Produção de pigmentos fúngicos e seu uso no tingimento de ... · Andréa Faria, Gicele de...

Universidade Federal de São João Del-Rei (UFSJ)

Campus Alto Paraopeba (CAP)

Programa de Pós-Graduação em Tecnologias para o

Desenvolvimento Sustentável (PPGTDS)

Produção de pigmentos fúngicos e seu uso no tingimento de tecidos

Aluno: Wesley Santiago da Silva

Orientador: Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas

Ouro Branco – MG,

Agosto de 2013

i

Wesley Santiago da Silva


Dissertação apresentada ao programa de Pós Graduação em Tecnologias para o Desenvolvimento Sustentável da Universidade Federal de São João Del Rei, como requisito para obtenção de título de Mestre. Linha de pesquisa: Processos e Produtos para Redução de Impactos Ambientais Área de Concentração: Microbiologia Aplicada Orientador: Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas

Ouro Branco, 2013

ii

Programa de Pós-Graduação para o Desenvolvimento Sustentável

Dissertação de Mestrado


Autor: Wesley Santiago da Silva Orientador: Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas

Banca examinadora composta pelos membros abaixo:

Orientador: Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas

Universidade Federal de São João Del-Rei

Dra. Silvana de Queiroz Silva

Universidade Federal de Ouro Preto

Dr. Marcel Otávio Cerri

Universidade Federal de São João Del-Rei

Ouro Branco, 27 de Agosto de 2013

iii

Dedico este trabalho aos meus pais e irmãos.

iv

Agradecimentos

Agradeço a Deus pela oportunidade de andar mais uma etapa em meus estudos.

Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Juliano L. Bicas pela dedicação

destinada ao meu desenvolvimento acadêmico, e por todo aprendizado, que levarei não

apenas para a vida profissional, pois certamente me proporcionou um grande crescimento

pessoal, sendo colega de trabalho, professor e amigo.

Agradeço ao Prof. Dr. Marcel Otávio Cerri pelo auxílio na manipulação do

Biorreator, uma das mais importantes etapas deste trabalho.

Agradeço ao Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de

Viçosa, pela caracterização do micro-organismo em estudo, ao Prof. Dr Marcos Tótola que

prontamente recebeu as culturas.

Agradeço ao Prof. Dr. José Carlos de Magalhães, por importantes

conhecimentos partilhados, um deles, a técnica do microcultivo de fungos.

Agradeço aos amigos técnicos de laboratório do Campus Alto Paraopeba,

Andréa Faria, Gicele de Oliveira Andrade, José Luiz Souza, Paula Vieira de Faria e Robinson

Souza Marinho, por toda contribuição.

Agradeço aos bolsistas atividade e iniciação científica pela contribuição.

Agradeço aos professores do Programa de Mestrado em Tecnologias para o

Desenvolvimento Sustentável.

Por fim, agradeço a todos que contribuíram direta ou indiretamente, para a

realização deste trabalho.

v

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Molécula de β-caroteno com o grupamento cromóforo destacado em vermelho (NELSON & COX, 2001). ......................................................................................................... 8

Figura 2 - Estrutura química de corantes com uso na indústria têxtil. a) Corante sintético vermelho congo, b) corante sintético índigo carmim, c) cristal violeta, e) corante natural anil. 8

Figura 3 - Estrutura química de corantes sintéticos com aplicação industrial. a) amaranto, b) Ponceau 4R, c) vermelho 40, d) amarelo crepúsculo; e) amarelo tartrazina, f) azul brilhante. . 9

Figura 4 - Espectro eletromagnético da luz, com variada gama de comprimentos de onda ..... 10

Figura 5 - Estrutura química de corantes naturais produzidos por micro-organismos (BICAS et al., 2013; DUFOSSÉ, 2006). ................................................................................................ 17

Figura 6 - As transformações no processamento têxtil. Cada uma das etapas é descrita em maiores detalhes no texto. ........................................................................................................ 20

Figura 7- Fluxograma resumindo o processo experimental para a produção dos pigmentos e tingimento de materiais. ........................................................................................................... 23

Figura 8 - Método de diluições seriadas para monitoramento do crescimento microbiano (número de viáveis). ................................................................................................................. 27

Figura 9 - Processo experimental para avaliar a cinética de crescimento e produção de pigmentos em Erlenmeyers. ..................................................................................................... 28

Figura 10 - Fungo produtor de biopigmento isolado a partir do meio ambiente. A) fungo crescido em placa com ágar PDA; B) fungo em tubo inclinado contendo meio PDA. ............ 32

Figura 11 - Estruturas do fungo F. oxysporum CCT7620 observadas em microscópio (aumento de 400 vezes) após microcultivo. ............................................................................. 32

Figura 12 - Crescimento e produção de pigmentos em meio arroz sólido granulometria ABNT/ASTM 16 (1180µm). .................................................................................................... 36

Figura 13 - Extração dos pigmentos fúngicos. (a) Etanol comercial 92% e (b) Acetato de etila e agitação por vortex durante 1 min. ........................................................................................ 38

Figura 14 - Varredura no visível do sobrenadante da cultura de F. oxysporum CCT7620 após extração com etanol 92%. ......................................................................................................... 40

Figura 15 - Resultados da alteração na cor do caldo arroz fermentado variando-se o percentual (0, 25, 50, 75 ou 100%) de recomposição de “pasta de arroz” após centrifugação do meio.... 41

Figura 16 - Cinética de crescimento (■) e produção de pigmentos (absorbância do sobrenadante da cultura a 485nm) (▲) por F. oxysporum CCT7620 em Erlenmeyers de 250mL. ...................................................................................................................................... 42

Figura 17 - Fermentação do fungo Fusarium oxysporum CCT7620 em biorreator de bancada do tipo air lift após cerca de 72h de processo. ......................................................................... 43

Figura 18 - Condições operacionais do biorreator air lift durante a o experimento de cinética de crescimento e produção dos pigmentos por F. oxysporum CCT7620 (Figura 13). ............. 44

Figura 19 - Cinética de crescimento microbiano (■) e de produção do pigmento (), em termos de absorbânica a 485nm. As barras de erro correspondem ao desvio padrão das medidas. .................................................................................................................................... 44

Figura 20 - Cinética de crescimento do fungo F. oxysporum CCT7620 em air lift com controle de pH, e temperatura. A figura apresenta como variaram o oxigênio dissolvido (linha contínua negra), a temperatura (linha contínua cinza), o pH (linha tracejada cinza) e a contagem microbiana (■) ao longo do processo. ...................................................................... 47

Figura 21 - Produção de pigmento roxo por fungo Fusarium oxysporum CCT7620 em biorreator de bancada do tipo air lift. ....................................................................................... 48

Figura 22 - Tecidos corados em meio líquido. A) Tecidos de poliéster; B) algodão; C) poliestireno; D) plástico polipropileno. .................................................................................... 49

vi

Figura 23 - Tecidos corados com o fungo crescendo sobre a fibra. A) Poliéster suspenso; B) algodão suspenso; C) algodão em contato com meio de cultivo. ............................................. 50

Tabela 1. Segmento da biotecnologia e suas aplicações: ........................................................... 6

Tabela 2. Alguns exemplos de micro-organismos envolvidos na produção de pigmentos microbianos: ............................................................................................................................. 16

Tabela 3. Crescimento microbiano e produção dos biopigmentos em meios de cultivo distintos, (+) indicando presença e (-) a ausência: ................................................................... 34

Tabela 4. Percepção visual quanto a crescimento e dispersão dos pigmentos em meio a base de arroz quebrado e peneirado em diferentes tamanhos. .......................................................... 35

Tabela 5. Extração dos pigmentos da biomassa com variados solventes: ................................ 38

vii

SUMÁRIO RESUMO ......................................................................................................................... 1

ABSTRACT ..................................................................................................................... 2

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 3

1.1. Objetivo geral .................................................................................................... 4

1.2. Objetivos específicos ......................................................................................... 4

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 4

2.1. Biotecnologia ..................................................................................................... 4

2.2. Corantes e pigmentos ......................................................................................... 7

2.3. Cor ................................................................................................................... 10

2.4. Corantes para tecidos ....................................................................................... 12

2.5. Biocorantes ...................................................................................................... 14

2.6. Processamento têxil e o tingimento de tecidos ................................................ 19

2.7. Biotingimento .................................................................................................. 21

3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 23

3.1. Micro-organismo ............................................................................................. 24

3.1.1. Caracterização morfológica ...................................................................... 24

3.2. Produção de pigmentos em Fermentação no Estado Sólido ............................ 24

3.2.1. Escolha do meio de cultivo ....................................................................... 24

3.2.2. Avaliação da granulometria no meio a base de arroz ............................... 25

3.2.3. Recuperação dos pigmentos ..................................................................... 25

3.3. Produção de pigmentos em cultivo submerso .................................................. 26

3.3.1. Preparo do meio de cultivo ....................................................................... 26

3.3.2. Quantificação dos pigmentos produzidos ................................................. 26

3.3.3. Quantificação do crescimento microbiano ............................................... 27

3.4. Cinética de produção dos pigmentos em Erlenmeyers .................................... 28

3.5. Cinética de produção dos pigmentos em biorreator air lift .............................. 28

3.5.1. Biorreator .................................................................................................. 28

3.5.2. Inóculo ...................................................................................................... 29

3.5.3. Experimento sem controle de temperatura e pH ...................................... 29

3.5.4. Experimento com controle de temperatura e pH ...................................... 29

3.5.5. Extração e quantificação dos pigmentos .................................................. 30

3.6. Tingimento de materiais .................................................................................. 30

3.6.1. Tingimento com o caldo fermentado (vermelho) ..................................... 30

3.6.2. Tingimento de tecidos in situ.................................................................... 31

3.7. Análise estatística dos dados ............................................................................ 31

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 31

4.1. Características do Fungo .................................................................................. 31

4.2. Produção dos pigmentos microbianos em Fermentação no Estado Sólido ..... 33

4.2.1. Separação e recuperação dos pigmentos .................................................. 36

4.3. Produção dos pigmentos microbianos em Fermentação Submersa ................. 39

4.4. Cinética de Produção do Pigmento em Biorreator de Bancada Air Lift .......... 42

4.4.1. Cultivo sem controle do pH e Temperatura e meio a 50g/L .................... 42

4.4.2. Cultivo em air lif controlando pH e temperatura ..................................... 46

4.5. Tingimento de materiais .................................................................................. 48

5. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 51

5.1. Conclusões ....................................................................................................... 51

5.2. Sugestões Para Trabalhos Futuros ................................................................... 51

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 52

1

RESUMO

Os processos biotecnológicos têm sido aplicados desde os tempos mais remotos,

por meio da utilização de organismos vivos, sejam eles micro-organismos ou plantas para a

obtenção de bens e serviços, geralmente surgindo como alternativa menos danosa ao meio

ambiente em comparação aos métodos tradicionais de produção. Neste contexto, a

biotecnologia surge como uma alternativa para suprir a crescente demanda por pigmentos

naturais e ambientalmente corretos. O presente estudo teve como objetivos a seleção de

linhagens de micro-organismos com potencial para produção de biopigmentos, o

desenvolvimento de métodos de recuperação do pigmento da biomassa, estudos relativos a

cinética de crescimento microbiano e produção dos pigmentos, além da aplicação dos mesmos

no tingimento de materiais plásticos e tecidos (algodão, poliéster, polipropileno e

poliestireno). Os biopigmentos fúngicos vermelhos e azuis foram sintetizados por Fusarium

oxysporum CCT7620 em meio de cultivo sólido e líquido a base de arroz, e a extração dos

mesmos foi testada com diferentes solventes: etanol, álcool iso-propílico, acetato de etila,

clorofórmio acidificado, água e acetona. Foi realizado um estudo cinético em shaker com

meio a 50g/L, T a 28ºC e 150rpm até 96 horas de cultivo, e dois estudos em biorreator air lift:

um sem controle do pH ou T e meio a 50 g/L; e outro mantendo o pH entre 6 e 7, meio a

20g/L e T a 28ºC, ambos com aproximadamente, uma semana de cultivo. Experimentos de

cinética em Erlenmeyers e em biorreator air lift revelaram que o crescimento exponencial

deste fungo ocorre até cerca de 48h de cultivo e que a produção dos pigmentos está associada

ao crescimento. Tanto para o experimento em Erlenmeyers quanto nos experimentos em

biorreator, a coloração variou com pH e concentração do meio. Ao controlar o pH, mantendo-

o na faixa entre 6 e 7, observou-se uma coloração roxa com forte associação dos pigmentos a

biomassa, sem sucesso no processo de extração e diminuição na taxa de crescimento

microbiano em comparação com o processo sem controle do pH, onde foi observada

coloração vermelha intensa. Os produtos obtidos revelaram-se adequados para o tingimento

de tecidos e plásticos. Dois métodos foram empregados no tingimento, um aquecendo tecidos

ou plásticos em presença do sobrenadante da cultura e outro, inovador, baseado no

crescimento fúngico e produção do pigmento diretamente no tecido com tingimento em azul

marinho.

Palavras-chave: biopigmentos, Fusarium oxysporum, tecidos, tingimento.

2

ABSTRACT The biotechnological processes have been applied since ancient times, through the

use of living organisms, whether micro-organisms or plants to obtain goods and services,

typically arising as alternative less harmful to the environment compared to traditional

methods of production. In this context, biotechnology is an alternative to supply the growing

demand for natural and environmentally friendly pigments. The present study aimed to the

selection of strains of micro-organisms with the potential to produce biopigments, the

development of methods for recovery of pigment biomass, studies on the kinetics of microbial

growth and production of pigments, in addition to implementing them in dyeing of plastics

and fabrics (cotton, polyester, polypropylene and polystyrene). The fungal biopigment red and

blue were synthesized by Fusarium oxysporum CCT7620 in culture medium liquid and solid

rice-based, and their removal was tested using different solvents: ethanol, isopropyl alcohol,

ethyl acetate, chloroform acidified water and acetone. We performed a kinetic study in a

shaker with half a 50g/L, T at 28°C and 150rpm up to 96 hours of cultivation, and two studies

in bioreactor air lift: one without pH control or T and middle to 50 g/L, and another

maintaining the pH between 6 and 7, the middle 20g/L and T at 28°C, both with

approximately one week of cultivation. Kinetic experiments in flasks and airlift bioreactor

revealed that the exponential growth of this fungus occurs until approximately 48 hours of

cultivation and the production of pigment is associated with growth. So much for the

experiment in flasks as well as in the bioreactor experiments, the staining varied with pH and

the concentration of the medium. By controlling the pH, maintained it in the range between 6

and 7, there was a strong association with purple coloring pigments biomass, with no success

in the extraction process, and a decrease in the rate of microbial growth in comparison with

the case without pH control, which was observed deep red color. The products obtained

proved suitable for the dyeing of fabrics and plastics. Two methods were used to dye a fabric

or plastics, by heating them in the presence of culture supernatant and another, an innovative

one, based on the fungal growth and production of the pigment directly into the fabric dyeing

it of navy blue.

