Obtenção de um antígeno para Ensaio Imunoenzimático (ELISA ...
Priscila Carmona Papel da resposta celular antígeno-específica na ...
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Priscila Carmona
Papel da resposta celular antgeno-especfica na
tolerncia operacional
Dissertao apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias
Programa Alergia e Imunopatologia Orientadora: Vernica Porto Carreiro de Vasconcellos Coelho
So Paulo 2016
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Priscila Carmona
Papel da resposta celular antgeno-especfica na
tolerncia operacional
Dissertao apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias
Programa Alergia e Imunopatologia Orientadora: Vernica Porto Carreiro de Vasconcellos Coelho
So Paulo 2016
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Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)
Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo
reproduo autorizada pelo autor
Carmona, Priscila Papel da resposta celular antgeno-especfica na tolerncia operacional / Priscila
Carmona. -- So Paulo, 2016.
Dissertao(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Programa de Alergia e Imunopatologia.
Orientadora: Vernica Porto Carneiro de Vasconcelos Coelho. Descritores: 1.Transplante de rim 2.Tolerncia ao transplante 3.Rejeio de
enxerto 4.Linfcitos T 5.Citocinas 6.Antgenos 7.Citomegalovrus 8.Chaperonina 60
USP/FM/DBD-282/16
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Agradecimentos Deus, por tudo!!!!!
Este trabalho foi realizado com muito amor e dedicao, portanto,
agradeo imensamente pela considerao e confiana que me foi dada,
obrigada pela colaborao e apoio das pessoas envolvidas como os
profissionais (pesquisadores, doutores, mestres e tcnicos), pacientes, amigos
e famlia.
Agradeo as pessoas mais importantes da minha vida, os meus pais,
Carme e Roberto, pelo incentivo, compreenso, cuidado, ajuda, auxlio
(financeiro, psicolgico e sentimental), amor, enfim, por estarem ao meu lado
em todos os momentos. Aos meus irmos Binho e Paulinho e minhas cunhas
Jenny e Tami, por serem to especiais, cuidarem de mim e por me darem fora
em todos os momentos, tambm perfeita princesa mais linda do universo, a
Alicia, por trazer mais brilho s nossas vidas. melhor amiga, minha linda e
querida irm, Pati no tenho palavras para dizer o quanto voc especial e o
quanto sou grata por tudo o que voc , fez e faz por mim. Obrigada pelos
choros e risos, tambm por ir ao lab comigo no Natal, Ano Novo, buscar
amostras no Aeroporto tarde da noite me acompanhando at de madrugada,
obrigada por me ouvir, me ajudar de todas as formas, tanto monetariamente,
quanto psicologicamente, voc sensacional. Minha famlia, a mais linda e
especial do universo, meu porto seguro, amo muito vocs, com todas as
minhas foras e de todo meu corao!!!!
Meu amor, lindo Edu, obrigada por ser to companheiro, amigo e
incentivador, estando sempre ao meu lado me amando e cuidando de mim, Te
amo muito!!!!
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A minha famlia em geral, os Carmonas, Souzas, Miyamotos e Higashis,
especialmente V Nilza, D. Wanda, Karla, Yuki, Eli e Su pelas oraes,
estudos, companheirismo e amizade.
Enfim, so tantas pessoas especiais em minha vida, que cometeria
grave erro por no colocar todos os nomes aqui, alm disso, os
agradecimentos seriam poucos para o tanto que vocs merecem.
Muito obrigada Veronica, minha orientadora querida, que me inseriu e
me guiou no complexo universo da cincia e pesquisa, me fazendo pensar (ir
alm do que os olhos possam ver), ter vontade de prosseguir, dando
tranquilidade nos momentos de desespero, pela motivao, pacincia e
disponibilidade. Sem voc nada disso aconteceria.
Ao Prof. Kalil por me receber to bem no laboratrio, pela oportunidade,
dicas, discusses cientficas e ensinamentos muito construtivos.
Aos pesquisadores Prof. Edcio Cunha-Neto e Dra Luiza Guilherme,
pela disponibilidade, sugestes e discusses intelectuais.
A Yordanka, por estar ao meu lado, pelo paper e auxlio quando
estvamos sem a Ve.
Ao grupo TX, pela amizade, compreenso e auxilio, sem dvida nos
tornamos uma famlia: San (forte e guerreira), Janinha (paciente, encorajadora,
obrigada pelas mensagens de incentivo, pelos whats de preocupao, por me
ajudar nas correes, pelo carinho), Madacita (alegre e prestativa, chegar de
manhazinha e te ver sempre me dava alegria), Amandinha (minha amiga
verdadeira e companheira dentro e fora do lab, voc foi sempre sensacional
para comigo, sua linda), Dani (sempre preocupada e empolgada, a doceira
mais talentosa), Jamile (nova amiga, forte e guerreira), Maluzinha, Marici,
-
Gege, Dashnna, todos vcs moram em meu corao, obrigada pelas
discusses, por me ouvirem e cuidarem de mim nos momentos difceis.
Tambm, agradeo a amizade e carinho das pessoas especiais que passaram
pelo grupo: Ana C., Ana P., Andy, Helen, Pri Tedesco, Marcus e Gabizinha, vcs
deixaram a marquinha, so muito especiais para mim.
Aos meus amigos queridos: Moni, Fezinha (pela disponibilidade em
ajudar sempre), Van, Karla, Isa, Li, Carlo, Darlan. A Rose pelos conselhos,
experincias vividas, berinjelas no dueto, amizade, toques e aos nossos
momentos de choros e risos que nos fizeram to bem.
Ao pessoal dos grupos do lab bioqumica (Dia Kuramoto (sempre que
precisava vc estava disposta a ajudar), Maris, Ludy, Hamendra, Amanda), FR
(Samar, Selminha, Simoninha, Karen, Raquel, Edil, Luis, Washington, Fred). Ao
pessoal animado do HLA (Dr. Helcio, Dr. Nicholas, Carlos S., Gis e R
(obrigada por me acudirem nos momentos de desespero e sempre me darem
fora), K, Lilian, Mario, Olguinha, San, Fe, Cami, Fi, Carol, Celinha, Marcelo,
Ger, Dia, Clod, Clau, Su).
A todos os alunos e amigos da ps, nossas reunies de quinta sempre
muito produtivas, obrigada tambm pela disponibilidade em apresentarem nas
reunies.
Aos fofos e companheiros Rainha, Laininha e Clecl, pelos nossos
almoos, conversas, amizade, palavras de conforto, docinhos, mimos, risadas
e carinho.A turma da diretoria Soninha, Sr. Jair, Fe Alegria e Paulo, essa
equipe forte, por serem sempre prestativos e compreensivos.
As meninas da limpeza por deixarem tudo sempre cheiroso e limpinho.
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A equipe da ps, como o Prof. Esper e a Eleni (muito fofa e prestativa,
obrigada por toda ajuda), por sempre nos darem suporte. A toda a galera do
LIM60 e a Carol (do luminex, pela disponibilidade e compreenso sempre),
pelos socorros quando precisvamos.
Ao pessoal do Projeto Imunologia nas Escolas (Paulo, Silvia, Sandra,
Dani, Monica) pela fora, discusses, aulas e idas na escola, foi muito bom
trabalhar com vocs.
Com muito carinho, ao Dr. Pedro por cuidar dos meus olhinhos, a Dra
Dbora por cuidar das minhas dores e a Gabi, por me chamar nos concursos.
Vocs foram e so bnos para mim.
Agradeo tambm Faculdade de Medicina da USP (pela abertura das
portas, pela educao de qualidade) Capes (pelos dois anos de bolsa), a
equipe dos outros centros de estudo por sempre fornecerem as amostras,
especialmente Amanda (da UEL), Dr. David S., e as meninas da UTR, pelo
recrutamento e telefonema aos indivduos participantes do estudo. E um super
obrigado a todos os indivduos que participaram deste projeto, nos quais
utilizamos as suas clulas, que Deus cuide de cada um, dando foras e sade,
sem estas pessoas, nosso trabalho no seria possvel.
Desculpe-me se esqueci algum, mas agradeo de todo corao a todos
do lab, e aqueles que estiveram em minha vida nestes momentos de luta,
alegrias, tristeza e desespero, sofrimentos, novidades, sabendo que, apesar de
tudo isso, estamos firmes e fortes prontos para o prximo desafio, com muita f
e amor!
