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WESLEY LYEVERTON CORREIA RIBEIRO BIOATIVOS VEGETAIS LIVRES E NANOENCAPSULADOS NO CONTROLE DE NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE PEQUENOS RUMINANTES FORTALEZA - CEARÁ 2017 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
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JESSICA MARIA LEITE DOS SANTO
WESLEY LYEVERTON CORREIA RIBEIRO
BIOATIVOS VEGETAIS LIVRES E NANOENCAPSULADOS NO
CONTROLE DE NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE PEQUENOS
RUMINANTES
FORTALEZA - CEARÁ
2017
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
2
WESLEY LYEVERTON CORREIA RIBEIRO
BIOATIVOS VEGETAIS LIVRES E NANOENCAPSULADOS NO
CONTROLE DE NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE PEQUENOS
RUMINANTES
FORTALEZA - CEARÁ
2017
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Doutor em Ciências
Veterinárias. Área de Concentração:
Reprodução e Sanidade Animal.
Orientadora: Profa. Dra. Claudia Maria Leal
Bevilaqua
3
4
5
Aos meus pais,
Dedico.
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AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Ceará, minha eterna Alma mater.
À Faculdade de Veterinária da UECE e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias por disponibilizarem suas estruturas físicas para o desenvolvimento do projeto de
doutorado.
Ao setor de transporte da UECE pelo fornecimento de transporte para realização dos testes a
campo.
Ao Laboratório de Química de Biopolímeros da UFC.
Ao Laboratório de Microscopia e Microanálise do Centro de Tecnológias Estratégicas do
Nordeste por disponibilizar suas estruturas físicas para realização da microscopia eletrônica de
varredura.
À Fazenda Guedeslândia (Jaguaretama/CE) pelo apoio logístico na execução da etapa in vivo
deste trabalho.
Ao INRA e seus pesquisadores pelo acolhimento e aprendizagem durante estágio de cooperação
técnica.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo fornecimento
da bolsa de pós-graduação.
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnlógico pelo suporte
financeiro para realização de parceria internacional com o Institut National de la Recherche
Agronomique (INRA, Nouzilly, França).
Agradeço imensamente a Deus por ter guiado meus pensamentos e atitudes durante minha
existência.
Agradeço a minha mãe, Maria Milene Correia Ribeiro, e ao meu pai, Francisco Blanchard
Lopes Ribeiro por todo amor e apoio durante essa longa jornada de formação moral e
intelectual.
Agradeço a toda minha família por ter me apoiado, em especial ao meu irmão Blanchard Júnior,
a minha irmã Thyciane Ribeiro.
Agradeço as minhas sobrinhas Ana Júlia e Laís Ribeiro, pequenos seres tão cheios de luz, por
alegrar nossas vidas!
Aos meus avós maternos, João Correia (in memoriam) e Lourdes Queiróz (in memoriam), e aos
meus avós paternos, João Ribeiro e Edirlene Lopes (in memoriam), fontes inesgotáveis de
sabedoria e amor, agradeço!
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Ao meu amado Eduardo Roger por todo apoio, carinho e força para alcançar essa vitória. Você
faz parte dessa conquista!
Aos meus dois dogs, amados membros da família, Bob (Marley) e Cyndi (Lauper) por estarem
ao meu lado há 12 anos, inclusive neste exato momento!
A minha querida orientadora, Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua, pelo seu exemplo, dedicação
e ensinamentos ao longo desses oito anos em que tenho integrado a família LABODOPAR.
Uma orientadora para a vida!
Ao Dr. Haroldo César Beserra de Paula por sua colaboração na orientação das etapas de
obtenção e avaliação físico-química do produto nanoformulado.
Ao Dr. Jacques Cabaret, pela orientação e recepção no INRA, França.
À Dra. Janaína Melo pela colaboração da execução da microscopia eletrônica de varredura no
CETENE/MCTIC
A todos os membros do LABODOPAR/UECE agradeço pela amizade e companheirismo. Em
especial a Dra. Iara Macedo, Dra. Ana Lourdes, Dra. Fernanda Rondon, Dra. Jéssica Santos,
Msc. Weibson Andre, Msc. Géssica Cavalcante e ao M.V. Vilemar Araújo, a colaboração dos
(a) senhores (as) foi essencial.
Aos membros do LABIOPOL/UFC, Msc. Érick Falcão e Msc. Vanessa Pereira pela
colaboração na execução das etapas de avalição físico-química dos produtos.
Agradeço a Sra. Adriana Albuquerque e Maria Moura (Ely), funcionárias do PPGCV/UECE
por toda colaboração ao longo desses anos de pós-graduação.
Ao ex-coordenador do PPGCV, Prof. Dárcio Ítalo, e ao atual, Prof. Davide Rondina, por tão
bem conduzirem esse programa de excelência internacional.
Aos membros da banca examinadora, Dr. Luiz da Silva Vieira, Dra. Lorena Mayana Beserra de
Oliveira, Dra. Iara Tercia Freitas Macedo, Dra. Maria Vivina Barros Monteiro e Dra. Ana
Lourdes Camurça Fernandes Vasconcelos por suas contribuições na escrita da tese.
Aos animais que integraram as fases experimentais deste estudo que de maneira tão nobre
colaboraram para o progresso a ciência. Meus mais sinceros agradecimentos!
Enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para que fosse possível a realização
deste trabalho, meu muito obrigado.
8
“Foi o tempo que dedicastes à tua rosa
que a fez tão importante”.
(Antoine de Saint-Exupéry)
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RESUMO
Um dos maiores entraves da ovinocaprinocultura no Nordeste do Brasil é o parasitismo por
nematoides gastrintestinais (NGI). A ocorrência da resistência anti-helmíntica em rebanhos
dessa região, tem favorecido investigações sobre o uso de métodos alternativos, tais como o
tratamento alvo-seletivo e o uso de plantas medicinais, no controle de NGI de pequenos
ruminantes. Assim, objetivou-se avaliar o efeito de bioativos vegetais nas formulações livre e
nanoencapsulada sobre NGI de ovinos. Na etapa 1, selecionou-se Spigelia anthelmia por ter
apresentado os melhores resultados para extratos vegetais investigados pelo Laboratório de
Doenças Parasitárias da Universidade Estadual do Ceará. O decocto de S. anthelmia (DecSa)
foi inicialmente submetido a avaliações fitoquímicas e, posteriormente, utilizado no teste de
eclosão de ovos (TEO), no teste de desenvolvimento de larvas (TDL), teste de motilidade em
adultos (TMA) e na avaliação de alterações cuticulares ultra-estruturais de Haemonchus
contortus por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Foram realizados testes de
toxicidade aguda em camundongos e de redução da contagem de ovos nas fezes (RCOF) em
ovinos. O rastreio fitoquímico detectou altas concentrações de taninos condensados,
flavonóides, flavonas, saponinas, alcalóides e xantonas. Os valores de CE50 ± 95% de intervalo
de confiança de DecSa no TEO e TDL foram 1,4 (1,2-1,6) e 1,2 (1-1,3) mg/mL,
respectivamente. O tratamento com 1,6 mg/mL DecSa produziu 100% de inibição da
motilidade de adultos após 12 h de exposição. A MEV revelou alterações ultraestruturais na
região cefálica e na cutícula de fêmeas de H. contortus. No teste de toxicidade aguda, não houve
mortalidade em camundongos na dose de 2.000 mg/kg. O DecSa na concentração de 350
mg/mL reduziu o opg dos ovinos em 47% após 14 dias de tratamento. Na etapa 2, o óleo
essencial de Eucalyptus staigeriana foi nanoformulado com quitosana com vistas a otimizar
seus efeitos sobre NGI de pequenos ruminantes. A caracterização físico-química da
nanoemulsão de E. staigeriana (NanoEs) foi realizada. Posteriormente, realizou-se testes in
vitro para avaliar as atividades ovicidas e larvicidas de NanoEs sobre H. contortus e testes
toxicologicos em roedores. NanoEs inibiu a eclosão de larvas e o desenvolvimento das larvas
em 99% e 96,3% nas concentrações de 1 e 8 mg/mL, respectivamente. O teste de toxicidade
aguda revelou que a dose de NanoEs necessária para matar 50% dos camundongos (DL50) foi
de 1.603,9 mg/mL. Na etapa 3, a avaliação in vivo do NanoEs foi realizada em uma fazenda
comercial, onde 162 ovinos machos e fêmeas, divididos em três grupos (n = 54 cada), foram
tratados durante seis meses a cada 17 dias quando o escore FAMACHA foi 3, 4 ou 5: G- 250
mg/kg de NanoEs; 7,5 mg/kg de levamisol (G-Lev) (controle positivo) e G-Neg não foi tratado
10
(controle negativo). Realizou-se a contagem de ovos por grama de fezes (OPG) e a identificação
dos gêneros de nematoides mais prevalentes no rebanho. O ganho de peso dos ovinos foi
monitorado. Não houve diferença significativa entre o número de animais tratados e de OPG
nos grupos tratados com NanoEs e levamisol em nenhuma visita (P>0,05). Haemonchus spp.
foi o nematoide mais prevalente em todos os grupos avaliados. Não houve ganho de peso
singnificativo em nenhum dos grupos tratados (P>0,05). Assim, após a execução das três etapas,
conclui-se que os bioativos testados apresentaram eficácia promissora no controle de
nematoides gastrintestinais. Entretanto, novas formulações e testes em condições a campo no
período chuvoso são necessários para validar e otimizar o efeito anti-helmíntico desses
produtos.
Palavras-chave: Pequenos ruminantes. Nematoides gastrintestinais. Fitoterapia. Eucalyptus
staigeriana. Spigelia anthelmia.
11
ABSTRACT
One of the major problems of ovine and caprine breeding in northeastern Brazil is parasitism
by gastrointestinal nematodes (NGI). The occurrence of anthelmintic resistance in herds in this
region has favored investigations on the use of alternative methods, such as the target-selective
treatment and the use of medicinal plants, in the control of small ruminants NGI. Thus, the
objective of this study was to evaluate the effect of plant bioactives on free and
nanoencapsulated formulations on NGI of sheep. In stage 1, Spigelia anthelmia was selected
because it presented the best results for plant extracts investigated by the Laboratory of
Parasitary Diseases of the State University of Ceará. The S. anthelmia decoction (SaDec) was
initially submitted to phytochemical evaluations and later used in the egg hatch test (EHT),
larval development test (LDT), adult worms motility test (WMT) and evaluation of
ultrastructural cuticular alterations of Haemonchus contortus by means of scanning electron
microscopy (SEM). Acute toxicity tests in mice and fecal egg count reduction test (FECRT) in
sheep were performed. By phytochemical screening we detected high concentrations of
condensed tannins, flavonoids, flavones, saponins, alkaloids and xanthones. The effective
concentration 50% (EC 50) ± 95% and confidence interval for SaDec in EHT and LDT were
1.4 (1.2-1.6) and 1.2 (1-1.3) mg/mL, respectively. Treatment with 1.6 mg/mL SaDec produced
100% inhibition of adult motility after 12 h of exposure. SEM showed ultrastructural changes
in the cephalic region and in the cuticle of H. contortus. In the acute toxicity test, there was no
mortality in mice at 2,000 mg/kg SaDec. The decoction at 350 mg/mL reduced the egg counts
per gram of feces (epg) of sheep by 47% after 14 days of treatment. In step 2, the Eucalyptus
staigeriana essential oil was nanoformulated with chitosan in order to optimize its effects on
small ruminants GIN. The physical-chemical characterization of E. staigeriana nanoemulsion
(EsNano) was performed. Subsequently, in vitro tests were performed to evaluate the ovicidal
and larvicidal activities of EsNano on H. contortus and toxicological tests in rodents. EsNano
inhibited larval hatching and larval development by 99% and 96.3% at concentrations of 1 and
8 mg/mL, respectively. The acute toxicity test revealed that the dose of EsNano required to kill
50% of the mice (LD50) was 1603.9 mg/mL. In stage 3, an in vivo evaluation of NanoEs was
performed in a commercial farm where 162 male and female sheep divided into three groups
(n = 54 each), were treated for six months every 17 days, when the FAMACHA score was 3 ,
4 or 5: G-250 mg/kg of NanoEs; 7.5 mg/kg levamisole (G-Lev) (positive control) and G-Neg
was not treated (negative control). The epg and the identification of the most prevalent
nematode genera in the herd were performed. The weight gain of the sheep was monitored.
12
There was no significant difference between the number of treated and OPG animals in both
the EsNano and levamisole treated groups at any visit (P> 0.05). Haemonchus spp. was the
most prevalent nematode in all groups evaluated. There was no significant weight gain in any
of the treated groups (P> 0.05). Thus, after performing the three steps, we conclude that the
bioactives tested showed promising efficacy in the control of gastrointestinal nematodes.
However, new formulations and tests in field conditions in the rainy season are necessary to
validate and optimize the anthelmintic effect of these products.
Keywords: Small ruminants. Gastrointestinal nematodes. Phytotherapy. Eucalyptus
staigeriana. Spigelia anthelmia
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo evolutivo de Haemonchus contortus em condições
ambientais ideais. Adaptado de Zacharias (2004).........................
23
Figura 2 - Folhas, fruto e flores de Spigelia anthelmia. Adaptado de
https://hiveminer.com/Tags/wormbush (Acesso em 6 nov.
2017)..........................................................................................
35
Figura 3 - Folhas de Eucalyptus staigeriana. Adaptado de Fonte:
https://www.well-edis.fr/42-huile-essentielle-d-eucalyptus-
staigeriana.html (Acesso em 6 nov. 2017).......................................
38
Figura 4 - Estrutura química da quitosana [poly (β1→4-D-glucosamina)].
Adaptado de Agnihotri; Mallikarjurna; Aminabhavi (2004)......
40
CAPÍTULO 1
Figure 1- The effect of Spigelia anthelmia decoction (SaDec) on the
inhibition of adult Haemonchus contortus motility. Phosphate
buffered saline (1 mL) containing 4% penicillin/streptomycin
was used as the negative control. The positive control was 100
µg/mL ivermectin. The error bars indicate standard deviation
of the mean (P<0.05)……………………………………………..
60
Figure 2 - A scanning electron microscopy image showing ultrastructural
changes in the cephalic region and cuticle of adult female
Haemonchus contortus after incubation in 1 mL phosphate
buffered saline (PBS) containing 4% penicillin/streptomycin
(A1 and B1) (negative control) or 0.8 mg/mL Spigelia anthelmia
decoction (A2 and B2)……………………………………………..
61
14
CAPÍTULO 3
Figure 1 - Infrared spectra of the sample of Eucalyptus staigeriana
nanoemulsion (EsNano), Eucalyptus estaigeriana essential oil
(EsEO) and 1% chitosan solution………………………………..
103
Figure 2 - Sheep (%) with EsNano (FAMACHA scores 3, 4 or 5) treated
with Eucalyptus staigeriana nanoemulsion (G-EsNano; 250 mg
kg-1) or levamisole (G-Lev; 7.5 mg kg-1) in a semi-arid region of
Northeastern Brazil from April to September 2013. *A specific
point on the rainfall curve refers to the accumulated rainfall
(mm) on day 17 before each visit………………………………….
104
Figure 3 - Figure 3. The mean (standard error) egg per gram (epg) of feces
in sheep treated with Eucalyptus staigeriana nanoemulsion (G-
EsNano; 250 mg kg-1) or levamisole (7.5 mg kg-1) and in
untreated animals (G-Neg) in a semi-arid region of
Northeastern Brazil from April to September 2013. The
significance level was 5%.................................................................
105
15
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Table 1 - Mean effects (± standard deviation) of Spigelia anthelmia
decoction on Haemonchus contortus in the egg hatching test
(EHT) and larval development test (LDT)....................................
59
Table 2 - The egg counts per gram of feces (epg) and percentage efficacy
± 95% confidence interval (95% CI) of 350 mg/ml Spigelia
anthelmia decoction (SaDec) in the fecal egg count reduction test
(FECRT)...........................................................................................
62
Table 3 - Prevalence (%) of nematode genera in the fecal egg count
reduction test (FECRT) on days 0, 7 and 14 post-treatment…….
63
CAPÍTULO 2
Table 1 - Composition of Eucalyptus staigeriana essential oil (%)………... 83
Table 2 - Mean effects (± standard error) of Eucalyptus staigeriana
nanoemulsion and Eucalyptus staigeriana essential oil on
Haemonchus contortus egg hatching……………………………...
84
Table 3 - Mean effects (± standard error) of Eucalyptus staigeriana
nanoemulsion (EsNano) and Eucalyptus staigeriana (EsEO)
essential oil on Haemonchus contortus larval development...........
85
Table 4 - Hematological parameters (± standard error) of albino
Wistar rats (n=24) before and after treatments with 866.5 mg/kg
(LD10) and 433.3 mg/kg (Half LD10) Eucalyptus staigeriana
nanoemulsion……………………………………………………….
86
CAPÍTULO 3
Table 1 - The mean (± standard error) sheep weights at the beginning and
at the end of the treatment with E. staigeriana nanoemulsion (G-
EsNano) and levamisole (G-LEV) and in untreated animals (G-
Neg) from April to September 2013………………………………
106
16
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C Graus Celsius
β Beta
µL Microlitro
BODCOM Escore de condição corporal
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
C. martinii Cymbopogon martinii
C. schoenanthus Cymbopogon schoenanthus
CE50 Concentração efetiva para inibir 50%
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
DecSa Decocto de Spigelia anthelmia
DISCO Escore de diarreia
DL50 Dose letal para matar 50% da população
DW dry weight
EC50 Effective concentration to inhibit 50%
EHT Egg hatch test
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
epg eggs per gram of faeces
EsNano Eucalyptus staigeriana nanoemulsion
FECRT Fecal egg count reduction test
FAMACHA Faffa Malan Chart
FUNCAP Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e
Tecnológico
g Grama
GAE Gallic acid equivalentes
GIN Gastrointestinal nematodes
G-Lev Grupo levamisol
G-NanoEs Grupo Nanoemuslão de Eucalyptus staigeriana
G-Neg Grupo Controle negativo
h Hora
H. contortus Haemonchus contortus
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
17
ISE Inbred-susceptible-Edinburgh
kg Quilograma
L1 Larva de 1º estágio
L2 Larva de 2º estágio
L3 Larva de 3º estágio
L4 Larva de 4º estágio
LABIOPOL Laboratório de Biopolímeros
LABODOPAR Laboratório de Doenças Parasitárias
LD50 lethal dose to kill 50% of population
LDT Larval development test
M. piperita Mentha piperita
MEV Microscopia eletrônica de Varredura
mg Miligrama
mL Microlitro
n Número
MCTIC Ministério da Ciência, Tecnológia, Inovações e Comunicações
NanoEs Nanoemulsão de Eucalyptus staigeriana
NGI Nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes
opg Ovos por grama de fezes
PCR Polymerase Chain Reaction
pH Potencial de hidrogênio
PIB Produto Interno Bruto
PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
PV Peso vivo
RCOF Resistência anti-helmíntica
S. anthelmia Spigelia anthelmia
SaDec Spigelia anthelmia decoction
SEM Scanning electron microscopy
SNP Polimorfismo de nucleotídeo único
TCs Taninos condensados
TDL Teste de desenvolvimento larvar
TEO Teste de eclosão de ovos
TIAL Teste de inibição da alimentação larvar
18
TMA Teste de motilidade em adultos
TML Teste de motilidade larvar
TST Targeted Selective Treatment
UECE Universidade Estadual do Ceará
WAAVP World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology
WMT Adult worms motility test
19
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 20
2 REVISÃO DE LITERATURA...................................................................... 22
2.1 NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE PEQUENOS RUMINANTES.. 22
2.1.1 Haemonchus contortus.................................................................................... 23
2.2 RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA............................................................. 25
2.3 TRATAMENTO ALVO-SELETIVO............................................................... 27
2.4 FITOTERAPIA................................................................................................. 29
2.4.1 Extratos vegetais.............................................................................................. 31
2.4.1.1 Spigelia anthelmia............................................................................................. 35
2.4.2 Óleo essencial de Eucalyptus spp. .................................................................. 36
2.5 NANOTECNOLÓGIA APLICADA AO CONTROLE DE NEMATOIDES
GASTRINTESTINAIS.....................................................................................
39
3 JUSTIFICATIVA............................................................................................ 42
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA............................................................................. 43
5 OBJETIVOS.................................................................................................... 44
5.1 OBJETIVO GERAL......................................................................................... 44
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................ 44
6 CAPÍTULO I................................................................................................... 45
7 CAPÍTULO II................................................................................................. 75
8 CAPITULO III................................................................................................ 91
9 CONCLUSÕES............................................................................................... 116
10 PERSPECTIVAS............................................................................................ 117
REFERÊNCIAS.............................................................................................. 118
APÊNDICES.................................................................................................... 133
APÊNDICE A - Publicação do artigo referente ao capítulo 1.......................... 134
APÊNDICE B - Publicação do artigo referente ao capítulo 2............................
APÊNDICE C - Publicação do artigo referente ao capítulo 3............................
