UNIVERSIDADE DE BRASÍLIADEPARTAMENTO DE ENGENHARIA CIVIL E AMBIENTALMICROBIOLOGIA AMBIENTAL E EXPERIMENTALPROFESSORA LENORA LUDOLF GOMES

Avaliação da capacidade de biodegradação aeróbia da microbiota indígena do solo através da respirometria

Clarice Carvalho Silva11/0010132

1. Introdução

Micro-organismos são considerados eficientes biodegradadores por causa de sua abundância, variedade de espécies e versatilidade catabólica e anabólica, além de sua habilidade de adaptação a condições ambientais diferenciadas. Quando as condições aeróbias são mantidas, o produto metabólico dos micro-organismos aeróbios geralmente é transformado em água, CO2 e biomassa através da respiração, processo conhecido como mineralização (MORAIS E TAUK-TORNISIELO, 2009). Levando isso em conta, estudos sobre biodegradação de resíduos têm sido realizados nos últimos anos com o objetivo de encontrar formas de diminuir a quantidade de resíduos industriais dos mais diversos. Resíduos esses, que se despejados no ambiente de forma inapropriada, causam impactos ambientais negativos e apresentam um risco potencial à saúde de todas as formas de vida (MIRANDA et al., 2007).

A análise do consumo de oxigênio pelos micro-organismos envolvidos nos processos de estabilização faz parte do que se denomina respirometria, técnica utilizada por estudantes e profissionais que atuam na área de controle da poluição e gestão de recursos hídricos e do meio ambiente, como ferramenta no monitoramento e na modelagem de processos de tratamento biológico de esgotos e resíduos sólidos (BERNASDES E SOARES, 2005).

2. Objetivos

i. Estimar, através da taxa de respiração, a capacidade biodegradadora da microbiota indígena do solo para os diferentes tipos de substratos: Glicose, Chorume, Benzeno e Tolueno.

ii. Verificar quais substratos se apresentam ótimos para o desenvolvimento da microbiota e quais são tóxicos a ela.

iii. Definir se o solo da Estação de Biologia da Universidade de Brasília é apropriado para implantação de tecnologias de Biorremediação.

3. Metodologia

A respirometria é a medida e a interpretação da taxa de respiração em um processo biológico de degradação de terminado substrato definido como a quantidade de oxigênio consumido pelos micro-organismos, em um determinado volume de controle por unidade de tempo (BERNASDES E SOARES, 2005).

O respirômetro consiste basicamente em um reator fechado, onde o substrato é colocado em contato com uma amostra de solo, com microbiota indígena para degradação. O princípio do método é que apenas haverá produção de CO2 dentro do reator se ali houver efetivamente, seres vivos respirando, e consequentemente, degradando o substrato a quem estão submetidos.

O teste respirométrico foi realizado no Laboratório de Análise de Águas do Departamento de Engenharia Civil e Ambiental da Universidade de Brasília, num período de 54 dias, como atividade da disciplina Microbiologia Ambiental e Experimental, Turma A. Foram utilizados seis respirômetros de Bartha, um equipamento relativamente simples que apresenta duas câmaras interligadas. Esses respirômetros foram montados segundo a Norma Técnica NBR 14283, de Fevereiro de 1999, da seguinte forma:

Primeiramente foram colocados dentro da Câmara maior de cada reator 50g de solo, coletados da estação de biologia da Unb,. Depois foram colocados 10 mL do substrato que se desejava analisar como potencial fonte de carbono para a microbiota indígena do solo. Os substratos utilizados foram: Glicose, Chorume (duplicata), Benzeno e Tolueno. Em um dos reatores foi feito um “respirômetro de controle”, com apenas a adição de água sem presença de CO2, para que a microbiota utilizasse a própria matéria orgânica presente no solo como substrato. Na outra câmara do reator, foram adicionados 10 ml de solução de Hidróxido de Potássio (KOH), com a função de reagir com o CO2 gerado no sistema, e formar K2CO3. Os respirômetros foram então fechados e lacrados com fita veda rosca, para que não houvesse entrada ou saída de CO2 do sistema, e levados à estufa à 28ºC para um período de incubação.

