QTL, e-QTL, associação e seqüênciamento ultra-HT: o ... 25_CURSO_CBAB_UFPR_2008.pdfG38 ab x cd...

QTL, e-QTL, associação e seqüênciamento ultra-HT: o desafio que resta são os fenótipos e a análise de dadosQTL, eQTL, e--QTL, associação e seqüênciamento ultraQTL, associação e seqüênciamento ultra--HT: o HT: o desafio que resta são os fenótipos desafio que resta são os fenótipos e a análise de dadose a análise de dados

Dario Grattapaglia EMBRAPA Recursos Genéticos e BiotecnologiaDario Grattapaglia EMBRAPAEMBRAPA Recursos Genéticos e BiotecnologiaRecursos Genéticos e Biotecnologia

Mapa genético(SSR, AFLP,

RAPD)

Mapa físicotrilha mínima

(Fingerprintingde BAC)

QTL mapeado

LOD >>3,0

LOD

= 3,0

~ 10 cM

~ 500 a 1000 kpb

Mapa genético de alta resolução

(AFLP, SNPs)

< 1,0 cM

Mapeamento de genes candidatos

derivados de análises de bioinfo ou QTLs de expressão

Sequenciamentoshotgun

de baixa cobertura e anotação

Testes funcionais via transformação

genética (complementação, superexpressão, silenciamento)

Mapeamento de associação

(whole genome scan, genes candidatos)

Identificação e validação do

gene-alvo

Fenotipagemem

população segregante

Abordagem de genética direta (forward genetics)

de fenótipos a genes

Abordagem de genética direta Abordagem de genética direta ((forward forward geneticsgenetics))

de fenótipos a genesde fenótipos a genes

Pré-requisitos para o sucesso de projetos genoma:

Grupo multidisciplinar de pesquisadores

Material genético e populações experimentais adequadas *****

Recursos genômicos: sequências de genes, marcadores moleculares (SSR e SNPs), mapas genéticos, mapa físico, bioinformática

Fenotipagem em larga escala: qualidade da madeira, resistência a doenças etc. *****

Abordagens experimentais integrativas de genética & genômica

Interconexão com trabalhos intensivos de campo, genética quantitativa e estratégias de melhoramento

PréPré--requisitos para o sucesso de projetos genoma:requisitos para o sucesso de projetos genoma:

Grupo multidisciplinar de pesquisadores Grupo multidisciplinar de pesquisadores

Material genético e populações experimentais adequadas *****Material genético e populações experimentais adequadas *****

Recursos Recursos genômicosgenômicos: : sequênciassequências de genes, marcadores moleculares de genes, marcadores moleculares (SSR e (SSR e SNPsSNPs), mapas genéticos, mapa físico, ), mapas genéticos, mapa físico, bioinformáticabioinformática

FenotipagemFenotipagem em larga escala: qualidade da madeira, resistência a em larga escala: qualidade da madeira, resistência a doenças etc. *****doenças etc. *****

Abordagens experimentais integrativas de genética & Abordagens experimentais integrativas de genética & genômicagenômica

Interconexão com trabalhos intensivos de campo, genética quantiInterconexão com trabalhos intensivos de campo, genética quantitativa e tativa e estratégias de melhoramentoestratégias de melhoramento

Projeto genoma no melhoramento florestalProjetoProjeto genomagenoma no no melhoramentomelhoramento florestalflorestal

Rede de experimentos de campo do projetoGENOLYPTUS: instalada em 2003

RedeRede de de experimentosexperimentos de campo do de campo do projetoprojetoGENOLYPTUS: GENOLYPTUS: instalada em 2003instalada em 2003

JariJariJari

VeracelVeracelVeracelCenibraCenibraCenibra

LwarcelLwarcelLwarcel

KlabinKlabinKlabin

Locais principais de instalaçãodos experimentosLocaisLocais principaisprincipais de de instalaçãoinstalaçãodos dos experimentosexperimentos

Locais complementares de instalação dos experimentosLocaisLocais complementarescomplementares de de instalaçãoinstalação dos dos experimentosexperimentos

Ampla variabilidade fenotípica paracrescimento e qualidade da madeiraAmplaAmpla variabilidadevariabilidade fenotípicafenotípica paraparacrescimentocrescimento e e qualidadequalidade dada madeiramadeira

Coleta de amostras de madeira paraanálise fenotípica via NIRS

ColetaColeta de de amostrasamostras de de madeiramadeira paraparaananááliselise fenotfenotíípicapica via NIRSvia NIRS

Amostras de

Calibração Resultados de análises de lab

espectroEquaçõesPreliminaresValidaçãoAnálises de Rotina

CALIBRAÇÃO do NIRSCALIBRAÇÃO do NIRS

E. urophyllaU15

F1.1

E. grandisG38

ab x cdEMBRA954

ab x acEMBRA186

aa x abEMBRA008

ab x aaEMBRA147

ab x abEMBRA676

F1.2

F1.3

F1.4

Configurações possíveis de segregação de marcadores co-dominantes microssatélites em uma família F1 de Eucalyptus

Configurações possíveis de segregação de marcadores coConfigurações possíveis de segregação de marcadores co--dominantes dominantes microssatélitesmicrossatélites em uma família em uma família F1F1 de de EucalyptusEucalyptus

EMBRA40314.6 EMBRA364.2 EMBRA2820.8 EMBRA695.4 EMBRA32411.6 EMBRA3874.3 EMBRA566.1 EMBRA4813.0 EMBRA1269.6 EMBRA2885.4 EMBRA32014.4 EMBRA3471.1 EMBRA3588.3 EMBRA1203.7 EMBRA2715.8 EMBRA5114.3 EMBRA17318.4 EMBRA71

EMBRA1621.4 EMBRA3447.1 EMBRA373.3 EMBRA35136.7 EMBRA18829.9 EMBRA28716.9 EMBRA2383.5 EMBRA3043.3 EMBRA2740.5 EMBRA2390.0 EMBRA490.0 EMBRA1140.5 EMBRA2221.6 EMBRA2472.9 EMBRA4260.0 EMBRA4354.1 EMBRA4364.2 EMBRA17110.4 EMBRA23617.7 EMBRA191a0.0 EMBRA263

EMBRA32210.2 EMBRA1339.5 EMBRA1650.0 EMBRA83.7 EMBRA4421.8 EMBRA1563.8 EMBRA24226.0 EMBRA3035.8 EMBRA4237.8 EMBRA752.4 EMBRA1312.5 EMBRA335

EMBRA3180.0 EMBRA1002.7 EMBRA801.1 EMBRA4330.9 EMBRA3755.4 EMBRA24612.4 EMBRA25113.8 EMBRA4714.5 EMBRA30012.2 EMBRA2714.6 EMBRA1820.0 EMBRA2580.0 EMBRA764.8 EMBRA122.0 EMBRA22410.7 EMBRA3329.1 EMBRA6813.7 EMBRA15911.8 EMBRA35

Grupo 1Grupo 1Grupo 2Grupo 2

Grupo 3Grupo 3

EMBRA2429.3 EMBRA8524.2 EMBRA4173.7 EMBRA29610.5 EMBRA3620.6 EMBRA2951.8 EMBRA183.3 EMBRA345.0 EMBRA3730.5 EMBRA3650.0 EMBRA3531.2 EMBRA3344.5 EMBRA1177.5 EMBRA1615.6 EMBRA4403.3 EMBRA2778.3 EMBRA42714.7 EMBRA2551.6 EMBRA2410.0 EMBRA2251.1 EMBRA1945.5 EMBRA23715.8 EMBRA925.6 EMBRA14515.1 EMBRAac7

Grupo 5Grupo 5

Grupo 4Grupo 4

EMBRA5737.3 EMBRA3107.0 EMBRA932.2 EMBRA9611.1 EMBRA1500.0 EMBRA3068.6 EMBRA700.0 EMBRA1482.6 EMBRA4349.8 EMBRA34522.0 EMBRA8622.4 EMBRA6211.4 EMBRA7910.4 EMBRA25914.6 EMBRA45