135
136
20
1 INTRODUÇÃO
Na região Nordeste do Brasil, a ovinocaprinocultura se constitui em uma das principais
fontes de proteína animal e de renda, sendo uma atividade eminentemente familiar e sem
grandes recursos tecnológicos, mas fundamental para a alimentação e sobrevivência das
famílias no semiárido (GUANZIROLI; SABATTO; VIDAL, 2014). Neste contexto, dentre os
os problemas com impacto econômico sobre a ovinocaprinocultura nessa região estão as
questões sanitárias, tais como as endoparasitoses gastrointestinais, em especial as eimerioses e
helmintoses (AHID et al., 2008).
Dentre os gêneros de helmintos mais prevalentes nessa região, Haemonchus spp. se
destaca devido a sua intensidade de infecção e patogenicidade em pequenos ruminantes
(PEREIRA et al., 2009; VIEIRA et al., 2014). Com o objetivo de controlar infecções não só
por H. contortus, mas por nematoides gastrintestinais (NGI) de uma maneira geral, diversas
estratégias têm sido utilizadas, dentre essas estratégias, cita-se os métodos clássicos que fazem
uso de anti-helmínticos sintéticos e semissintéticos, seleção de raças resistentes, manejo de
pastagem, tratamento-alvo seletivo, uso de fungos nematófogos e fitoterápicos (MOLENTO et
al., 2013).
A utilização de tratamentos convencionais com anti-helmínticos sintéticos e semi-
sintéticos leva inevitavelmente ao desenvolvimento da resistência anti-helmíntica (SANTOS et
al., 2017c). Ademais, o uso de formas inadequadas de tratamento acelera o desenvolvimento da
resistência anti-helmíntica (GASSER; VON SAMSON-HIMMELSTJERNA, 2016). Assim, a
implementação de estratégias como o tratamento alvo-seletivo e o uso de fitoterápicos tem sido
alternativas para diminuição da pressão de seleção para resistência em populações de NGI.
O tratamento alvo-seletivo visa minimizar o desenvolvimento de resistência ao
favorecer a sobrevivência de nematoides com genótipos suscetíveis para diluir genes dos
indivíduos resistentes que sobrevivem ao tratamento anti-helmíntico (LEATHWICK; BESIER,
2012; VAN WYK, 2001). Tratamentos alvo-seletivos utilizam marcadores fisiopatológicos,
tais como a coloração da conjuntiva ocular no método FAMACHA. Este método é uma
ferramenta adequada quando o parasitismo por H. contortus é bastante intenso (VAN WYK;
BATH, 2002).
Outra estratégia é a fitoterapia que tem sido tratada como um método alternativo de
controle de nematodioses gastrintestinais de pequenos ruminantes (MOLENTO et al., 2013).
As plantas medicinais, como recurso terapêutico, despertam interesse em investigações para o
desenvolvimento de fitoterápicos, sendo em muitos casos o ponto de partida para o screening
21
de substâncias a partir do conhecimento popular (RITTER et al., 2012). Entretanto, o
conhecimento popular sobre o uso de vegetais, em muitos casos, é transmitido oralmente, o que
torna a documentação deste conhecimento importante para validação científica de plantas com
compostos bioativos (AHMAD et al., 2015; LUCA et al., 2014). Assim, métodos de avaliação
fitoquímica, farmacológica e toxicológica destes produtos são necessários a partir desta
abordagem etnofarmacológica inicial. (HEINRICH; JÄGER, 2015).
Neste contexto, extratos vegetais é uma classe de produtos que tem sido investigada
quanto aos seus efeitos sobre nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes (OLIVEIRA
et al., 2011). Em parasitologia veterinária, o uso de plantas ricas em taninos condensados tem
demonstrado efeito anti-helmíntico sobre parasitos gastrintestinais de caprinos e ovinos
(HOSTE et al., 2015).
Outros produtos vegetais como os óleos essenciais também têm sido descritos como
substâncias com potencial efeito anti-helmíntico (MACEDO et al., 2013). Diversos estudos têm
avaliado o efeito in vitro de óleos essenciais sobre ovos e larvas de H. contortus (GAÍNZA et
al., 2016; 2017; MACEDO et al., 2013; ZHU et al., 2013;), outros tem realizado testes em
caprinos ou ovinos para verificar o efeito anti-helmíntico dessas substâncias (KATIKI et al.,
2012; MACEDO et al., 2010).
Recentemente, formulações nanoméricas com o objetivo de otimizar o efeito de óleos
essenciais com reconhecida atividade anti-helmíntica têm sido propostas, tais como nanogéis
(MESQUITA et al., 2013; RIBEIRO et al., 2013), nanoemulsões (RIBEIRO et al., 2014) e
nanoestruturas (GRANDO et al., 2016a; 2016b). O encapsulamento de compostos voláteis,
pode ser uma ferramenta para promover a proteção e maximizar o efeito biológico desses
produtos sobre nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes, além de minimizar os
efeitos toxicológicos (PAULA et al., 2011, RIBEIRO et al., 2013).
Apesar de ampla literatura sobre o uso de fitoterápicos no controle do parasitismo por
nematoides gastrintestinais, até o presente momento, não há um produto comercial à base de
óleo essencial ou extrato vegetal para o controle de parasitos de pequenos ruminantes, entende-
se, portanto, que estudos mais aprofundados que aperfeiçoem o efeito anti-helmíntico desses
produtos sejam uma estratégia adequada para obtenção de um fitoterápico em curto ou médio
prazos.
22
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE PEQUENOS RUMINANTES
A ovinocaprinocultura é uma atividade largamente explorada nos países tropicais,
visando a produção de carne, leite e peles (SILVA et al., 2017). No Brasil, o número de ovinos
e caprinos representa o sexto e o sétimo maior rebanho nacional com aproximadamente 18,5 e
9,6 milhões de cabeças, respectivamente (IBGE, 2015). Em termos de representatividade, a
região Nordeste detém 56,5% do rebanho de ovinos e 91,4% do rebanho caprino existentes no
Brasil. O estado do Ceará é detentor do 3o e 4o maior rebanho de ovinos (2,06 milhões de
animais) e caprinos (1,02 milhões de animais) no cenário nacional, respectivamente (IBGE,
2013).
Embora sem grande impacto sobre o produto interno bruto (PIB) agropecuário da região
Nordeste do Brasil, a ovinocaprinoculturta apresenta importância socioeconômica para
propriedades rurais, distritos e municípios. Comumente, a criação de ovinos e caprinos é
realizada de forma secundária pelos produtores rurais, servindo como renda complementar,
além de ser importante fonte de proteína animal, proporcionando maior segurança alimentar
das famílias (REIS-FILHO et al., 2015). A ovinocaprinocultura nessa região é uma atividade
eminentemente familiar e sem grandes recursos tecnológicos, mas fundamental para a
alimentação e sobrevivência das famílias no semiárido (GUANZIROLI; SABATTO; VIDAL,
2014). Assim, como reflexo da pouca tecnificação, da falta de assistência adequada e de
investimentos insuficientes, problemas no desenvolvimento na cadeia produtiva de ovino e
caprinos são evidenciados. Dentre esses problemas com importância econômica, destacam-se
as questões sanitárias, tais como as endoparasitoses gastrointestinais, em especial referente às
eimerioses e helmintoses (AHID et al., 2008). As helmintoses que apresentam de maior
importância econômica no Brasil são as causadas por nematoides gastrintestinais da família
Trichostrongylidae (SILVA et al., 2017).
O parasitismo por nematoides gastrintestinais ocupa lugar de destaque em relação a
outras enfermidades, uma vez que é responsável por inúmeras perdas econômicas, causa
mortalidade de animais e compromete o sistema produtivo, refletindo, sobretudo na redução do
ganho de peso dos animais, na produção de leite e de lã e na qualidade da carcaça (GANTONGI
et al., 2007). Essas perdas econômicas incluem ainda os custos monetários para o controle da
verminose, desde a aquisição do produto anti-helmínintico comercial à mão de obra para a sua
23
aplicação (MACIEL et al., 2014).
Na região Nordeste do Brasil, os gêneros mais prevalentes de nematoides
gastrointestinais são Haemonchus, Trichostrongylus, Strongyloides, Oesophagostomum
(PEREIRA et al., 2009; VIEIRA et al., 2014). Haemonchus contortus, espécie que parasita
ovinos e caprinos, tem grande importância e infecta rebanhos em todos os estados do Nordeste,
sendo o mais prevalente no estado do Ceará (ANDRIOLA et al., 2011; COELHO et al., 2010;
COSTA et al., 2011; MELO et al., 2009; SILVA et al., 2014; VIEIRA et al., 2014).
2.1.1 Haemonchus contortus
Haemonchus contortus é um parasito hematófago de ciclo de vida direto, com um
período de desenvolvimento no hospedeiro, denominado fase parasitaria e outra no ambiente,
período de vida livre (MORENO-ROMIEUX et al., 2017; ONYAH; ARSLAN, 2005).
Na figura 1 é possível observar o ciclo de vida do nematoides H. contortus. A fase de
vida livre inicia-se com a liberação dos ovos nas pastagens por meio das fezes do animal. As
fêmeas adultas dessa espécie podem eliminar até 10.000 ovos diariamente (PRICHARD, 2001).
Posteriormente, os ovos tornam-se embrionados e larvas de primeiro estágio (L1) eclodem em
aproximadamente 24 horas, essas larvas se desenvolvem até o estágio infectante (L3) em seis
dias sob condições ideais (temperatura entre 18 a 26°C e umidade entre 80 a 100%) (CLIMENE
et al., 2008). As larvas infectantes migram das fezes para a pastagem e são posteriormente
ingeridas, então prossegue o seu desenvolvimento no animal, atingindo o estágio adulto em
cerca de 21 a 28 dias no abomaso, onde se estabelece na mucosa (CLIMENI et al., 2008;
SANTOS; SILVA; AMARANTE, 2012).
Figura 1 – Ciclo evolutivo de Haemonchus contortus
Fonte: Adaptado de ZACHARIAS (2004).
24
As larvas de quarto estégio (L4) e os adultos causam desgaste na mucosa do abomaso
devido a presença de lanceta perfurante presente no interior da capsula bucal que permitem a
sucção de sangue e inoculação de substância anticoagulante, provocando um quadro
hemorrágico e anemia (FORTES, 1987; SANTOS, 2017c).
O quadro clínico da infecção por H. contortus depende da variação na susceptibilidade
da raça, do estado nutricional e da idade do animal (MOLENTO et al., 2013). A presença ou
ausência de sinais clínicos em infecções causadas por H. contortus está associada a diferenças
genéticas entre indivíduos que caracterizam os animais como resistentes, resilientes ou
susceptíveis a infecções (PEREIRA et al., 2016). A capacidade de resiliência permite ao
hospedeiro manter sua capacidade de produção apesar das infecções pelo parasito, embora
permaneça como fonte de contaminação em potencial; e a capacidade de resistência permite ao
hospedeiro limitar ou impedir o estabelecimento da infecção (MORENO-ROMIEUX et al.,
2017).
Em casos de estabelecimento da infecção, a hemoncose pode resultar em depressão do
apetite, alterações no metabolismo proteico, devido à perda de proteína endógena no trato
gastrintestinal, além de alterações no metabolismo energético, mineral e proteico, mudanças no
balanço hídrico, levando a alterações na composição corpórea e qualidade da carcaça
(MEDEIROS et al., 2009; HUPP; FREIRE; HUPP, 2013). Infecções elevadas resultam em
hipoproteinemia e fraqueza (CARLTON, 1998). Entretanto, o principal sintoma da infecção é
a anemia, devido à atividade hematófaga desse nematoide, isso porque um único parasito adulto
pode ingerir de 50 a 80 µL de sangue diariamente e, quando o animal alberga elevada carga
parasitária, pode apresentar anemia severa, podendo vir a óbito (LE JAMBRE, 1995;
AMARANTE, 2014; AMARANTE; SALES, 2007). Na fase crônica da doença, observa-se
debilidade orgânica geral, edema submandibular, diminuição significativa na produção de leite
e carne, emagrecimento, anemia acentuada e morte (SANTA ROSA, 1996).
A adaptabilidade de H. contortus ao semiárido nordestino pode estar relacionada a sua
plasticidade biológica e ecológica para sobreviver às condições desfavoráveis, tanto no
ambiente externo quanto no hospedeiro (WALLER et al. 2004). Embora, a baixa precipitação
dessa região seja um fator limitante, a escassez de chuvas não chega a restringir o
desenvolvimento, a sobrevivência e a dinâmica de dispersão larvar de H. contortus na pastagem
(AMARANTE; PADOVANI; BARBOSA, 1996).
Surtos de hemoncose em ovinos e caprinos na região Nordeste do Brasil ocorrem
normalmente entre os meses de fevereiro e junho, época de maiores índices pluviométricos na
região (COSTA, SIMÕES; RIET-CORREA, 2009). Entretanto, infecções por H. contotus são
25
verificadas ao longo de todo o ano, evidenciando que estratégias de controle parasitário nos
animais deve objetivar ações contra esse parasito (COSTA, SIMÕES; RIET-CORREA, 2009;
GIRÃO; MEDEIROS, GIRÃO, 1992). Em um levantamento realizado em fazendas no estado
do Ceará, H. contortus foi o nematoide mais prevalente em ovinos e caprinos, esse achado
corrobora para o aprofundamento de discussões sobre estratégias mais eficazes para o controle
de H. contortus (MELO, BEVILAQUA, REIS, 2009).
Embora haja esse consenso, o controle de H. contortus em rebanhos é realizado em
muitos casos de forma inadequada. Em um levantamento realizado por Nunes-Neto et al. (2014)
em fazendas no Maranhão, Brasil, evidenciou-se que criadores da região não atentam para o
fato de que o tratamento deve ser realizado antes e após o período chuvoso, períodos em que há
mais larvas no pasto e os animais estão submetidos a um maior desafio parasitário (MELO;
BEVILAQUA, REIS, 2009).
No intuito de controlar infecções não só por H. contortus, mas de nematoides
gastrintestinais (NGI) de uma maneira geral, diversas estratégias têm sido utilizadas. Cita-se os
métodos clássicos que fazem uso de anti-helmínticos sintéticos e semissintéticos, seleção de
raças resistentes, manejo de pastagem, tratamento-alvo seletivo, uso de fitoterápicos e fungos
nematófogos (MOLENTO et al., 2013). Comumente, o uso de anti-helmínticos sintéticos tem
sido a principal forma de controle de infecções por NGI (MORENO-ROMIEUX et al., 2017).
Porém, o controle parasitário realizado de forma inapropriada, com intensa pressão de seleção
sobre as populações de NGI, tem promovido a seleção de parasitos resistentes às diferentes
classes de drogas, principalmente benzimidazóis, lactonas macrocíclicas e imidazotiazóis
(PAPADOPOULOS, 2008; VAN WYK et al., 2006).
2.2 RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA
A resistência anti-helmíntica é definida como uma mudança genética que interfere na
habilidade do parasita em sobreviver a tratamentos nas doses recomendadas da droga, ou seja,
os NGI herdam a habilidade de sobreviver aos efeitos farmacológicos dos anti-helmínticos
(VÁRADY et al., 2011).
O primeiro relato de resistência do mundo foi a um benzimidazol em populações de H.
contortus nos Estados Unidos (DRUDGE et al., 1964). Desde então, diversos estudos no mundo
têm relatado a ocorrência de resistência às diversas classes de anti-helmínticos, inclusive ao
monepantel, um derivado amino-acetonitrílico, lançado no mercado em 2009 (KOTZE;
PRICHARD, 2016). Há relatos de resistência de H. contortus ao monepantel na Nova Zelândia
26
(SCOTT et al., 2013), Uruguai (MEDEROS; RAMOS; BANCHERO, 2014), Holanda (VAN
DEN BROM et al., 2015) e no Brasil (MARTINS et al., 2016).
No Brasil, a seleção e a crescente disseminação de nematoides resistentes aos anti-
helmínticos mais comumente utilizados, benzimidazóis, imidazotiazóis e lactonas
macrocíclicas, constituem um sério entrave na produção de pequenos ruminantes (FORTES;
MOLENTO et al., 2013). A situação da resistência anti-helmíntica é igualmente grave em
rebanhos de caprinos e ovinos da região Nordeste do país (MELO, BEVILAQUA, REIS, 2009;
SANTOS et al., 2014, 2017a, b).
Essa problemática deve-se ao fato de o uso de anti-helmínticos sintéticos ser
historicamente a principal forma de controle de NGI, assim, diversas propostas de esquemas de
tratamento com essas drogas foram instituidas para pequenos ruminantes (SANTOS et al.,
2013). Cita-se o tratamento supressivo que consta em vermifugar os animais a cada 2-4
semanas, com drogas de curta persistência, objetivando empregar drogas antes do fim do
período pré-patente do parasito na tentativa de eliminação quase total dos nematóides
(TORRES-ACOSTA; HOSTE, 2008). Porém, nenhum anti-helmíntico é eficaz sobre 100% dos
nematóides e, desta forma, as populações resistentes são selecionadas a cada administração do
tratamento (SANTOS et al., 2013).
Além das formas de tratamento, práticas de manejo inadequadas são responsáveis pelo
desenvolvimento da resistência anti-helmíntica, tais como a subdosagem de anti-helmínticos, a
alta frequência de tratamentos, a rápida rotação de princípio ativo ou utilização da mesma classe
de anti-helmínticos por um longo período de tempo (PAPADOPOULOS, 2008; TORRES-
ACOSTA; HOSTE, 2008). A alta frequência de tratamento e rotatividade de princípios ativos
é o esquema de tratamento supressivo adotado por grande parte dos produtores do estado do
Ceará (SANTOS et al., 2013). Esse esquema pode inclusive levar a seleção de populações de
nematoides gastrintestinais multirresistentes (SCZESNY-MORAES et al., 2010).
A multirreistência é quando há ocorrência de resistência a dois ou mais anti-helmínticos
com grupos químicos não relacionados e diferentes mecanismos de ação (VÁRADY et al.,
2011). Esse fenômeno é considerado um agravamento do problema de resistência em rebanhos
e representa uma ameaça mundial à criação de pequenos ruminantes (TIRABASSI et al., 2013;
Van den Brom et al., 2013).
Inevitavelmente, a evolução da resistência anti-helmíntica é causa principal do
esgotamento de opções de drogas com ação sobre populações de NGI. Assim, com o objetivo
de preservar a eficácia dos novos compostos e evitar que os anti-helmínticos que ainda possuem
alguma eficácia sobre determinada população de NGI venham a ser descartados em função do
27
fenômeno da multi-resistência anti-helmíntica, são necessárias medidas que prolonguem a vida
útil dessas drogas (MOLENTO et al., 2013). Dentre as inúmeras estratégias atualmente testadas,
destacam-se o tratamento alvo-seletivo de animais e o uso de fitoterápicos (CORNELIUS;
JACOBSON; BESIER; 2015).
2.3 TRATAMENTO ALVO-SELETIVO
O tratamento alvo-seletivo (do inglês, Targeted Selective Treatment - TST), pode ser
definido como qualquer sistema que seleciona animais de forma individual para tratamento,
usando critérios específicos lógicos (VAN WYK; BATH, 2009). Assim, um TST eficaz visa
diminuir o desenvolvimento da resistência anti-helmíntica, porém deve ser um método
aceitável, rápido, confiável, seguro e barato para os criadores (BATH, 2006).
A dispersão binômia negativa de parasitos gastrintestinais em rebanhos é útil para o
reconhecimento de animais com nível de infecção suficiente para causar perdas consideráveis
em sua produção (MALAN; VAN WYK; WESSELS, 2001). Neste sentido, a aplicação de um
TST restringe o tratamento anti-helmíntico apenas a animais julgados mais susceptíveis de
sofrer perda significativa na produção ou efeitos na saúde se não forem tratados, deixando os
demais sem serem expostos a anti-helmínticos (BESIER, 2012). Entretanto, a estratégia de TST
deve ser adaptada de acordo com as mudanças sazonais e temporais, uma vez que o tratamento
pode ser administrado apenas em certas épocas no ano ou ciclo de produção (CHARLIER et
al., 2014).
Na seleção dos animais a serem tratados pode-se considerar vários marcadores
fisiopatológicos, como o escore de diarreia (DISCO), o escore de condição corporal
(BODCOM) e o escore FAMACHA (BENTOUNSI; MERADI; CABARET, 2012;
CORNELIUS; JACOBSON; BESIER; 2015; LEASK et al., 2013).
