Perfil da microbiota de um serviço de alimentação e ... · Ao meu querido e amado tio-pai Jorge,...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS Perfil da microbiota de um serviço de alimentação e análise da eficácia dos métodos empregados no controle higiênico- sanitário. Aline Gomes de Mello de Oliveira 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
Perfil da microbiota de um serviço de alimentação e análise da
eficácia dos métodos empregados no controle higiênico-
sanitário.
Aline Gomes de Mello de Oliveira
2014
Perfil da microbiota de um serviço de alimentação e análise da eficácia dos
métodos empregados no controle higiênico-sanitário.
ALINE GOMES DE MELLO DE OLIVEIRA
.
Orientadores:
Profa. Dra. Selma Gomes Ferreira Leite Prof. Dr. Marco Antônio Lemos Miguel
Profa. Dra. Luciléia Granhen Tavares Colares
Rio de Janeiro
Março/2014
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos.
Oliveira, Aline Gomes de Mello de
Perfil da microbiota de um serviço e alimentação e análise da
eficácia dos métodos empregados no controle higiênico-sanitário / Aline
Gomes de Mello de Oliveira – Rio de Janeiro: UFRJ, 2014.
173fls.
Orientadores: Selma Gomes Ferreira Leite
Marco Antônio Lemos Miguel
Luciléia Granhen Tavares Colares
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de
Química, 2014
1. Serviços de alimentação 2. Comunidade microbiana 3. Estudo de
validação 4. Microbiologia molecular – Tese. I. Leite, Selma G.
Ferreira. II. Miguel,Marco Antonio Lemos. III. Colares, Luciléia
Granhen Tavares. IV. Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Ciência de
Alimentos. V. Título.
Perfil da microbiota de um serviço de alimentação e análise da eficácia dos métodos empregados no controle higiênico-sanitário
Aline Gomes de Mello de Oliveira
Orientadores: Profa. Dra. Selma Gomes Ferreira Leite; Prof. Dr. Marco Antônio Lemos Miguel; Profa. Dra. Luciléia Granhen Tavares Colares Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciência de alimentos. Aprovada por: _______________________________ Presidente, Profa. Selma Gomes Ferreira Leite – IQ/UFRJ _______________________________ Profa. Cristina Tristão de Andrade – IQ/UFRJ _______________________________ Prof. Sérgio Eduardo Longo Fracalanzza – IMPPG/UFRJ _______________________________ Profa. Rinaldini Coraline Philippo Tancredi - UNIRIO _______________________________ Profa. Arlene Gaspar – UFRJ/Macaé
Rio de Janeiro Março, 2014
Dedicatória
À minha mãe Fátima,
ao meu tio-pai Jorge
e ao meu marido Carlos Henrique,
companheiros incansáveis.
Agradecimentos
A caminhada foi longa e nem sempre fácil. Pedras apareceram ao longo
do caminho, mas muitas pessoas especiais estiveram ao meu lado, todo o
tempo, tornando a trajetória mais leve e doce. À essas pessoas, só posso
agradecer e dizer que sempre serão lembradas com muito carinho.
Agradeço à Deus por estar, sempre, ao meu lado, por ter colocado
pessoas especiais na minha vida, por me dar força. Sem Ele não teria
alcançado mais esta conquista.
Ao meu marido, Carlos Henrique, companheiro incansável, que esteve
ao meu lado todo este tempo, que entendeu minhas ausências, me consolou,
foi meu amigo e, principalmente, meu alicerce. Muito obrigada por sua
paciência e amor, te amo.
À minha mãe Maria Fatima, exemplo de força e coragem. Obrigada por
estar ao meu lado, por ter acreditado nas minhas escolhas e por me dar forças
para seguir em frente.
À minha irmã Alessandra Mello, pelo carinho, apoio e incentivo.
Ao meu querido e amado tio-pai Jorge, obrigada por tudo, pelo colo, por
financiar meus estudos, por acreditar nas minhas escolhas, por ter me
escolhido como filha do coração e, principalmente, por caminhar ao meu lado.
Aos meus queridos orientadores Luciléia Colares, Marco Miguel e Selma
Leite. Gratidão eterna! Vocês foram essenciais na realização deste estudo,
estiveram ao meu lado sempre e foram exemplos que pretendo reproduzir ao
longo da minha vida acadêmica.
Luciléia, minha querida amiga, mãe científica e orientadora, muito
obrigada por tudo: pelos ensinamentos, por estar comigo há anos me
auxiliando a alcançar degraus mais altos. Nunca vou me esquecer do seu
carinho, das palavras de conforto e da sua dedicação. Muito obrigada de
coração.
Marco Miguel, a jornada não foi fácil. Aprendi muito ao seu lado.
Obrigada pela sua paciência, pela sua amizade, pelo profissionalismo e por ter
me mostrado outras formas de enxergar a vida. Muito obrigada pelas
conversas enriquecedoras e pelo carinho.
Selma Leite, muito obrigada por ter acreditado em mim, por ter estado
ao meu lado nas horas que mais precisei e por me dar forças para seguir.
Ao prof. Sérgio Fracalanzza muito obrigada por ter me recebido de
abraços abertos em todos os momentos que precisei, por ter me oferecido seus
conhecimentos, seu tempo, seu carinho e sua amizade.
À profa. Raquel Bonelli, obrigada pelas conversas enriquecedoras,
disponibilidade e orientações.
Às minhas três “anjinhas” Ana Luiza Favilla, Daniela Gomes, Eduarda
Mundy, obrigada por terem acreditado em mim, por terem sido amigas,
companheiras e dedicadas. Sem vocês, essa trajetória teria sido bem mais
árdua. Muito obrigada de coração.
Aos Técnicos Antônio e Marley por me ajudarem e auxiliarem na
execução desta pesquisa. Antônio, obrigada pela paciência e pelas conversas.
Aos amigos do laboratório de microbiologia de alimentos: Analy, Juliana
Furtado, Carolina Beres, Renata Rangel, Maria Leoniza, Bianca, Tayná
obrigada pelas conversas e pelos momentos de diversão.
Às queridas Larissa, Carol e Deborah por terem me auxiliado ao longo
desta tese.
Ao corpo docente do curso de nutrição UFRJ - campus Macaé por terem
compreendido as minhas ausências e por me darem forças para continuar.
À Mariana, Camila Eliza, Kelse, Beatriz e Arlene pelo apoio, conversas e
conselhos.
Às amigas Ellen e Luciana pelo convívio, pelas conversas animadas e
por me darem força ao longo desta caminhada.
Aos meus queridos amigos, Aline Barros, Juliana Kuhne, Fabio
Machado, Artemis, Márcio, Isabel David e Fabiane Back pelo apoio, pelas
conversas, pelo carinho e principalmente por entenderem as minhas ausências.
À todos os docentes, servidores e funcionários do Programa de Pós
Graduação em Ciência de Alimentos pela oportunidade de crescimento e pelo
auxílio.
Ao Governo do Estado do Rio de Janeiro pela concessão da realização
da pesquisa.
À todos os funcionários (nutricionistas e manipuladores de alimentos) do
restaurante em que foi desenvolvimento este trabalho.
E a todos que não fiz menção, porém que contribuíram também para a
concretização deste trabalho, MUITO OBRIGADA!!!
RESUMO
PERFIL DA MICROBIOTA DE UM SERVIÇO DE ALIMENTAÇÃO E ANÁLISE
DA EFICÁCIA DOS MÉTODOS EMPREGADOS NO CONTROLE HIGIÊNICO-
SANITÁRIO
Aline Gomes de Mello de Oliveira
Orientadores: Profa. Dra. Selma Gomes Ferreira Leite; Prof. Dr. Marco Antônio Lemos Miguel; Profa. Dra. Luciléia Granhen Tavares Colares
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós Graduação em Ciência de Alimentos - Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos.
O objetivo deste estudo foi caracterizar a microbiota e avaliar a eficácia dos métodos de controle higiênico-sanitário em um serviço de alimentação da cidade do Rio de Janeiro. Foram pesquisados microrganismos patogênicos e indicadores em utensílios como: bandejas, pratos, talheres e nas mesas do refeitório. As amostras dos utensílios foram coletadas por lavagem de superfície com solução salina e as mesas por esfregaço com “swab”. As estirpes de bacilos Gram negativos e de estafilococos foram identificadas por espectrometria de massa. O perfil da comunidade microbiana foi verificado pelas técnicas moleculares de reação de cadeia de polimerase e eletroforese em gel com gradiente desnaturante (PCR-DGGE) e sequenciamento do gene RNAr 16S. Foi investigado o perfil de suscetibilidade das estirpes isoladas aos antimicrobianos pelo método de disco-difusão, assim como a eficácia do hipoclorito de sódio na diluição de uso sobre as estirpes prevalentes no estabelecimento. Validou-se o conteúdo do roteiro para avaliação das condições higiênico-sanitárias de serviços de alimentação (RACHS-SA) pela técnica Delphi e verificou-se a confiabilidade interavaliadores, após a aplicação do instrumento por 4 nutricionistas em um serviço de alimentação. Todas as superfícies estavam em condições higiênico-sanitárias inadequadas. O método dependente de cultivo evidenciou a predominância de enterobactérias (Enterobacter sp e Klebsiella sp), Acinetobacter sp. e Staphylococcus sp. As técnicas moleculares também revelaram a prevalência de Klebsiella sp e Acinetobacter sp em todas as superfícies analisadas. Nenhum isolado de estafilococos coagulase positiva e negativa apresentou perfil de resistência à meticilina e a vancomicina, porém, três estirpes de bacilos Gram negativos revelaram resistência ao imipenem. O hipoclorito de sódio à 200ppm foi capaz de inibir todas as estirpes testadas. O RACHS-SA teve seu conteúdo validado e apresentou confiabilidade interavaliadores. Os métodos dependentes e independentes de cultivo mostraram resultados equivalentes, o que reforça a aplicabilidade da associação das técnicas PCR-DGGE em serviços de alimentação, pois oferece resultados rápidos quando comparada com os métodos tradicionais. O RACHS-SA com o conteúdo validado apresentou resultados que corroboraram com os métodos experimentais, sendo identificados menores percentuais de adequação para os blocos que avaliaram
equipamentos e utensílios, assim como aquele que tratou da higiene das instalações e utensílios. Trata-se de uma ferramenta útil que pode ser utilizada pelos gestores dos serviços de alimentação para auxiliar na adoção das boas práticas e minimizar o risco de contaminação. Os dados obtidos mostraram que as estirpes prevalentes no serviço de alimentação, embora sensíveis ao desinfetante utilizado na rotina do estabelecimento, apresentavam resistência a alguns importantes antimicrobianos. Este dado evidencia a necessidade de um monitoramento mais abrangente do perfil da microbiota de serviços de alimentação, incluindo a busca por marcadores de resistência, favorecendo alterações eficientes nos protocolos de higiene.
Palavras chaves: Serviços de alimentação, Comunidade microbiana, Condições higiênico-sanitária, Estudo de validação, Biologia Molecular
ABSTRACT
MICROBIAL PROFILE IN A FOOD SERVICE AND ANALYSIS OF THE
EFFECTIVENESS OF METHODS EMPLOYED IN CONTROL HYGIENE AND
SANITARY
Aline Gomes de Mello de Oliveira
Orientadores: Profa. Dra. Selma Gomes Ferreira Leite; Prof. Dr. Marco Antônio Lemos Miguel; Profa. Dra. Luciléia Granhen Tavares Colares
Abstract da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós Graduação em Ciência de Alimentos – Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de
Doutor em Ciência de Alimentos. The aim of this study was to characterize the microbial and to evaluate the effectiveness of methods of hygienic-sanitary control in a food service in the city of Rio de Janeiro. Pathogenic microorganism and indicators in trays, plates, cutlery and dining room tables were surveyed. The samples were collected by washing utensils surface with saline and the tables by smear “swab". Strains of Gram-negative bacteria and staphylococci were identified by mass spectrometry. The bacterial community structure was verified by polymerase chain electrophoresis in denaturing gradient gel (PCR-DGGE) and sequencing of the 16S rRNA gene. The profile of susceptibility of isolates to antimicrobial agents by the disk diffusion method was investigated as well as the effectiveness of sodium hypochlorite in the dilution of the use on the prevalent strains in the establishment. Validated the contents of the script to evaluate the sanitary conditions of food service (RACHS-SA) was conducted by Delphi technique and was verified the interrater reliability, after application of the instrument by 4 dietitians in a food service. All surfaces were in inadequate sanitary conditions. The culture-dependent method showed the predominance of Enterobacteriaceae (Enterobacter sp. and Klebsiella sp.), Acinetobacter spp . and Staphylococci. Molecular techniques have also revealed the prevalence of Acinetobacter sp., and Klebsiella sp. in all surfaces analyzed. No isolate of coagulase positive and negative staphylococci showed resistance to methicillin and vancomycin, however, three strains of Gram negative bacilli showed resistance to imipenem. Sodium hypochlorite at 200 ppm was able to inhibit all strains tested. The RACHS-SA validated content presented interrater reliability. The dependent- and independent-culture methods showed equivalent results, which reinforces the applicability of the association of PCR- DGGE techniques in food service, it offers fast results when compared with traditional methods. The RACHS-SA with validated content presented results that corroborated the experimental methods, smaller percentages of adequacy being identified for the blocks that evaluated equipment and utensils, as well as one that dealt with the cleanliness of the premises and utensils. This proved to be a useful tool that can be used by managers of food services to assist in the adoption of best practices and minimize the risk of contamination. The data showed that,
although sensitive to the disinfectant used in the routine category, prevalent in the food service strains showed resistance to some important antimicrobials. This finding highlights the need for a more comprehensive monitoring of the profile of the microbioal of food services, including the search for markers of resistance, favoring efficient changes in hygiene protocols Keywords: Food service, Microbial community, sanitary conditions, Validation studies, Molecular Biology
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Diagrama explicativo das etapas realizadas na pesquisa.
52
Figura 2. Frequência das espécies de bacilos Gram negativos isoladas das superfícies das bandejas, talheres e mesas.
60
Figura 3. Perfil de bandas obtido por PCR-DGGE da região codificadora do RNAr 16S, das superfícies de mesas e utensílios. As setas indicam as bandas selecionadas para sequenciamento.
61
Figura 4. Ordenação multidimensional não métrica realizada a partir das matrizes obtidas do perfil de bandas da PCR-DGGE para as comunidades bacterianas presentes nos utensílios e mesas.
63
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Principais agentes etiológicos envolvidos em surtos de doenças transmitidas por alimentos no período de 2000/2011.
22
Quadro 2. Principais classes de antimicrobianos e seus, respectivos, mecanismos de ação e de resistência bacteriana.
27
Quadro 3. Propriedades dos diferentes princípios ativos utilizados em desinfetantes comerciais.
33
Quadro 4. Ação dos princípios ativos frente aos principais microrganismos.
34
Quadro 5. Relação das vantagens e desvantagens de cada técnica de análise microbiológica de superfície.
42
Quadro 6. Padrões Microbiológicos para avaliação das condições higiênico-sanitárias de equipamentos e utensílios de preparação, segundo organizadores oficiais e autores.
43
Quadro 7. Padrões microbiológicos para utensílios de mesa, segundo organizadores oficiais e autores.
43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Contagem microbiana das superfícies dos utensílios e mesas previamente higienizados no primeiro dia de coleta, em três horários diferentes.
57
Tabela 2. Contagem microbiana das superfícies dos utensílios e mesas previamente higienizadas no segundo dia de coleta, em três horários diferentes.
58
Tabela 3. Identificação das bandas obtidas por PCR-DGGE baseada no BLAST (GenBank) usando primers universais para bactérias totais.
62
Tabela 4. Total de bacilos Gram negativos e estafilococos isolados das superfícies higienizadas do talher, bandejas e mesa do refeitório.
68
Tabela 5. Perfil de resistência das estirpes de Acinetobacter sp, Enterobacter sp. e Klebsiella sp. isoladas das superfícies higienizadas de em um serviço de alimentação.
73
Tabela 6. Perfil de resistência das estirpes de Staphylococcus aureus e estafilococos coagulase negativa isoladas das superfícies higienizadas de um serviço de alimentação.
74
Tabela 7. Alterações e discordâncias entre os especialistas, por bloco, nas três rodadas de avaliação do instrumento, Rio de Janeiro, 2013.
85
Tabela 8. Classificação dos itens quanto ao risco oferecido para a manutenção da qualidade higiênico-sanitária das refeições, conforme julgamento dos especialistas, Rio de Janeiro 2013.
86
Tabela 9. Percentual de adequação das condições higiênico-sanitárias do serviço de alimentação a partir da avaliação dos quatro nutricionistas, Rio de Janeiro 2013.
87
Tabela 10. Coeficiente de correlação intraclasse obtidos das respostas dadas pelos quatro nutricionistas para cada bloco do RACHS-SA, Rio de Janeiro 2013.
88
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ABERC - Associação Brasileira de Refeições Coletivas
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ANOVA – Análise de variância
APHA – American Public Health Association
ARDRA Análise de Restrição de DNA Ribossomal Amplificado
ATCC - American Type Culture Colection
ATP – Adenosina Trifosfato
CCI - Coeficiente de Correlação Intraclasse
CHCA - Ácido α-hidroxi-ciano-cinâmico
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute
CONSEA - Conselho Nacional de Segurança Alimentar
CVS - Centro de Vigilância Sanitária
DGGE - Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante
DTA - Doença Transmitida por Alimentos
ECN - Estafilococos Coagulase Negativo
ECP - Estafilococos Coagulase Positivo
ESBL - Beta-Lactamase de Espectro Estendido
EUA - Estados Unidos da América
FDA - Food and Drug Administration
IRAs – Infecção relacionada à Assistência à Saúde
MRPP - Procedimento de Permutação de Múltipla Resposta
MRS - Staphylococcus metacilina resistente
MRSA - Staphylococcus aureus metacilina resistente
NMS - Escalonamento multidimensional não métrico
OMS - Organização Mundial de Saúde
ONG - Organizações Não Governamentais
OPAS - Organização Pan-Americana da Saúde
PACHS - Percentual de Adequação das Condições Higiênico-Sanitárias
PAT - Programa de Alimentação do Trabalhador
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
PEAA - Programa Estadual de Acesso à Alimentação
PNAE - Programa Nacional de Alimentação Escolar
POF - Pesquisa de Orçamento Familiar
RACHS-SA - Roteiro de Avaliação das Condições Higiênico-Sanitárias de
Serviço de Alimentação
RDC - Resolução da Diretoria Colegiada
RODAC - Replicate Organism Direct Agar Contact
RP - Restaurantes Populares
RU – Restaurante universitário
SAPS - Serviço de Alimentação da Previdência Social
SEASDH - Secretaria de Estado de Assistência Social e Direitos Humanos
UFC - Unidade Formadora de Colônia
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 16
2. REVISÃO DA LITERATURA 19
2.1 O setor de alimentação coletiva: aspectos históricos e evolução 19
2.2 Contaminantes microbianos em serviços de alimentação 21
2.2.1 Suscetibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos 26
2.3 Monitoramento das condições higiênico-sanitárias em serviços de alimentação.
31
2.3.1 Roteiros de Avaliação das condições higiênico-sanitária de serviços de alimentação
36
2.3.2 Análises microbiológicas em serviços de alimentação 39
2.4 Estudo da comunidade microbiana por métodos dependentes e independentes de cultivos
44
3. JUSTIFICATIVA 48
4. OBJETIVOS 49
4.1 Objetivo geral 49
4.2 Objetivos específicos 49
5. ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL 50
5.1 Local de estudo 50
5.2 Critérios para escolha dos pontos de coletas das amostras de superfícies. 50
5.3 Pontos de coleta das amostras. 51
6. CAPITULOS 53
6.1 Capitulo I: Caracterização da comunidade microbiana presente nas superfícies de serviços de alimentação
53
6.1.1 Material e métodos 53
6.1.1.1 Avaliação higiênico-sanitária das superfícies 53
6.1.1.2 Identificação das estirpes isoladas por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF
55
6.1.1.3 Caracterização da estrutura da comunidade microbiana presente na superfície
55
6.1.1.4 Análise estatística 56
6.1.2 Resultados 56
6.1.2.1 Características microbiológicas das superfícies do serviço de alimentação 56
6.1.3 Discussão 64
6.2 Capitulo II: Perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos e desinfetantes a base de cloro em estirpes de Acinetobacter sp., Enterobacter sp., Klebsiella sp. e Staphylococcus sp. isoladas de serviço de alimentação
68
6.2.1 Materiais e métodos 68
6.2.1.1 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos 68
6.2.1.2 Detecção fenotípica da produção de enzima β-lactamases de espectro estendido (ESBL).
70
6.2.1.3 Eficácia do desinfetante a base de hipoclorito de sódio frente às estirpes isoladas.
70
6.2.2 Resultados 72
6.2.3 Discussão 76
6.3 Capitulo III: Validação de conteúdo e confiabilidade de instrumento de avaliação higiênico-sanitária
79
6.3.1 Materiais e métodos 79
6.3.1.1 Elaboração do RACHS-SA 79
6.3.1.2 Validação do conteúdo do RACHS-SA por comitê de especialistas 80
6.3.1.3 Análise da confiabilidade e reprodutibilidade do instrumento validado 82
6.3.2 Resultados 83
6.3.2.1 Elaboração do instrumento para avaliação das condições higiênico-sanitária 83
6.3.2.2 Validade do conteúdo do instrumento pela Técnica Delphi 83
6.3.2.3 Avaliação das condições higiênico-sanitárias do serviço de alimentação e análise da confiabilidade e reprodutibilidade interavaliadores
86
6.3.3 Discussão 89
7. CONCLUSÕES FINAIS 91
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 92
ANEXOS 109
APÊNDICES 113
Asdagfagfsdg
16
INTRODUÇÃO
O setor de alimentação fora do lar tem crescido nas últimas décadas e
sua dimensão e importância na economia nacional podem ser medidas a partir
dos números gerados pelo segmento. No ano de 2013, o mercado de refeições
coletivas como um todo forneceu cerca de 18 milhões de refeições/dia,
ofereceu 195 mil empregos diretos e consumiu 11 mil toneladas de alimentos
(ABERC, 2013). No Brasil, os dados da Pesquisa Brasileira de Orçamentos
Familiares (POF) realizada entre 2008 e 2009 revelaram que na área urbana
31% do total médio da despesa familiar é gasto com alimentação fora do lar
(IBGE, 2010).
