Relatório Coliformes - Dário Macedo

5/21/2018 Relat rio Coliformes - D rio Macedo

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DISCIPLINA: ANLISE BACTERIOLGICA DA GUAPROFESSORA MARIA DAS DORES COSTA DUARTE

TCNICAS UTILIZADAS NA DETERMINAO DEBACTRIAS DO GRUPO COLIFORME:

TUBOS MLTIPLOS;MEMBRANA FILTRANTE;SUBSTRATO DEFINIDO.

Drio Macedo Lima e Jos Eduardo da Silva CastroCurso Tcnico Integrado em Controle Ambiental3ano

Joo PessoaJaneiro de 2012


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Autores: Drio Macedo Lima e Jos Eduardo da Silva Castro

TCNICAS UTILIZADAS NA DETERMINAO DEBACTRIAS DO GRUPO COLIFORME:

TUBOS MLTIPLOS;MEMBRANA FILTRANTE;SUBSTRATO DEFINIDO.

Relatrio de aula destinado disciplina de Anlise Bacteriolgicada gua, ministrada pela ProfessoraMaria Deise das Dores CostaDuarte.

Joo Pessoa

Janeiro de 2012


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1. INTRODUO

A gua indiscutivelmente o elemento de maior importncia para asobrevivncia de todos os seres vivos do planeta. Contudo, milhares de anos aps osurgimento das primeiras civilizaes, ainda no fomos capazes de adotar um modelode desenvolvimento que utilize a gua com o mnimo de sabedoria (ANA, 2011).

Quase um bilho de pessoas em todo o mundo no tem acesso gua potvel.Segundo a Organizao das Naes Unidas (ONU), cerca de quatro mil crianasmenores de 5 anos morrem todos os dias de doenas passiveis de prevenorelacionadas a gua, como diarria, febre tifide, clera e disenteria.

A contaminao dos ecossistemas de gua est intimamente ligada a essesdados alarmantes. No Brasil, cerca de 80% do esgoto no tem tratamento adequado, deacordo com o levantamento de 2008 do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica(IBGE).

Entre os contaminantes da qualidade da gua mais difundidos

especialmenteem reas onde o acesso a gua limpa e segura limitado esto os organismospatognicos: bactrias, protozorios e vrus. Estes organismos representam uma dasprincipais ameaas sade humana no planeta (ANA, 2011). Os maiores riscos decontaminao microbiana vm do consumo de gua contaminada com agentes

patognicos provenientes de fezes humanas ou animais (Carr e Neary, 2008).A gua potvel no deve conter microorganismos patognicos e deve estar

livre de bactrias indicadoras de contaminao fecal. Os indicadores de contaminaofecal, tradicionalmente aceitos, pertencem a um grupo de bactrias denominadascoliformes. O principal representante desse grupo de bactrias chama-se Escherichiacoli (FUNASA, 2006).

O grupo dos coliformes est dividido em coliformes totais e coliformestermotolerantes.As bactrias que pertencem ao grupo dos coliformes totais so caracterizadas

por apresentar bacilos gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos, noformadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de desenvolver na presena de sais

biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose com produo de cido, gs ealdedo a 35,0 0,5C em 24-48 horas, e que podem apresentar atividade da enzima -galactosidase. A maioria das bactrias do grupo coliforme pertence aos gnerosEscherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora vrios outros gneros eespcies pertenam ao grupo (MS, 2005).

O grupo dos coliformes termotolerantes, comumente chamados de coliformes

fecais, um subgrupo dos coliformes totais, restrito aos membros capazes de fermentara lactose em 24 horas a 44,5-45,5C, com produo de gs. Essa definio objetivou,em princpio, selecionar apenas as enterobactrias originrias do trato gastrintestinal (E.coli), porm, atualmente sabe-se que o grupo inclui membros de origem no fecal(vrias cepas Klebsiella pneumoniae, Pantoea agglomerans, Enterobacter aerogenes,

Enterobacter cloacae e Citrobacter freundii). Em funo disso, o termo coliformesfecais tem sido, gradativamente, substitudo por coliformes termotolerantes (SILVA etal, 2010).

