Relatório de final de iniciação científica

Processo:

Determinação voltamétrica do lapachol na presença de lapachonas e extrato etanólico

Tabebuia impetiginosa utilizando um eletrodo de epóxi-grafite

Aluna: Ana Beatriz Azevedo

Orientador: Ricardo Queiroz Aucélio

Participação: Carlos Alberto Toloza Toloza e Joseany de Moraes Santos Almeida

Departamento de Química

Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro (PUC-Rio)

Resumo

O projeto teve como objetivo a determinação do lapachol através da voltametria anódica

por onda quadrada (VOQ), utilizando um eletrodo de epóxi-grafite feito no laboratório. O meio

eletrolítico consiste em uma solução aquosa contendo o surfactante catiônico CTAB (1,2 × 10-4

mol L-1

), tampão fosfato (4,0 × 10-2

mol L-1

; pH 6,0) e KNO3 (1,0 mol L-1

). O surfactante

catiônico conseguiu melhorar a difusão e a interação do eletrodo com o analito, produzindo um

processo reversível que melhorou a detecção da corrente total através da VOQ. O sinal do

lapachol foi detectado em -470 mV, após uma pré-concentração em 400 mV durante 140 s,

usando uma frequência de 30 Hz e uma amplitude de pulso de 40 mV e com um passo potencial

de 20 mV. O limite de detecção instrumental foi de 0,029 mg L-1

e a faixa dinâmica linear foi na

ordem de duas grandezas. Na presença de β-lapachona (isômero estrutural) a seletividade foi

obtida na derivada de primeira ordem do sinal da VOQ. A determinação do lapachol no extrato

etanólico presente no cerne da planta Tabebuia Impetiginosa foi obtida através da separação do

analito dos componentes complexos da amostra, por cromatografia de camada fina (TLC). Os

resultados concordaram, em um nível de confiança de 95%, com os obtidos utilizando a

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção absorciométrica.

Palavras-chave: eletrodo de epóxi-grafite; lapachol; lapachonas; voltametria de onda quadrada;

extrato do cerne.

Resumo da produção científica

Artigo científico

Selective determination of naphtoquinones by square-wave voltammetry usig the graphite-epoxi

electrode, Azevedo A.B, Alnmeida, J.M.S., Toloza C.A.T., Aucelio R.Q., em preparação para

submissão em 2017.

1 Introdução

A flora tropical é uma abundante fonte de diferentes substâncias biológicas, como por

exemplo as naftoquinonas que são comumente encontradas na família de plantas Bignoniaceae 1.

O Lapachol (Fig. 1) é uma para-naftoquinona que possui compostos biológicos responsáveis por

combater diferentes bactérias2, o vírus HIV-1

3, parasitas molusco-hospedeiros

4 e protozoários

como o Trypassoma cruzi5. Oliveira e outros coautores demonstraram que o lapachol também

possui atividade contra o mosquito Aedes aegypti, principal transmissor do vírus da Dengue e

Zika6. Os isômeros α-lapachona e β-lapachona (Fig. 1) também possuem espécies da família

Bignoniaceae, entretanto tem quantidades significativamente menores quando comparadas ao

lapachol, o qual contém até 7% do cerne da planta1,7

.

(2) O

O

O

(1)

O

O

OH

CH3

CH3

O

O

O

(3)

Fig. 1: Estruturas química do (1) lapachol, (2) α-lapachona e (3) β-lapachona

A principal abordagem na determinação do lapachol e de outras naftoquinonas presentes

em extratos de plantas é baseada na cromatografia líquida de troca iônica (HPLC) e na

fotometria de absorção e detecção UV8,9

. Steinert et al. propôs a cromatografia líquida de alta

eficiência na região do ultravioleta (HPLC-UV) para separar e determinar as naftoquinonas em

extratos de Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae). Porém, o autor falhou em detectar lapachol

em extratos aquosos8. O lapachol e outras naftoquinonas foram isoladas com extrato etanólico da

raiz da Zeyheria montana (genus Tabeluia) e foi quantificado, com sucesso, através da HPLC-

UV, indicando a presença de 0,001% m/m de lapachol na amostra9.

A determinação indireta baseada na fotoluminescência de supressão de pontos quânticos

(QDs) na presença de lapachol, foi recentemente relatada10,11

. Demonstrou-se que o ácido 3-

mercaptopropiônico-CdTe QDs foi usado como sonda para determinar lapachol em amostras de

urinas (previamente limpas utilizando um cartucho com polímero de acrílico) com um limite de

detecção (LOD) de 1,9 mg L-1

. A supressão da fotoluminescência do ácido 3-

mercaptopropiônico-CdTe QDs promovido pelo lapachol, β-lapachona, α-lapachona ou ácido 3-

sulfônico-β-lapachona tornou-se melhor em uma dispersão aquosa contendo brometo de

hexadeciltrimetilamônio (CTAB). A presença do surfactante CTAB promoveu uma rápida

estabilização dos pontos quânticos depois das interações com as naftoquinonas e melhorou a

magnitude da supressão de fluorescência. O limite de detecção foi de 0,04 mg L-1

para o

lapachol e ele foi determinado, com sucesso, em um extrato etanólico do cerne de T.

impetiginosa11

. Outro método baseado na luminescência dependeu do sinal gerado depois da

redução das naftoquinonas, usando hidrosulfito de sódio, para gerar a derivatização da

fluorescência do lapachol, a qual é instável na presença de oxigênio12

. A redução com o ditionito

de sódio ou borohidreto de sódio permitiu a determinação fluorimétrica do lapachol (alcance do

LOD é de μg L-1

) e de outras quinonas em formulações farmacêuticas. Entretanto, o uso de

diferentes derivatizações dos produtos influenciaram à precisão do método13

.