Este crescimento tem ocasionado o aumento dos surtos de doenças
transmitidas por alimentos (DTA) devido às falhas ocorridas durante o processo
produtivo de refeições, incluindo a deficiente higienização das superfícies
(OMS, 2006). As DTA podem gerar perdas econômicas para o
estabelecimento, além da morbidade e mortalidade do indivíduo (BENEVIDES
& LOVATII, 2004).
Entre os anos de 2000 e 2011 foram notificados 8.663 surtos, que
acometeram 163.425 pessoas e ocasionaram 112 óbitos (SVS, 2012), sendo
Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Escherichia coli os
principais microrganismos envolvidos nesses surtos.
A manutenção da qualidade higiênico-sanitária dos alimentos, assim
como das superfícies que entram em contato com os alimentos é necessária
para prevenir a disseminação destes microrganismos, uma vez que se
propagam com rapidez e alta patogenicidade.
Nas últimas décadas os patógenos alimentares como Salmonella spp.,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes e Yersinia
enterololitica têm desenvolvido resistência a antimicrobianos, o que pode
comprometer o tratamento de infecções graves de origem alimentar (WHITE et
al., 2002).
O aumento da resistência das bactérias aos agentes antimicrobianos se
tornou um problema de saúde publica (OLIVEIRA & SILVA, 2008). Este fato
está associado ao uso extensivo dos antimicrobianos e às más condições de
higiene (VON NUSSBAUM et al., 2006).
17
Embora a maioria dos estudos de resistência a antimicrobianos esteja
relacionado com amostras provenientes de infecções relacionadas à
assistência à saúde (IRAs), também é importante analisar as amostras do
ambiente a fim de verificar se estes isolados apresentam resistência aos
antimicrobianos (DÍAZ et al., 2006).
Considerando que a resistência aos antimicrobianos é um problema de
saúde pública é necessário controlar a disseminação dos agentes patogênicos,
através da adoção de métodos de controle higiênico-sanitário nos serviços de
alimentação.
O controle de microrganismos patogênicos e indicadores das condições
higiênico-sanitárias pode ser realizado a partir da adoção de procedimentos de
higienização, uma vez que, o contato dos alimentos com superfícies
contaminadas é um dos principais fatores para a ocorrência de surtos (OMS,
2006). A existência de resíduos alimentares associados à umidade nas
superfícies favorecem a multiplicação dos microrganismos e o aumento da
contaminação (SILVA JR., 2007; ICMSF, 1997).
Para que os procedimentos de higienização sejam eficazes é
fundamental a escolha correta dos agentes de limpeza e desinfecção, sendo
necessário analisar o tipo e o grau dos resíduos aderidos às superfícies, a
qualidade da água, a natureza da superfície a ser higienizada, os métodos de
higienização (físicos ou químicos) aplicados e o perfil microbiano da superfície
(ANDRADE, 2008).
A oferta de refeições dentro dos padrões higiênico-sanitários é uma
condição essencial para promoção da saúde e prevenção de DTA, sendo o
controle da qualidade nos serviços de alimentação importante e bastante
abrangente.
O controle da qualidade pode ser realizado por métodos não
experimentais (aplicação de roteiros de avaliação das condições higiênico-
sanitárias) e métodos experimentais (análises microbiológicas).
Os roteiros de avaliação das condições higiênico-sanitárias apresentam
baixo custo e podem ser aplicados tanto em instituições públicas como nas
privadas. Estes instrumentos reúnem os principais tópicos exigidos pela
legislação sanitária, permitindo observar se o serviço de alimentação se
encontra em adequação.
18
Existem diversos roteiros disponíveis na literatura como: BRASIL,
(2002); AKUTSU et al. (2005); SACCOL et al. (2009), porém não há
informações sobre a validação de conteúdo dos mesmos. A validação de um
instrumento é importante, pois permite verificar se os resultados de uma
aferição se aproximam do estado verdadeiro dos fenômenos que estão sendo
medidos (PASQUALI, 2009)
De acordo com Pasquali (2009) a validação pode ser classificada como
critério, constructo e conteúdo. Esta última reflete a capacidade do instrumento
medir um conjunto de comportamentos relacionados entre si e que estão
associados ao que está sendo medido (SOUSA & TURRINI, 2012).
Desta forma, o uso de um roteiro de avaliação das condições higiênico-
sanitárias de serviços de alimentação com o conteúdo validado, associado às
análises microbiológicas complementa, comprova e assegura o nível higiênico-
sanitário do estabelecimento (TEBBUTT, 2007).
As análises microbiológicas do ambiente, superfície, manipuladores e
alimentos auxiliam na detecção das fontes de contaminação e na eficiência do
processo de higienização (ANDRADE, 2008). Estas análises podem ser
realizadas por técnicas dependentes e independentes de cultivo.
Os métodos dependentes de cultivo, embora confiáveis e eficientes
requerem vários dias e até mesmo semanas para obtenção dos resultados.
Além disso, as propriedades fenotípicas das bactérias podem não ser
expressas ou podem ser de difícil interpretação e classificação (MARIN et al.,
2006). Os métodos independentes de cultivo apresentam rapidez, maior
seletividade, especificidade, potencial para automação e a possibilidade de
analisar bactérias que não são cultiváveis em meios de cultura (BUSH &
NITSCHKO, 1999).
Sendo assim, quando os métodos dependentes de cultivo estão
associados aos métodos independentes podem gerar resultados mais
completos para estudos de caracterização da microbiota de um ambiente.
19
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 O setor de alimentação coletiva: aspectos históricos e evolução.
As alterações ocorridas na economia brasileira foram causadas pelas
transformações dos modos de vida, principalmente a modificação da estrutura
familiar e dos comportamentos alimentares; o desenvolvimento da atividade, no
que diz respeito ao trabalho feminino e a transformação da ocupação espacial
através da urbanização crescente e da industrialização, foram os fatores que
contribuíram para o desenvolvimento do Setor de alimentação coletiva
(PROENÇA, 1997).
No final da década de 30 foi criado o Serviço de Alimentação da
Previdência Social (SAPS), com o intuito de melhorar as condições de trabalho,
que eram bastante precárias, devido às longas jornadas, aos baixos salários, a
falta de segurança e ao ambiente insalubre, sendo instituída a obrigatoriedade
das empresas com mais de 500 empregados instalarem refeitório. O SAPS
possuía como objetivo o fornecimento de refeições equilibradas do ponto de
vista higiênico-sanitário e nutricional, com intuito de melhorar a alimentação do
trabalhador e, conseqüentemente, sua resistência orgânica e capacidade de
trabalho (BRASIL, 1940). Este Serviço promoveu a administração de
restaurantes para trabalhadores, assim como do refeitório localizado na União
Nacional dos Estudantes, mas foi extinto em 1967 (BRASIL, 1940; BRASIL,
1967).
Em 1941 a primeira cozinha industrial de grande porte foi instalada na
Companhia Siderúrgica Nacional. Em 1947 foram inauguradas, na cidade de
São Paulo, as primeiras cozinhas industriais do Serviço Social da Indústria
(SESI) a fim de fornecer refeições transportadas para os trabalhadores
industriais e do Serviço Social do Comércio (SESC) que tinham refeitório
centralizado para atender aos comerciários.
A partir de 1955 foram implementadas as Políticas de Alimentação e
Nutrição como o Programa Nacional de Alimentação Escolar (PNAE), que
visava o fornecimento de refeições a todos os estudantes da pré-escola e do
primeiro grau, matriculados na rede oficial de ensino e entidades filantrópicas,
20
um complemento nutricional diário, durante o período das atividades escolares,
aos escolares frequentadores de estabelecimento oficiais e filantrópicos de
ensino (BRASIL, 2014).
Ainda na década de 50, surgiram os Restaurantes Universitários (RU),
em escolas e faculdades, que eram mantidos pela Universidade do Brasil, para
atendimento de funcionários e estudantes (BRASIL, 2008).
A partir da Consolidação do processo de industrialização do país, foi
instituído pelo Governo Federal o Programa de Alimentação do Trabalhador
(PAT), pela Lei. 6.321, de 1976, regulamentada somente em 1991. O PAT é
direcionado ao atendimento dos trabalhadores de baixa renda, ou seja, aqueles
que ganham até cinco salários mínimos mensais, visando a melhoria das
condições nutricionais, a promoção da saúde e prevenção de doenças
profissionais (BRASIL, 2008).
A alimentação fora do lar se transformou em prática cotidiana e sofreu
mudanças visíveis, visto que a maioria das refeições, no Brasil, passou a ser
realizada fora do lar (COLLAÇO, 2003).
No final dos anos 80 surgiu no Brasil os restaurantes à peso, sendo o
resultado da adaptação do sistema de buffet existente na Europa e nos
Estados Unidos da América. Também foram adotados outros tipos de
segmentos como o sistema de rodízios de carne, de comida oriental, italiana e
o sistema à peso. Há ainda os restaurantes do tipo self service, churrascarias,
lanchonetes, fast foods, restaurantes gastronômicos, restaurantes tradicionais,
cantinas, bistrôs, pizzarias e as barracas de rua (COLLAÇO, 2007).
A dimensão e a importância do Setor de alimentação coletiva na
economia nacional podem ser ressaltadas a partir dos números gerados pelo
segmento. No ano de 2013, o mercado de refeições coletivas como um todo
forneceu 18 milhões de refeições/dia, 195 mil empregos diretos e consumiu
cerca de 11 mil toneladas de alimentos (ABERC, 2013). No Brasil, os dados da
Pesquisa Brasileira de Orçamentos Familiares (POF) (IBGE, 2010) revelaram
que, o total médio da despesa familiar gasto com a alimentação fora do lar, na
área urbana, foi de 31%.
Os dados das pesquisas mostraram que os serviços de alimentação fora
do lar assumiram um papel importante na alimentação da população e a
21
qualidade, passou a ser um atributo fundamental para o funcionamento destes
estabelecimentos (SOUSA & CAMPOS, 2003).
Com relação aos serviços de alimentação, a qualidade está associada
aos aspectos intrínsecos do alimento (qualidade nutricional e sensorial),
segurança (qualidade higiênico-sanitárias), atendimento (relação cliente-
fornecedor), e preço (AKUTSU et al., 2005). O aspecto da qualidade que será
tratado, ao longo desse estudo, está relacionado com as questões higiênico-
sanitárias, pois a ocorrência de doenças transmitidas por alimentos (DTA) é um
dos fatores que contribuem para morbidade, mortalidade e constituem-se em
um problema de saúde pública.
2.2 Contaminantes microbianos em serviços de alimentação.
A Organização Mundial de Saúde (OMS, 2006) define doença
transmitida por alimentos como patologia de natureza infecciosa ou tóxica
causada pelo consumo de alimentos ou água contaminados. Os agentes de
contaminação podem ser físicos, químicos ou biológicos, sendo a causa mais
comum dessas doenças a contaminação microbiana, principalmente por
bactérias (SVS, 2012).
As DTA têm sido abordadas como um problema de saúde pública, que
podem causar a redução da produtividade, perdas econômicas e da
credibilidade do estabelecimento. Além disso, dependendo da quantidade
ingerida do alimento contaminado, do tipo de microrganismo ou toxina e do
estado de saúde do indivíduo acometido, as DTA, podem levar a morte
(BENEVIDES & LOVATTI, 2004).
Entre os anos de 2000 e 2011 foram notificados 8.663 surtos,
acometendo 163.425 pessoas e ocasionando 112 óbitos (SVS, 2012).
Registros epidemiológicos mostraram que os serviços de alimentação são
responsáveis pelos altos índices de surtos de doença transmitida por
alimentos. Acredita-se que esses estabelecimentos sejam responsáveis por
mais de 50% dos surtos (OMS, 2006).
Diversas causas estão relacionadas aos surtos de DTA como: falhas
durante a manipulação de alimentos, inadequação do planejamento físico-
funcional, assim como na higienização dos equipamentos (OMS, 2006). No
22
Quadro 1 estão apresentados os principais agentes etiológicos e o percentual
de surtos de DTA ocorridos no Brasil entre 2000 e 2011.
Fonte: SVS, 2012.
Quadro 1: Principais agentes etiológicos envolvidos em surtos de doenças
transmitidas por alimentos no período ente 2000 e 2011.
Staphylococcus aureus é um dos principais microrganismos
patogênicos. Este microrganismo apresenta como reservatório os animais e o
homem, e pode colonizar as vias nasais, cabelos e pele de indivíduos
saudáveis. Há citação de 49 espécies e 26 subespécies incluídas no gênero
Staphylococcus spp (EUZÉBY, 2014) e são tradicionalmente divididos em dois
grupos: coagulase positiva e coagulase negativa de acordo com sua
capacidade de coagular o plasma de coelho (FORSYTHE, 2002).
Dentre os estafilococos coagulase positiva, Staphylococcus aureus é a
principal espécie podendo causar diversos tipos de infecções, incluindo
inflamações superficiais da pele, infecções sistêmicas e septicemia. Sua
presença é indicativa de falhas nos procedimentos de higienização
(JUNQUEIRA et al., 2009; MARTINS et al., 2009). Este microrganismo também
pode causar intoxicação alimentar estafilocócica que está associada à ingestão
de enterotoxinas produzidas pela espécie quando presentes nos alimentos
(HENNEKINNE et al., 2012).
A toxina estafilocócica é termoestável e, portanto, não pode ser inativada
por métodos de cocção comumente utilizados. Alimentos que requerem muita
Agente etiológico Surtos de DTA
N %
Salmonella spp. 1660 42,5 Staphylococcus aureus 799 20,5 Escherichia coli 411 10 Bacillus cereus 300 8 Clostridium perfringens 190 5 Outros 553 14
Total 3927 100
23
manipulação e são mantidos em temperaturas favoráveis à multiplicação deste
pátogeno são aqueles frequentemente envolvidos em intoxicações
estafilocócicas (FORSYTHE, 2002; JAY, 2005).
Nos Estados Unidos da América, anualmente, em média 185.000 casos
de surtos alimentares envolvem a enterotoxina estafilocócica (MUSTAFA et al.,
2009). No Brasil, de acordo com a Secretaria de Vigilância Sanitária foram
notificados 799 surtos no período entre 2000 e 2011 (SVS, 2012).
Staphylococcus aureus estão frequentemente associados aos casos e
surtos de intoxicação alimentar (OMOE et al., 2005), mas outras espécies
também produzem enterotoxinas e estão envolvidas em surtos alimentares.
Entre esta espécies destacam-se os estafilococos coagulase negativa (ECN):
S. intermedius (KHAMBATY et al., 1994; BECKER et al., 2001) e S. hyicus
(ADESIYUN et al., 1984; STAMFORD et al., 2006 ).
Os ECN envolvem espécies do genêro que foram por muito tempo
considerados como não-patogênicas, podendo estabelecer uma relação
comensal com seres humanos e animais (FITZGERALD & PENADES, 2008;
OTTO, 2010).
No entanto, é crescente o envolvimento de espécies como
Staphylococcus epidermidis, S. haemolyticus e S. saprophyticus em infecções
hospitalares (OTTO, 2009; PIETTE & VERSCHRAEGEN, 2009; MAZZARIOL et
al., 2012), bem como S.chromogenes, S. simulans, S. xylosus em infecções de
origem animal (TAPONEN et al., 2006; UNAL & CINAR, 2012). Os ECN podem
ocorrer tanto no ambiente clínico, como também nos alimentos (CUNHA et al.,
2006; EVEN et al., 2010), por isso, também devem ser pesquisados e
controlados.
A pesquisa de patógenos envolvidos em surtos de DTA é difícil,
trabalhosa e não garante a inexistência de outros agentes. Por este motivo,
microrganismos indicadores (bactérias aeróbias mesófilas, bolores e leveduras,
coliformes, enterococos, enterobactérias e Escherichia coli) são utilizados para
verificar as condições de higiene dos alimentos, manipuladores de alimentos,
utensílios e ambientes dos serviços de alimentação. A presença destes
microrganismos sugere falhas nas condições higiênico-sanitárias, assim como
a probabilidade da existência de microrganismos patogênicos (SOUSA, 2008).
24
A contagem de bactérias aeróbias mesófilas em alimentos tem sido um
dos indicadores de qualidade mais comumente utilizados. Apresentam
crescimento ótimo próximo à temperatura corporal (aproximadamente 37 °C)
(FERNANDES et al., 2000).
A alta contagem destes microrganismos é indicativa da deficiência da
qualidade higiênico-sanitária da matéria-prima e da produção ou conservação
dos alimentos; assim como da inadequação do processo de limpeza e
sanitização das superfícies e das condições de tempo/temperatura durante a
produção ou conservação dos alimentos (FRANCO & LANDGRAF, 2003;
FORTUNA & FORTUNA, 2008).
Além disso, a presença desses microrganismos em altas contagens
pode indicar também um perigo potencial da veiculação de patógenos, pois a
grande maioria das bactérias patogênicas pertence a este grupo. Mesmo que
os patógenos estejam ausentes e que não tenham ocorrido alterações nas
condições sensoriais do alimento, um número elevado destes microrganismos
indica que o alimento pode ser prejudicial à saúde (FRANCO & LANDGRAF,
2003; SILVA et al., 2007)
Os bolores e as leveduras constituem um grande grupo de
microrganismos, a maioria originária do solo ou ar. Sua temperatura de
crescimento ótima encontra-se na faixa de 25 a 28 °C, não crescendo bem em
temperaturas mesófilas (35 a 37 °C) e raramente em temperaturas acima de
45 °C. Os bolores e leveduras são bastante resistentes a condições adversas,
como pH ácido e baixa atividade de água (SILVA et al., 2007).
A detecção e quantificação de fungos é uma parte essencial da análise
microbiológica na avaliação das práticas de higiene, estocagem,
processamento e distribuição dos alimentos. A contagem de bolores e
leveduras é aplicável principalmente na análise de alimentos ácidos, com pH
inferior a 4,5 (HAJDENWURCEL, 1998). Embora a maioria das infecções
fúngicas não esteja relacionada ao sistema digestório como sítio de infecção,
em indivíduos imunocomprometidos pode ser importante causa de DTA.
Segundo Rodrigues (2005) altas contagens de bolores e leveduras indicam má
seleção da matéria-prima, deficiência no processamento do alimento e ou na
sanitização.
25
Os coliformes são bactérias indicadoras de contaminação fecal e
pertencem à família Enterobacteriaceae. As bactérias pertencentes ao grupo
são bastonetes Gram-negativos, não produzem a enzima oxidase, não formam
esporos, são anaeróbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com
produção de ácido e gás a 35-37ºC em 24/48 horas e apresentam atividade da
enzima β-galactosidase (LE CLERC, 2001). Os principais gêneros são:
Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. Na prática os coliformes
são divididos em totais e termotolerantes. Cerca de 20 espécies fazem parte do
grupo de coliformes totais, sendo elas encontradas em diversos ambientes
como: trato gastrointestinal de humanos e outros animais de sangue quente,
solos, vegetais e efluentes que contenham matéria orgânica.
Os coliformes termotolerantes, anteriormente chamado coliformes
fecais, formado por bactérias que podem ser diferenciadas pela capacidade de
fermentar a lactose com produção de gás na temperatura de 45 ºC em 24
horas. Dentre as bactérias de habitat reconhecidamente fecal, do grupo dos
coliformes termotolerantes, Escherichia coli é a mais conhecida e facilmente
diferenciada. Embora também possa ser introduzida em alimentos a partir de
fontes não fecais, é o melhor indicador de contaminação fecal conhecido até o
momento (LE CLERC, 2001).
Estudos têm sido realizados para verificar a presença desses
microrganismos nos serviços de alimentação. Andrade et al. (2003) e
Kochanski et al. (2009) analisaram o ar ambiente, as mãos dos manipuladores,
os equipamentos e utensílios de uma unidade de alimentação e nutrição e
Coelho et al. (2010) analisaram o ar ambiente e utensílios de um restaurante
comercial e em ambos os estudos foi relatada a existência de bactérias
mesófilas, bolores e leveduras e coliformes totais. Estes resultados mostram
que estes microrganismos podem ser isolados nos serviços de alimentação,
podendo contribuir com os surtos de DTA.