A cada período, que alternava entre 3, 4 ou 7 dias, a solução de KOH dos reatores era removida do sistema, e colocada em um frasco Erlenmeyer de 100 ml. Nesse mesmo frasco, eram acrescentadas 4 gotas do indicador fenolftaleína (que apresenta coloração rosa para substâncias básicas e

transparente para ácidas) e 1,0 ml de solução de Cloreto de Bário (CaCl2) 1,0 N, para que a solução de K2CO3 gerada no sistema, fosse precipitada na forma de Carbonato de Bário (BaCO3). Simultaneamente, era realizada uma reoxigenação do sistema, por meio da injeção de ar comprimido, com o emprego de uma bomba de aquário, através de uma entrada contendo cal soldada, que impede a saída de CO2 do sistema, e permite apenas a entrada do oxigênio, essencial para a atividade metabólica dos micro-organismos utilizados. Além disso, era feita uma “lavagem” do braço lateral do respirômetro, com a inserção e retirada de 10 ml de água destilada do reator por três vezes consecutivas. Essa água era despejada no frasco de titulação. Para a continuidade do experimento, eram adicionados mais 10 ml de KOH ao sistema. Os respirômetros eram então lacrados e encubados para uma avaliação posterior da atividade microbiana. Para a titulação, utilizou-se uma bureta contendo uma solução de Ácido Clorídrico (HCL) 0,1 N. O ácido era introduzido lentamente (gota a gota) ao Erlenmeyer, até que ocorresse a mudança da solução de rosa para branco. Para cada titulação realizada, foi anotada a quantidade de ácido utilizada, o que representava a quantidade de KOH excedente, que não havia reagido com o gás carbônico produzido pelo sistema. Além da titulação realizada em cada respirômetro, foi feita a titulação do branco, inserindo ao Erlenmeyer 10 ml de KOH puros e os outros reagentes utilizados na titulação normal.

A Norma Brasileira NBR 14283 (ABNT,1999), disponibiliza a forma correta para fazer os cálculos referentes à expressão dos resultados da seguinte forma:

i. A produção de gás carbônico entre a determinação anterior e a presente é calculada por:

μmolCO2solo (resíduo)= (A−B ) x50 x f Hcl (Equação 1)

Onde:

A=¿ Volume de HCL 0,1 N utilizado para titular o branco (ml);

B=¿ Volume de HCL 0,1 N utilizado para titular o tratamento (ml);

50=¿ Fator para transformar equivalente em μmol de gás carbônico;

f Hcl=¿ Fator do HCL 0,1 que é igual a 0,1

ii. Para determinar a quantidade de gás carbônico devida à biodegradação (CO2), subtrair a quantidade de CO2 produzida no respirômetro-controle da quantidade obtida no respirômetro-ensaio. Construir uma tabela e um gráfico

que forneçam a quantidade de CO2 acumulado produzida por biodegradação em função do tempo de incubação.

iii. Admitindo-se que a metade da quantidade de carbono que é biodegradado é convertida em CO2 e a outra metade é incorporada na forma de biomassa, a quantidade total de carbono biodegradado se dá pela seguinte equação:

Cb (μmolC )=2 xCO2b(μmolCO2) (Equação 2)

Onde:

Cb (μmolC )=¿ μmols de carbono biodegradado;

CO2b (μmolCO2 )=¿ μmols de CO2 produzido.

4. Resultados

Os resultados referentes à quantidade de HCl necessária para titular o KOH encontram-se na Tabela 1. Foram obtidos dois valores de branco, o primeiro, com 16 ml, utilizado a primeira até a quinta leitura, e o segundo com 17,5 ml, utilizado até o final do experimento. Os dados referentes à segunda leitura, realizada no 10º dia do experimento foram desprezados, pois foram obtidos de forma errada.