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Sumrio Lista de Figuras................................................................................................................i
Lista de Tabelas...............................................................................................................ii
Resumo...........................................................................................................................iii
Abstract...........................................................................................................................iv
1. Introduo................................................................................................................1
2. Objetivo..................................................................................................................25
2.1 Objetivo geral...................................................................................................25
2.2 Objetivos especficos........................................................................................25
3. Material e Mtodos.................................................................................................26
3,1 Delineamento experimental..............................................................................26
3.2 Sujeitos de pesquisa........................................................................................27
3.3 Material coletado..............................................................................................28
3,4 Obteno de clulas mononucleadas do sangue perifrico.............................29
3.5 Congelamento e descongelamento de clulas.................................................30
3.6 Marcao celular com CFSE............................................................................31
3.7 Seleo de peptdeos.......................................................................................32
3.8 Cultura celular com antgenos para coleta de sobrenadante para citocinas e ensaio de proliferao............................................................................................35
3.9 Ensaio de proliferao celular de subpopulaes CD4+ T regs, efetoras e de memria efetora frente aos antgenos....................................................................36
3.10 Marcao intracelular para Foxp3..................................................................38
3.11 Aquisio de estratgia de anlise das diferentes subpopulaes CD4+ T reg, efetora e de memria efetora..........................................................................39
3.12 Extrao de DNA e tipificao HLA................................................................42
3.13 determinao da produo de citocinas nos sobrenadantes de cultura frente aos diferentes antgenos, por Luminex................................................................44
3.14 Anlise dos resultados considerando respostas do tipo REGULA ou INFLAMA................................................................................................................45
3.15 Testes estatsticos..........................................................................................47
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4. Resultados..............................................................................................................49
4.1 Produo de citocinas REGULA e INFLAMA frente a estmulos com antgenos de diferentes origens: alogeneicos, derivados de um microrganismo patognico, e autlogo..................................................................................................................49
4.1.1 Produo espontnea de citocinas (REGULA e INFLAMA), nos diferentes grupos clnicos................................................................................50
4.1.2 Aloantgenos: produo de citocinas REGULA e INFLAMA frente a peptdeos derivados de molculas HLA-DR alogeneicas, nos diferentes grupos clnicos.................................................................................................58
4.1.3 Antgenos de microrganismo patognico: produo de citocinas REGULA e INFLAMA frentea peptdeos do CMV, nos diferentes grupos clnicos.............................................................................................................66
4.1.4 Autoantgenos: produo de citocinas REGULA e INFLAMA frente a peptdeos da Hsp60, nos diferentes grupos clnicos.......................................71
4.2 Resposta celular proliferativa de diferentes subpopulaes de linfcitos T REGULA e INFLAMA, dirigida a antgenos alogeneicos, antgenos derivados de um microrganismo patognico e antgenos autlogos.........................................89
4.2.1 Proliferao espontnea de diferentes subpopulaes de linfcitos T CD4+ REGULA e INFLAMA nos diferentes grupos clnicos.........................92
4.2.2 Alorreatividade: resposta proliferativa de diferentes subpopulaes de linfcitos T REGULA e INFLAMA, dirigida a peptdeos HLA-DR, nos diferentes grupos clnicos..............................................................................96
4.2.3 Antgeno d microrganismo patognico: resposta proliferativa de diferentes subpopulaes de linfcitos T (REGULA e INFLAMA) dirigida a peptdeos do CMV, nos diferentes grupos clnicas.....................................103
4.2.4 Autorreatividade: resposta proliferativa de diferentes subpopulaes de linfcitos T (REGULA e INFLAMA, dirigida a peptdeos da Hsp60, nos diferentes grupos clnicos............................................................................112
5. Discusses............................................................................................................126
6. Concluses...........................................................................................................150
7. Referncias bibliogrficas.....................................................................................154
ANEXO 1. Tabelas dos dados clnicos e demogrficos dos sujeitos de pesquisa...172
ANEXO 2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.........................................180
ANEXO 3. Aprovao do Comit de tica para Anlise de Projetos de Pesquisa CAPPesq..............................................................................................................185
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Lista de Figuras Figura 1: Delineamento experimental...........................................................................26 Figura 2: Clulas em proliferao.................................................................................39 Figura 3: Estratgia de anlise para a subpopulao de clulas T reguladoras
(CD4+CD25+CD127-Foxp3+)..........................................................................41 Figura 4: Estratgia de anlise para a subpopulao de clulas T efetoras
(CD4+CD28+CD127+CD45RA-CD27-)...........................................................41 Figura 5: Estratgia de anlise para a subpopulao de clulas T de memria efetora
(CD4+CCR7-CD27-CD45RA-)........................................................................42 Figura 6: Produo Espontnea de citocinas TOxRC e TOxSAU.............................53 Figura 7: Produo Espontnea de citocinas REGULA IL-4, IL-5, IL-7 e IL-10...........55 Figura 8: Produo Espontnea de citocinas predominantemente REGULA (em azul)
IL-13, sem perfil predominantemente Regula, nem Inflama, a IL-2 e citocinas predominantemente INFLAMA (vermelho) IL-1B, IL-6, IL-8 e IL-12................................................................................................................56
Figura 9: Produo Espontnea de citocinas predominantemente INFLAMA IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFN-y, TNF, MCP-1 e MIP-1B............................................57
Figura 10: Peptdeos HLA-DR alo do doador. Citocinas Regula e Citocinas Inflama TOxRC e TOxSAU......................................................................................61
Figura 11: Efeitos de peptideos HLA-DR-alo na produo de citocinas IL-4 e IL-10 - TOxRC........................................................................................................63
Figura 12: Efeitos de peptideos HLA-DR-alo na produo de citocinas IL-4, G-CSF e IFN-y - TOxRC............................................................................................64
Figura 13: Efeitos de peptideos HLA-DR-alo na produo de citocinas IL-4 e IL-10 - TOxSAU......................................................................................................65
Figura 14: Peptdeos CMV. Citocinas Regula e Citocinas Inflama TO, RC, SAU.....69 Figura 15: Efeitos de peptideos CMV na produo de citocina IFN-y TOxRC..........70 Figura 16: Peptdeo auto N6. Citocinas Regula e Citocinas Inflama TO, RC, SAU..74 Figura 17: Peptdeos auto N7. Citocinas Inflama TOxSAU e RCxSAU.....................81 Figura 18: Peptdeo auto C9. Citocinas Inflama - TO, RC, SAU.................................85 Figura 19: Produo citocinas IL-10 e MCP-1 frente ao estmulo com o peptdeo C9 -
TOxRC........................................................................................................87 Figura 20: Produo de citocina IL-2 frente ao estmulo com o peptdeo C9
TOxSAU.....................................................................................................88 Figura 21: Clulas T reguladoras (CD4+ CD25+ CD127- FOXP3+)...............................89 Figura 22: Clulas T efetoras (CD4+CD27- CD28+ CD45RA- CD127+).........................90 Figura 23: Clulas T de memria efetora (CD4+ CCR7- CD27- CD45RA-)...................90 Figura 24: Proliferao de linfcitos T CD4+, e as condies com estmulo e
estimulada com anti-CD3............................................................................91 Figura 25: Proliferao Espontnea TOxRC e TOxSAU...........................................94 Figura 26: Proliferao Espontnea das diferentes subpopulaes celulares de clulas
T CD4+........................................................................................................95 Figura 27: Porcentagem de clulas CD4+ T reguladora (CD25+CD127-Foxp3+). Pep
DR...............................................................................................................99 Figura 28: Porcentagem de clulas CD4+ T Efetora (CD28+CD27-CD45RA-CD127+).
Pep DR.....................................................................................................101 Figura 29: Porcentagem de clulas CD4+ T Memria Efetora (CD27-CCR7-CD45RA-).
Pep DR.....................................................................................................102 Figura 30: Peptdeo CMV. Populao Reguladora TO, RC, SAU...........................106 Figura 31: Peptdeos CMV. Populao Efetora TOxRC e TOxSAU........................107
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Figura 32: Porcentagem de clulas CD4+ T reguladora (CD25+CD127-Foxp3+). Pep CMV..........................................................................................................109
Figura 33: Porcentagem de clulas CD4+ T Efetora (CD28+CD27-CD45RA-CD127+). Pep CMV...................................................................................................110
Figura 34: Porcentagem de clulas CD4+ T Memria Efetora (CD27-CCR7-CD45RA-). Pep CMV...................................................................................................111
Figura 35: Porcentagem de clulas CD4+ T reguladora (CD25+CD127-Foxp3+). Pep N6.............................................................................................................115
Figura 36: Porcentagem de clulas CD4+ T Efetora (CD28+CD27-CD45RA-CD127+). Pep N6......................................................................................................116
Figura 37: Porcentagem de clulas CD4+ T Memria Efetora (CD27-CCR7-CD45RA-). Pep N6......................................................................................................117
Figura 38: Peptdeo auto N7. Populaes Reguladora e Efetora TO, RC, SAU.....120 Figura 39: Porcentagem de clulas CD4+ de diferentes subpopulaes em
proliferao, ou que sofreram inibio de proliferao espontnea na presena de peptdeo N7..........................................................................121
Figura 40: Peptdeo alo C9. Populaes Efetoras TO, RC, SAU............................124 Figura 41: Porcentagem de clulas CD4+ de diferentes subpopulaes em
proliferao, ou que sofreram inibio de proliferao espontnea na presena de peptdeo C9..........................................................................125
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Lista de Tabelas Tabela 1: Dados clnicos nos diferentes grupos de estudo..........................................29 Tabela 2: Seleo dos peptdeos HLA-DR alo dos sujeitos de pesquisa dos diferentes
grupos de estudo........................................................................................33 Tabela 3: Sequncias dos peptdeos HLA-DR sintticos utilizados.............................34 Tabela 4: Sequncias dos peptdeos da protena Hsp60 humana selecionados.........35 Tabela 5: Anticorpos utilizados (o respectivo fluorforo e a sua titulao)...................37 Tabela 6: Fentipo das diferentes subpopulaes celulares CD4+..............................38 Tabela 7: Citocinas analisadas potencialmente reguladoras e inflamatrias...............45 Tabela 8: Produo espontnea de citocinas nos diferentes grupos clnicos.........51-52 Tabela 9: Efeito do aloantgeno - HLA-DR -alo na induo e/ou inibio da produo
de citocinas............................................................................................59-60 Tabela 10: (Continuao): Efeito do peptdeo de microrganismo patognico - CMV - na
induo e/ou inibio da produo de citocinas...................................67-68 Tabela 11: Efeito do autoantgeno - Pep-N6 (Hsp60) - na induo e/ou inibio da
produo de citocinas...........................................................................72-73 Tabela 12: Efeito do autoantgeno - Pep-N7 (Hsp60) - na induo e/ou inibio da
produo de citocinas............................................................................78-79 Tabela 13: Efeito do autoantgeno - Pep-C9 (Hsp60) - na induo e/ou inibio da
produo de citocinas............................................................................83-84 Tabela 14: Porcentagem de Proliferao Espontnea de clulas CD4 de diferentes
fentipos nos diferentes grupos clnicos de estudo...............................92-93 Tabela 15: Porcentagem de proliferao de clulas CD4 com diferentes fentipos
frente ao estmulo com o peptdeo HLA-DR nos diferentes grupos clnicos de estudo...............................................................................................97-98
Tabela 16: Porcentagem de proliferao de clulas CD4 com diferentes fentipos frente ao estmulo com o peptdeo CMV nos diferentes grupos clnicos de estudo..............................................................................................104-105
Tabela 17: Porcentagem de proliferao de clulas CD4 com diferentes fentipos frente ao estmulo com o peptdeo N6 da HSP60 nos diferentes grupos clnicos de estudo..............................................................................113-114
Tabela 18: Porcentagem de proliferao de clulas CD4 com diferentes fentipos frente ao estmulo com o peptdeo N7 da HSP60 nos diferentes grupos clnicos de estudo..............................................................................118-119
Tabela 19: Porcentagem de proliferao de clulas CD4 com diferentes fentipos frente ao estmulo com o peptdeo C9 da Hsp60 nos diferentes grupos clnicos de estudo..............................................................................122-123
Tabela 20: Dados clnicos e demogrficos dos indivduos do grupo TO...................175 Tabela 21: Histrico clnico dos indivduos do grupo TO (IS/ Infeces e
Comorbidades).........................................................................................176 Tabela 22: Dados clnicos e demogrficos dos indivduos do grupo RC....................177 Tabela 23: Histrico clnico dos indivduos do grupo RC (IS/ Infeces e
Comorbidades)..................................................................................178-179 Tabela 24: Dados clnicos e demogrficos dos indivduos do grupo EST..................180 Tabela 25. Histrico clnico dos indivduos do grupo EST (IS/ Infeces e
Comorbidades).................................................................................181-182
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Resumo
Carmona, P. Papel da resposta celular antgeno-especfica na tolerncia operacional. [Dissertao]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2016.