Nas últimas décadas, patógenos alimentares como Salmonella, S.
aureus, Campylobacter, Escherichia coli, Listeria monocytogenes e Yersinia
enterocolitica têm apresentado resistência a antibióticos, o que pode
comprometer ao tratamento das DTA graves (WHITE et al., 2002).
A maioria das infecções bacterianas de origem alimentar causa
processos de diarreia autolimitada e não necessita de tratamento com
26
antibióticos. Infecções sistemáticas, incluindo bacteremia, ocorrem
especialmente nos casos que envolvem pacientes idosos e
imunocomprometidos (MENG & DOYLE, 2002).
Embora a resistência bacteriana a antimicrobianos seja realizada, na
maioria das vezes, em amostras provenientes de infecções relacionadas à
assistência à saúde, faz-se necessário a análise de amostras isoladas do
ambiente a fim de verificar a possibilidade dessas estirpes servirem como
reservatórios de genes codificadores de resistência a antimicrobianos (DÍAZ et
al., 2006).
2.2.1 Suscetibilidade dos microrganismos aos antimicrobianos.
O aumento da resistência das bactérias aos agentes antimicrobianos
se tornou um problema de Saúde Pública. Em várias partes do mundo foram
isolados microrganismos que apresentam resistência à maioria dos
antimicrobianos conhecidos (OLIVEIRA & SILVA, 2008). Este fato se deve ao
uso extensivo e muitas vezes inapropriado dos antibióticos, más condições de
higiene, ao fluxo contínuo de viajantes, aumento de pacientes
imunocomprometidos, entre outros (VON NUSSBAUM et al., 2006).
A administração de antimicrobianos em níveis sub terapêuticos para
promover o crescimento mais rápido de animais pode ser outra razão
encontrada para acelerar o surgimento de bactérias resistentes aos
antimicrobianos. Esta resistência é posteriormente transferida a partir dos
animais para seres humanos através da cadeia alimentar, se difundindo no
ambiente (WHITE et al., 2002).
Os mecanismos de resistência podem ser intrínsecos, adquiridos por
mutação genética e aquisição de genes de outros microrganismos, ou uma
associação de ambas (FORBES et al. 1998; DZIDIC & BEDEKOVIC, 2003).
Os genes para o mecanismo de resistência podem estar localizados no
cromossomo ou no plasmídeo. O DNA cromossômico é relativamente estável,
enquanto que o plasmidial pode ser facilmente mobilizado de uma estirpe para
outra, uma espécie para outra e até mesmo de um gene para outro (JAY,
2005).
27
A conjugação é o mecanismo mais comum pelo qual o gene de
resistência é transferido para outro microrganismo. Recentemente, foi
delineado um novo modelo conhecido como transposon, que conseguem
transportar porções de plasmídeos (JAY, 2005). Os mecanismos de ação e de
resistência de cada classe de antimicrobiano estão descritos no Quadro 2.
Classe de antimicrobianos Mecanismo de
ação
Mecanismos de
resistência
Aminoglicosídeos: Amicacina;
Canamicina; Estreptomicina
Gentamicina; Netilmicina
Tobramicina.
Inibem a síntese
proteica, fixando-
se à
subunidade
ribossomal 30S
Alterações enzimáticas;
redução da captação da
droga pela célula devido
à perda de proteínas
porinas;
Alvos da célula
bacteriana alterados
por mutação.
β-lactâmicos: Cefalotina;
Cefotetan; Ceftazidima e
Cefepime.
Inibem a síntese
da parede
celular,
fixando-se às
proteínas
ligadoras de
penicilina,
impedindo a
produção de
peptideoglicanos.
Destruição enzimática
por β-lactamases;
Alvos da célula
bacteriana alterados
por mutação;
Redução da captação da
droga pela célula devido
à perda de proteínas
porinas.
Fenicóis: Cloranfenicol Inibe a síntese
proteica, fixando-
se à
Subunidade
ribosomal 50S.
Alterações enzimáticas;
Diminuição da captação
da droga pela célula
devido à perda de
proteínas porinas.
Fluoroquinolonas:Ciprofloxacina;
Norfloxacina; Ofloxacin.
Inibem a síntese
de DNA, fixando-
se às DNA-
girases.
Diminuição da captação
da droga pela célula
devido à perda de
proteínas porinas;
Fontes: FORBES et al 1998; KONEMAN et al. 2001.
Quadro 2: Principais classes de antimicrobianos e seus, respectivos,
mecanismos de ação e de resistência bacteriana.
28
Classe de antimicrobianos Mecanismo de
ação
Mecanismos de
resistência
Glicopeptídeos: Vancomicina Inibem a síntese
da parede
celular.
Interagem com
precursores e
impedem sua
incorporação à
nova parede
celular.
Alvos da célula
bacteriana alterados
por mutação.
Macrolídeos, Lincosamidas e
Streptogramina (grupo MLS):
Azitromicina; Claritromicina;
Clindamicina e Eritromicina
Inibem a síntese
proteica, fixando-
se à
Subunidade
ribossomal 50S.
Alterações enzimáticas;
Alvo ribossomal alterado;
Sistema de efluxo da
droga pela célula,
reduzindo sua
concentração intracelular.
Sulfonamidas Interferem na via
do ácido fólico.
Alteração de alvos
enzimáticos.
Tetraciclinas Inibem a síntese
proteica, fixando-
se à
subunidade
ribossomal 30S
Sistema de efluxo da
droga pela célula,
diminuindo sua
concentração intracelular;
Inativação enzimática;
Alvo ribossomal alterado.
Inibidores da via Folato:
Trimetoprim
Interferem na via
do ácido fólico,
fixando-se
à enzima
diidrofolato-
redutase.
Alteração de alvos
enzimáticos.
Fontes: FORBES et al 1998; KONEMAN et al. 2001.
Continuação Quadro 2: Principais classes de antimicrobianos e seus,
respectivos, mecanismos de ação e de resistência bacteriana.
29
Nas últimas décadas, a resistência a antimicrobianos β-lactâmicos tem
sido cada vez mais relatada. Em patógenos Gram-negativos, as β-lactamases
continuam sendo o fator mais importante que contribui para a resistência a β-
lactâmicos, e a sua prevalência é crescente, bem como a sua evolução
alarmante parece estar diretamente relacionada com a utilização clínica de
novas sub-classes de β-lactâmicos (MEDEIROS, 1997; VON NUSSBAUM et
al., 2006).
As β-lactamases são enzimas bacterianas capazes de clivar o anel β-
lactâmico, alterando a estrutura do antimicrobiano, que não consegue se ligar
efetivamente às proteínas ligadoras de penicilina (PBP), o que permite que a
síntese da parede celular bacteriana continue normalmente (FORBES et al.,
1998).
Algumas β-lactamases podem ser codificadas pelo cromossomo, de
forma constitutiva ou induzível e outras por plasmídeos, sendo estes também
portadores de genes para resistência a outros agentes antimicrobianos, tais
como aminoglicosídeos, tetraciclinas, sulfonamidas e cloranfenicol
(PATERSON, 2000; HARADA et al., 2008).
As β-lactamases de Espectro Estendido (ESBL) são, por definição,
enzimas da classe molecular A ou D (classificação de Ambler), ou das classes
2be ou 2d (classificação de Bush, Jacoby e Medeiros), possuem sítio de ação
contendo o aminoácido serina como resíduo catalítico principal, e têm a
capacidade de hidrolisar penicilinas, cefalosporinas de primeira, segunda e
terceira gerações e monobactâmicos, mas não cefamicinas ou carbapenemas.
Além disso, são inibidas por inibidores de β-lactamases, como o ácido
clavulânico ou tazobactam (STÜRENBURG & MACK, 2003; PFALLER &
SEGRETI, 2006). As ESBL e seus precursores têm localização plasmidial,
porém podem ter sido originadas nos cromossomos. Os plasmídeos que
carregam os genes codificadores das ESBL podem carrear também
determinantes de resistência a outros microbianos (BRADFORD 2001;
GNIADKOWSKI, 2001; COQUE et al., 2002; HERNÁNDEZ et al., 2003;
SAMAHA-KFOURY & ARAJ, 2003).
Mesa et al. (2006) relataram a presença de estirpes de enterobactérias
(K. pneumoneae, E. coli, K. oxytoca) produtoras de ESBL nos animais, fezes
30
humanas, salada de cenoura com tomates e alimentos cozidos, sugerindo
disseminação dessas resistência.
A resistência aos antimicrobianos também foi verificada em estirpes de
S. aureus. A resistência é muitas vezes adquirida por transferência horizontal,
apesar da mutação cromossômica e da seleção de estirpes pela utilização de
antimicrobianos também apresentarem um papel importante no aparecimento
de estirpes resistentes (CHAMBERS & DELEO, 2009).
Um importante mecanismo para resistência de estirpes de
Staphylococcus aos antibióticos β-lactâmicos é uma alteração nas proteínas de
ligação à penicilina, de modo que o antibiótico não tenha mais acesso ao seu
alvo de ação, a cadeia de peptideoglicano em crescimento. Em S. aureus, esse
mecanismo de resistência se dá pela produção de uma variante da proteína de
ligação a penicilina 2 (PBP 2) que é designada PBP 2a, codificada pelo gene
mecA, e que confere resistência à meticilina (KONEMAN et al., 2001).
O gene mecA está localizado em um elemento genético móvel
denominado de staphylococcal cassete chromosome mec (SCCmec) e é
encontrado tanto em MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus) como
em MRS (methicillin resistant Staphylococcus). A resistência a meticilina é
considerada o maior desafio atual, sendo MRSA altamente prevalente em
vários países do mundo, com taxas que muitas vezes ultrapassam 40% dos
isolados de S. aureus (ROSSOLINI et al., 2010).
Os estafilococos coagulase negativa (ECN) são responsáveis por
infecções, principalmente, em indivíduos imunocomprometidos. Além disso,
tem sido observada uma grande proporção de estirpes hospitalares desses
microrganismos resistentes à maioria dos antimicrobianos disponíveis. Esse
fato faz com que as infecções por ECN sejam difíceis de ser tratadas
(WIDERSTRÖM et al., 2012).
Estudo realizado por Rogers et al. (2009) revelou que as estirpes
nosocomiais de ECN geralmente possuem o gene mecA, que causa resistência
à meticilina e a outros antibióticos β-lactâmicos, como também a uma
variedade de outras classes de antimicrobianos.
A presença de estirpes de Staphylococcus aureus e ECN resistentes à
meticilina em sashimi foi verificado em estudo realizado por Hammada et al.
(2012), no Japão. Os autores relataram que o sashimi pode ser um veículo de
31
transmissão de estirpes de Staphylococcus multirresistentes e ressaltaram a
importância desse resultado, uma vez que trata-se de um alimento composto
de peixe (salmão, atum ou haddock) e é consumido cru por grande parte da
população japonesa.
Segundo Kluytmans (2010), existem evidências de que estirpes de
Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) estão atualmente
presentes em alimentos, especialmente em carnes, e que isso representa um
risco potencial para a saúde humana. Não resta dúvida de que o risco principal
resultante da presença de Staphylococcus aureus em alimentos é o
desenvolvimento de intoxicação alimentar. Entretanto, independente desse
fato, fatores de risco relacionados à ingestão de alimentos contaminados por
MRSA estão relacionados ao desenvolvimento de doença invasiva após essa
ingestão e há possibilidade dos alimentos serem contaminados por estirpes de
MRSA durante o processamento ou consumo.
Considerando que a resistência bacteriana aos antimicrobianos é um
problema de saúde pública, algumas estratégias deveriam ser adotadas a fim
de evitar o desenvolvimento dessas resistências como: o uso racional de
antibióticos, desenvolvimento de novos antibióticos e o controle e prevenção da
disseminação de microrganismos resistentes (DZIDIC et al., 2008).
Dada a importância da disseminação de agentes patogênicos resistentes
ou não a antimicrobianos, medidas efetivas para o controle higiênico-sanitário
de serviços de alimentação devem ser adotadas, a fim de evitar danos à saúde
pública.
2.3 Monitoramento das condições higiênico-sanitárias de serviços de
alimentação.
Os procedimentos de higienização visam o controle dos microrganismos
patogênicos ou indicadores no ambiente e superfícies, garantindo a qualidade
e inocuidade dos alimentos (ICMSF, 1997). O contato dos alimentos com
superfícies contaminadas é um dos principais fatores que determinam a
ocorrência de surtos de DTA (OMS, 2006). Resíduos alimentares que não
forem removidos eficazmente das superfícies, associados à umidade ou
presença de água sobre as mesmas representam fontes de nutrientes para os
32
microrganismos, propiciando a multiplicação destes e, consequentemente o
aumento da contaminação (SILVA JR, 2007; ICMSF, 1997).
A higienização divide-se em duas etapas: limpeza e desinfecção
(BRASIL, 2004). A limpeza se refere à operação de remoção de resíduos
orgânicos e minerais aderidos à superfície, constituídos principalmente por
proteínas, gorduras e sais minerais. A desinfecção é a operação de redução,
por método físico e/ou agente químico, do número de microrganismos a níveis
seguros do ponto de vista higiênico-sanitário.
Dentre os métodos físicos destaca-se o emprego do calor, nas formas
de água quente, vapor e a radiação ultravioleta. No caso de utilização de
métodos químicos, têm-se os produtos de limpeza e desinfecção como os -
detergentes e desinfetantes, que são denominados saneantes domissanitários,
produtos aplicados a ambientes domésticos e coletivos e que são
regulamentados pelo Ministério da Saúde, através da Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (BRASIL, 2001).
Os desinfetantes são capazes de eliminar, em curto espaço de tempo,
os microrganismos patogênicos presentes nos objetos e superfícies
inanimadas, no entanto os desinfetantes não eliminam esporos bacterianos,
que são mais resistentes (BRASIL, 2007).
Para que procedimentos de higienização sejam eficazes é fundamental a
escolha correta dos agentes de limpeza e desinfecção. Estes produtos devem
ser escolhidos considerando os seguintes aspectos: uso autorizado pela
legislação, grau de toxicidade, poder corrosivo e o efeito residual sobre os
alimentos e meio ambiente (ROSSONI & GAYLARDE, 2000).
Também deve ser considerado o tipo e grau dos resíduos aderidos às
superfícies, a qualidade da água empregada, a natureza da superfície a ser
higienizada, os métodos de higienização aplicados e os tipos e níveis de
contaminação microbiológica (ANDRADE, 2008; QUARENTEI et al., 2008).
Para que os agentes de limpeza e desinfecção atinjam a sua eficácia a
Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 216/2004, recomenda que a
diluição dos produtos de limpeza, o tempo de contato com a superfície a ser
higienizada, assim como o modo de uso e aplicação devem obedecer às
instruções recomendadas pelo fabricante (BRASIL, 2004).
33
Há diferentes tipos de desinfetantes que podem ser utilizados em
indústria alimentícia e afins, ou seja, produtos químicos destinados a locais que
produzem, elaboram, fracionam ou manipulam alimentos (BRASIL, 2007).
De acordo com a Portaria 15/1988, os princípios ativos autorizados são:
quaternário de amônio, compostos inorgânicos liberadores de cloro ativo, iodo
e derivados, álcoois e biguanidas (BRASIL, 1988). No Quadro 3, estão
relacionadas as principais propriedades de cada desinfetante e no Quadro 4
estão relacionados os desinfetantes e ação contra os microrganismos.
Propriedades
Princípios ativos
Cloro Iodóforos Surfactante
catiônico
Surfactante
ácido
Aniônico
Corrosão Sim Levemente Não Levemente
Irritabilidade a tecidos
humanos
Sim Sim, em
algumas
Não Sim
Incompatibilidade Metais leves,
fenóis e aminas
Amido,
prata
Madeira,
roupa de
naylon
Detergente
alcalino e
surfactante
aniônico
Estabilidade em
soluções
Volatilização
rápida
Volatilizaç
ão lenta
Estável Estável
Estabilidade em
soluções aquecidas
acima de 66ºC
Instável Estável
acima de
45ºC
Estável Estável
Efetividade em pH
neutro
Sim Não Sim Não
Concentração máxima
permitida pelo USDA e
FDA
200ppm 25ppm
200ppm
_
Fonte: SHAPTON,1991
Quadro 3: Propriedades dos diferentes princípios ativos utilizados em
desinfetantes comerciais.
34
Microrganismos
Princípios ativos
Cloro Iodóforos Surfactante
catiônico
Surfactante
ácido
Aniônico
Bactérias Gram
positivas
(láticas,
clostridios,
Bacillus,
Staphylococcus)
Boa Boa Boa Boa
Bactérias Gram
negativas (E.
coli,
Salmonella,
psicrotróficos)
Boa Boa Pobre Boa
Esporos Boa Pobre Regular Regular
Bacteriófagos Boa Boa Pobre Pobre
Adaptado de SHAPTON (1991)
Quadro 4: Ação dos princípios ativos frente aos principais microrganismos.
O cloro e suas várias formas (cloro líquido, hipocloritos, compostos
clorados orgânicos e inorgânicos), provavelmente, são os compostos mais
utilizados para a desinfecção em indústrias de alimentos e serviços de
alimentação. Apresentam baixo custo e amplo espectro germicida, devido à
sua ação sobre a membrana celular, inibição de enzimas envolvidas no
metabolismo da glicose, danos no DNA e oxidação de proteínas celulares
(SCHMIDT, 2003).
A quantidade de cloro livre que estará presente na solução dependerá
do pH. Em pH igual a 8,0, cerca de 22% do cloro está na forma ativa, enquanto
que, em pH igual a 6,0, cerca de 96% do cloro estará na forma ativa (SOUZA &
DANIEL, 2005). O Food and Drug Administration (FDA) recomenda a utilização
de cloro líquido e hipoclorito de sódio nas concentrações entre 50 a 200ppm,
com tempo de contato de 1 a 2 minutos para superfícies e equipamentos (FDA,
2001). Concentrações entre 100 e 200 ppm têm sido recomendadas para
desinfecção de utensílios e equipamentos no Brasil (ANDRADE, 2008).
Os álcoois como o etanol à 70% (vol/vol) apresentam atividade
antimicrobiana devido à sua capacidade de desnaturar proteínas e por serem
35
solventes de lipídeos, provocando lesões na membrana citoplasmática. São
agentes altamente desidratantes em concentrações muito elevadas, podendo
retirar grandes quantidades de água das células microbianas, fato que vai
impedir a entrada do álcool na célula e afetar sua atividade germicida. Nessas
condições, as soluções alcoólicas apresentam apenas efeito bacteriostático.
Por isso, recomenda-se o uso de soluções contendo no máximo 70% de álcool
etílico, para minimizar seu efeito desidratante (ANDRADE, 2008).
O álcool etílico apresenta maior utilização como agente sanificante nos
serviços de alimentação, particularmente na desinfecção de mãos de
manipuladores e de algumas superfícies. Pode ser usado individualmente ou
em formulações, como por exemplo, com iodo. A concentração de 70% é mais
usada, apresentando uma boa ação sobre formas vegetativas, mas não contra
esporos bacterianos (ANDRADE, 2008).
Os quaternários de amônio são surfactantes catiônicos ativos em uma
ampla faixa de temperatura e apresentam melhor atividade em pH alcalino, não
tendo efeito corrosivo sobre superfícies (SCHMIDT, 2003). São amplamente
utilizados como antissépticos e desinfetantes (MCDONNEL & RUSSELL,
1999). Sua ação se dá pela atração por materiais carregados negativamente ou
estruturas como as proteínas bacterianas (SCHMIDT, 2003).
Estudos realizados por Coelho et al. (2010), Veiros et al. (2009);
Aycicek et al. (2006); Kassa et al. (2001), relacionados à avaliação das
condições higiênico-sanitárias de serviços de alimentação evidenciaram a
presença de microrganismos sobre as superfícies analisadas revelando
inadequações com relação aos procedimentos de higienização, reforçando a
importância da efetividade do procedimento empregado para a saúde do
consumidor.
Patógenos alimentares que sobrevivem aos processos de desinfecção
empregados nos serviços de alimentação podem ocasionar graves problemas
de saúde pública (MACHADO et al., 2009). Por isso, é necessário monitorar as
condições higiênico-sanitárias dos serviços de alimentação, a fim de verificar
se os procedimentos de higienização estão sendo eficazes.
De acordo com o Conselho Nacional de Segurança Alimentar (CONSEA,
1994) segurança alimentar consiste na realização do direito de todos ao acesso
regular e permanente a alimentos com qualidade nutricional, higiênico-sanitária
36
e em quantidades adequadas para saudável reprodução do organismo humano
e existência digna, sem comprometer o acesso a outras necessidades
essenciais.
Para Oliveira et al. (2008) a oferta de refeições dentro dos padrões
higiênicos-sanitários é uma das condições essenciais para promoção,
manutenção da saúde e prevenção das DTA.
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) estabelece normas e
procedimentos de boas práticas que devem ser adotados pelos Serviços de
Alimentação, a fim de reduzir o risco de contaminação e os surtos de DTA.
O monitoramento da adoção dos procedimentos de boas práticas pode ser
realizado por métodos não experimentais como: inspeções visuais, a partir da
aplicação de roteiros de avaliação das condições higiênico-sanitárias e por
métodos experimentais relacionados às análises microbiológicas.