O DISCO avalia o grau de consistência das fezes e é um bom indicador em casos de
parasitismo por Teladorsagia spp. e Nematodirus spp. que são as espécies mais prevalentes na
população de NGI em países temperados (CABARET et al., 2002). Em um estudo realizado na
Argélia oriental, verificou-se que o DISCO foi 80% eficaz na identificação de cordeiros que
necessitavam de tratamento, isso porque as raças locais apresentavam diarreia como principal
quadro clínico do parasitismo (BENTOUNSI; MERADI; CABARET, 2012). Assim, o DISCO
é uma ferramenta prática de diagnóstico em que apenas os animais mais propensos ao
parasitismo serão tratados e o resultado dessa seleção é um gerenciamento mais sustentável da
população de parasitos (BATH; VAN WYK, 2009). Porém, a suceptibilidade individual do
28
hospedeiro ao desafio parasitário e a baixa especificidade desse método de seleção, visto que
diarreia em pequenos ruminantes também pode ser ocasionada por Moniezia spp. e coccídeos,
são fatores limitantes desse marcador (BATH; VAN WYK, 2009; BENTOUNSI; MERADI;
CABARET, 2012).
O BODCOM deve servir como critério de seleção de animais para tratamento anti-
helmínitco especialmente em rebanhos com predominância de infecções por Nematodirus spp.,
Teladorsagia spp. e /ou Trichostongylus spp. (BATH; VAN WYK, 2009). Assim, o BODCOM
foi o marcador de eleição utilizado em um estudo realizado na Grécia, onde havia uma
predominância de 70% de Teladorsagia spp. (GALLIDIS et al., 2009). O escore para seleção
de animais no BODCOM varia de 1 a 5, onde o escore 1 é usado para animais muito emaciados
e 5 para animais com grande deposição de tecido adiposo; animais com escores menor ou
inferior a 2 devem ser tratados independente do seu ciclo reprodutivo (CAMPBELL et al.,
2006). Porém alguns métodos de avaliação são diferentes para caprinos e ovinos. Recomenda-
se que a avalição do teor de gordura em caprinos seja na região abdominal, diferentemente de
ovinos em que a visualização deve ser feita preferencialmente na região posterior do animal
(SMITH; SHERMAN, 1994).
Os fatores limitantes da adoção do BODCOM relacionam-se a necessidade de
comparação do animal avaliado com outros animais do mesmo padrão de idade ou padrão
reprodutivo no rebanho, só assim os resultados assumem uma confiabilidade, na medida em
que refletem o nível e a qualidade da nutrição versos as exigências nutricionais da idade e estado
fisiológico do animal (COTTLE, 1991). Outro ponto que limita sua adoção é quando há um
padrão homogêneo de animais e a variação de escore é acima de 1, isso pode ser reflexo de
outra doença crônica debilitante no rebanho (BARGER, 1985). Ademais, há necessidade de
intenso treinamento prévio da equipe para haver precisão na avaliação dos animais (BATH;
VAN WYK, 2009).
Dentre os marcadores de parasitismo por NGI, o FAMACHA é uma ferramenta
adequada para seleção de animais a serem tratados em rebanhos onde haja alta prevalência de
infecção por H. contortus (VAN WYK; BATH, 2002). Esse método é capaz de identificar
animais sensíveis, quando há alta correlação entre o OPG e FAMACHA, resistentes e resilientes
a parasitos hematófagos em um rebanho (PEREIRA et al., 2016; SOTOMAIOR et al., 2007).
O método FAMACHA é a abordagem de TST que tem sido utilizada no Brasil de forma
mais expressiva e que tem resultados promissores em avaliações a campo (BATISTA et al.,
2014; HAMMERSCHMIDT et al., 2012). O princípio do método FAMACHA reside na
distribuição binomial negativa que rege a frequência dos parasitos em uma população de
29
hospedeiros, ou seja, poucos animais estão infectados por muitos parasitos e a maioria dos
animais possui baixa carga parasitária. Assim, é possível tratar os animais com a maior taxa de
infecção, deixando a maior parte sem tratamento, o que permite a manutenção de abundante
parcela da população de parasitos in refugia. Como consequência direta do uso do FAMACHA,
ocorre a diminuição no uso de anti-helmínticos sintéticos e semissintéticos, redução nas
despesas com o tratamento antiparasitário do rebanho e o menor risco de contaminação
ambiental em decorrência de menor uso de produtos químicos (MOLENTO et al., 2013).
O método FAMACHA foi inicialmente proposto na África do Sul e seu uso passou a
ser disseminado a partir da década de 1990 (BATH; VAN WYK; 2001). Esse método apresenta
grau de confiabilidade superior a 95% e se baseia na coloração da conjuntiva ocular dos animais
classificado-os em escores de 1-5, onde 1 representa a coloração normal da conjuntiva e 5 o
mais alto grau de anemia; recomenda-se o tratamento de animais com escore igual ou maior a
3 (BATH; VAN WYK, 2001, 2009; FERNANDES et al., 2015). Embora o tratamento dos
animais com escores 3, 4 ou 5 resulte em um maior número de tratamentos sendo aplicados a
alguns animais falsos positivos, essa abordagem é capaz de elevar a sensibilidade do método e
reduzir aa chance de mortalidade em animais anêmicos não diagnosticados (FERNANDES et
al., 2015).
As restrições do método estão associadas ao seu uso para seleção de animais parasitados
por vermes hematófago, além disso, à ocorrência de observação de falsos positivos devido a
anemia por outras causas que não o parasitismo (BATH; VAN WYK, 2009).
2.4 FITOTERAPIA
O uso da fitoterapia no controle de verminose em pequenos ruminantes é outra
alternativa que pode reduzir o uso e prolongar a vida útil dos anti-helmínticos (MOLENTO et
al., 2013; VIEIRA, 2009). Isso porque pesquisas envolvendo plantas com atividade nematicida
podem revelar potenciais fontes de substâncias químicas a serem utilizadas em atividades
auxiliares para controlar NGI em pequenos ruminantes (BORGES; BORGES, 2016).
Atualmente, a demanda de uso de plantas medicinais tem aumentado acentuadamente,
levando a busca por novas substâncias com atividade farmacológica pela indústria
farmacêutica, o que torna os recursos genéticos das plantas muito valiosos (OLIVEIRA;
KFFURI; CASALI, 2010). No Brasil, a alta biodiversidade da flora favorece a obtenção de
biativos para produção de fitomedicamentos (HEINZMANN; BARROS, 2007). Dessa forma,
o uso racional desses produtos vegetais pode agregar valor à biodiversidade nacional, embora
30
dados sobre potencial econômico envolvendo o uso de plantas ainda sejam pouco definidos e,
em muitos casos, indisponíveis, visto que a maior parte dos recursos vegetais brasileiros são
comercializados em sua forma bruta (JOLY et al., 2011).
As plantas medicinais, como recurso terapêutico, despertam interesse em investigações
para o desenvolvimento de fitoterápicos e têm sido usadas como drogas por seres humanos há
milhares de anos como resultado do acumulado de experiência das gerações passadas. Hoje,
todas as culturas do mundo têm um amplo conhecimento sobre fitoterápicos (AL-SNAFI, 2016;
RITTER et al., 2012). Inúmeros estudos, principalmente na África, Ásia e América do Sul,
descreveram achados etnoveterinários sobre o uso de plantas por comunidades tradicionais
(AHMAD et al., 2015; AL-SNAFI, 2016; MARANDURE, 2016; MONTEIRO et al., 2011;
RITTER et al., 2012). Entretanto, o conhecimento popular sobre o uso de vegetais, em muitos
casos, é transmitido oralmente de geração para geração, forma vertical, ou entre membros de
uma mesma comunidade, forma horizontal, o que torna a documentação deste conhecimento
importante para validação científica de plantas com compostos bioativos (AHMAD et al., 2015;
LANS, 2011; LUCA et al., 2014;).
A validação científica é importante para avaliar a relação risco-benefícios do uso das
plantas no tratamento de animais, visto que vegetais possuem uma gama de compostos
farmacologicamente ativos com combinações singulares, que podem interagir de forma
sinérgica, adicional ou em antagônismo (KATIKI et al., 2017; RASTOGI et al., 2015).
Interações sinérgicas foram observada em compostos isolados oriundos de óleos essenciais e
podem ser promissoras no controle de parasitos, porém existe a necessidade de investigações
adicionais sobre o efeito desse sinergísmo por meio da execução de todas as etapas de validação
científica dos compostos (KATIKI et al., 2017). Em outro estudo, Klongsiriwet et al. (2015),
demonstraram pela primeira vez alto efeito sinérgico das combinações entre taninos
(procianidina) e flavanóides (quercitina ou luteolina) sobre o desembainhamento de H.
contortus.
Na validação científica de um produto vegetal para aplicação em parasitologia
veterinária é necessário que sua eficácia seja avaliada, confirmada e que a administração ocorra
sem riscos para saúde dos animais, dessa forma, várias questões devem ser abordadas, incluindo
a caracterização fitoquímica dos compostos ativos, o modo de ação contra os parasitos,
segurança toxicológica e as condições de aplicação na espécie-alvo (HEINRICH; JÄGER,
2015; TORRES-ACOSTA; HOSTE, 2008). Somente dessa forma, o uso do fitoterápico com
propriedades anti-helmínticas pode ser uma alternativa segura e eficaz, tanto do ponto de vista
de controle parasitário, quanto do baixo impacto ambiental provocado pelos resíduos nos
31
produtos de origem animal e no meio ambiente se comparados aos anti-helmínticos sintéticos
(GIQUELIN, 2014).
No processo de validação científica são realizados testes in vitro e in vivo sobre NGI de
pequenos ruminantes (MACEDO et al., 2011). Os testes in vitro são utilizados para o screening
de bioativos, extratos vegetais e óleos essenciais, com efeito anti-helmíntico, constituindo-se
como uma etapa preliminar essencial a verificação dos efeitos de possíveis compostos ativos
presentes nos vegetais (ACHARYA, HILDRETH; REESE, 2014; COSTA et al., 2002). Já os
testes in vivo são realizados após a obtenção de resultados promissores com os testes in vitro,
sendo realizados os testes toxicológicos em animais de laboratório e, posteriormente teste de
eficácia do produto na espécie-alvo que se deseja a recomendação terapêutica (CAMURÇA-
VASCONCELOS et al., 2007).
Assim, a validação científica de plantas com propriedades anti-helmínticas verifica sua
eficácia no controle parasitário. Além disso, deve-se de avaliar o impacto dos resíduos nos
produtos animais e no meio ambiente (GIQUELIN, 2014). Neste sentido, extratos vegetais
(ALONSO-DIAZ et al., 2010, MONTEIRO et al., 2011), decoctos (MACEDO et al., 2012) e
óleos essencias (MACEDO et al., 2013; ZHU et al., 2013) têm sido avaliados quanto a sua
eficácia contra NGI de ovinos e caprinos.
2.4.1 Extratos vegetais
Os compostos ativos das plantas podem ser agrupados em duas categorias, metabolitos
primários e secundários. Os metabólitos primários são substâncias representadas por moléculas
necessárias à fisiologia básica da planta, como carboidratos, lipídeos e proteínas; e os
metabólitos secundários são originados do metabolismo primário e apresentam funções
importantes para sobrevivência da planta em seu ecossistema, como atração dos polinizadores,
adaptação química das plantas à pressão ambiental, além de apresentarem atividades biológicas,
como ação contra microrganismos, insetos e predadores superiores (CHAGAS, 2004; GURIB-
FAKIM, 2006).
A atividade anti-helmíntica de diversas plantas tem sido atribuída à presença de
diferentes metabólitos secundários tais como esteróis, taninos condensados, cumarinas,
alcaloides, terpenoides e saponinas (ATHANASIADOU; KYRIAZAKIS, 2004;
HERNÁNDEZ-VILLEGAS et al., 2011) e ação sinérgica desses constituintes, presentes em
extratos, tem sido considerada (OLIVEIRA et al., 2009).
A composição química dos extratos vegetais está relacionada às condições de solo,
32
temperatura ambiental, sazonalidade e hora da coleta (AZUHNWI et al., 2013a). Esses produtos
podem ser obtidos por meio de vários processos físicos e/ou químicos resultando em materiais
com composição complexa, sendo a identificação de seus constituintes etapa inicial da
validação de sua eficácia anti-helmíntica (HOSTE et al., 2012). No contexto da fitoterapia, essa
combinação complexa de constituintes normalmente é requerida por ter uma maior eficácia do
que os constituintes individuais, entretanto a ingestão dessas misturas complexas possui maior
probabilidade de conduzir a interações medicamentosas e, neste caso, muitas ervas ou plantas
apresentam risco potencial (POSADZKI, 2013). Por outro lado, a complexa composição
química de extratos vegetais pode ser um fator importante no retardo do desenvolvimento de
resistência anti-helmínitica de NGI aos seus compostos, entretanto a falta de padronização
desses produtos pode comprometer sua utilização em larga escala em criações de ovinos e
caprinos. No caso de plantas ricas em taninos condensados, pesquisas foram realizadas na
seleção ou criação de plantas com composição estável para futuras padronizações de um
fitofármaco (AZUHNWI et al., 2013b).
A extração é o primeiro passo na obtenção de extratos vegetais e desempenha um papel
significativo sobre a composição química do produto obtido (CAMURÇA-VASCONCELOS
et al., 2005). Métodos convencionais de extração, como o Soxhlet, ainda são considerados
referência na comparação com outros métodos mais modernos. A técnica por Soxhlet é
amplamente utilizada para extrair, a quente, compostos bioativos de várias fontes naturais. Esse
processo consiste no acondicionamento de uma pequena quantidade de amostra seca em um
balão de destilação que contém o solvente de particular interesse que, após atingir um nível de
transbordamento, a solução é aspirada por um sifão e posteriormente volta para o balão de
destilação (AZMIR et al., 2013).
Na obtenção de extratos vegetais, critérios fitoquímicos devem ser levados em
consideração, como o tipo de extração de compostos bioativos específicos pretende-se utilizar
para obtenção de amostras complexas de plantas, como os critérios de seletividade do método
a ser utilizado, a sensibilidade do bioensaio e se todo o método reprodutível, independente das
variações da composição da amostra obtida (SMITH, 2013).
O uso de extratos vegetais no tratamento de parasitismo em animais tem sido
investigado, com especial atenção aos efeitos nutraceuticos dessas plantas (HOSTE et al.,
2015). No uso de produtos em avaliações nutraceuticas deve-se levar em consideração as
características inerentes a cada espécie animal, a ocorrência de resistência/resiliência dos
animais ao parasitismo, a quantidade e a qualidade do produto consumido, além de sua
toxicidade e/ou efeitos negativos (SANDOVAL-CASTRO et al., 2012). Assim, faz-se
33
necessário o desenvolvimento de vários procedimentos metodológicos prévios baseados em
métodos in vitro e in vivo para avaliar as plantas como nutracêuticos potenciais.
Os testes in vitro incluem testes sobre ovos, larvas, adultos de nematoides
(YOSHIHARA et al., 2015). Mesmo que ensaio in vitro tais como o teste de eclosão de ovos e
o teste de desenvolvimento larvar em H. contortus venha sendo os mais utilizados para
avaliação de extratos vegetais, a avaliação da motilidade em adultos fornece resultados de
triagem mais confiáveis para substâncias com ação anti-helmíntica in vivo, na medida em que
os efeitos in vitro de substâncias bioativas nem sempre correspondem à eficácia anti-helmíntica
nas espécies alvo. Nos testes in vitro, os extratos estão em contato direto com os parasitos e as
concentrações de substâncias potencialmente ativas aí contidas nem sempre correspondem à
sua biodisponibildade in vivo (GITHIORI et al., 2006). Um exemplo da falta de
correspondência entre resultados in vitro e in vivo foi demonstrado por Oliveira et al. (2009)
em que o extrato acetato de etila de Cocos nucifera, com alto teor de taninos condensados (TCs),
apresentou atividade ovicida e larvicida de 100% e 99,7% nas concentrações de 5 mg/mL e 80
mg/mL, respectivamente, porém não teve efeito in vivo sobre nematoides gastrintestinais de
ovinos.
Mesmo não havendo uma evidência concreta dos reais efeitos dos TCs sobre NGI de
pequenos ruminantes, a utilização de plantas forrageiras contendo alta concentração de TCs tem
despertado a atenção de pesquisadores e os resultados sugerem que essas plantas podem ser
usadas como nutraceuticos (ALONSO-DIAZ et al., 2010; HOSTE et al., 2015).
Os TCs são polímeros formados por policondensação de duas ou mais unidades flavan-
3-ol e flavan- 3,4-diol. Esses compostos são também denominados de proantocianidina pois
produzem pigmentos avermelhados da classe das antocianidinas. Os TCs e hidrolisáveis se
distribuem amplamente em vegetais, sendo os primeiros, com maior teor em plantas lenhosas
(BRUNETON, 1991).
A atividade anti-helmíntica in vitro dos TCs é avaliada inicialmente sobre diferentes
estágios dos nematóides, como ovos, larvas de primeiro estágio (L1), larvas de terceiro estágio
(L3) e adultos (MARTÍNEZ-ORTÍZ-DE-MONTELLANO et al., 2013; OLIVEIRA et al.,
2011; YOSHIHARA et al., 2015). Mais recentemente, a utilização da microscopia eletrônica
de varredura tem sido um avanço na identificação de alterações cuticulares em adultos
ocasionadas por extratos ricos em TCs e com potencial efeito anti-helmíntico, o uso dessa
técnica é plausível porque a cutícula do parasito é uma barreira protetora e está envolvida tanto
na motilidade quanto nas trocas metabólicas que ocorrem no trato digestivo de pequenos
ruminantes, consequentemente, o dano culticular pode estar associado ao efeito biológico do
34
vegetal (MARTÍNEZ-ORTÍZ-DE-MONTELLANO et al., 2013).
Em testes in vivo utilizando plantas taniníferas como nutraceuticos, o efeito dos TCs é
determinado na espécie-alvo a partir da comparação da eficácia anti-helmíntica em animais
natural ou experimentalmente infectados por nematóides gastrintestinais (OLIVEIRA et al.,
2011). Nesse sentido, vários extratos apresentaram bons resultados na redução da contagem de
opg em ovinos. Cita-se o extrato etanólico bruto de Artemisia absinthium na dose de 2 g/kg
por peso vivo (PV) que reduziu em 90,46% o opg de ovinos (TARIQ et al., 2009) e o extrato
metanólico de Combretum molle que reduziu opg de ovinos em 96,23% quando tratados com a
dose de 2 g/kg PV (SIMON et al., 2012).
Em pequenos ruminantes, os TCs podem agir, tanto reduzindo a carga parasitária
diretamente ou melhorando o fornecimento de proteína metabólica, promovendo a resiliência
do animal ao equilibrar as perdas proteicas causadas pelo parasitismo, reduzir a fertilidade de
fêmeas de H. contortus ou, ainda, atenuar o estabelecimento de larvas infectantes no hospedeiro
definitivo (BRUNET et al., 2008; HOSTE et al., 2006; MARTÍNEZ-ORTÍZ-DE-
MONTELLANO et al., 2010). Paulini et al. (2003) demonstraram redução de 57% na
fecundidade de fêmeas de H. contortus após 8 dias de tratamento com suspenção aquosa de
quebracho (Schinopsis sp.) com teor de taninos que representava 5% da dieta diária.
Esses mecanismos são especialmente importantes na avaliação dos efeitos diretos dos
TCs porque, embora o mecanismo de ação desses produtos não esteja completamente claro,
existe uma alta correlação entre o conteúdo fenólico de extratos vegetais e a atividade anti-
helmíntica de TCs (HOSTE et al., 2006).
As condições físico-químicas do trato gastrintestinal da espécie-alvo, tais como o pH do
abomaso e intestino delgado de pequenos ruminantes, também podem influenciar diretamente
o efeito biológico dos TCs. No pH do abomaso (2.5-3) ocorre uma dissociação dos complexos
taninos-proteína formados no rúmen (HAGERMAN et al., 1992; MIN et al., 2003). No entanto,
no início do intestino delgado, onde o pH é de aproximadamente 5,5, estes complexos podem
ser reconstituídos (McNABB et al., 1998). Esta condição pode fazer com que os CTs tenham
maior efeito direto sobre H. contortus em relação a T. colubriformis, conforme relatado por
Minho et al. (2010).
Embora os efeitos diretos pareçam estar mais relacionados a atividade anti-helmíntica
dos TCs, alguns estudos abordaram a hipótese indireta, comparando as alterações celulares
locais na mucosa digestiva produzida por forragem rica em TCs à imunidade de ovinos e
caprinos (PAULINI et al., 2013). Entretanto, os estudos realizados em pequenos ruminantes
não apresentaram resultados consistentes de alterações no número de mastócitos da mucosa,
35
eosinófilos ou leucócitos globulares, tornando essa abordagem de efeito indireto dos TCs
inconclusiva (PAULINI et al., 2003; TZAMALOUKAS et al., 2006). Martínez-Ortíz-de-
Montellano et al. (2010) verificaram a ocorrência de leve aumento de células inflamatórias no
tecido abomasal de animais infectados experimentalmente com H. contortus e alimentados com
Lysiloma latisiliquum por 36 dias, porém esse achado não foi relevante para ser associado com
o efeito anti-helmíntico indireto da planta no controle do parasitismo.