A Escherichia coli, considerada o mais especfico indicador de contaminaofecal e de eventual presena de organismos patognicos, est includa tanto no grupodos coliformes totais quanto no dos coliformes termotolerantes. Seu habitat natural otrato instestinal de animais de sangue quente (SILVA et al, 2010). A E.coli,


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reconhecida como um micro-organismo modelo, pois foi exaustivamente estudadageneticamente e bioquimicamente nos ltimos anos.

A razo da escolha daE. colicomo indicadora de contaminao da gua deve-se aos seguintes fatores: est presente nas fezes de animais de sangue quente, inclusiveos seres humanos; sua presena na gua possui uma relao direta com o grau de

contaminao fecal; facilmente detectvel e quantificvel por tcnicas simples eeconomicamente viveis, em qualquer tipo de gua; possui maior tempo de vida na guaque as bactrias patognicas intestinais, por ser menos exigente em termos nutricionais,alm de ser incapaz de se multiplicar no ambiente aqutico; mais resistente ao dosagentes desinfetantes do que os germes patognicos (FUNASA, 2006).

A portaria 518 de 2004 do Ministrio da Sade determina que a gua paraconsumo humano no deve apresentar E. coli ou coliformes termotolerantes.

Para identificar e quantificar a presena de bactrias do grupo coliforme nagua foram desenvolvidas diversas metodologias de anlise, dentre elas, destacam-se:fermentao em tubos mltiplos; tcnica da membrana filtrante; tcnica do substratodefinido ou substrato Cromognico / Fluorognico.

A tcnica dos tubos mltiplos ou mtodo do NMP (nmero mais provvel) um mtodo clssico na contagem de coliformes totais, termotolerantes e E. coli emgua. A tcnica de contagem em meio lquido menos exata que as que usam meioslido, apresentando a vantagem de que permitem detectar o gs produzido nometabolismo bacteriano (CEBALLOS, 1996).

O mtodo consiste em inocular alquotas da amostra de gua ou diluies delaem uma srie de tubos com meio de cultura apropriado e observar o crescimento

bacteriano. Este que se manifesta como cmbio na cor do meio lquido e turbidez ou, sturbidez ou turbidez e gs. O gs se observa retido em tubos de Durham que foramcolocados previamente dentro do tubo com meio de cultura. (CEBALLOS, 1996). Onmero de tubos positivosnos quais ocorreu crescimento de gsem cada diluio utilizado para determinar o Nmero Mais Provvel (NMP) desse microrganismo naamostra de gua analisada, consultando uma tabela estatstica (tabela de McGrady)(ABELHO, 2011).

O Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater

recomenda tambm, ao lado do mtodo do NMP, a tcnica da membrana filtrante. Arecomendao afirma que a tcnica pode ser adotada para determinar a potabilidade dequalquer gua, desde que, aps uma srie de exames paralelos, obtenham-se com asduas tcnicas, resultados compatveis.

Em linhas gerais a tcnica da MF consiste em passar volumes ou diluies daamostra atravs de uma membrana com poros microscpicos que retm as bactrias.

Estas membranas filtrantes so ento colocadas sobre meios seletivos com gar,contidos em placas de Petri. A determinao de coliformes procedida contando-se ascolnias tpicas que crescem na superfcie da membrana, aps 24 horas.

O mtodo da membrana filtrante possui algumas vantagens e desvantagens emrelao ao mtodo dos tubos mltiplos.

Vantagens: tem boa reprodutibilidade; os resultados so relativamente rpidos;permite o processamento de grandes volumes de amostra de forma a aumentar asensibilidade do teste; um mtodo mais econmico que o NMP (ABELHO, 2011);

pode ser processado com o mnimo de espao e equipamentos; resultado tem maior graude preciso em relao tcnica dos tubos mltiplos.