2.3.1 Roteiros de Avaliação das condições higiênico-sanitária de serviços
de alimentação.
Para avaliação da adoção das boas práticas em serviços de alimentação
é comum a utilização de roteiros de inspeção, também denominados check list
ou lista de inspeção. O roteiro é um instrumento que pode ser utilizado para
verificação, avaliação e monitoramento de serviços de alimentação com
relação à legislação vigente (VEIROS et al., 2007).
Os roteiros apresentam como vantagens o baixo custo e a facilidade de
utilização. Além disso, reúnem os principais tópicos legalmente exigidos e
podem ser aplicados de forma sistemática e concisa, permitindo identificar e
assinalar os itens que estão ou não em conformidade com a legislação
sanitária (VEIROS et al., 2007).
Estes instrumentos propiciam a análise detalhada do processo produtivo
de refeições e dos procedimentos higiênico-sanitários adotados (VEIROS et al.,
2009). Na literatura há alguns roteiros disponíveis como os sugeridos pela
Legislação sanitária: CVS 5/2013 e RDC 275/2002, e por alguns autores como
Akutsu et al. (2005), Kassa et al. (2001), Mallon & Bortolozo (2004), Tomich et
al. (2005), Tancredi et al. (2006) e Saccol (2009) que têm sido aplicados nos
37
serviços de alimentação a fim de fornecer diagnóstico higiênico-sanitário do
estabelecimento avaliado.
A partir da utilização de roteiro de inspeção sanitária em cinco creches
Oliveira et al. (2008) relataram não conformidades com relação a higiene dos
manipuladores, ao funcionamento e estrutura-física da cozinha. Poerner et al.
(2009) também identificaram não conformidades nos serviços de alimentação
localizados em Santa Rosa/RS, após a aplicação do check list. Machado et al.
(2009) aplicaram o roteiro em Serviços de Alimentação de Organizações Não
Governamentais (ONG) de Toledo/PR, sendo identificadas não conformidades
na estrutura física e instalações, equipamentos, móveis e utensílios e na
produção de refeições, o que facilitou a adoção de medidas corretivas.
Conforme observado nos estudos supracitados, os roteiros de inspeção
sanitária auxiliam na avaliação do serviço de alimentação, no entanto até o
momento não foi observada a existência de estudos que tratassem da
validação de conteúdo de instrumentos para avaliação das condições higiênico-
sanitárias de serviços de alimentação. A validação do instrumento é realizada
para verificar se os resultados de uma aferição se aproximam do estado
verdadeiro dos fenômenos que estão sendo medidos (PASQUALI, 2009).
Para Pasquali (2009) a validação pode ser classificada em: critério,
constructo e conteúdo. A validação de critério é realizada pela comparação de
um instrumento de medição com um critério externo, que representa o padrão
(HAYNES et al., 1995). Também chamada de preditiva ou concorrente, refere-
se ao grau de correlação entre os escores de um teste e outras medidas do
desempenho (critério) obtidas independentemente ou simultaneamente ao
teste. Quando o instrumento e o critério são aplicados simultaneamente, tem-
se validade concorrente; quando o critério é avaliado no futuro, refere-se como
validade preditiva (RAYMUNDO, 2009).
A validação de construto examina a definição e operacionalização de
variáveis que se encontram o mais próximo do significado teórico do conceito.
Um construto é a percepção formada a partir da relação entre as cognições e
variáveis observáveis. Refere-se à demonstração de que o instrumento
realmente mede aquilo a que se propõe medir. As evidências necessárias para
esse tipo de validação são obtidas a partir de uma série de estudos inter-
38
relacionados, através de testes estatísticos, das construções teóricas sobre a
relação entre as variáveis a serem medidas (RAYMUNDO, 2009).
A validação de conteúdo reflete a capacidade do instrumento em medir
um conjunto de comportamentos relacionados entre si e que estão associados
ao que está sendo medido (SOUSA & TURRINI, 2012). Esta também avalia o
grau em que cada elemento de um instrumento de medida é relevante e
representativo de um específico constructo com um propósito particular de
avaliação (DINI & GUIARDELLO, 2013). Ainda, a avaliação resulta do
julgamento de diferentes examinadores especialistas, que analisam a
representatividade dos itens em relação às áreas de conteúdo e à relevância
dos objetivos a medir (RAYMUNDO, 2009).
Alguns instrumentos tiveram seu conteúdo validado conforme observado
nos estudos realizados por Almeida et al. (2009) que validaram um instrumento
para classificação do idoso quanto a capacidade de autocuidado; Sousa &
Turrimi (2012) que validaram material educativo para pacientes submetidos à
cirurgia ortognática e Dini & Guirardello (2013) que validaram um instrumento
para avaliação de pacientes pediátricos.
Alguns estudos da prática clínica utilizaram a Técnica Delphi para
validação do conteúdo de seus instrumentos (ALMEIDA et al., 2009; DINI &
GUIARDELLO, 2013) Essa técnica está baseada na reunião de especialistas
para buscar o consenso sobre determinado assunto a partir de uma sequencia
de rodadas com feedback controlado, sendo a única forma de comunicação
entre os especialistas (LINSTONE & TUROFF, 1975).
O anonimato dos especialistas é mantido, favorecendo a expressão de
opinião precisa, sem interferência (ROWE et al., 1991). A necessidade de longo
periodo de tempo para aplicação da técnica, pode desencorajar a participação
dos especialistas (WILLIAMS & WEBB, 1994). No entanto a técnica Delphi, é
uma estratégia apropriada para estabelecer a validade de conteúdo de
instrumentos, pois permite analisar, de forma sistemática, as opiniões dos
especialistas (FARO, 1997).
Um instrumento, mesmo tendo seu conteúdo validado, deve ser
reprodutível sendo o teste de confiabilidade um critério utilizado. Este teste se
baseia na verificação do grau de correspondência entre avaliações
independentes (GIOVANNETTI, 1979). A confiabilidade fornece fidedignidade
39
ao instrumento de medida, que apresenta resultados consistentes daquilo que
pretende medir, sendo a condição necessária para a validade (RAYMUNDO,
2009).
A confiabilidade interavaliadores (interrater reliability) pode ser estimada,
possibilitando a verificação do grau de correspondência entre as avaliações
independentes de dois ou mais profissionais que classificam e avaliam uma
mesma situação, utilizando o mesmo instrumento de classificação (WHITNEY
& KILLIEN,1978).
A validação de instrumentos para o controle da qualidade higiênico-
sanitária de serviços de alimentação é útil e importante para auxiliar tanto aos
gestores dos serviços de alimentação com aos profissionais da área na
implantação das boas praticas de manipulação conforme prevê a legislação
vigente.
O uso de roteiro quando associado às análises microbiológicas dos
alimentos, superfícies, equipamentos e manipuladores complementam,
comprovam e asseguram o nível higiênico-sanitário do serviço de alimentação
avaliado (TEBBUTT, 2007).
2.3.2 Análises microbiológicas em serviços de alimentação
No serviço de alimentação a avaliação microbiológica fornece
informações importantes, que auxiliam na detecção de fontes de contaminação
e na eficiência dos processos de higienização adotados (ANDRADE et al.,
2003)
Em serviços de alimentação, o crescimento de microrganismos
patogênicos está associado à presença de umidade e material orgânico sobre
as superfícies que entram contato com alimentos e ao processo de
higienização inadequado (ZOTTOLA & SASAHARA, 1994; EVANCHO et al.,
2001; MOORE & GRIFFITH, 2002; ANDRADE, 2008; DOMÉNECH-SÁNCHEZ
et al., 2011). A higienização deficiente de equipamentos e utensílios tem sido
relatada como responsável, isoladamente ou associada a outros fatores, por
surtos de DTA (DOMÉNECH-SÁNCHEZ et al., 2011).
40
A análise microbiológica das superfícies pode auxiliar na avaliação do
processo de higienização bem como na definição da frequência e na
identificação das fontes de contaminação (EVANCHO et al., 2001).
Diversos autores (KASSA et al., 2001; SAGGO et al., 2003; SOUZA et
al., 2004; LELES et al., 2005; STASKEL et al., 2007) têm realizado análises
microbiológicas das superfícies que entram em contato com alimentos em
serviços de alimentação. De forma geral, foram analisadas as superfícies de
equipamentos (mesa de preparo, moedor de carne, fatiador de carne, placa de
corte); da estrutura-física (torneira da pia e da maçaneta de freezeres e
refrigeradores) e dos utensílios (garfos, facas e pratos).
Alguns identificaram a presença de microrganismos patogênicos como:
Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e outros sobre as
superfícies analisadas, apontando a necessidade do controle do processo de
higienização das superfícies (COELHO et al., 2010).
Diferentes técnicas de amostragem das superfícies podem ser aplicadas
como: a) remoção de microrganismos por contato direto; b) técnica de lavagem
das superfícies; c) técnica do “swab”; d) métodos rápidos, que detectam
resíduos de matéria orgânica e microrganismos oriundos de uma limpeza
deficiente como adenosina trifosfato (ATP) bioluminêscencia.
As placas de contato RODAC® (Replicate Organism Direct Agar
Contact) são utilizadas na metodologia de contato direto, por ter sua superfície
com meio de cultura em relevo, permitindo o contato (por pressão) com a
superfície a ser testada. O método de aplicação é simples, rápido e tem boa
precisão, porém são difíceis de ser utilizadas em superfícies úmidas, ásperas
ou irregulares e com contagens de microrganismos muito altas (KORNACKI,
2010).
A técnica de lavagem de superfícies consiste na lavagem, com líquido
estéril, que é agitado mecanicamente ou manualmente sobre a superfície. O
líquido coletado é então diluído e semeado nas superfícies de meios de cultura
para determinar a carga microbiana presente. O método pode ser empregado
em utensílios e equipamentos côncavos, mas não é adequado para superfícies
de grandes equipamentos. O método de lavagem é mais preciso e exato que a
técnica do “swab”, pois toda a superfície é amostrada (EVANCHO et al., 2001)
41
A técnica do “swab” consiste na remoção de microrganismos de uma
área demarcada da superfície através de fricção com “swab” estéril umedecido
em uma solução. Em seguida, o “swab” é colocado em solução de diluição e
desta é feito o plaqueamento em meio de cultura para contagem de
microrganismos. Essa técnica possui como vantagem a capacidade de ser
empregada em superfícies com irregularidades, além de ser simples e rápida.
Ainda hoje ela tem se mostrado uma importante ferramenta na validação de
limpeza em diversas áreas, como na indústria de alimentos (KORNACKI,
2010).
Entre as técnicas de detecção rápida, podemos encontrar o sistema de
ATP-bioluminescência. Nessa técnica, as moléculas de ATP presentes na
superfície reagem com o complexo enzimático luciferina-luciferase e a reação
irá emitir uma intensidade de luz, que é expressa em URL (Unidade Relativa de
Luz) (COSTA et al., 2004). A rapidez da leitura dos resultados do método de
ATP-bioluminescência é uma das principais vantagens para sua aplicação
(OLIVEIRA et al.,1998).
Para escolher a técnica mais adequada alguns critérios devem ser
considerados como: o objetivo do teste, a composição das superfícies a serem
analisadas, assim como o nível e o tipo de contaminação que pode ser
encontrada sobre a superfície (ANGELOTTI et al.,1964; FAVERO et al., 1968;
FLISS et al., 1991). Além disso, as vantagens e desvantagens de cada técnica
devem ser consideradas. O Quadro 5 apresenta as vantagens e desvantagens
de cada técnica de análise microbiológica de superfície.
42
Técnica de análise de superfície
Vantagens Desvantagens
Lavagem superficial
- Maior precisão que o swab e a placa de contato, pois toda a superfície pode ser imersa ou lavada na solução estéril.
- Não pode ser utilizada em superfícies grandes e/ou fixas; - O contaminante pode não ser solúvel na solução de lavagem ou pode estar ocluído na superfície.
Contato com esponjas de celulose
- Tende a capturar mais microrganismos da superfície do que a técnica do swab. - Boa sensibilidade em superfície seca.
- Em superfície úmida, tem limite de detecção mais baixo do que o swab teste e a placa de contato.
Esfregaço em superfície com Swab
- Facilidade de aplicação. - Baixo custo. - Pode ser utilizado em superfícies irregulares de difícil acesso para a higienização.
- Muito subjetiva. - Dificuldade no controle do ângulo, do grau da pressão empregado e a umidade da cabeça do swab, podendo influenciar na determinação do resultado.
Placas de contato em ágar do tipo “RODAC”
- Simplicidade e facilidade na aplicação. - Maior precisão que o swab.
- Não é possível realizar diluições. - Só deve ser utilizada em superfícies limpas, planas e lisas, caso contrário pode haver super crescimento de microrganismos, o que inviabilizará a contagem. - Não é recomendado o uso em superfícies rugosas, porosas e de difícil acesso.
Fonte: FAVERO et al., 1968; EVANCHO et al., 2001; FORSYTHE, 2002; AYCICEK et al., 2006
e MOORE & GRIFFITH, 2007, GLASEL 2011.
Quadro 5: Relação das vantagens e desvantagens de cada técnica de análise
microbiológica de superfície.
A legislação brasileira não estabelece critérios de padrão microbiológico
para as superfícies em ambientes processadores de alimentos. Por esse
motivo, os resultados obtidos com o monitoramento de superfícies são
normalmente comparados às especificações propostas por órgãos oficiais ou
entidades científicas, como a American Public Health Association (APHA) e à
Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS) (ANDRADE et al., 2003). Nos
Quadros 6 e 7 estão descritos os padrões microbiológicos sugeridos por alguns
43
autores para avaliar as condições higiênico-sanitárias de equipamentos e
utensílios.
Microrganismos Critério (UFC/cm²)2 Referência
Bactérias mesófilas
≤ 2 (satisfatório) > 2 ( insatisfatório)
American Public Health Association (Speck, 1984).
0-10 (excelente) 11-29 (ótimo) 30-49 (regular) 50-99 (mau) >100 (péssimo)
Organização Panamericana de Saúde (Moreno, 1982).
≤ 5 (satisfatório) 5-25 (lavar novamente) > 5 ( insatisfatório)
Harrigan e Maccange, 1976
≤ 50 (satisfatório) > 50 ( insatisfatório)
Silva Jr., 2007
Coliformes termotolerantes (fecais)
Ausência Silva Jr., 2007; Speck, 1984; Moreno, 1982; Harrigan e Maccange, 1976
Staphylococcus aureus Ausência
Silva Jr., 2007 Bacilus cereus Ausência
Pseudomonas aeruginosa
Ausência
1- Facas de manipulação, placas de altileno, monobloco, assadeira, panela, espátula,
escumadeira, concha, cuba do banho maria e bancada de manipulação; 2- Unidades
formadoras de colônias por centímetro quadrado.
Quadro 6: Padrões Microbiológicos para avaliação das condições higiênico-
sanitárias de equipamentos e utensílios de preparação1, segundo
organizadores oficiais e autores.
Microrganismos Critério (UFC/cm²)2 Referência
Bactérias mesófilas
Até 100/cm² (satisfatório) >100 ( insatisfatório)
Tiedman, 1944
≤ 100 (satisfatório) > 100 ( insatisfatório)
Silva Jr., 2007
1-Pratos, bandejas, garfos, facas, colheres, copos de vidros, potes plásticos; 2- Unidades
formadoras de colônias por centímetro quadrado.
Quadro 7: Padrões microbiológicos para utensílios de mesa, segundo
organizações oficiais e autores.
44
Dependendo dos resultados obtidos, os procedimentos de higienização
adotados devem ser mantidos ou medidas corretivas devem ser aplicadas
(ANDRADE, 2008). Além disso, a fim de auxiliar na definição dos
procedimentos de higienização é necessário o estudo da comunidade
microbiana dos serviços de alimentação para conhecer os microrganismos
presentes nestes ambientes.
2.4 Estudo da comunidade microbiana por métodos dependentes e
independentes de cultivos.
O estudo da comunidade microbiana pode ser realizado por métodos
dependentes e independentes de cultivo.
Os métodos dependentes de cultivo ou tradicionais foram desenvolvidas
por Pasteur, Koch, Beijerinck e Winogradsky (apud TORSVIK et al., 1990).
Estes métodos de análise da comunidade microbiana estão relacionados com a
caracterização de culturas puras isoladas em laboratório e fundamentam-se na
utilização de testes morfológicos e bioquímicos para tipagem, subtipagem e
identificação de gêneros, espécies e subespécies microbianas. O isolamento
do microrganismo exige meios de cultura não-seletivos e/ou seletivos que
supram as necessidades metabólicas dos microrganismos (GANDRA et al.,
2008).
A identificação microbiana pelos métodos dependentes de cultivo inclui a
avaliação das características macroscópicas como: temperatura ótima de
crescimento e morfologia das colônias e microscópicas como: tamanho,
formato, padrões de agregação celular, mobilidade, presença ou ausência de
flagelos e coloração de Gram (HOLT, 1994)
Estes podem ser complementados pelos testes bioquímicos ou
fisiológicos, que também são relevantes para o estudo de microrganismos
cultiváveis. As reações bioquímicas são catalisadas por enzimas que têm a
capacidade de degradar carboidratos, lipídios, proteínas e aminoácidos. Os
testes bioquímicos podem apresentar interpretações errôneas, principalmente
se houver uma limitação do número de testes, além de possuir um custo de
análise muito elevado (FARBER et al., 2001).
45
Os métodos dependentes de cultivo utilizados na detecção de
microrganismos, embora confiáveis e eficientes, podem requerer vários dias e
até mesmo semanas antes dos resultados serem obtidos (MARIN et al., 2006).
As propriedades fenotípicas dos microrganismos podem não ser expressas ou
podem ser de difícil interpretação e classificação. No ambiente a ser analisado
também pode haver células viáveis, porém não-cultiváveis (TORSVIK et al.,
1990; MARIN et al., 2006).
Dessa forma, dada às limitações dos métodos dependentes de cultivos,
quando estes são associados aos métodos independentes geram resultados
mais completos em estudos de comunidades.
Nas últimas décadas foi significativo o aumento do desenvolvimento dos
métodos moleculares para a detecção, identificação e caracterização de
bactérias patogênicas (DESTRO, 1995). Isso ocorreu porque se verificou a
existência de grande diversidade de microrganismos que até então não tinham
sido acessados pelos métodos dependentes de cultivo (TORSVIK et al., 1990;
TORSVIK et al., 2002). Os métodos independentes de cultivo permitem acesso
ao genoma de toda a comunidade microbiana de uma amostra
(HANDELSMAN, 2004).
Existem diversas técnicas moleculares como as baseadas na
amplificação das sequencia de DNA e RNA pela reação em cadeia da
polimerase (PCR), que tem se tornado uma ferramenta importante no estudo
taxonômico e de comunidades bacterianas (MUYZER et al, 1993). A reação,
em cadeia da polimerase, é uma técnica sensível, pela qual, pequenas
quantidades de seqüências de DNA ou RNA específicas podem ser
enzimaticamente amplificadas até que sejam obtidas milhões de cópias da
sequência alvo (KONEMAM et al., 2001).
A reação em cadeia de polimerase é realizada em equipamento
automatizado e computadorizado, denominado termociclador, que promove a
alternância de temperaturas por determinados períodos de tempo,
possibilitando a ocorrência de ciclos repetitivos de desnaturação e síntese do
DNA (KONEMAM et al., 2001).
O uso da PCR, para conhecer o perfil microbiano de um determinado
ambiente é uma alternativa viável aos métodos convencionais, dependentes de
cultivos microbianos (MARLONY et al., 2003). Como vantagens, a PCR
46
apresenta maior rapidez, bom limite de detecção, maior seletividade,
especificidade, potencial para automação e a possibilidade de analisar
bactérias que não são cultiváveis em meios de cultura normalmente utilizados
(BUSH & NITSCHKO, 1999). Porém a desvantagem de sua utilização se refere
à incapacidade em diferenciar as células vivas, das mortas, a presença de
inibidores de enzima polimerase em alguns alimentos, o alto investimento em
equipamentos e reagentes e a falta de padronização e regulamentação por
parte dos órgãos oficiais (MARLONY et al., 2003).
Existem também as técnicas que diferenciam a comunidade microbiana
através do padrão de bandeamento do gene ribossomal, como a eletroforese
em gel com gradiente desnaturante (DGGE).
O DGGE se baseia na mobilidade eletroforética de fragmentos de DNA
com mesmo tamanho, mas com sequências diferentes de pares de base,
amplificados por PCR de uma mesma amostra ambiental. Isto ocorre à medida
que os fragmentos de DNA migram em um gel de poliacrilamida contendo
gradiente desnaturante composto por uréia e formanida, no qual os fragmentos
são separados baseados em seus diferentes perfis de desnaturação (MUYZER
et al., 1993). Quando as sequencias de mesmos pares de bases atingem a
temperatura de desnaturação, em uma determinada posição do gel, a migração
cessa.
Devido a variação do gradiente de desnaturação, sequências de pares
de bases diferentes irão parar de migrar em diferentes posições, podendo ser
separados por DGGE (MUYZER, 1993). O perfil de bandas de DNA pode ser
visualizado corando-se o gel de DGGE com brometo de etídio, ou nitrato de
prata (MUYZER, 1993).