EMBRA1224.6 EMBRA3141.0 EMBRA2791.0 EMBRA4180.5 EMBRA3080.0 EMBRA4312.2 EMBRA2603.8 EMBRA3271.7 EMBRA950.0 EMBRA1394.9 EMBRA658.2 EMBRA3998.2 EMBRA3509.6 EMBRA3761.1 EMBRA2811.1 EMBRA3709.8 EMBRA1183.3 EMBRA15324.0 EMBRA331.4 EMBRA2501.3 EMBRA1550.0 EMBRA2437.7 EMBRA294

EMBRA18621.3 EMBRA6019.4 EMBRA313.9 EMBRA1730.3 EMBRA1247.7 EMBRA2525.3 EMBRA2728.5 EMBRA12912.0 EMBRA35713.3 EMBRA2286.0 EMBRA3542.3 EMBRA3463.3 EMBRA4478.3 EMBRA4111.0 EMBRA1360.0 EMBRA1230.9 EMBRA4412.8 EMBRA2931.0 EMBRA3401.6 EMBRA1549.8 EMBRA3924.5 EMBRA1373.1 EMBRA283.7 EMBRA14211.8 EMBRA253

EMBRA19310.3 EMBRA18530.0 EMBRA10926.9 EMBRA23516.0 EMBRA3561.7 EMBRA36611.9 EMBRA62.2 EMBRA1995.2 EMBRA3259.2 EMBRA14420.2 EMBRA1388.8 EMBRA39711.1 EMBRA1106.3 EMBRA54.4 EMBRA36711.6 EMBRA5913.6 EMBRA34217.5 EMBRA128

EMBRA17411.6 EMBRA2701.1 EMBRA19011.1 EMBRA19822.1 EMBRA8735.6 EMBRA9142.4 EMBRA8222.8 EMBRA995.8 EMBRA721.7 EMBRA16311.5 EMBRA22912.3 EMBRA192.7 EMBRA3438.7 EMBRA5319.6 EMBRA73

EMBRA144.8 EMBRA239.9 EMBRA8911.0 EMBRA31120.4 EMBRA406.7 EMBRA3373.7 EMBRA2891.8 EMBRA580.9 EMBRA415.5 EMBRA250.9 EMBRAac80.0 EMBRA125

Grupo 6Grupo 6

Grupo 11Grupo 11

Grupo 7Grupo 7 Grupo 8Grupo 8Grupo 9Grupo 9 Grupo 10Grupo 10

Um mapa genético referência para espécies de Eucalyptus baseado exclusivamente em microssatélites

Um mapa genético referência para espécies de Eucalyptus baseado exclusivamente em microssatélites

Desenvolvimento de novos microssatélitesdi e tri de ESTs – mapeamento de genestetra e pentanucleotídeos de BACends e shotgun genômico - fingerprinting

Desenvolvimento de novos microssatélitesdi e tri de ESTs – mapeamento de genestetra e pentanucleotídeos de BACends e shotgun genômico - fingerprinting

EmbraEmbra 2321 (2321 (pentapenta)) EmbraEmbra 3275 (3275 (pentapenta))

0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

197 201 206 211 216 217 227Alelos

Freq

uênc

ia

E.grandis(Coff's Harbor)

E.grandis(AthertonQueensland)E.globulus(Jeerlang)

E.globulus(Flinder)

E.urophylla(Timor)

E.urophylla(Flores)0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

214 219 224 229 234 239 244 249Alelos

Freq

uênc

iaE.grandis(Coff's Harbor)

E.grandis(AthertonQueensland)E.globulus(Jeerlang)

E.globulus(Flinder)

E.urophylla(Timor)

E.urophylla(Flores)

Exemplos de QTLsmapeados paracaracterísticas de importância industrial

Novaes et al. 2006

ExemplosExemplos de de QTLsQTLsmapeadosmapeados paraparacaractercaracteríísticassticas de de importânciaimportância industrialindustrial

NovaesNovaes et al. 2006et al. 2006

Embra762

Embra219

Embra012Embra632Embra070Embra222Embra2000

Embra006Embra676

EN006Embra011

1

Embra762

Embra219

Embra012Embra632Embra070Embra222Embra2000

Embra006Embra676

EN006Embra011

1

Embra068

Embra710

Embra063Embra159

Embra164bEmbra228Embra134Embra072

Embra218EG086Embra195Embra027

Embra648

EG096

2

Embra068

Embra710

Embra063Embra159

Embra164bEmbra228Embra134Embra072

Embra218EG086Embra195Embra027

Embra648

EG096

2

Embra189

Embra227

EG061Embra125

3

Embra189

Embra227

EG061Embra125

3

Embra393Embra019Embra078Embra130Embra137Embra341EG030ES054

EG128Embra662Embra146Embra213Embra036Embra044Embra179

4Embra393Embra019Embra078Embra130Embra137Embra341EG030ES054

EG128Embra662Embra146Embra213Embra036Embra044Embra179

4Embra618Embra242Embra120Embra1040Embra041Embra640

Embra224Embra138Embra152

Embra160Embra665Embra111Embra746Embra054Embra045Embra214Embra009Embra208Embra037

5Embra618Embra242Embra120Embra1040Embra041Embra640


Embra160Embra665Embra111Embra746Embra054Embra045Embra214Embra009Embra208Embra037

5

DAPAlturaPilodynDens. BásicaGlicanaXilanaÁc. metilglucurônicoÁc. galactourônicoLigninaSiringil/GuaicilÁlcali efetivoRendimento depuradoViscosidadeExtrativos

EG115

Embra095Embra018Embra183ES140

Embra017Embra172

Embra109

Embra357

9

EG115

Embra095Embra018Embra183ES140

Embra017Embra172

Embra109

Embra357

9


Embra022


Embra194

Embra624

10


Embra022


Embra194

Embra624

10

Embra021Embra326aEmbra191

Embra655

Embra652

Embra221

Embra176

Embra651Embra039Embra002EG024Embra681b

11

Embra021Embra326aEmbra191

Embra655

Embra652

Embra221

Embra176

Embra651Embra039Embra002EG024Embra681b

11

Embra097

Embra020Embra362Embra345Embra135ES157

Embra175Embra646


Embra008Embra241EN016

Embra627

Embra028Embra187

6

Embra097

Embra020Embra362Embra345Embra135ES157

Embra175Embra646


Embra008Embra241EN016

Embra627

Embra028Embra187

6Embra098Embra067Embra680Embra200Embra148Embra083Embra340Embra069EN014Embra128Embra046

Embra347

7Embra098Embra067Embra680Embra200Embra148Embra083Embra340Embra069EN014Embra128Embra046

Embra347

7

Exemplos de QTLsmapeados paracaracterísticas de importância industrial

QTL para teor de álcali efetivo

QTL para a relação Siringil/Guaicillignina

Novaes et al. 2006

ExemplosExemplos de de QTLsQTLsmapeadosmapeados paraparacaractercaracteríísticassticas de de importânciaimportância industrialindustrial

QTL QTL parapara teorteor de de áálcalilcali efetivoefetivo

QTL QTL parapara a a relarelaççãoão Siringil/GuaicilSiringil/Guaicilligninalignina

NovaesNovaes et al. 2006et al. 2006

DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES E CONSTRUÇÃO DE MAPAS GENÉTICOS

DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES E DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES E CONSTRUÇÃO DE MAPAS GENÉTICOSCONSTRUÇÃO DE MAPAS GENÉTICOS

Desenvolvimento de microssatélites de ESTDesenvolvimento de microssatélites de tetra e pentanucleotideosCostrução de mapas genéticos e posicionamento de QTL para 7 famílias