Desvantagens: as amostras com gua muito turva impedem a filtrao de

grandes volumes e se esta turbidez for devido presena de algas ou substncias emsuspenso, estas podem formar uma pelcula na superfcie da membrana e interferir no


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desenvolvimento de colnias caractersticas de coliformes; quando existem grandespopulaes de bactrias no coliformes, porm capazes de se desenvolver sobre o meiode cultura, os coliformes podero ser impedidos de se desenvolver ou seno a densidadede coliformes pode ser menor do que a obtida pela tcnica do NMP; se existirem metaise fenis presentes na amostra podem adsorver aos filtros e inibir o crescimento

bacteriano (ABELHO, 2011).O mtodo do substrato Definido permite a determinao simultnea deColiformes Totais e E. coli. um mtodo extremamente simples e prtico baseado nautilizao de substratos anlogos lactose (glicopiranosdeos) processados somente porColiformes Totais e E. coli. Esses substratos so hidrolisveis e detectamsimultaneamente enzimas presentes nessas bactrias.

O teste vem sendo cada vez mais usado em todo o mundo, apresenta muitasvantagens, principalmente com relao rapidez de sua realizao, pois ele apresentaum tempo de manuseio inferior a um minuto, detecta coliformes totais e E. coli,simultaneamente, em 24 horas ou menos, no h necessidade de nenhuma confirmaoou de limpeza de utenslios de vidro nem de contagem de colnia. O mtodo tambm

possui uma fcil execuo, eliminando a necessidade de preparao de meios, uma vezque o substrato j vem em uma embalagem de dose unitria. O procedimento realizado em 15 minutos. O mtodo do substrato Cromognico / Fluorognico tambmse destaca por ser muito preciso.

Neste relatrio descreveremos as trs tcnicas de identificao e quantificaode bactrias do grupo coliformes aqui introduzidas: tcnica dos tubos mltiplos, tcnicada membrana filtrante e a tcnica do Substrato Definido (DST) ou SubstratoCromognico / Fluorognico.


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2. OBJETIVOS

Ressaltar e fortalecer a importncia da realizao da anlise bacteriolgica dagua para a sade das pessoas, dos animais e do meio ambiente; Destacar as bactrias do grupo coliforme, com enfoque na E. coli, comomicroorganismos indicadores fundamentais na averiguao da qualidade da gua; Descrever, analisar e comparar as tcnicas de determinao de Coliformes TotaiseE. Coli.

3. METODOLOGIA

3.1. Preparao da amostra e diluies

A preparao e inoculao de diluies requerida nos ensaios quantitativos,para reduzir o nmero de microorganismos por unidade de volume. A amostra pode serinoculada bruta ou diluda, a necessidade de diluies ou o nmero de diluies seriadasvai depender do nvel de contaminao esperado e deve ser tal que permita a obtenode tubos positivos nas menores diluies e negativos nas maiores no caso do mtodo do

N.M.P. No mtodo de filtrao em membrana geralmente no so feitas diluies daamostra, pois o mtodo uma tcnica de concentrao dos microorganismos emamostras com baixas contagens. O procedimento usual a filtrao de 100ml, que

podem ser fracionados em duas pores de 50ml, 4 pores de 25ml ou 3 pores de 70,25 e 5ml, respectivamente. A seleo do volume a ser filtrado, entretanto, depende dacontaminao estimada na amostra, de forma a resultar em placas com contagens nafaixa de 20 a 200 colnias (SILVA et al, 2010).

A amostra diluda na gua de diluio que resultado da mistura de duassolues. A sua preparao est descrita na sequncia. Soluo 1:

Pesar 34 gramas de Fosfato de Potssio Monobsico (KH2PO4) e dissolver em500 ml de gua destilada, ajustar o pH para 7,2 com Hidrxido de Sdio, soluonormal (NaOH 1N) e diluir a 1 litro com gua destilada. Normalmente so necessrios

175 ml de NaOH 1N para elevar o pH. Soluo 2:Pesar 81,1 gramas de Cloreto de Magnsio hexahidratado (MgCl2.6H2O) e

dissolver em 1 litro de gua destilada. Soluo 3 = Soluo 1 + Soluo 2:

Adicionar 1,25 ml da soluo 1 e 5 ml da soluo 2 a 1 litro de gua destilada.Distribuir em tubos de ensaio em quantidade que, aps autoclavao, assegurem umvolume de 9 0,2 ml. Esterilizar em autoclave a 121 C (1Kg/cm2 de presso) durante15 minutos.