2.4.1.1 Spigelia anthelmia
Uma das plantas que tem sido investigada quanto a sua ação sobre NGI de pequenos
ruminantes é Spigelia anthelmia Linn. (figura 2). Essa espécie vegetal pertence a família
Loganiaceae, é nativa da Ásia e América tropical e é usada como um anti-helmíntico na
medicina popular do Brasil (BRAGA, 1976). S. anthelmia é amplamente distribuída do norte
ao sudeste do território brasileiro, sendo popularmente conhecida como “arapabaca” ou “erva-
lombrigueira”. Segundo a German Homeopathic Pharmacopoeia (2015), o extrato da parte
aérea de S. anthelmia é descrito como um remédio para desordens neurológicas e cardíacas.
Figura 2 – Folhas, fruto e flores de Spigelia anthelmia
Fonte: Adaptado de https://hiveminer.com/Tags/wormbush.
Investigações fitoquímicas dessa planta descreveram o isolamento do alcaloide
espigantina, que demonstrou atividade cardiovascular (ACHENBACH et al., 1995). Em outros
estudos, foi relatada a presença de dois alcaloides voláteis, isoquinolina e actinidina, e três
alcaloides quaternários, colina, benzoilcolina e 2,3-dimetil-lacrolil colina, que também estão
envolvidos na atividade cardiotônica de S. anthelmia.
36
Achenbach et al. (1995) demonstraram que S. anthelmia possui um princípio ativo
estereoquímico e funcionalmente relacionado ao alcalóide rianodina. Esse alcaloide tem uma
estrutura similar à espigantina, e parece inibir a motilidade larvar e a eclosão de ovos de H.
contortus (BATISTA et al., 1999). Essa substância também demonstrou atividade antialimentar
em insetos (GONZALEZ-COLOMA et al., 1999). O mecanismo de ação do rianoide se dá por
interação com receptores de rianodina presentes nos canais de cálcio do retículo
sarcoplasmático, esses receptores são mantidos abertos, condição para que ocorra uma
contração tônica no músculo esquelético isolado e paralisia tônica em células de muitas espécies
de vertebrados e invertebrados; esse mecanimos foi demonstrado experimentalmente na
diminuição da motilidade de Caenorhabditis elegans (MARYON et al., 1998). O rianoide e
espigantina também demonstraram atividade cardiodepressora em músculo papilar isolado de
porquinhos-da-índia (HÜBNER et al., 2001). Camurça-Vasconcelos et al. (2004) avaliaram os
efeitos neuromusculares e a toxicidade aguda do extrato acetato de etila de S. anthelmia,
relatando que esta planta induz paralisia tônica in vivo, diminui a amplitude de contração e
aumenta o tônus de músculos esqueléticos in vitro, sugerindo que este extrato tem efeito sobre
receptores nicotínicos para acetilcolina.
Estudos relataram ainda que o extrato aquoso e extratos orgânicos desta planta inibem
a eclosão de ovos e o desenvolvimento larvar de H. contortus (ASSIS et al., 2003; BATISTA
et al, 1999). O extrato etanólico na dose de 500 mg/kg de S. anthelmia diminuiu o opg de ovinos
em 76, 79,8, 75 e 12,3% para Strongyloides spp., Oesophagostomum spp., Haemonchus spp. e
Trichostrongylus spp., respectivamente, após o 12º dia de tratamento (ADEMOLA;
FAGBEMI; IDOWU, 2007).
Diante desses resultados promissores, S. anthelmia pode ser considerada como um
vegetal que possui potencial efeito no controle de NGI de pequenos ruminantes, sendo,
portanto, necessários estudos adicionais nas espécies-alvo a campo para comprovação da real
eficácia de seus bioativos.
2.4.2 Óleos essenciais
As plantas são capazes de sintetizar dois tipos de óleos: óleos fixos e óleos essenciais.
Óleos fixos consistem de ésteres de glicerol e ácidos graxos (triglicérideos ou triacilgliceróis).
Enquanto que os óleos essenciais são misturas de compostos orgânicos voláteis, sendo muitos
de seus constituintes individuais utilizados naturalmente como atrativos para insetos
(TISSERAND; YOUNG, 2014). Os componentes dos óleos essenciais incluem uma série de
37
hidrocarbonetos terpênicos, ésteres, ácidos orgânicos, aldeídos, cetonas, fenóis, entre outros,
em diferentes concentrações, nos quais um composto farmacologicamente ativo é majoritário
(BURT, 2004). Na classe dos hidrocarbonetos terpênicos, destacam-se os monoterpenoides,
carvacrol, carvona, cineol, linalol, limoneno e timol e os fenilpropanóides, cinamaldeído,
anetol, vanilina e eugenol (KATIKI et al., 2017). Andre et al. (2016) demonstraram a redução
de opg de ovinos naturalmente infectados em 65,9% após 14 dias do tratamento único com
carvacrol na dose de 250 mg/kg. Em outro estudo, verificou-se uma redução de 59, 8% no opg
de ovinos tratados com a mesma dose de timol (ANDRE et al., 2017).
Variações desses produtos nas composições de óleos essenciais podem ocorrer como
resultado de diferentes condições de solo, altitude, condições climáticas e fatores sazonais
(HEYWOOD et al., 2002). Assim, a análise química é o ponto de partida para avaliar o efeito
biológico dos óleos essenciais, visto que a identificação e a quantificação dos componentes em
altas concentrações podem ser responsáveis por sua atividade anti-helmíntica (MACEDO et al.,
2013) ou, ainda, compostos podem atuar em sinergismo promovendo esse efeito (KATIKI et
al., 2017). A mistura complexa de substâncias de óleos essenciais pode interagir com vários
alvos moleculares em vários estágios de desenvolvimento de parasitos (MARIE-
MAGDELEINE et al., 2009), desencadeando efeito ovicida, larvicida e/ou adulticida sobre NGI
de pequenos ruminantes.
Diversos estudos têm avaliado o efeito in vitro de óleos essenciais sobre ovos e larvas
de H. contortus (GAÍNZA et al., 2016; 2017; MACEDO et al., 2013; ZHU et al., 2013), outros
estudos realizaram testes em caprinos e ovinos para verificar o efeito anti-helmíntico desses
produtos (KATIKI et al., 2012; MACEDO et al., 2010).
O óleo essencial de Eucalyptus citriodora na concentração de 5,3 mg/mL inibiu 98,8%
da eclosão de ovos, já a concentração de 10,6 mg/mL, inibiu em 99,71% o desenvolvimento
larvar de H. contortus (MACEDO et al., 2011). O óleo essencial de Eucalyptus globulus inibiu
até 98,7% do desenvolvimento larvar de H. contortus em concentrações que variaram de 21,75
a 43,5 mg/mL (MACEDO et al., 2009). Ao avaliar o efeito larvicida de Cymbopogon martinii,
Cymbopogon schoenanthus e Mentha piperita, demonstrou-se que a concentração efetiva para
inibir 50% (CE50) da eclosão das larvas foi de 0,27, 1 e 0,61 mg/mL, respectivamente. As
CE50 no TDL foram de 0,27, 0,91 e 0,35 mg/mL para C. schoenanthus, M. piperita e C.
martinii, respectivamente (KATIKI et al., 2011).
O óleo essencial de E. staigeriana tem sido amplamente estudado quanto a sua atividade
anti-helmíntica (MACEDO et al., 2010; MESQUITA et al., 2013; RIBEIRO et al., 2013).
E. staigeriana (figura 3) é uma árvore de porte médio originária da região de
38
Queensland, Austrália e, atualmente, seu cutivo está disseminado nas mais variadas regiões dos
trópicos. O óleo essencial, destilado a partir de suas folhas, é bastante usado na perfumaria e na
aromoterapia. O rendimento na obtenção do óleo essencial está na faixa de 2,9 a 3,4% do peso
das folhas secas. Esse óleo contém uma variedade de componentes, tais como geraniale,
limoneno, geraniol, neral, dentre outros (MACEDO et al., 2010; RIBEIRO et al., 2013). Gilles
et al. (2010) relatarma que o componente majoritário do óleo essencial de E. staigeriana é o
eucalyptol (34,8%), seguido por neral e geraniale, com 10,8%, cada, sendo os demais
constituintes, encontrados em menor porcentagem. Mesquita et al. (2013) verificaram que o
componente majoritário de E. staigeriana foi o limoneno (72,9%).
Figura 3 – Folhas de Eucalyptus staigeriana
Fonte: https://www.well-edis.fr/42-huile-essentielle-d-eucalyptus-staigeriana.html.
O óleo essencial de E. staigeriana na dose de 500 mg/kg reduziu o OPG de caprinos em
76, 57% no 15º dia após o tratamento, resultado foi semelhante ao controle positivo, ivermectina
(MACEDO et al., 2010). O óleo de E. staigeriana na dose de 365 mg/kg encapsulado em matriz
de quitosana apresentou eficácia de 83,75% sobre nematoides abomasais de ovinos
(MESQUITA et al., 2013). Esse resultado despertou interesse em novas formulações
farmacêuticas objetivando otimizar a eficácia do óleo de E. staigeriana sobre NGI de pequenos
ruminantes.
Embora haja diversos outros estudos, até o presente momento, não há um produto
comercial à base de óleos essenciais para uso como fitoterápico no controle de NGI. Entende-
se, portanto, que investigações mais aprofundadas que aperfeiçoem o efeito anti-helmíntico de
óleos já testados, sejam uma estratégia adequada para obtenção de um fitoterápico em curto ou
médio prazos. Diante disso, novas formulações químicas, além de avaliações de segurança
toxicológica na espécie-alvo, podem aperfeiçoar o efeito de óleos essenciais, visto que alguns
39
fatores, tais como a dose administrada, formulação química adequada e a frequência de
exposição a esses produtos podem promover a otimização do efeito anti-helmíntico de óleos
essenciais, além de minimizar possíveis efeitos toxicológicos, como a irritação da mucosa do
trato gastrintestinal do animal devido à sua sensibilidade e permeabilidade tecidual
(MESQUITA; 2012).
Ademais, outra lacuna no estudo dos efeitos anti-helmínticos dos óleos essenciais é a
inexistência de equivalência entre os resultados obtidos em testes in vitro e in vivo (FERREIRA
et al., 2016; GRANDO et al., 2016). Nos testes in vitro, os nematoides são expostos diretamente
aos compostos bioativos, enquanto nos testes in vivo, os compostos podem ter ação direta sobre
os parasitos presentes no trato gastrointestinal ou sofrer efeito de primeira passagem hepática
(ATHANASIADOU et al., 2011). Assim, a concentração dos compostos ou metabólitos que
atinge os parasitos vai influenciar de maneira decisiva na eficácia anti-helmíntica do produto
(LANUSSE et al., 2015). Neste sentido, investigações que avaliam a farmacocinética e
obtenção de formulações nanoestruturadas de óleos essenciais devem ser estimuladas como
ferramenta para compreender a biodisponibilidade em pequenos ruminantes objetivando adotar
estratégias que visem potencializar o efeito anti-helmíntico desses produtos.
2.5 NANOTECNOLOGIA APLICADA AO CONTROLE DE NEMATOIDES DE
PEQUENOS RUMINANTES
Recentemente, formulações nanoméricas com o objetivo de otimizar o efeito de óleos
essenciais com reconhecida atividade anti-helmíntica têm sido propostas, tais como nanogéis
(MESQUITA et al., 2013; RIBEIRO et al., 2013), nanoemulsões (RIBEIRO et al., 2014) e
nanoestruturas (GRANADO et al., 2015; 2016).
A tecnologia de encapsulamento de óleos essenciais em matrizes biopoliméricas é uma
nova área ainda subexplorada, porém o desenvolvimento de fórmulas farmacêuticas utilizando
matrizes à base de quitosana, por exemplo, para encapsulação de compostos voláteis, é uma
ferramenta que tem propriedades de promover a proteção e maximizar o efeito biológico de
óleos essenciais (PAULA et al., 2011; RIBEIRO et a., 2013).
O encapsulamento de óleos essenciais em matrizes biopoliméricas se baseiam em
propriedades de “Drug Delivery System” que sustentam a concentração de bioativos em sítio
de ação específico, promovendo exposição satisfatória de nematoides a uma concentração
efetiva de fármaco durante um tempo prolongado. Assim, alterações cíclicas na concentração
são eliminadas e a disponibilidade biológica do fármaco é aumentada (VILLANOVA;
40
ORÉFICE; CUNHA, 2010). Como consequência direta dessa propriedade de liberação
controlada, pode haver diminuição do número de doses administradas, redução da toxicidade e
supressão de reações adversas (SWARBRICK, 2007).
A característica físico-química do biopolímero adequado é particularmente importante
no tratamento de nematodioses em pequenos ruminantes devido às condições intrínsecas do
rúmen, isto porque formulações nanoencapsuladas, tais como os hidrogéis e nanoemulsões
respondem a variações de pH do meio, promovendo interações iônicas que podem influenciar
na cinética de liberação do óleo encapsulado (DASH et a., 2011). Assim, sistemas
gastroretensivos são requeridos em situações em que há ação e/ou absorção do produto em
regiões ruminais ou proximais do intestino delgado (BARROCAS, 2007). Nesse caso, a
bioadesividade também é uma propriedade importante que o biopolímero, como é o caso da
quitosana, deve possuir para maior interação química com a mucosa (VILLANOVA;
ORÉFICE; CUNHA, 2010). Esta propriedade pode induzir uma estadia prolongada da matriz
biopolimérica no abomaso, sustentando o sistema de liberação controlada do bioativo.
Na realização de testes controlados de eficácia in vivo, Mesquita et al. (2013)
demonstraram que o óleo de E. staigeriana encapsulado em matriz de quitosana, cujo
componente majoritário foi limoneno (72,9%), apresentou eficácia de 60,79% sobre NGI em
ovinos, sendo mais eficaz que a ivermectina (48,7%).
Assim, a quitosana (figura 4) tem surgido como agente encapsulante de óleos essenciais
para o tratamento de NGI em pequenos ruminantes (RIBEIRO et al., 2013). Esse biopolímero
obtido a partir da desacetilação alcalina da quitina é o polissacarídeo natural mais abundante na
natureza após a celulose (AGNIHOTRI; MALLIKARJURNA; AMINABHAVI, 2004). A
quitina é sintetizada por diversos organismos vivos e ocorre, principalmente, como componente
estrutural de exoesqueletos de artrópodes e nas paredes celulares de fungos e leveduras
(RINAUDO, 2006).
Figura 4 – Estrutura química da quitosana [poly (β1→4-D-glucosamina)]
Fonte: Adaptado de Agnihotri; Mallikarjurna; Aminabhavi (2004)
41
A quitosana tem recebido muita atenção como biopolímero funcional para diversas
aplicações, especialmente em produtos farmacêuticos e medicamentos (ZHANG et al., 2010).
Essa aplicação se deve a sua reconhecida versatilidade como biomaterial por não ser tóxico,
possuir baixa alergenicidade, ser biocompatível, biodegradável, além de possuir propriedades
físicas de interesse, tais como a alta área de superfície, porosidade e resistência à tração
(CHEUNG et al., 2015). Quitosana possui ainda excelente muco-adesividade aos tecidos duros
e macios, sendo possível sua aplicação em ortopedia, oftalmologia e em procedimentos
cirúrgicos. Assim, esse biopolímero tem sido descrito com uma ampla aplicação em sistemas
de entrega coloidal, com uso potencial em medicina veterinária (SENEL; MCCLURE, 2004).
Abulaihaiti et al. (2015) demonstraram efeitos promissores de microesferas de
albendazol e quitosana contra infecção por Echinococcus multilocularis em camundongos.
Outros estudos verificaram o uso de quitosana como agente encapsulante do óleo essencial de
E. staigeriana e E. citriodora para uso contra nematoides gastrintestinais de pequenos
ruminantes (MESQUITA et al., 2013; RIBEIRO et al., 2013; RIBEIRO et al., 2014).
Entretando, esses estudos não demonstraram se o encapsulamento de óleos essenciais
com quitosana promove o aumento de sua eficácia no controle de NGI de pequenos ruminantes.
Assim, a busca por biopolímeros ou polímeros sintéticos como agentes encapsulantes para uso
no tratamento anti-helmíntico de ovinos e caprinos é uma abordagem biotecnológica que
necessita de maiores investigações com vistas a otimizar o efeito desses produtos.
42
3 JUSTIFICATIVA
O uso de anti-helmínticos sintéticos e semi-sintéticos é o método mais largamente
empregado no controle de NGI em pequenos ruminantes por ser uma forma prática, rápida e
eficiente. Porém nenhum composto é capaz de eliminar 100% dos parasitos em todas as
populações, dessa forma, tem-se inevitavelmente o desenvolvimento de resistência anti-
helmíntica que causa o esgotamento das opções de drogas para uso contra o parasitismo, além
de acúmulo de resíduos de anti-helmínticos na carne dos animais e no meio ambiente. Assim,
existe um consenso entre os pesquisadores sobre indicações para reduzir e desacelerar o
desenvolvimento da resistência. Dessa forma, novas estratégias estão sendo investigadas, como
a diminuição do número de administrações anuais de anti-helmínticos, administração desses
fármacos apenas nos animais em risco, utilização de substâncias de origem vegetal com
atividade anti-helmíntica, ou seja, anti-helmínticos não convencionais, e administração de anti-
helminticos sintéticos apenas se a população in refugia for elevada.
Neste contexto, o grupo de pesquisa “Helmintoses de Pequenos Ruminantes” da
Universidade Estadual do Ceará há 22 anos busca produtos naturais que possam auxiliar no
controle de nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes. Duas substâncias que se
destacaram foram os extratos de Spigelia anthelmia e óleos essenciais de Eucalyptus spp.
A utilização de formulações farmacêuticas adequadas, usando inclusive recursos
nanotecnológicos, pode ser uma ferramenta na otimização dos efeitos anti-helmínticos desses
produtos na tentativa de melhorar a eficácia de bioativos vegetais, reduzir o número de doses
administrada e, consequentemente, reduzir a toxicidade e atenuar reações adversas.
Assim, esse trabalho se justifica na medida em que tenta aliar o uso de produtos naturais
à nanotecnologia de encapsulamento desses produtos, tendo como finalidade a oferta de um
produto viável para o controle de nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes ao
produtor.
43
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
O uso de fitoterápicos, tais como o decocto de Spigelia anthelmia e o óleo essencial de
Eucalyptus staigeriana, em suas formulações livre e nanoencapsulada, possuem atividade anti-
helmíntica sobre NGI de pequenos ruminantes.
44
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Identificar um bioativo vegetal livre ou nanoencapsulado para uso no controle de
nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar caracterização fitoquímica do decocto de S. anthelmia;
Avaliar o efeito do DecSa sobre ovos, larvas e adultos de H. contortus;
Avaliar alterações morfológicas in vitro do DecSa em adultos de H. contortus por
meio de microscopia eletrônica de varredura;
Avaliar a segurança toxicológica de DecSa em camundongos e ratos;
Avaliar o efeito in vivo de DecSa sobre NGI de ovinos naturalmente infectados;
Realizar a caracterização química do óleo essencial de E. staigeriana;
Obter e realizar a caracterização físico-química da nanoemulsão do óleo essencial
de E. staigeriana (NanoEs);
Avaliar o efeito ovicida e larvicida in vitro do óleo livre e NanoEs sobre H. contortus
Avaliar a segurança toxicológica de NanoEs em camundongos e ratos;
Avaliar o efeito in vivo da NanoEs sobre NGI de ovinos naturalmente infectados
usando como critério de seleção para tratamento alvo-seletivo o método
FAMACHA.
45
6 CAPITULO I
Effects of Spigelia anthelmia decoction on sheep gastrointestinal nematodes
Efeito do decocto de Spigelia anthelmia sobre nematóides gastrintestinais de
ovinos
Períodico: Small Ruminant Research, v. 153, p. 146–152, 2017
Qualis Capes: B1 (Medicina Veterinária)
46
Effects of Spigelia anthelmia decoction on sheep gastrointestinal nematodes
Wesley L. C. Ribeiro1, Weibson P. P. Andre1, Géssica S. Cavalcante1, José V. de Araújo-Filho1,
Jessica M. L. Santos1, Iara T. F. Macedo1, Janaina V. de Melo2, Selene M. de Morais1, Claudia
M. L. Bevilaqua1*
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, Brazil.
2Laboratório de Microscopia e Microanálise, Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste, Brazil.