Família testemunha IP – 188 ind.; ~200 marcadores (Eva)Família testemunha VCP - – 188 ind.; ~180 marcadores (Evandro)Família DG x UGL – 188 ind.; ~120 marcadores (Danielle)Família C1 x UGL - – 188 ind.; ~110 marcadores (Leo & Danielle)Família DG x U2 – 188 ind.; ~100 marcadores (Cesar & Carolina)Familia na UFG – 188 ind.; 40 marcadores (Medina)Família na Embrapa GO – 188 ind.; 70 marcadores (Gisele)

Desenvolvimento de microssatélites de ESTDesenvolvimento de microssatélites de ESTDesenvolvimento de microssatélites de tetra e pentanucleotideosDesenvolvimento de microssatélites de tetra e pentanucleotideosCostrução de mapas genéticos e posicionamento de QTL para 7 famíCostrução de mapas genéticos e posicionamento de QTL para 7 famíliaslias

Família testemunha IP Família testemunha IP –– 188 ind.; ~200 marcadores (Eva)188 ind.; ~200 marcadores (Eva)Família testemunha VCP Família testemunha VCP -- –– 188 ind.; ~180 marcadores (Evandro)188 ind.; ~180 marcadores (Evandro)Família DG x UGL Família DG x UGL –– 188 ind.; ~120 marcadores (Danielle)188 ind.; ~120 marcadores (Danielle)Família C1 x UGL Família C1 x UGL -- –– 188 ind.; ~110 marcadores (Leo & Danielle)188 ind.; ~110 marcadores (Leo & Danielle)Família DG x U2 Família DG x U2 –– 188 ind.; ~100 marcadores (Cesar & Carolina)188 ind.; ~100 marcadores (Cesar & Carolina)Familia na UFG Familia na UFG –– 188 ind.; 40 marcadores (Medina)188 ind.; 40 marcadores (Medina)Família na Embrapa GO Família na Embrapa GO –– 188 ind.; 70 marcadores (Gisele)188 ind.; 70 marcadores (Gisele)

Vigor híbrido em nível de média de família

Vigor híbrido Vigor híbrido emem nível nível de de média de famíliamédia de família

Vigor híbrido em nível de árvore individual

dentro de família

Fotos: Teotônio de Assis

Vigor híbrido Vigor híbrido emem nível nível de árvore de árvore individual individual

dentro de famíliadentro de família

Fotos: Teotônio de AssisFotos: Teotônio de Assis

Cruzamento entre híbridos para maximização da segregação na F2

Geração de um grande número de descendentes F2 (n >1000) da mesma família

XF1 F1

Mapeamento de QTLs para características de qualidade da madeira

com expressão tardia

embra_189*EG_94*embra_227*

embra_350*embra_321*EG-98*embra_125*

embra_629*

EN_14*

embra_189embra_115EG_94embra_227

embra_122*

EG_98*embra_125*

embra_114

embra_361

embra_109embra_197embra_57EN_1embra_53

embra_210.1*

EG_67

embra_103

embra_624

ES_140embra_18embra_131

embra_210embra_204*embra_217*

embra_365*

embra_701*embra_19embra_393embra_66*embra_78*embra_137*

ES_54*

embra_645*

embra_622*embra_28*embra_94*embra_627*EG_62*embra_372*embra_32*embra_31*embra_233*embra_50*embra_8*embra_328*embra_324*embra_173*embra_51*embra_25*embra_106*embra_248*embra_258*embra_105*embra_646*embra_175*

ES_157*embra_277*

embra_362*

embra_189*EG_94*embra_227*

embra_350*embra_321*EG-98*embra_125*

embra_629*

EN_14*

embra_189embra_115EG_94embra_227

embra_122*

EG_98*embra_125*

embra_114

embra_361


embra_210.1*

EG_67

embra_103

embra_624




embra_210.1*

EG_67

embra_103

embra_624



embra_365*


ES_54*

embra_645*

embra_365*


ES_54*

embra_645*


ES_157*embra_277*

embra_362*


ES_157*embra_277*

embra_362*


ES_157*embra_277*

embra_362*

Genotipagem de descendentes em idade ultra precoce (semanas) para marcadores ligados a QTLs para características de expressão tardia (ex. qualidade

de fibra, teor de lignina, densidade básica) detectados na fase de mapeamento

Seleção assistida por marcadores para características de expressão tardia de descendentes. Estes são clonados para implantação de teste clonal. Teste clonal é otimizado pois envolve

somente indivíduos pré-selecionados para características de expressão tardia.

Infor

maçã

o de Q

TLsd

esco

berto

s par

a car

acter

ística

s de

expr

essã

o tar

dia (e

x. qu

alida

de da

mad

eira)ETAPA DE DESCOBRIMENTO

DE QTLSs

ETAPA DE UTILIZAÇÃO DE QTLSsPARA SELEÇÃO ASSISTIDA

F2

F2

Marcadores EL – Equilíbrio de ligaçãoEx. Marcadores microssatélites que flanqueiam um QTLResolução da ordem de centimorgans, ~ 105 a 107 pb

Marcadores DL – Desequilíbrio de ligaçãoEx. Marcadores SNP´s fortemente ligados ao QTL

Resolução da ordem de subcentimorgans ~ 102 a 104 pb

Marcadores D – DiretosEx. SNPs causais da variação quantitativa observada

Máxima resolução e identificação do alelo causal exato

QTL

QTL ou gene candidato

Gene e polimorfismo responsável identificados

Reso

luçã

o

-

+

Marcadores EL – Equilíbrio de ligaçãoEx. Marcadores microssatélites que flanqueiam um QTLResolução da ordem de centimorgans, ~ 105 a 107 pb

Marcadores DL – Desequilíbrio de ligaçãoEx. Marcadores SNP´s fortemente ligados ao QTL

Resolução da ordem de subcentimorgans ~ 102 a 104 pb

Marcadores D – DiretosEx. SNPs causais da variação quantitativa observada

Máxima resolução e identificação do alelo causal exato

QTL

QTL ou gene candidato

Gene e polimorfismo responsável identificados

Reso

luçã

o

-

+ Estas são as associações marcador-fenótipo úteis em nível

populacional

Variaçãofenotípica

MENSURAÇÃO FENOTÍPICA

Variaçãofenotípica

MENSURAÇÃO FENOTÍPICA

Variação genotípica(SNP, marcadores

moleculares)MAPA GENÉTICO

Variação genotípica(SNP, marcadores

moleculares)MAPA GENÉTICO

Variação de expressão

gênicaMICROARRANJOS

Variação de expressão

gênicaMICROARRANJOS

eQTLQTL

Esta abordagem identifica:Genes diferencialmente expressos nos parentaisGenes diferencialmente expressos no tecido de interesseGenes controladores dos QTLs mapeadosNão é necessária a sequência completa do genoma

LimitaçõesDetecta somente genes que estão no microarranjoAo testar muitos genes, alguns estarão associados devido ao acaso

EstaEsta abordagemabordagem identificaidentifica::Genes Genes diferencialmentediferencialmente expressosexpressos nosnos parentaisparentaisGenes Genes diferencialmentediferencialmente expressosexpressos no no tecidotecido de de interesseinteresseGenes Genes controladorescontroladores dos dos QTLsQTLs mapeadosmapeadosNãoNão é é necessárianecessária a a sequênciasequência completacompleta do do genomagenoma

LimitaçõesLimitaçõesDetectaDetecta somentesomente genes genes queque estãoestão no no microarranjomicroarranjoAoAo testartestar muitosmuitos genes, genes, algunsalguns estarãoestarão associadosassociados devidodevido aoao acasoacaso

Identificação de genes responsáveis por QTLs usando abordagemcombinada mapeamento genético e expressão em microarranjosIdentificaIdentificaççãoão de genes de genes responsresponsááveisveis porpor QTLsQTLs usandousando abordagemabordagemcombinadacombinada mapeamentomapeamento gengenééticotico e e expressãoexpressão emem microarranjosmicroarranjos

