etc O PCR também é utilizado na paleontologia para o sequenciamento genico de animais pré-históricos.

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A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações.

Resultado da PCR após ser realizada uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida.

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96°C por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60°C dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72°C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2 ciclos

O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.

3 – NOÇÕES DE DIREITO PROCESSUAL PENAL

3.1. Sistemas Processuais- Criados com o objetivo de fazer justiça.- São identificados pelos Princípios da Legislação processual penal.

FUNÇÕES PROCESSUAISa) Acusarb) Defenderc) Julgar

SISTEMA ACUSATÓRIO

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Verdadeira relação processual.actum trium personarum = as diferentes funções processuais são entregues a diversas pessoas onde uma acusa, outra defende e uma terceira julga. Fundamentação: ninguém será processado senão em virtude de acusação de outro que lhe mova (Princípio da Iniciativa das partes). Presença das partes, às quais superpõe-se um terceiro imparcial. Nasceu na Roma antiga, com o objetivo de outorgar, a qualquer um do povo, o direito de acusar. Não alterou a essência, já que o MP faz a voz do povo Características: Contraditório como garantia do cidadão. Igualdade Processual = igualdade das partes sob o ponto de vista processual. Publicidade = o processo é público, fiscalizável pelo povo.Característica Secundária: Embora a publicidade sempre acompanhe tal sistema, a publicidade não é essencial para sua existência. Isso se prova pela hipótese em que é possível, em tese, um processo que respeite o contraditório e a igualdade e que seja sigiloso.

SISTEMA INQUISITÓRIOFunções concentradas em uma pessoa apenas, só há o juiz. Contrário ao sistema anterior. Vigorou no mundo patrocinado pela Igreja. Para o sistema, a confissão é a “rainha das provas” permitindo-se, para tal, inclusive, a tortura.Características: Não há contraditório = pois não há partes. Confissão como prova bastante para a condenação. Não há partes.Característica Secundária: Sigilo = hipoteticamente, é possível, em tese, haver as características acima citadas num processo que seja público.

SISTEMA MISTOHistoricamente, o sistema acusatório surge primeiro, mas nem ele nem o sistema inquisitório funcionaram. “A virtude está no meio”.FasesFase preliminar = polícia judiciária = sistema inquisitivo. Instrução Preparatória = sistema inquisitivo. Julgamento = sistema acusatório.

SISTEMA ADOTADO NO BRASILNo Brasil há na instrução preparatória o sistema inquisitivo.Portanto, no Brasil, o sistema adotado é o Sistema Acusatório, pois “inquérito policial” não é considerado processo, apesar de interferir de forma significativa no mesmo e até mesmo podendo influenciá-lo, em alguns casos.

3.2. Investigação Criminal3.3. Do Inquérito Policial

É procedimento administrativo, dispensável, presidido pelas autoridades policiais (delegado estadual e delegado federal), de caráter informativo (peça de informação), inquisitivo (não há ampla defesa, nem contraditório), que tem por finalidade colher provas da infração e indícios suficientes de autoria, viabilizando o exercício da ação penal (destinatário é o titular da ação penal).

Dos Indícios Ao delegado não e possível limitar antecipadamente qual vai ser sua linha de investigação. O

delegado não colhe provas, mas sim indícios. Indício é uma presunção sem certeza. O artigo 6°CPP, é um rol exemplificativo para o delegado; este baseia-se na sua

discricionariedade.Art. 6º Logo que tiver conhecimento da prática da infração penal, a autoridade policial deverá: I – dirigir-se ao local, providenciando para que não se alterem o estado e conservação das

coisas, até a chegada dos peritos criminais; II – apreender os objetos que tiverem relação com o fato, após liberados pelos peritos criminais; III – colher todas as provas que servirem para o esclarecimento do fato e suas circunstâncias; IV – ouvir o ofendido; V – ouvir o indiciado, com observância, no que for aplicável, do disposto no Capítulo III do Título

