Universidade Tecnológica Federal do Paraná Departamento Acadêmico de Química e Biologia

Disciplina: Ecotoxicologia Aplicada Cód. CTA027 Profas : Adriane Martins de Freitas, Lucia Regina Rocha Martins, Wanessa Ramsdorf

Aula Prática 4: BIOENSAIO DE TOXICIDADE AGUDA COM Artemia salina

Princípio:

O microcrustáceo Artemia sp é um organismo marinho cosmopolita, que tem como habitat

natural lagos de água salgada e salinas, estando adaptada pra sobrevivência em corpos de água

que sofrem marcantes flutuações sazonais. A reprodução partenogenética, quando os machos estão

ausentes, produz cistos que viabilizam a produção de enormes populações e a dispersão do gênero

pelo mundo. O princípio do ensaio consiste na exposição de indivíduos jovens (náuplios fase II e III -

48 horas vida), por um período de 24-48h, a várias concentrações de uma amostra, após o qual

verifica-se o efeito sobre a capacidade natatória (imobilidade)

Equipamentos, reagente e materiais:

lupa estereoscópica

câmara BOD ou estufa (25-27oC)

placa de 24 poços

meio de cultivo para artêmias (solução de água marinha artificial)

funil de separação, bomba de aeração (eclosão de cistos e coleta de náuplios)

béqueres

pipetas graduadas (25, 10 e 5 mL)

pipetas Pasteur e ponteiras

balões volumétricos (50 mL)

solução-teste

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Procedimento:

Para eclosão dos cistos: preparar 200 a 500mL de água marinha artificial (30g L-1) e deixar sob

aeração por 20-40 min. Colocar a água em um béquer e adicionar 100-200 mg de cistos. Incubar o

béquer por 24 horas, na ausência de luz, a 25-28oC. Após, incidir luz apenas na região superior do

béquer (proteger com papel alumínio) e aguardar alguns minutos para a migração das larvas. Retirar

os organismos com auxílio de pipeta-Pasteur ou micropipeta, cuidando para não coletar cistos não

eclodidos. Transferir os náuplios para outros 200-500mL de água marinha artificial previamente

aerada, e incubar o béquer por 24 horas, para que atinjam o estágio adequado à execução do ensaio

(náuplios fase II e III - 48 horas vida).

Preparo das amostras: preparar soluções-teste de SDS nas seguintes concentrações: 50, 40, 30,

20 e 10 mg.L-1, a partir de uma solução-estoque de concentração 100mg.L-1. Homogeneizar

totalmente as soluções-teste. Todas as soluções são preparadas com água marinha artificial

(30 g L-1) para artêmias, assim como o controle.

Outras amostras: adicionar 3g do sal marinho em um béquer com 100mL da solução-teste

(efluente, resíduo de Ni, etc.). A partir desta amostra, realizar as diluições (100, 50, 25, 12 e 6 % ou

100, 10, 1, 0,1 e 0,01%) em água de cultivo.

Protocolo:

1. Transferir cuidadosamente, com auxílio de pipeta Pasteur (ou com pipeta graduada), 10 náuplios

de Artemia sp. (estágio larval mais sensível), para cada poço da Placa de teste.

2. Aspirar, cuidadosamente, o máximo volume possível de meio de cultivo de cada poço,

garantindo a manutenção da quantidade de organismos (usar ponteira de micropipeta)

3. Identificar, na tampa da placa, as concentrações das soluções-teste por fileira de poços, nome

dos responsáveis pelo experimento.

4. Aplicar 1,5 mL de cada solução-teste nos poços (n = 4), assim como no controle negativo

(apenas meio de cultivo)

5. Fechar as placas e mantê-las a 25oC, no escuro, por 24-48 horas.

6. Terminado o tempo de exposição (a leitura poderá ser feita em 24 e 48h, a critério do grupo),

contar os organismos mortos em cada poço: consideram-se mortos aqueles que não

apresentarem qualquer movimento em até 10 segundos de observação. Anotar na tabela e

determinar o valor da CL50 por interpolação gráfica.

7. Validade do teste: a mortalidade no controle negativo (apenas meio de cultivo) não deve

ultrapassar 10% e pelo menos 80% das larvas devem morrer na maior concentração do teste; a

CL50 deve estar entre 13,1 e 30,9 mg/L

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Montagem do Bioensaio de toxicidade aguda:

Esquematize as diluições na placa:

Data de início: ___________________ Data de término: _______________________________

poço controle* Conc 1 Conc 2 Conc 3 Conc 4 Conc 5

A

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*controle =1,5 mL de meio de cultivo

Referências bibliográficas:

EPA. United States Environmental Protection Agency. Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters to freshwater and marine organisms. 5.ed. 2002.

Nascimento, Iracema A.; Sousa, Eduinetty C.P.M.; Nipper, Marion. Testes de toxicidade aguda com o microcrustáceo Artemia sp. (In: Métodos em ecotoxicologia: aplicações no Brasil), São Paulo: Editora Artes Gráficas e Indústricas Ltda, 2002.

PETROBRAS. Normas técnicas. Norma técnica N-2588. Determinação da toxicidade aguda de agentes tóxicos em relação à Artemia sp. 1996.

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