A voltametria foi empregada em estudos de redução e determinação de naftoquinonas14-

17. Estudos utilizando a voltametria cíclica (VC) feitos por Goulart et al., usando um eletrodo de

carbono vítreo (GCE), mostraram que o radical aniônico do lapachol interage com o oxigênio e

provoca a desprotonação do lapachol e de radicais peroxil16

. A redução eletroquímica das

lapachonas foi estudada por Oliveira-Brett et al., utilizando a VC, voltametria de onda quadrada

(VOQ) e voltametria de pulso diferencial em um meio hidroalcóolico. O processo de redução,

promovido pelo GCE, para a β-lapachona, ácido 3-sulfônico-β-lapachona e β-lapachona 3-

bromo-β-lapachona foi reversível e dependente do pH. Entretanto, para a α-lapachona o processo

foi irreversível no pH 4,5 e quasi-reversível para pH 7,0. Outro estudo para a redução

eletroquímica da β-lapachona e o seu ácido, derivado, 3-sulfônico, em meio aquoso, foi feito

utilizando GCE. Os resultados indicaram um processo reversível e dependente do pH e

evidências de uma interação entre β-lapachona e a topoisomerase17

. A voltametria de pulso

diferencial foi aplicada na determinação do ácido 3-sulfônico-β-lapachona com LOD de 0,41 mg

L-1 15

.

Os eletrodos feitos de carbono são amplamente utilizados como sensores eletroquímicos

devido à sua janela de potencial operacional favorável em uma ampla faixa de pH. Eles são

dispositivos de baixo custo e fáceis de modificar e manusear18

. Adams, em 1958, introduziu os

compósitos, os quais são constituídos de uma fase condutiva mista de carbono e um material

isolante, como resinas, polímeros e óleos18-20

. Os compósitos são microscopicamente

heterogêneos e apresentam propriedades de materiais precursores21

. Os eletrodos compósitos

podem ser aplicados em uma ampla faixa de pH e potencial e também apresentam uma boa

condutividade, baixo custo, estabilidade mecânica e versatilidade na maneira em que podem ser

preparados. Mudanças químicas, principalmente com surfactantes, podem melhorar a

sensibilidade e a seletividade em analitos específicos. Além disso, mudanças reprodutíveis

podem ser facilmente feitas na a superfície do eletrodo22,23

.

Semaan et al., desenvolveu um compósito de poliuretano-grafite para determinação de

furosemida em fármacos através de SWV. A resposta do analito foi linear até 6,95 mg L-1

. Não

houve necessidade de renovação constante da superfície do eletrodo, uma vez que o analito não

adsorveu no material do eletrodo23

. Mais recentemente, Balbin-Tamayo et al., validou o

compósito de epóxi-grafite para ser usado como sensor de DNA24

. Eletrodos feitos com

diferentes proporções de epóxi/grafite foram caracterizados por VC, espectroscopia de

impedância eletroquímica e microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo. A

melhor resposta eletroquímica, usando SWV, para a guanosina monofosfato e a adenina foi

obtida usando uma resina endurecedora de epóxi-grafite nas proporções 3,3/2,5/1m/m/m.

Neste trabalho, um método SWV sensível para determinar o lapachol, utilizando o

eletrodo compósito de epóxi-grafite, foi desenvolvido. A resposta analítica foi melhor em um

meio contendo o surfactante catiônico CTAB. Uma simples separação por cromatografia de

camada fina permitiu determinar a seletividade do lapachol no extrato etanólico do cerne de T.

impetiginosa.

2 Experimental

2.1. Instrumentação

O método voltamétrico foi desenvolvido utilizando-se um potenciostato / galvanostato

(m-AUTOLAB Type III, Metrohm, Holanda) interligado a um computador e operando no modo

de onda quadrática de análise voltamétrica e voltametria cíclica. O eletrodo de trabalho foi de

epóxi-grafite e foi feito de acordo com o trabalho de Balbin-Tamayo et al. 24

. Utilizou-se o Ag /

AgCl (KClsat) como eletrodo de referência do sistema eletroquímico e um fio de platina como

eletrodo auxiliar. O GCE também foi usado para comparar experimentos. Uma célula

eletroquímica de 15 mL, feita de borosilicato, foi utilizada com uma tampa de Teflon, a qual

proporcionou o acesso dos três eletrodos até a solução. As medidas de pH foram feitas em um

pHmetro (modelo mPA-210, MS Tecnopon, Brasil) usando um eletrodo de vidro combinado

com um eletrodo de referência Ag / AgCl (KClsat). As análises de cromatografia foram feitas em

um cromatógrafo líquido de alta eficiência (modelo 1200, Agilent Technologies, Japão),

equipado com detecção de absorção fotométrica, em um forno de coluna (mantido a 30oC) e em

um Agilent Eclipse XDB–C18 com coluna (250 × 4.6 mm e tamanho médio de partícula de 5

μm, EUA).

2.2. Reagentes e materiais

Todas as soluções foram preparadas utilizando água deionizada (resistividade inferior a

18 Mcm) obtida a partir de um purificador de água Milli-Q Gradient Sistem A10, Millipore

(EUA). O lapachol (142-143oC), α-Lapachona (140

oC), β-lapachona (155

oC) e ácido sulfônico-

β-lapachona (158-160ºC) foram obtidos segundo os procedimentos obtidos na literatura25-27

.