Tabela 1: Volume de HCl (mL)Intervalo leituras

7 dias 3 dias

4 dias

7 dias

3 dias

4 dias

3 dias

4 dias

3 dias

4 dias

3 dias

4 dias

3 dias

4 dias

Grupos L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 L13 L141A Água 2,0 11,5 5,8 4,0 9,1 8,5 11,4 9,1 11,4 7,8 10,0 8,4 10,8 10,22A Glicose 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,6 2,0 5,8 5,6 6,9 8,93A Chorume 0,0 10,2 7,9 6,5 12,5 12,4 14,3 12,8 14,7 12,2 13,5 12,1 13,3 13,6

4A Chorume 0,0 Sem leitur

a5,7 4,0 10,0 9,7 11,7 10,7 12,2 9,6 11,2 9,5 12,4 11,1

5A Benzeno 11,7

15,9 14,5 15,1 15,6 16,8 17,5 17,4 17,9 14,7 15,8 15,8 16,1 15,4

6A Tolueno 10,9

15,2 14,1 14,2 15,5 15,7 17,3 17,2 17,5 14,7 15,4 13,2 15,3 14,9

5. Discussão

Assumindo que a quantidade de ácido clorídrico titulada, representa a quantidade de base que não reagiu com o CO2, podemos inferir que quanto menor a quantidade de HCL titulada, maior a taxa de respiração da microbiota presente nos respirômetros, e quanto maior o intervalo das leituras, maior foi quantidade de CO2 liberada, por isso, menor foi a quantidade de HCL titulada. Então, a quantidade de CO2 produzida nos respirômetros, calculada a partir da Equação 1 apresentou valores oscilando para todos os respirômetros. Fato ilustrado no Gráfico 1.

0 10 20 30 40 50 60-20

0

20

40

60

80

100

Quantidade de CO2 produzida 6A Tolueno1A Água2A Glicose3A Chorume4A Chorume5A Benzeno

Gráfico 1: Quantidade de CO2 produzida pelos respirômetros com diferentes tratamentos.

Pode-se perceber a partir da análise do Gráfico 1, que inicialmente houve uma “explosão” na atividade metabólica nos respirômetros contendo glicose, não sendo possível quantificar exatamente a taxa de respiração da microbiota, pois houve mais produção de CO2 do que a quantidade de KOH no respirômetro, não sendo necessária a titulação até a sexta leitura, quando essa taxa começou a decair.

No respirômetro com água, a taxa de respiração dos micro-organismos começou alta e a partir da quarta leitura diminuiu até se tornar mais ou menos constante, isso pode se relacionar ao fato de os micro-organismos terem vivido uma fase exponencial até a quarta leitura, e depois permaneceram na fase estacionária.

Os respirômetros com chorume apresentaram resultados bem distintos. Na primeira leitura, os dois apresentavam alta taxa de respiração, mas a partir da terceira leitura, o respirômetro com chorume 4A começou a apresentar resultados semelhantes aos do respirômetro de controle, enquanto que o

chorume 3A apresentou taxas de respiração cada vez mais decrescentes durante toda a realização do experimento. Isso pode ter ocorrido porque o chorume é um substrato que contém diversos compostos, alguns simples e outros mais complexos. Além disso, pode haver micro-organismos diferenciados em cada respirômetro, fato que pode ter causado tal alteração. Provavelmente no respirômetro com amostra de chorume 4A existia uma maior quantidade de compostos assimiláveis pela microbiota que na amostra de chorume 3A.

No caso dos respirômetros contendo benzeno e tolueno, foi verificado que as taxas de respiração dos micro-organismos foram baixas desde a primeira leitura e continuaram decrescendo até o final.

Percebeu-se ainda que no final do experimento, todos os micro-organismos iniciaram sua fase de morte.

A quantidade de CO2 acumulada devido à biodegradação é representada no Gráfico 2, e foi obtida através da subtração das quantidades de CO2 obtidas nos respirômetros com água da quantidade obtida nos diferentes tratamentos, e posterior soma dos valores obtidos em cada medição.

0 10 20 30 40 50 60

-600

-400

-200

0

200

400

600

Quantidade de CO2 acumulada devido à biodegradação.

2A Glicose3A Chorume4A Chorume5A Benzeno6A Tolueno

Gráfico 2: Quantidade de CO2 acumulada devido à biodegradação.