A tolerncia operacional (TO) um raro fenmeno que ocorre em
indivduos transplantados, que permanecem com funo estvel do aloenxerto,
sem rejeio, aps a suspenso de drogas imunossupressoras, por pelo
menos um ano. A compreenso de mecanismos envolvidos na tolerncia
operacional poder contribuir para a elaborao de novas terapias
imunorreguladoras, na clnica do transplante. Investigamos se, no estado de
tolerncia operacional, h um perfil funcional diferencial de resposta imune
celular antgeno-especfica, dirigida a trs grupos de antgenos relevantes no
alotransplante: aloantgenos do doador (peptdeos HLA-DR), antgenos de
patgenos (peptdeos do CMV citomegalovrus) e autoantgenos (peptdeos
da Hsp60 Protena de choque trmico 60, com funes imunolgicas,
imunorreguladora (REGULA) e pr-inflamatria (INFLAMA). Analisamos a
produo de citocinas (por Luminex) e a proliferao de diferentes
subpopulaes de clulas T CD4+ (por FACS), com funes,
predominantemente, REGULA ou INFLAMA, frente aos trs tipos de antgenos,
comparativamente entre TO (n=6) e Rejeio Crnica (RC: n=8), indivduos
com funo estvel do enxerto, usando imunossupressores (EST: n=8) e
indivduos saudveis (SAU: n=7). Em concordncia com nossa hiptese, a
resposta celular modulada, de forma diferencial, na tolerncia operacional,
ocorrendo um desvio funcional da resposta a peptdeos HLA-DR do doador
para um perfil REGULA, enquanto preservado o perfil INFLAMA na resposta
a peptdeos do patgeno (CMV). Apesar das diferenas nas respostas aos
peptdeos do CMV entre TO e RC (p=0,02 e p=0,02 para citocinas e
subpopulaes regula e p=0,008 e p=0,003 para citocinas e subpopulaes
inflama), houve preservao do perfil INFLAMA na TO, em relao ao estado
fisiolgico, com induo/aumento das citocinas inflamatrias IL-1B, IL-17, IFN-
y, MCP-1 e MIP-1B, com algum grau de inibio de citocinas
imunorreguladoras, e inibio da proliferao de clulas Tregs, sugerindo
-
serem importantes mecanismos na preservao da imunocompetncia, na
tolerncia operacional. Na resposta celular a autoantgenos, destacamos o
peptdeo N6 que induziu um perfil significativamente diferente na TO (mais
REGULA), em relao RC (mais INFLAMA) (p=0,001 para citocinas regula;
p=0,04 para citocinas inflama), principalmente pelo aumento/induo da
produo de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, na TO, sugerindo que o peptdeo N6
possa ter uma contribuio nos mecanismos na TO, favorecendo a produo
dessas citocinas com atividade imunorreguladora. Considerando a diferena
significativa do perfil funcional de resposta aos aloantgenos do doador entre
TO (REGULA) e RC (INFLAMA) (p=0,0007 para citocinas regula e p
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Abstract
Carmona, P. The role of antigen-specific cellular response in operational tolerance. [Dissertation]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2016
Operational tolerance (OT) is a rare phenomenon, taking place in
transplanted individual who do not reject, following the complete withdrawal of
immunosuppressive drugs for at least one year. Understanding the mechanisms
involved in operational tolerance will contribute to opening new pathways for the
development of novel immunoregulatory therapies, in transplantation. We
investigated whether the state of operational tolerance displays a functionally
differential profile of the antigen-specific cellular response, directed to three
groups of antigens, relevant in the context of allotransplantation: donor
alloantigens (HLA-DR peptides), pathogen-derived antigens (cytomegalovirus
peptides - CMV) and autoantigens (peptides derived from the Hsp60 self-
antigen displaying immunoregularory (REG) and proinflammatory (INFLAMMA)
properties). We determined cytokine production (by Luminex) and the
proliferative response of different CD4+ T cell subsets (by FACS), displaying
predominantly REG or INFLAMMA activities, in response to the three types of
antigens, comparing OT (n=6) with Chronic Rejection (CR: n=8), individual with
stable graft function, taking conventional immunosuppression (Sta: n=8), and
healthy individuals (HI: n=7). In concordance with our hypothesis, the cellular
immune response is differentially modulated in operational tolerance, giving rise
to an immunoregulatory deviation in the response to HLA-DR donor peptides,
preserving the proinflammatory response to pathogen peptides (CMV). Despite
significant differences in the responses to CMV peptides, between OT and CR
(p=0.02 and p=0.02 for REG cytokines and CD4+ subsets; p=0.008 and
p=0.003 for INFLAMMA cytokines and CD4+ subsets), OT is able to preserve
the INFLAMMA response in relation to the physiologic state (HI). This
INFLAMMA profile of the response to CMV peptides is maintained by the
induction/increase of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-17, IFN-, MCP-1
and MIP-1B, some inhibition of REG cytokines and inhibition of Treg
proliferation, suggesting that these are important mechanisms in the
-
preservation of immunocompetence to deal with pathogens, in OT. In the
cellular response to autoantigens, we highlight the N6 peptide that induced a
differential profile in OT (REG profile) compared to CR (INFLAMMA profile)
(p=0.001 for REG cytokines; p=0.04 for INFLAMMA cytokines), due to the
induction/increase of IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, in OT, suggesting that N6 may
contribute to the underlying mechanisms in OT, favoring the production of these
immunoregulatory cytokines. Taken the marked differences in the response to
donor alloantigens, between OT (predominantly REG) and CR (predominantly
INFLAMMA) (p=0.0007 for REG cytokines and p
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1
1. Introduo
Imunobiologia do Transplante
O transplante de rgo uma importante modalidade teraputica capaz
de substituir tecidos ou rgos com falncia irreversvel. Na clnica, dentre os
vrios transplantes de rgos, o mais frequente o transplante renal. No Brasil,
no perodo de 2005 a 2015, cerca de 90% dos transplantes realizados foram de
rim (ABTO, 2015).
Pode-se dizer que grande parte do conhecimento existente sobre a
imunobiologia dos transplantes, d-se pelos estudos envolvendo transplante
renal. Grandes avanos foram dados na clnica para manter a funo do
enxerto a longo prazo, mas a despeito disso muitos desafios clnicos persistem,
e um destes e a rejeio (Nankivell e Kuypers, 2011).
A rejeio do rgo consiste na deteriorao funcional e estrutural do
enxerto podendo culminar na perda completa de sua funo (Lechler et al.,
2003). Aps o transplante, o processo cirrgico j promove um microambiente
inflamatrio, logo aps uma intensa atividade inflamatria estabelecida
decorrente da interao do linfcito T e seu receptor (TCR, do ingls, T cell
receptor) com as molculas de MHC (complexo principal de
histocompatibilidade, do ingls, major histocompatibility complex) (Watts,
1997).
Em humanos, as molculas MHC so chamadas de antgenos
leucocitrios humanos (HLA do ingls, Human Leukocyte Antigens) que so os
principais antgenos polimrficos contra os quais est dirigida, a resposta
alogeneica. Os genes que fazem parte do sistema HLA em humanos localizam-
-
2
se no cromossomo 6, tendo, assim, uma variabilidade muito grande entre
indivduos. As molculas do sistema HLA so classificadas em classe I (HLA-A,
B e C) que so expressas por clulas nucleadas, e molculas de classe II que
so expressas, principalmente, em clulas apresentadoras de antgeno (APCs,
do ingls, Antigen Presenting Cells), (HLA-DR, DP e DQ) (Krensky et al., 1990;
Mandelbrot, 2010) ou em clulas ativadas que expressam MHC classe II, aps
expostas a citocinas como o IFN-y, como por exemplo, as clulas endoteliais e
linfcitos T (Mandelbrot, 2010).
As molculas HLA so os principais alvos de reconhecimento antignico
pelos linfcitos T. Assim, quando doador e receptor no apresentarem as
mesmas molculas HLA, o receptor reconhece as molculas do doador,
culminando na ativao do sistema imune, o que desencadeia respostas
inflamatrias dirigidas ao enxerto (Rapaport et al., 1965, Muller et al., 2011),
levando rejeio do rgo transplantado, se o sistema imune no for
suprimido (Klein J. et al., 2000; Almoguera, B. et al., 2014).
Apesar das molculas HLA do doador, expressas na superfcie celular do
aloenxerto, serem os principais alvos de reconhecimento pelos linfcitos T
importante destacar que a alorreatividade tambm pode induzir uma resposta
imune com perfil imunorregulador, como descrito para a via indireta de
alorreconhecimento, por nosso grupo (Spadafora-Ferreira et. al., 2001) e por
outros (Waaga et. al., 2001).
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Mecanismos da rejeio
A rejeio no transplante renal mediada por diversos mecanismos e
componentes imunolgicos. Ela classificada de acordo com critrios
adotados em Banff, em funo de alteraes histopatolgicas e fatores
imunolgicos envolvidos (Solez et al., 2007). A rejeio pode ser classificada
como aguda ou crnica, mediada por clulas T ou por anticorpos (Solez et al.,
2007; Haas et al., 2013).
A rejeio aguda mediada por anticorpos ocorre quando h anticorpos na
circulao de receptores, com especificidade para antgenos expressos nas
clulas do enxerto. A ligao desses anticorpos s clulas-alvo desencadeia a
ativao do sistema complemento, cascata de coagulao, das cininas que
levam trombose e necrose do tecido (Magee, C. C., 2006; Wahrmann et al.,
2006). H relatos de indivduos que possuem anticorpos dirigidos ao
aloenxerto, no fixadores de complemento, possuem um prognstico
semelhante aos indivduos sem anticorpos dirigidos ao aloenxerto (Cornell et
al., 2008), sugerindo que a ativao do sistema complemento determina um
pior prognostico do transplante. A rejeio aguda mediada por clulas T,
caracterizada por clulas infiltrantes no rgo, inflamao monoctica e
linfocitria, ativao e proliferao de clulas T auxiliares o que leva leso
tecidual e necrose (Kindt, 2007). Esse tipo de rejeio, em geral, responde bem
s terapias imunossupressoras.
Mesmo com avanos laboratoriais e o desenvolvimento de novas terapias
imunossupressoras, a rejeio crnica (RC) a maior limitao para o sucesso
do transplante alogeneico de rgos (Nankivell et al., 2003). Ademais, como
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citado anteriormente, em pacientes transplantados com rejeio crnica,
tumores e as infeces so mais frequentes devido ao uso de
imunossupressores (Toungouz et al., 2003).
No transplante renal a rejeio crnica mediada por anticorpos, pode
apresentar depsitos de C4d (um produto da degradao do componente C4
da via clssica do complemento), nos capilares peritubulares e nas alas dos
capilares do glomrulo, podendo ocorrer tambm a presena de anticorpos
doador especficos no soro. Na rejeio crnica mediada por clulas T, h
presena de fibrose intersticial, infiltrado mononuclear e atrofia tubular,
infiltrao com clulas mononucleares, inflamao intersticial, fibrose e
glomerulonefrite (Solez et al., 2007).
O que diferencia a fase aguda da crnica, a formao de fibrose
levando perda da funo do rgo ou tecido (Ibrahim et al., 1995). Alm
disso, ambos os mecanismos celulares e humorais podem existir, ao mesmo
tempo, no processo de agresso do enxerto. Os mecanismos efetores da
rejeio incluem, principalmente, a citotoxicidade mediada por linfcitos T ou
dependentes de anticorpos, produo de citocinas e sua ao ltica devido ao
recrutamento de clulas inflamatrias, ativao do complemento, e reao de
hipersensibilidade tardia (Cai e Terasaki, 2005; Coelho & Kalil, 2009), entre
outros.
importante lembrar que, diante de intensas respostas inflamatrias ao
longo da vida, o sistema imune possui mecanismos reguladores essenciais na
manuteno da homeostase do organismo (Monk et al., 2006; Rowe et al.,
2006). Na alorreatividade devido ao intenso estmulo inflamatrio
desencadeado pelo enxerto h um desequilbrio dessas respostas reguladoras,
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sendo necessrio o uso de drogas imunossupressoras para manuteno da
sobrevida enxerto.