Todas as naftoquinonas foram purificadas e caracterizadas por métodos espectroscópicos e os

resultados concordaram com os dados da literatura28-30

. O brometo de hexadeciltrimetilamônio

(CTAB) e o ácido acético (grau analítico) foram comprados da Sigma-Aldrich (EUA). O nitrato

de potássio, fosfato de sódio monobásico e o fosfato de sódio dibásico foram obtidos na Merck

(Alemanha). O hexano, álcool metílico e etanol (todos com grau HPLC) foram obtidos na Tedia

(Brasil). O clorofórmio foi comprado na Isofar (Brasil), o ferrocianeto de potássio foi obtido na

Autolabor (Brasil) e o tampão Tris.HCl foi comprado na Synth, Brasil.

O pó de grafite de grau espectroscópico foi adquirido na Ringsdorff-Werke GMBH

(Alemanha). A resina epóxi foi obtida a partir de um kit comercial de pasta Araldite®. A pasta

de alumínio (1 m) foi adquirida da Fortel (Brasil). O gás nitrogênio, marca comercial, foi

comprado na Linde-gases (Brasil). As placas de gel de sílica (60 F254), para cromatografida de

camada fina, foram adquiridas da Merck. Os filtros de seringa de PTFE (0,45 μm) foram

comprados na Whatman (Reino Unido).

O extrato comercial (Pau d'arco, supostamente da T. impetiginosa) foi comprado na

farmácia e o cerne natural da T. impetiginosa (Ipê Rosa) foi comprado em um mercado local.

2.3. Construção e caracterização do eletrodo de epóxi-grafite

Para a construção do eletrodo de epóxi-grafite foi utilizado o procedimento descrito na

literatura24

, com pequenos ajustes. A resina epóxi e o endurecedor (do kit de Araldite) foram

misturados em quantidades iguais, antes da adição do pó de grafite. Esses componentes foram

misturados a fim de se obter um compósito homogêneo constituído de 3%m/m de uma mistura

resina-endurecedor e 97% m/m de grafite. Antes do compósito de epóxi-grafite endurecer, ele foi

introduzido na ponta de um capilar de vidro (aproximadamente 10mm), onde já tinha um fio de

cobre, estabelecendo o contato elétrico entre o fio de cobre e o compósito. Após 24h, a superfície

do compósito foi polida usando uma lixa (1200 e 600 grão) e depois realizou-se um polimento

final utilizando alumina em suspensão (1 μm). A imagem microscópica do compósito polido é

mostrada na (Fig. 2). A área ativa de superfície do eletrodo foi determinada usando medidas de

VC (de -250 até +650 mV na faixa de varredura de 20-100 mV s-1

) de uma solução de K4[Fe

(CN)6] (1,0 × 10-3

mol L-1

) usando uma solução de KNO3 (0,5 mol L-1

) como eletrólito suporte.

Fig. 2: Imagem de microscopia eletrônica de varredura com emissão de campo das superfícies polidas de eletrodos

compósitos de epóxi-grafite (tensão de aceleração de 1,0k; resolução de 10 μm).

2.4. Soluções Estoque e soluções padrão

Quantidades apropriadas de cada uma das naftoquinonas (lapachol, α-lapachona e β-

lapachona) foram usadas para preparar as soluções estoque de 1,0 × 10-2

mol L-1

e 1,0 × 10-4

mol

L-1

em metanol. Soluções mais diluídas de naftoquinonas foram preparadas para diluir nas

soluções estoque com metanol. As concentrações finais dos componentes presentes na solução

eletrolítica de trabalho foram: tampão fosfato (4,0 × 10-2

mol L-1

; pH 6,0), nitrato de potássio

(1,0 mol L-1

) e o surfactante catiônico CTAB (1,2 × 10-4

mol L-1

) em água deionizada. A

presença de lapachol diminuiu a concentração micelar crítica do CTAB (normalmente em 9,2 ×

10-4

mol L-1

31

), o que torna o sistema eletrolítico rico em micelas e estruturas pré-micelas.

2.5. Preparação da Amostra

Como descrito por Lima et al. 11

, o Pau d'arco comercial (250 mg do interior da casca em

pó por cápsula) foi extraído, utilizando etanol, em um banho de ultrassom (5 min) e depois o

extrato foi passado por um filtro seringa (0,45 μm) e coletado em um balão volumétrico de 10,00

mL. Ao final, ele foi guardado no escuro e sob refrigeração. O cerne da T. impetiginosa (Ipê

Rosa) foi triturado finamente (aproximadamente 1 g). Depois, porções de 125 mg do pó

resultante foi extraído com etanol (como descrito acima) e guardado em um balão volumétrico de

10,00 mL. Todas os extratos da amostra foram realizados em triplicata.

2.6. Cromatografia de Camada Fina

O procedimento de cromatografia de camada fina (TLC) utilizado foi o descrito por Lima

e co-autores11

. Alíquotas de 20 μL de soluções estoque de naftoquinonas (1,0 × 10-2

mol L-1

ou

1,0 × 10-3

mol L-1

) ou alíquotas de 40 μL de amostras de extratos alcóolicos foram pingadas na

placa de TLC e deixadas para secar a temperatura ambiente. Depois, as placas foram colocadas

em uma câmara de revelação contendo uma fase móvel (clorofórmio:hexano 8:2 v/v). Misturas

contendo lapachol, α-lapachona e β-lapachona (proporção equimolar) foram pingadas na placa

TLC para mostrar a separação do lapachol das outras naftoquinonas. O lapachol apresentou o

maior fator de retenção (FR = 0,78), sendo completamente separado das outras naftoquinonas. A

área da placa de TLC contendo o pingo de lapachol foi removida e extraída com 3 mL de

metanol (em 5 min de ultrassom). A solução eluída foi filtrada em um filtro seringa. Depois,

colocou-se 5 mL de metanol no filtro para lavá-lo. A solução coletada foi evaporada (em um

banho quente) até secar. Depois, o resíduo foi redissolvido em metanol (1,00 mL) e coletou-se

uma alíquota de 250 μL para ser adicionada na célula eletrolítica a fim de se realizar medidas

voltamétricas. Os outros pontos da placa de TLC não usada (aproximadamente 1g) também

foram tratados do mesmo modo para avalia qualquer interferência potencial causada pelo

fluoróforo da placa removida.