Mapeamento genético do local físico e nível de transcrição do gene CAD2 e RCI2.Níveis relativos de transcritos foram mapeados como características quantitativas (setas

sólidas)A posição física dos dois genes foi mapeada geneticamente via SSCP e dHPLC (setaspontilhadas)RCI2: o sítio de regulação da transcrição coincide com o seu local físico (regulação em

CIS)CAD2: padrão mais complexo com três QTLs de expressão identificados em outros locaisno genoma diferentes do local do gene (regulação em trans)

MapeamentoMapeamento genéticogenético do local do local físicofísico e e nívelnível de de transcriçãotranscrição do gene CAD2 e RCI2.do gene CAD2 e RCI2.NíveisNíveis relativosrelativos de de transcritostranscritos foramforam mapeadosmapeados comocomo característicascaracterísticas quantitativasquantitativas ((setassetassólidassólidas))A A posiçãoposição físicafísica dos dos doisdois genes genes foifoi mapeadamapeada geneticamentegeneticamente via SSCP e via SSCP e dHPLCdHPLC ((setassetaspontilhadaspontilhadas))RCI2: o RCI2: o sítiosítio de de regulaçãoregulação dada transcriçãotranscrição coincide com o coincide com o seuseu local local físicofísico ((regulaçãoregulação ememCIS)CIS)CAD2: CAD2: padrãopadrão maismais complexocomplexo com com trêstrês QTLsQTLs de de expressãoexpressão identificadosidentificados emem outrosoutros locaislocaisno no genomagenoma diferentesdiferentes do local do gene (do local do gene (regulaçãoregulação emem trans) trans)

LG1 LG2 LG3 LG4 LG5 LG6 LG7 LG8 LG9 LG10 LG11

CAD2 RCI2

Kirst et al. 2004 Plant Phys.Kirst et al. 2004 Plant Phys.Kirst et al. 2004 Plant Phys.

Uma das premissas básicas da genética é de que genomas de indivíduos pertencentes à mesma espécie são colineares em nível de sequência e contém o mesmo complemento gênico

Exceções incluem SNPs, indels, translocações e inserções de transposons

Esta premissa tem sido desafiada nos últimos anos à medida que tem sido possível resequenciar e comparar longos trechos de DNA além de regiões transcritas, principalmente em gramíneas

Uma das premissas básicas da genética é de que genomas de indivíUma das premissas básicas da genética é de que genomas de indivíduos duos pertencentes à mesma espécie são colineares em nível de sequêncipertencentes à mesma espécie são colineares em nível de sequência e a e contém o mesmo complemento gênicocontém o mesmo complemento gênico

Exceções incluem SNPs, indels, translocações e inserções de tranExceções incluem SNPs, indels, translocações e inserções de transposonssposons

Esta premissa tem sido desafiada nos últimos anos à medida que tEsta premissa tem sido desafiada nos últimos anos à medida que tem sido em sido possível resequenciar e comparar longos trechos de DNA além de rpossível resequenciar e comparar longos trechos de DNA além de regiões egiões transcritas, principalmente em gramíneastranscritas, principalmente em gramíneas

Variação genômica entre indivíduos da mesma espécie é maior do que se imaginava e muito grande em regiões não codantesVariaçãoVariação genômica entre indivíduos da mesma espécie é maior genômica entre indivíduos da mesma espécie é maior do que se imaginava e muito grande em regiões não codantesdo que se imaginava e muito grande em regiões não codantes

VARIAÇÃO ESTRUTURAL NO GENOMADiferenças no conteúdo e distribuição de DNA repetitivo fornecem diferentes ambientes genômicos

que por sua vez afetam a regulação da expressão gênicaEstas diferenças tem sido propostas como explicação para a base molecular da heterose em milhoVariaçào estrutural dentro e entre espçies de Eucalyptus deve ser abundante e poderá ajudar a

entender a base molecular da superioriade de híbridos para crescimento e adaptabilidadeGenômica comparativa e análise de micro-colinearidade entre indiv’duos dentro de espécie deverá

ser uma fronteira cada vez mais importante de ser explorada para o entendimento da base molecular das diferenças fenotípicas

Para isso tecnologias de sequenciamento de alta performance serão fundamentais

VARIAÇÃO ESTRUTURAL NO GENOMAVARIAÇÃO ESTRUTURAL NO GENOMADiferenças no conteúdo e distribuição de DNA repetitivo fornecemDiferenças no conteúdo e distribuição de DNA repetitivo fornecem diferentes ambientes genômicos diferentes ambientes genômicos

que por sua vez afetam a regulação da expressão gênicaque por sua vez afetam a regulação da expressão gênicaEstas diferenças tem sido propostas como explicação para a base Estas diferenças tem sido propostas como explicação para a base molecular da heterose em milhomolecular da heterose em milhoVariaçào estrutural dentro e entre espçies de Eucalyptus deve seVariaçào estrutural dentro e entre espçies de Eucalyptus deve ser abundante e poderá ajudar a r abundante e poderá ajudar a

entender a base molecular da superioriade de híbridos para crescentender a base molecular da superioriade de híbridos para crescimento e adaptabilidadeimento e adaptabilidadeGenômica comparativa e análise de microGenômica comparativa e análise de micro--colinearidade entre indiv’duos dentro de espécie deverá colinearidade entre indiv’duos dentro de espécie deverá

ser uma fronteira cada vez mais importante de ser explorada paraser uma fronteira cada vez mais importante de ser explorada para o entendimento da base molecular o entendimento da base molecular das diferenças fenotípicasdas diferenças fenotípicas

Para isso tecnologias de sequenciamento de alta performance serãPara isso tecnologias de sequenciamento de alta performance serão fundamentaiso fundamentais

Velasco et al. 2007- structural variation between haplotypes in the Vitis genome is associated with transposable elements and gaps

Sequenciamento e alinhamento dos dois haplótipos de uma árvore heterozigota de Eucalyptus grandis

Avaliação das perspectivas de montagem do genoma heterozigoto(dados colaboração Genolyptus – Stanford Genome Technology Center)

Sequenciamento e alinhamento dos dois haplótipos Sequenciamento e alinhamento dos dois haplótipos de uma árvore heterozigota de de uma árvore heterozigota de Eucalyptus grandisEucalyptus grandis

Avaliação das perspectivas de montagem do genoma heterozigotoAvaliação das perspectivas de montagem do genoma heterozigoto(dados colaboração Genolyptus (dados colaboração Genolyptus –– Stanford Genome Technology Center)Stanford Genome Technology Center)

Elevada microcolinearidade (27 kb)Elevada microcolinearidade (27 kb)Elevada microcolinearidade (27 kb)

Presença de duplicações em tandem (25 kb)Presença de duplicações em tandem (25 kb)Presença de duplicações em tandem (25 kb)

Presença de duplicações invertidas (14 kb)Presença de duplicações invertidas (14 kb)Presença de duplicações invertidas (14 kb)

Novas tecnologias de sequenciamentoNovas tecnologias de sequenciamentoNovas tecnologias de sequenciamento

HUDSON, ME (2008) Sequencing breakthroughs for genomic ecology and evolutionary biology. Molecular Ecology Resources 8 (1), 3-17.