As drogas imunossupressoras disponveis, atualmente, so capazes de
inibir a rejeio aguda, suprimindo a resposta mune inflamatria, entretanto,
pouco controlam o desenvolvimento da rejeio crnica, alm de causarem
efeitos colaterais significativos como, desordens metablicas, mielossupresso
e nefro e cardiotoxicidade (Demirkiran et al., 2008), alta suscetibilidade a
infeces (Fishman & Rubin, 1998), malignidades (Dantal et al., 1998; Hojo et
al., 1999).
Entre as principais drogas imunossupressoras esto: a ciclosporina A e o
tacrolimus que, alm de agir inibindo a atividade da calcineurina, podem causar
efeitos adversos como nefrotoxicidade e hipertenso arterial (Nankivell et al.,
2004). O mofetil micofenolato e a azatioprina que tm ao inibidora de IMPDH
(enzima inosinomonofosfato-desidrogenase), mas apresentam efeitos como
mielossupresso. Os corticosterides afetam a concentrao e funo de
leuccitos; a rapamicina inibe a transcrio de RNA mensageiro, mas pode
causar problemas de cicatrizao, hiperlipidemia (Borie et al., 2004), alm de
afetar a qualidade de vida do indivduo transplantado. Tambm so usados no
transplante renal, imunobiolgicos, como o ATG (globulina anti-timocitria) e o
anticorpo monoclonal anti-CD3 (Mota et al., 2009). Permanece o desafio de
minimizar os efeitos colaterais das drogas imunossupressoras (Danger et al.,
2008) e proporcionar esquemas com menores doses (Page et al., 2012).
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Imunorregulao no Transplante
Aps o estmulo dos linfcitos pelos antgenos do doador, as clulas
estimuladas polarizam seu perfil para atividades pr-inflamatria ou
imunorreguladora. Com a polarizao do perfil celular ocorre maior ou menor
produo de citocinas associadas ao perfil celular adotado. importante
destacar que os linfcitos Th diferenciam-se em subpopulaes que so
capazes de produzir diferentes citocinas e, exercerem funes auxiliares
distintas. importante destacar que linfcitos T com outras especificidades
antignicas, inclusive dirigida a autoantgenos, como as Hsps, so recrutados e
podem participar da resposta imune ao alotransplante (Caldas et al., 2006).
As citocinas so protenas de baixo peso molecular produzidas por
diferentes tipos de clulas e que agem de maneira autcrina, parcrina e
endcrina, sendo frequentemente envolvidas na propagao e controle da
resposta imunolgica (Tonet e Nobrega, 2008). Elas so peas chave no
processo de comunicao celular, e no transplante possuem papel, por vezes,
predominantemente inflamatrio. Na presena das citocinas IL-2, IL-18 e TNF-
, as APCs, os linfcitos T ativados e clulas NK levam ao aumento de clulas
Th1 que so clulas envolvidas com respostas inflamatrias exacerbadas
(Cardoni et al., 2005)
Citocinas pr-inflamatrias, como por exemplo: interleucina-1 (IL-1),
interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), fator de necrose tumoral (TNF-),
interferon- (IFN-), interleucina-2 (IL-2) e quimiocinas so descritas como
indutoras do aumento do processo inflamatrio (Belotto, 2011) estando
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relacionadas rejeio aguda, fibrose intersticial, atrofia celular e infeces
(Cardoni et al., 2005).
Foi observado em enxertos renais com rejeies agudas, maior
expresso de citocinas com perfil predominantemente Inflama MCP-1/CCL2 e
CCR5 (receptor celular de RANTES, MIP-1 e MIP-1) na regio tbulo
intersticial justacortical (Robertson, 2000; Ruster et al, em 2004), tambm,
maior expresso de IL-6 (Oliveira, 1997) e MCP-1/CCL2 (Robertson, 2000).
Em contrapartida s pro-inflamatrias, as citocinas anti-inflamatrias so
caracterizadas por atuarem na diminuio do processo inflamatrio, pela
inibio de citocinas pr-inflamatrias, dentre elas destacam-se: a interleucina-
4 (IL-4), interleucina-10 (IL-10), interleucina-13 (IL-13), assim como, o receptor
antagonista da IL-1 (IL-1ra) (Belotto, 2011).
As citocinas podem apresentar diversos papeis biolgicos na biologia do
transplante renal, tais como, comunicao celular, recrutamento, diferenciao
e ativao de diversos subtipos celulares (Hu e Knetchle, 2006).
As clulas T CD4+ so um grupo heterogneo, funcionalmente, que
apresentam diversas populaes distintas (Mosmann et al., 1986). Em estudos
iniciais, foi descrito que clulas T naives no produziam IL-4, no entanto, ao
serem estimuladas pelo receptor de clula T (TCR, do ingls Tcell receptor) na
presena de IL-4, podiam torna-se produtoras dessa citocina (Killar et al., 1987;
Le Gros et al., 1990). A diferenciao de clulas T CD4+ auxiliares (Th, do
ingls T helper cells), para um perfil Th2, pela ao de IL-4, e diferenciao de
clulas Th1 pela ao de IL-12, parecia bem estabelecida. No entanto,
observou-se que a citocina IL-12 induzia uma produo de IFN-y, mediada pela
expresso de T-bet (um fator de transcrio), levando ao aumento na produo
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de IFN-y, cuja neutralizao diminui a diferenciao de clulas para um perfil
Th1 (Szabo et al., 2000; Lighvani et al., 2001).
As clulas T CD4+ so importantes na rejeio de enxertos alogeneico
(Krieger et al., 1996; Zhao et al., 2000). A participao de clulas T CD4+
intensificada quando h disparidade no MHC de classe II entre o receptor e o
doador, assim como as clulas T CD8+ participam da rejeio mediada por
disparidades no MHC classe I, em relao a alorreatividade pela via direta
(Rosenberg et al.,1987; Christianson et al., 1993).
As populaes de clulas T podem ser caracterizadas em subpopulaes
com diferentes funes, como clulas T reguladoras (CD25+CD127-Foxp3+),
efetoras (CD28+CD127+CD45RA-CD27-), clulas T naive (CD45RA+CD62L+) e
de memria: memria central (CCR7+CD27+CD45RA-); memria efetora
(CCR7-CD27-CD45RA-) e memria efetora altamente diferenciada - TEMRA
(CD45RA+CD62L-) (Hamann et al., 1997; Sallustro et al., 1999, Fukada et al.,
2002).
As clulas T naive, ao encontrar o antgeno em rgos linfoides, podem
se ativar, proliferar e gerar clones, diferenciando-se em clulas T efetoras
(Estgio de Expanso). Aps a eliminao do antgeno, h morte de
aproximadamente 90% das clulas efetoras (Estgio de Contrao ou Morte)
(Kaech et al., 2002). Nesta etapa, ocorre tambm, diminuio dos mediadores
inflamatrios, e, ocorre a transio de clulas T CD4 efetoras, para clulas T
CD4 de memria (McKinstry et al., 2008).
As clulas restantes sero aquelas que sobreviveram a este processo
(estgio de memria), de forma que, quanto maior o nmero de clulas
efetoras entrando em apoptose ou morte, menor a quantidade de clulas T de
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memria (Kaech et al., 2002). As clulas T de memria podem ser ativadas por
baixas quantidades do antgeno (Lanzavecchia e Sallustro, 2001).
As clulas T CD4+ efetoras tm funes especficas como secreo de
citocinas e induo da diferenciao de clulas T CD8+ (capazes de eliminar
clulas que apresentam antgeno que estimulou a expanso clonal). Sendo
tambm responsveis pela ativao e modulao da produo de
imunoglobulinas em clulas B.
As clulas T de memria podem ser definidas como qualquer clula T
que tenha entrado em contato com um antgeno estando em uma fase ps
efetora (McKinstry et al., 2008), sendo normalmente encontradas por longos
perodos aps a exposio ao antgeno, permanecendo presentes na
circulao sangunea e no bao (Dutton et al.,1998). As clulas T CD4+ de
memria, so capazes de estimular APCs, linfcitos B e clulas T CD8, tendo a
capacidade de reconhecer um antgeno especfico, iniciar uma resposta rpida
e secretar citocinas pr-inflamatrias (McKinstry et al., 2008).
As subpopulaes de clulas T de memria central, so caracterizadas
por expressar CCR7 e produzir a citocina IL-12 aps a reativao, atuando nos
rgos linfoides secundrios, o que auxilia na gerao de clulas efetoras. As
clulas T de memria efetora expressam baixos nveis de CCR7 (McLeod et
al., 2009), as quais estudamos neste trabalho. Portanto, as clulas T de
memria so funcionais e fenotipicamente heterogneas (Berard e Tough,
2002).
Alm dos linfcitos com atividade inflamatria, clulas T reguladoras
tambm possuem um papel importante na imunobiologia do transplante. As
Treg fazem parte dos mecanismos de tolerncia, e atuam suprimindo ou
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controlando respostas inflamatrias, sendo assim, importantes na manuteno
da homeostase imunolgica (Josefowicz e Rudensky, 2012).
As Tregs so classificadas como Treg tmicas (Abbas et. al., 2008), que
adquirem capacidade imunorreguladora durante o seu desenvolvimento no timo
foram chamadas, inicialmente, de Treg naturais (Kyewski e Klein, 2006). No
entanto, a nomenclatura tem sido rediscutida, argumentando-se ser mais
adequado no usar o termo natural e sim usar o termo em relao sua
origem tmica (Abbas, et. al., 2008), ou Treg induzidas perifricas (iTregs),
quando adquirem atividade supressora na periferia, em diferentes contextos de
respostas imunes, in vivo.
As Tregs tmicas so CD4+, tm capacidade imunossupressora,
expressam a cadeia (alfa) do receptor de IL-2 (CD25), e o fator de transcrio
Foxp3 (do ingls, forkhead box P3) (Kyewski e Klein, 2006; Chen et al., 2003),
so, geralmente, autorreativas e so selecionadas positivamente, no timo, a
despeito de apresentarem alta avidez a antgenos prprios (Sakaguchi et al.,
1995; Muller et al., 2011; Hsieh et al., 2012). A expanso de Tregs tmicas in
vivo, parece ser importante na regulao da inflamao em diferentes
contextos, inclusive no transplante (Nishimura et al., 2004). relatado que o
maior nmero de clulas Tregs e da expresso de mRNA do gene de Foxp3
esto, associados ao momento de diminuio da imunossupresso em
indivduos com funo estvel do enxerto, mas no em indivduos com
rejeio, sugerindo que as Tregs favorecem a induo de um perfil
imunorregulador e o controle da inflamao no enxerto (Pons et al., 2008).