2.7. Medições Voltamétricas do Lapachol

Todos os experimentos voltamétricos foram realizados depois da purga da solução na

célula eletrolítica (aproximadamente 2 min) e antes da medição. Também foram realizados

experimentos de VC para avaliar o processo redox na faixa de -900 mV a +600 mV, usando 24

mg L-1

de lapachol na solução eletrolítica de trabalho que continha ou não CTAB. Medições de

SWV foram realizadas, usando a solução eletrolítica de trabalho, para avaliar o processo redox e

também para determinar analiticamente o lapachol. Realizaram-se experimentos de diagnóstico

redox na faixa de +600 mV a -1000 mV. Determinações analíticas foram obtidas com uma pré-

concentração analítica em +400 mV por 140 s (sob regime de transporte convectivo e purga com

gás nitrogênio). Após o tempo de equilíbrio (1 min) sem agitação e purga, as medidas de +600

mV até -900 mV foram realizadas usando 30 Hz, 20 mV de passo potencial e 40 mV de

amplitude de pulso. O sinal analítico foi um pico em -470 mV.

2.8. Análise da Cromatografia

As amostras extraídas foram analisadas por HPLC-UV sob uma eluição isocrática com

metanol/solução 5% de ácido acético (80/20% v/v)11

. A vazão da fase móvel foi 1 mL min-1

e o

volume de amostra injetado foi 10 μL. Sob essas condições, o tempo de retenção do lapachol foi

de 5,7 min. As curvas analíticas foram construídas através da injeção de 20 μL de soluções

estoque de lapachol com 24 mg L-1

a 96,9 mg L-1

. As análises foram realizadas em triplicata com

detecção absorciométrica em 278 nm.

3 Resultados e Discussão

3.1 Estudos preliminares

3.1.1. Área eletroativa

As quantidades de resina epóxi e grafite usadas para preparar o compósito de epóxi-

grafite foram ajustadas de acordo com Tamayo-Balbin et al. 24

. A proporção escolhida (97% de

grafite e 3% de resina m/m) apresentou excelentes propriedades mecânicas e produziu correntes

de pico de difusão acentuadas a partir da guanina com sinal de base de corrente baixa. A corrente

de difusão do lapachol encontrada foi intensa. A caracterização da área eletroativa foi realizada

usando VC (de -250mV a +650mV) com uma célula eletroquímica contendo [Fe(CN)6]3-

(1,0 ×

10-3

mol L-1

) em KNO3 (0,5 mol L-1

). Varreduras sequenciais geraram uma corrente de pico (Ip)

que aumenta linearmente em função da faixa de varredura (v), de 20 a 100 mV s-1

. Como a

concentração de espécies eletroativas (C) foi 1,00 × 10-6

mol cm-3

, foi possível estimar a área

eletroativa como 0,0078 cm2 pela simplificação da equação de Randles-Sevcik: A = Ip/(2,686 ×

105 v

1/2 n

3/2 C D

1/2 ), onde D é 6,32 × 10

-6 cm

2 s

-1 e n=1. Para o GCE, a área eletroativa foi 0,019

cm2.

3.1.2. Influência do CTAB no processo eletroanalítico para diferentes valores de pH

Os surfactantes representam um importante papel no processo eletroquímico, pois eles

conseguem mediar a interação entre as espécies eletroativas e o eletrodo32,33

. Os surfactantes

também podem influenciar processos redox e minimizar a passivação da superfície do eletrodo

causada pela adsorção de produtos eletrogerados ou por componentes da matriz da amostra 34,35

.

Além disso, eles melhoram a solubilidade de analitos hidrofóbicos e facilitam o transporte de

massa 36,37

.

Guin et al., revelou a área eletroquímica de redução de quinonas, em diferentes meios de

comunicação 38

. Em meio aquoso tamponado, o par redox quinona-hidroquinona envolve a

transferência de dois elétrons, em potenciais que variam com pH, com etapas que envolvem

diferentes espécies reduzidas e oxidadas com diferentes valores de pKa. Em pH ácido, devido à

rápida cinética e disponibilidade de prótons, o processo de protonação em duas fases afeta ambos

grupos carboxílicos e pode ser visto como um processo de apenas uma fase, envolvendo dois

elétrons e dois prótons. Em pH básico, o processo de redução ocorre, unicamente, devido aos

elétrons, enquanto em pH neutro, a redução envolve ou um próton e dois elétrons ou apenas dois

elétrons38

. Para o lapachol, Ngameni et al,.14

mostrou que o aumento do pH causa um

alargamento dos picos anódicos (em maior extensão devido à dificuldade da re-oxidação do

hidrolapachol) e catódicos na VC, o que é um reflexo da cinética dos diferentes processos que

estão ocorrendo. Em condições básicas, as espécies não-protonadas hidrofílicas (devido ao

próton perdido no grupo hidroxílico do sistema enol) são dominantes em relação às protonadas.