A diluio inicial recomendada de 1:10 (10-1). Ela obtida acrescentandoassepticamente 1 ml da amostra com uma pipeta estril 9 0,2 ml de gua de diluio

esterilizada. Em seguida, deve-se misturar bem.


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Para obter uma segunda diluio 10-2 preciso transferir assepticamente 1 mlda primeira diluio 10-1 para 9 0,2 ml do mesmo diluente. Para mais diluiessubseqentes proceder de maneira similar.

Nota: assepticamente = bancada sanitizada; utilizao de luvas, mscara etoca; chama do bico de Bunsen prxima de onde est se realizando a

tcnica.

3.2. Tcnica dos tubos mltiplos

Essa tcnica dividida em trs etapas: presuntiva, confirmativa e completa.Esta ltima, porm opcional e muitos laboratrios terminam a anlise na faseconfirmativa (SILVA et al, 2010).

3.2.1. Preparao do meio de cultura

O meio de cultura usado na etapa presuntiva o Caldo Lactosado emconcentrao dupla e simples. O Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) tambm pode serutilizado nessa primeira fase.

Na fase confirmativa do teste so os usados o Caldo Verde Brilhante Bile 2%(VB) e o Caldo E. coli (EC).

Na preparao dos meios a seguir voc pode preparar apenas a quantidade

necessria para o uso. Esse valor adquirido aplicando uma regra de trs simples.

3.2.1.1. Caldo Lactosado em concentrao dupla

Pesar 26 gramas do meio de cultura e dissolver em 1.000 ml de gua destilada. Emseguida distribuir em tubos de ensaio com tubos de Durham invertidos (10 ml em cadatubo), tampar os tubos. Esterilizar a 121 C (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave durante15 minutos. Aps frio ele pode ser armazenado no refrigerador e vlido por umasemana.

3.2.1.2. Caldo Lactosado em concentrao simples

Pesar 13 gramas do meio de cultura e dissolver em 1.000 ml de gua destilada. Emseguida distribuir em tubos de ensaio com tubos de Durham invertidos (10 ml em cadatubo), tampar os tubos. Esterilizar a 121 C (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave durante15 minutos. Aps frio ele pode ser armazenado no refrigerador e vlido por umasemana.

3.2.1.3. Caldo VB

Pesar 40 gramas do meio de cultura e dissolver em 1.000 ml de gua destilada. Emseguida distribuir em tubos de ensaio com tubos de Durham invertidos (10 ml em cada


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tubo), tampar os tubos. Esterilizar a 121 C (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave durante15 minutos. Aps frio ele pode ser armazenado no refrigerador e vlido por umasemana.

3.2.1.4. Caldo EC

Pesar 37 gramas do meio de cultura e dissolver em 1.000 ml de gua destilada. Emseguida distribuir em tubos de ensaio com tubos de Durham invertidos (10 ml em cadatubo), tampar os tubos. Esterilizar a 121 C (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave durante15 minutos. Aps frio ele pode ser armazenado no refrigerador e vlido por 96 horas.

3.2.2. Fase Presuntiva

3.2.2.1. Material

Tubos de ensaio com caldo lactosado de concentrao dupla Tubos de ensaio com caldo lactosado de concentrao simples. Estante para tubo de ensaio. Pipeta graduada de 10 mL. Pipeta graduada de 1 mL. Bico de Bunsen ou lamparina a lcool. Estufa bacteriolgica.

3.2.2.2. ProcedimentoTomar uma bateria contendo 15 tubos de ensaio distribudos de 5 em 5; nos

primeiros 5 tubos, (os que contm caldo lactosado de concentrao dupla) inocularassepticamentecom pipeta esterilizada, 10 ml da amostra de gua a ser examinada, emcada tubo (Diluio 1:1); nos 10 tubos restantes (os que contm caldo lactosado deconcentrao simples), inocular assepticamente nos 5 primeiros, 1 ml da amostra(Diluio 1:10) e nos 5 ltimos tubos, inocular 0,1 ml da amostra, em cada tubo(Diluio 1:100).