Assim, tanto na tolerncia ao prprio como no contexto de transplante, as
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clulas Tregs tmicas e induzidas desempenham um papel importante no
controle da inflamao.
As clulas Treg induzidas podem ter diferentes especificidades
antignicas, inclusive dirigida protena de choque trmico 60 (Zanin-Zhorov et
al., 2006), e diferentes fentipos, com ou sem a expresso do fator de
transcrio FOXP3. Entre os diferentes fentipos, podemos citar as Treg
CD8+/CD28 negativas (Colovai et al., 2003), CD4+/LAP+ (do ingls latency-
associated peptide) (Hall, 2010), Tregs Th1 (Sakaguchi et al., 2008) e Tregs
Th2. Sabe-se que a citocina IL-2 contribui para a sobrevivncia das clulas T
efetoras na periferia, porm a utilizao de anticorpos bloqueadores
neutralizantes anti-IL-2, in vitro, anula a funo supressora das clulas Tregs,
indicando que a IL-2 tambm importante para as Tregs (Lafaille, et al., 2002;
Thornton et al., 2004).
As clulas Tregs tm a habilidade de suprimir inflamao tecido-
especfica, em resposta a antgenos expressos diretamente em tecidos
inflamados (Cohen, 2000), e sua ativao, gerao e induo podem ser
desencadeadas no incio da resposta imune celular (OGorman et al., 2009).
Estas clulas tambm exercem atividade imunorreguladora por diversos
mecanismos: inibem a proliferao de clulas T efetoras, principalmente pela
secreo de IL-10, mas podem tambm produzir TGF- (fator de crescimento
transformador , do ingls, Transforming growth factor ) (Chen et al., 1994;
Sakaguchii et al., 1995), por mecanismos de interaes clula-clula, entre
outros.
A participao de clulas Treg no contexto do transplante, na induo de
tolerncia, se restringem a modelos experimentais. Por exemplo, em
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transplante de pele, foi observado que clulas Tregs antgeno-especficas in
vivo, podem mediar uma imunossupresso protegendo o enxerto (Nishimura et
al., 2004), por outro lado, podem ser induzidas, in vitro, por diferentes
protocolos experimentais, visando o seu uso em terapia celular em diversas
condies patolgicas, para o controle de inflamao.
Em estudos do nosso grupo, foram encontrados baixos nmeros da
populao de clulas Treg CD4+CD25hiFoxp3+ em indivduos transplantados
com rejeio crnica (Moraes-Vieira et al., 2010), sugerindo que a sua
deficincia esteja envolvida no processo de RC.
Clulas Tregs so essenciais para tolerncia ao prprio (Sakaguchi,
2004) e na tolerncia alogeneica (Braudeau et al., 2007; San Segundo et al.,
2010) no contexto do transplante, sendo inibidas pelas citocinas IFN-y, IL-2, IL-
4, IL-10 e IL-27, secretadas por clulas Th1 e Th2, atuando como mediadoras
do recrutamento de neutrfilos para locais da inflamao (Ivanov, et al., 2007;
MacGeachy e Cua, 2008).
Tolerncia Imunolgica
O sistema imune fundamental no equilbrio biolgico do organismo,
atuando como uma rede complexa integrada, capaz de interagir com
componentes celulares e moleculares prprios (autoantgenos), e antgenos
exgenos. Sua ao envolve a captao de sinais do microambiente que
modulam a resposta imune, mantendo o estado de tolerncia imunolgica ao
prprio, ao mesmo tempo em que capaz de eliminar microrganismos
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patognicos e clulas tumorais prejudiciais ao organismo. (Kyewski e Klein,
2006).
A tolerncia ao prprio um estado de no agresso ao prprio
organismo e , atualmente, classificada de duas formas: central (que ocorre
nos rgos linfides primrios: no timo, para os linfcitos T, e na medula ssea,
para os linfcitos B), e a perifrica (que ocorre nos rgos linfides perifricos:
linfonodos e bao) (Kyewski e Klein, 2006; Kindt et al., 2007).
Os precursores de linfcitos T chegam ao timo, passam por um processo
de amadurecimento e sofrem seleo positiva ou negativa (Anderton et al.,
2001; Savage e Davis, 2001). Na seleo positiva, os timcitos se ligam com
intensidade intermediria a antgenos prprios apresentados pelas molculas
MHC, so selecionados positivamente, amadurecem e saem para a periferia
povoando os rgos linfoides perifricos (Liu, 2006). Na seleo negativa,
ocorre forte ligao aos antgenos prprios apresentados pela molcula MHC,
e os timcitos morrem por apoptose, ou por negligncia, quando no se ligam a
antgeno algum (Anderton et al., 2001; Savage e Davis, 2001; Hsieh et al.,
2012; Rouhani et al., 2014). A seleo tmica parece desempenhar um
importante papel na autotolerncia exercida pelos linfcitos T, tanto por
diminuir a possibilidade de maturao de timcitos autorreativos de alta avidez,
que podem ser ativados e se tornar agressivos na periferia, como pela seleo
de clulas Tregs (Cohen, 1992; Cohen, 2007; Muller et al., 2011).
O fator de transcrio AIRE (do ingls, autoimmune regulator ou
regulador autoimune), expresso nas clulas epiteliais da medula do timo,
determinante na expresso de antgenos prprios tecido-especficos no timo
(Ruan et al., 2007). Na tolerncia central, o fator de transcrio AIRE parece
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desempenhar um papel importante na tolerncia ao prprio, e acredita-se que o
processo de tolerncia central seja importante para a manuteno da
homeostase e da tolerncia ao prprio.
Esta expresso parece ser fundamental para a manuteno da
homeostase, uma vez que mutaes que levam no expresso deste gene
(AIRE), induzem o desenvolvimento de doenas autoimunes (Liston e
Goodnow, 2005). Sua importncia parece ser devida tanto eliminao de
clones T e B fortemente autorreativos, e potencialmente patognicos, como
seleo positiva de clulas Tregs autorreativas (Anderson et al., 2002;
Anderson et al., 2005).
Acredita-se que a tolerncia perifrica seja mediada por um processo de
contnuo reconhecimento de antgenos prprios. Na periferia, a regulao da
atividade efetora de linfcitos pode ocorrer por diversos mecanismos como: (i)
incapacidade de proliferao e produo de IL-2 por linfcitos (Knoechel et al.,
2006); (ii) no ativao de linfcitos, pela falta de sinais coestimulatrios, aps
o encontro do linfcito com o antgeno, ou ativao do sinal supressor pela
molcula CTLA-4 (Anderton et al., 2001; Zheng et al., 2007); (iii) apoptose pela
repetida estimulao antignica dos linfcitos T (Anderson et al., 2005);
culminando na eliminao de clulas autorreativas efetoras (Wells et al., 2001);
(iv) ignorncia das clulas T pela no ligao do linfcito a qualquer antgeno
(Miller e Heath, 1993); (v) pela induo e atuao de clulas T reguladoras
(Tregs) (Chen et al., 2004; Carrier et al., 2007a; Carrier et al., 2007b; Li et
al.,2015), clulas T CD8+ de memria (Rao et al., 2010) e clulas B
reguladoras, cuja atividade parece estar relacionada com a produo de IL-10
(Iwata et al., 2011; Rosser et al., 2015); (vi) pela participao de clulas
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dendriticas (DC) tolerognicas (Harryet al., 2010); (vii) pelo desvio da resposta
imune celular de Th1 para Th2 e, provavelmente tambm (Li., 2014), (viii) pela
participao de anticorpos com propriedades imunorreguladoras.
Outros contextos de regulao que se tornaram clssicos na imunologia,
mostram a importncia dos processos biolgicos que ocorrem na vida intra-
uterina para a tolerncia imunolgica alogeneica na relao materno-fetal.
Acredita-se que mltiplos caminhos da tolerncia alogeneica tenham
sido selecionadas ao longo da evoluo, sendo ela fundamental na
perpetuao da espcie em todos os animais com reproduo sexuada e
fecundao interna. Assim, a tolerncia imunolgica materno-fetal que
alognica, pode ser muito importante para se compreender a tolerncia
imunolgica no transplante alogeneico (Erlebache, 2013), pois, embora haja
uma resposta inflamatria dirigida ao feto, h predominncia de uma resposta
imunorreguladora (Caetano, 2009). Apesar de no se ter uma compreenso
dos mecanismos que protegem o feto, supe-se que o trofoblasto (que no
apresenta a molcula HLA-DR) e a expresso de HLA-G possuam funo
importante neste estado de tolerncia imunolgica, pois fazem interface entre
as clulas maternas e fetais (Hviid TV, 2006).
Acredita-se, hoje, que diferentes tipos celulares e vrios mecanismos
imunorreguladores ativados, individualmente ou em conjunto, frente s diversas
experincias imunolgicas vividas pelo indivduo, ao longo da vida, sejam
cruciais na manuteno do equilbrio biolgico. Diversos desses mecanismos
imunorreguladores tm sido descritos como atuantes na imunobiologia do
transplante.
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Protena de Choque Trmico Hsp60
Na Teoria da Seleo Clonal, postulou-se que os clones de linfcitos T
autorreativos seriam eliminados no timo, sendo liberados para a periferia,
somente aqueles no reativos ao prprio (Burnet, 1959). Essa teoria trouxe
uma importante contribuio para a compreenso sobre o funcionamento do
sistema imune e durante vrias dcadas era a viso mais aceita do sistema
imune. Hoje, sabe-se que as clulas autorreativas fazem parte do repertrio
fisiolgico do sistema imune (Cohen, 2000, Luna et al., 2007; Lio e Hsieh,
2010), podendo resultar em respostas imunes tanto pr-inflamatrias como ter
atividade imunorreguladora. As Tregs tmicas so exemplos de clulas
autorreativas com atividade regula inflama. Esses dados tm dado suporte para
a o conceito de autoimunidade benfica e imunorreguladora, em contraposio
ao conceito dominante nos anos 50 de que a autoimunidade ocorria apenas na
doena.
As Hsps (do ingls, Heat Shock Proteins ou protenas de choque
trmico) (Wheeler et. al., 1995; Pockley et al., 2005; Zanin-Zhorov et al., 2003),
descobertas por Ferruccio Ritossa e colaboradores (Ritossa, 1962), so
protenas chaperonas amplamente distribudas na natureza, e compreendem
uma famlia de molculas altamente conservadas, presentes em todas as
clulas eucariticas e procariticas (Hightower e Guidon, 1989). As Hsps foram
descritas, primeiramente, em larvas de Drosophila melanogaster onde os
genes se alteravam durante a incubao em resposta ao aumento da
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temperatura (Ritossa, 1964). So molculas conservadas evolutivamente,
apresentando importncia em todas as clulas vivas (Van Eden et al., 2005).