O comportamento, no meio básico aquoso (usando Tris-HCl com pH 9), confirmou, neste

trabalho, que o processo de redução não é favorável, devido à falta de prótons, entretanto o

processo de oxidação ocorre, provavelmente envolvendo apenas elétrons (voltamograma b da

Fig. 3A). Na presença de CTAB (perto da CMC), o pico de redução foi reestabelecido,

provavelmente, por causa da estabilização, reduzindo a energia necessária para produzir radicais.

Uma melhora na oxidação foi claramente notada, provavelmente, ocorrendo em diferentes

estágios, como é mostrado no voltamograma cíclico, e além do pico principal da oxidação,

percebem-se picos menores em potenciais positivos (voltamograma a da Fig. 3A).

No voltamograma obtido em pH 6 (tampão fosfato) em meio aquoso, o pico de

oxidação foi menor do que o de redução, indicando um processo quasi-reversível (voltamograma

a da Fig. 3B). Nestas condições, o lapachol teve um valor de pKa de 6 (o que se refere a

ionização do enol39

), portanto, a proporção entre as espécies protonadas e as não-protonadas é de

aproximadamente 1. Em contraste, quando o surfactante catiônico foi incluído na solução de pH

6, um comportamento reversível apareceu, com correntes de pico mais intensas (voltamograma b

da Fig. 3B). Em um meio contendo CTAB, o pKa de soluções ácidas, como o lapachol, diminui

em aproximadamente duas unidades 40,41

, fazendo com que as espécies não-protonadas e

hidrofílicas sejam predominantes em pH 6. Em meios aquosos com pH 4 (tampão acetato), um

comportamento quasi-reversível foi observado e a intensidade de ambas correntes de pico de

redução foi menor que as de pH 6 (voltamograma a da Fig. 3C). No pH 4, as espécies não-

protonadas foram predominantes, mas quando se colocou CTAB, a proporção não-

protonado/protonado dessas espécies ficou próxima a 1 e o pico de oxidação aumentou até o

ponto que o processo eletroquímico se tornou reversível (voltamograma b da Fig. 3C). O CTAB

também deslocou o pico de oxidação para um potencial mais anódico e o pico de redução para

um potencial mais catódico. Apesar disso, a intensidade do pico de corrente foi

significantemente menor que os observados em pH 6.

A presença de CTAB pareceu melhorar a difusão do lapachol, já que o eletrodo realizou

um melhor transporte e uma reação redox mais eficiente. As micelas e os agregados pré-micelas

confinaram os reagentes e produtos envolvidos na reação (especialmente na de oxidação)

fazendo a concentração local (dentro da micela normal ou entre os monômeros que formam a

estrutura micelar) ficar muito alta, mas melhorando a cinética da reação. A formação de radicais

também é favorecida, pois eles são estabilizados pelo sistema de micelas.

É importante ressaltar que os processos redox intensos e reversíveis costumam levar a

picos SWV muito intensos (que contribuem para um sinal para ambas correntes de difusão de

redução e oxidação), levando a um maior poder de detecção em análises quantitativas. Assim, o

meio tamponado a pH 6 e contendo CTAB foi escolhido para estabelecer o método quantitativo

voltamétrico.

Como mencionado na seção anterior, o estudo qualitativo do processo eletroquímico do

lapachol (24 mg L-1

) na presença de CTAB por VC produziu um único pico de redução (máximo

em -450 mV) na direção catódica e também um único pico de oxidação (máximo em -154 mV)

na direção anódica. Uma outra adição de lapachol (para produzir uma concentração final de 72,7

mg L-1

) produziu um resultado similar, mas com picos mais intensos. Esse comportamento é

típico de processos reversíveis (taxa de transferência de carga elevada e transferência de massa

controlada por difusão) o que possibilitou um equilíbrio dinâmico na interface do eletrodo42

.

Varreduras VC sequenciais foram feitas para checar a estabilidade do processo (taxa de

varredura foi e 100 mV s-1

, de -900 mV a 700 mV e sem transporte convectivo forçado de

massa). Mesmo depois do décimo ciclo (Fig. 4A) não existiam evidências de decréscimo da

magnitude do pico, indicando que as espécies na interface solução-eletrodo são prontamente e

repetidamente convertidas nas formas oxidada e reduzida. Além disso, a razão calculada entre a

corrente do pico anódico (Ipa) e a corrente do pico catódico (Ipc), na velocidade de varredura de -

100 mV s-1

, foi de 0,83. A literatura mostra que em sistemas redox mais simples, essa razão

tende a se aproximar de 1 à medida que o pH fica mais ácido e a disponibilidade de H+ garante

uma rápida reoxidação14

.Os valores de razão perto ou igual a 1, independentemente da taxa de

varredura, são típicos de sistemas reversíveis, como é observado no lapachol na presença de

CTAB (Fig. 4B)20,43

. A diferença entre os potenciais de pico anódico e catódico (ΔEp = Epa -

Epc) manteve-se constante com a mudança da taxa de varredura (de 10 a -100 mV s-1

), o que é

uma indicação de reversibilidade. A reversibilidade do processo foi confirmada, pois a raiz

quadrada da taxa de varredura (v), de 10 a 1000 mV s-1

, produziu uma resposta linear (R2 =

0,982) em função de Ip (catódico). A linearidade (R2 = 0,990) foi encontrada em relação ao log v

em função do log Ip, produzindo um valor de inclinação de 0,6, o que sugere que o processo

envolvido é pincipalmente difusional em vez de adsortivo (Fig. 4C)44

.