Keywords: biopigments, Fusarium oxysporum, tissues, dyeing.

3

1. INTRODUÇÃO

O principal atributo que salta aos olhos do consumidor é a cor dos objetos, sendo

assim considerado de suma importância para o sucesso comercial dos produtos, é fator

determinante para aceitação de produtos como tecidos e alimentos. Um bom corante deve

possuir estabilidade a luz, à lavagem e à transpiração, além de possuir elevado grau de fixação

para ser usado com eficiência no processo de fabricação (GUARATINI & ZANONI, 2000).

Na antiguidade, os corantes usados eram extraídos obrigatoriamente de fontes

naturais, sejam elas plantas ou animais, contudo a partir da descoberta dos corantes sintéticos

em 1856 pelo químico Willian Perkin, os corantes naturais foram gradativamente sendo

substituídos (GUARATINI & ZANONI, 2000). Dentre os principais problemas associados ao

uso e descarte dos corantes sintéticos, seja na indústria de alimentos ou tecidos, destacam-se

as propriedades toxicológicas, principalmente relacionadas aos corantes com grupamento azo-

aromático, que atua como grupo cromóforo em boa parte dessas moléculas (KUNZ; DE

MORAES & DURÁN, 2002). Além disso, as moléculas de corantes sintéticos são, em sua

maioria, substâncias xenobióticas, ou seja, substâncias estranhas aos seres vivos e, portanto,

os micro-organismos e demais seres vivos podem não dispor de enzimas capazes de

eficientemente degradar tais moléculas. Assim, estes corantes podem apresentar uma taxa de

degradação demasiadamente lenta (baixa biodegradabilidade). Segundo ROSOLEN et al.

(2004), os corantes sintéticos apresentam estrutura aromática complexa, formando compostos

extremamente estáveis e de difícil biodegradação. Além disso, este tipo de substância tem

propriedades recalcitrantes e com tendência a se acumular nos organismos vivos e na cadeia

alimentar (BERTAZZOLI & PELEGRINI, 2002).

Já os corantes naturais apresentam inúmeras vantagens, sendo biodegradáveis e de

baixa toxicidade, possuem maior valor comercial frente aos produtos sintéticos, além de

apresentarem atividades antioxidantes, antibióticas, atuando também na prevenção do cancer

(VOLP; RENHE & STRINGUETA, 2009). Alguns exemplos de pigmentos naturais são

carmim, produzido pelo inseto Dactylopius coccus, a curcumina, obtida a partir da planta

Curcuma longa, e os pigmentos de Monascus, sendo o ultimo, produzido em escala industrial

em países orientais (VOLP; RENHE & STRINGUETA, 2009).Os corantes naturais obtidos

por via biotecnológica apresentam vantagens frente aos corantes naturais de fontes

convencionais (vegetais e animanis), pois não estão sujeitos à sazonalidade, podem ser

4

produzidos ininterruptamente em condições controladas e com rendimentos previsíveis e

otimizáveis.

Com recentes manifestações da sociedade em busca da preservação dos recursos

ambientais e hábitos mais saudáveis, um novo estilo de vida tem surgido. Neste contexto,

produtos naturais adquirem maior valor de mercado em relação aos produtos sintéticos como

relatado por DUFOSSÉ (2006). Diante do exposto, o presente trabalho foi idealizado de forma

a desenvolver processos biotecnológicos para a produção de corantes microbianos em

processos fermentativos tradicionais (“biotecnologia clássica”). Tais produtos representam

potencial interesse para as indústrias de alimentos e tecidos, dado que o primeiro setor

industrial utiliza grande quantidades de corantes sintéticos, alguns deles tóxicos e com pouco

apelo mercadológico; já o segundo setor tem como um dos principais desafios encontrar

substitutos ambientalmente mais amigáveis para os corantes tradicionalmente empregados.

1.1. Objetivo geral

Produzir pigmentos microbianos com potencial aplicação na indústria de tecidos,

de forma a evitar os problemas toxicológicos e ambientais comumente associados aos

corantes sintéticos.

1.2. Objetivos específicos

i. Selecionar, dentre linhagens isoladas do meio ambiente, uma capaz de

produzir pigmentos microbianos;

ii. Produzir os pigmentos microbianos empregando a fermentação no estado

sólido analisando o potencial de determinados substratos;

iii. Produzir os pigmentos microbianos por fermentação submersa em meio

líquido a base de arroz;

iv. Testar diferentes métodos de separação e recuperação dos pigmentos;

v. Efetuar a cinética de produção do pigmento em biorreator de bancada;

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Biotecnologia

A biotecnologia é uma ferramenta que acompanha a humanidade desde seus

primórdios. O termo biotecnologia, este sim mais recente (cunhado no século XX),

5

originalmente descrevia processos de produção de pães, vinhos e derivados lácteos, mas

atualmente evoluiu para incluir outros processos de produção de bens e serviços como as

variadas técnicas de manipulação do DNA (BORÉM, 2005). Mais especificamente, a

chamada “engenharia genética” engloba técnicas de transferência e modificação genética

direta que originaram a “biotecnologia moderna”. A “biotecnologia clássica”, por outro lado,

vale-se de técnicas tradicionais de manipulação dos seres vivos, sem fazer uso da modificação

genética direta, como os já citados processos fermentativos convencionais (SILVEIRA;

BORGES & BUAINAIN, 2005). Dessa forma, a biotecnologia envolve um conjunto de

tecnologias que possibilitam a utilização, alteração e otimização de organismos vivos ou

somente partes deles, suas células, organelas e moléculas gerando produtos, processos e

serviços de interesse econômico visando à saúde humana, saúde animal, agricultura e meio

ambiente (JUDICE & BAÊTA, 2005).

Dentre os pontos positivos da biotecnologia moderna, podemos citar o aumento da

produtividade, a contribuição na redução dos custos de produção, a produção de alimentos de

melhor qualidade e o desenvolvimento de práticas mais favoráveis ao meio ambiente

(SILVEIRA; BORGES & BUAINAIN, 2005). Mais especificamente, os efeitos desejados

com uso da modificação genética de organismos e bens alimentícios incluem a resistência a

herbicidas e pesticidas, as mais variadas pragas, amadurecimento tardio, busca-se a alterar

determinadas propriedades, sendo a cor uma das principais. Apesar dos possíveis efeitos

adversos associados ao consumo destes produtos, tanto para os ecossistemas quanto para a

saúde humana, sua demanda tem aumentado, de modo que atualmente constituem uma parte

significativa das culturas agrícolas em todo o mundo (GARCIA, 2006).

Porém, a biotecnologia ainda remete muitos temores à sociedade, sendo os

principais deles relativos ao desconhecimento de possíveis efeitos adversos nos organismos e

a disseminação descontrolada dos organismos geneticamente modificados, que em contato

com as espécies naturais levariam à perda de variabilidade genética. Outros fatores que

frequentemente entram em discussão são referentes a questões éticas nos processos de

experimentação envolvendo humanos e animais.

Segundo JUDICE & BAÊTA (2005), a biotecnologia é constituída de variados e

importantes segmentos, como a saúde humana, animal e o meio ambiente, a tabela 1, mostra o

segmento da biotecnologia e sua respectiva aplicação.

6

Tabela 1. Segmento da biotecnologia e suas aplicações: Segmento da Biotecnologia Aplicação

Saúde Humana Diagnósticos, medicamentos, vacinas, utilização

de biodiversidade

Saúde animal Veterinária, vacinas, probióticos, nutrição animal,

aquacultura

Agribusiness Genética de plantas, transgênicos, produtos

florestais, ornamentais, medicinais, bioinseticídas,

biofertilizantes; inoculantes

Meio ambiente Biorremediação, tratamento de resíduos, análises

Instrumental complementar Software, internet, bioinformática, e-commerce,

P&D, consultorias

Insumos industriais Química fina, enzimas, alimentos

Em sinergia Biomateriais, biomedicina, nanobiotecnologia

Fornecedores Equipamentos; insumos e matérias primas

Fonte: JUDICE & BAÊTA, 2005.

Em relação ao meio ambiente, a biotecnologia fornece importantes alternativas

para o tratamento de resíduos e recuperação de áreas degradadas com o uso dos mais variados

micro-organismos e plantas, fornecendo assim, importantes alternativas para o

desenvolvimento sustentável, como é o caso dos mais variados processos de biorremediação.

Um exemplo interessante é a remoção de cádmio por Pseudomonas aeruginosa, onde a

remediação microbiológica mostrou elevado potencial para o tratamento in situ ou ex situ de

resíduo industrial (SINHA & MUKHERJEE, 2009).

Além disso, os processos biotecnológicos são mais ambientalmente amigáveis,

quando comparados aos processos químicos tradicionais, dado que na maioria dos casos eles

7

ocorrem em condições mais brandas (menor demanda energética), não utilizam produtos

tóxicos e seus resíduos são facilmente biodegradáveis. Tal fato possui considerável relevância

no contexto atual para a redução dos impactos ambientais e a manutenção do

desenvolvimento sustentável, uma vez que contribui para a redução da geração de produtos

nocivos à saúde e ao meio ambiente.

2.2. Corantes e pigmentos

Corantes e pigmentos são nomes genéricos dado aos aditivos responsáveis por

conferir cor aos materiais. A diferença entre os dois se dá basicamente pelo tamanho da

partícula e o grau de solubilidade no meio em que estão inseridos (SARON & FELISBERTI,

2005). Geralmente os pigmentos possuem maior tamanho em relação aos corantes sendo

insolúveis no polímero; em contrapartida, os corantes apresentam maior solubilidade. Podem

também ser diferenciados de acordo com a forma de cobertura: o pigmento promove

simultaneamente a cobertura, a opacidade, o tingimento e a cor nos materiais; o corante

promove apenas o tingimento, não conferindo a cobertura. De modo que o corante mantém a

propriedade de transparência do objeto tingido; o pigmento por sua vez, confere cor e retira a

transparência (MENDA, 2011). Por conveniência, estes dois termos serão considerados

sinônimos no texto da presente dissertação.

Os corantes possuem elevada capacidade de captar radiação luminosa e permitem

aos polímeros transparentes a manutenção da propriedade de transparência. Em determinados

aspectos, a solubilidade dos corantes pode ser considerada um ponto negativo, fazendo com

que os mesmos migrem para a superfície do material, provocando mudanças na cor dos

produtos. Podem também sublimar e apresentar toxicidade e são mais caros em relação aos

pigmentos. Os pigmentos, por sua vez, não migram, não apresentam sublimação, são

geralmente mais baratos e sua toxicidade é menor ou ausente. Possuem a desvantagem de ser

geralmente abrasivos, de difícil dispersão e quando são incorporados ao polímero fazem com

que o material se torne opaco (SARON E FELISBERTI, 2005).

As moléculas de corantes naturais ou sintéticos, possuem em sua estrutura um

sistema de duplas ligações alternadas (conjugadas), que confere a propriedade de absorção de

determinados comprimentos de onda de radiações eletromagnéticas na região do espectro da

luz visível, promovendo a deslocalização dos elétrons e proporcionando a capacidade da

molécula manifestar a cor. Esse grupamento particular recebe o nome de cromóforo,

conforme destacado no exemplo apresentado para o β-caroteno na Figura 1 (NELSON &

COX, 2001). Alguns exemplos de corantes com importância

são apresentados nas Figuras 2 e

ligações conjugadas (cromóforos) que conferem cor a estes elementos.

Figura 1 Molécula de β-caroteno com o g

a)

c)

Figura 2 - Estrutura química de corantes

corante sintético

Alguns exemplos de corantes com importância na indústria têxtil e de

são apresentados nas Figuras 2 e 3, respectivamente. É interessante observar as duplas

ligações conjugadas (cromóforos) que conferem cor a estes elementos.

caroteno com o grupamento cromóforo destacado em vermelho2001).

b)

d)

ímica de corantes com uso na indústria têxtil. a) Corante sintético sintético índigo carmim, c) cristal violeta, e) corante natural

8

na indústria têxtil e de alimentos

É interessante observar as duplas

vermelho (NELSON & COX,

sintético vermelho congo, b) natural anil.

a)

c)

Figura 3 - Estrutura química de corantes vermelho 40, d) amarelo crepúsculo; e

b)

d)

e)

f)

Estrutura química de corantes sintéticos com aplicação industrial. a) amaranto,

, d) amarelo crepúsculo; e) amarelo tartrazina, f) azul brilhan

9

) amaranto, b) Ponceau 4R, c) ) azul brilhante.

10

2.3. Cor

Segundo PEDROSA (1982) e MELCHIADES & BOSCHI (1999), a cor pode ser

definida como uma sensação ou um aspecto de aparência, de característica subjetiva, em

resposta a um estímulo recebido por células da visão e transmitido ao cérebro. A cor está

diretamente relacionada com a fonte de luz, o objeto a ser observado e com o observador,

considerados os três elementos primordiais para a distinção da cor.

Somente podem ser vistos objetos luminosos ou iluminados por uma fonte de luz,

que é o elemento determinante para a manifestação das cores de qualquer objeto. São

exemplos de fontes de luz: o sol, as lâmpadas incandescentes, lâmpadas fluorescentes e de

sódio. Cada uma delas possui uma composição espectral diferente, o que faz com que um

mesmo objeto possa apresentar diferentes colorações diante de diferentes iluminantes. Assim

sendo, a cor é uma propriedade não imutável dos objetos (PEDROSA, 1982).

A luz, por sua vez, é o nome dado à radiação eletromagnética com comprimentos

de onda na faixa de aproximadamente 400 a 700 nm, o que corresponde ao chamado espectro

visível, de forma que cada intervalo representa a uma cor diferente (MELCHIADES &

BOSCHI, 1999). O espectro de radiações eletromagnéticas da luz é ilustrado na Figura 4, na

qual se pode verificar que a luz visível compreende apenas uma estreita faixa do espectro.

Além disso, o espectro visível situa-se entre as radiações eletromagnéticas altamente

energéticas, como as radiações gama e os raios X, que tem potencial de causar danos as

células vivas, e as radiações de baixa intensidade, como as ondas de radio e TV

(MELCHIADES & BOSCHI, 1999).

Figura 4

Figura 4 - Espectro eletromagnético da luz, com variada gama de comprimentos de onda.

Os estímulos responsáveis pelas sensações cromáticas se dividem em dois grupos

de acordo com a teoria da cor: o princípio da composição aditiva de cores (cor luz) indica que

qualquer cor do espectro visível pode ser obtida mesclando-se ou sobrepondo-se as três cores

primárias, que são o vermelho, o verde e o azul. Tais misturas aditivas são evidenciadas nas

Espectro Eletromagnético da Luz

Radio Microondas Infravermelho Visível Ultravioleta Raio X Raios Gama

11

cores de imagens projetadas em telas, sendo que a sobreposição de luzes vermelhas, verdes e

azuis gera uma luz branca. A cor descrita como pigmento ou substância material é oriunda da

difusão da luz sobre a substância, que ao absorver, refratar e refletir os raios luminosos; sendo

uma substância com capacidade de absorver todas as faixas coloridas da luz, teoricamente

preta, sendo este o princípio da mistura subtrativa das cores, como observado em uma mistura

de tintas vermelha, verde e azul (PEDROSA, 1982).

