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RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS:

TESTES DE SENSIBILIDADE

Em 1928, Alexander Fleming observou a inibição do crescimento

de S. aureus ao redor das colônias de um fungo (Penicillium

notatum) que havia contaminado a placa.

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RESISTÊNCIA INTRÍNSECA OU ADQUIRIDA:

Emprego generalizado e indiscriminado de antibióticos

Originada por mutação ou transferência genética

MUTAÇÕES: mutações pontuais, transposição de segmentos

de genes, inserções, deleções, inversões

TRANSFERÊNCIA GENÉTICA: plasmídeos, bacteriófagos,

transposição de genes (do plasmídeo para o cromossomo)

MECANISMOS DE RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS

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As bactérias se tornam resistentes por meio de 4 mecanismos: I

I. Destruição ou inativação da droga por enzimas bacterianas

As β-lactamases destroem o local de ligação dos antimicrobianos

β-lactâmicos (proteínas de ligação da penicilina ou PLPs).

Ex. Staphylococcus aureus e penicilinas.

II. Prevenção da penetração dentro do MO (contra tetraciclinas)

Ocorre alteração na porina específica da membrana celular.

Bacilos Gram-negativos à penicilina, eritromicina, clindamicina e

vancomicina e pela resistência de Pseudomonas aeruginosa ao

trimetoprim e imipenem.

.

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III. Alteração dos sítios alvos das drogas (troca de aas contra

macrolídeos)

Staphylococcus aureus resistente à oxacilina e estafilococos

coagulase-negativos resistente à antibimicrobianos β-lactâmicos.

Um gene transportado por plasmídeo ou por transposon codifica uma

enzima que inativa os alvos ou altera a ligação dos antimicrobianos

como ocorre com eritromicina e clindamicina.

IV. Efluxo rápido (ejeção) que bombeia a droga para fora da

célula antes do efeito iniciar.

A resistência às tetraciclinas codificada por plasmídeos em

Escherichia coli resulta deste efluxo ativo.

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PLAMÍDEOS E TRANSPOSONS

Plasmídeo são fragmentos de DNA auto-replicantes, circulares,

contendo genes.

Fatores R (resistência): De importância médica. Plasmídeos que

transferem características de resistência à antibióticos, metais

pesados e toxinas celulares.

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TESTES DE SENSIBILIDADE MICROBIANA

O padrão de sensibilidade de muitos microrganismos geralmente

é previsível.

O médico deve saber a sensibilidade de um patógeno antes do

tratamento por antibióticos.

Após a identificação do patógeno (gênero e espécie) é

fundamental a determinação da terapia.

A susceptibilidade de um MO pode mudar com o tempo ou

mesmo durante a terapia.

A freqüência de antibióticos no ambiente hospitalar e na

comunidade aumentou a resistência de muitos patógenos

importantes em humanos como Staphylococcus aureus e

Neisseria gonorrhoeae.

Os testes de susceptibilidade são indicados quando:

(1) O microrganismo envolvido é frequentemente resistente às

drogas antimicrobianas (ex. bactérias gram-negativas

entéricas);

(2) Um processo infeccioso é mortal se não tratado

especificamente;

(3) Em certas infecções que requerem o uso de drogas que são

rapidamente bactericidas.

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DUAS CATEGORIAS DE TESTES

Diluição em Caldo de CulturaMétodo do disco de difusão

Qualitativos (disco de difusão) Quantitativos (valor CIM ou MIC)

Fita com gradiente: Etest

TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO

Utiliza um disco com papel de filtro impregnado com

antimicrobiano colocado sobre o ágar.

A leitura da área de inibição é feita com medição do diâmetro (Ø)

do halo em milímetros.

Três categorias de resultados

são utilizados:

Sensível

Sensibilidade intermediária

Resistente

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São armazenados sob refrigeração (2 a 8° C) e possuem validade

de um ano. Antes do uso manter fora da geladeira de 1 a 2 horas.

Ambas as faces são impressas com a sigla do antibiótico,

separados em cores de acordo com seu grupo.

Os discos para antibiogramas são acondicionados em cartuchos

com 50 unidades cada, em uma embalagem protegida contra a

umidade por sílica.

Antibiótico Concentração em disco (µg)

Amicacina 30

Amoxicillina 25

Ampicillina 10

Azitromicina 15

Bacitracina 130

Cefaclor 30

Cefalexina 30

Clindamicina 2

Eritromicina 5

Gentamicina 10

Imipenem 10

Rifampicina 2

Tetraciclina 10

Trimetropim 2,5

Vancomicina 30

As concentração são conforme as indicações da NCCLS

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Meios padronizados proporcionam resultados reproduzíveis.