Incubar a 35 0,5 C durante 24/48 horas.Se no final de 24/48 horas, houver a formao de gs dentro do tubo de

Durhan, significa que o teste Presuntivo foi positivo, ou seja, considerada suspeita(presuntiva) a presena de coliformes. Neste caso, fazer o teste confirmativo. Se nohouver a formao de gs durante o perodo de incubao, o exame termina nesta fase eo resultado do teste considerado negativo.

3.2.3. Fase confirmativa

3.2.3.1. Material

Tubos de ensaio com VB.

Tubos de ensaio com EC. Estante para tubo de ensaio.


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Ala de platina com cabo de Kolle. Bico de Bunsen ou lamparina a lcool. Estufa bacteriolgica.

3.2.3.2. Procedimento

Tomar o nmero de tubos do Teste Presuntivo que deram Positivos (Formaode gs) nas 3 diluies 1:1; 1:10 e 1:100. Depois tomar igual nmero de tubos contendoo meio de Cultura Verde Brilhante Bile a 2% e o meio de cultura E. coli. Com a ala de

platina, previamente flambada e fria, retirar assepticamente de cada tubo positivo umaporo de amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio Verde Brilhante.Repetir o mesmo procedimento com os tubos que contem o meio EC. Esta tcnicachama-se repicagem.

Incubar durante 24/48 horas a 35 0,5C os tubos que contm o caldo VB. Se

no final desse perodo houver a formao de gs dentro do tubo de Durham o teste considerado positivo para coliformes totais. Se no houver formao, o teste considerado negativo.

Os tubos que contm o caldo EC devem ser incubados durante 24 2 horas a44,5 0,2 C. Se no final de 24 horas ou menos houver a formao de gs, est indicadoa presena de coliformes de origem fecal.

3.2.4. Expresso dos resultados

Os resultados so expressos em N.M.P (Nmero Mais Provvel) /100 ml de

amostra. Para se determinar o N.M.P, verifica-se a combinao formada pelo nmero detubos positivos que apresentaram as diluies 1:1; 1:10 e 1:100 no Teste Confirmativo.Exemplo:

nos 5 tubos da diluio 1:1, obtiveram-se 3 tubos positivos; nos 5 tubos da diluio 1:10, obtiveram-se 2 tubos positivos; nos 5 tubos da diluio 1:100, obteve-se 1 tubo positivo;

Formou-se, portanto, a combinao 3-2-1 e determina-se o N.M.P consultandoa tabela 1 (ver em Anexos) de acordo com essa combinao.

Se no quiser trabalhar com 15 tubos para determinar o NMP fazer apenas 5tubos na diluio 1:1 (10 ml do meio de cultura + 10 ml da amostra) e calcular o NMPconsultando a tabela 2 (ver em Anexos).

Essas tabelas podem ser usadas para os resultados de coliformes totais (VB) ecoliformes termotolerantes (EC).

Se a amostra estiver sido diluda o resultado da tabela precisa ser corrigido.Voltando ao exemplo anterior, ao olhar a tabela veramos que a combinao 3-2-1indica 17 bactrias/100 ml, mas se a amostra estiver sido diluda a 10 -1, antes de serinoculada, esse resultado precisa ser multiplicado por 10 e, portanto a amostra analisadacontm 170 bactrias/100 ml.


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3.3. Tcnica da membrana filtrante

3.3.1. Preparao do meio de cultura

O Caldo m-FC com adio de cido Roslico o meio de cultura usado para adeterminao de coliformes termotolerantes. Em substituio ao Caldo m-FC pode serusado o gar m-FC.

O M ENDO MF usado em coliformes totais. O gar M-Endo LES podesubstitu-lo.

Na preparao dos meios a seguir voc pode preparar apenas a quantidadenecessria para o uso. Esse valor adquirido aplicando uma regra de trs simples.