Portanto, podemos manipular a cor desejada de um objeto ao alterar suas

propriedades de absorção de cores pela adição de determinadas substâncias químicas, as quais

são chamadas de pigmentos e corantes. Desta forma, o que determina a cor de um objeto é sua

capacidade de refletir ou absorver a radiação eletromagnética em um dado comprimento de

onda. Ou seja, um objeto é branco ao refletir todas as cores do espectro enquanto que algo

preto não reflete nenhuma luz incidente (MELCHIADES & BOSCHI, 1999).

Existem equipamentos que permitem a caracterização das cores, chamados

colorímetros e espectrofotômetros, sendo a caracterização das cores mais completa com o

emprego dos espectrofotômetros, por realizarem um número maior de subdivisões quanto a

luz refletida por um objeto em intervalos de comprimento de onda (MELCHIADES &

BOSCHI, 1999).

12

2.4. Corantes para tecidos

Segundo GUARATINI & ZANONI (2000), o processo de tingimento é de vital

importância para o sucesso comercial dos produtos têxteis. Assim, para apresentar

propriedade de tingimento, os corantes para tecidos devem apresentar dois componentes-

chaves: o grupo cromóforo, o responsável pela cor, e o grupo funcional, capaz de se ligar às

fibras do tecido. A literatura descreve grande quantidade de corantes, que podem ser

classificados de acordo com a natureza química ou sua aplicação a um dado tipo de fibra

(SOARES, 1998). As principais categorias são:

- Corantes ácidos: são conhecidos como corantes aniônicos. Boa parte destes

corantes são sais de ácido sulfônico. Os corantes ácidos se associam a fibra por meio de troca

iônica. Quimicamente, os corantes ácidos são classificados em azo, antraquinona,

trimetilmetano, xanteno, nitro e nitroso, quinolina (GUARATINI & ZANONI, 2000).

- Corantes diretos: denominados corantes substantivos, são corantes aniônicos

solúveis em água e sua principal diferença em relação aos corantes ácidos e básicos é a

elevada afinidade por fibras celulósicas. São caracterizados pela presença de mais de um

grupo azo na molécula, são similares aos corantes ácidos, sendo aplicados em fibras

celulósicas, viscose e polinósica. Seu elevado grau de exaustão contribui para uma menor

liberação de rejeitos nas águas (GUARATINI & ZANONI, 2000).

- Corantes ao enxofre: sua característica de maior relevância é presença de

compostos macromoleculares com pontes dissulfeto. São inicialmente insolúveis em água,

mas dissolvem em solução de sulfito de sódio ou hidrossulfito de sódio que podem atuar

como agente redutor (GUARATINI & ZANONI, 2000).

- Corantes a cuba: são corantes insolúveis em água baseados nos índigos,

tioindigóides e antraquinonas, formam compostos leuco-solúveis em meio alcalino (NaOH) e

agente redutor como, por exemplo, o hidrossulfito de sódio. Amplamente utilizados para corar

algodão, são absorvidos pela fibra e subseqüentemente oxidados na presença de ar

(GUARATINI & ZANONI, 2000).

- Corantes azóicos: são sintetizados sobre as fibras, é necessária a adição de um

agente de acoplamento como o naftol e um sal diazônio. O mecanismo de produção sobre a

fibra no momento da reação de tingimento resulta na produção de um corante com elevado

grau de fixação, resistência a luz e umidade. Esses corantes podem ser aplicados em fibras

celulósicas, seda, viscose e poliamida (GUARATINI & ZANONI, 2000).

- Corantes dispersos: suspensões de compostos orgânicos insolúveis em água,

também denominados corantes não-iônicos. O processo de tingimento acorre na presença de

13

agentes dispersivos de cadeia longa. São usados em fibras sintéticas como acetato de celulose,

poliéster, nylon e poliacrilonitrila (GUARATINI & ZANONI, 2000).

- Corantes reativos: são compostos que contém um ou mais grupos reativos

capazes de formarem ligações covalentes com os grupos hidroxilas, nitrogênio, aminas ou

enxofre das fibras celulósicas, fibras de proteínas e poliamidas. Os principais corantes da

classe possuem como grupo cromóforo a antraquinona ou azo (GUARATINI & ZANONI,

2000).

- Corantes pré-metalizados: estes corantes possuem um grupamento hidroxila ou

carbonila na posição orto em relação ao grupo cromóforo azo, o que torna possível a

formação de complexos com íons metálicos. São usados no tingimento de fibras protéicas e

poliamidas. Tais corantes possuem uma considerável desvantagem ecológica devido a

elevadas concentrações de metais nas águas de rejeito (GUARATINI & ZANONI, 2000).

Além dos corantes citados acima, SOARES (1998) considera de grande relevância

para o setor têxtil, os seguintes tipos de corantes:

- Corantes básicos: também conhecidos como corantes catiônicos, eles apresentam

solubilidade em água e estão distribuídos em várias classes químicas como azo, antraquinona,

triarilmetano, triazina, oxima, acridina e quinolina.

- Mordentes: o corante liga-se à fibra têxtil através de um mordente, podendo o

mesmo ser uma substância orgânica ou inorgânica, naturais ou sintéticos. O cromo é o

mordente inorgânico mais utilizado, estando na forma de óxido; já o mordente orgânico mais

utilizado é o ácido tânico. São aplicados a fibras celulósicas, protéicas e poliamida.

De forma geral, os corantes têxteis são os grandes responsáveis pelo aumento da

turbidez das águas onde são lançados de modo que a passagem de luz torna-se comprometida,

afetando negativamente o equilíbrio dos ecossistemas aquáticos por interferir no processo

fotossintético de diversas espécies de plantas e micro-organismos fotossintetizantes. Segundo

GUARATINI & ZANONI (2000), devido a sua natureza colorida, os corantes podem ser

detectados sem dificuldade a olho nu, podendo ser notados em concentrações tão baixas

quanto 1ppm. Além disso, mesmo presentes em pequena quantidade nos efluentes, estes

corantes são capazes de ocasionar grande impacto ambiental devido a propriedades inerentes

como dispersão, baixa biodegradabilidade e toxicidade, sendo que nos processos de

tingimento são lançadas grandes quantidades de agentes dispersivos como hidrossulfito de

sódio e íons metálicos (GUARATINI & ZANONI, 2000).

14

Geralmente, os corantes não são facilmente removíveis através de processos

convencionais de tratamento de efluentes e alguns deles apresentam potencial mutagênico e

carcinogênico. Muitos desses corantes, principalmente os derivados da função azo,

apresentam atividade pró-carcinógena ao serem metabolizados por micro-organismos

intestinais (GUARATINI & ZANONI, 2000).

Como exemplo de métodos de tratamento de efluentes têxteis usados atualmente,

podemos citar: a ozonização, a adsorção por carvão ativado e a degradação microbiológica.

Segundo KUNZ; DE MORAES & DURÁN (2002), as novas tendências no tratamento de

corantes e resíduos têxteis são: a biodegradação, o tratamento com ozônio, a fotocatálise

heterogênea, os processos físicos e os processos combinados.

2.5. Biocorantes

Para o setor têxtil, a cor possui elevada importância na comercialização dos

produtos, de modo que atributos como a solidez, resistência a luz, temperatura, extremos de

pH e dispersão, são indispensáveis para a qualidade do produto GUARATINI & ZANONI

(2000), de modo que um bom biocorante deve exibir as características relatadas

anteriormente. No que se refere a indústria de alimentos, a cor é um dos principais atributos

inerentes aos bens alimentícios, estando diretamente relacionada à aceitação ou rejeição de

um produto por parte da sociedade. Logo, é muito comum a associação da cor ao sabor dos

alimentos, por tal motivo, parece lógica a associação de um aditivo vermelho ao sabor de

morango (ABEROUMAND, 2011).

Segundo CHATTOPADHYAY; CHATTERJEE & SEN (2008) a aplicação dos

corantes, data de 2.600 aC na China. O carmin, um corante natural derivado do inseto

Dactylopius coccus, era usado pelos povos astecas na América Central já no século IV dC.

Considerando o uso tradicional e o apelo mercadológico dos corantes naturais, a demanda por

tais materiais tem aumentado substancialmente nos últimos anos, especialmente após a

segunda metade do século XX, devido a mudanças de atitudes por parte da sociedade e a

associação generalizada que tem sido feita entre os termos “corantes sintéticos”, “tóxicos” e

“contaminantes” (CHATTOPADHYAY; CHATTERJEE & SEN, 2008).

Os corantes naturais podem apresentar diferentes origens: são oriundos de plantas,

a Curcuma longa, que sintetiza a curcumina (corante presente no açafrão-da-terra);

provenientes de animais, como já citado para o inseto Dactylopius coccus; ou também

derivados do metabolismo de diferentes micro-organismos, sendo os últimos chamados

15

“biocorantes”(PINTEA, 2008). Os biocorantes, além do atributo da cor, podem atuar como

conservantes naturais de alimentos, os corantes produzidos por Monascus ruber ao

metabolizar o arroz constituem um bom exemplo, influenciando ainda no “flavour” desses

produtos (VIDYALAKSHMI et al., 2009). O caráter antimicrobiano dos biocorantes é um

atributo desejável também para o setor têxtil, ALIHOSSEINI et al. (2008) descreve o

tingimento de diversos materiais a partir de corante produzido pela bactéria Vibrio sp.

exibindo atividade antimicrobiana contra E.coli e S.aureus.

Assim, os biocorantes são corantes sintetizados biologicamente a partir de micro-

organismos, normalmente como metabólitos secundários (CHAVEZ et al., 2008). Bactérias,

fungos e microalgas são amplamente descritos na literatura como produtores de diversas

moléculas de pigmentos naturais (Tabela 2). Tais substâncias são produzidas pelo micro-

organismo como forma de defesa a ataques de outros organismos ou radiações

eletromagnéticas danosas, proteção contra agentes oxidantes, proteção contra frio e calor

extremos, aquisição de nutrientes como ferro, aquisição de energia por processo fotossintético

estando associados em alguns casos, a funções vitais e reprodutivas dos micro-organismos

(LIU E NIZET, 2009).

16

Tabela 2. Alguns exemplos de micro-organismos envolvidos na produção de pigmentos microbianos: Micro-organismo produtor Pigmento Cor

Streptomyces coelicolor Actinorhodina Azul, vermelho

Monascus sp. Monascorubrina,

Ancaflavina;

Rubropuctatina

Amarelo ao vermelho

Fusarium oxysporum Antraquinonas Vermelho

Fusarium sp. Bicaverina Vemelho

Blakeslea trispora, Dunaliella sp. β-caroteno Amarelo, laranja

Chromobacterium violaceum Violaceína Violeta

Dermocybe sanguinea Antraquinonas Vermelho

Agrobacterium aurantiacum Astaxantina Rosa, vermelho

Xanthophyllomyces dendrorhous Astaxantina Rosa, vermelho

Serratia marcescens Prodigiosina Vermelho

Penicillium oxalicum Arpink RedTM

(antraquinona)

Vermelho

Penicillium sp. Outros Amarelo,

vermelho,

azul e verde.

Cordyceps unilateralis Naftoquinona Vermelho sangue

Mucor circinelloides β-caroteno Laranja, Amarelo

Spirulina Ficocianina Azul

Fonte: BICAS et al., 2013; NAGIA & MOHAMEDY, 2007; RETTORI & DURÁN, 1998; RÄISÄNEN, 2009 &

DUFOSSÉ, 2006.

Bicaverina

Monascina

Figura 5. Estrutura química de corantes naturais produzidos por micro

OO O

O

OO OH

OH

O

HO

OO

O

O

OR

Actinorhodina

Astaxantina

Rubropunctatina

Zeaxantina

Estrutura química de corantes naturais produzidos por micro-organismosDUFOSSÉ, 2006).

O

O O

OO O

O O

OH OH

OHOH

O

OH

OO

O

O

OR

17

organismos (BICAS et al., 2013;

O

O

O

18

Muitos desses micro-organismos produtores de corantes naturais sintetizam

substâncias tóxicas, como micotoxinas, o que pode limitar o uso destes produtos,

principalmente na indústria de alimentos e na indústria têxtil, já que a presença de substâncias

tóxicas pode levar a reações alérgicas quando em contato com a pele humana. Dessa forma, é

interessante que o micro-organismo produza elevadas concentrações de pigmento e o mínimo

ou nenhuma toxina (CARVALHO et al., 2005). Em experimentos realizados com quatro

linhagens do fungo Monascus sp. para a avaliação da produção de pigmentos, uma das

linhagens mostrou-se vantajosa, tanto para obtenção do bioproduto a partir de arroz cozido

quanto para a baixa produção da micotoxina citrinina. No estudo em questão, o crescimento

celular foi quantificado pelo método da determinação do crescimento radial, os pigmentos e a

toxina citrinina foram extraídos com etanol e avaliados por espetrofotometria e HPLC,

concluindo ser o pigmento instável em pHs baixos e temperaturas elevadas (CARVALHO et

al., 2005).

Em contrapartida, alguns organismos produzem pigmentos com atividade

antimicrobiana e antitumoral, como é o caso da violaceína, produzida pela bactéria

Chromobacterium violaceum, da actinorrodina, produzida pela bactéria filamentosa

Streptomyces coelicolor, e da bicaverina, produzida por linhagens do fungo Fusarium,

(RETTORI & DURÁN, 1998; BYSTRYKH et al.,1996; LIMÓN; RODRÍGUES-ORTIZ &

AVALOS, 2010).

O fungo Monascus sp. é talvez o mais antigo exemplo de micro-organismo

produtor de corante alimentício, pois tem sido tradicionalmente usado em países orientais

desde a antiguidade como aditivo alimentar (CARVALHO et al., 2005). Outros pigmentos

microbianos com relevância comercial são: astaxantina oriunda de Haematococcus pluvialis

ou Xanthophyllomyces dendrorhous, Arpink Red obtido do fungo Penicillium oxalicum,

riboflavina obtida de Ashbya gossypii, β-caroteno a partir de Dunaliella salina, D. bardawil

ou Blakeslea trispora, e ficolibiproeínas de Spirulina sp. e Porphyridium sp. (DUFOSSÉ et

al., 2005). Uma série de pigmentos de relevância comercial e respectivos organismos

produtores são listados na Tabela 2.