As Hsps so classificadas de acordo com o peso molecular (Hsp10,
Hsp40, Hsp60, Hsp65, Hsp70, Hsp90, alm das Hsps pequenas). Expressas,
constitutivamente, em todos os seres vivos, so molculas conservadas
filogeneticamente e tm sido apontadas como alvo de reconhecimento cruzado
aps a resposta a antgenos de microrganismos nas infeces, induzindo
autoimunidade patolgica (Lamb et. al., 1989).
As Hsps aumentam em diversas situaes de estresse metablico, como
em clulas com deficincia nutricional, estresse oxidativo, aumento da
temperatura, tratamento com drogas anti-inflamatrias, exposio a
mediadores de inflamao e infeco viral (Morimoto e Santoro, 1998). Alm
disso, respostas Hsp-especficas favorecem a proteo contra infeces
microbianas (Zgel e Kaufmann, 1999).
Na Teoria do perigo, proposta por Matzinger e Fuchs, destacam-se
tambm respostas imunes dirigidas a antgenos no necessariamente
infecciosos, mas sinalizadores de perigo como as protenas de estresse, que
desencadeiam respostas imunes inflamatrias (Fuchs e Matzinger, 1996;
Matzinger et. al., 2002). Esta teoria foi objeto de intenso debate na comunidade
cientfica. Sabe-se, porm, que as protenas de estresse nem sempre
desencadeiam uma resposta imune inflamatria e podem tambm estar
envolvidas na imunorregulao (Cohen, 2007).
H dados na literatura apontando que as Hsps podem ativar linfcitos T
via receptor TLR2 (do ingls, Toll-like receptor 2), portanto, na presena de alta
concentrao de Hsp60, o TLR2 aumenta a adeso celular de clulas T (Zanin-
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18
Zhorov et al., 2003). Em experimentos com camundongos transplantados, foi
mostrado que a alta expresso de Hsp60 no camundongo receptor selvagem
leva a um retardo na rejeio do aloenxerto de pele e o desvio de resposta Th1
para Th2, podendo regular a resposta imune ao aloenxerto (Birk et al., 1999).
H trabalhos mostrando que indivduos apresentando casos graves de
esclerose mltipla apresentam altos nveis de autoanticorpos contra a hsp60,
em comparao a indivduos saudveis (Quintana et al., 2008).
A interao da Hsp60 com clulas do sistema imune pode induzir
respostas pr inflamatrias e imunorreguladoras (REGULA/INFLAMA), nosso
grupo tem investigado a resposta imune Hsp60 no contexto do transplante.
Temos dados mostrando ocorrer uma resposta imune celular dirigida protena
Hsp, em condies inflamatrias, na resposta ao aloenxerto (Caldas et al.,
2004), e no perodo tardio ps alotransplante em momentos de estabilidade do
enxerto (Caldas et al., 2006).
Tambm, foi observado que indivduos sadios tm resposta proliferativa
de linfcitos T Hsp60 (Granja, 2000), e que PBMCS estimuladas com HSP60,
em humanos, produzem citocinas IL-10 (Caldas, 2005). Dados do nosso grupo,
mostram tambm que autoanticorpos anti-Hsp60 humana esto distribudos na
populao (Victora et al., 2007) indicando uma resposta humoral fisiolgica,
relacionada com a manuteno da homeostase.
As Hsps podem estar envolvidas na tolerncia ao aloenxerto, em
modelos experimentas, sendo alvo de reconhecimento pelos linfcitos T
presentes no enxerto, alm das molculas MHC (Pockley, 2001). No contexto
do transplante renal humano, nosso grupo sugeriu um papel imunorregulador
para a Hsp60, com base nas observaes de que populaes de linfcitos T
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19
perifricos e infiltrantes do enxerto podem produzir IL-10, in vitro, em resposta
ao estmulo com a protena Hsp60 (Caldas et al., 2006). Alm disso, tambm
foi observado um perfil Th2 com produo de IL-4, associado a perodos
tardios do ps transplante, sem rejeio, sugerindo como o repertrio T reativo
Hsp60 estaria envolvido na regulao da resposta imune, no transplante
humano (Granja et al., 2004).
Considerando que o equilbrio REGULA/INFLAMA essencial na
manuteno do equilbrio biolgico, favorecendo uma resposta efetora ou
controlando a inflamao (Coelho e Faria, 2011), em diferentes contextos,
analisaremos se os peptdeos da Hsp60 podem tambm participar da
imunobiologia da tolerncia operacional, resultando em autorreatividade celular
com um perfil diferencial imunorregulador.
Tolerncia operacional
A induo de tolerncia ao aloenxerto, tem sido bem sucedida com uso
de diversas estratgias experimentais. Mas ainda um desafio na clnica. Nos
modelos experimentais j foram utilizadas diferentes estratgias, como: injeo
intratmica de antgenos do doador (Turvey et al, 1999; Jones et al,
1998), inibio da ativao de clulas T pelo bloqueio da coestimulao por
meio de protenas de fuso (Vogel et al., 2013), transplante de medula ssea
(Sharabi et al., 1989; Pilat et al, 2015). Alguns destes protocolos j foram
testados em humanos, como o transplante de medula ssea (van Rood et al.,
2002). Atualmente, existem ensaios clnicos em andamento testando-se terapia
celular no transplante (Jeroen et al., 2015).
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No entanto, h hoje na clnica, um grupo especial de indivduos chamados
de tolerantes operacionais, que apresentam funo estvel do enxerto, mesmo
aps a suspenso de imunossupressores por um perodo maior ou igual h um
ano. Portanto, o estado de tolerncia operacional (TO) definido como um
estado de estabilidade do rgo transplantado no qual o indivduo apresenta
um sistema imunolgico imunocompetente, com caractersticas funcionais
normais, sem haver sinais de rejeio (Ashton-Chess et al., 2006; Brouard et
al.,2008; Hernandez-Fuentes e Lechler, 2010; Brouard et al, 2012).
Apesar de parecer mais frequente nos transplantes hepticos (Thomson
et al., 2001; Mazariegos et al., 2005; Demetris et al., 2009), a tolerncia
operacional, tem sido descrita no transplante renal (Strober et al., 2000;
Brouard et al., 2005; revisado por Ashton-Chess et al., 2006).
As experincias imunolgicas vivenciadas por cada indivduo levam
formao de um repertrio de clulas reativas que podem favorecer o
desenvolvimento do estado de tolerncia. importante uma viso global dos
diversos caminhos imunolgicos que possa envolver este estado de tolerncia.
Apesar de um nmero crescente de publicaes sobre pacientes
tolerantes operacionais, ainda no so bem conhecidos os mecanismos
envolvidos neste estado, e muito tem sido investigado por diferentes grupos
(Hernandez-Fuentes e Lechler, 2010; Roedder et al, 2012, Brouard et al, 2012;
Chowdhury et al, 2013). Determinar os principais mecanismos envolvidos no
estado de TO, assim como biomarcadores confiveis para o seu diagnstico,
pode trazer uma contribuio importante para a identificao de pacientes que
podem, eventualmente, evoluir de forma favorvel, como os TO, e mesmo para
o desenvolvimento de novas estratgias teraputicas imunorreguladoras.
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21
Na anlise de clulas T, observou-se baixo acmulo de transcritos de
citocinas tanto Th1, quanto Th2, podendo ser sugerido um estado de
hiporresponsividade (Brouard et al., 2005). Tambm, na anlise de clulas T
perifricas, com o fentipo CD4+CD25+FOXP3+, observou-se semelhana entre
tolerantes operacionais e saudveis, diferentemente dos indivduos com
rejeio crnica, que apresentaram nmeros inferiores (Braudeau et al., 2007),
a anlise da resposta inata no sangue perifrico e no enxerto, observou que
indivduos tolerantes apresentavam baixa expresso de TLR4 em comparao
com rejeio crnica (Braudeau et al., 2008).
No contexto do transplante renal, alguns perfis diferencias foram
relatados na literatura, como o aumento da expresso gnica de molculas
relacionadas via TGF- (Brouard et al., 2007), o repertrio diferencial de TCR
(Miqueu et al., 2010), ausncia de anticorpos anti-doador HLA especficos
(Sagoo et al., 2010) e nmeros de clulas T reguladoras Foxp3 preservados
(Louis et al, 2006; Pons et al, 2008).
Na anlise de clulas B em TO, no transplante renal, verificou-se a
expresso diferencial de genes especficos de clulas B (Sagoo et al., 2010;
Newell et al., 2010; Lozano et al., 2011), com maiores porcentagens e nmeros
absolutos de clulas B da periferia (Newell et al., 2010; Louis et al, 2006; Pallier
et al., 2010) e ausncia de anticorpos anti-HLA doador-especfico no soro
(Sagoo et al., 2010). Tambm foi observado que, em indivduos tolerantes, as
clulas B estimuladas apresentaram maior razo TGF-/IFN- (Sagoo et al.,
2010).
Nosso grupo tambm tem estudado potenciais mecanismos envolvidos na
tolerncia operacional no transplante renal. Nossos principais dados mostram
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que o grupo tolerante operacional apresenta diversas similaridades aos
indivduos saudveis, em relao aos nmeros de clulas B reguladoras
(Bregs) (Silva et al., 2012) e Treg (Moraes-Vieira et al., 2012) , enquanto os
grupos de rejeio crnica e estvel, apresentam menores nmeros dessas
subpopulaes imunorreguladoras, sugerindo que a sua preservao
importante nos mecanismos de TO.
Os dados do nosso grupo tambm apontam que o fator GATA3
desempenha um papel importante na induo/manuteno do estado de
tolerncia operacional, sugerindo que um desvio para a resposta imune do tipo
Th2 possa ter uma importncia na manuteno de um estado com
caractersticas imunorreguladoras nos TO (Moraes-Vieira, 2012). A respeito do
papel das clulas Th2 no transplante, h trabalhos que falam desse subtipo
celular como tendo papel imunorregulador (Waaga et al., 2001), outros,
destacam seu papel no processo de rejeio (Pirenne et al., 2005). Entretanto,
de acordo com estudos do nosso grupo, os indivduos TO, com funo estvel
do enxerto e TO, parecem possuir um perfil diferenciado com aumento
significativo da expresso de GATA-3 (Moraes-Vieira, 2012).
Diversos pesquisadores tm comparado parmetros imunolgicos
relacionados com a atividade das clulas T na tolerncia operacional (Louis et
al, 2006; Braudeau et al, 2007; Pons et al, 2008), no transplante renal e de
transplante de fgado (Martnez-Llordella et al, 2007; Snchez-Fueyo, 2010), e
tm apontado diferenas imunolgicas especficas de cada rgo em estado de
tolerncia operacional (Heidt e Wood, 2012). Foi visto que, pacientes em
estado de tolerncia operacional, podem apresentar aumento da produo de
citocinas potencialmente reguladoras, como IL-10 e TGF- (Alber et al., 2004),
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mas no foi observada diferena no nmero absoluto de clulas T regs entre
indivduos transplantados hepticos em estado de tolerncia operacional e
indivduos saudveis (Li et al., 2004).