* Corresponding author:
Claudia Maria Leal Bevilaqua
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias/FAVET/UECE
Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi
CEP: 60.714-903
Fortaleza, Ceará, Brazil
Phone: + 55 85 31019853 Fax: + 55 85 31019840
E-mail: [email protected]
47
Resumo
O uso de medicamentos à base de plantas quer em combinação ou não com antihelmínticos
sintéticos é uma abordagem para reduzir a exposição de parasitas a produtos químicos
sintéticos. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos in vitro e in vivo do decocto
de Spigelia anthelmia (DecEa) sobre nematóides gastrointestinais de ovinos. O DecEa foi
obtido pela extração de constituintes ativos da planta em água fervente. Os taninos condensados
presentes no DecEa foram quantificados e submetidos à análise fitoquímica. O teste de eclosão
de ovos ovos (TEO), o teste de desenvolvimento de larvas (TDL) e o teste de motilidade em
adultos (TMA) foram realizados. As alterações ultra-estruturais na cutícula do adulto
Haemonchus contortus foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Foram
realizados testes de toxicidade aguda em camundongos para definir a dose segura de DecEa a
ser administrada no teste de redução da contagem de ovos nas fezes (RCOF) em ovinos. No
RCOF, as amostras fecais foram coletadas nos dias 0, 7 e 14 pós-tratamento para estimar os
ovos por grama de fezes (opg) e para identificar os gêneros de nematóides mais prevalentes. Os
resultados do TEO e TDL foram analisados utilizando análise de variância (ANOVA) e
comparados utilizando o teste de Tukey (P<0,05). A concentração efetiva para inibir 50%
(CE50) da eclosão dos ovos ou desenvolvimento de larvas foi determinada pelo método de
probit. No TMA, a sobrevivência dos parasitos foi analisada com o teste de regressão Cox não
paramétrico estratificado. A eficácia no RCOF foi calculada usando o software BootStreat 1.0.
O rastreio fitoquímico detectou altas concentrações de taninos condensados, flavonóides,
flavonas, saponinas, alcalóides e xantonas. Os pesos dos fenóis totais e dos taninos condensados
foram 96,56 e 51,25 mg equivalentes de ácido gálico (GAE) / g de peso seco (DW),
respectivamente. Os valores de CE50 ± 95% de intervalo de confiança de DecEa para o TEO e
TDL foram 1,4 (1,2-1,6) e 1,2 (1-1,3) mg/mL, respectivamente. O tratamento com 1,6 mg/mL
DecSa a produziu 100% de inibição da motilidade de adultos após 12 h de exposição. A MEV
revelou alterações ultraestruturais na região cefálica e na cutícula de fêmeas de H. contortus.
No teste de toxicidade aguda, não houve mortalidade em camundongos. O DecSa na
concentraçaõ de 350 mg/mL reduziu o opg dos ovinos em 47% após 14 dias de tratamento.
Haemonchus foi o gênero de nematóides mais prevalente. Este estudo demonstrou que SaDec
apresenta eficácia promissora contra nematóides gastrointestinais de pequenos ruminantes.
Keywords: Small ruminants; Haemonchus contortus; Phytotherapic; Tannins
48
Abstract
The use of herbal medicines either in combination with or instead of synthetic anthelmintics is
an approach to reducing the exposure of parasites to synthetic chemicals. The present study
aimed to assess the in vitro and in vivo effects of Spigelia anthelmia decoction (SaDec) on sheep
gastrointestinal nematodes. SaDec was obtained by extracting active constituents of the plant in
boiling water. The condensed tannins present in SaDec were quantified and subjected to
phytochemical analysis. The egg hatch test (EHT), the larval development test (LDT), and an
adult worm motility (AWM) assay were performed. Ultrastructural changes in the cuticle of the
adult Haemonchus contortus were evaluated by scanning electron microscopy (SEM). Acute
toxicity tests in mice were performed to define the safe dose of SaDec to be administered in the
fecal egg count reduction test (FECRT). In the FECRT, fecal samples were collected at days 0,
7 and 14 post-treatment to estimate the eggs per gram (epg) and to identify the most prevalent
nematode genera. The results of the EHT and LDT were analyzed using analysis of
variance (ANOVA) and compared using Tukey’s test (P<0.05). The effective concentration to
inhibit 50% (EC50) of egg hatching or larval development was determined by the probit method.
In the AWM assay, worm survival was analyzed with the non-parametric stratified Cox
regression test. The efficacy in the FECRT was calculated using BootStreat 1.0 software. The
phytochemical screening detected high concentrations of condensed tannins, flavonoids,
flavones, saponins, alkaloids and xanthones. The weights of the total phenolics and the
condensed tannins were 96.56 and 51.25 mg gallic acid equivalents (GAE)/g dry weight (DW),
respectively. The EC50 ± 95% confidence interval values of SaDec for the EHT and LDT were
1.4 (1.2–1.6) and 1.2 (1–1.3) mg/ml, respectively. Treatment with SaDec at 1.6 mg/ml produced
100% inhibition of worm motility after 12 h of exposure. SEM revealed ultrastructural changes
in the cephalic region and cuticle of H. contortus females. In the acute toxicity test, there was
no mortality in mice. SaDec at 350 mg/ml reduced the sheep epg by 47% at 14 days post-
49
treatment. Haemonchus was the most prevalent nematode genus. This study demonstrated that
SaDec shows promising efficacy against gastrointestinal nematodes in small ruminants.
Keywords: small ruminants; Haemonchus contortus; phytotherapic; tannins.
50
1 Introduction
The impact of gastrointestinal nematode (GIN) infection in small ruminants is linked to
clinical signs associated with infection and also to subclinical economic losses due to decreased
growth and milk production (Martinez-Valladares et al., 2015). GIN control programs are
primarily based on a combination of animal management practices and the use of anti-parasitic
drugs (Lifschitz et al., 2014). The intensive use of synthetic chemical anthelmintics in small
ruminant grazing farms has resulted in the widespread development of resistance to these
products (Jackson et al., 2012). Furthermore, the residue of some persistent chemicals in the
environment disrupts the ecosystem and poses a threat to human health (Qi et al., 2015).
Therefore, anthelmintic resistance in parasitic nematodes is a global threat to sustainable
livestock production (Kaplan et al., 2004, Dos Santos et al., 2017).
The development of sustainable and environmentally acceptable methods of nematode
control has become a necessity (Ribeiro et al., 2015). The use of phytotherapics has been
considered a suitable approach to nematode control in small ruminants (Sandoval-Castro et al.,
2012, Macedo et al., 2015, Ribeiro et al., 2015). The anthelmintic effects of phytotherapics have
generally been associated with the presence of one or more plant secondary metabolites, such
as condensed tannins (CTs) (Hoste and Torres-Acosta, 2011). CTs of different plants have
different physical and chemical properties, and CT composition may vary between organs
within the same plant species (Mangan, 1988, Salminen and Karonen et al., 2011). The
mechanism of action of differing subgroups of CTs on small ruminant gastrointestinal
nematodes has not been clearly described (Kommuru et al., 2015). For example, tannin-rich
plants may act through direct antiparasitic activity but might also act indirectly by increasing
host resistance (Hoste et al., 2006).
51
Reduced nematode egg laying, impaired development of eggs into third-stage larvae
(L3), and lower establishment of L3 in the host can be considered direct effects of tanniniferous
plants (Hoste et al., 2012). Alternatively, the tannins may act indirectly, by improving the
interactions of proteins in the host and consequently improving the immune response to
parasites (Hoste et al., 2006).
Physicochemical conditions such as the pH of the gastrointestinal tract organs of small
ruminants may influence the biological effect of CTs; for example at the pH of the abomasum
(2.5- 3), there is a dissociation of the tannin-protein complexes formed in the rumen (Hagerman
et al., 1982, Min et al., 2003). However, at the beginning of the small intestine, where the pH
is approximately 5.5, these complexes can be reconstituted (McNabb et al., 1998). This
condition can cause CTs to have a greater effect on Haemonchus contortus than on
Trichostrongylus colubriformis as reported by Minho et al. (2008).
Tannin-rich plants can be used as nutraceuticals for small ruminants (Hoste et al., 2015),
especially in situations of feed scarcity during dry periods (Oliveira et al., 2013), and their use
can be considered for combined treatment with synthetic anthelmintics (Gaudin et al., 2016).
However, the excessive consumption of tannins can detrimentally affect the parasitized host
(Hoste et al., 2006). Possible anti-nutritional consequences of these compounds have been
reported and should be considered in the use of tanniniferous plants as nutraceutical products
(Athanasiadou, et al., 2001). In particular, disturbances of digestive physiology and decreases
in nutrient digestibility can occur in small ruminants (Min et al., 2003).
Spigelia anthelmia (Loganiaceae) is a plant native to Asia and tropical South America
and is widely used as an anthelmintic in Brazilian folk medicine (Braga, 2001). Phytochemical
studies have revealed that the alkaloid spiganthine is the major component of S. anthelmia
(Achenbach et al., 1995, Morais et al., 2002). Other minority compounds linked to the alkaloid
spiganthine exhibit insect antifeedant activities (Hübner et al., 2001).
52
The nematicidal effect of S. anthelmia ethanolic extract against sheep GIN has been
described previously (Ademola et al., 2007). S. anthelmia ethyl acetate extract exhibited
ovicidal and larvicidal effects on H. contortus (Assis et al., 2003) and can cause tonic paralysis
at the level of acetylcholine neurotransmission (Camurça-Vasconcelos et al., 2004). However,
decoction, a method of extracting plant material in boiling water, is the one most commonly
used by small farmers and traditional communities in the empirical treatment of animals and
humans in North and Northeast Brazil (Monteiro et al., 2011, Paulino et al., 2012). These
ethnoveterinary descriptions thus prompted the present study to evaluate the anthelmintic effect
of S. anthelmia decoction (SaDec).
Few studies have tried to explain the mode of action of the herbal and/or isolated
products from a vegetable against small ruminant GINs. Recently, a scanning electron
microscopy (SEM) technique has been used to demonstrate potential anthelmintic effects on
the H. contortus cuticle in an attempt to predict the direct effect of these products on the cuticle
of sheep nematodes (Martínez-Ortíz-de-Montellano et al., 2013, Kommuru et al., 2015, Andre
et al., 2016).
The objective of the present study was to assess the in vitro and in vivo effects of SaDec
on sheep GIN.
2 Materials and methods
2.1 Animal ethics approval
The experimental protocol was approved by the ethics committee for animal use of the
Universidade Estadual do Ceará (Approval number: 5166759/14).
53
2.2 S. anthelmia decoction
The aerial parts of S. anthelmia were collected on the campus of Universidade Estadual
do Ceará, Brazil, between January and March 2015. The samples of the plant were identified
and authenticated by botanists at the Prisco Bezerra Herbarium of the Universidade Federal do
Ceará, Brazil (Voucher specimen number: 55223).
In total, 1,650 g of the aerial parts of S. anthelmia was crushed in an electric crusher.
Subsequently, 4 l of distilled water was added to the resulting material. The mixture was heated
at 85 °C (decoction method) for 30 minutes. The decoction was filtered with gauze and then
with Whatman® No. 1 filter paper (diameter: 110 mm; pore size: 11 µm). The resulting
decoction was lyophilized.
2.3 Phytochemistry
Phytochemical screening to identify the major classes of secondary metabolites of
SaDec was performed according to the methodology described by Matos (2009). The chemical
characterization was based on the addition of specific reagents to aliquots of the decoction and
observation of the changes in the solution color or precipitate formation (Macedo et al., 2015).
The total phenolics (TP) in the SaDec were measured using the Folin-Ciocalteu method
according to Makkar (2003). Polyvinyl polypyrrolidone (PVPP) was added, and then the total
tannin was calculated as the difference in the TP when measured with and without the addition
of PVPP. Then, a tannic acid standard curve was plotted, with the results expressed as tannic
acid equivalents (Oliveira et al., 2013). The TP content was converted to milligrams of gallic
acid equivalents per gram of dry weight (mg GAE/g DW) using a calibration curve for gallic
acid (0–400 µg/ml) (Vermerris and Nicholson, 2006). The condensed tannins were measured
using the butanol–HCl assay (Makkar, 2003).
54
2.4 Egg hatch test (EHT)
The assay was based on a modification of the EHT, which is performed to measure
anthelmintic resistance (Coles et al., 1992). One sheep was experimentally infected with the
Inbred-susceptible-Edinburgh (ISE) isolate of H. contortus, and it was used as a source of eggs,
which were recovered according to the method described by Hubert and Kerboeuf (1992).
Aliquots of a suspension containing approximately 100 fresh H. contortus eggs were incubated
with lyophilized SaDec at concentrations of 0.31, 0.62, 1.25, 2.5, 5 and 10 mg/ml for 48 h at 25
°C. The hatching of eggs was stopped by adding Lugol’s iodine solution. The eggs and first-
stage larvae (L1) were counted under a light microscope. The negative control was distilled
water, and the positive control was 0.025 mg/ml thiabendazole. Three completely replicated
assays with five repetitions of each concentration were performed.
2.4 Larval development test (LDT)
The LDT was based on the method of Hubert and Kerboeuf (1992). Aliquots of 250 µl
of a suspension containing approximately 100 fresh eggs obtained by fecal washing were added
to each well of a 24-well microplate. Then, 80 µl of a nutrient solution containing yeast extract
(Sigma-Aldrich®, USA), Escherichia coli (Sigma-Aldrich®, USA), amphotericin B (A9538,
Sigma-Aldrich®, USA), 0.9% saline solution and Earle's balanced salt solution (ATCC E9637,
Sigma-Aldrich®, USA) was added to each well, and the microplate was incubated at 27 ± 1 °C.
After 24 h, the L1 hatching and viability were checked based on sinusoidal larval movement,
and subsequently, aliquots of SaDeC in concentrations from 0.31, 0.62, 1.25, 2.5 and 5 mg/ml
were added to the wells that already contained the nutrient solution. SaDec was diluted in
distilled water, which was also used as the negative control, and the positive control was 100
55
µg/ml ivermectin. The plate was again incubated at 27 ± 1 °C. After six days, the larvae were
killed with Lugol's iodine solution. H. contortus in the first three larval stages (L1, L2, and L3)
were counted in each well under a light microscope. Three completely replicated assays with
five repetitions of each concentration were performed.
2.5 Adult worm motility (AWM)
The AWM assay was conducted according to the methodology described by
Hounzangbe-Adote et al. (2005).
A sheep was experimentally infected with a single dose of 4,000 larvae of the ISE isolate
of H. contortus. After confirmed infection over 5,000 eggs per gram (epg) of feces, the sheep
was euthanized by the use of a captive bolt pistol according to the Brazilian legislation for
animal welfare (CONCEA, 2015), and it was used as source of adult worms.
Adult female H. contortus were recovered from the sheep’s abomasum and washed in
0.9% saline solution at 37 °C. After the worms were assessed for viability, they were distributed
in 24-well plates at a ratio of 3 worms per well in a medium containing 1 ml of phosphate
buffered saline (PBS) and 4% penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich®, USA). The nematodes
were incubated at 37 °C in a gas phase of 5% CO2/95% air mixture for 1 h. Then, 1 ml SaDeC
at concentrations of 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 and 1.6 mg/ml was added to the wells. After 6, 12,
18 and 24 h of incubation, the motility and survival of the adult worms were observed under an
inverted light microscope at a magnification of 40×. The worms that showed no motility during
2 minutes of observation were considered dead. The negative control was 1 ml of PBS with 4%
penicillin/streptomycin, and the positive control was 100 µg/ml ivermectin (Ivomec®, Merial
Saúde Animal, Brazil). Eight replicates for each treatment and for each control were performed.
56
2.6 Scanning electron microscopy (SEM)
Adult female H. contortus in a medium containing 1 ml PBS and 4%
penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich®, USA) were treated with 0.8 mg/ml SaDec under the
same conditions as in the AWM assay for 24 h and used to evaluate the ultrastructural changes
in the worm cuticle by scanning electron microscopy (SEM). Untreated worms were used as
the negative control. The cuticle and cephalic region of ten parasites were evaluated for each
group.
Initially, the specimens were preserved according to the methodology described by
Karnovsky (1965), in a medium composed of 5% glutaraldehyde in a phosphate emulsifier
buffer containing 0.1 M sodium cacodylate (Sigma-Aldrich®, USA) at pH 7.4 and 4 °C for 72
h. Next, they were post-fixed in 1% osmium tetroxide in a phosphate emulsifier at pH 7.4 for 1
h. Then, the specimens were washed twice with 0.2 M sodium cacodylate buffer/distilled water
and dehydrated in a series of acetone solutions of increasing concentration. The specimens were
then critical point dried using a Critical Point Dryer (CPD 030, BAL-TEC, Liechtenstein),
mounted on slides, covered in a 10 nm layer of gold-palladium using a Leica SCD 500 (Leica
Microsystems, Germany) and analyzed using a scanning electron microscope FEI Quanta 200
FEG ESEM (FEI Company, USA) at an accelerating voltage of 20 kV.
2.7 Acute toxicity in mice
The acute toxicity test in mice was designed to define the safe dose of SaDec for
administration in sheep. Therefore, female Swiss albino mice (n= 36) with an average weight
of 25.6 ± 2.2 g were allowed to acclimate to the experimental conditions (cycle of 12 h
light/dark and a temperature of 22 ± 2 °C) for seven days, during which they were kept in
57
polypropylene boxes. Ionized commercial feed (Nuvilab®, Brazil) and filtered water were
provided ad libitum to the rodents. The mice were randomly divided into the following 6
groups: G1 to G5, in which they received 1,000, 2,000, 3,000, 4,000 and 5,000 mg/kg SaDec,
respectively; and G6 (the negative control), which received distilled water. The treatments were
administered in a single oral dose of 0.2 ml. The animals were carefully observed individually
for any signs of toxicity at least once during the first 30 minutes after dosing, periodically during
the first 24 h (with special attention given during the first 4 h), and daily thereafter for a period
of 14 days (OECD, 2001).
2.8 Fecal egg count reduction test (FECRT)
Thirty sheep from 6 to 18 months old and with an average weight of 21 ± 6.5 kg that
were naturally infected with GIN at an epg greater than 1,000 were selected and randomly
divided (n=10) into three groups: G1, receiving 350 mg/kg SaDec; G2, receiving 2.5 mg/kg
monepantel (Zolvix®, Novartis Animal Health, New Zealand) and G3, receiving distilled water.
The treatments were administered orally in a single dose. Fecal samples were collected on days
0, 7 and 14 post-treatment to estimate the epg. A larval culture using a pool of feces from each
group was performed to identify the nematode genera. The identification of L3 was based on
Ueno and Gonçalves (1998).
2.9 Statistical analysis
The larval hatching percentage was determined according to the following formula:
(number of hatched larvae / number of hatched larvae + number of eggs) × 100. The percent
inhibition of larval development was calculated as follows: (Number of L3/total number of
larvae per well) × 100.
58
The larval hatching percentage in the EHT and the percent inhibition of larval
development in the LDT were analyzed using analysis of variance (ANOVA), and the mean
effects for each concentration were compared by Tukey’s test using GraphPad Prism® 5.0
software (GraphPad Software Inc., USA). The dose–response relationships in the EHT and
LDT were determined considering the statistical level of significance as P<0.05. The effective
concentrations to inhibit 50% (EC50) of larval hatching or to cause 50% inhibition (EC50) of
larval development were determined by the probit method using IBM SPSS Statistics version
22 for Windows (IBM, USA).
The adult worm motility was evaluated as the number of motile worms/total number of
worms per well. The survival of worms was analyzed with the non-parametric stratified Cox
regression test for evaluation of dose–response relationship using Minitab® Release 17 software
(Minitab Inc., USA). The results of the worm motility inhibition are expressed as the
mean ± standard deviation (SD) (P<0.05).
The anthelmintic efficacy of SaDec was interpreted through the FECRT based on each
group arithmetic mean faecal egg counts using the following formula: FECRT = 100×(1-
[T2/T1] [C1/C2]), in which the arithmetic faecal egg count means in controls (C) and treated
(T) animals before (T1 and C1) and 7 or 14 days after (T2 and C2) deworming were compared
(Dash et al., 1988), and 95% confidence intervals were estimated using BootStreat 1.0 software
(Cabaret, 2014). The epg were log transformed (log10[x+1]), submitted to ANOVA and
compared using Tukey’s test using Graph Pad Prism® 5.0 software (Ribeiro et al., 2014).
59
3 Results
3.1 Phytochemistry
The yield of the SaDec after lyophilization was 10.4% of the initial weight of the aerial
parts of S. anthelmia. The phytochemical test showed the presence of condensed tannins,
flavonoids, flavones, saponins, alkaloids and xanthones. The weights of the total phenolics and
condensed tannins were 96.56 and 51.25 mg GAE/g DW, respectively.
3.2 In vitro tests
The effect of the SaDec in the EHT and LDT is presented in Table 1. When used at 10
mg/ml, SaDec was found to inhibit 99.3% of egg hatching. The effective concentration of
SaDec that was able to inhibit 97.8% of larval development was 5 mg/ml. The effect of higher
and lower concentrations of SaDec in the EHT and LDT were not significantly different from
their respective positive and negative controls in both tests. (P>0.05).
Table 1. Mean effects (± standard deviation) of Spigelia anthelmia decoction on
Haemonchus contortus in the egg hatching test (EHT) and larval development test (LDT).
Concentration (mg/ml) EHT LDT
10 99.3±1.1A -
5 90.0±3.3B 97.8±2.4A
2.5 71.1±7.8C 83.3±3.8B
1.25 42.1±4.9D 50.0±4.9C
0.62 23.9±5.9E 20.4±6.1D
0.31 2.8±2.3F 2.8±2.2E
Negative Control 2.9±2.1F 2.2±2.5E
Positive Control 98.0±1.8A 96.4±2.2A
Capital letters denote comparisons of the means in the columns. Different letters indicate
significantly different values (P<0.05). Distilled water was the negative control in both tests. The
positive controls for EHT and LDT was 0.025 mg/ml thiabendazole and 0.008 mg/ml ivermectin,
respectively. The EHT and LDT were performed in three repetitions with five replicates for each
treatment and for each control.