A produção de pigmentos microbianos azuis é mais rara. No caso do micro-

organismo Streptomyces coleicolor esta cor está associada a uma substância descrita como

actinorrodina (BRYSTRYKH et al., 1996). Este pigmento azul mostrou boas características

para a utilização como aditivo alimentício, não sendo tóxico e apresentando boa estabilidade,

apesar de sua coloração poder variar de vermelho (pH ácido) a azul (pH alcalino) em função

19

do pH do meio em que estão inseridos (ZHANG et al. (2006). Cianobactérias produzem uma

substância de coloração azul fluorescente chamada ficocianina, a qual possui propriedades

antioxidantes e com potencial para utilização na indústria farmacêutica, indústria de

cosméticos e indústria de alimentos (ERIKSEN, 2008; DUFOSSÉ et al., 2005). Em

experimentos para a recuperação do pigmento azul ficocianina, a partir de biomassa fresca de

Spirulina sp. bons resultados foram obtidos, sendo que os pigmentos apresentaram boa

estabilidade a pH’s próximos a neutralidade e temperatura ambiente por longo período de

tempo, contudo, ao elevar a temperatura acima dos 45ºC, a cor desaparece e o perfil de

absorbância a 615nm é drasticamente alterado (SARADA; PILLAI & RAVISHANKAR,

2008). Além disso, uma série de microalgas são descritas como produtoras de carotenóides,

tais como as do gênero Rhodophyta ou Dunaliella, com destaque para o último (DUFOSSÉ et

al., 2005).

NAGIA & MOHAMEDY (2007), obtiveram êxito na produção de biocorantes e

tingimento de tecidos de lã a partir do fungo Fusarium oxysporum, posteriormente

conduzindo estudos para avaliar a influência da concentração de sais, pH e temperatura no

banho de tingimento.

2.6. Processamento têxil e o tingimento de tecidos

O setor têxtil constitui um importante mercado de consumo de produtos químicos

necessários para a fabricação de fibras sintéticas, naturais e produtos auxiliares de relevância

para o beneficiamento (ALCÂNTARA & DALTIN, 1996). Segundo ALCÂNTARA &

DALTIN (1996), as transformações no processamento têxtil ocorrem de modo subsequente,

começando com a obtenção das fibras, naturais ou não, chegando ao processo de fiação,

tecelagem e o beneficiamento têxtil (Figura 6). O processo é descrito adiante em maiores

detalhes segundo ALCÂNTARA & DALTIN (1996):

- Fiação: é o processo de produção dos fios, ocorrendo a partir de fibras naturais

ou não naturais, como o algodão, a seda, a lã e o poliéster. É comum a utilização de fibras

mistas, como algodão e nylon, para se aumentar a elasticidade dos fios.

- Tecelagem: consiste no cruzamento de dois sistemas distintos de fios paralelos,

onde um sistema de fios já paralelizados entra no tear e recebe o nome de fio de urdume. O

processo de paralelização dos fios gera os rolos de urdume. Os fios de urdume sofrem grande

atrito devido a repetidas batidas dos pentes dos teares contra a trama, podendo ocasionar

rompimento dos fios levando a atrasos no processo. Para diminuir a possibilidade de

rompimento, os fios de urdume recebem um tratamento denominado engomagem.

20

Fiação Engomagem Tecelagem

Beneficiamento

primário

Degomagem Malha

Purga Mercerização Tingimento

Secagem Amaciamento Lavagem

Figura 6 - As transformações no processamento têxtil. Cada uma das etapas é descrita em maiores detalhes no

texto.

- Fiação: o processo de fiação consiste na obtenção dos fios a partir da matéria

prima, seja ela de origem natural, como as lãs, o algodão ou a seda, seja ela sintética como o

poliéster ou o nylon.

- Engomagem: é a impregnação e revestimento de fios com substâncias adesivas,

que ao formar um filme em sua superfície, aumentam a resistência mecânica dos fios

diminuindo as tensões e os atritos. A substância comumente usada no processo de

engomagem é a goma sintetizada a partir de amido de milho ou batata.

- Tecelagem: consiste no processo de entrelaçamento dos fios, que ocorre no

teares, para obtenção das malhas ou tecidos.

- Desengomagem: o procedimento tem por objetivo, a remoção da goma de amido

impregnada a fibra têxtil. A degomagem ocorre pela ação de enzimas amilolíticas ou por

oxidação.

- A purga é a fervura do tecido na presença de compostos tensoativos, que

melhoram a penetração do corante aplicado subsequentemente, além de promover a limpeza

dos tecidos.

- A mercerização é o tratamento com hidróxido de sódio para promover brilho,

maior afinidade ao corante aplicado subsequentemente, toque mais macio, maior resistência,

aumenta a capacidade de absorção de água e promove o pré-encolhimento.

- Beneficiamento primário: consiste na aplicação dos três processos anteriores

junto a fibra têxtil (degomagem, purga e a mercerização) e envolve a preparação do tecido

para outros tratamentos químicos.

21

- Tingimento: É a modificação da cor original dos tecidos pela adição de

substâncias que podem ser corantes ou pigmentos. Ocorre em três fases distintas: i)

montagem, que é a transferência do corante em solução para a superfície da fibra; ii) fixação,

que ocorre pela reação do corante com a fibra por insolubilização do corante ou alteração da

fibra por elevação da temperatura; iii) tratamento final, que consiste na lavagem com água

quente na presença de detergentes para a remoção do excesso de corante, geralmente

realizado em água corrente.

- A lavagem acontece em água corrente e temperaturas mais elevadas, e na

presença de detergentes, como descreve GUARATINI & ZANONI (2000), trata-se da etapa

mais problemática do processo têxtil com relação a questões ambientais, uma vez que todo o

corante não fixado, estimado em 15% da produção total, sai nos banhos de lavagem, sendo

lançado diretamente no ambiente.

- As etapas finais são o amaciamento, com a adição de agentes químicos que

causam repulsão entre as fibras e a secagem dos tecidos, e os mesmos estão aptos a

comercialização.

2.7. Biotingimento

Os micro-organismos podem ser explorados como fontes naturais e virtualmente

inextinguíveis de corantes têxteis, sendo capazes de se multiplicar rapidamente a partir de

variadas matérias-primas, além de poderem ser cultivados ininterruptamente (sem efeitos

sazonais) em condições controladas e otimizáveis e sem os impactos ambientais comumente

associados aos processos puramente químicos. Porém, a exploração do potencial de

pigmentos microbianos para o tingimento de tecidos é uma abordagem relativamente recente

e pouco explorada. Dentre os poucos trabalhos encontrados nesta área, todos foram efetuados

há menos de uma década.

Os fungos Trichoderma virens, Curvularia lunata e Alternaria alternata são

exemplos de produtores de pigmentos com boas caracteristicas para tingimento de lã e seda,

podendo ser considerados não tóxicos para a pele humana. O pigmento oriundo do fungo

Trichoderma virens possui ainda atividade antifúngica devido a síntese de substâncias

antimicrobianas. O processo pode ser facilmente adaptado para escalas maiores de forma a

obter o produto de maneira ambientalmente correta, ou com baixo impacto ambiental

negativo (SHARMA et al., 2012).

22

Linhagens da espécie Fusarium oxysporum isoladas previamente de raízes de

plantas cítricas acometidas pela murcha e podridão radicular foram utilizadas por NAGIA &

MOHAMEDY (2007) para o cultivo em meio PDA, exibindo coloração roxa e rósea, e para

produção de antraquinonas em cultivo submerso, onde o pigmento gerado demonstrou

elevado potencial para utilização no biotingimento de tecidos de lã com bom rendimento e

boas propriedades de fixação e solidez da cor. Os pigmentos produzidos foram ainda

analisados por cromatografia após extração e purificação. O banho de tingimento foi

acrescido de cloreto de sódio em diferentes concentrações, sendo que a adição do sal não foi

favorável ao processo, variando-se a temperatura de 30 a 100ºC no intervalo de tempo de 12 a

120 min, os autores observaram que as maiores temperaturas propiciam um melhor

tingimento, a fixação foi testada após limpeza dos tecidos com solução de detergente não

iônico na concentração de 3g/L a temperatura de 50ºC por 30 min, mantendo-se a solidez da

cor (NAGIA & MOHAMEDY, 2007).

RÄISÄNEN (2009), em estudos com o fungo ectomicorrízico Dermocybe

sanguinea, obteve êxito na produção de pigmentos naturais da classe das antraquinonas

(emodina e dermocibina) com tons brilhantes e boas propriedades de estabilidade da cor, e

aplicando-os como licor de tingimento têxtil de lã, poliester e poliamida.

ALIHOSSEINI et al. (2008), investigando a produção de pigmentos naturais por

processos fermentativos com micro-organismo identificado como Vibrio sp. isolado

previamente de sedimentos marinhos, testou a aplicação dos pigmentos microbianos no

tingimento de diversas fibras têxteis, obtendo sucesso no tingimento de tecidos de lã, seda,

nylon e acrílico, concluindo ser a molécula responsável pela coloração vermelha, a

prodigiosina. Foi constatada ainda, atividade antimicrobiana desta molécula.

O tingimento de algodão a partir de biopigmentos oriundos de cinco fungos

diferentes (Monascus purpureus, Isaria farinosa, Emericella nidulans, Fusarium

verticillioides e Penicillium purpurogenum) em temperatura de 80ºC por 90 minutos, foi

avaliado bem como a utilização de mordentes por dois diferentes métodos de fixação,

mostrando boa eficiência e comprovando o potencial dos biopigmentos para suprir a demanda

do mercado têxtil (Velmurugan et al., 2010).

DE SANTIS et al., (2005), em experimentos com Monascus purpureus C322,

produziu pigmentos vermelho e laranja e realizando testes de tingimento em amostras de lã,

obteve sucesso tanto na aplicação dos pigmentos nas fibras, quanto para a aplicação dos

23

mordentes alúmen e cloreto estânico. O pigmento laranja mostrou-se mais estável em relação

aos testes de solidez e fixação dos pigmentos.

3. MATERIAL E MÉTODOS

O fluxograma a seguir (Figura 7) mostra de forma esquemática a sequencia de

procedimentos experimentais adotados no presente estudo.

Figura 7. Fluxograma resumindo o processo experimental para a produção dos pigmentos e tingimento de materiais.

Suspensão de solo

Seleção Isolamento

Slants de PDA

Fermentação em estado sólido com arroz moído em

moinho de bolas.

Testes com diferentes granulometrias de arroz.

Cinética em Erlenmeyers

Fermentação submersa com meio

líquido a base de arroz

Cinética em Air Lift

Tingimento de materiais

Testes de extração com solventes

24

3.1. Micro-organismo

O micro-organismo utilizado foi isolado a partir de suspensão de solo em água

estéril coletado nas proximidades do Campus Alto Paraopeba – CAP/UFSJ no município de

Ouro Branco-MG. Em béquer estéril foram adicionados aproximadamente 5g de solo e 50 mL

de água estéril. Este material passou por sucessivas diluições seriadas, transferindo-se 1 mL

da solução inicial para um tubo de ensaio previamente esterilizado contendo 9 mL de água

peptonada. Cem microlitros da diluição 10-3 foram transferidos para a superfície de uma placa

de Petri contendo meio PDA (ágar dextrose de batata), seguido de espalhamento com alça de

Drigalsky (spread plate). As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 28°C por uma

semana. Dentre as colônias que cresceram, culturas de fungos pigmentadas de vermelho

foram isoladas por meio do método de esgotamento por estrias em meio nutritivo PDA. As

culturas escolhidas com base na coloração das colônias foram inoculadas em tubo com ágar

PDA inclinado, sendo mantidas à temperatura de 4°C e repicadas periodicamente para o

mesmo meio nutritivo. Algumas réplicas foram estocadas em tubo inclinado contendo glicerol

estéril a -18°C e outras foram liofilizadas.

3.1.1. Caracterização morfológica

O micro-organismo previamente isolado foi enviado para identificação junto ao

Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa – UFV, que gentilmente

realizou a caracterização morfológica do mesmo, concluindo ser o fungo fusiforme Fusarium

oxysporum. Esta linhagem foi depositada na Coleção de Culturas Tropicais da Fundação

André Tozello (Campinas – SP) sob o número Fusarium oxysporum CCT7620.

3.2. Produção de pigmentos em Fermentação no Estado Sólido

3.2.1. Escolha do meio de cultivo

Em testes preliminares, alguns meios de cultivo sólidos foram testados para

avaliar o crescimento e a produção de pigmento pelo fungo F. oxysporum CCT7620, entre

eles o meio PDA, ágar Sabouraud (peptona 10g/L, extrato de levedura 5g/L, glicose 20g/L,

ágar 15g/L, pH 6,5), ágar amido (1% amido solúvel; 0,2% extrato de levedura; 0,5% peptona;

0,1% NaCl; 0,02% CaCl2 e 1,7% agar), além de meios a base de farinha de mandioca e arroz,

como será detalhado adiante.

25

Como inóculo utilizou-se uma suspensão de esporos preparada pela adição de 20

mL em de água estéril em tubo com meio PDA inclinado contendo micro-organismo

esporulado (crescimento por sete dias a 28°C) com subseqüente raspagem da cultura com

auxílio de uma alça de platina devidamente flambada. Esta suspensão continha, em média, 8,0

x 107 esporos/mL. Nos três primeiros meios mencionados, placas de Petri estéreis contendo os

meios PDA, ágar sabouraud e ágar amido foram inoculadas 0,1 mL da suspensão de esporos e

espalhados, seguindo o método spread plate. Nos dois últimos casos, os meios a base de

farinha de mandioca e arroz foram preparados em placa de Petri adicionando-se 15g de uma

mistura arroz e água ou farinha de mandioca e água na proporção de uma parte de material

sólido para cada parte de água. Após autoclavagem (121°C/15min), o que proporcionou o

cozimento do material amiláceo, 1 mL da suspensão de esporos foi adicionada o mais

homogeneamente possível sobre a superfície do meio. Todas as placas foram incubadas por

uma semana em estufa bacteriológica a 28°C.

3.2.2. Avaliação da granulometria no meio a base de arroz

Aproximadamente 1 Kg de arroz foi moído com auxílio de moinho de bolas

durante 10 minutos. O farelo obtido foi peneirado em agitador de peneiras com os seguintes

tamanhos de poros: ABNT/ASTM 16 (Mach 14, 1,18mm), ABNT/ASTM 30 (Match 28,

600µm), ABNT/ASTM 40 (Match 35, 425µm) e ABNT/ASTM 50 (Match 48, 300µm). As

frações retidas em cada uma das peneiras, assim como o pó (F) obtido na bandeja final, foram

usadas para preparo de meio de cultivo e crescimento microbiano, em triplicata, da mesma

forma como descrito acima (item 3.3.1). De forma resumida, cada uma das frações retidas em

cada peneira, bem como o produto da bandeja final (“fundo de peneira”), foi adicionada (15g)

em placas de Petri, sendo umidificadas (15g de água) e esterilizadas em autoclave antes da

inoculação.