Sabendo que os indivduos tolerantes operacionais alcanaram um
estado de equilbrio com o enxerto, nos perguntamos se, neste estado
imunorregulador, a resposta celular antgeno-especifica dirigida a trs grupos
de antgenos: aloantgenos relevantes no transplante (peptdeos da molcula
HLA-DR), autoantgenos da Hsp60 que podem ter atividade pr-inflamatria e
imunorreguladora, e antgenos do CMV, importantes microrganismos nas
infeces no transplante ocorreu de forma diferencial. Apesar de os pacientes
em TO no apresentarem maior prevalncia de infeces do que a populao
em geral, h poucas informaes sobre a resposta imune celular antgeno-
especfica na TO, tanto em relao via indireta de alorreconhecimento, como
em relao autorreatividade pr-inflamatria e imunorreguladora (Shiu et al.,
2015).
Este estudo contribuir para o avano do conhecimento sobre a
imunobiologia da TO no transplante renal e a modulao da resposta celular
antgeno especfica. Partimos da hiptese de que o indivduo tolerante
operacional tenha ativado mecanismos imunorreguladores e desenvolvido um
perfil imunolgico diferencial em relao resposta imune celular antgeno-
especfica.
Dada a importncia funcional de citocinas e de algumas subpopulaes
na resposta imune no desfecho do rgo transplantado, analisamos diferentes
subpopulaes de clulas T (linfcitos TCD4+ de memria efetora, efetoras e
reguladoras), frente os citados estmulos antignicos, em indivduos
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24
transplantados renais em TO, comparativamente com indivduos em diferentes
estados clnicos e indivduos saudveis. Com essas anlises esperamos
identificar parmetros diferenciais com relao resposta celular em indivduos
tolerantes operacionais. Podendo contribuir para maior compreenso deste
estado imunolgico com relao evoluo clnica do rgo transplantado,
principalmente em relao s condies contrastantes: a tolerncia operacional
e a rejeio crnica.
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2. Objetivos
2.1 Objetivo geral
Determinar se o estado de tolerncia operacional envolve a modulao
funcional diferencial da resposta celular antgeno-especfica em relao a trs
grupos de antgenos relevantes no transplante: antgenos do doador, antgenos
de patgenos e autoantgenos.
2.2 Objetivos especficos
Determinar no estado de tolerncia operacional, comparativamente a
diferentes grupos clnicos e indivduos saudveis,
1. O perfil de produo de citocinas predominantemente
imunorreguladoras (REGULA) ou pr-inflamatrias (INFLAMA) na
resposta de clulas mononucleadas do sangue perifrico dirigida
aos trs grupos antignicos.
2. A resposta proliferativa de diferentes subpopulaes de linfcitos
T predominantemente REGULA ou INFLAMA dirigida aos trs
grupos antignicos.
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3. Material e Mtodos
3.1 Delineamento Experimental
Figura 1. Delineamento experimental. TO: Tolerante operacional; RC: Rejeio Crnica; EST: Estvel; SAU: Saudvel; PBMC: Clulas Mononucleadas do Sangue Perifrico; CMV: Citomegalovrus; CFSE: do ingls, Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester; HSP: Protena do choque trmico. REGULA: aumento da expresso de citocinas ou de subpopulao celular predominantemente reguladoras ou diminuio da expresso de citocinas ou de subpopulao celular pr-inflamatria; INFLAMA: aumento da expresso de citocinas ou de subpopulao celular predominantemente inflamatrias ou diminuio da expresso de citocinas ou de subpopulao celular reguladora.
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3.2 Sujeitos de pesquisa
Este projeto faz parte do Estudo Multicntrico em tolerncia operacional
no Brasil, dentro do projeto coordenado pela Dra. Vernica Coelho: Estudo do
perfil imunolgico regulador em pacientes com longo tempo de transplante de
rgos slidos, em estado de tolerncia operacional: bases para novas
estratgias teraputicas imunomoduladoras na clnica, vinculado ao Instituto
de Investigao Imunolgica (iii) Instituto do Milnio, CNPq (573879/2008-7),
coordenado pelo Prof. Dr. Jorge Kalil.
Neste estudo, os sujeitos de pesquisa so provenientes dos seguintes
centros brasileiros integrantes: Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina
da Universidade de So Paulo, do Hospital So Lucas (Rio Grande do Sul,
PUC-RS), Hospital Beneficncia Portuguesa (SP) e Hospital de Londrina (PR).
O Estudo Multicntrico est em andamento desde 2005, e o material biolgico
foi coletado de todos os grupos aps assinatura do termo de consentimento
livre e esclarecido (TCLE) (Anexo 2), tambm para os novos pacientes
recrutados. Este projeto especfico foi aprovado pela Comisso de tica do
Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo
HCFMUSP (CAPPesq no 0476/08).
A anlise foi realizada em trs grupos clnicos diferentes, seguindo o
desenho experimental representado na figura 1:
Grupo TO- tolerante operacional: pacientes estveis, com mais de um ano de
transplante sem o uso de drogas imunossupressoras (1 ano).
Grupo RC- rejeio crnica: indivduos com mais de um ano de transplante
com diagnstico de rejeio crnica, diagnosticado por bipsia.
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Grupo EST- funo estvel do enxerto: transplantados com mais de um ano de
transplante, com doses habituais de imunossupressores.
Grupo SAU- indivduos saudveis. Doadores ou no de rgos.
A seleo dos pacientes feita pelos seguintes critrios: Funo estvel:
Limite de clearance de creatinina >45ml/min, no apresentando variao
negativa de clearance > 10% nos ltimos 6 meses. Rejeio crnica: medida
clinicamente pelo aumento do nvel de creatinina (superior a 2,0 mg/dl) no
perodo de 4 a 6 meses, na ausncia de fatores como nefrotoxicidade por
drogas ou doenas e comprovada por bipsia renal, sendo verificada
histologicamente por alteraes vasculares caracterizadas por fibrose intimal e
intersticial, atrofia difusa dos glomrulos, tubular, avanando para insuficincia
renal crnica. Tolerncia operacional: no utilizao de imunossupressores por
um perodo igual ou maior a 1 ano.
Neste estudo, analisamos ao todo, 6 indivduos tolerantes operacionais
(TO), 8 com rejeio crnica (RC), 8 estveis com doses habituais de
imunossupressores (EST) e 7 indivduos saudveis SAU), em um total de 29
sujeitos de pesquisa. Todos os indivduos estudados possuem dados clnicos
(Tabela 1) e demogrficos (ANEXO 1). Para alguns ensaios, nem todos os
indivduos puderam ser estudados, por limitao de material, apontamos esta
informao nos resultados.
3.3 Material coletado: Para a realizao dos experimentos, foram feitas
coletas de 40 ml de sangue em tubos com heparina.
-
29
Tabela 1. Dados clnicos nos diferentes grupos de estudo
Grupo Clnico Sujeito de Pesquisa Origem do
enxerto N Total
Disparidades HLA
Tipificao HLA-DR Infeces (ps TX ou ps TO ou ps IE) Sorologia CMV Receptor Doador
TO N=6
Ltx03 Fal 3 DR-1, DR-7 DR-1, DR-4 No CMV+
Ltx10 VA (irm) 1 DR-3, DR-17 DR-4, DR-17 No CMV+
Ltx16 VA (irm) 0 DR-13, DR-16 DR-13, DR-16 No CMV+
Ltx62 VA 3 DR-4, DR-0 DR-4, DR-0 No CMV+
Ltx90 VA 0 DR-1, DR-3 DR-1, DR-3 No CMV+
Ltx91 VA 0 DR-3, DR-13 DR-3, DR-13 No CMV+
RC N=8
Ltx04 Fal 6 DR-3, DR-13 DR-12, DR-8 HZ CMV+ Ltx05 Fal 6 DR-4, DR-0 DR-17, DR-9 HCV; HS; CDD; AMID, rCMV; PNMN CMV+ Ltx13 VA (pai) 2 DR-4, DR-13 DR-15, DR-13 rCMV; HPV; PNMN; HS; IU; TBC; ERI CMV+ Ltx24 Fal 5 DR-10, DR-16 DR-4, DR-10 rCMV; H1N1 CMV+
Ltx26 VNA 5 DR-14, DR-8 DR-7, DR-17 HZ; PANCag; PNMN CMV+
Ltx79 VNA 3 DR-4, DR-0 DR-15, DR-0 POLIv, TBC, HZ CMV+
Ltx80 VA (me) 0 DR-7, DR-0 DR-7, DR-0 PNMN; CS; POLIV; HZ CMV+
Ltx87 VA (me) 0 DR-7, DR-0 DR-7, DR-0 CMV; EBV; RUB, HAV; PNMN; IU CMV+
EST N=8
Ltx11 Fal 6 DR-15, DR-3 DR-1, DR-7 rCMV; HbsAg CMV+ Ltx12 Fal 6 DR-11, DR-13 DR-1, DR-7 CDD; rCMV CMV+
Ltx14 Fal 3 DR-8, DR-14 DR-14, DR-17 Sem intercorrncias CMV+
Ltx19 Fal 3 DR-0, DR-13 DR-13, DR-4 HS CMV+
Ltx22 Fal 3 DR-13, DR-15 DR-4, DR-13 Nd CMV+
Ltx31 VA (irm) 3 DR-3, DR-11 DR-11, DR-18 CDD CMV+
Ltx33 Fal 5 DR-11, DR-14 DR-1, DR-14 Nd CMV+
Ltx71 Fal 2 DR-4, DR-13 DR-13, DR-13 rCMV CMV+
SAU N=7
Ltx18 ------- ------- DR-14, DR-17 ------- No CMV+
Ltx36 ------- ------- DR-1, DR-14 ------- No CMV+
Ltx37 ------- ------- DR-12, DR-8 ------- No CMV+
Ltx40 ------- ------- DR-4, DR-13 ------- No CMV+
Ltx41 ------- ------- DR-17, DR-11 ------- No CMV+
Ltx44 ------- ------- DR-4, DR-13 ------- No CMV+
Ltx84 ------- ------- DR-4, DR-0 ------- No CMV+
TO: tolerncia operacional. RC: rejeio crnica. EST: estvel. SAU: saudvel. Fal: falecido. VA: vivo aparentado. VNA: vivo no aparentado. HLA: human leukocyte antigen (angeno leucocitrio humano). CMV: citomegalovrus. IE: incluso no estudo. HCV: vrus da hepatite C. HS: herpes simples. HZ: herpes zoster. CDD: candidase. rCMV: recidiva de CMV. PNMN: pneumonia. HPV: vrus do papiloma humano. IU: infeco urinria. TBC: tuberculose. ERI: erisipela. PANCag: pancreatite aguda. POLIV: polioma vrus. HBs: hepatite B. HAV: vrus da hepatite A. CS: choque sptico. AMID: amidalite. RUB: rubola.