60
The EC50±95% confidence interval (CI) values were 1.4 (1.2 – 1.6) and 1.2 (1 – 1.3)
mg/ml for SaDec in the EHT and LDT, respectively. The EC95±95% CI values were 6.8 (5.5 –
8.8) and 4.1 (3.4 – 5.1) mg/ml for SaDec in the EHT and LDT, respectively. The inhibition of
egg hatching and larval development were dose-dependent.
The results of the AWM assay are presented in Figure 1. SaDec at 1.6 mg/ml inhibited
100% of the worm motility after 12 h of exposure. This effect was not significantly different
from that seen in the positive control (P<0.05). Regression analysis indicates that there is a dose-
dependent effect of SaDec after 24 h of incubation.
Figure. 1. The effect of a Spigelia anthelmia decoction (SaDec) on the inhibition of adult
Haemonchus contortus motility. Phosphate buffered saline (1 ml) containing 4%
penicillin/streptomycin was used as the negative control. The positive control was 100 µg/ml
ivermectin. The error bars indicate standard deviation of the mean (P<0.05).
SEM revealed ultrastructural changes in the cephalic region and cuticle of female H.
contortus after exposure to 0.8 mg/ml SaDec (Figure 2). Wrinkling of the cuticular ridges was
observed in the cephalic region (A2) and cuticle (B2). Cuticular detachments were observed on
0
20
40
60
80
100
0 6 12 18 24
Liv
e w
orm
s (%
)
Time (h)
Negative control
IVM (100 µg/ml)
1.6 mg/ml
0.8 mg/ml
0.4 mg/ml
0.2 mg/ml
0.1 mg/ml
0.05 mg/ml
61
the proximal cephalic region. Moreover, a deformation of the lancet located in the dorsal surface
of the oral cavity was observed (Figure 2, A2).
Figure 2. A scanning electron microscopy image showing ultrastructural changes in the
cephalic region and cuticle of adult female Haemonchus contortus after incubation in 1 ml
phosphate buffered saline (PBS) containing 4% penicillin/streptomycin (A1 and B1) (negative
control) or 0.8 mg/ml Spigelia anthelmia decoction (A2 and B2).
3.3 In vivo tests
There was no mortality of mice in the acute toxicity test. Moreover, no change in
behavior indicating a clinical condition of poisoning of the animals by SaDec was observed.
62
The FECRT results are expressed as the mean epg (± 95% CI) on days 0, 7 and 14 post-
treatment (Table 2). SaDec and monepantel reduced epg by 47% and 83%, respectively, after
14 days post-treatment, indicating that both approaches presented low efficacy against the
population of gastrointestinal nematodes of the evaluated sheep.
Table 2. The egg counts per gram of feces (epg) and percentage efficacy ± 95% confidence
interval (95% CI) of 350 mg/ml Spigelia anthelmia decoction (SaDec) in the fecal egg count
reduction test (FECRT).
Treated groups Day 0 Day 7 Day 14
SaDec
Mean epg 6,095Aa 5,008Aa 3,240Ba
Efficacy (%) (95% CI) -- 9 (-200 to 79) 47 (-69 to 88)
Positive control
Mean epg 3,250Ab 955Bb 530Bb
Efficacy (%) (95% CI) -- 67 (-41 to 96) 83 (36 to 99)
Negative Control
Mean epg 2,800Ab 2,825Aa 2,980Aa
Efficacy (%) (95% CI) -- NA NA
Capital letters compare the means in the lines, and the lowercase letters denote comparisons of the means
in the rows. Different letters indicate significantly different values (P<0.05). The positive control group
(G2) was treated with 2.5 mg/kg monepantel (Zolvix®), and the negative control group (G3) received
distilled water. NA = not applicable.
Prevalence of nematode genera in the FECRT is presented in Table 3. Haemonchus spp.
was the most prevalent among larvae in all groups.
63
Table 3. Prevalence (%) of nematode genera in the fecal egg count reduction test (FECRT)
on days 0, 7 and 14 post-treatment.
Treated groups Day 0 Day 7 Day 14
SaDec
Haemonchus spp. 61 57 49
Trichostrongylus spp. 37 42 47
Oesophagostumum spp. 2 1 1
Positive control
Haemonchus spp. 68 65 69
Trichostrongylus spp. 27 31 26
Oesophagostumum spp. 5 4 5
Negative control
Haemonchus spp. 66 69 68
Trichostrongylus spp. 31 2 28
Oesophagostumum spp. 3 29 4
The SaDec group was treated with 350 mg/ml Spigelia anthelmia decoction. The positive control
group (G2) was treated with 2.5mg/kg monepantel (Zolvix®), and the negative control group (G3)
received distilled water.
4 Discussion
One of the great challenges of veterinary parasitology is the search for alternative
methods for controlling gastrointestinal parasites in small ruminants. In this context, the use of
herbal medicine as anthelmintic has been considered for the control of GINs in small ruminants,
and this alternative approach can reduce the use of anthelmintic synthetic drugs (Engströmet
al., 2016).
The complex composition of plant products can result in difficulties in characterizing
and validating natural products as anthelmintic (Hoste et al., 2012). However, the interactions
among various chemical components of a vegetable preparation may be important to slow the
development of anthelmintic resistance. Plant secondary metabolites (e.g., CTs) have been
considered in the control of GINs in small ruminants (Hoste et al., 2016).
64
The CTs content can vary depending on the plant’s metabolism under the influence of
biotic and abiotic factors (Pavarini et al., 2012). Furthermore, Klongsiriwet et al. (2015)
demonstrated that the effect of CTs on H. contortus is associated with synergism with
flavonoids. In the present study, the phytochemical analysis detected a high concentration of
CTs that was greater than those described for Anadenanthera colubrina, Leucaena
leucocephala and Mimosa tenuiflora leaves, which contained 40.68, 45.21 and 30.13 mg
GAE/g DW, respectively (Oliveira et al., 2011).
The effects of SaDec in the EHT and LDT in the present study were greater than those
of the ethyl acetate extract of S. anthelmia, which inhibited 100% of the egg hatching and 81.2%
of the larval development at a dose of 50 mg/ml (Assis et al., 2003). In the LDT, the LC50 of S.
anthelmia aqueous and ethanolic extracts against L3 strongyles were 0.714 mg/ml and 0.628
mg/ml, respectively (Ademola et al., 2007). These values were lower than in the present study.
Furthermore, a lower LC50 value in the LDT compared to that in the EHT was also shown in
the present study. The possible synergistic action among the various compounds present in the
S. anthelmia extracts may have been responsible for the different effects of these products on
H. contortus eggs and larvae, as demonstrated for Acacia pennatula and sainfoin (Onobrychis
viciifolia) acetone:water extracts in the EHT (Chan-Pérez et al., 2016).
In the present study, inhibition of 100% of H. contortus adult motility was achieved
after incubation for 12 h at a dose of 1.6 mg/ml. The ethyl acetate extract of Calotropis procera
latex at 100 µg/ml reduced H. contortus adult motility by 100% (Cavalcante et al., 2016). Crude
aqueous and ethanolic extracts of Artemisia campestris at doses of 2 mg/ml reduced the in vitro
motility of adult H. contortus by 71 and 100% after 24 h, respectively (Akkari et al., 2014).
Although the in vitro assay was relatively brief compared to the EHT and LDT, the AWM assay
provides more reliable screening results of substances with anthelmintic action in vivo. This
assay is important because it assesses the in vivo effect of a product on the adult parasite, given
65
that the in vitro effects of bioactive substances do not always correspond to anthelmintic
effectiveness in the target species.
More recently, SEM has been used to demonstrate direct effects of products with
potential anthelmintic effects (Martínez-Ortíz-de-Montelhano et al., 2013, Yoshihara et al.,
2015, Andre et al., 2016). This technique assesses the interaction of compounds with the
helminth cuticle (Martínez-Ortíz-de-Montellano et al., 2013). This is especially important in
the evaluation of the direct effects of CTs because although the CT mechanism of action is not
completely clear, there is a high correlation between phenolic content and the anthelmintic
activity of the compounds (Akkari et al., 2016).
In the present study, there was accentuated wrinkling of the cuticular ridges in the
cephalic region and cuticle and structural changes in the H. contortus oral cavity region. The
presence of transverse and longitudinal wrinkles on the cuticle of H. contortus upon contact
with sources of CTs has been described previously (Martínez-Ortíz-de-Montellano et al., 2013,
Yoshihara et al., 2015). Andre et al. (2016) showed loss of the normal appearance of the vulvar
flap of female H. contortus and bubbles emerging from the worm cuticle after contact with
carvacryl acetate. The description of skin wrinkles in H. contortus caused by substances with
potential anthelmintic effects is unanimous in the literature, and it seems plausible because the
worm cuticle is a protective barrier and is involved in both motility and metabolic exchanges
that occur in the digestive tract of small ruminants (Martínez-Ortíz-de-Montellano et al., 2013).
The toxicological safety of SaDec was evaluated in mice. Toxicity tests in rodents are
important for assessing the safety of a drug; only then is the product is tested in the target species
(Camurça-Vasconcelos et al., 2005). A dose of 5,000 mg/kg did not cause any mortality and/or
change of animal behavior; therefore, the product was considered safe. Although the maximum
recommended dose for acute toxicity testing is 2,000 mg/kg, we used the 5,000 mg/kg dose to
ensure that SaDec was safe for target species. This decision was based on specific guidelines
66
for the performance of acute toxicity (OECD, 2001). The low toxicity of SaDec may be
associated with the molecular weight of the CTs present in the decoction if the CTs with higher
molecular weight are not absorbed (McLeod, 1974).
The effectiveness of SaDec and monepantel in the FECRT were 46.8% and 83% at a
dose of 350 mg/kg and 2.5 mg/ kg, respectively. These effects are remarkably low for what is
proposed for anthelmintics according to World Association for the Advancement of Veterinary
Parasitology (WAAVP) guidelines (Wood et al., 1995). The poor efficacy of monepantel has
also been reported in sheep farms in Uruguay and in goats from New Zealand (Scott et al., 2013,
Mederos et al., 2014).
Thus, more detailed studies involving the description of the mode of action of the
product and its effect on the controlled anthelmintic efficacy test in sheep should be conducted
so that the efficacy of SaDec as a phytotherapic with potential effects on GINs can be
reconsidered. In addition, tests with new pharmaceutical formulations of SaDec, multiple doses
delivery or the usage of SaDec as a nutraceutical product can be considered in the validation of
its anthelmintic effect. Although these are preliminary results, the low efficacy of SaDec does
not invalidate further studies that may be developed to isolate and test the CTs and/or flavonoids
present in SaDec, as it demonstrated an in vitro synergistic effect of these two classes of
secondary metabolites against H. contortus (Klongsiriwet et al., 2015).
Promising results were observed for 500 mg/kg S. anthelmia ethanolic extract, which
decreased the epg by 76, 79.8, 75 and 12.3% for Strongyloides spp., Oesophagostomum spp.,
Haemonchus spp. and Trichostrongylus spp., respectively, after 12 days post-treatment
(Ademola et al., 2007). In the present study, the effects were milder, but it is important to note
that the ethanol extract dose was higher than that used for SaDec.
Haemonchus spp. and Trichostrongylus spp. were the most prevalent genera in all of the
coprocultures. In the present study, SaDec reduced of Haemonchus spp. prevalence as observed
67
in Table 3. Consequently, a relative increase in Trichostrongylus spp. prevalence was observed.
This effect might be due to the influence of pH in dissociation and reconstitution of tannin-
protein complexes in the different infected organs (Hagerman et al. 1982, McNabb et al. 1998,
Min et al. 2003, Minho et al. 2008).
The present study demonstrated the effects of SaDec against small ruminant GINs.
Additional studies are necessary to isolate and identify CT subgroups present in SaDec in an
attempt to optimize the results obtained because studies related to the structural features of CTs
and their anthelmintic activity are scarce (Quijada et al., 2015). In addition, the present study
contributes to the numerous reports of plants with anthelmintic effects. The use of herbal
medicines as an alternative method of controlling hemonchosis in sheep should be pursued
further, as the ineffectiveness of synthetic and semi-synthetic anthelmintics due to the resistance
or multiresistance of GIN populations is a worldwide problem.
Acknowledgments
We thank Dr. J. Cabaret from INRA for providing the ISE isolate of H. contortus. The
authors also thank Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(FUNCAP) (CI3-0093-001020100/14) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq) (458011/2014-2) for their financial support. Mr. Ribeiro received a
doctoral research scholarship from Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Dr.
Bevilaqua was supported by a fellowship from CNPq (303018/2013-5).
Conflicts of interest
The authors declare that they have no conflicts of interest.
68
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7 CAPÍTULO II
In vitro effects of Eucalyptus staigeriana nanoemulsion on Haemonchus
contortus and toxicity in rodents
Efeito in vitro da nanoemulsão de Eucalyptus sataigeriana sobre Haemonchus
contortus e toxicidade em roedores
Períodico: Veterinary Parasitology, v. 2012, p. 444–447, 2015
Qualis Capes: A2 (Medicina Veterinária)
76
In vitro effects of Eucalyptus staigeriana nanoemulsion on Haemonchus contotus and
toxicity in rodents
Wesley Lyeverton Correia Ribeiro1, Ana Lourdes Fernandes Camurça-Vasconcelos1, Iara
Tersia Freitas Macedo1, Jessica Maria Leite dos Santos1, José Vilemar de Araújo-Filho1, Juliana
de Carvalho Ribeiro1, Vanessa de Abreu Pereira2, Daniel de Araújo Viana3, Haroldo Cesar
Beserra de Paula2, Claudia Maria Leal Bevilaqua1*
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, Brazil
2Departamento de Química Analítica e Físico-Química, Universidade Federal do Ceará, Brazil
3Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Brazil
* Corresponding author:
Claudia Maria Leal Bevilaqua
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias/FAVET/UECE
Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi CEP 60714-903
Phone: + 55 85 31019853 Fax: + 55 85 31019840
E-mail: [email protected]
77
Resumo
As estratégias para controlar os nematóides gastrointestinais têm sido desenvolvidas com base
no uso de inúmeros métodos alternativos, incluindo o uso da fitoterapia. Novas formulações de
óleos essenciais com atividade anti-helmíntica têm sido propostas como meio de otimizar seus
efeitos biológicos. Assim, o objetivo deste estudo foi formular uma nanoemulsão para otimizar
o efeito nematicida do óleo essencial de Eucalyptus staigeriana (EsEO). Inicialmente, foram
realizadas análises físico-químicas para verificar a estabilidade da nanoemulsão de E.
Staigeriana (EsNano). Foram realizados testes in vitro para avaliar as atividades ovicidas e
larvicidas de EsNano e EsEO sobre Haemonchus contortus, e os testes de toxicologia foram
então realizados em roedores. O conteúdo de EsEO na nanoemulsão foi de 36,4% (v/v), e o
tamanho médio de partícula foi de 274,3 nm. EsNano e EsEO inibiram a eclosão de larvas em
99% e 96,3% nas concentrações de 1 e 2 mg/mL, respectivamente, e inibiram o
desenvolvimento de larvas em 96,3% e 97,3% a concentrações de 8 mg/mL. O teste de
toxicidade aguda revelou que as doses de EsNano e EsEO necessárias para matar 50% dos
camundongos (DL50) foram de 1.603,9 e 3.495,9 mg / ml, respectivamente. EsNano não alterou
os parâmetros hematológicos dos ratos após o tratamento.
Palavras-chave: Haemonchus contortus; Anti-helmíntico; Nanoemulsão; Quitosana
78
Abstract
Strategies for controlling gastrointestinal nematodes have been developed based on the
use of numerous alternative methods, including the use of phytotherapy. New formulations of
essential oils with anthelmintic activity have been proposed as a means to optimize their
biological effects. Thus, the objective of this study was to formulate a nanoemulsion to optimize
the nematicide effect of Eucalyptus staigeriana essential oil (EsEO). Initially, physico-
chemical analyses were performed to verify the stability of the E. staigeriana nanoemulsion
(EsNano). In vitro tests were conducted to evaluate the ovicidal and larvicidal activities of both
EsNano and EsEO against Haemonchus contortus, and toxicology tests were then performed
on rodents. The EsEO content in the nanoemulsion was 36.4% (v/v), and the mean particle size
was 274.3 nm. EsNano and EsEO inhibited larval hatching by 99% and 96.3% at 1 and 2 mg/ml
concentrations, respectively, and inhibited larval development by 96.3% and 97.3% at 8 mg/ml
concentrations. The acute toxicity test revealed that the EsNano and EsEO doses required to
kill 50% of the mice (LD50) were 1,603.9 and 3,495.9 mg/ml, respectively. EsNano did not
alter the hematological parameters in the rats after treatment.
Keywords: Haemonchus contortus; Anthelmintic; Nanoemulsion; Chitosan.
79
1 Introduction
Inappropriate application of anthelmintics to control gastrointestinal nematodes (GINs)
has promoted the selection of a Haemonchus contortus resistant population (Santos et al., 2014).
Therefore, the development of effective and environmentally acceptable methods of nematode
control has become a necessity.
The nematicide action of Eucalyptus staigeriana essential oil (EsEO) has been described
previously (Macedo et al., 2010). To protect and maximize the nematicidal effect of EsEO,
encapsulation techniques employing chitosan have been investigated (Ribeiro et al., 2014).
However, the hydrogel obtained in previous studies has not shown anthelmintic activity, and a
suitable formulation is still needed for administration under field conditions (Ribeiro et al.,
2013). Thus, the use of a nanoemulsion formulation is recommended because of its greater
capacity for entrapping the oil and maintaining a fluid consistency, which can facilitate
administration of the drugs to target species (Chime et al., 2014).
The objective of this study was to assess the anthelmintic activity of an E. staigeriana
nanoemulsion (EsNano) against H. contortus, in addition to its toxicity in rodents and physico-
chemical characteristics.
2 Materials and methods
2.1 Preparation and physico-chemical analysis of E. staigeriana nanoemulsion
The chemical composition of the EsEO (Avondale Essências, Paraná, Brazil) was
determined by gas chromatography and mass spectrometry (Adams, 2001).
80
A mixture of EsEO and Tween 80 at a 4:1 ratio was added to a 1% chitosan (w/w)
solution, under stirring at 188.5 rad/s for 5 min using a mechanical stirrer. The macroscopic
characteristics of EsNano stability were observed over 72 h at 27°C.
The size and distribution of nanoparticles in solution were determined using a beam of
red light with a wavelength of 633 nm (ZetaSizer 3600, Malvern, United Kingdom).
2.2 Animal welfare
The protocol was approved by the ethics committee for animal use of Universidade
Estadual do Ceará (10461354-8/65).
2.3 Egg hatch test
The egg hatch test (EHT) was performed based on the methodology described by Coles
et al. (1992). Sheep experimentally infected with a H. contortus population resistant to
benzimidazole was used as sources of eggs, which were recovered according to Hubert and
Kerboeuf (1992). Aliquots of a suspension containing approximately 100 fresh H. contortus
eggs were incubated with EsNano at concentrations of 0.06 to 2 mg/ml or with EsEO at
concentrations of 0.125 to 2 mg/ml for 48 h at 27°C. Next, a drop of Lugol’s iodine was added
to stop larvae hatching. The eggs and first-stage larvae (L1) were counted under a light
microscope. The negative control for EsNano was a 1% chitosan solution and that for EsEO
was 3% Tween 80. The positive control was 0.025 mg/ml thiabendazole. Three repetitions with
five replicates for each treatment and for each control were performed.
The hatching percentage was determined according to the following equation: number
of hatched larvae / (number of hatched larvae + number of eggs) x 100.
81
2.4 Larval development test
An aliquot of egg suspension was incubated for 24 h at 27°C to obtain L1 (Hubert and
Kerboeuf, 1992). Next, 500 µl of a suspension containing approximately 250 L1 was incubated
for 6 days at room temperature with the same volume of EsNano or EsEO at a concentration of
1 to 8 mg/ml in 1 g of feces collected from a gastrointestinal nematode-free sheep. Third-stage
larvae (L3) were recovered according to Roberts and O'Sullivan (1950) and counted under a
light microscope. The negative control for EsNano was a 1% chitosan solution and that for
EsEO was 3% Tween 80. The positive control was 0.008 mg/ml ivermectin. Three repetitions
with five replicates for each treatment and for each control were performed.
The inhibition of larval development was calculated based on the following equation:
(number of L3 in the control - number of L3 in the treated group) / number of L3 in the control
group x 100.
2.5 Acute toxicity in mice
Female Swiss albino mice (n=96) with an average weight of 25 g were allowed to
acclimatize to the laboratory conditions for seven days, where they were kept in polypropylene
boxes and provided commercial feed (Labina®, Purina, São Paulo, Brazil) and water ad libitum.