VII, deste Livro, devendo o respectivo termo ser assinado por duas testemunhas que lhe tenham ouvido a leitura;

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c Arts. 185 a 196 deste Código. VI – proceder a reconhecimento de pessoas e coisas e a acareações; VII – determinar, se for caso, que se proceda a exame de corpo de delito e a quaisquer outras

perícias; VIII – ordenar a identificação do indiciado pelo processo datiloscópico, se possível, e fazer juntar

aos autos sua folha de antecedentes; Direito Processual Penal – Ana Cristina Mendonça 39 Curso Aprobatum – 1º Semestre 2009

IX – averiguar a vida pregressa do indiciado, sob o ponto de vista individual, familiar e social, sua condição econômica, sua atitude e estado de ânimo antes e depois do crime e durante ele, e quaisquer outros elementos que contribuírem para a apreciação do seu temperamento e caráter.

O inquérito não é “formal” como procedimento, sendo sua forma pré-definida pela lei. Pode o delegado alterar a ordem e a forma de colheita dos indícios.

O inquérito policial é formal (escrito) à medida que o delegado deve seguir as formalidades legais, ex: o inquérito policial é escrito, o delegado deve rubricar todas as suas folhas. Isso não significa rito procedimental rígido. Não há nulidades na fase de inquérito, pois não se aplica a Teoria das Nulidades no Inquérito Policial.Exceções à discricionariedade do Delegado de Polícia:

1 - Diante do Exame de Corpo de Delito(crimes que deixam vestígios) 2 - Quando lavrar Auto de Prisão em Flagrante( imposição legal/cognição coercitiva), Não HÁ AUTO DE PRISÃO EM FLAGRANTE SEM INQUÉRITO POLICIAL, se lavrar tem que instaurar inquérito! 3- Quando existe requisição do MPO MP é o destinatário do Inquérito Policial (e não o juiz), por isso, quando o art. 10 do CPP diz que o inquérito será remetido para o “juiz”, deve ser lido “juízo”, pois se trata de atuação administrativa do juiz – critério de distribuição, para saber qual membro do MP vai atuar no caso, uma vez que é o MP quem irá requerer o que entender cabível.

NATUREZA JURÍDICA: Peça investigatória, escrita, inquisitória e sigilosa, preparatória da ação penal. É considerada por alguns autores como uma Instrução Provisória.

Quanto a instauração do inquérito policial, este pode ser:1) De oficio : Significa que o Inquérito Policial é iniciado por “ato voluntário” da autoridade

policial, sem que tenha havido pedido expresso de qualquer pessoa nesse sentido, é o “Princípio da Oficiosidade”. 1.1) Portaria: Quando o delegado de polícia fica sabendo da prática de um delito, deve baixar

a chamada “portaria”, que é peça inaugural do procedimento inquisitorial. Nesta a autoridade declara instaurado o Inquérito e determina as providências iniciais.

1.2) Auto de Prisão em Flagrante: Quando uma pessoa é presa em flagrante, deve ser encaminhada à Delegacia de Polícia. Nesta é lavrado o auto de prisão, que é o documento no qual ficam constando as circunstâncias do delito e da prisão. Lavrado o auto o Inquérito é instaurado. O flagrante será obrigatório se realizado pela autoridade policial e seus agentes, pois há o dever legal de se efetuar a prisão daquele que se ache em estado de flagrante delito, podendo incidir a autoridade, conforme o caso, em crime de prevaricação.

1.3) Auto de Resistência

2) Mediante Requisição do Juiz ou MP: Requisição é a exigência legal (o que não pode ser feito pelo ofendido), assim, quando o Juiz ou Promotor requisitam a instauração do inquérito, o delegado está obrigado a dar início às investigações, caso se recuse ou por outras causas não o faça, poderá dar causa a crime de prevaricação ou sanções administrativas. Aqui não é necessário baixar portaria, no entanto se o fizer não haverá problema. Poderá desde já pedir Diligências. É importante lembrar neste momento o “Princípio da Obrigatoriedade”, onde o MP não tem liberdade para decidir se vai ou não processar o réu.