-1200 -800 -400 0 400 800-2

-1

0

1A b

a

I (

A)

Potential x Ag/AgCl (mV)

-1200 -800 -400 0 400 800-2

-1

0

1B

b

a

I (

A)

Potential x Ag/AgCl (mV)

-1200 -800 -400 0 400 800-2

-1

0

1 C

ba

I (

A)

Potential x Ag/AgCl (mV)

Fig. 3: Voltametria Cíclica do processo redox do lapachol em meio aquoso em diferentes pHs na (a) presença e (b)

ausência de CTAB. A- tampão Tris-HCl (4,0 × 10-2

mol L-1

, pH 9); B- tampão fosfato (4,0 × 10-2

mol L-1

, pH 6) e C-

tampão acetato (4,0 × 10-2

mol L-1

, pH 4). v = 100 mV s-1

3.1.3. Estudo dos mecanismos em meio aquoso contendo CTAB

-1200 -800 -400 0 400 800

-2

-1

0

1

2A

Potential x Ag/AgCl (mV)

I (

A)

a

k

a

k

-1200 -800 -400 0 400 800

-1,8

-0,9

0,0

0,9

1,8 B 100 mV s-1

10 mV s-1

I (

A)

Potential x Ag/AgCl (mV)

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0-6,4

-6,0

-5,6

-5,2C

Lo

g I

p

Log v

Fig. 4: A – Análises cíclicas sequenciais (linha a-k) para o lapachol a 100 mV s

-1 em 72,7 mg L

-1 de lapachol. B –

Taxa de varredura cíclica de 10-100 mV s-1

para o lapachol na presença de CTAB 1,2 × 10-4

mol L-1

para checar a

reversibilidade do processo redox. C – Estudo do log v × log Ip (29,1 mg L-1

) do lapachol; v = 10 a 1000 mV s-1

.

Condições Experimentais: tampão fosfato (4 × 10-2

mol L-1

; pH 6), 1,2 × 10-4

mol L-1

CTAB, KNO3 (1 mol L-1

) em

meio aquoso com v = 100 mV s-1

.

A SWV também forneceu informações importantes sobre o processo. A dependência da

frequência (na verdade log f com f de 10 a 90 Hz) em relação ao potencial de pico (Ep) foi linear

(R2 = 0,994) como mostrado na Fig. 5A. Além disso, o aumento de Ip em função de f (Fig. 5B)

foi diretamente proporcional e linear (R2 = 0,964), o que é uma indicação que o processo foi

controlado pela difusão dos reagentes43

.

Na presença de CTAB, o Ep mudou para valores negativos à medida que o pH do

eletrólito suporte foi aumentando (Fig. 5C). Esses são processos típicos influenciados pela

concentração hidrogeniônica do meio, a qual é confirmada pela relação dada por Ep (mV) = (48,0

± 1,3) + (-68,5 ± 0,18) pH, que relaciona a equação de Nernst e a transferência de dois

elétrons43,45

. Isso é compatível com a redução de dois grupos carboxílicos, um deles perto do

grupo hidroxil, que pode promover a ligação de hidrogênio auxiliada pela estabilização dos

radicais gerados durante a redução15

. A concentração de CTAB (8,1 × 10-4

mol L-1

), no eletrólito

suporte, estava ligeiramente abaixo da concentração micelar crítica teórica (CMC de 1,0 × 10-3

mol L-1

) e foi escolhida com base em testes preliminares.

Fig. 5: A – Estudo do log f × Ep na faixa de 10 - 90 Hz; B – Estudo de f × Ip na faixa de 10 a 90 Hz; C – Estudo do

pH × Ep na faixa de pH de 5 a 9, usando SWV e 29,1 mg L-1

de lapachol.

3.2 Otimização de condições experimentais e instrumentais para análise usando SWV

Foi descoberto que o lapachol acumula na superfície do eletrodo (sob transporte

convectivo forçado e purga com N2) na mesma faixa não importando o potencial aplicado (na

faixa de +600 a -100 mV), o que permite uma pré-concentração do analito antes da

quantificação. A corrente de redissolução medida após diferentes tempos de pré-concentração

pode ser vista na Fig. 6A, onde a saturação é alcançada após 140 s. Para fins quantitativos, 160 s

de acumulação do analito em +400 mV foram usados para medir a SWV da corrente de

redissolução do analito.

Os parâmetros instrumentais para a voltametria de onda quadrada (amplitude de pulso de

10 a 100 mV e frequência de 10 a 60 Hz) foram ajustados usando um passo potencial de 20 mV.

Apesar do fato de que a magnitude da corrente de redissolução medida foi diretamente

proporcional à frequência ou à amplitude de pulso, as distorções na forma dos picos

voltamétricos também foram consideradas na escolha dos valores finais: amplitude de pulso de

40 mV e frequência de 30 Hz (Fig. 6B e 6C).

1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

-350

-400

-450

-500

-550A

Ep (

mV

)Log f

3 4 5 6 7 8 9 10-3,5

-4,2

-4,9

-5,6

-6,3

-7,0B

f-1/2

I (

A)

5 6 7 8 9

-300

-360

-420

-480

-540

-600C

Ep (

mV

)pH

Fig. 6: Sinal SWV (medido usando eletrodo de epóxi-grafite) dependendo do: A - tempo de deposição; B –

amplitude de pulso (a) e C – frequência de pulso (f). Eletrólito suporte: CTAB (1,2 × 10-4

mol L-1

), tampão fosfato

(4,0 × 10-2

mol L-1

; pH 6) e KNO3 (1,0 mol L-1

) em meio aquoso. Concentração de lapachol de 0,388 mg L-1

.