O ICSST (International Collaborative Study of Susceptibility Testing)

recomenda que o meio deverá:

Ter alta qualidade,

Possibilitar o crescimento da maioria dos patógenos

Não ser antagonista dos agentes antimicrobianos empregados

Deverá ser isotônico

Não alterar o pH significativamente durante o crescimento

microbiano.

FATORES QUE INFLUENCIAM O TESTE

MEIO DE CULTURA

Ágar Mueller-Hinton (método Kirby-Bauer) NCCLS (National

Committee for Clinical Laboratory Standards)

Streptococcus, S. aureus e E. coli necessitam de piridoxina;

Sangue lisado para Neisseria spp. e Streptococcus.

MEIO DE CULTURA

Afeta o Ø do halo, ou seja, um meio com pouca profundidade

aumenta a difusão e o tamanho do halo.

Ideal 25 mL de meio em placa de 90 mm de Ø, ou 4 mm de

profundidade.

PROFUNDIDADE DO ÁGAR

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Em média o pH deverá ser estável em torno de 7,2 a 7,4.

Aminoglicosídeos, macrolídeos, lincomicina, e cefalosporinas =

melhor em pH alcalino.

Tetraciclina, meticilina, novobiocina e pirazinamida = melhor em pH

ácido.

Para evitar que o inóculo cresça antes da colocação do disco ou

ocorrer a pré-difusão do antimicrobiano, o inoculo deverá:

Ser semeado após 15 minutos da preparação da placa de ágar.

Aguardar mais 15 minutos e colocar o disco.

Passados mais 15 minutos, incubar com as placas invertidas.

pH

PRÉ-DIFUSÃO E PRÉ-INCUBAÇÃO

Procedimentos padrões requer o uso de concentrações

padronizadas de inóculo em solução salina estéril.

Utiliza-se uma escala de Mac Farland de 0,5 para comparação visual.

Nesta escala há aproximadamente 1,5 x 108 unidades formadoras de

colônias (UFC)/mL.

Umedecer um swab na solução com bactérias padronizada e semear

na placa de Mueller-Hilton.

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TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO

Após a semeadura, adicionar os discos de antibióticos.

As placas são incubadas de 30 a 37C, com leitura de 16 a 24

horas, com ou sem CO2 (dependendo do patógeno).

Uma placa de 90 mm poderá ter 6 discos, um representante de

cada classe e a escolha é pelo menos ativo.

Utilizar uma cepa padrão como controle (S. aureus NCTC 6571; E.

coli NCTC 10418).

MÉTODO QUALITATIVO DO DISCO DE DIFUSÃO

Sensibilidade ao antibiótico numa

concentração fixa em disco

SR

Zona de inibição

Zona de inibição=

Sensível ao quimioterápico.

Sem halo ou zona de

inibição= Resistente.

Determinação do diâmetro do halo de

inibição

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Sensíveis: As bactérias são sensíveis às doses comuns.

Resistente: Não é provável que as

bactérias respondam à terapêutica com o antibiótico.

Sensibilidade intermediária ou Sensibilidade

Dose Dependente (SDD): Depende da

concentrações alcançadas no sítio infeccioso ou

se o MO é sensível à terapêutica de infecções

sistêmicas no caso de altas doses do antibiótico.

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Arraste da zona de inibição, causada pelo deslizamento do disco

no meio.

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Cepa bacteriana resistente (?????????????)

Ao invés de disco, usa-se uma fita graduada contendo

antimicrobiano. Determina:

Sensibilidade ao antibiótico;

Concentração de antibiótico: MIC=Concentração Inibitória Mínima*

QUANTITATIVOS: Etest

*Concentração inibitória mínima (MIC): concentração que resulta

em 99% de inibição (mínimo que deve atingir o sítio de ação).

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Campana et al., 2011

Cultura

em caldo

Cultura em caldo + Tetraciclina µg/mL

1248163264

MIC= 4 µg/mL

Determinada com uma mistura da droga antimicrobiana + meio

líquido + inóculo padronizado.

O teste em caldo determina a Concentração Inibitória Mínima

de uma droga (CIM ou MIC).

TESTES DE DILUIÇÃO EM CALDOS DE CULTURAS

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Podem ser usados em sistemas de automação ou

de leitura de placa de ELISA.

Suscetibilidade ao voriconazol de espécies Candida a um agente

antifúngico.

Discos impregnados com 1 µg de voriconazol são usados para

testar a suscetibilidade de leveduras.

Concentração Inibitória Mínima

(CIM em µg/mL)

Suscetível

(S)

Suscetibilidade

Dose-dependente (S-DD)

Resistente

(R)

≤ 1,0 2,0 ≥ 4,0

Difusão do Disco

(zona de diâmetro em mm)

Suscetível

(S)

Suscetibilidade

Dose-dependente (S-DD)

Resistente

(R)

≥17 14-16 ≤ 13