3.2.3. Recuperação dos pigmentos

Após crescimento e pigmentação dos meios de cultivo, os mesmos foram

esterilizados em autoclave a 121°C por 15 minutos e, posteriormente, os meios sólidos

fermentados e já pigmentados foram secos em estufa a 50°C por 48 horas. O material sólido

estéril foi pulverizado em almofariz e tratado com variados solventes como tentativa de

extração e purificação. Os solventes acetato de etila, acetona, etanol, álcool isopropílico,

clorofórmio/HCl e água foram testados. Cerca de 2g do material seco foi disposto em seis

26

tubos de ensaio, cada qual contendo um dos solventes (4 mL) mencionados. Após mistura por

60s em vórtex, a possível extração dos pigmentos foi avaliada visualmente e, quando fosse o

caso, em espectrofotômetro (varredura no visível).

Para avaliar a possível extração de pigmentos associados à biomassa, foram

realizados testes para rompimento da parede celular do fungo. As técnicas consideradas nesta

etapa foram: i) o material sólido foi triturado em moinho de bolas durante 10 min; ii)

aplicação de Tween 20 (polissorbato) (1%, v/v).

3.3. Produção de pigmentos em cultivo submerso

3.3.1. Preparo do meio de cultivo

Considerando que os melhores resultados da Fermentação no Estado Sólido foram

obtidos com meio a base de arroz, em comparação com os demais meios testados, o meio de

cultivo utilizado nesta etapa também empregou este material e foi denominado “caldo arroz”.

Este meio foi preparado adicionando-se 50g de arroz comercial (arroz polido tipo 1, adquirido

em mercado local) em 1L de água destilada com posterior cozimento durante 10 min em

forno de micro-ondas operando na potência máxima. O material cozido foi então

homogeneizado em homogeneizador tipo Turrax operando a aproximadamente 35.000 rpm

por 5 min.

Para os testes com variação no conteúdo de arroz na formulação do meio, o caldo

arroz foi centrifugado (10.000 rpm/10min) e o sobrenadante foi recomposto com 0, 25, 50, 75

ou 100% da “pasta de arroz” (material sólido obtido durante a centrifugação).

3.3.2. Quantificação dos pigmentos produzidos

O produto (pigmento de coloração avermelhada) foi quantificado

espectrofotometricamente (espectrofotômetro de varredura Biochrom Libra S60), em termos

da absorbância a 485 nm (pico de máxima absorbância) do sobrenadante da cultura, obtido

após centrifugação (10.000 rpm/10min). Foram considerados apenas valores de absorbância

entre 0,1 e 1,0, o que garantiu linearidade entre os valores de absorbância e a concentração de

pigmentos (lei de Beer-Lambert). Amostras mais concentradas foram diluídas até atingir a

faixa de leitura.

3.3.3. Quantificação do crescimento microbiano

O crescimento

ilustrado na Figura 8. Este método foi escolhido

apresentaria interferência do material insolúvel (amido) presente no “caldo arroz”. Dessa

forma, 100µL de diluições seriadas (razão 10) das amostras foram plaq

com posterior incubação a 28°C.

delimitados, originados a partir de um único esporo ou micélio fúngico após espalhamento de

100 µL da diluição seriada em placa de meio PDA.

48h), estas foram quantificadas, sendo consideradas apenas as placas contendo entre 30 e 300

UFC (Figura 8).

Figura 8 - Método de diluições seriadas

10-1 10

1mLL

1mLL

Quantificação do crescimento microbiano

O crescimento fúngico foi efetuado pelo método de diluição seriad

. Este método foi escolhido pois a determinação da massa seca (g/L)


ções seriadas (razão 10) das amostras foram plaq

com posterior incubação a 28°C. Foram consideradas colônias, contornos arredondados e bem


ção seriada em placa de meio PDA. Após crescimento das colônias (cerca de


diluições seriadas para monitoramento do crescimento microbiano (número de viáveis)

10-2 10-3 10-4 10-5

1mLL

1mLL

1mLL

0,1mL

27

pelo método de diluição seriada, como

pois a determinação da massa seca (g/L)


ções seriadas (razão 10) das amostras foram plaqueados em meio PDA

Foram consideradas colônias, contornos arredondados e bem


rescimento das colônias (cerca de


para monitoramento do crescimento microbiano (número de viáveis).

28

3.4. Cinética de produção dos pigmentos em Erlenmeyers

Mantendo-se a mistura de arroz moído em Turrax constantemente homogeneizada

com auxílio de agitador magnético, 30 mL de meio “caldo arroz” foi distribuído em 20

Erlenmeyers de 125mL, posteriormente os frascos foram esterilizados em autoclave (121°C

por 15 min). Os frascos foram inoculados em condições assépticas pela adição de 1 mL da

suspensão de esporos (vide item 3.2.1) e incubados em a 28°C e 150 rpm. Amostras foram

retiradas em 24, 48, 72, 96 e 120 h de fermentação para monitorar o crescimento microbiano

(vide item 3.3.3) e a formação do produto (item 3.3.2). Este procedimento encontra-se

resumido na Figura 9.

O caldo fermentado preparado conforme este procedimento (72h de processo) foi

utilizado nos ensaios para tingimento de tecidos e plásticos (item 3.6.1)

50g 1000mL H2O

Turrax e

Esterilização10mL H2O

30 ml

1ml

24h, 48h, 72h, 96h

150rpm, 28°C10.000rpm

5min

Absorbância 485 nm

UFC/ml

Figura 9 - Processo experimental para avaliar a cinética de crescimento e produção de pigmentos em

Erlenmeyers.

3.5. Cinética de produção dos pigmentos em biorreator air lift

3.5.1. Biorreator

Neste experimento foi utilizado o Biorreator Pneumático (agitação por bolhas) air

lift Tecnal TEC-BIO com 5L de volume operacional, com entrada para sensores de

temperatura, pH, O2 e entradas para dosagem, amostragem e condensador de refluxo;

29

termostatização através de jaqueta de água com auxílio de Banho Termostatizado Tecnal

TEC-BIO, bomba peristáltica Tecnal TEC-BIO para injeção de ácido, base, nutrientes.

3.5.2. Inóculo

A partir de uma cultura do fungo Fusarium oxysporum CCT7620 crescida durante

uma semana a 28°C em tubo com meio PDA inclinado, foi feita uma suspensão de esporos,

conforme mencionado acima (item 3.2.1). Em um Erlenmeyer de 125mL contendo 30mL de

“caldo arroz” foram inoculados 100µL da suspensão de esporos e subsequentemente este

frasco foi incubado a 28°C e 150 rpm por 48 horas. Este “caldo arroz” fermentado nas

condições descritas foi utilizado como inóculo nos ensaios em biorreator air lift.

Para efeito de padronização, este inóculo foi quantificado em triplicata por meio

do plaqueamento de 100µL de diluições seriadas (razão 10) do mesmo. Após crescimento em

estufa bacteriológica (48h/28°C) as culturas foram quantificadas, sendo consideradas apenas

as placas contendo entre 30 e 300 colônias.

3.5.3. Experimento sem controle de temperatura e pH

Neste primeiro ensaio a fermentação foi conduzida com monitoração constante do

pH, temperatura, oxigênio dissolvido, contagem de células (item 3.3.3) e quantidade de

pigmentos (item 3.5.5). Contudo a temperatura e o pH não foram controlados durante o

processo. Assim, o biorreator operou a temperatura ambiente, com aeração de 1 vvm (5

L/min) e um volume total de 5L, sendo 4,5L de “caldo arroz” (na concentração de 250g de

arroz em 4,5L, mantendo uma concentração final de 50g/L, preparado conforme descrito em

3.3.1) e 500mL de inóculo (vide item 3.5.2). Periodicamente foram retiradas amostras para

monitorar o crescimento microbiano e a formação do produto.

3.5.4. Experimento com controle de temperatura e pH

Foi realizado um segundo estudo cinético em air lift, porém em condições

modificadas para avaliar qual seria o comportamento do fungo quanto ao crescimento celular

e produção de pigmento. Neste caso, o meio de cultivo “caldo arroz” foi preparado conforme

mencionado no item 3.3.1, porém empregando-se uma concentração menor (20g de arroz para

1L de água). O inóculo foi preparado conforme mencionado anteriormente (3.5.2), mas com o

“caldo arroz” na concentração de 20g de arroz por L de água. O tamanho do inóculo também

sofreu redução: foram utilizados 60 mL.

30

Com relação às condições operacionais, empregou-se temperatura (mantida a

28°C) e pH (mantido a 6,5±0,5, controlado automaticamente com adição de NaOH 1M ou

H2SO4 1M) controlados e uma aeração inicial de 1,5 vvm (7,5L/min), que decaiu ao longo do

processo (aeração final de 0,5 vvm) devido ao aumento na perda de carga do sistema. Os

valores de pH, temperatura e oxigênio dissolvido foram monitorados e registrados a cada 10

minutos. Já o crescimento microbiano foi avaliado pela retirada periódica de amostras, que

foram utilizadas para a determinação da contagem microbiana (item 3.3.3).

3.5.5. Extração e quantificação dos pigmentos

A produção de pigmentos foi determinada pela quantificação em termos da

absorbância a 485 nm (pico de máxima absorbância) de um extrato orgânico. Tal extrato foi

preparado misturando-se, em um tubo de ensaio, 5 mL de caldo fermentado e 5 mL de

acetado de etila. Após agitação por 1min em vórtex, a mistura foi mantida em repouso para

separação das fases ou, alternativamente, efetuou-se a centrifugação (10.000rpm por 5 min)

da mesma. Observou-se que a última proposta resultava em dados mais padronizados. A

fração orgânica (superior) foi utilizada para as análises espectrofotométricas. Foram

considerados apenas valores de absorbância entre 0,1 e 1,0, o que garantiu linearidade entre os

valores de absorbância e a concentração de pigmentos (lei de Beer-Lambert). Amostras mais

concentradas foram diluídas até atingir a faixa de leitura.

3.6. Tingimento de materiais

3.6.1. Tingimento com o caldo fermentado (vermelho)

Foram realizados testes preliminares relacionados ao tingimento de materiais

plásticos e tecidos, sendo utilizados fragmentos de tecidos de algodão, poliéster, poliestireno e

plástico polipropileno. Pequenas frações dos materiais de aproximadamente 5 x 5 cm foram

aquecidos a cerca de 80°C por 5min no caldo fermentado. Para avaliar a estabilidade da cor, o

material tingido foi fervido em água durante 5 e 10 minutos e posteriormente lavados com

solução de detergente (lava-roupas comercial) durante 30 minutos com agitação constante em

shaker rotatório (100rpm). Os resultados foram avaliados de forma subjetiva com relação à

perda de cor. Metodologia semelhante foi empregada por NAGIA & MOHAMEDY (2007)

para o tingimento de lã.

31

3.6.2. Tingimento de tecidos in situ

Este trabalho também considerou o tingimento de tecidos pelo crescimento

fúngico e produção do pigmento in situ. Neste caso, o material a ser tingido (fragmento com

cerca de 5 x 5 cm de tecido de algodão ou poliéster) foi embebido em uma massa amilácea

(“pasta de arroz” descrita no item 3.3.1), que atuou como substrato para o desenvolvimento

microbiano. Após autoclavagem (121°C/15min), o tecido recebeu o inóculo por meio da

atomização de uma suspensão de esporos (vide item 3.2.1) do fungo F. oxysporum CCT 7620.

Este material foi levado à estufa bacteriológica a 28°C até crescimento fúngico. Após cerca de

72h de crescimento, o tecido tingido foi autoclavado (121°C/15min) e lavado para remoção da

biomassa e do amido aderidos à trama.

3.7. Análise estatística dos dados

Os dados apresentados neste estudo foram tratados no programa Excell, por meio

do qual se efetuou o cálculo das médias e do desvio padrão além de ter sido utilizado como

ferramenta para construção de todos os gráficos.

Para a cinética em Erlenmeyers, foram utilizados três cultivos independentes e,

em cada tempo de amostragem, foram retirados 1.000 µL de cada um dos frascos para a

contagem microbiana (item 3.3.3), que foi efetuada em duas replicatas independentes para

cada amostra. Dessa forma, os dados relativos à média e desvio padrão referem-se às

variações entre diferentes experimentos (em princípio idênticos) e os desvios ocorridos são

referentes aos erros analíticos e inerentes aos processos.

Já no experimento em airlift, apenas um cultivo foi efetuado em cada caso, mas

para cada um dos tempos de amostragem foi efetuada a coleta de três amostras, que seguiram

para as análises de absorbância (uma replicata por amostra) e contagem microbiana (duas

contagens independentes por diluição da amostra). Neste caso, os dados relativos à média e

desvio padrão referem-se às variações entre amostras de um mesmo processo e os desvios

ocorridos são referentes aos erros das análises.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Características do Fungo

Com base no isolamento dos micro-organismos, surgiram inúmeras colônias nas

placas de Petri, sendo que uma delas, isolada a partir de amostras de solo, chamou a atenção

devido a coloração vermelha intensa em meio PDA. O fungo utilizado neste estudo foi

32

depositada na na Coleção de Culturas Tropicais da Fundação André Tozello (Campinas – SP)

sob o número Fusarium oxysporum CCT7620. Conforme apresentado na Figura 10, colônias

deste fungo mostraram-se vermelhas com aspecto aveludado que em meio PDA.

Figura 10 - Fungo produtor de biopigmento isolado a partir do meio ambiente. A) fungo crescido em placa com ágar PDA; B) fungo em tubo inclinado contendo meio PDA.

As características morfológicas são típicas de fungos do gênero Fusarium, com

hifas septadas e esporos ovalados e falciformes quando observados em microscópio (Figura

11). Estas características levaram os especialistas do Departamento de Microbiologia da

Universidade Federal de Viçosa – UFV a concluir que este fungo é da espécie Fusarium

oxysporum.

Figura 11 - Estruturas do fungo F. oxysporum CCT7620 observadas em microscópio (aumento de 400 vezes)

após microcultivo.

POLETTO et al. (2006) relata que o gênero Fusarium é amplamente distribuído

nos mais variados ambientes, sendo classificado no reino Eumycota, divisão Ascomycota,

A B

33

classe Euascomycetes, ordem Hipocreales, família Hypocreaceae, inclui-se as espécies que

são capazes de formar macroconídios hialinos, septados, que se destacam pela presença de

células basais e apicais distintas, de considerável relevância na taxonomia das espécies. Os

mesmos autores observaram ainda que a formação de macroconídios e microconídios, além

de clamidósporos, é abundante em estirpe de Fusarium oxysporum crescido em meio ágar

dextrose de batata (PDA).

O fungo Fusarium oxysporum, como relata EDEL et al. (1997), trata-se de um

importante integrante da microflora que compõe o solo em todo o mundo. Algumas cepas são

descritas como fitopatogênicas, estando elas relacionadas com a murcha foliar nas mais

variadas espécies de plantas. Os solos também podem abrigar populações de Fusarium

oxysporum que não são patogênicos. Ambas as cepas, patogênicas e não patogênicas podem

coesistir em uma forma de crescimento saprofítica a base de matéria orgânica do solo (EDEL

et al., 1997).