O DGGE é uma técnica de fingerprinting, ou seja, as sequências de DNA
são reconhecidas e cortadas por enzimas de restrição, que dividem o DNA em
fragmentos cujas dimensões e composição em nucleotídeos variam de
microrganismos para microrganismo e refletem as diferenças entre os alelos
dos vários loci. Esta técnica é rápida e pouco onerosa que possibilita a análise
simultânea de amostras múltiplas, o que permite o estudo da comunidade
microbiana relacionando às alterações no tempo e ambiente (MUYZER et al.,
1993). Além disso, também permite a identificação dos membros da
comunidade a partir da excisão, purificação, reamplificação e sequenciamento
47
das bandas obtidas com o DGGE. Esta técnica apresenta limitações pois
apenas fragmentos de até 500 pares de bases podem ser separados no gel de
poliacrilamida (CHANG et al., 2000).
Embora tenham sido verificadas limitações, o PCR-DGGE tem sido
amplamente utilizado associado ao sequenciamento das bandas (processo que
determina a ordem dos nucleotídeos de uma amostra) e tem se mostrado
bastante eficientes na identificação e caracterização bacteriana presentes nas
comunidades. Estas técnicas foram utilizadas por Vaerewijck et al. (2008) e
Tanaka et al. (2012) para avaliar, respectivamente, a comunidade de
protozoários em plantas de corte de carne e controlar as comunidades
microbianas envolvidas no processo de fabricação de molho de soja com o
intuito de obter uma melhor compreensão dos microrganismos presentes
nestes ambientes.
As informações obtidas pelas técnicas moleculares podem ser utilizadas
para determinar a comunidade microbiana, a presença de microrganismos
específicos ou dominantes, bem como verificar a presença de um determinado
gene. Além disso, podem ser complementares as técnicas dependentes de
cultivo, reduzindo o custo e o tempo das análises e aumentando a quantidade
de dados gerados.
48
3. JUSTIFICATIVA
Devido ao elevado número de relatos de doenças transmitidas por
alimentos associados aos serviços de alimentação, e na necessidade de
redução destes, Mello (2009), com o objetivo de monitorar as práticas
higiênicas durante o processo produtivo de refeições, desenvolveu um roteiro
de avaliação das condições higiênico-sanitárias de serviço de alimentação
(RACHS-SA) que foi aplicado em dez serviços de alimentação localizados no
estado do Rio de Janeiro.
Verificou-se a existência de não conformidades durante o processo
produtivo de refeições como: a adoção de hábitos inadequados pelos
manipuladores de alimentos (uso de adorno e conduta inadequada durante o
preparo das refeições); inadequações durante a distribuição dos alimentos
prontos para consumo (abuso de tempo e temperatura e ausência de proteção
nos balcões de distribuição), além de utensílios enferrujados e mal
higienizados. Estas não conformidades colocam em risco a qualidade das
refeições servidas assim como a saúde da população atendida, uma vez que
podem favorecer a disseminação de microrganismos nosocomiais e contribuir
para o surto de DTA.
Desta forma, as falhas durante o processo produtivo de refeições devem
ser identificadas e corrigidas e a caracterização da microbiota do serviço de
alimentação pode viabilizar a adoção de procedimentos de controle higiênico-
sanitário adequados, sendo necessário o uso de análises microbiológicas a
partir de técnicas independes e dependentes de cultivo.
Além disso, a utilização de ferramenta da qualidade para avaliar e
monitorar as condições higiênico-sanitárias em serviços de alimentação,
também é uma alternativa de baixo custo que pode auxiliar a adoção das boas
práticas nestes estabelecimentos, tendo em vista que nem todos tem acesso
às análises microbiológicas. A validação permite verificar se o instrumento
mede o que realmente se propõe e, além disso, poderá ser utilizada por
gestores de serviços de alimentação, fiscais sanitários e profissionais que
atuem na área.
49
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar o perfil da microbiota de um serviço de alimentação e
analisar a eficácia dos métodos empregados no controle higiênico-sanitário.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a. Pesquisar microrganismos patogênicos e indicadores das condições
higiênico-sanitárias das superfícies em um serviço de alimentação.
b. Identificar as espécies de bacilos Gram negativos e de Estafilococos
coagulase positivo e negativos isoladas das superfícies higienizadas do serviço
de alimentação.
c. Caracterizar o perfil da comunidade microbiana de um serviço de
alimentação através de técnicas moleculares.
d. Avaliar a eficácia do desinfetante a base de cloro sobre as estirpes
prevalentes nas superfícies do serviço de alimentação.
e. Verificar a presença de estirpes com perfil de resistência à antimicrobianos
de interesse para saúde pública.
f. Validar um roteiro para avaliação das condições higiênico-sanitárias de
serviços de alimentação.
50
5. ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL
5.1 Local de estudo:
O estudo foi realizado em um serviço de alimentação localizado no
município do Rio de Janeiro durante o horário do almoço. O serviço de
alimentação funciona diariamente e são servidos 1500 desjejuns e 3500
almoços por dia e está localizado próximo a algumas comunidades carentes,
hospitais e postos de saúde, sendo frequentado, principalmente por moradores
dessas comunidades e por população de rua, além de gestantes, idosos e
crianças.
O serviço de alimentação é administrado por empresa terceirizada
selecionada por processo de licitação que é responsável pelo preparo das
refeições e pela higienização das superfícies, como também a aquisição dos
produtos químicos de limpeza. Optou-se por desenvolver esta pesquisa no
restaurante que fica próximo ao laboratório de microbiologia de alimentos do
Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, a fim de viabilizar as análises das amostras coletadas.
O Estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa Parecer
118/2010 (Anexo I) e foi autorizado pela Secretaria de Estado de Assistência
Social e Direitos Humanos (SEASDH) (Anexo II).
5.2 Critérios para escolha dos pontos de coleta de amostras de
superfícies:
A escolha dos pontos de coleta das amostras foi baseada nos resultados
obtidos por Mello (2009) a partir da aplicação do roteiro de avaliação das
condições higiênico-sanitárias de serviços de alimentação (RACHS-SA) e da
observação direta do processo de higienização.
5.2.1 Observação direta do processo produtivo de refeições:
Durante um mês foram realizadas quatro visitas técnicas ao serviço de
alimentação a fim de conhecer o processo de higienização das superfícies. Foi
51
verificado: (1) o procedimento adotado para higienização dos utensílios e da
mesa do refeitório (2) o princípio ativo utilizado para a higienização das
superfícies, (3) a frequência do processo de higienização, (4) a adoção de
medidas para evitar a recontaminação das superfícies e (5) o uso de etanol à
70% sobre os utensílios como pratos, talheres e bandejas mesmo após a
higienização em máquina de lavar, tendo em vista que a população que
frequenta este restaurante está em vulnerabilidade social e pode carrear
microrganismos patogênicos e resistentes a antimicrobianos. Durante a
observação direta foi realizado registro fotográfico e gravação em vídeo. Foram
obtidas informações com os manipuladores de alimentos e registradas em
diário de campo.
5.3 Pontos de coleta das amostras:
Foram analisadas amostras das superfícies incluindo: utensílios (pratos,
talheres e bandejas) e mesas do refeitório. A coleta foi realizada em 2 dias
distintos e em 3 horários diferentes: 10:00h (antes da abertura do restaurante),
12:00h (durante o horário de distribuição de refeições) e 14:00h (próximo ao
fechamento do restaurante). Para as análise moleculares foram empregados os
mesmo pontos, utilizando-se as amostras obtidas às 10:00h.
A higienização dos utensílios (pratos, bandejas e talheres) é realizada
com máquina de lavar em que é empregado detergente neutro e secante. Após
a lavagem os utensílios são retirados da máquina, ainda com resíduos de
alimentos e com umidade. O etanol a 70% é borrifado sobre os utensílios, mas
não entra em contato com toda a superfície.
Com relação às mesas do refeitório, as mesmas são higienizadas
manualmente pelos auxiliares de serviços gerais. Ao longo da distribuição das
refeições a higienização é realizada com pano úmido embebido em hipoclorito
de sódio. As mesas são constituídas de fórmica e apresentavatr5gf4m
ranhuras.
52
Figura 1: Diagrama explicativo das etapas realizadas na pesquisa.
Estudo da ecologia microbiana
Pesquisa de microrganismos
indicadores e patogênicos
(métodos convencionais)
Bact. Mesófilas, fungos e leveduras, estafilococos,
coliformes termotolerantes,
E. coli e bacilos Gram negativos.
Isolamento de bacilos Gram negativos e
Estafilococos
Identificação das amostras isoladas
(MALDI-TOF)
Estabelecer o perfil de suscetibilidade aos
antimicrobianos
Determinação da diversidade microbiana e de microrganismos prevalentes
PCR-DGGE e Sequenciamento
Método experimental
Método não experimental
Observação direta Observação direta
53
6. CAPÍTULOS
O presente estudo será apresentado em três diferentes capítulos. O
primeiro capítulo trata da caracterização da comunidade microbiana das
superfícies de serviços de alimentação. O segundo refere-se ao perfil de
suscetibilidade das estirpes de bacilos Gram negativos e estafilococos isoladas
de um serviço de alimentação e a ação do desinfetante e o terceiro reporta a
validação do conteúdo do roteiro para avaliação das condições higiênico-
sanitárias de serviços de alimentação.
6.1 CAPÍTULO I: Caracterização da comunidade microbiana presente nas
superfícies de serviços de alimentação.
6.1.1 Materiais e métodos
O estudo foi conduzido no período de fevereiro de 2012 a agosto de
2013 em um serviço de alimentação, localizado na cidade do Rio de Janeiro,
Brasil. O Serviço de alimentação serve aproximadamente 3500 refeições no
período do almoço e atende, principalmente, à população em vulnerabilidade
social, composta, principalmente, por população de rua e população de baixa
renda.
6.1.1.1 Avaliação higiênico-sanitária das superfícies:
Técnica de amostragem: Para os utensílios utilizou-se a técnica de
lavagem de superfície com 50 mL de solução salina estéril a 0,85%. Cada
amostra era composta de 5 unidades de um dos utensílios analisados. As
amostras das mesas foram coletadas pelo método de esfregaço em superfície
com swab com molde estéril de 100 cm², que foi diluído em 10 ml de salina
estéril a 0,85% (EVANCHO et al, 2001).
Análise microbiológica: Foram realizadas, segundo os métodos
descritos por Evancho et al. (2001). As suspensões iniciais foram
homogeneizadas, diluídas decimalmente e semeadas em triplicata nos meios
de cultivo apropriados. Foram pesquisados bolores e leveduras (agar batata
dextrose, pH 3,5, Himedia, Mumbai, Índia); assim como bactérias heterotróficas
54
aeróbias mesófilas totais (agar padrão para contagem, Himedia);; coliformes
totais (Caldo Lactose Bile Verde brilhante, Himedia); coliformes termotolerantes
(Caldo EC, Himedia); Escherichia coli (IDEXX Laboratories, EUA); Bactérias
Gram negativas totais (agar eosina azul de metileno, Himedia) e Estafilococos
(agar Baird-Parker, Himedia). Para micobactérias de crescimento lento,
incluindo Mycobacterium tuberculosis e de crescimento rápido foi utilizado o
método de Petroff e a amostra foi inoculada em (agar Löwenstein-Jensen, BD,
Curitiba, Brasil) Kent & Kubica (1985). A semeadura foi realizada em triplicata e
as placas de petri foram incubadas em tempo e temperatura específicos para o
crescimento de cada microrganismo analisado. Os resultados obtidos foram
expressos em unidade formadora de colônia por centímetro quadrado
(UFC/cm²) e número mais provável por centímetro quadrado (NMP/cm²). A
área aproximada dos utensílios foi calculada.
As estirpes de estafilococos foram presuntivamente caracterizadas pela
coloração de Gram e teste de produção das enzimas catalase, coagulase e
oxidase (FDA, 2001). Foram isoladas 5 estirpes de cada placa de agar Baird
Parker identificadas como estafilococos e Bactérias Gram negativas totais
foram selecionadas estirpes com diferentes morfologias. Todas as estirpes
foram criopreservadas à -20 ºC em caldo Brain Heart Infusion (BHI, Himedia)
com 20% de glicerol.
Análise das condições higiênico-sanitárias: Para a avaliação das
condições higiênico-sanitárias dos utensílios e mesas foram consideradas as
recomendações nacionais baseadas nos critérios estabelecidos por Silva Jr.
(2007) e também as recomendações internacionais, conforme critérios
estabelecidos pela APHA. Como não há uma legislação brasileira que defina os
padrões higiênico-sanitários para análise microbiológica de superfícies, utilizou-
se os parâmetros sugeridos por Silva Jr. (2007) que admite contagens de até
10² UFC/cm2 para bactérias mesófilas e ausência para Coliformes
termotolerantes e Staphylococcus aureus. De acordo com a APHA (EVANCHO
et al., 2001), os utensílios e mesa do refeitório devem ser considerados em
condições higiênico-sanitárias adequada quando forem obtidas contagens de 2
UFC/cm2 para bactérias mesófilas aeróbias.
55
6.1.1.2 Identificação das estirpes isoladas por espectrometria de massa
do tipo MALDI-TOF: Foi realizado em um espectrômetro de massa – Microflex
LT (Brucker, Germany), segundo as especificações do fabricante. As estirpes
criopreservadas foram ativadas em placas de Petri contendo Tripticase soy
agar (TSA) (Biomerieux, Brasil) e incubadas à 37 ºC/18h. Uma fração da
colônia de Bactérias Gram negativas totais ou Staphylococcus sp. foi
depositada, em triplicata, em uma placa de metal, sendo adicionado 1 µl de
matriz composta da solução saturada de ácido α-hidroxi-ciano-cinâmico
(CHCA). O espectro de massa gerado foi analisado e comparado com banco
de dados MALDI Biotyper (Bruker Daltonik, United Kingdom). Como calibrante
utilizou-se uma colônia de E. coli DH5α (LARTIGUE et al., 2009; PAIM et al.,
2013). Os critérios de identificação utilizados foram baseados na confiabilidade
fornecida pelo equipamento, sendo considerados scores ≥ 2.000 em que há a
identificação em nível de gênero e espécie.
6.1.1.3 Caracterização da estrutura da comunidade microbiana presente
na superfície: Foi realizada a extração de DNA, em que três mililitros dos
lavados e swab das amostras originais de superfícies foram removidos e
filtrados em membrana de celulose 0,22µm, que foram criopreservadas a -20
oC. A extração do DNA total da amostra foi realizada utilizando-se o FastDNA®
SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals), segundo as recomendações do fabricante.
Foi utilizado o par de iniciadores U968f GC e L1401 r para o gene que codifica
a subunidade 16S do RNA ribossomal (gene rrs) (HEUER & SMALLA, 1997).
Os fragmentos amplificados foram separados pela técnica de DGGE (MUYZER
et al.,1993), com a utilização do equipamento Dcode™ Universal Mutation
Detection System (BioRad, Richmond, USA), em géis de poliacrilamida que
foram submetidos à eletroforese a 75 V durante 16 horas a 60 oC.
Excisão e sequenciamento das bandas: Para identificar as
sequências de DNA obtidas, as bandas que foram detectadas em todas as
superfícies analisadas foram selecionadas e excisadas do gel de
poliacrilamida. As amostras foram enviadas para sequenciamento (Macrogen,
Seoul, Korea). Os resultados obtidos foram comparados com as sequencias de
gene depositadas no GeneBank.
56
6.1.1.4 Análise estatística: Para análise das condições higiênico-sanitárias foi
empregada a Análise de Variância (ANOVA), seguida de teste de Tukey, para a
verificação de diferenças estatísticas entre as médias da contagem dos
horários, para cada microrganismo pesquisado e para um mesmo dia de
análise (nível de significância de 5%). Foi utilizado o software XLSTAT
(addinsoft, versão 2013.4).
Para avaliar o perfil de bandas do PCR-DGGE, foram geradas matrizes
utilizando o programa Bionumerics (Applied Maths, versão 6.5) de acordo com
as instruções do fabricante, transformando os perfis de bandas em valores
quantitativos relativos. As diversas matrizes foram ordenadas pela análise de
escalonamento multidimensional não métrico (NMS) (KRUSKAL, 1964) com a
distância de matrizes de Sørensen com o auxílio do programa PC-ORD
statistical package (MjM Software, Gleneden Beach, OR, versão 5). A
ordenação do NMS foi restringida a duas dimensões, com o objetivo de
simplificar a análise e a discussão dos dados. Também foi executado o
Procedimento de Permutação de Múltipla Resposta (MRPP) a fim de verificar
se havia diferença entre as superfícies analisadas.
6.1.2 Resultados
6.1.2.1 Características microbiológicas das superfícies do serviço de
alimentação
Superfícies dos utensílios e mesas do refeitório
Foram analisadas 462 amostras: 32,5% (n=150) provenientes dos
pratos, 32,5% (n=150) dos talheres, 32,5% (n=150) das bandejas e 2,5%
(n=12) amostras das mesas do refeitório. Na Tabela 1 e 2 pode-se verificar que
tanto no primeiro como no segundo dia de coleta 100% das amostras estavam
fora dos padrões higiênico-sanitários internacionais e dos sugerido por Silva Jr.
(2007).
57
Tabela 1: Contagem microbiana das superfícies dos utensílios e mesas previamente higienizados no primeiro dia de coleta, em
três horários diferentes.
Microrganismos Prato Talher Bandeja Mesa do refeitório
10h00 12h00 14h00 10h00 12h00 14h00 10h00 12h00 14h00 10h00 12h00 14h00
Bactérias
mesófilas
UFC*/cm²
7,8x104A
4,2x104AB
2,3x103B
4,5x100B
1,1x102AB
5,0x102A
6,1x104 4,3x10
4 4,8x10
4 1,5x10
3 1,6x10
4 1,8x10
4
Bolores e
leveduras
UFC/cm²
4,6x101 8,0x10
3 1,5x10
1 1,0x10
2 2,0x10
2 1,4x10
2 1,4x10
3 1,7x10
2 2,0x10
2 3,9x10
4 3,0x10
5 3,6x10
4
Coliformes
termotolerantes
NMP*/cm²
1,3x101 1,1x10
1 2,3x10
0 5,0x10
1A 1,1x10
0B 0,6x10
0B 5,9x10
0 5,6x10
0 4,3x10
0 3,4x10
1 6,7x10
1 1,3x10
1
Staphylococcus
aureus UFC/cm²
nd**** nd nd nd nd nd nd nd nd 3,2x102**
5,4x103 5,5x10
3
Estafilococos
coagulase
negativa
UFC/cm²
3,9x102 1,8x10
2 7,9x10
1 1,5x10
2 8,3x10
1 2,5x10
2 2,2x10
4 8,2x10
3 1,1x10
4 nd nd nd
*UFC: Unidades Formadoras de Colônias; **Número mais provável por centímetro quadrado; **** Não detectado.
Padrão: Bactérias aeróbias mesófilas: 10²UFC/cm² (Silva Jr., 2007) e 2UFC/cm² (Evancho, Sveum, Moberg, & Frank, 2001); Bolores e leveduras:
10²UFC/cm² (Silva Jr., 2007); Coliformes termotolerantes e Staphylococcus aureus: Ausência (Silva Jr., 2007).
Nota: Itens que apresentaram a mesma letra na coluna não são significativamente diferentes ao nível de 5%.
58
Tabela 2: Contagem microbiana das superfícies dos utensílios e mesas previamente higienizadas no segundo dia de coleta, em
três horários diferentes.
Microrganismos Prato Talher Bandeja Mesa do refeitório
10h00 12h00 14h00 10h00 12h00 14h00 10h00 12h00 14h00 10h00 12h00 14h00
Bactérias
mesófilas
UFC*/cm²
3,1x105 5,1x10
4 7,2x10
4 1,6x10
3 7,8x10
2 2,0x10
2 2,6x10
4 3,9x10
4 3,0x10
4 7,7x10
4 1,1x10
4 3,6x10
5
Bolores e
leveduras
UFC/cm²
2,6x102 4,8x10
1 4,2x10
1 6,4x10
2 7,0x10
2 2,0x10
2 9,3x10
1 1,1x10
2 1,3x10
2 2,0x10
2 6,2x10
2 1,0x10
2
Coliformes
Termotolerantes
NMP*/cm²
1,5x101 1,4x10
1 8,2x10
0 5,7x10
1A 0,6x10
0B 2,0X10
0B 7,0x10
0 7,0x10
0 5,7x10
0 1,0x10
0 2,4x10
0 7,9x10
0
Staphylococcus
aureus UFC/cm²
nd**** Nd nd nd nd nd nd nd nd 1,4x101**
3,9x101 7,0x10
1
Estafilococos
coagulase
negativa
UFC/cm²
2,7x102 2,2x10
4 2,6x10
0 1,6x10
3A 1,3x10
1B 2,5X10
1B 4,5x10
3 1,1x10
3 3,8x10
3 nd nd nd
*UFC: Unidades Formadoras de Colônias; **Número mais provável por centímetro quadrado; **** Não detectado.
Padrão: Bactérias aeróbias mesófilas: 10²UFC/cm² (Silva Jr., 2007) e 2UFC/cm² (Evancho, Sveum, Moberg, & Frank, 2001); Bolores e leveduras:
10²UFC/cm² (Silva Jr., 2007); Coliformes termotolerantes e Staphylococcus aureus: Ausência (Silva Jr., 2007).