3.3 Determinação analítica do lapachol

3.3.1. Características analíticas

Figuras analíticas de mérito foram obtidas usando condições experimentais selecionadas

para determinar o lapachol (Tabela 1). O sinal analítico (corrente de pico) foi diretamente e

linearmente proporcional à concentração de lapachol na célula eletroquímica (R2 = 0,996). A

equação da curva de adição padrão foi Ip (μA) = (2,5 × 10-7

± 7,0 × 10-9

) Clapachol (mg L-1

) + (3,8

× 10-6

± 3,4 × 10-8

) (R2 = 0,999), cobrindo o intervalo até 0,49 mg L

-1) de analito (Fig. 7A). As

medidas foram realizadas em triplicata e os erros associados a sensibilidade e coeficiente linear

foram calculados como desvio-padrão. O LD instrumental de 0,029 mg L-1

e o LQ instrumental

de 0,097 mg L-1

foram calculados usando, respectivamente, 3sb/m e 10sb/m, onde sb é o desvio-

padrão de dez medições consecutivas de sinal da menor concentração de analito na curva de

adição analítica e m é a sensibilidade dessa curva. A precisão instrumental de 2% foi obtida a

partir de dez medições consecutivas de sinal (medidas após a pré-concentração) produzido pelos

padrões analíticos em duas diferentes concentrações (0,097 mg L-1

e 0,580 mg L-1

).

Para estabelecer uma comparação, a curva de adição analítica foi realizada usando

também o eletrodo de GCE (área eletroativa de aproximadamente 0,019 cm2), SWV e as mesmas

condições estabelecidas neste trabalho. A curva de adição padrão (R2 = 0,996) foi Ip (μA) = (9,9

× 10-7

± 9,2 × 10-8

) Clapachol (mg L-1

) + (2,7 × 10-5

± 7,7× 10-7

) e ela cobriu, aproximadamente, a

mesma gfaixa de concentrações com quase a mesma sensibilidade, apesar da área eletroativa ser

cerca de três vezes maior que a área eletroativa do eletrodo compósito de epóxi-grafite (Fig. 7B).

Também pode-se notar que o sinal de fundo gerado usando o eletrodo epóxi-grafite foi

significantemente menos intenso que o associado com o eletrodo GCE, o que reflete na relação

sinal-ruído, que por sua vez afeta a capacidade de detectar baixas concentrações de lapachol (Fig.

7C).

Tabela 1: Condições para determinação de lapachol por SWV.

Parâmetro Valor

Mistura Eletrolítica CTAB (1,2 × 10-4

mol L-1

) / tampão fosfato (4 × 10-2

mol L-1

; pH 6) / KNO3 (1 mol L

-1)

Potencial de Deposiçao 400 mV

Tempo de Deposição 140 s

Amplitude 40 mV

Passo Potencial 20 mV

Frequência 30 Hz

Sinal Monitorado em 447 mV

Alcance do Potencial de

Varredura

600 a -900 mV

Fig. 7: Curva de adição analítica SWV do lapachol cobrindo a faixa de concentrações de 0,097 mg L-1

a 0,485 mg L-

1 usando: A – eletrodo de epóxi-grafite e B – eletrodo de carbono vítreo (GCE). Condições experimentais da tabela

1. C – Sinal de fundo medido usando eletrodo de epóxi grafite (GEE) e eletrodo de carbono vítreo (GCE).

3.3.2. Interferência de outras naftoquinonas e determinação do lapachol no extrato etanólico de

T. impetiginosa

A interferência do α-lapachona e β-lapachona (ambos isômeros do lapachol) foi avaliada.

O pico do voltamograma SWV do isômero α-lapachona se sobrepõe, totalmente, ao do lapachol

(Fig. 8A). Em contraste, ocorreu uma sobreposição parcial dos picos do voltamograma SWV do

lapachol e do β-lapachona (Fig. 8B). Portanto, a primeira derivada foi aplicada para resolver

esses picos voltamétricos (Fig. 8C), permitindo a determinação seletiva do lapachol na presença

de β-lapachona e a determinação de ambos.

As curvas de adição do lapachol e do β-lapachona foram construídas sob as condições

otimizadas e usando a primeira derivada do voltamograma. A curva de adição padrão produziu

uma resposta linear analítica (R2 = 0,996) para o lapachol de 4,0 × 10

-7 mol L

-1 (97 g L

-1) a 3,2

× 10-6

mol L-1

(760 g L-1

) modelado pela equação dIp/dE = (-6,6 × 10-7

± 8,5× 10-8

) Clapachol

(mol L-1

) + (-3,5 ± 0,04). Para β-lapachona, a resposta linear (R2 = 0,943) cobriu uma gama de

concentrações de 4,0 × 10-7

mol L-1

(97 g L-1

) a 1,6 × 10-6

mol L-1

(390 g L-1

) com a seguinte

equação para a curva de adição analítica: dIp/dE = (-7,7 × 10-7

± 1,1× 10-7

) Clapachol (mol L-1

) + (-

2,0 ± 0,09).

-1200 -800 -400 0 400 8000

-8

-16

-24

-32A

e

a

I (

A)

Potential (mV) -1200 -800 -400 0 400 800

-4

-8

-12

-16

-20B

e

a

I (

A)

Potential (mV)

Fig. 8: Voltamogramas de misturas contendo lapachol (4,8 mg L-1

) e seus isômeros: A) mistura com α-lapachona e

B) mistura com β-lapachona. Concentrações indicadas para o isômero: a) branco; b) 0 mg L-1

; c) 4,8 mg L-1

; d) 7,3

mg L-1

e e) 9,7 mg L-1

. C) Primeira derivada da resposta voltamétrica para a) lapachol de 4,0 × 10-7

mol L-1

(97 g L-

1) a 3,2 × 10

-6 mol L

-1 (775 g L

-1) e b) β-lapachona de 4,0 × 10

-7 (97 g L

-1) a 1,6 × 10

-6 mol L

-1 (388 g L

-1).