3) A Requerimento do Ofendido

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4) Por Notícia de Qualquer do Povo 5) Mediante representação do ofendido

3.4. Da ProvaA prova é a soma dos fatos produtores de convicção do julgador dentro do processo. É o

conjunto de elementos produzidos pelas partes, ou pelo próprio Juiz, visando estabelecer dentro do processo, a existência de certos fatos.

São os meios de demonstrar a existência de um fato jurídico ou os meios destinados a fornecer ao julgador o conhecimento da verdade dos fatos deduzidos no processo.

A função da prova é formar a convicção do julgador sobre a veracidade ou não dos fatos alegados pelas partes. Primeiro cria a certeza, que, tornada inabalável pela exclusão de todos os motivos contrários, faz-se convicção.

3.5. Do Juiz, do Ministério Público, do Acusado e seu Defensor, dos Assistentes e Auxiliares da JustiçaDo JuizO juiz exerce o papel de maior relevo no processo. A lei confere-lhe os poderes necessários para zelar pelo processo e solucionar a lide. Para tanto, são necessários alguns pressupostos processuais subjetivos relativos à função de juiz. São eles:

Investidura: a jurisdição só pode ser exercida por quem tenha sido regularmente investido na autoridade de juiz, atualmente pela aprovação em concurso público de provas e títulos, observando-se nas nomeações a ordem de classificação (art. 93, inc. I, da Constituição Federal).

Imparcialidade: o juiz deve estar, no processo, acima e eqüidistante das partes, super et inter partes. Se presentes algumas das causas de suspeição (art. 254 do Código de Processo Penal), impedimento (art. 252 do Código de Processo Penal) ou incompatibilidade (art. 253 do Código de Processo Penal), o juiz deverá ser afastado do processo. Nos casos de impedimento, o juiz tem algum vínculo com uma das partes; são causas graves que afetam a imparcialidade, acarretando a inexistência do ato realizado pelo juiz impedido. Na suspeição, o juiz tem interesse no resultado do processo. Esta gera a nulidade absoluta do processo. Para parte da doutrina, o rol que trata do impedimento e da suspeição, por ser restritivo de direitos, é um rol taxativo que não pode ser ampliado.

Competência: o juiz deve ser o competente para julgar a lide, segundo as regras de competência previstas na Constituição Federal e no Código de Processo Penal.

Do Ministério Público (Acusador)Instituição permanente, essencial à formação jurisdicional do estado, incumbindo-lhe a defesa

da ordem jurídica, do regime democrático e dos interesses sociais e individuais indispensáveis. Exerce função de parte e de fiscal.

O acusador, no processo penal, é representado pelo Ministério Público, no caso da ação penal pública, e pelo querelante (ofendido ou seu representante legal), no caso de ação penal privada ou ação penal subsidiária da pública. O Ministério Público atuará sempre no processo penal, seja como parte na ação penal pública, seja como custus legis, isto é, fiscal da lei na ação penal privada.

Conforme o art. 68 do Código de Processo Penal, o Ministério Público também tem legitimidade para promover a ação civil ex delicto em nome do ofendido. Nesse caso, o Ministério Público atua como substituto processual.

A Constituição Federal, no art. 129, relaciona as funções institucionais do Ministério Público e prevê, no § 2.º, que essas funções só podem ser exercidas por integrantes da carreira. A Constituição Federal vedou a possibilidade do promotor ad hoc, isto é, a nomeação de uma pessoa que faça as vezes do promotor para algum ato processual.