The mice were randomly divided into the following 12 groups: G1 to G5, in which they received
2000, 3000, 4000, 5000 and 6000 mg/kg EsEO, respectively; G6 to G10, in which they received
1000, 1500, 2000, 2500 and 3000 mg/kg EsNano, respectively; G11, in which they received
3% Tween 80; and G12, in which they received a 1% chitosan solution. The treatments were
administered in a single oral dose. The animals were observed carefully for any signs of toxicity
during the first 24 h after the treatments and daily thereafter for a period of 14 days. The total
82
number of dead animals was verified, and the lethal doses required to kill 50% (LD50) and
10% (LD10) were calculated.
2.6 Subchronic toxicity in rats
Female Wistar albino rats (n=24) weighing 150–185 g were allowed to acclimatize to
the laboratory conditions for seven days and were maintained on standard animal feed for
rodents (Labina®, Purina, São Paulo, Brazil) and provided water ad libitum. The animals were
randomly divided into the following 3 groups: G1, in which they received a 1% chitosan
solution (negative control), G2, in which they received the corresponding LD10 dose
determined in the acute toxicity test; and G3, in which they received half of the dose of LD10.
The treatments were administered daily by gavage for 30 days. The animals were weighed on
days 0, 15 and 30 to measure weight gain.
Blood samples were collected from all animals before and after the treatments. The
hematological parameters were analyzed using species-specific smart cards for rats with a Vet
ABC™ Hematology Analyzer (Scil Animal Care Company, Illinois, USA).
After 30 days, the animals were euthanized. The liver, stomach, heart, lungs and kidneys
were weighed, and samples were collected for histopathological analysis.
3 Statistical analysis
The results of the egg hatch, larval development and toxicity tests were analyzed by
ANOVA and compared by Tukey’s test (P<0.05) using GraphPad Prism® (GraphPad Software,
Inc., California, USA) program. The effective concentrations for inhibiting 50% (EC50) of egg
83
hatching and the larval development and the LD50 and LD10 for the mice were determined by
probit analysis using SPSS 17.0 for Windows (IBM, New York, USA).
3 Results
The major constituents of the EsEO were geranial (16%) and geraniol (14.8%) (Table
1), and its concentration in the nanoemulsion was 36.4% (v/v). Analysis of the resulting
nanoemulsion particles demonstrated a mean size of 274.3 nm, with bimodal distribution and
polydispersity. The nanoemulsion had a white color and milky consistency. No phase
separation was visually observed after 72 h.
Table 1. Composition of Eucalyptus staigeriana essential oil (%)
KI Compound RT Percentage
939 -pinene 5.85 1.8
979 -pinene 7.04 1.3
1026 o-cymene 8.59 0.7
1029 Limonene 8.69 7
1031 Eucalyptol 8.86 5
1031 -3-Carene 9.97 2
1097 Linalool 11.32 1.1
1150 Menth-3-en-8-ol 13.45 0.6
1153 Citronellal 13.58 5.5
1177 Terpinen-4-ol 14.66 1.7
1180 Cymen-8-ol (meta) 14.78 0.8
1189 -terpineol 15.21 2.2
1226 Citronellol 16.80 6.3
1238 Z-Citral 17.32 9.7
1253 Geraniol 17.95 14.8
1267 Geranial 18.62 16
1325 Methyl geranate 21.19 11
1353 Citronellol acetate 22.41 0.8
1362 Neryl acetate 22.81 2.5
1381 Geranyl acetate 23.70 9.2
Total identified 99.9 KI – Kovats index. RT- Retention time (min)
84
The results of the EHT and LDT for EsNano and EsEO are presented in Tables 2 and
Table 3, respectively.
Table 2. Mean effects (± standard error) of Eucalyptus staigeriana nanoemulsion and
Eucalyptus staigeriana essential oil on Haemonchus contortus egg hatching.
E. staigeriana essential oil nanoemulsion E. staigeriana essential oil
Concentration
(mg/ml)
Efficacy (%) Concentration
(mg/ml)
Efficacy (%)
1 99.0 ± 0.5Aa 2 96.3 ± 0.6Aa
0.5 87.9 ± 2.7Ba 1 66.2 ± 2.3Ba
0.25 59.1 ± 2.6Ca 0.5 18.5 ± 1.1Cb
0.125 16.2 ± 1.2Da 0.25 7.8 ± 0.8Db
0.06 10.7 ± 1.2Da 0.125 4.9 ± 0.6Da
Negative control 10.4 ± 1.1Da Negative control 4.2 ± 0.9Da
Positive control 98.3 ± 0.3Aa Positive control 98.3 ± 0.3Aa
The capital letters indicate comparisons of the means in the columns, and the lowercase letters denote
comparisons of the means in the rows. The different letters indicate significant differences (P<0.05). A
chitosan solution (1%) was used as a negative control for E. staigeriana nanoemulsion, and 3% Tween
80 was the negative control for E. staigeriana essential oil. Thiabendazole (0.025 mg/ml) used as a
positive control.
The EHT revealed EC50 values (95% confidence intervals) of 0.2 (0.16–0.24) and 0.7
mg/ml (0.4–1.3) for EsNano and EsEO, respectively, and the LDT showed values of 2.3 (1.4–
3.8) and 1.8 mg/ml (1.2–2.8), respectively. The inhibition of egg hatching and the larval
development was dose-dependent.
85
Table 3. Mean effects (± standard error) of Eucalyptus staigeriana nanoemulsion
(EsNano) and Eucalyptus staigeriana (EsEO) essential oil on Haemonchus contortus
larval development.
Concentration (mg/ml) Effect (%)
EsNano EsEO
8 96.3 ± 1.3Aa 97.4 ± 0.3Aa
4 75.5 ± 4.5Ba 85.2 ± 1.1Bb
2 31.9 ± 2.9Ca 40.4 ± 1.8Ca
1 17.3 ± 2.2Da 25.9 ± 1.5Da
0.5 9.1 ± 1.6Da 11.3 ± 2.0Ea
Negative control 1.2 ± 0.6Da 2.1 ± 0.9Ea
Positive control 99.9 ± 0.1Aa 99.9 ± 0.1Aa
The capital letters indicate comparisons of the means in the columns, and the lowercase letters
denote comparisons of the means in the rows. The different letters indicate significant differences
(P<0.05). A chitosan solution (1%) was used as a negative control for E. staigeriana
nanoemulsion, and 3% Tween 80 was used as a negative control for E. staigeriana essential oil.
Ivermectin (0.008 mg/ml) was used as a positive control.
In the acute toxicity test, EsNano and EsEO presented LD50 values of 1,603.9 (1,222.2–
1,991.1) mg/ml and 3,495.9 (2,598– 4,507.7) mg/ml, respectively. The hematological
parameters of the rats are presented in Table 4. No significant differences were found in the
body weights or the histological morphologies of organs between the treatment and control
groups.
86
Table 4. Hematological parameters (± standard error) of albino Wistar rats (n=24) before and after treatments with 866.5 mg/kg
(LD10) and 433.3 mg/kg (Half LD10) Eucalyptus staigeriana nanoemulsion.
The capital letters indicate comparisons of the means of the same parameter on day 0 and 30 for the same group. The lowercase letters denote
comparisons of the means between different groups at the same sampling time. The different letters indicate significant differences (P<0.05). A 1%
chitosan solution was used as a negative control. The hematological parameters analyzed included the white blood cell count (WBC), red blood cell
count (RBC), hemoglobin concentration (Hb), hematocrit (Ht), platelets count (Plt), mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular
hemoglobin (MCH) and mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC); 866.5 mg/kg=LD10; and 433.3 mg/kg=half LD10. 1The reference
values established by Diniz et al. (2006).
Parameter (Unit)
Negative Control LD10 (866.5 mg/kg) Half LD10 (433.3 mg/kg) Reference1
Day 0 Day 30 Day 0 Day 30 Day 0 Day 30
WBC (103/mm3) 1.6 ± 0.2Aa 1.8 ± 0.1Aa 1.3 ± 0.1Aa 1.6 ± 0.4Aa 1.8 ± 0.3Aa 3.3 ± 0.7Ab 8 ± 4.1
RBC (106/mm3) 7.4 ± 0.1Aa 7.3 ± 0.1Aa 7.8 ± 0.1Aa 7.5 ± 0.2Aa 7.7 ± 0.2Aa 7.6 ± 0.1Aa 7.4 ± 0.3
Hb (g/dl) 14.4 ± 0.1Aa 14.3 ± 0.2Aa 14.9 ± 0.1Aa 14.6 ± 0.3Aa 15.1 ± 0.15Aa 14.7 ± 0.2Aa 13.6 ± 0.4
Ht (%) 39.1 ± 0.6Aa 39.2 ± 0.5Aa 40.6 ± 0.6Aa 38.8± 1.0Aa 39.96 ± 0.4Aa 39.0 ± 0.6Aa 38.0 ± 1.31
Plt (103/mm3) 765.4 ± 11.8Aa 767.5 ± 21.1Aa 809.2 ± 12.1Aa 732.8 ± 37.3Aa 775.3 ± 16.5Aa 757.5 ± 24.1Aa 638.5 ± 42.4
MCV (µm3) 52.7 ± 0.4Aa 53. 5 ± 0.5Aa 52.1± 0.37Aa 45.7 ± 6.6Ab 51.50 ± 0.4Aa 51.45 ± 0.4Aa 51.0 ± 0.3
MCH (µµg3) 18.7 ± 0.8Aa 19.6 ± 0.2Aa 19.0 ± 0.2Aa 19.5 ± 0.4Aa 19.48 ± 0.2Aa 19.5 ± 0.2Aa 18.4 ± 0.2
MCHC (%) 36.8 ± 0.4Aa 36.6 ± 0.3Aa 36. 8 ± 0.2Aa 37.2 ± 0.6Aa 37.81 ± 0.2Aa 37.9 ± 0.1Aa 36.1 ± 0.2
87
4 Discussion
The composition of EsEO may vary substantially. That used by Ribeiro et al. (2013)
contained (+)-limonene (73%) and cineole (9.5%), whereas that used in current study contained
geranial (16%) and geraniol (14.8%). These chemical variations may result in a modification
of this essential oil’s efficacy against GINs.
The preparation of a chitosan-based matrix for encapsulation has been proposed to
promote the active protection of volatile compounds and to maximize the biological effects of
EsEO. Chitosan is a biopolymer suitable for biomedical applications such as encapsulation
matrices due to its low toxicity and biodegradability (Balan and Verestiuc, 2014). Therefore, it
was selected as the encapsulating matrix for EsEO for evaluation of the activity of essential oil
H. contortus using in vitro tests. The nanoemulsion obtained had similar physico-chemical
characteristics as those of an E. citriodora nanoemulsion evaluated by Ribeiro et al. (2014).
The EHT results indicated that the EC50 of EsNano was approximately one-third of that
of EsEO, and the LDT results revealed that it was greater than that of EsEO. This discrepancy
in results may have been due to the presence of feces in the medium used to promote larval
development. An aqueous system is necessary for the proper release of oil; the diffusion of the
drugs retained in nanoemulsions occurs when water enters the polymer system, resulting in its
swelling and the subsequent release of the encapsulated drugs (Dash et al., 2011).
The acute toxicity test results indicated that EsNano was more toxic than EsEO. These
results differ from those described by Ribeiro et al. (2014) for an E. citriodora nanoemulsion,
in which the encapsulation process caused a rise in the LD50 for mice. The relative surface area
and size of a nanosystem is important for promoting the intermolecular interactions of the
nanometric substance with gastric mucosa. These properties can result in the generation of
adhesive interactions (Sosnik et al., 2014), which can cause retention of the nanoemulsion in
88
the gastrointestinal tract, with increased intestinal absorption and consequently, increased
toxicity.
The subchronic toxicity test revealed that the hematological parameters were not altered,
except for the white blood cell count (WBC), after treatment of the mice (P>0.05). The highest
dose of EsNano caused a significant increase in the WBC (P<0.05); however, WBC reference
values for rats in different animal facilities have varied from 1.9 to 17 x 103/mm3. This
discrepancy may be due to the use of different methodologies for hematological analysis, as
well as different equipment and reagents for preparing doses (Melo et al., 2012).
As reported by Macedo et al. (2010) for EsEO, no histopathological tissue changes or
tissues and body weight gain of the animals were observed.
EsNano has ovicidal and larvicidal effects on H. contortus, and it did not alter the
hematological parameters in the rats after treatment with the product. In vivo studies are needed
to validate its the anthelmintic activity.
Conflicts of interest
The authors declare that they have no conflicts of interest.
Acknowledgements
The authors would like to thank FUNCAP for their financial support (CI3-0093-01020100/14)
and CAPES for a the scholarship. Dr. Bevilaqua was supported by a grant from CNPq
(303018/2013-5).
89
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91
8 CAPITULO III
The use of Eucalyptus staigeriana nanoemulsion in the control of sheep
haemonchosis
Uso da nanoemulsão de Eucalyptus staigeriana no controle de hemoncose em
ovinos
Períodico: Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 37, p. 221–226, 2017
Qualis Capes: A2 (Medicina Veterinária)
92
The use of Eucalyptus staigeriana nanoemulsion in the control of sheep haemonchosis
Wesley L. C. Ribeiro1, Ana L. F. Camurça-Vasconcelos1,2, Jessica M. L. dos Santos1, Iara T. F.
Macedo1, Juliana de C. Ribeiro1, Erick F. de Oliveira3,4, Haroldo C. B. de Paula3, Claudia M. L.
Bevilaqua1*
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária,
Universidade Estadual do Ceará, Brazil
2Curso de Medicina Veterinária, Faculdade Terra Nordeste, Brazil
3Departamento de Química Analítica e Físico-Química, Universidade Federal do Ceará, Brazil
4Department of Food Science and Technology, University of California, United States
* Corresponding author:
Claudia Maria Leal Bevilaqua
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias/FAVET/UECE
Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi CEP 60714-903
Phone: + 55 85 31019853 Fax: + 55 85 31019840
E-mail: [email protected]
93
Resumo
O controle sustentável de nematódeos gastrointestinais (GIN) de pequenos ruminantes baseia-
se no uso de métodos alternativos, incluindo o tratamento alvo-seletivo, como FAMACHA.
Outra alternativa de controle GIN é o uso de medicamentos à base de plantas, embora, em
muitos casos, seu uso seja baseado no conhecimento empírico. As nanoformulações de
biopolímero têm sido investigadas para maximizar os efeitos do óleo essencial contra os
nematoides gastrointestinais dos ovinos. O objetivo do presente estudo foi combinar uma
nanoemulsão de óleo essencial de Eucalyptus staigeriana (EsNano) com o FAMACHA como
controle alternativo para hemonchose em ovinos. O estudo foi realizado ao longo de seis meses
em uma fazenda comercial de ovelhas localizada em uma região semiárida do Nordeste do
Brasil. Inicialmente, um teste de redução da contagem de ovos fecais (FECRT) com
levamisole, ivermectina e oxfendazol foi realizado em ovinos para determinar o anti-
helmíntico mais eficaz para ser usado como controle positivo. Levamisole foi selecionado
porque mostrou eficácia superior a 95%. EsNano foi obtido e, em seguida, suas propriedades
físico-químicas foram caracterizadas. O tamanho médio (± SE) das partículas na nanoemulsão
foi de 276,8 (± 12,3) nm com distribuição bimodal e polidispersão. Foram realizadas nove
visitas, de abril a setembro de 2013, com um intervalo de 17 dias. Cento e sessenta e dois
ovinos machos e fêmeas foram divididas em três grupos (n = 54 cada) e foram tratadas quando
o escore FAMACHA foi 3, 4 ou 5: G- 250 mg kg-1 de EsNano; G-Lev 7,5 mg kg-1 de
levamisole (controle positivo) e G-Neg não foi tratado (controle negativo). Foram coletadas
fezes dos ovinos para quantificar o número de ovos por grama de fezes (opg) e identificar os
gêneros de nematoides mais prevalentes. O ganho de peso dos animais foi monitorado. Os
dados epg para cada grupo e os ganhos médios de peso das ovelhas foram analisados por análise
de variância e comparados com o teste de Tukey (P <0,05). Não houve diferença significativa
94
entre o número de animais tratados com EsNano e levamisole em nenhuma visita (P>0,05). A
variação de epg foi semelhante nos grupos G-EsNano e G-Lev em visitas (P>0,05), exceto na
segunda e a quinta avaliação em que os opg dos grupos foram significativamente diferentes
(P<0,05). Haemonchus spp. foi o nematoide mais prevalente. Não houve aumento significativo
de peso em nenhum dos grupos tratados (P>0,05). A combinação de fitoterapia e FAMACHA
pode ser uma alternativa para minimizar o uso de anti-helmínticos sintéticos para controlar
populações resistentes de GIN de pequenos ruminantes.
Palavras-chave: Pequenos ruminantes; Haemonchus contortus; FAMACHA; Óleo essencial,
Quitosana
95
Abstract
Sustainable control of gastrointestinal nematodes (GIN) in small ruminants has been
based on the use of alternative methods, including targeted selective treatment, such as
FAMACHA. Another GIN control alternative is the use of herbal medicines, although in many
cases their use is based on empirical knowledge. Biopolymer nanoformulations has been
investigated to maximize the essential oil effects against sheep gastrointestinal nematodes. The
aim of the present study was to combine a Eucalyptus staigeriana essential oil nanoemulsion
(EsNano) with FAMACHA as an alternative control for sheep haemonchosis. The study was
performed over six months at a commercial sheep farm located in a semiarid region of Northeast
Brazil. Initially, a fecal egg count reduction test (FECRT) in sheep with levamisole, ivermectin
and oxfendazole in sheep was performed used to determine the most effective anthelmintic to
use as the positive control. Levamisole has been selected because it showed efficacy superior
to 95%. EsNano was obtained and then its physicochemical properties were characterized. The
average (±SE) size of the particles in the nanoemulsion was 276.8 (±12.3) nm with bimodal
distribution and polydispersity. Nine visits were performed, from April to September 2013,
with an interval of 17 days. One hundred sixty-two male and female sheep were divided into
three groups (n= 54 each) and were treated when FAMACHA score was 3, 4, or 5: G-EsNano
250 mg kg-1 EsNano; G-Lev 7.5 mg kg-1 levamisole (positive control), and G-Neg was not
treated (negative control). Feces from sheep were collected to quantify the number of eggs per
gram of feces (epg) and to identify nematode genera. Sheep weight gain was monitored. The
epg data for each group and the average sheep weight gains were analyzed by variance analysis
and compared with the Tukey’s test (P<0.05). Significant difference between the number of
animals treated with EsNano and levamisole was not observed in any visit (P>0.05). The epg
variation was similar in the G-EsNano and G-Lev groups on visits (P>0.05), except the second
96
and fifth evaluation in the epg groups were significantly different (P<0.05). Haemonchus spp.
was the most prevalent nematode. There was no significant weight gain in any of the treated
groups (P>0.05). The combination of phytotherapy and FAMACHA can be an alternative to
minimize the use of synthetic anthelmintics to control resistant GIN populations of small
ruminants.
Key words: Small ruminants; Haemonchus contortus; FAMACHA; Essential oil; Chitosan
97
1 Introduction
Gastrointestinal nematodes (GIN) of small ruminants cause severe pathology and major
economic losses in sheep and goat farming, particularly in tropical and subtropical areas
worldwide (Akkari et al. 2013). GIN control programs primarily rely on a combination of
animal management practices and the use of anti-parasitic drugs (Lifschitz et al. 2014).
However, indiscriminate use of anthelmintics (AH) is considered to be inefficient, costly and
harmful to herds, as it favors rapid selection of GIN-resistant populations to all available AH
classes (Molento et al. 2004). Anthelmintic resistance has already been reported for
monepantel, the latest anthelmintic released on the market (Scott et al. 2013; Van der Brom et
al. 2015). Therefore, the development of sustainable, environmentally acceptable methods of
nematode control is crucial.
Targeted selective treatment (TST) was proposed to reduce the use of AH and thereby
help maintain GIN populations in refugia, i.e., larvae and/or adults that remain without
treatment continue to harbor sensitivity alleles (Cabaret 2008). FAMACHA is considered a
TST approach for reducing parasite chemical exposure (Kenyon et al. 2009). The method is
based on the correlation between eye mucous color and hematocrit values, which is used to
identify animals that are able to withstand infections by Haemonchus contortus (Vilela et al.
2012).
Research on plants to obtain new bioactive compounds has also been encouraged
(Acharya et al. 2014). Elucidating the mechanisms governing the anthelmintic activity of plants
against parasites of small ruminants is important for the development of sustainable strategies
of helminth control (Sandoval-Castro et al. 2012). Eucalyptus spp. (Myrtaceae) is native to
Australia and is mainly cultivated for use by the paper, pharmaceutical and cosmetic industries
98
(Hasegawa et al. 2008). The nematicide action of Eucalyptus staigeriana essential oils (EsEO)
was described previously (Macedo et al. 2010, Mesquita et al. 2013).