Nota: Itens que apresentaram a mesma letra na coluna não são significativamente diferentes ao nível de 5%.
59
Houve diferença significativa (p≤0,05) no primeiro dia de coleta entre a
média das contagens dos diferentes horários de coletas na pesquisa de
bactérias mesófilas aeróbicas nos pratos (p=0,045) e talheres (p=0,019)
(Tabela 1). No segundo dia, houve diferença significativa (p=0,024) entre a
média das contagens dos diferentes horários para pesquisa de estafilococos na
superfície dos talheres (Tabela 2).
Com relação à pesquisa de coliformes termotolerantes houve diferença
significativa nos dois dias entre a média das contagens dos diferentes horários
de coletas dos talheres (Dia 1: p=0,002 e Dia 2: p=0,014) (Tabelas 1 e 2). Não
houve diferença significativa entre a média das contagens de bolores e
leveduras nos três horários de coletas dos dois dias para todas as superfícies
analisadas (Tabelas 1 e 2). Em nenhuma amostra analisada foi detectada a
presença de micobactérias.
Identificação das estirpes de bacilos Gram negativos e estafilococos
isolados.
Foram isoladas um total de 239 estirpes de bactérias Gram negativas
com morfologia diferenciada das superfícies das bandejas, talheres e mesas do
refeitório. Na Figura 2, pode-se verificar a frequência e a superfície em que a
espécie isolada foi detectada.
60
Figura 2. Frequência das espécies de bacilos Gram negativos isoladas das
superfícies das bandejas, talheres e mesas.
Quanto aos Staphylococcus sp. foram isoladas 152 estirpes; destes, 27
(17,8%) foram identificados como S. aureus, sendo isolados da mesa do
refeitório e 125 foram classificados como estafilococos coagulase negativo: S.
cohnii (2%) e S. saprophyticus (0,7%) isolados das bandejas; S. pasteuri
(2,6%) dos talheres; S. epidermidis (3,9%); S. hemoliticus (1,3%); S. hominis
(0,7%) e S. warneri (71%) isolados dos talheres e bandejas.
Mesa do refeitório
Bandeja
Talher
61
Perfil da comunidade microbiana dos utensílios e mesas do refeitório.
Utilizando-se a técnica de sequenciamento das bandas de PCR-DGGE
(Figura 3) foram identificados microrganismos presentes nas superfícies
analisadas como pode ser observado na Tabela 3. Foram selecionadas para
sequenciamento as bandas que eram mais frequentes nas superfícies
analisadas.
Legenda: B: bandeja; P: prato; T: talher; M: mesa. i: dia 1; ii: dia 2 e iii: dia 3 de coleta.
Figura 3. Perfil de bandas obtido por PCR-DGGE da região codificadora do
RNAr 16S, de microrganismos isolados das superfícies dos utensílios e das
mesas. As setas indicam as bandas selecionadas para sequenciamento.
62
Tabela 3. Identificação das bandas obtidas por PCR- DGGE baseada no
BLAST (GenBank) usando primers universais para bactérias totais.
Banda Espécie de Referência Porcentagem de
similaridade (%)
Nº de acesso
GenBank
Nº de bases
analisadas (bp)
1 Klebsiella pneumoniae 100 JN969334 361
2 Aeromonas caviae 100 JF920476 385
3 Micrococcus luteus 99 JX262404 345
4 Acinetobacter
calcoaceticus subsp.
anitratus
99 AB302132 471
5 Micrococcus luteus 99 JX262404 387
6 Micrococcus luteus 99 JX262404 405
7 Acinetobacter sp. 99 JF772529 509
8 Acinetobacter
baumannii 99 HE978267 405
9 Klebsiella sp. 98 GQ416644 387
10 Acinetobacter sp. 98 AM412161 248
11 Citrobacter sp. 98 HM536988 424
12 Aeromonas hydrophila 98 JX262991 357
13 Acinetobacter sp. 98 HM366447 345
14 Acinetobacter
calcoaceticus subsp.
anitratus
97 AB302132 370
15 Acinetobacter rudis 97 FR773879 353
16 Acinetobacter
calcoaceticus subsp.
anitratus
97 AB302132 465
17 Acinetobacter sp. 97 HM366447 317
Na Figura 4 pode-se verificar que os grupos propostos pela análise de
escalonamento multidimensional não métrico (NMS) apresentaram diferenças
significativas quando realizado o procedimento de permutação de múltipla
resposta (PPMR) (A = 0,28; p < 0,01). A Figura 4 mostra que a partir a
ordenação das bandas foi possível verificar há existência de comunidades
diferentes para cada superfície analisada, com também comunidades comuns
compostas por Klebsiella sp. e Acinetobacter sp.
63
Figura 4. Ordenação multidimensional não métrica realizada a partir das
matrizes obtidas do perfil de bandas da PCR-DGGE para as comunidades
bacterianas presentes nos utensílios e mesas.
64
6.1.3 Discussão
Com relação à avaliação das condições higiênico-sanitárias dos
utensílios e mesas do refeitório, a legislação brasileira não estabelece padrões
microbiológicos e as recomendações microbiológicas americanas são
consideradas rígidas demais para o Brasil, devido às altas temperaturas
ambientais médias anuais em nosso país, sendo admitidas contagens de até
10²UFC/cm² para bactérias mesófilas e bolores e leveduras, considerando a
recomendação de Silva Jr. (2007).
Verificou-se, portanto, que em 100% das amostras a contagem de
bactérias mesófilas, bolores e leveduras, Staphylococcus sp. e Coliformes
termotolerantes (Tabela 1 e 2) não atendiam as recomendações de Silva Jr.
(2007) e nem a internacional.
Os resultados do presente estudo corroboram com aqueles obtidos por
Staskel et al. (2007) que realizaram estudo em cozinhas escolares localizadas
no Texas (EUA), relataram que em 41% das superfícies analisadas foram
detectados com microrganismos da família Enterobacteriaceae. Yoon et al.
(2008) que avaliaram as superfícies de cozinhas escolares de Jinju, South
Korea relataram a presença de Escherichia coli e Staphylococcus aureus.
Apesar de não ter sido detectada a presença de micobactérias de
crescimento lento ou rápido, a pesquisa deste microrganismo é necessária, já
que estão associados a graves patologias. Estes microrganismos apresentam
uma grande resistência às condições ambientais, sendo reconhecidos por
permanecer viável por longos períodos no ambiente (FIJAN et al., 2007). Os
serviços de alimentação, que apresentam falhas no processo de higienização
podem viabilizar a presença de micobactérias, principalmente os que atendem
populações em vulnerabilidade social que podem estar mais expostos a este
tipo de contaminação. No entanto a presença de Mycobacterium foi detectada
por Franco et al. (2013) no leite de vaca.
Para o controle microbiológico em serviços de alimentação é comum o
uso das técnicas dependentes de cultivo, que estão relacionadas com a
caracterização de culturas puras isoladas em laboratório e fundamentam-se na
utilização de testes morfológicos e bioquímicos para tipagem, subtipagem e
65
identificação de gêneros, espécies e subespécies microbianas. Os métodos
dependentes de cultivo utilizados na detecção de microrganismos, embora
confiáveis e eficientes, requerem vários dias e até mesmo semanas antes que
os resultados sejam obtidos (GANDRA et al., 2008).
Além disso, as propriedades fenotípicas das bactérias podem não ser
expressas ou podem ser de difícil interpretação, classificação e no ambiente a
ser analisado podem haver células viáveis, porém não-cultiváveis (TORSVIK et
al., 1990).
A maioria dos bacilos Gram negativos são frequentemente isolados nos
serviços de alimentação (STASKEl et al., 2007; YOON et al., 2008), mas
Wautersiella falsenii foi descrita por Kämpfer et al. (2006) a partir de 26
amostras clinicas obtidas de laboratórios Belgas no período de 1980 a 2004
como sendo não fermentadores, oxidase e catalase postivos, imóveis e
apresentam pigmentação amarelada quando submetidos a longo período de
incubação. Até o momento, não foram encontrados relatos deste
microrganismo em serviços de alimentação ou indústria de alimentos. Neste
estudo Wautersiella falsenii foi isolada em todas as superfícies do restaurante
(Figura 1).
Além disso, nas mesas do refeitório foram identificados Staphylococcus
aureus, o que sugere que o método de higienização manual utilizado não é
capaz de eliminar estes microrganismos. A presença de altas concentrações de
estafilococos coagulase negativa nas superfícies analisadas também
representa um risco à saúde da população que frequenta o restaurante. Estes
microrganismos têm sido reconhecidos como agentes etiológicos de processos
infecciosos, principalmente em indivíduos imunocomprometidos e podem
causar infecções cutâneas e oculares como furúnculos, conjuntivite purulenta e
blefarite, um processo inflamatório das pálpebras, comumente associada à
infecção por estafilococos (BARRETO & PICOLI, 2008).
Staphylococcus warnerii foi o ECN mais frequente nas superfícies dos
talheres e bandejas. Este microrganismo é encontrado na pele humana e na
cavidade nasal e na boca (OHARA-NEMOTO et al., 2008), podendo causar
bacteremia, infecção na pele, olhos e trato urinário (TAN et al., 2006). Podem
formar biofilmes nas superfícies (MARQUES et al., 2007).
66
Em associação às técnicas dependentes de cultivo utilizou-se as
técnicas independentes de cultivo como as análises moleculares para conhecer
a comunidade microbiana dos serviços de alimentação e orientar a escolha do
princípio ativo do produto químico de limpeza, assim como na técnica de
higienização empregada.
Dentre as técnicas moleculares, tem-se a reação em cadeia de
polimerase (PCR), que é uma alternativa viável aos métodos convencionais
dependentes de cultivo microbiano, para conhecer o perfil microbiano de um
ambiente (MALORNY et al., 2003). Para a diferenciação de comunidades
microbianas tem sido utilizado o padrão de bandeamento do gene ribossomal
por eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) (MUYZER et al.,
1993). O PCR-DGGE tem sido amplamente utilizado associado ao
sequenciamento das bandas obtidas, e tem se mostrado bastante eficiente na
identificação e caracterização bacteriana presente nas comunidades
(Vaerewijck et al., 2008). Zhao et al. (2012) utilizaram a técnica para
caracterizar a comunidade microbiana do solo e Al-Radha et al. (2012) para
identificar bactérias associadas a doenças peri-implante, no entanto, não foram
encontrados relatos do emprego do PCR-DGGE para a caracterização da
comunidade microbiana de serviços de alimentação.
No presente estudo, a partir do emprego do PCR-DGGE pode-se
observar não só a presença de uma comunidade bacteriana especifica em
cada superfície, como também representantes distribuídos em todas as
superfícies estudadas, a exemplo dos gêneros Klebsiella e Acinetobacter.
Não há relatos na literatura da detecção de Acinetobacter sp. em
serviços de alimentação. No entanto, trata-se de uma bactéria de grande
importância clínica, sendo causa de diversas infecções hospitalares, incluindo
bacteremia, pneumonia e meningite e está envolvido com infecções
relacionadas à assistência à saúde (IWASHKIW et al., 2012). Desta forma, o
predomínio destes microrganismos nas superfícies analisadas indica falhas no
processo de higienização e contaminação cruzada.
A presença de enteropatógenos na microbiota dos utensílios e mesas do
restaurante evidencia o risco a que são expostos os comensais. Estes achados
reforçam a necessidade de rigoroso controle microbiológico nos serviços de
alimentação a fim de analisar se os procedimentos empregados na
67
higienização das superfícies estão adequados, de forma a evitar a
multiplicação e a disseminação desses microrganismos para outros ambientes.
68
6.2 CAPÍTULO II. Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos e
desinfetante a base de cloro em estirpes de Acinetobacter sp.,
Enterobacter sp., Klebsiella sp. e Staphylococcus sp. isoladas de serviço
de alimentação
6.2.1 Materiais e métodos
O procedimento de cultura, seleção das colônias e identificação das
estirpes foi realizado conforme descrito no item 6.1.1.
6.2.1.1 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos: A partir da
identificação e quantificação dos gêneros presentes nas superfícies dos
serviços de alimentação, selecionou-se as estirpes que se apresentavam em
maioria nas superfícies, para a realização do teste de susceptibilidade aos
antimicrobianos. Utilizou-se as estirpes de Staphylococcus sp. e bacilos Gram
negativos (Acinetobacter sp., Enterobacter sp. e Klebsiella sp.) isoladas dos
utensílios (bandejas e talheres) e das mesas do refeitório. Ao todo foram
analisadas 391 estirpes sendo, 239 bacilos Gram negativos e 152 de
estafilococos. As fontes de isolamento das estirpes estão apresentadas na
Tabela 4.
Tabela 4. Total de bacilos Gram negativos e estafilococos isolados das
superfícies higienizadas de talher, bandejas e mesa do refeitório.
Superfícies
Bacilos Gram negativos
Staphylococcusa sp
n % N %
Talher 131 55.0 113 74.3
Bandeja 97 40.4 15 10.0
Mesa do refeitório 11 4.6 24 15.7
Total 239 100 152 100
a Estafilococos coagulase positiva e negativa
69
A susceptibilidade dos isolados de Staphylococcus sp e bacilos Gram
negativos aos agentes antimicrobianos foi determinada pelo método de disco-
difusão segundo a metodologia proposta por Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI, 2012).
A partir de culturas recentes em Trypticase soy agar - TSA (Biomérieux-
Rio de Janeiro-Brasil), foram preparadas suspensões em salina a 0,85% (p/v)
contendo 1,5x108 unidades formadoras de colônias - UFC/mL, semeadas com
swab em agar Mueller-Hinton (Himédia-Mumbai-Índia). Os discos impregnados
com antimicrobianos foram colocados sobre a superfície do meio de cultura e
incubados a 37 °C por 16 a 18 horas.
Para Staphylococcus coagulase negativa foram utilizados discos
contendo os seguintes antimicrobianos (Sigma-Aldrich-St.Louis-USA):
Eritromicina (15µg), Cefoxitina (30µg), Penicinilina (10units), Trimetoprim-
sulfamethoxazole (1.25/23.75µg), Linezolida (30µg), Tetraciclina (30µg) e
Ciprofloxacina (30µg) e para staphylococcus coagulase positiva, além dos
discos citados anteriormente, também utilizou-se Vancomicina (30µg). A estirpe
Staphylococcus aureus American Type Culture Colection (ATCC) 25923 foi
utilizada como controle.
Para bacilos Gram negativo os antibióticos utilizados foram: ácido
nalidíxico (30µg); amoxicilina - ácido clavulânico (20/10µg); ampicilina (10µg);
aztreonam (30µg); cefepime (30µg); cefotaxima (30µg); cefoxitina (30µg);
ceftazidina (30µg); cefuroxima (30µg); ciprofloxacina (5µg); cloranfenicol (30
µg); gentamicina (10µg) imipenem (10µg); tetraciclina (30µg) e
trimetoprim/sulfametoxazol (1,25/23,75µg). Como controle de qualidade do
teste utilizou-se a estirpe Escherichia coli ATCC 25922.
A interpretação dos halos formados seguiu as recomendações do CLSI
(2012). As estirpes, que apresentaram susceptibilidade intermediária ao
antimicrobiano, foram consideradas resistentes para fins de interpretação de
resultados.
70
6.2.1.2 Detecção fenotípica da produção de enzima β-lactamases de
espectro estendido (ESBL).
As estirpes de Escherichia coli, Klebsiella pneumonie e Klebisiella oxytoca
foram testadas com relação à produção de ESBL pela técnica de difusão em
disco, como descrito acima, utilizando os seguintes antimicrobianos:
cefuroxima (30µg), cefoxitina (30µg), ceftazidima (30µg), aztreonam (30µg) e
cefepime (30µg) (Sensifar®), que foram aplicados a uma distância de 2,5cm, de
centro a centro, de um disco de amoxicilina-clavulanato (20/10µg) (Sensifar)
(JARLIER et al., 1988). As placas contendo os antimicrobianos foram
incubadas a 37 °C por 18 a 24 horas. Para o teste presuntivo da produção de
ESBL foi medido o tamanho dos halos conforme CLSI (2012) e para
confirmação da produção de ESBL, foi verificado se as amostras apresentaram
distorção nos halos de inibição para qualquer um dos cinco antimicrobianos β-
lactâmicos. O fato de que a partir de 2010 o CLSI indicar que não há
necessidade de realizar este teste para fins de diagnóstico da resistência, este
ainda é preconizado para fins epidemiológicos, e foi realizado no presente
estudo com esta finalidade.
6.2.1.3 Eficácia do desinfetante a base de hipoclorito de sódio frente às
estirpes isoladas.
Para avaliação da atividade bactericida do desinfetante a base de cloro
foi empregado o método da diluição de uso (FIOCRUZ/INCQS, 2004),
utilizando cilindros de aço inox, polidos na parte interna e externa, com 8 mm
de diâmetro externo, 6mm de diâmetro interno e 10mm de comprimento. Para
cada análise foram utilizados 60 cilindros estéreis que foram previamente
tratados em solução de hidróxido de sódio 1N por 18 horas, transferidos para
solução de asparagina a 0,1%.
Foram escolhidas para teste 3 estirpes de Acinetobacter sp. e 3 de
Klebsiella sp. isoladas das superfícies do restaurante, além das culturas padrão
Staphylococcus aureus ATCC 6538, Salmonella enterica subsp. enterica
serovar Choleraesuis ATCC 10708 e Escherichia coli ATCC 25922. A partir de
cultura recente (24 horas), foi feito inóculo de aproximadamente 108 UFC/mL,
para tubos contendo 10 mL de caldo nutriente (Merck-Rio de Janeiro-Brasil),
71
sendo realizadas 3 incubações consecutivas por 24 horas a 37 ºC e 1
incubação por 48 horas a 37 ºC.
Posteriormente, os cilindros foram transferidos para o tubo contendo o
inóculo que foi incubado por 48 horas e mantidos por 15 minutos à 25 °C. Após
este período, os cilindros foram colocados na posição vertical em placas de
Petri estéreis contendo papel de filtro e mantidos em estufa a 35 °C por 40
minutos.
O desinfetante a base de cloro utilizado foi coletado no serviço de
alimentação no dia da realização do experimento. Para a determinação da
concentração de cloro livre da solução foi utilizado o kit teste cloro livre
(Hidroall-São Paulo-Brasil).
Para o experimento foram distribuídos 10 mL do desinfetante em 60
tubos estéreis e 10 mL de caldo nutriente (Merck, Brasil) adicionado de 0,6%
de tiossulfato de sódio em 120 tubos estéreis. O experimento foi realizado em
seis etapas, sendo cada etapa composta de uma série de 10 tubos contendo
desinfetante e 2 séries de 10 tubos contendo caldo nutriente.
Foi colocado um cilindro inoculado com o microrganismo a ser testado
em cada tubo contendo desinfetante a base de cloro, com intervalo de 1
minuto. No décimo minuto, o cilindro do primeiro tubo contendo desinfetante foi
retirado e transferido para o tubo contendo caldo nutriente da primeira série e o
mesmo procedimento foi seguido com os demais cilindros, com 1 minuto de
intervalo. Dessa forma, cada cilindro permaneceu em contato com o
desinfetante por 10 minutos. Após esta etapa, todos os tubos das duas séries
foram incubados a 37 ºC por 24 horas.
Para que a ação bactericida do desinfetante fosse considerada eficaz,
ele deveria ser capaz de inibir o crescimento bacteriano sobre pelo menos 59
dos 60 cilindros utilizados, conferindo um nível de confiança de 95%. O
controle positivo foi feito com a inoculação de um cilindro contaminado, sem
que houvesse contato com desinfetante, em um tubo contendo caldo nutriente
adicionado de 0,6% de tiossulfato e o controle negativo com a inoculação de
um cilindro que não foi contaminado em outro tubo contendo caldo nutriente
adicionado de 0,6% de tiossulfato.
72
6.2.2 Resultados
Nas Tabelas 5 e 6 estão descritos os resultados da avaliação da
susceptibilidade das estirpes aos antimicrobianos. Verificou-se que duas
estirpes de Enterobacter asburiae, uma de Enterobacter clocae e uma
Klebsiella pneumoniae foram resistentes ao imipenem (Tabela 5). Das estirpes
de Acinetobacter sp. a única característica significativa foi a resistência de
72,3% à cefoxitina.
73
Tabela 5. Perfil de resistência das estirpes de Acinetobacter sp, Enterobacter sp e Klebsiella sp isoladas das superfícies
higienizadas de em um serviço de alimentação.