O Gráfico 2 mostra que todos os respirômetros tiveram uma taxa inicial de respiração parecida, o que pode ter ocorrido devido a fase de adaptação da microbiota ao meio. Porém no decorrer do experimento, o que continha glicose apresentou uma alta taxa de crescimento na respiração, mostrando que a microbiota se adaptou melhor a esse substrato. Os respirômetros com chorume apresentaram resultados próximos de zero, mostrando que a duplicata de chorume foi tóxica para alguns micro-organismos fato que provavelmente selecionou os mais adaptados à degradação desse composto. As taxas de

CO2 acumulado para o benzeno e tolueno mostraram-se menores que os do respirômetro de controle durante toda a realização do experimento. Esses resíduos apresentam estrutura complexa de compostos aromáticos, que por sua vez não possuem boa biodisponibilidade para os micro-organismos utilizados, apresentando-se tóxicos a eles.

Sabendo que a quantidade total efetiva de carbono biodegradado é a quantidade total de gás carbônico e Biomassa produzida nos respirômetros em todo o período do experimento, foi realizado o cálculo a partir da Equação 2, e os resultados foram representados no Gráfico 3.

Comprovou-se que a glicose foi o substrato mais adequado ao metabolismo da microbiota indígena do solo, e o tolueno foi o que se apresentou mais tóxico entre todos os compostos. Além disso, foi confirmado que duplicatas não funcionam quando se trata de micro-organismos, pois pode ser que existam seres diferentes em amostras de solo diferentes, por isso a duplicata do chorume apresentou valores tão divergentes na quantidade final de Carbono Biodegradado.

0100200300400500600700800900

1000

1A Água

2A Glicose

3A Chorume

4A Chorume

5A Benzeno

6A Tolueno

Quantidade total de Carbono Biodegradado.

1A Água2A Glicose3A Chorume4A Chorume5A Benzeno6A Tolueno

Gráfico 3: Quantidade total de Carbono Biodegradado para os diferentes tratamentos.

6. Conclusão

Da análise dos dados, pode-se inferir que:

A glicose foi o substrato com maior biodisponibilidade para a microbiota indígena do solo, fato que já era esperado, já que é um composto orgânico facilmente assimilável pela maioria dos organismos.

A eficiência da degradação do chorume não foi comprovada, pois apesar de apresentar resultados divergentes, foram muito próximos aos do respirômetro de controle.

No caso do Benzeno e Tolueno, foi verificado que por serem compostos muito complexos, ambos apresentaram-se tóxicos aos micro-organismos, com valores cada vez mais decrescentes nas taxas de respiração e carbono biodegradado.

Os resultados mostraram que o solo da estação de Biologia da Unb não é apropriado para a aplicação de tecnologias de biorremediação para degradação dos compostos analisados.

7. Referências Bibliográficas

MORAIS, E.B.;TAUK-TORNISIELO, S.M. Biodegradation of oil refinery residues using mixed-culture of microorganisms isolated from a landfarming. Brazilian archives of Biology and technology, v. 52, n. 6, p. 1571-1578, 2009.

Miranda, R.C; Souza, C.S.; Gomes, E.B.; Lovaglio, R.B.; Lopes, C.E.; Souza, M.F.V.Q. (2007), Biodegradation of diesel oil by yeast from the vicinity of Suape Port in the State of Pernambuco – Brazil. Braz. Arch. Biol. Tecnol., 50(1), 147-152.

BERNARDES, R.S.; SOARES, S.R.A. Fundamentos da respirometria no controle da poluição da água e do solo. Ed. Universidade de Brasília, Finatec, 2005. 164p.

COSTA, M.R. (2009). Uso da respirometria para avaliação da biodegradação aeróbia de lixiviado de resíduos sólidos urbanos em Latossolo Vermelho-Escuro. Dissertação de Mestrado em Tecnologia Ambiental e Recursos Hídricos, Publicação PTARH.DM – 125/09, Departamento de Engenharia Civil e Ambiental, Universidade de Brasília, Brasília, DF, 109p.

ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS – ABNT – NBR 14283 Resíduos em solo – Determinação da biodegradação pelo método respirométrico, 1999.