O Ministério Público, porque exerce a acusação pública, possui algumas peculiaridades, como a possibilidade de impetrar habeas corpus e de recorrer em favor do réu; além disso, seus membros estão sujeitos à disciplina das suspeições e impedimentos, entre outras. Uma vez que atuam em nome da instituição e não em nome próprio, podem ser substituídos no curso do processo, proibindo-se, entretanto, designações discricionárias feitas pelo Procurador-Geral de Justiça.

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Os membros do Ministério Público não se encontram subordinados, quer ao Poder Executivo, quer ao Judiciário, possuindo total independência.

Do AcusadoO acusado é aquele contra quem se dirige a pretensão punitiva. É o sujeito passivo da relação

jurídico-processual. O acusado deve ser identificado com o nome e com os demais dados. O Código de Processo Penal permite a propositura da ação penal somente com a descrição das características físicas do indivíduo.

É necessário que o acusado tenha capacidade para ser parte (sujeito de direitos e obrigações) e capacidade para estar em juízo em nome próprio, o que advém com a idade de 18 anos. Ao acusado menor de 21 anos, será nomeado curador, que poderá ser advogado ou outra pessoa idônea. Se o acusado teve a assistência de defensor dativo, a falta de curador não anula o processo, conforme a Súmula n. 352 do Supremo Tribunal Federal.

Não podem ser acusadas as pessoas que dispõem de imunidade parlamentar ou diplomática.O acusado que, citado pessoalmente, não comparecer ao interrogatório, será considerado

revel.A Constituição Federal previu a possibilidade de a pessoa jurídica ser o sujeito passivo da

infração penal nos casos de crime contra a economia popular, contra a ordem econômica e financeira e nas condutas lesivas ao meio ambiente.

A Constituição Federal prevê uma série de garantias ao acusado no processo penal, entre as quais:

• o direito ao respeito à integridade física e moral;• o direito ao devido processo legal;• o direito ao contraditório e à ampla defesa, que inclui a autodefesa e a defesa técnica feita

por defensor;• o direito ao silêncio.O acusado poderá, sem o defensor: impetrar habeas corpus, interpor recurso, interpor revisão

criminal, pagar fiança arbitrada pelo juiz e argüir suspeição.

Do DefensorO defensor não é sujeito processual, mas sim o representante do acusado, que age em nome e

no interesse dele. Exerce a defesa técnica do acusado, que é tão importante e indisponível que poderá ser exercida ainda que contra a vontade do representado ou mesmo na sua ausência. No processo penal, o contraditório e a ampla defesa são efeitos. A ciência e a participação são necessárias.

A ampla defesa, no processo penal, constitui-se de autodefesa, feita pelo próprio acusado no interrogatório, e de defesa técnica, desempenhada por pessoa legalmente habilitada, o advogado (art.133 da Constituição Federal).

Se o acusado não possuir defensor constituído, também chamado de procurador, o juiz irá nomear-lhe um defensor, chamado de defensor dativo. Se o acusado possuir habilitação técnica, ele mesmo poderá defender-se.

A constituição do defensor faz-se por meio de outorga de procuração com cláusula ad judicia. A constituição do defensor pode ser também apud acta, isto é, o próprio acusado em seu interrogatório indica quem é seu defensor.

Para a realização de alguns atos no processo, o defensor precisa de poderes especiais, como poderes para argüir a suspeição, argüir falsidade de documento e concordar com perdão do querelante.

Conforme entendimento do Supremo Tribunal Federal, o defensor dativo não tem a obrigação de recorrer, mas, se o acusado interpuser recurso, o defensor dativo tem a obrigação de arrazoar o recurso.

A intimação do defensor dativo é feita pessoalmente e a intimação do defensor constituído é feita por publicação na imprensa oficial. A Lei n. 1.060/50, art. 5.º, § 5.º, que trata da assistência judiciária, prevê o prazo em dobro para o defensor público. A jurisprudência estende a prerrogativa do prazo em dobro ao defensor dativo e aos advogados com convênio na Procuradoria-Geral do Estado.

