PROTOCOLO Nº 1

CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS

CURSO: Biologia Marinha e Biotecnologia ANO: 3º

PROTOCOLO Clonagem in vitro de couve-flor

ANO LECTIVO: 2007/2008 SEMESTRE: 6º

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1. Introdução

A micropropagação de plantas consiste na regeneração de plantas completas a partir

de pequenos fragmentos de tecido (conhecidos como “explantes”) colocados em meios

nutritivos esterilizados. Os explantes utilizados podem ter origens muito variadas, permitindo

distinguir-se vários tipos dentre os quais se destacam os meristemas apicais. As plantas

produzidas a partir de meristemas apicais são réplicas idênticas (clones) da planta mãe com a

particularidade de serem geneticamente estáveis.

A couve-flor é uma planta pertencente à espécie Brassica oleraceae ou seja a mesma

família que as couves. É uma planta anual, que se reproduz por semente e que é muito

utilizada a nível de ensino de técnicas de cultura in vitro devido à sua disponibilidade, robustez

e rápido crescimento. Após 10 dias em cultura já se pode observar crescimento e as

“plantinhas” ficam completas e prontas a ser transplantadas em cerca de 12 semanas. Estas

técnicas são utilizadas comercialmente na produção de clones de couve-flor destinados a

produção de sementes.

A formulação dos meios de cultura in vitro varia com a espécie de planta que se está a

tentar crescer. Usualmente estes meios contêm:

� Todos os minerais e vitaminas necessários ao crescimento e diferenciação;

� Fontes de carbono ou energia pois muitas vezes a fotossíntese encontra-se

reduzida;

� Reguladores do crescimento que permitem a divisão e diferenciação das células;

� Agar para solidificar o meio.

Neste caso vamos utilizar o meio de Murashige e Skoog (1962) suplementado com

vitaminas, sacarose e kinetina e solidificado com agar.

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2. Protocolo Experimental

2.1. Objectivos

Clonagem de couve-flor utilizando técnicas de cultura in vitro em condições assépticas

utilizando meios de cultura com reguladores do crescimento.

2.2. Material e Reagentes Necessários:

Para cada um dos grupos de trabalho:

Couve-flor (parte branca) fresca

Placas de Petri limpas, pinças e bisturis

100 ml de uma solução a 20% de lixívia com detergente (Domestos por exemplo)

300 ml de água destilada esterilizada

4 copos de vidro esterilizados e tapados com folha de alumínio

Copo com 100 ml de etanol

Frascos de cultura com meio de crescimento MS contendo kinetina

Placas de Petri em vidro esterilizadas

Algodão e etanol para desinfecção da câmara de fluxo laminar

Material não fornecido:

Bata, luvas, marcadores de acetato

2.3. Procedimento:

1. Ligar a luz UV da câmara de fluxo laminar durante 15 minutos.

2. Lavar a couve-flor (parte branca) em água corrente.

3. Utilizando uma placa de Petri como suporte e um bisturi, cortar um fragmento de

couve-flor do tamanho aproximado de uma cereja.

4. Dividir o fragmento em 3 pedaços de tamanho mais ou menos idêntico.

5. Colocar os fragmentos (explantes) no copo com a solução de lixívia e detergente

durante 10 minutos. Este procedimento esteriliza a superfície dos tecidos. A partir deste

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ponto é fundamental trabalhar em condições de esterilidade de modo a evitar

contaminações, ou seja todos os procedimentos serão realizados na câmara de fluxo

laminar.

6. Desligar a luz UV da câmara de fluxo laminar e desinfectar toda a superfície com

etanol a 70%. Desembrulhar a pinça e bisturi esterilizados e colocá-los no copo com

álcool.

7. Lavar os explants através da passagem sucessiva por 3 vezes em água destilada e

esterilizada. Isto tem como objectivo remover a lixívia e detergente utilizados na

desinfecção, se a lixívia não for devidamente removida os explants não crescerão.

Utilizar sempre pinças esterilizadas (mergulhar em álcool, passar à chama, deixar

arrefecer) entre cada mudança de copo.

8. O explant pode ser deixado no último copo com água destilada e esterilizada, desde

que tapado com folha de alumínio esterilizada ou com a tampa de uma placa de Petri

esterilizada.

9. Utilizando como suporte uma placa de Petri, e pinças e bisturis esterilizados, cortar

os tecidos superficiais (cerca de 1mm de espessura) pois provavelmente estarão

danificados.

10. Abrir um dos boiões com meio de cultura e colocar os 3 fragmentos de explant

preparados anteriormente no agar em posições equidistantes.

11. Colocar os frascos em câmara de crescimento com iluminação apropriada.

12. Aproximadamente 10 dias depois observar os frascos: o crescimento já deve ser

visível assim como as possíveis contaminações. Se não ocorrer nenhum crescimento

possivelmente a lixívia não foi devidamente removida da superfície do explante.

13. Observar regularmente as culturas e remover imediatamente quaisquer recipientes

onde ocorram contaminações. Os rebentos estarão formados dentro de 6-8 semanas.

Quando atingirem 1-2 cm podem ser colocados em meio de enraizamento (idêntico ao

utilizado mas sem kinetina). Os rebentos deverão formar raízes em 2-3 semanas, após

o que as plantinhas devem ser lavadas e colocadas em vasos com composto

esterilizado e cobertas com plástico por vários dias para não desidratarem.

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2.5. Meios de Cultura

2.5.1. Meio de crescimento de couve-flor

Formulação para meio M&S (sigma M0404) ………………... 4,4 g

Sacarose…………………………………………………………20 g

Agar ……………………………………………………………...5 g

Solução stock de “kinetin”………………………………..……2,5 ml

Água destilada até 1000 ml

Aquecer até dissolver o agar completamente após o que se pode então dividir o

meio pelos recipientes de cultura.

Autoclavar os recipientes a 121 °C durante 15 minutos.

2.5.2. Solução stock de “kinetin”

Pesar 0,1 g por 100 ml de água destilada. A dissolução em água é auxiliada pela

adição de algumas gotas de uma solução de hidróxido de sódio concentrada. A

solução stock deve ser armazenada a 4ºC.