EDEL et al. (1997), em experimentos incluindo sessenta isolados de Fusarium

oxysporum, três espécies de plantas foram inoculadas com o referido fungo, mas nenhum

sintoma de murcha foi observado em qualquer planta cultivada. Assim sendo, todos os

isolados incluídos no estudo foram considerados não fitopatogênicos.

Determinados fungos do gênero Fusarium são reconhecidamente produtores de

colônias com pigmentação avermelhada. Em alguns casos, coloração mais intensa, tendendo

ao violeta, também pode ser evidenciada. POLETTO et al. (2006), por exemplo, observaram

que colônias de Fusarium oxysporum apresentaram-se com coloração violeta no centro e

esbranquiçadas nas bordas em meio PDA. As moléculas responsáveis por tal coloração são

descritas como sendo da classe das antraquinonas (NAGIA & MOHAMEDY, 2007) ou mais

especificamente um composto chamado bicaverina (RETTORI & DURÁN, 1998). Já no caso

dos pigmentos vermelhos associados a culturas de Monascus, as moléculas

monascorubramina e monascopunctatina se destacam como principais responsáveis

(CARVALHO et al., 2005; DUFOSSÉ, 2006).

4.2. Produção dos pigmentos microbianos em Fermentação no Estado Sólido

Os meios a base de arroz mostraram-se efetivos tanto para o crescimento

microbiano quanto para a produção dos pigmentos, cuja coloração variou do vermelho ao

roxo. O meio de cultivo a base de arroz, também empregado por VIDYALAKSHMI et al.

34

(2009) para produção dos biopigmentos a partir de Monascus ruber, pode ser sintetizado a

partir de um arroz de refugo, denominado arroz quebrado, esse material, geralmente usado

como suplemento para ração animal, possui baixo valor comercial, o que evitaria a

competição com a indústria de alimentos.

Os meios ágar-amido e PDA também resultaram em crescimento e produção de

coloração avermelhada, o que também foi evidenciado por POLETTO et al., (2006) . O meio

o ágar Sabouraud resultou em crescimento satisfatório, mas não propiciou produção de

pigmentos. Algo semelhante ocorreu com o meio a base de mandioca, que possibilitou

crescimento sem produção do pigmento. Isso ocorreu possivelmente pela granulometria fina

da farinha de mandioca, causando uma consistência pastosa no meio e pouca aeração. Em

relação ao meio agar sabouraud, a falta de produção dos pigmentos pode estar associada a

ausência de algum nutriente específico presente tanto no meio a base de arroz quanto no meio

PDA, necessitando-se de estudos subseqüentes para elucidação. A tabela 3 trás a produção de

pigmentos e crescimento microbiano em meios de cultivo distintos.

Tabela 3. Crescimento microbiano e produção dos biopigmentos em meios de cultivo distintos, (+) indicando presença e (-) a ausência:

Meio de cultivo Crescimento Produção de pigmento

Ágar sabouraud + -

Mandioca + -

Ágar amido + +

Arroz + +

PDA + +

Tal observação levantou algumas dúvidas com relação à influência do tamanho

das partículas do meio no crescimento e produção dos pigmentos. Na verdade, sabe-se que a

granulometria é fator determinante em uma Fermentação no Estado Sólido, pois grãos muito

finos se compactam em demasia, evitando uma eficiente aeração do meio. Já grânulos muito

grandes apresentam baixa superfície de contado, minimizando a disponibilidade de nutrientes

para o crescimento microbiano. Portanto, realizou-se um experimento com substratos

apresentando diferentes tamanhos de partículas.

No meio a base de arroz, a influência da granulometria do arroz moído no

crescimento e produção do corante foi avaliada visualmente. De forma geral, notou-se uma

relação direta entre tamanho do grânulo de arroz e crescimento/pigmentação, sendo que as

35

granulometrias maiores mostraram visualmente uma maior produção e dispersão dos

pigmentos. Quando cultivados em arroz moído retido na peneira ABNT/ASTM 16 (1,18 mm),

o crescimento dos micélios mostrou-se mais difuso e homogêneo, bem como a pigmentação

avermelhada. Desempenhos semelhantes foram observados para cultivos com arroz retidos

nas peneiras ABNT/ASTM 30 (600 µm) e ABNT/ASTM 40 (425 µm), que mostraram tanto

crescimento como pigmentação equivalentes entre si, mas em menor grau quando comparados

ao resultado anterior (ASTM/ABNT 16) e em maior grau em comparação com o crescimento

em arroz retido na peneira ANBNT/ASTM 50 (300 µm). Tanto no último caso

(ABNT/ASTM 50) como no cultivo com arroz do fundo (<300 µm), o crescimento fúngico

ficou limitado à superfície e houve pouca dispersão dos pigmentos, que em relação aos

demais se manifestaram em quantidade inferior e em pontos isolados nas placas. Tais

resultados indicam que há uma relação direta entre a produção dos pigmentos e o contato das

culturas fúngicas com o ar, visto que cultivos em grânulos maiores, onde a superfície de

contato com ar é maior, mostraram-se mais eficientes para produção e tonalidade das cores

dos pigmentos.

Tabela 4 Percepção visual quanto a crescimento e dispersão dos pigmentos em meio a base de arroz quebrado e peneirado em diferentes tamanhos.

Peneira Poro Crescimento Pigmentação do arroz

ABNT/ASTM 16 1180 µm + + + + + + + + + +

ABNT/ASTM 30 600 µm + + + + + +

ABNT/ASTM 40 425 µm + + + + + +

ABNT/ASTM 50 300 µm + + +

Fundo - + + +

A figura 12 ilustra o crescimento fúngico e produção de pigmentos a partir do

meio a base de arroz moído e peneirado com granulometria ABNT/ASTM 16 (1180µm),

considerado o melhor tamanho de partícula tanto para o crescimento quanto produção de

pigmentos em meio sólido.

36

Figura 12. Crescimento e produção de pigmentos em meio arroz sólido granulometria ABNT/ASTM 16

(1180µm).

A produção de pigmentos vermelhos em Fermentação no Estado Sólido utilizando

arroz como substrato não é novidade. O processo de produção do Anka por fungos do gênero

Monascus tem sido tradicionalmente empregado em países orientais como o Japão, Índia e

China, sendo que a produção dos pigmentos e tonalidade da cor varia entre diferentes

linhagens de Monascus, e função das condições de cultivo e do meio empregado

(CARVALHO et al., 2005). Uso de arroz quebrado, por exemplo, foi utilizado em um

processo de produção de pigmentos vermelhos por Monascus ruber para aplicação em

produtos lácteos (VIDYALASKSHMI et al., 2009). CARVALHO et al. (2007) em seus

experimentos, utilizaram uma série de substratos ricos em amido, dentre eles o arroz quebrado

e o bagaço de mandioca para o cultivo de Monascus sp., com resultados satisfatórios quanto a

produção de pigmentos microbianos. Apesar de o arroz apresentar os melhores resultados,

estes autores concluíram que o bagaço de mandioca suplementado poderia ser uma opção

mais viável, por se tratar de um resíduo de baixo valor agregado.

4.2.1. Separação e recuperação dos pigmentos

Ao longo do processo experimental observou-se que o pigmento produzido não

era lançado no ambiente extracelular quando o cultivo se dava por Fermentação no Estado

37

Sólido. Assim sendo, foi possível deduzir que o pigmento produzido caracteriza-se por um

metabólito intracelular ou associado à parede celular. Tal característica impõe determinados

desafios à separação, pois torna necessária a adoção de técnicas de rompimento de células.

Porém, as técnicas testadas neste estudo (moinho de bolas, uso de surfactantes) não se

mostraram eficientes em liberar o pigmento da biomassa.

Com intuito de extrair os compostos responsáveis pela pigmentação microbiana,

diferentes solventes foram empregados. No entanto, algo curioso relacionado a alterações na

coloração dos pigmentos foi observado durante os ensaios de extração, como será descrito

adiante.

O material de partida foi o arroz fermentado, que originalmente apresentava

coloração vermelho-roxo, mas depois de autoclavado passava a azul. Quando a extração foi

testada com arroz fermentado autoclavado (azul), apenas o solvente acetato de etila extraiu

quantidades significativas de pigmento (Figura 13), mas o extrato apresentou coloração

vermelho intensa enquanto que o arroz manteve-se azul. O solvente etanol gerou resultados

qualitativos equivalentes, mas com eficiência de extração muito menor. No caso dos solventes

acetona e álcool isopropílico não foi evidenciada qualquer extração de coloração, seja de

coloração azul ou vermelha. Já quando a extração foi efetuada com arroz fermentado não

autoclavado (vermelho-roxo), o acetato de etila mais uma vez mostrou boa capacidade de

extração, gerando um extrato vermelho e uma biomassa também avermelhada. A água e o

clorofórmio acidificado (HCl) gerou resultados qualitativos semelhantes, mas com eficiência

de extração muito menor. Os solventes, álcool isopropílico e acetona não conferiram extração

de cor aparente nem alteração na cor da biomassa. O etanol, porém, extraiu corantes

vermelhos (extrato vermelho) e alterou a cor da biomassa para azul. A tabela 5 mostra a

eficiência dos solventes testados para o processo de extração e alteração na cor da biomassa.

Até onde se sabe este foi o primeiro relato de pigmentos azuis oriundos da fermentação

fúngica e, portanto, tal processo gerou um pedido de patente junto ao INPI (BR 10 2013

015305 2 – Processo de produção e aplicação de pigmento oriundo do fungo Fusarium

oxysporum).

38

Figura 13. Extração dos pigmentos fúngicos. (a) Etanol comercial 92% e (b) Acetato de etila e agitação por

vortex durante 1 min.

O baixo desempenho da água como solvente deve-se provavelmente a polaridade

da molécula de corante, dado que as prováveis moléculas (antraquinonas ou bicaverina)

apresentam caráter apolar. CARVALHO et al. (2007), em experimentos de extração

semelhantes, não conseguiram aplicação efetiva da água no processo de recuperação dos

pigmentos de Monascus ruber. O etanol, todavia, apresentou uma extração intermediária

(entre acetato de etila e clorofórmio acidificado) de cor vermelha, mas a biomassa resultante

da extração teve sua coloração modificada para azul. CARVALHO et al., (2007) também

empregou uma série de solventes orgânicos (metanol, etanol, DMSO, éter etílico e hexano)

com o intuído de extrair pigmentos vermelhos da biomassa do fungo Monascus, relatando

elevada eficiência no processo de extração com metanol, DMSO e etanol.

Tabela 5. Extração dos pigmentos da biomassa com variados solventes:

Solvente Extração de pigmentos vermelhos Alteração na cor da biomassa para azul

Etanol + +

Acetona - -

Álcool isopropílico - -

Água + -

Acetato de etíla + -

Clorofórmio+HCl + -

Diante do exposto, associadas às observações com a biomassa autoclavada

oriunda das fermentações submersas, formulou-se a hipótese de que a coloração vermelha e

azul são resultados da mesma molécula, a qual em estado livre ou ligada à proteína nativa

a b

39

apresenta-se com coloração avermelhada; já quando ligada a proteína desnaturada (calor,

solventes) apresenta-se com coloração azulada. Seria justamente esta ligação pigmento-

proteína que garantiria que a coloração permanecesse associada à célula. A hipótese de que há

dois corantes sendo produzidos (um vermelho e outro azul) foi descartada já que todos os

procedimentos de extração do pigmento azul geraram um extrato de cor vermelha, exceto com

o solvente DMSO. Além disso, análises químicas preliminares (HPLC-EM) indicaram que as

moléculas responsáveis pela manifestação da cor no extrato roxo (DMSO) e no extrato

vermelho (acetato de etila) apresentavam possivelmente a mesma estrutura química.

4.3. Produção dos pigmentos microbianos em Fermentação Submersa

A fermentação submersa foi utilizada para estudo cinético preliminar, tendo como

parâmetros o crescimento celular, avaliado por contagem de micro-organismos em placa

(UFC/mL), e a quantidade de pigmentos produzidos, determinada pela absorbância a 485nm

em função do tempo de crescimento das culturas. Este valor de absorbância foi definido após

a avaliação do perfil de absorbância do sobrenadante da cultura em diferentes comprimentos

de onda na região do visível, como é mostrado no gráfico a seguir (Figura 14). Em

experimentos semelhantes para a quantificação de pigmento vermelho, CARVALHO et al.

(2007) monitoraram a absorbância no intervalo entre 400 e 500 nm, faixa esta responsável

pela manifestação da coloração vermelha. VIDYALAKSHMI et al. (2009), por sua vez,

determinaram os pigmentos de Monascus por espectrofotometria de varredura no intervalo de

410 a 510 nm, após extração com etanol a 80% para análise dos pigmentos vermelhos e

amarelos; posteriormente separando-os e analisando por HPLC após extração com acetato de

etila.

40

Figura 14 - Varredura no visível do sobrenadante da cultura de F. oxysporum CCT7620 após extração com

etanol 92%.

O meio escolhido para este estudo foi uma mistura de arroz e água, dado que este

material propiciou os melhores resultados de crescimento e produção de pigmentos na

Fermentação no Estado Sólido. Como o meio em questão apresentava grande quantidade de

material em suspensão (amido), a quantificação de biomassa por massa seca (g/L) mostrou-se

uma técnica inapropriada, por isso optou-se pela determinação de micro-organismos viáveis

para determinar a curva de crescimento microbiano. Outra maneira de se quantificar o

crescimento celular seria a determinação do crescimento radial das colônias fúngicas, através

de medições diretas do diâmetro das colônias, como feito por CARVALHO et al. (2005).

Porém, a técnica escolhida neste estudo apresenta maior precisão e reprodutibilidade.

O meio a base de arroz usado no presente estudo foi capaz de gerar uma diferente

gama de cores ao caldo fermentado quando se alterava a proporção de arroz de sua

formulação (Figura 15). Tal fato comprova que a quantidade de arroz na formulação do meio

é fundamental não apenas para a coloração como para a intensidade da coloração da

biomassa.

0

0,5

1

1,5

2

380 440 500 560 620 680 740 800

Abs

orbâ

ncia

Comprimento de onda (nm)

41

Figura 15 - Resultados da alteração na cor do caldo arroz fermentado variando-se o percentual (0, 25, 50, 75 ou

100%) de recomposição de “pasta de arroz” após centrifugação do meio.

Variações na cor da biomassa também puderam ser evidenciadas após

autoclavagem (121°C/15min) do meio fermentado. O material que tinha originalmente a cor

vermelho-roxo passou para azul marinho quanto submetido ao tratamento térmico

mencionado. Conforme mencionado anteriormente, esta observação corrobora a hipótese de

que o pigmento em questão pode estar associado à célula via ligação com proteínas.