3.3.1.1. Caldo m-FC

3.3.1.1.1. Material

Meio de cultura desidratado (Caldo M FC); gua destilada; cido roslico a 1% em NaOH 0,2 N. Frasco Erlenmeyer de 125 ml. Vidro de relgio Bico de Bunsen ou lamparina a lcool.

3.3.1.1.2. Procedimento

Pesar 3,7 gramas do meio desidratado; Transferir para o Erlenmeyer; Dissolver o meio pesado, em 100 ml de gua destilada; Adicionar 1 ml da soluo de cido roslico a 1%; Aquecer at a ebulio; Deixar esfriar; Para preparar o cido roslico a 1% dissolver 1 grama do cido em 100 ml de

NaOH 0,2 N; Para preparar o NaOH 0,2 N diluir 20 ml da soluo 1N para 100 ml de guadestilada.

3.3.1.2. Caldo M ENDO MF

3.3.1.2.1. Material

Meio de cultura desidratado (M ENDO MF); gua destilada;


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lcool etlico a 95%; Frasco Erlenmeyer de 125 ml; Vidro de relgio; Bico de Bunsen ou lamparina a lcool.

3.3.1.2.2. Procedimento

Pesar 4,8 gramas do meio desidratado; Transferir para o Erlenmeyer; Adicionar aos poucos 100 ml de gua destilada contendo 2 ml de lcool etlico a95%; Aquecer em banho-maria ou no bico de Bunsen at o incio da fervura (nodeixar ferver); Deixar esfriar;

3.3.2. Material do ensaio

Conjunto de filtrao esterilizado (holder). Meios de cultura: Caldo m-FC com adio de cido Roslico(para coliformesfecais) e M ENDO MF para coliformes totais. Bquer esterilizado. Placas de Petri esterilizadas.

Membranas de 47 mm de dimetro, porosidade de 0,45, brancas equadriculadas. Proveta de 100 ml estril. Pina. Bomba de vcuo. Estufa bacteriolgica a 45 0,5C e 35 0,5C. Contador de colnias.

3.3.3. Procedimento do ensaio

Com a pina, colocar cuidadosamente na placa de Petri um carto absorvente.Com pipeta esterilizada colocar 2 ml de Caldo m-FC (coliformes termotolerantes) ou1,8 ml de Caldo M ENDO MF (coliformes totais) no carto absorvente e tampar a placa.

Colocar a membrana filtrante no porta-filtro, com a pina previamenteflambada e fria.

Agitar o frasco contendo a amostra, pelo menos 25 vezes, destampar e flambara boca do frasco.

Medir 100ml num proveta estril e verter cuidadosamente no copo do conjuntode filtrao, evitando respingos.

Ligar a bomba de vcuo (seringa) e fazer a suco. Desligar a bomba de vcuoantes que a membrana seque excessivamente. As bactrias ficam retidas na membrana.


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Aps filtrada a amostra, lavar 3 vezes as paredes do funil com gua de diluioestril com pores de 20 ml aplicando vcuo. Aps a lavagem e filtrao, aliviar ovcuo e remover o funil do suporte.

Com a pina flambada e fria, remover o filtro do suporte e coloc-lo na placade Petri, antes preparada, com o lado quadriculado para cima. Tampar a placa de Petri e

incub-la invertida a 35 C durante 24 2 horas (placas com meio M ENDO MF, paracoliformes totais) e a 44,5 0,2 C durante 24 2 horas (placas com meio m-FC, paracoliformes termotolerantes).

Todos os procedimentos de transferncia, filtrao e inoculao, devem serrealizados de acordo com as medidas asspticas j citadas em nota no item 3.1.

3.3.4. Contagem das colnias

Aps o perodo de incubao retirar as placas de Petri da estufa, coloc-lassobre uma bancada limpa e proceder contagem das colnias com o auxlio de um

contador de colniasContar apenas as colnias tpicas, ou seja, as colnias de bactrias decoliformes (ver tabela 3).