Genolyptus librariesUR-XY

9%SP-RX

1%

SP-FX13%

PE-XY10%

GR-YL1% GR-XY

1% GR-TS12% GR-SE

12%

GR-PU5%

GR-ML7%

GR-GE8%

GR-BC6%

GL-XY15%

GENOLYPTUS EST database (Brazil)4 species ; 11 libraries124,851 reads ~ 50 Mbp21,442 tentative consensi

To be released in 20081.5 years – 1.5 million USD

GENOLYPTUS EST database (Brazil)GENOLYPTUS EST database (Brazil)4 species ; 11 libraries4 species ; 11 libraries124,851 reads ~ 50 Mbp124,851 reads ~ 50 Mbp21,442 tentative consensi21,442 tentative consensi

To be released in 2008To be released in 20081.5 years 1.5 years –– 1.5 million USD1.5 million USD

Genomic resources for Eucalyptus breeding

Expressed sequence tagsThe impact of next generation sequencing technologies for the generation of genomic

resources

Genomic resources for Genomic resources for Eucalyptus breedingEucalyptus breedingExpressed sequence tagsExpressed sequence tags

The impact of next generation sequencing The impact of next generation sequencing technologies for the generation of genomic technologies for the generation of genomic

resourcesresources

UNIVERSITY OF FLORIDA (Kirst lab)Pool of 21 E. grandis trees

1,024,251 reads 148.4 Mbp 29,000 tentative consensi1.5 months – 30 k USD

UNIVERSITY OF FLORIDA (Kirst lab)UNIVERSITY OF FLORIDA (Kirst lab)Pool of 21 E. grandis trees Pool of 21 E. grandis trees

1,024,251 reads 148.4 Mbp 1,024,251 reads 148.4 Mbp 29,000 tentative consensi29,000 tentative consensi1.5 months 1.5 months –– 30 k USD30 k USD

Comparative study Sanger x 454 sequencingComparative study Sanger x 454 sequencingComparative study Sanger x 454 sequencing

SequênciaSequência da triagem da biblioteca de 20.160 clones BAC desde a análise dda triagem da biblioteca de 20.160 clones BAC desde a análise dos os superpoolssuperpools até até a identificação do clone BAC contendo o gene alvo. a identificação do clone BAC contendo o gene alvo.

TRIAGEM DOS SUPERPOOLS e análise em gel TRIAGEM DOS SUPERPOOLS e análise em gel de eletroforese. Para este gene foram detectados de eletroforese. Para este gene foram detectados

3 3 superpoolssuperpools positivos (nº 19, 20 e 28)positivos (nº 19, 20 e 28)

TRIAGEM DOS 6 POOLS TRIAGEM DOS 6 POOLS de de cada um dos 3 SUPERPOOLS cada um dos 3 SUPERPOOLS positivos. Em cada positivos. Em cada superpoolsuperpool foi foi encontrado um pool positivo.encontrado um pool positivo.

TRIAGEM DOS 96 CLONES BAC DO TRIAGEM DOS 96 CLONES BAC DO POOL POSITIVO 28. POOL POSITIVO 28. Para este gene foi Para este gene foi detectado o BAC contendo o gene alvo na detectado o BAC contendo o gene alvo na posição posição B8B8

+

19 20 28

POOL 28

Eg POOL - BACs incluídosEg POOL Eg POOL -- BACs incluídosBACs incluídos

4CL 150 kbCCR 110 kbCELLULOSE SINTASE* 190 kbXET* 190 kbSAMS 70 kbUDP-Glucose 220 kbF5H* 140 kbRGA* 90 kbRCI* n.a.CAD* 25 kb

4CL4CL 150 kb150 kbCCRCCR 110 kb110 kbCELLULOSE SINTASE*CELLULOSE SINTASE* 190 kb190 kbXET*XET* 190 kb190 kbSAMSSAMS 70 kb70 kbUDPUDP--GlucoseGlucose 220 kb220 kbF5H*F5H* 140 kb140 kbRGA*RGA* 90 kb90 kbRCI*RCI* n.a.n.a.CAD*CAD* 25 kb25 kb

BACs sequenciados individualmenteBACs sequenciados individualmenteBACs sequenciados individualmente

* BACs sequenciados via Sanger* BACs sequenciados via Sanger* BACs sequenciados via Sanger

8,000202,170800EGPOOLAmostra 58,000202,093800RGAAmostra 48,000201,987800F5HAmostra 38,000201,793800CADAmostra 28,000202,259800RCIAmostra 1

Total DNA (µg)

Volume(µl)

A260/A280DNA Conc.(ng/µl)

Nome da amostra

Amostras enviadas para sequenciamento no GS FLXAmostras enviadas para sequenciamento no GS FLXAmostras enviadas para sequenciamento no GS FLX

BAC pool (EgPool)

4cl, ccr, CesA,xet, udp-g transf, sams,f5h, rga,

rci,cad

BAC pool (EgPool)

4cl, ccr, CesA,xet, udp-g transf, sams,f5h, rga,

rci,cad

cadcad rcirci RGARGA f5hf5h

Plate layoutPlate layoutPlate layout

223,435 high quality reads57 Mb high quality bases

256 bp average read length

223,435 high quality reads223,435 high quality reads57 Mb high quality bases57 Mb high quality bases

256 bp average read length256 bp average read length

Um clone de BAC contendo o gene da álcool cinamílico desidrogenase (cad) foi submetido ao seqüenciamento shotgun utilizando a tecnologia 454 e a tradicional tecnologia Sanger (ABI 3100)

Um clone de BAC contendo o gene da álcool cinamílico desidrogenaUm clone de BAC contendo o gene da álcool cinamílico desidrogenase (cad) se (cad) foi submetido ao seqüenciamento shotgun utilizando a tecnologia foi submetido ao seqüenciamento shotgun utilizando a tecnologia 454 e a 454 e a tradicional tecnologia Sanger (ABI 3100)tradicional tecnologia Sanger (ABI 3100)

Montagem do BAC com o gene cadMontagem do BAC com o gene cadMontagem do BAC com o gene cad

18.25918.377Largest contig

~ 10X~ 300XEstimated coverage

486260Avg read size (bp)

184.2125.554.630# bases

37921.830# reads

Sanger454

Cobertura do BAC com o gene CAD utilizando a tecnologia Sanger

Cobertura do BAC com o gene CAD Cobertura do BAC com o gene CAD utilizando a tecnologia Sangerutilizando a tecnologia Sanger

Cobertura do BAC com o gene CAD utilizando a tecnologia 454

Cobertura do BAC com o gene CAD Cobertura do BAC com o gene CAD utilizando a tecnologia 454utilizando a tecnologia 454

O maior contig montado foi para o BAC contendo o gene F5H com 84 Kb seguido por contigs com 20,5; 10,3 e 9,6 Kb

Foram encontrados 13 genes putativos, incluindo 2 retrotransposons

Restam apenas algumas lacunas (“gaps”) para se finalizar o BAC

Melhor finalizar com algumas corridas com o método Sanger

O maior contig montado foi para o BAC contendo o gene F5H com 8O maior contig montado foi para o BAC contendo o gene F5H com 84 4 Kb seguido por contigs com 20,5; 10,3 e 9,6 KbKb seguido por contigs com 20,5; 10,3 e 9,6 Kb

Foram encontrados 13 genes putativos, incluindo 2 retrotransposoForam encontrados 13 genes putativos, incluindo 2 retrotransposonsns

Restam apenas algumas lacunas (“gaps”) para se finalizar o BACRestam apenas algumas lacunas (“gaps”) para se finalizar o BAC

Melhor finalizar com algumas corridas com o método SangerMelhor finalizar com algumas corridas com o método Sanger

Maior montagem de um clone BACMaior montagem de um clone BACMaior montagem de um clone BAC

Disease Resistance gene analog (RGA)Disease Resistance gene analog (RGA)

Análogo de gene de resistênciaAnálogo de gene de resistênciaAnálogo de gene de resistência

Mapeamento de associaçãoMapeamento de associaçãoMapeamento de associaçãoVANTAGENS

Permite o estabelecimento de relações diretas entre a variabilidade de sequência destes genes e a variabilidade fenotípicaSNPs são mais frequentes do que SSR e permitem análises a

distâncias mais curtas Permite a análise direta de bancos de germoplasma e coleções de clones elite sem necessidade de populações segregantes

DESAFIOSDesconhecimento da extensão do desequilíbrio de ligação (espécie

e/ou população específica)Whole genome scan ou genes candidatos??Quantos e quais SNPs genotipar ? Como genotipar ?Definição de quais genes candidatos devem ser analisadosSeleção de populações adequadas para análise