Microrganismo
Antimicrobianos
AMC CRX CFO CAZ ATM CPM AMP IMP TET CLO CIP NAL CTX SUT GEN
% % % % % % % % % % % % % % %
Acinetobacter baumannii (n=47) nt nt 73 2,4 nt 0 12,2 0 0 nt 0 nt nt 39 0
Acinetobacter baylyi (n=5) nt nt 80 20 nt 20 0 0 0 nt 0 nt nt 0 0
Acinetobacter tondoii (n=1) nt nt 0 0 nt 0 0 0 0 nt 0 nt nt 0 0
Enterobacter asburiae (n=31) 67,7 9,7 87 3,2 9,7 0 38,7 6,4 3,2 0 0 3, 6,4 3,2 0
Enterobacter clocae (n=58) 77,6 20,7 89,6 12 3,4 0 62 1,7 1,7 0 0 0 3,4 0 0
Enterobacter cowanii (n=2) 100 0 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0
Enterobacter gergoviae (n=1) 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Entorobacter kobei (n=4) 25 0 75 0 0 0 50 0 0 0 0 0 0 0 0
Klebsiella oxytoca (n=3) 33,3 0 33,3 33,3 66,6 0 66,6 0 0 0 0 0 0 33,3 0
Klebsiella pneumoniae (n=56) 12,5 3,6 7,1 5,4 5,4 0 94,6 1,8 1,8 0 0 3,6 0 1,8 0
AMC: Amoxicilina; CRX: Cefuroxima; CFO: Cefoxitina; CAZ: Ceftazidima; ATM: Aztreonam; CPM: Cefepime; AMP: Ampicilina; IMP: imipenem; TET: Tetraciclina; CLO: cloranfenicol; CIP: ciprofloxacina; NAL: ácido nalidíxico; CTX: Cefotaxima; SUT: trimetoprim-sulfametoxazol; GEN: Gentamicina. Nt: não testado
74
Das estirpes de Enterobacter sp. isoladas, 3 possuíam resistência
múltipla (resistência a três ou mais antimicrobianos), 35 estirpes apresentaram
multirresistência (resistência a 3 ou mais classes de drogas) e 8 tinham
multirresistência e resistência múltipla. Com relação às estirpes de Klebsiella
sp. uma apresentou resistência múltipla e quatro estirpes eram
multirresistentes. Das 47 estirpes do Gênero Acinetobacter sp., 2 estirpes
apresentaram resistência múltipla. Das 59 estirpes de Klebsiella sp. nenhuma
produziu a enzima β-lactamase de espectro estendido (ESBL).
Das 152 estirpes de Staphylococcus sp., 27 foram identificadas como
estafilococos coagulase positiva e 125 como coagulase negativa, o perfil de
resistência desses isolados pode ser observado na Tabela 3. Nenhuma das
estirpes de estafilococos coagulase positivaapresentou resistência à
vancomicina. Staphylococcus epidermidis apresentou resistência à meticilina
(Tabela 6).
Tabela 6. Perfil de resistência das estirpes de Staphylococcus aureus e
estafilococos coagulase negativa isoladas das superfícies higienizadas de um
serviço de alimentação.
Microrganismos
Antimicrobianos
CFO CIP ERI GEN LIN PEN TET SUT VAN
% % % % % % % % %
Staphylococcus warneri (n=108) 0,9 0,9 3,7 0 0,9 23 0,9 0,9 -
Staphylococcus epidermidis (n=6) 66,6 0 83 50 0 83 17 0 -
Staphylococcus hominis (n=1) 0 0 0 0 0 0 0 0 -
Sthapylococcus haemolyticcus (n=2) 0 0 0 0 0 0 0 0 -
Staphylococcus saprophyticus (n=1) 0 0 0 0 0 0 0 0 -
Staphylococcus cohnii (n=3) 0 0 33 0 0 0 0 0 -
Staphylococcus pasteuri (n=4) 0 0 0 0 0 75 25 0 -
Staphylococcus aureus (n=27) 0 2 0 0 0 2 1 1 0
CFO: Cefoxitina; CAZ: Ceftazidima; CPM: Cefepime; AMP: Ampicilina; IMP: imipenem; TET: Tetraciclina;CIP: ciprofloxacina; SUT: trimetoprim-sulfametoxasol; GEN: Gentamicina; ERI: eritromicina; LIN: linezolida; PEN: Penicilina; VAN: vancomicina
75
Após testar o desinfetante a base de cloro na diluição de uso (200ppm)
utilizada no serviço de alimentação de estudo nos isolados de Klebsiella
pneumoniae e Acinetobacter baumannii e nas estirpes padrão Staphylococcus
aureus, Salmonella sp e Escherichia coli, foi constatado que nenhuma das
estirpes testadas apresentou resistência ao cloro.
76
6.2.3 Discussão
A frequência de microrganismos resistentes tem aumentado de forma
constante nos Estados Unidos da América, Europa e em países em
desenvolvimento. Este aumento pode estar relacionado com uma combinação
de características microbianas: a pressão seletiva pela utilização de agentes
antimicrobianos, mudanças sociais e nas técnicas de uso dos antimicrobianos
(LIVERMORE, 2012).
Embora a resistência bacteriana aos antimicrobianos seja observada,
na maioria das vezes, em amostras provenientes de infecções relacionadas à
assistência à saúde, estas também podem estar presentes em isolados
ambientais (DÍAZ et al., 2006),
As estirpes selecionadas foram caracterizadas em um estudo prévio
como as frequentes em um serviço de alimentação, conforme pode ser
observado no capitulo 6.1, Figura 2. A presença destas estirpes pode ser
explicada por se tratar de microrganismos associados a manipulação
inadequada de alimentos como os estafilococos, microrganismos indicadores
de falhas em condições higiênico sanitárias como os coliformes entre eles
Klebsiella sp. e Enterobacter sp., assim como um microrganismo com
reconhecida capacidade de adesão em superfícies sólidas como Acinetobacter
sp. (KARSLIGIl et al., 2004).
No presente estudo, o perfil de resistência mais significativo foi a
resistência de uma estirpe de K. pneumoniae e duas de E. asburiae e uma de
E. cloacae ao imipenem.
As carbapenemases constituem uma familia de beta-lactamases e são
utilizados no tratamento de infecções graves causadas por Enterobacteriaceae
produtoras de beta-lactamases de espectro-extendido (ESBL). Estes
antimicrobianos são estáveis à hidrólise por β-lactamases e sua
susceptibilidade à maioria das estirpes os torna geralmente favorável no
tratamento contra microrganismos multirresistentes. Logo, a presença de
estirpes de bacilos Gram negativos resistentes ao imipenem reforça a
importancia de monitorar a multiplicação e a disseminação desses
microrganismos.
77
K. penumoniae é um dos patógenos nosocomiais mais importante e
possui a capacidade de desenvolver e/ou adquirir novos mecanismos de
resistência e podem se tornar uma reservatório de gene de resistência aos
antimicrobianos (PATERSON et al., 2004). Mesa et al. (2006) detectaram a
presença de K. pneumoniae produtora de ESBL em alimentos. No presente
estudo embora seis estirpes de K. pneumoniae tenham apresentrado
resistência às cefalosporinas de terceira geração (ceftazidima e cefotaxima),
não foi observada distorção no halo de inibição no teste de sinergismo, o que
sugere que estas estirpes não sejam produtoras de ESBL.
Levando-se em consideração a ocorrência de casos de infecções
comunitárias causadas por Acinetobacter baumannii, a presença deste
microrganismo como prevalente no serviço de alimentação demostra a
exposição de uma população em vulnerabilidade social ao risco de infecções
de pele e respiratória por este microrganismo, que tem uma propensão para
desenvolvimento de resistência antimicrobiana extremamente rápida,
principalmente resistência múltipla (PONTES et al., 2006). Entretanto, no
presente estudo, nenhuma estirpe de Acinetobacter apresentou resistência
significativa aos antimicrobianos.
Entre os estafilococos, o fenótipo encontrado mais significativo foi a
resistência à cefoxitina detectada em 66,6% das estirpes de Staphylococcus
epidermidis, caracterizadas como estafilococos coagulase negativos (ECN)
resistentes à meticilina. ECN resistentes à meticilina tem sido isolado de
diversas fontes, Vyletělová et al. (2011) que avaliaram a produção de leite cru
isolaram estirpes de S. epidermidis resistentes à meticilina. Huber et al. (2011)
isolaram estes microrganismos de carcaças de frango e carne picada e Mayer
& Hörner (2009) isolaram em um Hospital universitário.
Segundo Tavares (2000) o isolamento dessas estirpes em ambiente
não hospitalar pode estar relacionado com o uso prévio de antibióticos,
internação recente e atendimento diário em centros médicos. Uma forma de
minimizar a multiplicação e a disseminação destes microrganismos é utilizar
processos de desinfecção de forma adequada a fim de minimizar a
sobrevivência desses patógenos nas superfícies dos serviços de alimentação
(MACHADO et al., 2010).
78
O fato dessas estirpes terem sido isoladas em um serviço de
alimentação é um aspecto importante que deve ser destacado, pois as
refeições produzidas neste ambiente, assim como as superfícies podem servir
de veículo de disseminação de microrganismos com resistências importantes
aos antimicrobianos. Sendo assim, para tentar minimizar a multiplicação e a
disseminação desses microrganismos é importante utilizar produtos químicos
de limpeza com princípios ativos eficazes.
O Food and Drug Administration (FDA, 2013) recomenda o uso do
hipoclorito de sódio como agente desinfetante para superfícies que entram em
contato com alimentos em concentrações acima de 200ppm. Concentrações
entre 100 e 200ppm têm sido recomendadas para desinfecção de utensílios e
equipamentos no Brasil (ANDRADE & MACEDO, 1996). A Portaria CVS5/2013
(São Paulo, 2013) recomenda as concentrações de 1 a 2,5% de hipoclorito de
sódio para a desinfecção de frutas e vegetais.
No presente estudo o uso de hipoclorito de sódio à 200ppm apresentou
ação bactericida sobre as estirpes testadas, porém Machado et al. (2010) que
isolaram estirpes de Salmonella typhimurium e Salmonella bredeney, de fezes
de suínos e de um embutido, respectivamente e Salmonella enteritidis isoladas
de salmoneloses investigadas pela Vigilância Sanitária do RS, verificaram que
o Hipoclorito de sódio só foi eficaz em concentrações superiores a 200ppm.
Estudos realizados por Coelho et al. (2010), Veiros et al. (2009);
Aycicek et al. (2006); Kassa et al. (2001), relacionados à avaliação das
condições higiênico-sanitárias de serviços de alimentação evidenciaram a
presença de microrganismos sobre as superfícies analisadas revelando
inadequações com relação aos procedimentos de higienização, reforçando a
importância da efetividade do procedimento empregado para a saúde do
consumidor.
As estirpes que se apresentavam em maior quantidade no ambiente
dos serviços de alimentação de estudo, não foram resistentes ao cloro, no
entanto, estes microrganismos foram isolados de superfícies higienizadas o
que sugere que o procedimento de higienização adotado não é adequado ou
que ocorre a recontaminação.
79
6.3 CAPÍTULO III. Validação de conteúdo e confiabilidade de instrumento
de avaliação higiênico-sanitária.
6.3.1 Materiais e métodos
Tratou-se de um estudo descritivo, não experimental com delineamento
transversal realizado no período de fevereiro de 2011 a junho de 2012.
Amparou-se em princípios éticos, da Resolução 016/2000 do Conselho Federal
de Psicologia e pela Resolução 196 do Conselho Nacional de Saúde, com
aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Estudos em Saúde
Coletiva da Universidade Federal do Rio de Janeiro (parecer 118/2010) e
constou das seguintes etapas: 1ª) Elaboração do roteiro; 2ª) Submissão do
roteiro ao comitê de especialistas para validação do conteúdo e 3ª) Avaliação
do roteiro validado quanto a reprodutibilidade e confiabilidade.
6.3.1.1 Elaboração do RACHS-SA.
O instrumento foi elaborado a partir da pesquisa e análise de
ferramentas disponíveis na literatura para avaliação das condições higiênico-
sanitárias de estabelecimentos que manipulam, preparam, armazenam e/ou
comercializam alimentos, tomando por base a Resolução RDC 216/2004
(BRASIL, 2004) e as exigências da Norma Brasileira ABNT/NBR 15635/2008
(ABNT, 2008), que estabelece os requisitos e controles operacionais essenciais
para adoção das boas práticas.
Na elaboração do roteiro foram considerados os seguintes aspectos
relacionados às boas práticas: estrutura físico-funcional; recebimento e
armazenamento de alimentos, pré-preparo, preparo e distribuição de refeições;
higiene pessoal e ambiental, e documentação.
Foi proposto o cálculo do percentual de adequação das condições
higiênico-sanitárias (PACHS) parcial, para cada bloco que compõe o
instrumento, ou total, levando em consideração todos os blocos como mostram
as equações 1 e 2.
80
Equação 1: ACH bloco
Equação 2: ACH total
Para a classificação qualitativa das condições higiênico-sanitárias do
serviço de alimentação foi proposta a categorização adaptada da Resolução
275/2002, sendo classificadas como condições adequadas quando o PACHS
apresentar ≥76% de conformidade; parcialmente adequadas quando o ACH
ficar entre 51 e 75% e inadequadas quando o ACH for ≤ 50% (BRASIL,
2002).
6.3.1.2 Validação do conteúdo do RACHS-SA por comitê de especialistas.
Para estabelecer a validação do conteúdo do instrumento foi utilizada a
técnica Delphi, que consistiu em três fases: 2.1) seleção dos especialistas; 2.2)
apresentação do instrumento e orientação para avaliação do conteúdo do
roteiro quanto à aplicabilidade, relevância, pertinência e clareza e 2.3)
classificação dos itens dos instrumento de acordo com o risco oferecido à
qualidade higiênico-sanitária das refeições prontas.
Seleção do comitê de especialistas.
Foram convidados para o processo de validação dez especialistas que
atendiam a, pelo menos, dois dos seguintes critérios de inclusão, comprovados
pelo Curriculum vitae baseado na plataforma Lattes do CNPQ: a) experiência
profissional ou acadêmica mínima de cinco anos em segurança dos alimentos
e vigilância sanitária; b) possuir publicação e desenvolver pesquisas sobre
boas práticas em serviços de alimentação; c) conhecimento metodológico
sobre a construção de instrumentos de boas práticas em serviços de
alimentação, e d) pós-graduação Strictu e/ou Lato sensu em vigilância sanitária
ou áreas afins. Priorizou-se a escolha de profissionais de diferentes áreas da
saúde para que a avaliação do instrumento fosse realizada de forma
81
complementar. Após o aceite, foi enviado aos dez especialistas uma carta
explicativa sobre o processo de validação de conteúdo do instrumento
elaborado por correio eletrônico. Todos os dez participantes do comitê de
especialistas assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
Apresentação do instrumento e orientação para avaliação do
conteúdo quanto à aplicabilidade, relevância, pertinência e clareza.
Considerada como uma fase exploratória, o RACHS-SA foi apresentado
aos especialistas acompanhado de formulário de orientação para análise do
mesmo quanto à aplicabilidade, relevância e pertinência para a avaliação
higiênico-sanitária de SA, bem como clareza dos itens quanto à forma de
redação dos mesmos (TILDEN et al., 1990; ALEXANDRE & COLUCI, 2011). O
julgamento dos especialistas foi tabulado em planilha do Excel®, levando em
consideração seus comentários e sugestões.
Classificação dos itens do instrumento elaborado de acordo com o
risco oferecido à qualidade higiênico-sanitária das refeições prontas.
Essa fase, seguindo o preconizado na Técnica Delphi, foi composta de
rodadas para a análise do instrumento pelos especialistas, a fim de classificar
cada item do RACHS-SA de acordo com o risco oferecido à manutenção da
qualidade higiênico-sanitária das refeições prontas, conforme recomendações
do Ministério da Saúde (2012) em: Imprescindível (I), Necessário (N),
Recomendável (R), quando esses contribuíssem, respectivamente, de forma
crítica, menos crítica e não crítica para a contaminação dos alimentos. Ainda
nessa fase, os especialistas puderam sugerir a inclusão, modificação ou
eliminação de itens. Foi recomendado que o instrumento fosse avaliado em
ambiente tranquilo e sem interrupções de outras pessoas, de forma a não
interferir na qualidade da análise.
Os resultados foram escrutinados e as tendências centrais, assim como
as dispersões calculadas, foram enviadas por correio eletrônico aos
especialistas para que eles pudessem ver as respostas dos demais conforme
sugerido por Jairath & Weinstein (1994). Os itens que não obtiveram
82
concordância, assim como os novos itens inseridos, foram reavaliados pelo
comitê em uma nova rodada, como prevê a Técnica Delphi, até que fosse
obtida concordância interespecialista mínima de 70% na classificação de cada
item, sendo considerado validado o conteúdo do instrumento.
6.3.1.3 Análise da confiabilidade e reprodutibilidade do instrumento
validado.
Para medir a qualidade do RACHS-SA, foram convidadas quatro
nutricionistas que atuavam na área de Alimentação Coletiva, para aplicar o
roteiro com o conteúdo validado em um serviço de alimentação localizado na
cidade do Rio de Janeiro que produzia e distribuía 3.500 almoços de segunda a
sexta-feira para a coletividade sadia, tendo como objetivo a avaliação das
condições higiênico-sanitárias do serviço de alimentação, sua classificação
segundo o PACHS por bloco e total e analisar a confiabilidade e
reprodutibilidade do instrumento.
A aplicação do RACHS-SA foi realizada por todos os nutricionistas no
mesmo dia, entre as 8h e as 12h. Os avaliadores foram orientados a não
consultarem as demais colegas durante a aplicação do RACHS-SA e para não
comunicarem os resultados obtidos, a fim de evitar influência nas respostas.
Para comparar os percentuais de adequação das condições higiênico-
sanitárias do serviço de alimentação, obtidos a partir da avaliação dos quatro
nutricionistas, foi utilizada a análise de variância não paramétrica, sendo
aplicado o Teste de Kruskal-Wallis, sendo considerado o nível de significância
de 5% em todas as análises.
Para a análise dos dados, foi utilizado o pacote estatístico SPSS (versão
20). O coeficiente de correlação intraclasse (CCI), que avalia a homogeneidade
de duas ou mais medidas, foi utilizado para verificar a confiabilidade e a
reprodutibilidade do instrumento. Quando o CCI foi ≥0,75, a confiabilidade foi
considerada excelente, entre 0,4 e 0,75 houve confiabilidade satisfatória e
confiabilidade pobre quando o CCI foi < 0,4. O nível de significância de 5% foi
considerado em todas as análises (STREINER & NORMAN, 2008).
83
6.3.2 Resultados
6.3.2.1 Elaboração do instrumento para avaliação das condições
higiênico-sanitária.
O RACHS-SA foi desenvolvido tomando como base a estrutura do
roteiro disponível na legislação vigente, sendo composto inicialmente por 103
itens com variáveis dicotômicas para avaliação (conforme = 1 e não conforme =
0), que foram agrupados em 12 blocos: I. Armazenamento dos alimentos; II.
Estrutura física; III. Equipamentos e utensílios; IV. Higiene ambiental; V.
Manejo de resíduos sólidos; VI. Manipuladores de alimentos; VII. Preparo de
alimentos; VIII. Distribuição; IX. Controle integrado de vetores e pragas
urbanas; X. Abastecimento de água; XI. Documentação e XII. Capacitação dos
manipuladores de alimentos.
6.3.2.2 Validade do conteúdo do instrumento pela Técnica Delphi.
Caracterização do comitê de especialistas.
O comitê de especialistas composto pelos dez profissionais que
aceitaram participar dessa etapa da pesquisa possuía, em média, 18 anos de
experiência em uma das seguintes áreas: segurança dos alimentos e vigilância
sanitária. Com relação à formação acadêmica, 60% eram nutricionistas 10%,
pedagogas 10%, químicas e 10%, farmacêuticas. Dos especialistas, 40%
possuíam doutorado, 40%, mestrado e 20%, especialização em vigilância
sanitária ou áreas afins. Quanto à área de atuação, 40% trabalhavam como
docente, 40% eram consultores em serviços de alimentação e 20%
trabalhavam na Vigilância Sanitária.
84
Análise dos itens quanto à aplicabilidade, relevância, pertinência e
clareza.
O RACHS-SA foi avaliado positivamente por 100% dos especialistas
com relação à clareza na leitura, objetividade e relevância dos itens, sendo o
conteúdo do instrumento considerado adequado para avaliar as condições
higiênico-sanitárias de serviços de alimentação.
Com relação à aplicabilidade e relevância, os especialistas julgaram que
o RACHS-SA é uma ferramenta útil para visitas fiscais e para a avaliação dos
serviços de alimentação, sendo de simples aplicação e relevante, visto que
engloba os principais aspectos relacionados à inspeção sanitária, podendo
auxiliar os profissionais da área, estudantes e gestores na avaliação do
estabelecimento quanto aos aspectos sanitários.
Classificação dos itens do instrumento elaborado de acordo com o
risco oferecido à qualidade higiênico-sanitária das refeições prontas.
Para essa fase da pesquisa, foram realizadas três rodadas de avaliação
pelo comitê de especialistas, até que houvesse concordância entre os mesmos.
Na primeira rodada, dos 103 itens avaliados, de acordo com o risco oferecido
para a manutenção da qualidade higiênico-sanitária, 90% obtiveram consenso
entre os especialistas (Tabela 7), sendo 80% dos itens classificados como
imprescindíveis. O Comitê de especialistas solicitou a inclusão de 17 itens
(35% no bloco 1) e a subdivisão de 5 itens resultando em 15 novos itens de
avaliação (Tabela 7).