Meio de cultura Grupo Caracterstica das colniasM ENDO MF Coliformes totais Cor rosa ou vermelha com

brilho metlicocaracterstico

m-FC Coliformes termotolerantes Cor AzulTabela 3Caracterstica tpica das colnias

As colnias indicativas de Coliformes termotolerantes aparecem de cor azul.As no coliformes, aparecem em colorao clara ou rsea.

As colnias indicativas de Coliformes Totais tpicas tm uma cor rosa avermelho escuro, com brilho metlico. O brilho pode aparecer no centro ou na periferiada colnia. As no coliformes aparecem com colorao vermelho-clara ou escura sem o

brilho metlico caracterstico.s vezes, quando o disco est muito mido e a fonte de luz muito intensa, as

colnias de no Coliformes podem aparecer com um brilho falso, causando erros. Istopoder ser contornado usando-se fonte de luz mais difusa ou secando-se o filtro antes deser examinado.

3.3.5. Clculo dos resultados

Nas sistuaes normais, em que so filtrados 100 ml da amostra, o nmero deunidades formadoras de colnias (UFC) / 100 ml da amostra dado diretamente pelonmero de colnias presentes.

Exemplo 1: Foram contadas 40 colnias de coliformes fecais em umamembrana, cujo volume de gua filtrado foi 100 ml, ento o resultado se d: 40UFC/100 ml.

Se for filtrado um volume diferente de 100 ml, considerar o volume no clculodo resultado. Nesse caso, o nmero de UFC/100 ml dado pela seguinte frmula:

UFC/100 ml = __N de colnias tpicas x 100___Volume da amostra que foi filtrado


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Exemplo 2: Foram contadas 30 colnias de coliformes fecais em umamembrana, cujo volume de gua filtrado foi 15 ml, ento o resultado se d:

30 x 10 = 200 UFC/100 ml15

3.4. Tcnica do Substrato DefinidoEssa tcnica pode ser executada de trs maneiras: atravs dos tubos mltiplos e

da contagem Quanty-Tray onde se pode identificar e quantificar a presena dosColiformes por meio da tabela do N.M.P. ou a partir do procedimento P/A onde se podeapenas identificar a presena ou no de bactrias do grupo Coliforme.

3.4.1. Substrato

um meio de cultura base da combinao de substratos que foi desenvolvido

pela Colilert and ColilertMW, Idexx Laboratries, Inc. Westbrook, Maine.So usados dois substratos: Substrato cromognico: ONPG (Orto-nitrofenol -D-galactopiranosdeo); Substrato fluorescente: MUG ( D-glucoronido-4-metil-umbeliferona).

Quando se inocula o meio em uma amostra de gua que contem Coliformestotais eE. coli ocorrem as seguintes reaes:

O grupo dos Coliformes Totais definido como todas as bactrias possuidorasda enzima -galactosidase, que quebra o substrato cromognico ONPG (orto-nitrofenil--galactopiranosdeo) resultando na liberao do cromgeno de cor amarela,denominado ortonitrofenol.

A bactria Escherichia coli d uma resposta positiva igual para os coliformes

totais e ainda possui a enzima -glucoronidase, a qual cliva o substrato fluorgenoMUG ( D-glucoronido-4-metil-umbeliferona), resultando na liberao do fluorgeno4-metilumbeliferona que emite cor fluorescente sob a luz ultravioleta.

3.4.2. Procedimento

3.4.2.1. P/A

Indica a presena/ ausncia em 100 ml adicionando o substrato enzimtico a

100 ml da amostra de gua numa garrafa ou frasco de vidro no fluorescente. O meiodesidratado estril comercializado em ampolas, na quantidade necessria para 100 mlda amostra.

Agitar levemente a soluo, no precisa dissolver totalmente, essa dissoluoocorrer normalmente.

Incubar a 35C durante 24 horas.

3.4.2.2. Tubos mltiplos

Indica o nmero mais provvel (NMP) em 100 ml, fracionando-se eadicionando assepticamente os 100 ml em 10 alquotas de 10 ml.

Incubar a 35C durante 24 horas.