VANTAGENSVANTAGENSPermite o estabelecimento de relações diretas entre a variabiliPermite o estabelecimento de relações diretas entre a variabilidade de dade de sequênciasequência destes genes e a variabilidade destes genes e a variabilidade fenotípicafenotípicaSNPsSNPs são mais são mais frequentesfrequentes do que SSR e permitem análises a do que SSR e permitem análises a

distâncias mais curtas distâncias mais curtas Permite a análise direta de bancos de Permite a análise direta de bancos de germoplasmagermoplasma e coleções de e coleções de clones elite sem necessidade de populações clones elite sem necessidade de populações segregantessegregantes

DESAFIOSDESAFIOSDesconhecimento da extensão do desequilíbrio de ligação Desconhecimento da extensão do desequilíbrio de ligação (espécie (espécie

e/oue/ou população específica)população específica)WholeWhole genomegenome scanscan ou genes candidatos??ou genes candidatos??Quantos e quais Quantos e quais SNPsSNPs genotipargenotipar ? Como ? Como genotipargenotipar ??Definição de quais genes candidatos devem ser analisadosDefinição de quais genes candidatos devem ser analisadosSeleçãoSeleção de populações adequadas para análisede populações adequadas para análise

Equilíbrio de ligaçãoNÃO ASSOCIAÇAO

1 21 2

Desequilíbrio de ligaçãoASSOCIAÇÃO

3 3

3 3

Loco 1

Loco

2D’=0

6

6

Loco 2

Loco

2

| D’|=1

Rafalski, 2001 Current Op. Pl. Biology

DL: Alto Baixo Resolução Baixo Alto Número de marcadores Baixo Alto

Ruim para abordagem de gene candidato Bom para abordagem de gene candidato

Consequências do desequilíbrio de ligaçãoConsequênciasConsequências do desequilíbrio de ligaçãodo desequilíbrio de ligação

Em Eucalyptus com LD ~2 kb seriam necessários 630.000.000/2000 =315.000 marcadores para fazer um whole genome scan (WGS) !!!!!!!!!Em Eucalyptus com LD ~2 kb seriam necessários 630.000.000/2000 =Em Eucalyptus com LD ~2 kb seriam necessários 630.000.000/2000 =315.000 marcadores para fazer um whole genome scan (WGS) !!!!!!315.000 marcadores para fazer um whole genome scan (WGS) !!!!!!!!!!!!

Desafio: seleção de genes candidatosDesafioDesafio: seleção de genes candidatos: seleção de genes candidatos

Conhecimento de função pelo papel bioquímico de enzimasInferência de função com base em similaridades em bancos de dados Existência de mutantes em plantas modelo com fenótipo relacionadoExpressão diferencial do gene entre fenótipos contrastantesAnálise de expressão diferencial em nível de proteína ABORDAGEM GENÉTICA: co-localização do gene com QTLs e QTLs de expressão gênica mapeados

Isenta de premissasBaseada em modelo mendeliano

Parte de caracterização fenotípica

Conhecimento de função pelo papel bioquímico de enzimasConhecimento de função pelo papel bioquímico de enzimasInferência de função com base em similaridades em bancos de dadoInferência de função com base em similaridades em bancos de dados s Existência de mutantes em plantas modelo com fenótipo relacionadExistência de mutantes em plantas modelo com fenótipo relacionadooExpressão diferencial do gene entre fenótipos contrastantesExpressão diferencial do gene entre fenótipos contrastantesAnálise de expressão diferencial em nível de proteína Análise de expressão diferencial em nível de proteína ABORDAGEM GENÉTICA: coABORDAGEM GENÉTICA: co--localização do gene com localização do gene com QTLsQTLs e e QTLs de expressão gênica mapeadosQTLs de expressão gênica mapeados

Isenta de premissasIsenta de premissasBaseada em modelo Baseada em modelo mendelianomendeliano

Parte de caracterização Parte de caracterização fenotípicafenotípica

II - Candidate Gene Selection

Functional annotations

Expression profiles from literature

Sequence similarity searches in spruce ESTs

Unique gene sequences of interest

Transcript profilinga in

spruce tissues

Transgenic Experiments:

Misregulation of Transription

factorsb

Coordinatelyregulated

genes

Putative Regulons

Tissue preferential

profiles

b Putative conifer transcription factors• Analyzed pine and spruce• Xylem preferential sequences

A priori knowledge (hypothesis)Literature & Sequence data

Discovery driven (unbiased)Gene expression analyses

Data Integration

a Custom spruce microarrays• 10,400 amplicons (sequence verified

clones)• Low redundancy < 96% identiy

1990 - 1996 RAPD1990 1990 -- 19961996 RAPDRAPD

1997 – 2002 microsats1997 1997 –– 20022002 microsatsmicrosats

1996- 1997 AFLP19961996-- 1997 1997 AFLPAFLP

2002 – 2007Microsats com detecção

fluorescente

2002 2002 –– 20072007Microsats com detecção Microsats com detecção

fluorescentefluorescente

SNPs, SFPs, DArT, Tecnologias genome-wide

SNPs, SFPs, DArT, SNPs, SFPs, DArT, Tecnologias genomeTecnologias genome--widewide

500

1000

1500

1 2 3 4

Sign

al in

tens

ity

Probe

Adapted from Roald et al. 2005 Genome Res. Courtesy of Derek Drost - UFLAdapted from Roald et al. 2005 Genome Res. Courtesy of Adapted from Roald et al. 2005 Genome Res. Courtesy of DerekDerek Drost Drost -- UFLUFL

Detection of putative SFPs by analyzing probe x genotype interactionDetection of putative SFPs by analyzing Detection of putative SFPs by analyzing probe x genotypeprobe x genotype interactioninteraction

Genotype (tree) 1

Genotype Genotype (tree) 1(tree) 1

Genotype (tree) 2

Genotype Genotype (tree) 2(tree) 2

SFP probeSFP probeSFP probe

Non-significant SFP by LSM and K-means clusteringNonNon--significant SFP by LSM and Ksignificant SFP by LSM and K--means clusteringmeans clustering

PARENTS PARENTSPROGENY PROGENY

Significant SFP by LSM and K-means clusteringSignificant SFP by LSM Significant SFP by LSM and Kand K--means clusteringmeans clustering

Significant SFP by K-means clustering but not by LSM

Significant SFP by KSignificant SFP by K--means means clusteringclustering but not by but not by LSMLSM

PARENTS PARENTSPROGENY PROGENY

Multiple linked SFP in the same gene co-segregateMultiple linked SFP in the same gene coMultiple linked SFP in the same gene co--segregatesegregate

PARENTS PARENTS

PARENTS PARENTSPROGENY

PROGENY PROGENY

PROGENY

High throughput genotyping technologiesHigh throughput genotyping technologiesHigh throughput genotyping technologies

Reduced genomic representations on arrays of locus specific probes

(Ex. Diversity Arrays Technology DArT)

Reduced genomic representations on Reduced genomic representations on arrays of locus specific probes arrays of locus specific probes

(Ex. Diversity Arrays Technology DArT)(Ex. Diversity Arrays Technology DArT)

Extension ligation of locus specific oligos end allele specific oligos on bead arrays

(Ex. GoldenGate)

Extension ligation of locus specific oligos Extension ligation of locus specific oligos end allele specific oligos on bead arraysend allele specific oligos on bead arrays

(Ex. GoldenGate)(Ex. GoldenGate)

Fan et al. 2006 Nature Genetics ReviewsFan et al. 2006 Nature Genetics ReviewsFan et al. 2006 Nature Genetics Reviews

5033 marcadores DArT

58 amostras

E. urophylla

E. grandis

E. nitens

E. globulus

E. camaldulensis

Polimorfismo em E. nitens, E. globulus, E. urophylla, E. grandis, E. camaldulensis - array teste de 14.600 fragmentos