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30
3.4 Obteno de clulas mononucleadas do sangue perifrico: Na
separao de clulas mononucleadas do sangue perifrico (PBMC, do ingls,
peripheral blood mononuclear cells), as amostras de sangue foram diludas em
soluo salina isotnica e separadas em gradiente de Ficoll-Hypaque
(densidade 1.077 g/l, Ficoll: Pharmacia Biotech, Sweden e Hypaque: Urografina
370, Schering, Brasil). Aps centrifugao por 30 minutos (min) a 800xg, a
interface que contm clulas mononucleadas foi coletada, ressuspendida em
salina, e centrifugada por mais 10 min a 700xg.
O sedimento celular foi lavado por duas vezes, e as clulas ressuspendidas
em meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute - Gibco-BRL, Grand
Island, NY, USA), suplementado com 2 mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, EUA), 40 g/ml de gentamicina (HC-USP, SP, Brasil), 1% de
ciprofloxacina (HC-USP,SP, Brasil) e, posteriormente, centrifugadas por 8 min
a 600xg. Logo aps, ressuspendemos as clulas em 3 ml de meio RPMI. A
concentrao celular foi determinada por contagem em cmara de Neubauer e
a viabilidade foi verificada com o corante vital Azul de Tripan (MCB
Manufacturing Chemists Inc., Cincinnati, OH, EUA). Posteriormente, as clulas
foram congeladas (conforme descrito abaixo).
3.5 Congelamento e descongelamento de clulas: Para o congelamento,
a suspenso de clulas mononucleadas que estava em 3ml de meio RPMI, foi
centrifugada a 600xg por 8 min e ressuspendidas em meio de congelamento
contendo 90% de soro fetal bovino inativado (Hyclone,South,Logan,UT,USA), e
10% de DMSO (dimetilsulfxido, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).
-
31
Utilizamos alquotas de 1ml de soluo de congelamento para cada criotubo
(10 a 15x106 clulas/ml). As clulas foram levadas para o freezer 80C e,
posteriormente, armazenadas em nitrognio lquido at o momento da
utilizao. Para o descongelamento, aps serem retirados do nitrognio lquido,
os criotubos foram colocados rapidamente em banho-maria a 37C por 1 min. A
suspenso de clulas foi transferida para um tubo contendo 10 ml de meio
RPMI (Gibco, Rockville, MD, USA), suplementado com 2 mM de L-glutamina
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 40g/ml de gentamicina (HC-USP, SP,
Brasil), 1% de ciprofloxacina (HC-USP,SP, Brasil) e 10% de soro fetal bovino
inativado (SBFi, Hyclone, South, Logan, UT, USA) e centrifugada por 8 min a
600xg por duas vezes. Logo aps, foi verificada a viabilidade celular com o
corante vital Azul de Tripan.
3.6 Marcao celular com CFSE: para o ensaio de proliferao, as PBMCs
sero inicialmente marcadas com CFSE (do ingls, Carboxyfluorescein
Diacetate Succinimidyl Ester) (Molecular Probes, Eugene, OR). O CFSE (Life
Technologies) difunde-se para dentro da clula e emite a fluorescncia que
permanece nas clulas, e, a cada ciclo de diviso celular, a intensidade da
fluorescncia diminui. Aps descongelamento das PBMCs, elas foram
mantidas em estufa de CO2 a 37C, overnight a fim de estabilizar as funes
celulares. Aps este tempo, deixamos as clulas em temperatura ambiente
(TA) por 1h. Procedemos a centrifugao por 8 min a 600xg, ressuspedemos
as clulas em 3ml de meio RPMI e realizamos a contagem das clulas em
cmara de Neubauer, coradas com azul de tripan, para calcular a viabilidade
-
32
celular. Separamos uma alquota como controle negativo (de clulas sem
marcao), e partimos para a marcao com o CFSE. Apagamos as luzes,
devido ao fato do CFSE ser sensvel a luz. Para a marcao, partimos da
concentrao de 20x106 clulas diludas em 2ml de PBS (do ingls, Phosphate
Buffered Saline Life Technologies) contendo 2% de FCS inativado (SBFi,
Hyclone, South, Logan, UT, USA). Portanto, utilizamos a concentrao final de
3,5M de CFSE, as clulas foram incubadas em banho-maria a 37C por 10
min, sendo, o falcon agitado a cada 3min, garantindo assim, a homogeneizao
do CFSE e sua mistura s clulas. Em seguida, o processo de marcao foi
interrompido adicionando-se RPMI (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) gelado
contendo 10% de FCS, e as clulas ficaram por 3min em gelo. Centrifugamos
as clulas por 6min a 500xg, descartamos o sobrenadante e acrescentamos
5ml de meio RPMI, e assim, repetimos a centrifugao por 3 vezes.
Procedemos a contagem das clulas em cmara de Neubauer com corante
vital Azul de Tripan. As clulas marcadas foram cultivadas com os antgenos
previamente titulados e para ensaios funcionais de proliferao para posterior
avaliao de proliferao por citometria de fluxo.
3.7 Seleo dos peptdeos: para selecionar os alopeptdeos,
escolhemos uma das molculas HLA-DR baseada na disparidade do doador
com seu respectivo receptor (Tabela 2). Todos os sujeitos de pesquisa foram
devidamente tipificados para HLA-DR de acordo com o protocolo (descrito em
3.12). Os peptdeos HLA-DR utilizados encontram-se na Tabela 3.
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33
Tabela 2. Seleo dos peptdeos HLA-DR alo dos sujeitos de pesquisa dos diferentes grupos de estudo.
Grupo Clnico
Sujeito de Pesquisa Receptor Doador
HLA-DR Selecionado
TO N=6
Ltx03 DR-1, DR-7 DR-1, DR-4 DR-4 Ltx10 DR-3, DR-17 DR-4, DR-17 DR-4 Ltx16 DR-13, DR-16 DR-13, DR-16 DR-13 Ltx62 DR-4, DR-0 DR-4, DR-0 DR-4 Ltx90 DR-1, DR-3 DR-1, DR-3 DR-1 Ltx91 DR-3, DR-13 DR-3, DR-13 DR-13
RC N=8
Ltx04 DR-3, DR-13 DR-12, DR-8 DR-8 Ltx05 DR-4, DR-0 DR-17, DR-9 DR-17 Ltx13 DR-4, DR-13 DR-15, DR-13 DR-15 Ltx24 DR-10, DR-16 DR-4, DR-10 DR-4 Ltx26 DR-14, DR-8 DR-7, DR-17 DR-17 Ltx79 DR-4, DR-0 DR-15, DR-0 DR-15 Ltx80 DR-7, DR-0 DR-7, DR-0 DR-7 Ltx87 DR-7, DR-0 DR-7, DR-0 DR-7
EST N=8
Ltx11 DR-15, DR-3 DR-1, DR-7 DR-7 Ltx12 DR-11, DR-13 DR-1, DR-7 DR-7 Ltx14 DR-8, DR-14 DR-14, DR-17 DR-17 Ltx19 DR-0, DR-13 DR-13, DR-4 DR-4 Ltx22 DR-13, DR-15 DR-4, DR-13 DR-4 Ltx31 DR-3, DR-11 DR-11, DR-18 DR-18 Ltx33 DR-11, DR-14 DR-1, DR-14 DR-1 Ltx71 DR-4, DR-13 DR-13, DR-13 DR-13
SAU N=7
Ltx18 DR-14, DR-17 ------- DR-4 Ltx36 DR-1, DR-14 ------- DR-16 Ltx37 DR-12, DR-8 ------- DR-16 Ltx40 DR-4, DR-13 ------- DR-7 Ltx41 DR-17, DR-11 ------- DR-8 Ltx44 DR-4, DR-13 ------- DR-16 Ltx84 DR-4, DR-0 ------- DR-7
Os peptdeos sintticos alogeneicos foram derivados de molculas HLA-
DR alogeneicas, correspondentes a uma disparidade presente no doador (para
os indivduos transplantados) ou, simplesmente, derivados de uma molcula
HLA-DR no presente no sujeito de pesquisa estudado (para os indivduos
saudveis). Deste modo, utilizamos diferentes peptdeos HLA-DR para os
diferentes sujeitos de pesquisa (Tabela 2).
Os alopeptdeos HLA-DR foram selecionados baseados nas
disparidades doador/receptor e analisando a sua potencial antigenicidade
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usando-se o programa de predio IEDB (Immund Epitope Database And
Analysis Resource - http://www.iedb.org/#). Estes peptdeos, foram sintetizados
pela empresa GLS Ltd (GL Biochem (Shanghai) Ltd) com uma pureza de 90%.
Os peptdeos foram preparados a uma concentrao de 1mg/ml, em DMSO
(dimetilsulfxido, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Fizemos alquotas de
100l e armazenamos no freezer -20C at o momento de uso. Utilizamos a
concentrao de 2,5 g/ml do peptdeo HLA-DR.
Tabela 3. Sequncias dos peptdeos HLA-DR sintticos utilizados Nomenclatura Sequncia do Peptdeo sinttico Molcula HLA-DR
SHLA-1 DWTFQTLVMLETVPRSGEVYT DR-1, DR-4[1], DR-8, DR15[1] SHLA-2 GLLFLGAGLFIYFRNQKGHSG DR-16 SHLA-3 LFLGAGLFIYFRNQKGHSGLQPTGF DR-4[2], DR-17[1] SHLA-5 FNGTERVRFLDRYFHNQEENV DR-17[2] SHLA-6 FNGTERVQFLERLFYNQEEFV DR-7[1] SHLA-7 ALTVTLMVLSSPLALAGDTQPR DR-4[3], DR-7[2] SHLA-8 VLTVTLMVLSSPLALAGDTRPRFLEYSTSECH DR-15[2] SHLA-9 ECHFFNGTERVRFLDRYFHNQ DR-13[1] SHLA-10 ALTVTLMVLSSPLALAGDTRPRFLEQV DR-8 SHLA-11 KHECHFFNGTERVRFLDRYFYHQE DR-4[4] SHLA-12 WTFQTLVMLETVPRSGEVYTC DR-13[2], DR-18
Para os peptdeos do antgeno CMV, utilizamos um pool de peptdeos
PepTivator CMVpp65 (Miltenyi Biotec), constitudo de 15 peptdeos com 11
aminocidos sobrepostos, abrangendo a sequncia completa da protena pp65
do citomegalovrus humano, sendo um alvo imunodominante de clulas T. Foi
preparada uma soluo estoque de 30nmol/ml correspondente a 0,6g/ml,
alquota em volume de 100l e armazenada a -800C.
Como autoantigenos, utilizamos os peptdeos de Hsp60 denominados (N6,
N7 e C9) (Tabela 4) que foram selecionados baseados no perfil
REGULA/INFLAMA, de dados anteriores do nosso grupo mostrando que os
peptdeos N6 e N7, localizados na regio N-terminal da HSP60, foram os
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peptdeos que mostraram predomnio de modificaes do perfil REGULA, e o
peptdeo C9 da regio C-terminal da HSP60, o que apresentou as maiores
frequncias de efeitos INFLAMA.
Tabela 4. Sequncias dos peptdeos da protena Hsp60 humana selecionados
Assim como os p