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3.4.2.3. Contagem Quanty-Tray

Assepticamente adicionar o substrato 100 ml da amostra de gua e transferirpara cartelas de quantificao Quanty-Tray 200 ou Quanty-Tray 2000.

Selar a cartela em seladora prpria e levar a cartela para incubao 35C por18 ou 24 horas.

3.4.3. Resultados

Aps o perodo de incubao fazer a contagem das cubetas (Quanty-Tray) outubos (tubos mltiplos) amarelos (= colifiormes totais) e fluorescentes (= E. coli). Paraquantificao utilizar a tabela do NMP (em Anexos). Os frascos do procedimento P/Aseguem o mesmo padro: quando amarelos indicam a presena de coliformes totais equando fluorescentes a presena da bactria E. coli. Dependendo do resultado, ele deveser relatado como presente ou ausente em 100 ml da amostra.

A anlise de fluorescncia deve ser realizada usando uma lmpada ultravioletade longo comprimento de onda (366nm).

4. Consideraes Finais

Como j foi falado, as bactrias do grupo coliforme tm um papel principalcomo indicador da qualidade da gua, por essa razo, a gua, para ser considerada

prpria para o consumo humano, precisa passar por peridicos e sistemticos processosde anlises para avaliao e quantificao da presena desses microrganismos.

Esse fator faz com que as anlises de coliformes se destaquem como as maisexecutadas na maioria dos laboratrios de gua. Por esse motivo esses laboratriostendem a buscar metodologias que demandem menos tempo, sejam eficientes e precisas,facilitem, e barateiem os custos.

Dentre as metodologias aqui descritas, no se pode deixar de dar destaque atcnica do substrato definido, que atende os itens almejados pelos laboratrios demaneira muito satisfatria: rpida, eficiente, precisa, de fcil execuo e relativamente

barata se comparada a outras anlises. Nela as duas reaes especficas para coliformese coliformes fecais, so visualizadas simultaneamente, enquanto que nas metodologiasempregadas pelo mtodo tradicional, cada reao ocorre separadamente, levando odobro do tempo para a verificao do resultado. Alm disso, a tcnica do substrato

definido apresenta mais clareza e preciso nos resultados.J o mtodo dos tubos mltiplos mais trabalhoso para ser executado, pois

requer a preparao e esterilizao dos caldos de cultura. Necessita, portanto, de umlaboratrio equipado com autoclave, vidrarias e outros equipamentos, alm de tcnicos

bem treinados (BETTEGA, J. M. P. R. et al et al,2006).A tcnica da membrana filtrante, por sua vez, ganha em alguns aspectos do

mtodo dos tubos mltiplos, aspectos que j foram citados na introduo. Ela, porm sedemonstra to trabalhosa quanto, exigindo tambm uma boa preparao do laboratorista

para ser executada.Apesar das discrepncias, as trs tcnicas so comprovadamente eficientes

quanto ao resultado final. Alm disso, o sucesso de uma metodologia depende da

adequao do laboratrio a ela.


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5. Referncias

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Agncia Nacional de guas (Brasil). Cuidando das guas: solues paramelhorar a qualidade dos recursos hdricos / Agncia Nacional de guas; Programa das

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BETTEGA, J. M. P. R. et al. Mtodos Analticos no ControleMicrobiolgico da gua para Consumo Humando. Disponvel em Acesso:01/01/2012.

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Silva, N. da Amstalden, V.C. Manual de mtodos de anlise microbiolgicade alimentos. So Paulo: Livraria Varela, 1997.

SILVA, N. da; AMSTALDEN, V.C. Manual de Mtodos de AnliseMicrobiolgica de Alimentos e gua. So Paulo: Livraria Varela Editora, 2010.

6. Anexos

Tabela 1

do NMP com limite de confiana de 95% paravrias combinaes de resultados positivos quando 5 tubos

so usados para cada diluio (10 ml, 1,0 ml e 0,1 ml)


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Tabela 2do NMP com limite de confiana de 95% para

os resultados positivos quando 5 pores de 10 ml so

examinadas

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