Polimorfismo em E. nitens, E. globulus, E. urophylla, E. grandisPolimorfismo em E. nitens, E. globulus, E. urophylla, E. grandis, E. , E. camaldulensis camaldulensis -- array teste de 14.600 fragmentosarray teste de 14.600 fragmentos

Mineração e seleção de SNPs para desenvolvimento de plataforma de genotipagem de alto desempenho para Eucalyptus

Mineração e seleção de SNPs para desenvolvimento de plataforma dMineração e seleção de SNPs para desenvolvimento de plataforma de e genotipagem de alto desempenho para Eucalyptusgenotipagem de alto desempenho para Eucalyptus

Sequenciamento do genoma de Eucalyptus

grandis : uma análise com microssatélites mostra

manutenção de heterozigosidade no

genoma alvo parcialmente endogâmico

Sequenciamento do Sequenciamento do genoma de genoma de Eucalyptus Eucalyptus

grandisgrandis : uma análise com : uma análise com microssatélites mostra microssatélites mostra

manutenção de manutenção de heterozigosidade no heterozigosidade no

genoma alvo parcialmente genoma alvo parcialmente endogâmicoendogâmico

Marilia R. Pappas. Danielle Faria. Sheila Purim. Georgios Pappas and Dario GrattapagliaEMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia; ABI do Brasil

Marilia R. Pappas. Danielle Faria. Sheila Purim. Georgios Pappas and Dario GrattapagliaEMBRAPAEMBRAPA Recursos Genéticos e Recursos Genéticos e Biotecnologia; Biotecnologia; ABI do BrasilABI do Brasil

Eucalyptus é preferencialmente alógamo (taxa de fec. Cruzada de 90%) com depressão por endocruzamento de ação retardadaA heterozigosidade no genoma é altaA diversidade nucleotídica também é alta da ordem de 1 SNP a cada 50 a 200 pbDificuldades são esperadas para a montagem do genoma completo devido à variação entre haplótipos (i.e. entre os dois cromossomos homólogos)Humanos: artigo recente do genoma de Venter desenvolveu métodos para montar os dois alelos separadamente; idem para o genoma de VitisVitis (uva): foram sequenciados dois genomas um de um clone S7 e outro de um clone comercial altamente heterozigoto

Eucalyptus é preferencialmente alógamo (taxa de fec. Cruzada de Eucalyptus é preferencialmente alógamo (taxa de fec. Cruzada de 90%) com 90%) com depressão por endocruzamento de ação retardadadepressão por endocruzamento de ação retardadaA heterozigosidade no genoma é altaA heterozigosidade no genoma é altaA diversidade nucleotídica também é alta da ordem de 1 SNP a cadA diversidade nucleotídica também é alta da ordem de 1 SNP a cada 50 a 200 pba 50 a 200 pbDificuldades são esperadas para a montagem do genoma completo deDificuldades são esperadas para a montagem do genoma completo devido à variação vido à variação entre haplótipos (i.e. entre os dois cromossomos homólogos)entre haplótipos (i.e. entre os dois cromossomos homólogos)Humanos: artigo recente do genoma de Venter desenvolveu métodos Humanos: artigo recente do genoma de Venter desenvolveu métodos para montar os para montar os dois alelos separadamente; idem para o genoma de Vitisdois alelos separadamente; idem para o genoma de VitisVitis (uva): foram sequenciados dois genomas um de um clone S7 eVitis (uva): foram sequenciados dois genomas um de um clone S7 e outro de um outro de um clone comercial altamente heterozigotoclone comercial altamente heterozigoto

Porque queremos um genoma mais homozigoto ?Porque queremos um genoma mais homozigoto ?Porque queremos um genoma mais homozigoto ?

1968: Sementes de E. grandis Coffs Harbor (Australia) foram adquiridas pela Suzano e plantios comerciais estabelecidos em 1968 em SP1974: sementes foram colhidas de árvores selecionadas de forma massal para volume e forma1975: um teste de progênie de polinização aberta foi estabelecido 1979/1980: melhores árvores dentro e entre progênies foram selecionadas no teste e clonadas por enxertia1982: um pomar de sementes clonal foi estabelecidos com os enxertos1986: autofecundação de todas as árvores do pomar1990: mudas S1 sobreviventes estabelecidas em um pomar de sementes por mudas composto exclusivamente de mudas S1 onde a árvore 7D (BRASUZ1) é uma delas2008: BRASUZ1 tem ~18 anos e tem boa capacidade geral de combinação eresistência a ferrugem

1968:1968: Sementes de Sementes de E. grandisE. grandis Coffs Harbor (Australia) foram adquiridas pela Coffs Harbor (Australia) foram adquiridas pela Suzano e plantios comerciais estabelecidos em 1968 em SPSuzano e plantios comerciais estabelecidos em 1968 em SP1974:1974: sementes foram colhidas de árvores selecionadas de forma massalsementes foram colhidas de árvores selecionadas de forma massal para para volume e formavolume e forma1975:1975: um teste de progênie de polinização aberta foi estabelecido um teste de progênie de polinização aberta foi estabelecido 1979/1980:1979/1980: melhores árvores dentro e entre progênies foram selecionadas nmelhores árvores dentro e entre progênies foram selecionadas no o teste e clonadas por enxertiateste e clonadas por enxertia1982:1982: um pomar de sementes clonal foi estabelecidos com os enxertosum pomar de sementes clonal foi estabelecidos com os enxertos1986:1986: autofecundação de todas as árvores do pomarautofecundação de todas as árvores do pomar1990:1990: mudas S1 sobreviventes estabelecidas em um pomar de sementes pomudas S1 sobreviventes estabelecidas em um pomar de sementes por r mudas composto exclusivamente de mudas S1 onde a árvore 7D (BRASmudas composto exclusivamente de mudas S1 onde a árvore 7D (BRASUZ1) é UZ1) é uma delasuma delas2008:2008: BRASUZ1 tem ~18 anos e tem boa capacidade geral de combinação eBRASUZ1 tem ~18 anos e tem boa capacidade geral de combinação eresistência a ferrugemresistência a ferrugem

História do clone alvo BRASUZ1História do clone alvo BRASUZ1História do clone alvo BRASUZ1

Marcador pai/mãe BRASUZ1Embra02 111/116 111/116Embra03 136/140 136/136Embra05 135/135 135/135Embra10 145/147 145/145Embra11 117/135 117/135Embra12 120/130 130/130Embra27 107/113 107/113Embra28 197/204 197/204Embra324 143/163 143/163Eg62 192/192 192/192Embra42 141/145 141/141Embra53 121/141 121/141Embra115 97/114 97/97Embra120 139/141 139/141Embra121 113/130 113/130Embra157 141/151 141/151Embra186 180/180 180/180Embra646 146/160 146/160Eg91 138/149 138/138

Confirmação da origem autofecundada do BRASUZ1Confirmação da origem autofecundada do BRASUZ1Confirmação da origem autofecundada do BRASUZ1

19 marcadores microssatélites foram genotipados no parental autofecundado e no clone BRASUZ1

16 marcadores estavam em heterozigose no parental e portanto informativos

Dos 16 marcadores informativos se espera 50% entrando em homozigose no S1

Foram observados 6 marcadores em homozigose e os demais 10 ainda em heterozigose

Genótipos são consistentes com a origem de autofecundação do clone BRASUZ1

19 marcadores microssatélites foram 19 marcadores microssatélites foram genotipados no parental autofecundado e no genotipados no parental autofecundado e no clone BRASUZ1clone BRASUZ1

16 marcadores estavam em 16 marcadores estavam em heterozigose no parental e portanto heterozigose no parental e portanto informativosinformativos

Dos 16 marcadores informativos se espera Dos 16 marcadores informativos se espera 50% entrando em homozigose no S150% entrando em homozigose no S1