No ensaio de cinética de crescimento microbiano em Erlenmeyers de 250 mL

(Figura 16) foi possível observar que o crescimento microbiano atinge valor máximo após

48h de cultivo e depois deste período entra em fase estacionária. De forma geral, a produção

do pigmento (DO485) vermelho acompanha a curva de crescimento. Isso indica que a

produção do pigmento está associada ao crescimento celular. Há relatos que associam que a

quantidade de pigmento acumulado é diretamente dependente da concentração de biomassa,

mesmo que muitas vezes os pigmentos são metabólitos secundários produzidos após a fase

logarítmica de crescimento (CHAVEZ et al., 2005).

0% 25% 50% 75% 100%

42

Figura 16 -. Cinética de crescimento (■) e produção de pigmentos (absorbância do sobrenadante da cultura a

485nm) (▲) por F. oxysporum CCT7620 em Erlenmeyers de 250mL.

Em relação ao monitoramento da produção dos pigmentos, um dos pontos foi

retirado das análises por apresentar desvio muito elevado em relação aos demais. Optou-se

por repetir o ensaio de cinética em biorreator de bancada (air lift), onde as condições de

cultivo seriam mais homogêneas, principalmente quanto ao fornecimento de oxigênio, tendo

ainda como vantagens, maior facilidade no monitoramento do pH e temperatura durante o

processo fermentativo. Os resultados deste estudo serão apresentados na sequência.

A cinética em Erlenmeyers, mesmo se tratando de um estudo preliminar, forneceu

importantes informações e estimativas precisas que foram amplamente aplicadas nos

processos subseqüentes em air lift, principalmente com relação a estimativas do tamanho do

inóculo, o tempo de cultivo e as faixas de diluições que deveriam ser consideradas para a

quantificação de células.

4.4. Cinética de Produção do Pigmento em Biorreator de Bancada Air Lift

4.4.1. Cultivo sem controle do pH e Temperatura e meio a 50g/L

A condução do processo fermentativo em biorreator de bancada possibilitou a

produção de biopigmento em maior escala comparativamente ao processo realizado em

Erlenmeyers. A coloração do meio fermentado foi semelhante ao processo em Erlenmeyer,

um vermelho-roxo (Figura 17).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 20 40 60 80 100 120

Con

tage

m (

UF

C/m

L),

DO

485

Tempo de fermentação (h)

43

Figura 17 - Fermentação do fungo Fusarium oxysporum CCT7620 em biorreator de bancada do tipo air lift após

cerca de 72h de processo.

Foi efetuada a adição de 300 mL de água nos tempos 44 e 78 horas, a fim de

completar o volume operacional do biorreator, sendo que nos tempos citados as amostras

foram coletadas antes da adição para que não ocorresse a diluição do material e conseqüente

alteração dos parâmetros cinéticos avaliados.

Os parâmetros operacionais pH, temperatura e oxigênio dissolvido foram

monitorados (Figura 18), enquanto que a retirada de amostras ao longo do tempo permitiu

determinar os parâmetros cinéticos de crescimento microbiano e produção de pigmentos

(Figura 19).

44

Figura 18 - Condições operacionais do biorreator air lift durante a o experimento de cinética de crescimento e

produção dos pigmentos por F. oxysporum CCT7620 (Figura 13).

Figura 19 - Cinética de crescimento microbiano (■) e de produção do pigmento (), em termos de absorbânica a

485nm. As barras de erro correspondem ao desvio padrão das medidas.

Pode-se observar um crescimento acentuado (fase log) nas primeiras 30 horas de

crescimento, com crescimento exponencial (de aproximadamente 1.107 UFC/mL para 5.107

UFC/mL) e paralela depleção no oxigênio dissolvido (cai de pouco mais de 80% para

praticamente zero), que permanece praticamente nulo entre 18 e 35h, e produção de ácidos

2

3

4

5

6

7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 20 40 60 80 100

pH

Tem

pera

tura

(°C

), o

xigê

nio

diss

olvi

do

(%)

Tempo (h)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

6

7

8

0 20 40 60 80 100

Abs

orbâ

ncia

a 4

85nm

Con

tage

m (

Log

UF

C/m

L)

Tempo (h)

pH

Temperatura

Oxigênio dissolvido

45

(abaixamento do pH de cerca de 6 para cerca de 3,8) (Figuras 18 e 19). A partir de

aproximadamente 35h de cultivo o fungo entrou na fase estacionária, o que pode ser

observado pela estabilização na contagem microbiana, pelo aumento no oxigênio dissolvido

(menor taxa de crescimento equivale a menor demanda por O2) e pela estabilização do pH,

por volta de 3,5, pelo interrupção na produção de ácidos (Figuras 18 e 19). É possível concluir

que a produção do pigmento acompanha o crescimento celular, mas se estende até a fase

estacionária e, com aproximadamente 60 h de fermentação, a pigmentação permanece estável

até o fim do cultivo. É importante destacar que a absorbância inicial, apesar da ausência de

produção de pigmentos microbianos, pode ser explicada pela adição de 10% de inóculo já

pigmentado (equivalente ao cultivo de 48h que é mostrado no ensaio em Erlenmeyers na

Figura 16).

De forma geral, o comportamento do fungo em Erlenmeyers (Figura 16) e em air

lift (Figuras 18 e 19) foi equivalente. Apesar das evidentes diferenças entre os dois sistemas,

pode-se observar que nos dois casos o crescimento celular cessou entre 24 e 48h e que a

produção do pigmento cessou logo após a fase log. Tanto para os experimentos em air lift,

quanto para o experimento em Erlenmeyers, pode-se observar que o cultivo poderia ser

interrompido antes mesmo das 96 horas, sem comprometer as conclusões obtidas, visto que a

fase estacionária encontrava-se consolidada.

Em experimentos com biorreator de bancada air lift para estudo cinético da

produção de biopigmentos a partir de quatro linhagens de Monascus purpureus,

KONGRUANG (2011) obteve uma mistura de pigmentos amarelo, laranja e vermelho, cujo

monitoramento, determinado por leituras de absorbância a 400, 460 e 500nm,

respectivamente, indicou um máximo de produção após cerca de 4 dias de cultivo. No

presente experimento por outro lado, em cerca de dois dias e meio de cultivo, o fungo

Fusarium oxysporum foi capaz de atingir seu pico máximo de produção de pigmentos

microbianos vermelhos. Outro experimento em air lift foi efetuado para produção de

bicaverina e ácido giberélico por culturas de Fusarium fujikuroi. Operando em volume de

trabalho de 3,5 litros com aeração de 1,6 vvm, pH 3, temperatura de 29ºC e 0,3 litros de

inóculo, a produção máxima de biomassa e de pigmento bicaverina foi obtida por volta de 60

horas de fermentação. Logo após este tempo o fungo alcançou a fase estacionária e a

produção de bicaverina também foi interrompida (CHAVEZ et al., 2008). Estes autores,

trabalhando em condições semelhantes às utilizadas no presente experimento, obtiveram

resultados equivalentes na cinética de produção do pigmento vermelho bicaverina.

46

Em síntese, o processo em air lift, mostra-se mais versátil para o controle dos

parâmetros durante o processo, visto que permite a incorporação de agentes controladores do

pH (ácidos e bases), permite a manutenção constante do oxigênio dissolvido no sistema com

distribuição homogênea em todo o meio de cultivo, possibilita o monitoramento constante em

curtos intervalos de tempo, além da facilidade para coletas periódicas de amostras que pode

ser feita com o auxílio de uma seringa comum. Por outro lado, o processo realizado com altas

concentrações de material particulado, gera grumos que não podem ser metabolizados pelo

fungo, o que não é observado no processo em Erlenmeyers. Este, por sua vez, também

mostrou-se eficiente para o cultivo do Fusarium oxysporum e produção dos seus

biopigmentos, apesar da limitação quanto a possibilidade de controle dos parâmetros de

processo.

4.4.2. Cultivo em air lif controlando pH e temperatura

Como relatado na Metodologia, pH e temperatura não foram controlados durante

os cultivos em Erlenmeyers e no ensaio em air lift anterior. Buscando conhecer como o

controle desses parâmetros poderia interferir no processo, um segundo experimento em

biorreator air lift foi realizado, agora diminuindo a concentração de substrato de 50 g/L para

20 g/L, uma vez que no cultivo anterior, boa parte do material sólido encontrou-se aderido ao

aspersor do air lift, tornando parte do meio de cultivo indisponível ao fungo. O inóculo

também foi diminuído (de 10% para 1% do volume), pois a contagem inicial havia se

mostrado muito elevada, com pouco crescimento microbiano durante a fase exponencial. O

pH foi controlado automaticamente pelo sistema, exceto no intervalo entre 12 e 24 horas de

cultivo, em que o estoque de NaOH se esgotou, sendo completado subsequentemente. A

temperatura foi mantida aproximadamente a 28ºC durante todo o cultivo com auxílio de

banho ultratermoestatizado sem variação alguma durante o processo. A aeração, inicialmente

em 1,5 vvm, diminuiu até cerca de 0,5 vvm devido ao aumento na perda de carga do sistema.

Infelizmente, como será discutido adiante, houve uma significativa alteração no processo e

nas características do fungo. A Figura 20 apresenta como variaram os parâmetros crescimento

celular, oxigênio dissolvido, pH e temperatura ao longo do processo.

47

Figura 20 - Cinética de crescimento do fungo F. oxysporum CCT7620 em air lift com controle de pH, e

temperatura. A figura apresenta como variaram o oxigênio dissolvido (linha contínua negra), a temperatura (linha contínua cinza), o pH (linha tracejada cinza) e a contagem microbiana (■) ao longo do processo.

É possível notar que o controle do pH e temperatura, estenderam a fase log até

cerca de 40 horas de fermentação. Algo curioso pôde ser observado no ponto de 24h, que

apresentou contagem microbiana pouco acima da tendência até então observada. Tal fato

ocorreu pois, conforme citado anteriormente, a solução de NaOH 1M foi completamente

consumida, causando queda acentuada do pH (de 6,0 para menos de 4,5) em cerca de 18h de

cultivo. Neste momento, foi identificada a geração de espuma vermelha no vidro do reator

(vide Figura 21) e aumento da taxa específica de crescimento, dado que bolores tendem a

preferir valores de pH mais baixos, o que também gerou um maior consumo de O2 (queda no

oxigênio dissolvido, Figura 20). A partir das 40h de cultivo, concentração de biomassa

permaneceu estável até o fim do processo, mantendo-se aproximadamente constante em 8.107

UFC/mL. O oxigênio dissolvido foi gradualmente sendo diminuído, apesar do crescimento ter

sido interrompido, devido a já mencionada queda na aeração ao longo do processo.

Conforme pode ser observado (Figura 21), os pigmentos produzidos neste

segundo cultivo em biorreator air lift manifestaram coloração roxa intensa, principalmente

após 48 horas de cultivo, de forma diferente ao cultivo anterior, que produziu apenas

pigmentos vermelhos (Figura 17). Esta observação de que a composição do meio de cultivo

foi capaz de alterar a coloração do meio fermentado não foi surpreendente, pois algo

semelhante já havia sido relatado para os experimentos em Erlenmeyer (Figura 15). Porém, os

pigmentos roxos, contrariamente ao observado no cultivo anterior, não puderam ser extraídos

4

5

6

7

8

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

Con

tage

m (

Log

UF

C/m

L),

pH

Tem

pera

tura

(°C

), o

xigê

nio

diss

olvi

do (%

)

Tempo (h)

48

com o solvente acetato de etila, e nenhum outro testado até o momento, por tal motivo, a

quantificação dos pigmentos ficou seriamente comprometida. Uma hipótese para o insucesso

na extração seria a associação dos pigmentos roxos e azuis a parede celular do fungo, fazendo

com que a recuperação dessas moléculas seja mais problemática. Apesar deste fato, este

ensaio foi bastante útil por mostrar a relação entre condições de cultivo e

crescimento/produção de metabólitos.

Figura 21 - Produção de pigmento roxo por fungo Fusarium oxysporum CCT7620 em biorreator de bancada do

tipo air lift.

4.5. Tingimento de materiais

Pedaços (5 x 5 cm) de tecidos de algodão, poliéster, poliestireno e de plástico

polipropileno foram testados como material de partida no processo de tingimento com o

pigmento do F. oxysporum 7620 presente no sobrenadante da cultura. Os resultados indicaram

que não houve fixação do pigmento sobre a fibra de poliestireno (Figura 22c), provavelmente

devido à ausência de grupos funcionais específicos tanto no corante quanto na fibra têxtil,

necessitando estudo específico para elucidação dos mecanismos de ligação do biopigmento

produzido à fibra. Já o algodão (Figura 22a) e o poliéster (Figura 22b) foram tingidos em

vermelho, sendo o último com uma coloração mais intensa. Estes tecidos tingidos mantiveram

a cor mesmo após fervura em água por 10 min ou após lavagem com detergente e sabão em

49

pó. Quanto ao material plástico polipropileno, este também passou por tingimento efetivo

assumindo uma coloração rósea (Figura 22d).

Figura 22 - Tecidos corados em meio líquido. A) Tecidos de poliéster; B) algodão; C) poliestireno; D) plástico

polipropileno.

Estudos semelhantes foram efetuados por NAGIA & MOHAMEDY (2007), que

eficazmente tingiram tecidos de lã a partir de pigmentos da classe das antraquinonas

produzidas por Fusarium oxysporum. Em seu experimento, estes pesquisadores monitoraram

a influência do pH, temperatura, concentração de sais, tempo de tingimento nas propriedades

de solidez da cor. No presente trabalho, até o momento não foram realizados estudos

considerando tais parâmetros como a influência da concentração de sais no banho de

tingimento ou pH. Todavia, os testes preliminares apontam resultados convergentes com os

encontrados por NAGIA & MOHAMEDY (2007), como a influência positiva da temperatura

(por volta de 100°C) e o tempo de tingimento.

DE SANTIS et al. (2005), trabalhando com Monascus pupureus, obteve sucesso

no tingimento de lã com cores vermelho e laranja, e de forma análoga, o tingimento de

vermelho apresentou coloração rósea pálida na fibra. A aplicação de pigmento prodigiosina,

produzido por culturas de Vibrio sp., no tingimento de lã, nylon, acrílico e seda mostrou ainda

ação antimicrobiana, além de boas propriedades no processo de tingimento em vermelho dos

materiais (ALIHOSSEINI et al., 2008). Propriedades antimicrobianas (antifúnbgica) também

foram evidenciadas para tecidos (lã e seda) tingidos com pigmentos de Trichoderma virens

(SHARMA et al., 2012). Tais propriedades antimicrobianas também podem ocorrer para os

pigmentos do F. oxysporum CCT7620, visto que a bicaverina, pigmento vermelho produzida

por algumas espécies de Fusarium, apresenta atividade antibiótica contra protozoários e

fungos como verificado por LIMÓN et al. (2010).