To protect the chemical constituents and maximize the nematicidal effect of EsEO,
nanoencapsulation techniques employing chitosan have been investigated (Ribeiro et al. 2013,
2015). The emulsion technology is generally applied for the encapsulation of bioactive
compounds in aqueous solutions through the production of nanoemulsions (Shahavi et al.
2015). Chitosan is a widely used biopolymer in the biomedical area and offers several
advantages, and these include its ability to control the release of active compounds, low toxicity
and high biodegradability (Dash et al. 2011).
The study aimed to assess the ability of E. staigeriana essential oil nanoemulsion
(EsNano) combined with Famacha to control haemonchosis in a sheep management system.
2 Material and methods
2.1 E. staigeriana essential oil nanoemulsion (EsNano)
The EsEO was purchased from Avondale Essências (Braganey, Brazil) and the sample
used in the present study was similar to that used by Ribeiro et al. (2015).
The main chemical constituents were geranial (16.0%), geraniol (14.8%), methyl geranate
(11.0%), geranyl acetate (9.2%) and limonene (7%) (Ribeiro et al., 2015).
Chitosan powder, with 92% deacetylation was purchased from Polymar S/A (Fortaleza,
Brazil). The EsNano was obtained according to the methodology described by Ribeiro et al.
(2015) and the macroscopic characteristics of EsNano stability were observed over 72 h.
99
The EsNano, EsEO and 1% chitosan solution were subjected to thin layer
chromatography and characterized by infrared spectroscopy (FTIR) using the model 8300
(Shimadzu Corporation, Japan).
The size and distribution of nanoparticles in solution were determined using a beam of
red light with a wavelength of 633 nm and angulation of 175° (ZetaSizer 3600, Malvern, United
Kingdom). For this purpose, EsNano samples were dissolved in deionized water to a final
concentration of 0.1% (w/v) and were left to stir for 24 h. These analyses were performed in
triplicate.
EsNano samples were prepared up to 72 h prior to each administration. The size
distribution of the nanoparticles and macroscopic characteristics of all samples were evaluated
to standardize the EsNano physicochemical properties.
2.2 Study area
The study was conducted on a sheep farm in the municipality of Solonópole (5° 46.003'
S and 38º 51.000' W), a semiarid region of the Ceará State, Brazil.
The climate is typically hot, semi-arid tropical with average temperatures ranging from
26 to 28°C. The annual rainfall is 717.1 mm with rains concentrated between January and April.
The vegetation is predominantly formed by open shrubby Caatinga and dense shrubby Caatinga
(Ceará 2011).
The mean rainfall at the Solonópole Rainfall Measuring Station during the study period
was provided by Fundação Cearense de Meteorologia e Recursos Hídricos.
2.3 Ethics committee on animal welfare
100
The protocol was approved by the ethics committee for animal use of Universidade
Estadual do Ceará (number: 10461354-8/65).
2.4 Fecal egg count reduction test
The sheep were originated from crosses between Dooper, Santa Inês and Somalis races.
The animals were kept under semi-extensive rearing management protocols, fed on native
pastures and supplemented with mineral salt (Ovinofós, Tortuga, São Gonçalo do Amarante,
Brazil).
A fecal egg count reduction test (FECRT) was used to determine the most effective
anthelmintic to use as the positive control. Therefore, thirty sheep with egg counts per gram of
feces (epg) greater than 250 were selected and randomly divided into three groups (n=10 each)
for treatment with the anthelmintic classes that are most widely used by producers from the
region: G1: 200 µg kg-1 ivermectin (Ivomec, Merial Saúde Animal, Paulínia, Brazil); G2: 7.5
mg kg-1 levamisole (Ripercol, Fort Dodge Saúde Animal LTDA, Campinas, Brazil) and G3: 5
mg kg-1 oxfendazole (Systamex, Schering-Plough Animal Health, Guarulhos, Brazil). The
treatments were administered orally in a single dose. The fecal samples were collected at days
1 and 14 post-treatment for epg estimation. Larvae from a pool of feces from each group were
cultured to identify the nematode genera. Larval identification was based on Ueno & Gonçalves
(1998).
After performing the FERCT, levamisole was selected as the positive control of the
anthelmintic activity in the field.
101
2.5 Anthelmintic activity in the field
One hundred sixty-two male and female sheep aged seven months to six years were
identified and divided into three groups (n=54 each) based on epg, age, sex and body weight.
G EsNano: 250 mg kg-1 EsNano, corresponding to 0.76 ml of EsNano per kg of bodyweight;
G-Lev: 7.5 mg kg-1 levamisole (positive control) (Ripercol, Zoetis, São Paulo, Brazil) and G-
Neg: sheep were untreated.
Nine visits with 17 days in between were made from April and September 2013. The color of
the ocular mucous membranes of each sheep was examined and classified into one of five
categories according to the FAMACHA eye color chart (Vatta et al. 2001). Animals with a
FAMACHA score of 3, 4 or 5 were treated according to their respective group.
The fecal samples were collected directly from the rectums of all sheep in each
experimental group to perform epg and larvae from a pool of feces from each group were
cultured to identify the nematode genera. The epg was performed using the McMaster technique
(Gordon & Whitlock 1939).
Additionally, the animals were weighed on the first and last visits to assess their weight
gain. Based on dental age, the sheep were categorized into five groups (<1.5; 1.5 to 3; 3 to 4; 4
to 5 and >5 years) (Sandoval-Júnior 2011).
2.6 Statistical analysis
The arithmetic mean ± standard error (SE) of the mean EsNano particle size were
calculated.
The FERCT efficacy was calculated using the following formula: FERCT= 100 x (1-
[T2/T1]), where T1 and T2 represent fecal eggs counts in the treated groups at days -1 and 14
102
post-treatment, respectively (Kochapakdee et al. 1995), and 95% confidence intervals (CI) were
estimated using the BootStreat 1.0 software (Cabaret 2014).
Chi-square tests were conducted to compare the number of animals treated with
levamisole and EsNano for each visit using the GraphPad Prism 5.0 program (GraphPad
Software, Inc., California, USA. A p-value of <0.05 was considered significant.
The epg data for each group were log transformed (log10[x+1]), analyzed with variance
analysis (ANOVA) and compared with Tukey’s test (P<0.05) using the GraphPad Prism 5.0
program. The mean epgs for each group at different visits were presented as the arithmetic mean
± SE.
The mean sheep weight gains were analyzed with ANOVA and compared by the
Tukey’s test (P<0.05) using the GraphPad Prism 5.0 program.
3 Results
The infrared spectroscopy has demonstrated that the chitosan main bands (Figure 1)
appeared at 1643 cm-1 (carbonyl groups of partially acetylated groups), 1425 cm-1 (angular
deformation of CH2), 1370 cm-1 (C-N axial deformation) and 1084 cm-1 (C-O-C glycosidic
bonds) (Robles et al. 2013, Herculano et al. 2015). The main characteristic bands of EsEO can
be observed at 2922, 1742, 1670, 1438, 1377, 1227 and 1146 cm-1. Most signals are referred to
CH and C=O aldehyde groups, as well to methyl and methylene groups of limonene and
citronelal. The nanoemulsion exhibits overlapped bands of both chitosan and EsEO, providing
evidence of a successful encapsulation.
The nanoemulsion was formed almost immediately after the organic (chitosan solution)
and inorganic (EsEO) phase come into contact. The EsEO concentration in the nanoemulsion
was 36.4% (v/v). Physicochemical analyses of the resulting nanoemulsion particles revealed a
103
mean size (±SE) of 276.8 (±12.3) nm with bimodal distribution and polydispersity in all
samples. The nanoemulsion was white, with a milky consistency and could flow through an
oral dosing pistol. No phase separation was visually observed after 72 h.
Figure. 1. Infrared spectra of the sample of Eucalyptus staigeriana nanoemulsion
(EsNano), Eucalyptus estaigeriana essential oil (EsEO) and 1% chitosan solution.
The efficacy (±CI) of ivermectin, levamisole and oxfendazole in the FERCT was 55%
(-7 – 89), 97% (88 – 101) and 11% (-66 – 55), respectively. Based on these results, levamisole
was selected as the positive control. The most prevalent helminth in all of the larval cultures
pre- and post-treatment was Haemonchus spp. (85.5%) followed by Trichostrongylus spp.
(8.8%), Oesophagostomum spp. (4.2%) and Cooperia spp. (0.6%).
104
The percentage of animals treated with levamisole and EsNano based on FAMACHA
is presented in Figure 2. There was no significant difference in the number of animals treated
in the groups at all visits (P>0.05).
Figure. 2. Sheep (%) with EsNano (FAMACHA scores 3, 4 or 5) treated with Eucalyptus
staigeriana nanoemulsion (G-EsNano; 250 mg kg-1) or levamisole (G-Lev; 7.5 mg kg-1) in a
semi-arid region of Northeastern Brazil from April to September 2013. *A specific point on the
rainfall curve refers to the accumulated rainfall (mm) on day 17 before each visit.
The curves of the mean epg variations of the G-EsNano, G-Lev and G-Neg groups are
presented in Figure 3. The tendency of epg variation was similar for G-EsNano and G-Lev,
except on the second (April 22th) and fifth (June 12th) visits, wherein the mean epg in G-EsNano
was significantly higher (P<0.05). The mean epg of G-EsNano and G-Neg was signicantly
different except in the first (April 5th), second (April 22th), fourth (May 26th) and eighth (August
29th) visits (P<0.05).
0
30
60
90
120
150
180
0
5
10
15
20
25
30
22-Apr 9-May 26-May 12-Jun 29-Jun 16-Jul 2-Aug 19-Aug 5-Sep
Rain
fall
(m
m)
Tre
ate
d A
nim
als
(%
)
Evaluation day
G- EsNano
G-LEV
Rainfall (mm)*
105
Figure 3. The mean (standard error) egg per gram (epg) of feces in sheep treated with
Eucalyptus staigeriana nanoemulsion (G-EsNano; 250 mg kg-1) or levamisole (7.5 mg kg-1)
and in untreated animals (G-Neg) in a semi-arid region of Northeastern Brazil from April to
September 2013. The significance level was 5%.
A similar percentage of nematode genera were recovered from sheep in all of the groups
after nine evaluation visits. Haemonchus spp. was the most prevalent genus with a mean of
79%, 80.1% and 82.3% for G-EsNano, G-Lev and G-Neg, respectively. The prevalence of
Trichostrongylus spp. and Oesophagostomum spp. was not significantly different among the
three groups. Cooperia spp. was the less prevalent genus.
The sheep weight gains in the groups are presented in Table 1. There were no significant
differences in weight gain among the ages of animals in the same treatment group before and
after treatment (P<0.05).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
5-Apr 22-Apr 9-May 26-May 12-Jun 29-Jun 16-Jul 2-Aug 19-Aug 5-Sep
mea
n e
pg
Evaluation day
G-LEV
G-EsNano
Negative Control
106
Table 1. The mean (± standard error) sheep weights at the beginning and at the end of the
treatment with E. staigeriana nanoemulsion (G-EsNano) and levamisole (G-LEV) and in
untreated animals (G-Neg) from April to September 2013.
Age1 (year)
Group
Weight (kg)
Initial Final
<1.5
G-EsNano 22.6± 1.1Aa 25.7 ± 1.4Aa
G-Lev 24.3± 1.7Aa 30.3 ± 2.4Aa
G-Neg 23.3± 0.9Aa 27.3 ± 0.9Aa
1.5 – 3
G-EsNano
24 ± 0.8Bb
26.5 ± 1.7Bb
G-Lev 32.6 ± 1.5Bb 33.5 ± 2.4Bb
G-Neg 28.1 ± 1.3 Bb 29.9 ± 1.8Bb
3 – 4
G-EsNano
31 ± 0.4Cc
34.8 ± 3Cc
G-Lev 37.1 ± 1.7Cc 36.8 ± 2.2Cc
G-Neg 32 ± 0.9Cc 34.7 ± 1.3Cc
4 – 5
G-EsNano
34 ± 1.5Dd
38 ± 1.5Dd
G-Lev 34 ± 1.6Dd 36.2 ± 1.5Dd
G-Neg 33 ± 1.8Dd 34 ± 2.4Dd
>5
G-EsNano
35.7± 1.6Ee
36.3 ± 1.5Ee
G-Lev 36.6 ± 1.9Ee 37.8 ± 2.1Ee
G-Neg 37.8 ± 1.7Ee 38.2 ± 2.9Ee
The capital letters indicate comparisons of the means in the rows, and the lowercase letters indicate
comparisons of the means between groups of the same age. The different letters indicate significant
differences (P<0.05). 1Estimated age according to changes in the teeth of the animals.
4 Discussion
The adoption of alternative methods for GIN control must be based on the
implementation of strategies to address anthelmintic resistance control while considering not
only the parasite biology but also farm decisions and whole management decisions (Morgan &
107
Van Dijk 2012). Therefore, new alternatives for controlling helminths in small ruminants have
been widely tested, such as using phytotherapy and FAMACHA (Vieira et al. 2014).
The EsEO with limonene as major oil component (28.82%) showed effect of 76.57%
against goat gastrointestinal nematodes (Macedo et al. 2010) and the EsEO hydrogel presented
effect of 83.75% against sheep abomasal nematodes (Mesquita et al. 2013).
A new area of study that focuses on the use of biopolymers for encapsulation of essential
oils has been developed (Paula et al. 2011). Chitosan is a biopolymer that is suitable for
biomedical applications such as encapsulation matrices due to its low toxicity and excellent
biodegradability (Balan & Verestiuc 2014). Therefore, chitosan was selected as the
encapsulating matrix for EsEO to be evaluated against sheep haemonchosis.
The preparation of chitosan-based nanoemulsions for encapsulating volatile
compounds has been proposed to promote active protection and to maximize the biological
effects of essential oils (Paula et al. 2011). Nanoemulsions are versatile and can be prepared via
numerous different aqueous solutions, surfactants and oil constitutes (Underwood & Van Eps
2012). In this study, the physicochemical characteristics of EsNano were similar to the
nanoemulsion used in in vitro tests on H. contortus (Ribeiro et al. 2015).
Although nanostructured essential oils have been developed for use against GIN small
ruminants (Ribeiro et al. 2014, Grando et al. 2015), validation of these products requires an
assessment of AH effects for a prolonged period in sheep. The present study validated the
anthelmintic effect of EsNano when combined with FAMACHA in the dry season.
FAMACHA is the TST most used by sheep and goat farmers in Northeast Brazil.
Furthermore, Haemonchus spp. was the most prevalent nematode in larval cultures, supporting
the application of FAMACHA (Bath & Van Wyk 2009). Although H. contortus infection
persisted in the herd, the selective treatment strategy significantly reduced the use of AH,
yielding significant health and economic benefits (Molento et al. 2009). Additionally, the
108
FAMACHA method is able to identify sheep that are at risk of reducing the selection pressure
for anthelmintic resistance. In this study, using FAMACHA, the highest percentage of animals
treated per visit was 26% for the G-Lev, which is important for maintaining nematode
populations in refugia (Cabaret, 2008). Furthermore, FAMACHA is particularly important in
areas with a prolonged dry season, when the survival of free-living stages in the pasture is low
or null, thus decreasing the proportion of nematodes in refugia (Kenyon et al. 2009).
The study period (April to September 2013) corresponds to the end of the rainy season
and the early dry season in Northeast Brazil (Vilela et al. 2008). In these months,
gastrointestinal nematode parasitism is higher in sheep and H. contortus represents more than
80% of the nematode population in the flock (Souza et al. 2013). This condition was decisive
for the choice of the experiment execution period.
The volume and regularity of rainfall this year were atypical, where a low rainfall
occurred in every month of the study. The low rainfall may have influenced the decline of the
first epg (5th April to 26th May). A more profound decline in G-EsNano and G-Lev epg curves
was apparent and differed significantly from the negative control. The epg peak in the sixth
visit (June 29th) can be explained by the final rainy period, when the epg is high (Costa et al.
2009), but this increase was significantly more pronounced in the negative control group.
Moreover, EsNano was able to maintain the epg of G-EsNano similar to the epg in the positive
control group at all visits, except on April 22th and June 12th. The EsNano AH effect was also
demonstrated for E. staigeriana encapsulated oil, which was used against sheep GIN in a
controlled test (Mesquita et al. 2013).
Although there was no significant difference in the number of animals treated between
groups (P>0.05), on June 29th and July 16th, the number of animals treated in G-EsNano was
twice the number of animals treated in G-Lev; however the percentage of treated animals
109
declined with subsequent visits while the G-Lev group maintained the same number of treated
sheep.
There was no significant weight gain for any of the age groups treated with EsNano or
levamisole or that were untreated (P>0.05). This result may be attributed to the low food supply
in the pasture, which is typical for periods with lower rainfall than average in semi-arid
Northeastern Brazil. Even when sheep are exposed to supplementary feeding, Leask et al.
(2013), in a study conducted in South Africa, did not observe a significant difference in weight
gain among sheep treated with FAMACHA versus a conventional treatment with levamisole
for twelve weeks during the summer and autumn seasons.
The combination of herbal medicines and FAMACHA minimizes the use of synthetic
anthelmintics and maintains GIN populations in refugia. However, the survival of GIN
populations at higher than acceptable levels requires a balance between the population in
refugia, established by the new approach, and the potential adverse consequences of excessive
parasitism (Besier 2012). This study demonstrated that levamisole may be replaced by EsNano,
as they demonstrated equivalent anthelmintic effects. Further studies evaluating phytotherapy
and FAMACHA in the rainy season are required to confirm the powerful effects of this
combination in times of high pasture infestation.
Conflicts of interest
The authors declare that they have no conflicts of interest.
Acknowledgements
The authors would like to thank Programa de Apoio a Projetos Institucionais com a
Participação de Recém-Doutores (PRODOC) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) for their financial support (AUX-PE-PRODOC 2717/2010) and
110
CAPES for the scholarship. Dr. Bevilaqua was supported by a grant from Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (303018/2013-5).
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9 CONCLUSÕES
O decocto de S. anthelmia (DecSa) apresentou atividade in vitro sobre ovos, larvas e adultos
de H. contortus. Além disso, DecSa apresentou segurança em avaliação toxicológica aguda
em camundongos. No teste de contagem de redução de ovos nas fezes de ovinos com
infecção mista, DecSa demonstrou eficácia de 47%. Esse valor é abaixo do preconizado pela
WAAVP para um produto com eficácia anti-helmíntica, porém, novas formulações desse
produto que otimizem sua biodisponibilidade e eficácia são requeridas.
O óleo essencial de E. staigeriana, cujo componente majoritário foi o geranial, em sua
formulação livre e nanoencapsulada com o biopolímero quitosana, apresentou atividade anti-
helmíntica in vitro sobre ovos e larvas de H. contortus, tendo, portanto, efeito potencial no
controle de NGI de pequenos ruminantes. Ademais, os produtos não causaram nenhuma
alteração bioquímica ou histopatológica em roedores em avalições toxicológicas aguda e
sub-crônica, o que indica uma segurança para aplicação na espécie-alvo.
O óleo nanoencapsulado de E. staigeriana pode ser utilizado no controle de nematoides
gastrintestinais de pequenos ruminantes em épocas secas, período em que se verifica um
baixo parasitismo. O uso de produtos diferentes dos anti-helmínticos convencionais é fator
essencial para desacelerar o desenvolvimento da resistência anti-helmíntica em populações
de NGI. Essa substituição é especialmente importante quando há seleção dos animais pelo
tratamento alvo-seletivo utilizando o FAMACHA, com vistas a não desencadear uma forte
pressão de seleção sobre a população de NGI e consequente desenvolvimento de resistência
anti-helmínitica ao novo produto.
117
10 PERSPECTIVAS
São necessárias investigações adicionais sobre o uso da nanoemulsão do óleo essencial
de E. staigeriana, especialmente no período chuvoso, época em que o desafio por NGI
é maior em rebanhos de pequenos ruminantes.
É fundamental investigar o papel de substâncias isoladas de óleos essenciais a fim de
verificar seus efeitos. Ademais, estudos específicos sobre o efeito farmacológico dessas
substâncias na espécie-alvo, incluindo critérios de biodisponibilidade são necessários.
Embora o uso de nanotecnologia para formulação de produtos para uso em parasitologia
veterinária seja recente, investigações mais aprofundadas sobre o potencial dessa
ferramenta merece atenção, principalmente no que se refere à segurança toxicológica e
ambiental desses produtos.
O decocto de S. anthelmia precisa ser reavaliado por meio de nanoformulações que
otimizem seu efeito anti-helmínintico. Além disso, um estudo de biodisponibilidade é
requerido com a finalidade de investigar a quantidade de princípio ativo ou produtos
biotransformados que atingem o parasito.
118
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133
APÊNDICES
134
APÊNDICE A - Publicação do artigo referente ao capítulo 1
135
APÊNDICE B - Publicação do artigo referente ao capítulo 2
136
APÊNDICE C - Publicação do artigo referente ao capítulo 3