Condições otimizadas experimentalmente (Tabela 1).

-1200 -800 -400 0 400 800-8

-4

0

4

8C b

a

d (I

/

A)

/ d (

E / m

V)

Potential (mV)

A adição de uma alíquota do extrato etanólico do cerne da T. impetiginosa diretamente

dentro da célula eletroquímica produziu um sinal amplo e largo, o que indica que a matriz

interfere na análise. A separação do lapachol dos componentes da matriz da amostra foi feita

utilizando cromatografia em camada fina (TLC) a fim de eliminar qualquer interferência

potencial durante a análise. A separação por TLC foi muito simples e relativamente rápida,

levando a uma percentagem de recuperação do lapachol maior que 95% e um FR de 0,78. Isso

foi verificado por duas analistas diferentes, cada uma utilizando três réplicas da solução padrão

de lapachol. Ao detectar uma massa de lapachol de 97 mg, a perda média de analito durante o

processo de separação foi de 3,3 ± 0,3% (para o analista 1) e 3,5 ± 0,4% (para o analista 2), o que

permitiu uma recuperação de 93,7 mg, levando em conta o percentual de perda média de 3,4%

do analito. Esse resultado pode ser considerado satisfatório, mas, quando necessário, a

percentagem de perda média pode ser utilizada para corrigir o resultado final da análise do

extrato de planta.

A precisão intermediária do método SWV foi também calculada levando em

consideração os resultados das análises das amostras obtidas por ambos analistas. A precisão

intermediária considerou a variabilidade do procedimento da TLC. Dois níveis do analito foram

usados para avaliação utilizando 40 μL de um extrato da amostra. Os resultados (em massa

absoluta) obtidos foram 3,10 ± 0,05 μg para o analista 1 e 3,05 ± 0,04 μg para o analista 2. O

desvio padrão combinado (analista 1 e analista 2) produziu a precisão intermediária de 0,06μg ou

2% da média geral.

Amostras do extrato do cerne da T. impetiginosa foram analisados, com sucesso, a fim de

determinar o lapachol. A análise de diferentes alíquotas do extrato (diluídas 500 vezes, por causa

da sensibilidade do método) foram feitas em três dias diferentes e os resultados (média das três

replicatas) estão mostrados na Tabela 2. A concentração média do lapachol (com limite de

confiança de 95% e n=9) no extrato do cerne de T. impetiginosa foi de 340 ± 10 mg L-1

.

Tabela 2: Concentração de lapachol (analisada em três dias, com n=3 replicatas) na madeira da T. impetiginosa (Ipê

Rosa) e no extrato comercial após separação por TLC

Amostra Dia Concentração

(mg L-1

)

Extrato de T. impetiginosa

(Ipê Rosa)

1 a(0,34 ± 0,016)

2 a(0,32 ± 0,009)

3 a(0,36 ± 0,02)

Extrato Comercial 1 < LD

2 < LD

3 < LD a Resultados dos extratos das amostras diluídas 500 vezes

As mesmas amostras do extrato também foram analisadas por HPLC e os resultados (três

amostras feitas em três replicatas) são mostrados na Tabela 3 junto com os obtidos pelo método

proposto por SWV. Os resultados são estatisticamente concordantes entre si, pois o teste t

Student (usando o valor da média geral) deu um valor para tcalculado =1,2 e tcrítico = 2,0, em um

nível de confiança de 95% (n1 = n2 = 24). A análise da variância (fator único) usando cada valor

médio como um resultado independente produziu um Fcalculado de 1,3 e Fcrítico de 4,3, em um nível

de confiança de 95% e n1 = n2 = 24.

O método voltamétrico proposto foi usado também para determinar lapachol em uma

formulação comercial de pó de vegetal (Pau d'arco), supostamente contendo T.impetiginosa. O

lapachol não foi detectado por esse método e nenhuma indicação do analito foi encontrada no FR

da placa TLC.

Tabela 3: Determinação de lapachol em amostras do cerne do Ipê Rosa

Amostra Método Concentração no extrato

(mg L-1

)

Conteúdo de lapachol

na madeira

(%)

1 SWV a,b

(0,1696 ± 0,0121) 1,36 ± 0,10

2 HPLC-UV c(0,17686 ± 0,00848) 1,41 ± 0,07

a Concentração corrigida pelo fator de diluição de 500

b Procedimento de TLC para separar analito

c Solução de amostra não diluída

4 Conclusão

Um método voltamétrico simples foi desenvolvido para quantificar o lapachol e foi

aplicado em análises de extratos do cerne da T.impetiginosa. Um eletrodo de epóxi-grafite de

laboratório, fácil de fazer e barato, possibilitou a melhor resposta linear e baixo ruído quando

comparado com o eletrodo de carbono vítreo. A utilização de CTAB no eletrólito suporte (a pH

6) possibilitou picos redox intensos e reversíveis para o lapachol, o qual produziu um intenso

sinal SWV. O LD instrumental de 0,029 mg L-1

foi alcançado com um intervalo linear de duas

ordens de grandeza. A determinação do lapachol, na presença de β-lapachona, foi realizada com

êxito usando a primeira derivada do sinal e o procedimento da TLC possibilitou a separação do

lapachol de componentes presentes em extratos de plantas, permitindo assim determinações

exatas.

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