A B

C D

50

O uso de mordentes, quando necessário, para fixação dos corantes a fibra têxtil é

muito comum, DE SANTIS et al. (2005) verificou o desempenho de diversos mordentes

como por exemplo o sulfato de ferro, sulfato de cobre e o ácido tânico nos banhos de

tingimento com pigmentos oriundos de Monascus purpureus, entretanto, no presente trabalho

não foi aplicado nenhum mordente até o momento.

Neste trabalho também descrevemos um procedimento original de tingimento, que

foi proposto baseando-se na observação de que fungos filamentosos crescem em tecidos

úmidos, provocando manchas muito persistentes e difíceis de serem removidas. Portanto,

idealizou-se o crescimento fúngico e produção do pigmento diretamente no tecido. Assim, o

tecido (algodão ou poliéster) foi enriquecido com substrato para o crescimento fúngico e

inoculado de forma mais homogênea possível com uma suspensão de esporos. Após

crescimento microbiano, o tecido apresentou uma coloração vermelho-roxo. Da mesma forma

como a fermentação no estado sólido e na fermentação submersa, a biomassa entremeada no

tecido, e consequentemente o tecido, tornou-se azul marinho após tratamento térmico

(autoclavagem) (Figura 23). Esta cor se manteve mesmo após a remoção da biomassa e do

tecido. A heterogeneidade do tingimento ainda permanece um desafio a ser vencido em

futuros estudos. Uma alternativa pode ser o tingimento do fio antes da tecelagem, conforme

efetuado por VELMURUGAN et al., (2010).

Figura 23 - Tecidos corados com o fungo crescendo sobre a fibra. A) Poliéster suspenso; B) algodão suspenso;

C) algodão em contato com meio de cultivo.

É importante ressaltar, que não foram encontrados até o momento, trabalhos

relacionados ao tingimento de tecidos com o fungo crescendo sobre a fibra, sendo também

inédita a pigmentação em azul de tecidos com os biopigmentos. Por este motivo, um pedido

de patente para este processo já está em fase final de redação.

A B C

51

5. CONCLUSÃO

5.1. Conclusões

O presente trabalho demonstrou a capacidade do fungo Fusarium oxysporum para

a produção de pigmentos vermelhos e roxos aplicando-se dois métodos distintos de cultivo,

em meio sólido e em meio líquido, tendo ambos, o arroz cozido como substrato. O processo

pode ser conduzido em shaker rotatório e em maior escala no Biorreator Airlift, que oferece a

possibilidade de controle de diversos parâmetros como o pH, temperatura e oxigênio

dissolvido. A matéria prima pode ser um arroz de refugo denominado arroz quebrado, com

baixo valor de mercado. De forma original, foi demonstrada a possibilidade de se produzir

pigmentos azuis a partir da biomassa fúngica após processo de extração com etanol.

Adicionalmente, um processo inovador para o tingimento de tecidos foi proposto. Apesar das

importantes conquistas até o momento, ainda resta avaliar a biodegradabilidade e a toxicidade

dos pigmentos obtidos, procedimentos estes que estão sendo avaliados.

5.2. Sugestões Para Trabalhos Futuros

No futuro, espera-se desenvolver protocolos eficazes para produzir pigmentos e

tecidos tingidos de forma viável em escala comercial. É fundamental conhecer a molécula

responsável pela manifestação das cores e sua estrutura química, bem como o mecanismo de

associação dos pigmentos e azuis a biomassa fúngica. Da mesma forma, torna-se

imprescindível conhecer a toxicologia, verificar a possibilidade de ocorrência de reações

alérgicas e a biodegradabilidade destes corantes, pois sugere-se avaliar seu uso como

potencial ingrediente para a indústria de alimentos. Por fim, sabe-se que os fungos da espécie

F. oxysporum são extremamente versáteis, com potencial produção de enzimas (ex.: lípases) e

bioaromas por biotransformação de terpenos. Portanto, seria apropriado explorar mais a fundo

o arsenal metabólico do F. oxyposrum CCT7620, monitorando seu metabolismo e como ele se

relaciona com a produção dos corantes, para possivelmente ser considerada sua utilização em

bioprocessos integrados para a produção de diferentes produtos de interesse comercial.

52

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABEROUMAND, Ali. A review article on edible pigments properties and sources

as natural biocolorants in foodstuff and food industry. World Journal of Dairy Food

Science, v. 6, n. 1, p. 71-78, 2011.

ALCÂNTARA, M. R.; DALTIN, D. A química do processamento têxtil. Química

Nova, v. 19, n. 3, p. 320-330, 1996.

ALIHOSSEINI, F., Ju, K. S., LANGO, J., HAMMOCK, B. D., & SUN, G.

Antibacterial colorants: characterization of prodiginines and their applications on textile

materials. Biotechnology progress, v. 24, n. 3, p. 742-747, 2008.

BERTAZZOLI, Rodnei; PELEGRINI, Ronaldo. Descoloração e degradação de

poluentes orgânicos em soluções aquosas através do processo fotoeletroquímico. Química

Nova, v. 25, n. 3, p. 477-482, 2002.

BICAS, J.L.; MARÓRSTICA JR, M.R.; BARROS, F.F.C.; MOLINA, G.;

PASTORE, G.M. Bioadditives Produced by Fermentation. In: SOCCOL, C.R.; PANDEY,

A.; LARROCHE, C. (Eds.) Fermentation Processes Engineering in the Food Industry. CRC

Press. 2013. 510 pp).

BORÉM, A. A história da biotecnologia. Biotecnologia Ciência &

Desenvolvimento, v. 34, p. 347, 2005.

BYSTRYKH, L.V., FERNÁNDEZ-MORENO, M.A., HERREMA, J.K.,

MALPARTIDA, F., HOPWOOD, D.A. and DIJKHUIZEN, L. Production of actinorhodin-

related ‘‘blue pigments’’ by Streptomyces coelicolor A3(2). Journal of Bacteriology,

178:2238-2244, (1996).

CARVALHO, J.C., OISHI, B.O., PANDEY, A. and SOCCOL, C.R. Biopigments

from Monascus: strains selection, citrinin production and color stability. Brazilian Archives

of Biology and Technology, 48:885-894, 2005.

53

CHAVEZ-PARGA, M. D. C., GONZALEZ-ORTEGA, O., NEGRETE-

RODRÍGUEZ, M. D. L. L. X., VALLARINO, I. G., ALATORRE, G. G., & ESCAMILLA-

SILVA, E. M. Kinetic of the gibberellic acid and bikaverin production in an air lift bioreactor.

Process Biochemistry, v. 43, n. 8, p. 855-860, 2008.

CHATTOPADHYAY, Pritam; CHATTERJEE, Sandipan; SEN, Sukanta K.

Biotechnological potential of natural food grade biocolorants. African Journal of

Biotechnology, v. 7, n. 17, 2008.

CHOUDHARI, Sheetal M.; ANANTHANARAYAN, Laxmi; SINGHAL, Rekha

S. Use of metabolic stimulators and inhibitors for enhanced production of β-carotene and

lycopene by Blakeslea trispora NRRL 2895 and 2896. Bioresource technology, v. 99, n. 8,

p. 3166-3173, 2008.

DE MORAES, C. M. Estudo da difusão de corantes reativos em tecido de

algodão. 87 f. (Mestrado em Engenharia Química) – Faculdade de Engenharia Química,

Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2010.

DE SANTIS, D., MORESI, M., GALLO, A. M., & PETRUCCIOLI, M.

Assessment of the dyeing properties of pigments from Monascus purpureus. Journal of

Chemical Technology and Biotechnology, v. 80, n. 9, p. 1072-1079, 2005.

DUFOSSÉ, L. Microbial production of food grade pigments. Food Technology

and Biotechnology, v. 44, n. 3, p. 313-323, 2006.

DUFOSSÉ, L., GALAUP, P., YARON, A., ARAD, S. M., BLANC, P.,

CHIDAMBARA MURTHY, K. N., & RAVISHANKAR, G. A. Microorganisms and

microalgae as sources of pigments for food use: a scientific oddity or an industrial reality?

Trends in Food Science & Technology, v. 16, n. 9, p. 389-406, 2005.

EDEL, V., STEINBERG, C., GAUTHERON, N., & ALABOUVETTE, C.

Populations of nonpathogenic Fusarium oxysporum associated with roots of four plant species

compared to soilborne populations. Phytopathology, v. 87, n. 7, p. 693-697, 1997.

54

ERIKSEN, Niels T. Production of phycocyanin a pigment with applications in

biology, biotechnology, foods and medicine. Applied microbiology and biotechnology, v.

80, n. 1, p. 1-14, 2008.

GARCIA, José Luís, “Biotecnologia e biocapitalismo global”, Análise Social,vol.

XLI, 181: 981-1009, 2006.

GUARATINI, Cláudia CI; ZANONI, Maria Valnice B. Corantes têxteis. Química

Nova, v. 23, n. 1, p. 71-78, 2000.

JUDICE, Valéria Maria Martins; BAÊTA, Adelaide Maria Coelho. Modelo

empresarial, gestão de inovação e investimentos de venture capital em empresas de

biotecnologia no Brasil. Revista de Administração Contemporânea, v. 9, n. 1, p. 171-191,

2005.

KUNZ, A., Peralta-Zamora, P., DE MORAES, S. G., & DURÁN, N. Novas

tendências no tratamento de efluentes têxteis. Química Nova, v. 25, n. 1, p. 78-82, 2002.

LIMÓN, M. Carmen; RODRÍGUEZ-ORTIZ, Roberto; AVALOS, Javier.

Bikaverin production and applications. Applied microbiology and biotechnology, v. 87, n.

1, p. 21-29, 2010.

LIU, George Y.; NIZET, Victor. Color me bad: microbial pigments as virulence

factors. Trends in microbiology, v. 17, n. 9, p. 406-413, 2009.

MELCHIADES, Fabio G.; BOSCHI, Anselmo O. Cores e tonalidades em

revestimentos cerâmicos. Cerâmica Industrial, v. 4, n. 1-6, p. 1-6, 1999.

MENDA, M. Corantes e pigmentos. Disponível em:

<http://www.crq4.org.br/quimicaviva_corantespigmentos>. Acesso em: 15 junho de 2013.

55

NAGIA, F. A.; EL-MOHAMEDY, R. S. R. Dyeing of wool with natural

anthraquinone dyes from Fusarium oxysporum. Dyes and pigments, v. 75, n. 3, p. 550-555,

2007.

NELSON, David L.; COX, Michael M. Lehninger princípios de bioquímica.

Omega, 2001.

PEDROSA, I.; Da cor à cor inexistente, 3a. ed., Ed. Léo Christiano, Co-editora

Univ. Brasília: Rio de Janeiro, 1982.

PINTEA, A.M. (2008) Food colorants derived from natural sources by

processing. In: C. Socaciu (ed.) Food colorants: chemical and functional properties, Boca

Raton: CRC Press, pp. 101-124.

POLETTO, I., MUNIZ, M. F. B., CECONI, D. E., SANTIN, D., WEBER, M. N.

D., & BLUME, E. Zoneamento e identificação de Fusarium spp. causadores de podridão de

raízes em plantios de erva-mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) na região do vale do Taquarí,

RS. Ciência Florestal, 16(1), 2006.

RÄISÄNEN, R. Anthraquinones from the Fungus Dermocybe sanguine as

Textile Dyes. 2002. 113 f. (Ph.D. Thesis, University of Helsinki) - Department of Home

Economics and Craft Science Research Report 10. Vantaa: Dark. 2002.

RETTORI, D.; DURÁN, N. Production, extraction and purificationof violacein:

an antibiotic pigment producedby Chromobacterium violaceum. World Journal of

Microbiology and Biotechnology, v. 14, n. 5, p. 685-688, 1998.

ROSOLEN, L. A., MONTEIRO, R. T., DELLAMATRICE, P. M., & KAMIDA,

H. M. Biodegradação de efluente têxtil e nove corantes técnicos utilizando fungos

basidiomicetos. Química Têxtil, n. 76, p. 44-52, 2004.

SARADA, R.; PILLAI, Manoj G.; RAVISHANKAR, G. A. Phycocyanin from

Spirulina sp: influence of processing of biomass on phycocyanin yield, analysis of efficacy of

56

extraction methods and stability studies on phycocyanin. Process Biochemistry, v. 34, n. 8,

p. 795-801, 1999.

SARON, Clodoaldo; FELISBERTI, Maria Isabel. Ação de colorantes na

degradação e estabilização de polímeros. Química Nova, v. 29, n. 1, p. 124, 2006.

SHARMA1A, D., GUPTA, C., AGGARWAL, S., & NAGPAL, N. Pigment

extraction from fungus for textile dyeing. Indian Journal of Fibre & Textile Research, v.

37, p. 68-73, 2012.

SILVEIRA, J. M. F. J. D., BORGES, I. D. C., & BUAINAIN, A. M.

Biotecnologia e agricultura: da ciência e tecnologia aos impactos da inovação. São Paulo em

Perspectiva, 19(2), 101-114, 2005.

SINHA, S., & MUKHERJEE, S. K. Pseudomonas aeruginosa KUCd1, a possible

candidate for cadmium bioremediation. Brazilian Journal of Microbiology, v. 40, n. 3, p.

655-662, 2009.

SOARES, José Luciano. Remoção de corantes têxteis por adsorção em carvão

mineral ativado com alto teor de cinzas. Diss. Dissertação de Mestrado-Universidade

Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 1998.

VELMURUGAN, P., KIM, M. J., PARK, J. S., KARTHIKEYAN, K.,

LAKSHMANAPERUMALSAMY, P., LEE, K. J., ... & OH, B. T.. Dyeing of cotton yarn

with five water soluble fungal pigments obtained from five fungi. Fibers and Polymers, v.

11, n. 4, p. 598-605, 2010.

VIDYALAKSHMI, R., PARANTHAMAN, R., MURUGESH, S., &

SINGARAVADIVEL, K. Microbial bioconversion of rice broken to food grade pigments.

Global Journal of Biotechnology and Biochemistry, v. 4, p. 84-87, 2009.

57

ZHANG, H., ZHAN, J., SU, K., & ZHANG, Y. A kind of potential food additive

produced by Streptomyces coelicolor: Characteristics of blue pigment and identification of a

novel compound, λ-actinorhodin. Food Chemistry, v. 95, n. 2, p. 186-192, 2006.

VOLP, Ana Carolina Pinheiro; RENHE, Isis Rodrigues Toledo; STRINGUETA,

Paulo César. Pigmentos naturais bioativos. Alimentos e Nutrição Araraquara, v. 20, n. 1, p.

157-166, 2009.

Produção de pigmentos fúngicos e seu uso no tingimento de ... · Andréa Faria, Gicele de...

Documents

Transcript of Produção de pigmentos fúngicos e seu uso no tingimento de ... · Andréa Faria, Gicele de...