A falta do defensor, ainda que motivada, não implica adiamento do ato processual, devendo o juiz nomear ao réu um substituto ad hoc para o ato.

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3.6. Processos dos crimes de responsabilidade dos funcionários públicos.O procedimento dos crimes funcionais é aplicado a todos os crimes em que a condição de

funcionário público funcione como elementar ou circunstância do tipo penal. Ex.: o Título XI, Capítulo I, do Código Penal aborda os crimes praticados por funcionário público contra a AdministraçãoPública, e o Capítulo IV trata dos crimes praticados contra as finanças públicas.

O procedimento dos crimes funcionais segue o rito ordinário após o recebimento da denúncia ou queixa subsidiária; a peculiaridade que o torna especial é a possibilidade de o funcionário apresentar defesa preliminar antes do recebimento da peça inicial.

Para tanto, o acusado é notificado com prazo de 15 dias para se defender (art. 514 do CPP). Se não for encontrado, ser-lhe-á nomeado defensor dativo para exibir a resposta preliminar.

O próprio acusado pode apresentar a defesa preliminar, mesmo não sendo advogado.Descumprida essa formalidade prévia, a nulidade é relativa (anulam-se os atos seguintes

mediante comprovação de prejuízo). Essa é a orientação do Supremo Tribunal Federal. Nada obstante, consigna-se a posição minoritária do Professor Tourinho a favor da existência de nulidade absoluta pela violação do contraditório e da ampla defesa.

O objetivo da defesa preliminar é evitar que ocupantes de cargos públicos sejam alvo de acusação infundada, tendo aplicação apenas aos crimes funcionais afiançáveis (são inafiançáveis o excesso de exação e a facilitação do contrabando e descaminho – arts. 316, § 1.º, e 318, do CP).P.: Há algum meio para garantir a apresentação da defesa preliminar?R.: Sim, pela correição parcial, caso o juiz não conceda a oportunidade para a sua apresentação.P.: Se o funcionário público, aposentado ou exonerado, for processado por um fato que praticou enquanto exercia a função de funcionário público, terá direito a defesa preliminar?R.: O entendimento atual é no sentido de não ter direito à defesa preliminar, em razão da revogação da Súmula n. 394 do Supremo Tribunal Federal. A súmula não se refere a esse procedimento, mas o fundamento de sua revogação é o mesmo dessa questão.A súmula determinava que: “Cometido o crime durante o exercício funcional, prevalece a competência especial por prerrogativa de função, ainda que o inquérito policial ou a ação penal sejam iniciados após a cessação daquele exercício”.Com o cancelamento dessa súmula, os fatos ocorridos durante a existência do foro especial são processados após o término dessa prerrogativa na primeira instância e não no foro especial, pois este existe em razão da função que a pessoa desempenha (do cargo), não se tratando de um privilégio individual.Ex.: se um funcionário público pratica um crime durante o exercício de sua função, mas só vem a ser processado quando já estava aposentado ou exonerado, não será adotado o procedimento que permite a defesa preliminar, mas sim o procedimento comum.Verificado o concurso de agentes no crime, os co-autores e partícipes, que não sejam funcionários públicos, não serão notificados para a apresentação da defesa preliminar – pois não possuem essa faculdade.

Conforme entendimento do Supremo Tribunal Federal, o recebimento da denúncia ou da queixa deve ser fundamentado. Isso porque os crimes funcionais têm o contraditório antecipado na defesa preliminar. Trata-se de exceção, pois, em regra, no despacho que recebe ou rejeita a denúncia ou a queixa não há fundamentação. Recebida a denúncia ou a queixa, o acusado é citado – seguindo-se o procedimento ordinário.

4 – LEGISLAÇÃO EXTRAVAGANTE

4.1 10. Código de Trânsito Brasileiro (Lei n° 9.503/97)