Foram observados 6 marcadores em Foram observados 6 marcadores em homozigose e os demais 10 ainda em homozigose e os demais 10 ainda em heterozigoseheterozigose

Genótipos são consistentes com a origem Genótipos são consistentes com a origem de autofecundação do clone BRASUZ1de autofecundação do clone BRASUZ1

Pomar de sementes por mudas onde BRASUZ1 está localizado em Itapetininga, SP

Pomar de sementes por mudas onde Pomar de sementes por mudas onde BRASUZ1 está localizado em Itapetininga, SPBRASUZ1 está localizado em Itapetininga, SP

Uma análise do genoma todo via microssatélites permite estimar preliminarmente a proporção do genoma que entrou em homozigoseA premissa é que a heterozigosidade aos microssatélites é um bom surrogado da heterozigosidade de sequência embora a taxa de mutação seja difererenteEsta análise forneceria uma primeira “olhada” sobre o que esperar em termos de desafios da montagem

Uma análise do genoma todo via microssatélites permite estimar Uma análise do genoma todo via microssatélites permite estimar preliminarmente a proporção do genoma que entrou em homozigosepreliminarmente a proporção do genoma que entrou em homozigoseA premissa é que a heterozigosidade aos microssatélites é um bomA premissa é que a heterozigosidade aos microssatélites é um bom surrogado surrogado da heterozigosidade de sequência embora a taxa de mutação seja dda heterozigosidade de sequência embora a taxa de mutação seja difererenteifererenteEsta análise forneceria uma primeira “olhada” sobre o que esperaEsta análise forneceria uma primeira “olhada” sobre o que esperar em termos r em termos de desafios da montagemde desafios da montagem

Quão homozigoto é o BRASUZ1 ?Quão homozigoto é o BRASUZ1 ?Quão homozigoto é o BRASUZ1 ?

♀♂ARVORE PROGÊNIE S1 Aa ¼ AA ½ Aa ¼ aa

♀♂♀♂ARVOREARVORE PROGÊNIE S1 PROGÊNIE S1 AaAa ¼ AA¼ AA ½ Aa½ Aa ¼ aa¼ aa

RESULTADOS: grupo de ligação 1, um bom !!!RESULTADOS: grupo de ligação 1, um bom !!!RESULTADOS: grupo de ligação 1, um bom !!!

Position cM Locus0 embra11 116 134 134 134 116 134 116 134 116 134 116 134 116 134 116 134

7.2 en06 83 93 93 93 83 93 83 93 93 93 83 83 83 93 83 9311.9 embra147 190 19013.2 embra676 267 26717.4 embra006 139 143 143 143 139 143 139 143 143 143 139 139 143 143 139 14335.1 embra2000 240 24040.4 embra180 120 122 122 122 120 122 120 122 122 122 120 122 122 122 120 12046 embra70 158 192 192 192 158 192 158 192 192 192 158 192 192 192 158 158

54.4 embra632 235 239 235 239 235 239 235 239 235 235 235 239 235 235 239 23958.5 embra12 120 131 120 131 120 131 120 131 131 131 120 131 131 131 120 12068.2 embra1639 176 176 176 176 176 176 176 176 176 176 176 176 176 176 176 17675.6 embra705 265 267 265 267 265 267 265 267 267 267 267 267 267 267 265 26575.7 embra219 261 277 261 277 261 277 261 277 277 277 277 277 277 277 261 261n.a. embra56 121 123 123 123 121 123 121 123 121 123 121 123 121 123 121 123n.a. embra83 76 78 76 78 76 76 76 78 76 78 76 78 76 78 76 78n.a. embra100 220 228 220 228 220 228 220 228 220 220 220 228 220 220 228 228

GC BRASUZ1 E F? ? A B♀♂

RESULTS: grupo de ligação 9, um ruim !!! BRASUZ1 é um clone de sua mãe/pai para este cromossomo

RESULTS: grupo de ligação 9, um ruim !!! BRASUZ1 RESULTS: grupo de ligação 9, um ruim !!! BRASUZ1 é um clone de sua mãe/pai para este cromossomoé um clone de sua mãe/pai para este cromossomo

Position cM Locus0 embra357 97 97

2.1 embra2014 128 1287.1 embra1492 - - - - - - - - - - - - - - - -

13.6 embra1928 325 32529.6 embra941 235 237 237 237 235 237 235 237 235 237 235 237 237 237 235 23731.6 embra629 151 153 151 151 151 153 151 153 151 153 153 153 151 153 153 15333.7 es140 168 16835.3 embra1977 95 111 95 95 95 111 95 111 95 111 111 111 95 111 111 11136.9 embra1851 105 117 105 117 105 117 105 117 105 117 117 117 - - 117 11738.6 embra18 120 139 120 139 120 139 120 139 120 139 139 139 120 139 139 13947 embra691 200 200

50.4 embra954 173 181 173 181 173 181 181 181 173 181 173 181 173 181 173 18156.6 embra204 140 144 140 144 140 144 144 144 140 144 140 144 140 144 140 14456.8 embra1578 93 104 93 104 93 104 104 104 93 104 93 104 93 104 93 10458.6 embra210 207 211 207 211 207 211 211 211 207 211 207 211 - - 207 21160.1 embra310 262 282 262 282 262 282 262 262 262 282 262 282 262 282 262 282n.a. embra17 227 242 242 242 227 242 227 242 227 242 227 242 242 242 227 227n.a. embra75 102 123 102 102 102 123 102 123 102 123 102 123 102 102 102 123n.a. embra131 86 102 86 102 86 102 86 102 86 102 102 102 86 102 102 102

? ? A B C BRASUZ1 E F G♀♂

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Linkage Group

RESULTADOS: incremento em homozigose por grupo de ligaçãoVariação significativa por grupo de ligação sugere tolerância variável à homozigose

devido a uma distribuição variável da carga genética

RESULTADOS: incremento em homozigose por grupo de ligaçãoRESULTADOS: incremento em homozigose por grupo de ligaçãoVariação significativa por grupo de ligação sugere tolerância vaVariação significativa por grupo de ligação sugere tolerância variável à homozigose riável à homozigose

devido a uma distribuição variável da carga genéticadevido a uma distribuição variável da carga genética

Genomic resources will be abundant and public

Cost reduction of genomic methods: genotyping and sequencing

Main challenge: availability of appropriate structured material, sufficiently replicated across field sites and precisely phenotyped for traits of interest

Concrete possibilities of Brazil-Australia collaborative research projects from germplasm exchange and conservation to molecular breeding technologies

Perspectives of applied genomics in Eucalyptus are encouraging given the existing variation, the upcoming draft genome and the evolution of better and cheaper genotyping technologies

GenomicGenomic resources will be abundant and publicresources will be abundant and public

Cost reduction of genomic methods: genotyping and sequencingCost reduction of genomic methods: genotyping and sequencing

Main challenge: availability of appropriate structured material,Main challenge: availability of appropriate structured material, sufficiently sufficiently replicated across field sites and precisely phenotyped for traitreplicated across field sites and precisely phenotyped for traits of interests of interest

Concrete possibilities of BrazilConcrete possibilities of Brazil--Australia collaborative research projects Australia collaborative research projects from germplasm exchange and conservation to molecular breeding from germplasm exchange and conservation to molecular breeding technologiestechnologies

Perspectives of applied genomics in Eucalyptus are encouraging gPerspectives of applied genomics in Eucalyptus are encouraging given iven the existing variation, the upcoming draft genome and the evolutthe existing variation, the upcoming draft genome and the evolution of ion of better and cheaper genotyping technologiesbetter and cheaper genotyping technologies

The Eucalyptus genome will be key for applied genomicsThe Eucalyptus genome will be key forThe Eucalyptus genome will be key for applied genomicsapplied genomics

QTL, e-QTL, associação e seqüênciamento ultra-HT: o ... 25_CURSO_CBAB_UFPR_2008.pdfG38 ab x cd...

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