Os especialistas apontaram a necessidade de incluir a aferição das
temperaturas de armazenamento e distribuição dos alimentos, assim como a
periodicidade de troca de filtros de água e limpeza da caixa d’agua e dos
condicionadores de ar, medidas necessárias para orientar a adoção das boas
práticas. Além disso, 17 itens sofreram alteração quanto à sintaxe, para torná-
los mais objetivos. As sugestões dos especialistas foram incorporadas no
instrumento.
Na segunda rodada, os especialistas receberam o instrumento contendo
135 itens (Tabela 7), no entanto foram orientados a avaliarem os 27 itens
85
(referente aos itens incluídos e aqueles sem concordância) (Tabela 7). Dos 135
itens avaliados, 100% obtiveram consenso entre os especialistas, no entanto o
comitê solicitou a inclusão de 20 novos itens (Tabela 7).
Tabela 7: Alterações e discordâncias entre os especialistas, por bloco, nas três
rodadas de avaliação do instrumento, Rio de Janeiro 2013.
Blocos
1ª Rodada
2ª Rodada
3ª Rodada
Itens N
I¹ D² SC³ Itens N
I D SC Itens n n n n n n n
I. Armazenamento de alimentos 15 6 6 0 27 3 0 0 30
II. Estrutura física 29 1 4 1 34 2 0 0 36
III. Equipamentos e utensílios 6 0 0 0 6 0 0 0 6
IV. Higiene ambiental 4 1 0 1 5 8 0 0 13
V. Manejo de resíduos sólidos 5 0 1 1 6 2 0 0 8
VI. Recursos humanos 11 0 3 2 14 0 0 0 14
VII. Preparo de alimentos 5 1 0 1 6 1 3 0 10
VIII. Distribuição de refeições 12 2 0 1 14 0 0 0 14
IX. Controle integrado de vetores e pragas urbanas 3 1 0 0 4 0 1 0 5
X. Abastecimento de água 6 0 1 1 7 4 0 0 11
XI. Documentação 5 2 0 2 7 0 0 0 7
XII. Capacitação dos manipuladores de alimentos 2 3 0 0 5 0 0 0 5
Total 103 17 15 10 135 20 4 0 159 1. I = Total de Itens incluídos; ². D= Total de itens divididos; ³. SC: Total de itens sem
concordância.
Conforme sugerido por um dos especialistas, foi inserida a instrução de
utilização e preenchimento do RACHS-SA para orientar a inspeção sanitária e
a avaliação quali-quantitativa do serviço de alimentação, a fim de auxiliar na
aplicação do mesmo.
Na terceira e última rodada, para a classificação dos itens conforme o
risco oferecido à qualidade das refeições servidas, os especialistas receberam
o instrumento contendo 159 itens, mas foram orientados a julgarem apenas os
20 itens incluídos na segunda rodada (Tabela 8), assim como a instrução de
utilização e preenchimento do RACHS-SA. Nesta rodada, a maioria dos itens
(58,5%) foi classificada como imprescindível e não foram solicitadas alterações
(Tabela 8). Todos os especialistas julgaram a instrução de preenchimento
adequada.
86
Tabela 8: Classificação dos itens quanto ao risco oferecido para a manutenção
da qualidade higiênico-sanitária das refeições, conforme julgamento dos
especialistas, Rio de Janeiro 2013.
Blocos Itens
Classificação dos itens
Imprescindível Necessário Recomendado
N N % N % N %
I. Armazenamento de alimentos
30 20 66,7 10 33,3 0 0,0
II. Estrutura física 36 12 33,3 22 61,1 2 5,6
III. Equipamentos e utensílios 6 4 66,7 2 33,3 0 0,0
IV. Higiene ambiental 13 7 53,8 6 46,2 0 0,0
V. Manejo de resíduos sólidos
8 4 50,0 4 50,0 0 0,0
VI. Recursos humanos 17 13 76,5 4 23,5 0 0,0
VII. Preparo de alimentos 6 6 100,0 0 0,0 0 0,0
VIII. Distribuição de refeições 19 11 57,9 6 31,6 2 10,5
IX. Controle integrado de vetores e pragas urbanas
4 4 100,0 0 0,0 0 0,0
X. Abastecimento de água 8 6 75,0 2 25,0 0 0,0
XI. Documentação 7 3 42,9 4 57,1 0 0,0
XII. Capacitação dos manipuladores de alimentos
5 3 60,0 2 40,0 0 0,0
Total 159 93 58,5 62 39,0 4 2,5
O comitê avaliou os itens do instrumento e sugeriu as alterações
necessárias para que o conteúdo do RACHS-SA pudesse se tornar o mais
objetivo e compreensível possível.
6.3.2.3 Avaliação das condições higiênico-sanitárias do serviço de
alimentação e análise da confiabilidade e reprodutibilidade
interavaliadores.
O percentual de adequação das condições higiênico-sanitárias do
serviço de alimentação (PACHS total) foi considerado parcialmente adequado
(Tabela 9). Já o PACHS dos blocos III, IV e VI respectivamente: Equipamentos
e utensílios, Higiene ambiental e Preparo de alimentos foram classificados
como inadequados (Tabela 9). Ressalta-se que o bloco VI possui 100% dos
itens classificados como imprescindíveis (Tabela 8).
87
O teste de Kruskal-Wallis mostrou que não houve diferença estatística
significativa entre as avaliações obtidas, tanto para o PACHS total, como para
o PACHS dos blocos (Tabela 9).
Tabela 9: Percentual de adequação das condições higiênico-sanitárias do
serviço de alimentação a partir da avaliação dos quatro nutricionistas, Rio de
Janeiro 2013.
Bloco Nutricionistas
A (%)
B (%)
C (%)
D (%)
p-valor²
I. Armazenamento de alimentos 76 76 70 53 0,12
II. Estrutura física 41 55 41 39 0,34
III. Equipamentos e utensílios 33 16,6 0 0 0,55
IV. Higiene ambiental 54 46 46 39 0,84
V. Manejo de resíduos sólidos 62,5 87,5 62,5 50 0,23
VI. Recursos humanos 71,4 71,4 71,4 71,4 1,00
VII. Preparo de alimentos 33,3 50 33,3 33,3 0,78
VIII. Distribuição de refeições 72,2 55,5 66,6 44,4 0,33
IX. Controle integrado de vetores e pragas urbanas 50 75 50 50 0,67
X. Abastecimento de água 57 100 100 100 0,66
XI. Documentação 77,7 66,6 66,6 66,6 0,87
XII. Capacitação dos manipuladores de alimentos 60 80 80 80 0,82
PACHS¹ 59,2 58 58 51 0,64 1. Percentual de adequação das condições higiênico-sanitárias: Adequado ≥76%;
parcialmente adequado 51-75%; inadequado ≤50%
2. Não foram obtidas diferenças estatisticamente significativas pelo teste de Kruskal-Wallis.
Após o cálculo do coeficiente de correlação intraclasse (CCI), encontrou-se
75% dos CCI classificados como excelentes, 8% como satisfatórios e 17%
como pobres (Tabela 10).
88
Tabela 10: Coeficiente de correlação intraclasse obtidos das respostas dadas
pelos quatro nutricionistas para cada bloco do RACHS-SA, Rio de Janeiro
2013.
Blocos CCI¹ IC 95% p-valor
I. Armazenamento de alimentos 0,872 0,777 - 0,933 0,000
II. Estrutura física 0,784 0,635 - 0,882 0,000
III. Equipamentos e utensílios 0,667 -0,374 - 0,962 0,063
IV. Higiene ambiental 0,769 0,420 - 0,930 0,001
V. Manejo de resíduos sólidos 0,346 -0,108 - 0,874 0,225
VI. Recursos humanos 0,822 0,586 - 0,939 0,000
VII. Preparo de alimentos 0,957 0,847 - 0,993 0,000
VIII. Distribuição de refeições 0,918 0,824 - 0,968 0,000
IX. Controle integrado de vetores e pragas urbanas 0,941 0,701 - 0,996 0,000
X. Abastecimento de água 0,000 -0,851 - 0,737 0,455
XI. Documentação 1 - -
XII. Capacitação dos manipuladores de alimentos 0,933 0,725 - 0,992 0,000
¹. Coeficiente de correlação intraclasse: CCI>0,75 excelente; 0,4-0,75 satisfatória; <0,4 pobre.
89
6.3.3 DISCUSSÃO
A elaboração de instrumento para a avaliação das condições higiênico-
sanitárias de serviços de alimentação viabiliza a uniformização da identificação
das não conformidades e auxilia os gestores na implantação das normas
sanitárias vigentes (KOOPMANS & DUIZER, 2004).
O RACHS-SA foi avaliado por um comitê de especialistas que possuía
formação acadêmica e profissional heterogênea, com experiência necessária
para a avaliação do instrumento já que o sucesso da Técnica Delphi depende
do conhecimento e habilidade desse grupo (JONES et al., 1999).
O comitê de especialistas classificou todos os itens dos blocos VI e VII
respectivamente, Manipuladores de alimento e Preparo de alimentos como
imprescindíveis, ou seja, podem influenciar de forma critica na qualidade das
refeições servidas e causar danos à saúde do consumidor.
Estudos realizados por Kassa et al. (2001); Yoon et al. (2008) e Veiros et
al. (2009) têm relatado que a adoção de condutas inadequadas de higiene
pessoal pelos manipuladores de alimentos, assim como a existência de não
conformidades durante a etapa de preparo de refeições podem colocar em
risco a qualidade das refeições servidas. Yoon et al. (2008) verificaram a
presença de micro-organismos patogênicos como Salmonella e
Staphylococcus aureus nas mãos dos manipuladores de alimentos e
Cunningham et al. (2011) verificaram a existência de bactérias mesófilas na
área de preparo de refeições. Esses estudos reforçam a necessidade de um
controle rigoroso desses blocos e a classificação dos mesmos como
imprescindível pelo comitê de especialistas é necessária para auxiliar na
manutenção da saúde pública.
O RACHS-SA permite avaliar se o serviço de alimentação está em
adequação com a legislação vigente de forma direta, através da classificação
dos itens que compõem o instrumento em conformes e não conformes. A
classificação qualitativa das condições higiênico-sanitárias do serviço de
alimentação está baseada no percentual de adequação das condições
higiênico-sanitárias (PACHS).
Para Veiros et al. (2007) a possibilidade de pontuar e classificar os
blocos e o serviço de alimentação como um todo torna-se necessário, já que se
90
pode obter uma análise detalhada – o que torna a avaliação objetiva,
ressaltando as necessidades de correção das não conformidades, a fim de
cumprir as exigências legais.
Após o cálculo do percentual de adequação das condições higiênico-
sanitárias do serviço de alimentação e de cada bloco de avaliação, verificou-se
que o RACHS-SA foi capaz de identificar os itens que necessitam de medidas
corretivas imediatas, uma vez que podem interferir de forma crítica na
qualidade das refeições servidas. Os resultados obtidos com a aplicação do
RACHS-SA corroboraram com as análises microbiológicas realizadas que
também identificaram inadequações na higienização dos utensílios e mesas do
serviço de alimentação (Tabelas 1 e 2).
Não houve diferença significativa entre as avaliações dos nutricionistas,
mostrando que há existência de confiabilidade e reprodutibilidade do
instrumento. De acordo com Streiner & Normann (2008), para que um
instrumento apresente confiabilidade o valor do CCI deve ser ≥ 0,75. Como a
maioria dos blocos (75%) apresentou CCI acima de 0,75, reforça a existência
de confiabilidade do instrumento. No bloco X, o CCI ficou instável devido à
ocorrência de muitos valores iguais, dificultando o cálculo da variância dos
itens.
Os resultados obtidos indicam que o RACHS-SA pode ser aplicado com boa
reprodutibilidade pelos profissionais que atuam na área de segurança dos
alimentos e vigilância sanitária a fim de avaliar as condições higiênico-
sanitárias dos serviços de alimentação, auxiliar na adoção das boas práticas de
manipulação, favorecendo a manutenção da saúde pública.
A contribuição do estudo foi colocar à disposição de profissionais um
instrumento para a avaliação das condições higiênico-sanitárias de serviços de
alimentação com o conteúdo validado e reprodutível.
91
7. CONCLUSÕES
Todas as superfícies analisadas estavam em condições higiênico-
sanitárias inadequadas.
Os métodos dependente e independente de cultivo mostraram
compatibilidade, uma vez que detectaram a prevalência de Klebsiella
pneumoniae e Acinetobacter baumannii sobre as superfícies analisadas.
A presença de espécies microbianas relacionadas com infecções
clinicas sugere a necessidade de melhor controle higiênico-sanitário no
restaurante estudado.
Mesmo nos serviços de alimentação em que os métodos químicos
apresentam eficácia na redução da população microbiana, os
microrganismos remanescentes, que podem inclusive dominar a
microbiota do serviço, podem possuir um importante perfil de resistência
a outras substâncias, como aos antimicrobianos.
Além do monitoramento da microbiota de serviços de alimentação, é
necessário realizar o estudo do perfil de susceptibilidade destes aos
antimicrobianos, pois uma vez que microrganismos resistentes estejam
distribuídos em número significativo no ambiente, métodos alternativos
de controle para sua erradicação devem ser adotados.
O RACHS-SA possibilita o controle dos itens imprescindíveis, que
podem contribuir de forma mais crítica na qualidade das refeições
servidas, a fim de orientar a adoção das boas práticas de manipulação.
O RACHS-SA com conteúdo validado possui reprodutibilidade e
confiabilidade para a avaliação das condições higiênico-sanitárias.
O roteiro com conteúdo validado se mostrou adequado na avaliação
geral das condições higiênico-sanitárias do serviço de alimentação
estudado, porém as falhas específicas na higienização devem ser
estudas a partir de métodos experimentais (análises microbiológicas).
A existência de microrganismos de importância para saúde pública
reforça a necessidade de adoção de boas práticas em serviços de
alimentação, que melhorem as condições higiênico-sanitárias utilizando
os métodos experimentais e não experimentais de forma complementar.
92
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110
ANEXOS
111
ANEXO I. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
112
ANEXO II. Autorização do Governo do Estado do Rio de Janeiro para
realização da pesquisa
113
APÊNDICES
114
APÊNDICE I: Roteiro de avaliação higiênico-sanitária com conteúdo validado.
Roteiro de Avaliação das Condições Higiênico-sanitárias de Serviços de
Alimentação (RACHS-SA)
_______________________________________________________________
Responsável pela aplicação do RACHS-SA
Nome:_________________________________________________________
Cargo: _________________________________________________________
Data de aplicação: _______________________________________________
Caracterização do restaurante
Nome do restaurante:
Endereço completo:
Telefones:
Serviço próprio: ( ) sim ( ) não
Nome da concessionária que administra
Número de refeições servidas:
Número de pavimentos:
Número de manipuladores de alimentos:
Identificação dos recursos humanos
Nome do nutricionista fiscal de contrato: CRN:
Nome do nutricionista responsável técnico: CRN:
Nome dos demais nutricionistas e função:
115
Instrução para preenchimento e aplicação do instrumento:
1. Inicie a inspeção sanitária pela área de recebimento e armazenamento e
siga o fluxo do processo produtivo até a distribuição das refeições.
2. O serviço de alimentação deve ser avaliado como um todo, por exemplo, no
bloco II, item 8, caso o teto de um setor esteja não adequado, classifique o item
como não conforme. O mesmo critério deve ser adotado para outros itens.
3. No bloco IV, item 2 se um dos utensílios de limpeza apresentar-se em
condições inadequadas, classifique o item como não.
4.Caso os registros de aferição de tempo e temperatura, de capacitação e de
higienização de equipamentos não sejam apresentados, classifique o item
como não conforme.
5. Ao quantificar o total de itens e subitens do bloco, desconsidere os itens não
aplicáveis (NA), caso existam.
6. Todas as informações relevantes devem ser registradas na observação.
7. Após a aplicação do RACHS-SA, calcule o percentual de adequação das
condições higiênico-sanitárias (PACHS) de cada bloco e do estabelecimento,
conforme orientação no bloco XIII.
8. Classifique o PACHS dos blocos e PACHS Total conforme a categorização
descrita no bloco XIII.
9. Os itens foram classificados de acordo com o risco oferecido à manutenção
da qualidade higiênico-sanitária das refeições prontas em: Imprescindível (I),
Necessário (N), Recomendável (R), quando esses contribuíssem,
respectivamente, de forma crítica, menos crítica e não crítica para a
contaminação dos alimentos.
10. Se os itens imprescindíveis apresentarem não conformidades, deverão ser
adotadas medidas corretivas imediatas.
12. Legenda: C (conforme); NC (Não conforme) e NA (Não se aplica).
116
BLOCO I. Recepção e armazenamento dos alimentos
Classificação
C NC NA
Recebimento de matéria-prima
1 A recepção de matéria-prima, dos ingredientes e de embalagens é realizada em área protegida e limpa.
I
2 Na área de recebimento há ausência de insetos e roedores.
I
3 Em relação ao transporte das matérias-primas, ingredientes e embalagens, o caminhão de entrega apresenta-se:
3.1 Em condições adequadas de higiene. I
3.2 Em adequado estado de conservação. N
3.3 Com temperatura adequada, de acordo com o
tipo de matéria-prima transportada. I
4 O entregador das matérias-primas, ingredientes e embalagens apresenta-se:
4.1 Com uniforme completo. I
4.2 Com uniforme limpo e em prefeito estado de
conservação. I
5
Os lotes de matérias-primas, dos ingredientes ou das embalagens reprovadas ou com prazo de validade vencida são identificadas e armazenadas separadamente.
I
6 As matérias-primas, ingredientes e embalagens são encaminhados imediatamente para o estoque.
N
7 A temperatura das matérias-primas refrigeradas é verificada na etapa de recepção.
N
Estoque seco
8
As matérias-primas, os ingredientes e as embalagens são armazenados em local limpo e organizado, de forma a garantir proteção contra contaminantes.
I
9 O armazenamento das matérias-primas respeita o prazo de validade. ( Sistema primeiro que vence, primeiro que sai (PVPS))
I
10 As matérias-primas são armazenadas sobreas prateleiras, estrados ou paletes.
I
11 As embalagens são armazenadas sobre as prateleiras, estrados ou paletes.
I
12 Os ingredientes são armazenados sobre as prateleiras, estrados ou paletes.
I
13 As prateleiras estão em perfeito estado de conservação.
N
14 As prateleiras são de material liso, resistente, impermeável e lavável.
N
15 Os estrados estão em perfeito estado de N
117
conservação.
16 Os estrados são de material liso, resistente, impermeável e lavável.
N
17 Os paletes se encontram em perfeito estado de conservação.
N
18 Os paletes são de material liso, resistente, impermeável, lavável.
N
19
As matérias-primas e os ingredientes armazenados apresentam espaçamento mínimo necessário para garantir a adequada ventilação e, quando for o caso, a desinfecção do local. Distante do piso no mínimo 25 cm, separados da parede e entre pilhas no mínimo 10 cm e distante do forro 60 cm.
I
20
As embalagens armazenadas apresentam espaçamento mínimo necessário para garantir a adequada ventilação e, quando for o caso, a desinfecção do local. Distante do piso no mínimo 25 cm, separados da parede e entre pilhas no mínimo 10 cm e distante do forro 60 cm.
I
21 Os produtos de limpeza são armazenados em local separado dos alimentos.
I
22 Os descartáveis são armazenados em local separado dos alimentos.
I
Estoque refrigerado e congelamento
23 As unidades de frio como: freezers, câmaras, geladeiras são mantidas limpas e organizadas.
I
24 As unidades de frio são dotadas de termômetros ou termostatos em perfeito funcionamento.
I
25 Há controle periódico e diário da temperatura das unidades de frio.
I
26
As câmaras estão em perfeito estado de conservação: sem rachadura, parede descascando, azulejo quebrado e cortina de ar em perfeito estado de conservação e limpeza.
I
27 As canaletas das câmaras frigoríficas possuem proteção contra a entrada de vetores e acúmulo de resíduos de alimentos.
N
Total de itens= (Itens do bloco-NA)
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
118
BLOCO II. Estrutura física Classificaçã
o C NC NA
Área Física
Edificações
1 O acesso às instalações é controlado e independente, não comum a outros usos.
N
2 As áreas externas e internas do restaurante estão livres de objetos em desuso ou estranhos ao ambiente e não há presença de animais.
I
Piso, parede, teto e portas
3 Os pisos possuem revestimento liso, impermeável e lavável.
N
4 Os pisos são mantidos livres de rachaduras, trincas, goteiras, vazamentos, infiltrações, bolores, descascamentos.
N
5 As paredes possuem revestimento liso, impermeável e lavável.
N
6
As paredes são mantidas livres de rachaduras, trincas, goteiras, vazamentos, infiltrações, bolores, descascamentos, dentre outros e não transmitem contaminantes aos alimentos.
N
7 Os tetos possuem revestimento liso, impermeável e lavável.
N
8
Os tetos são mantidos livres de rachaduras, trincas, goteiras, vazamentos, infiltrações, bolores, descascamentos, dentre outros e não transmitem contaminantes aos alimentos.
N
9 As portas são mantidas ajustadas aos batentes. N
10 As portas da área de armazenamento de alimentos são dotadas de fechamento automático (molas ou similares).
I
11
As aberturas de comunicação externa das áreas de armazenamento e preparação de alimentos, inclusive o sistema de exaustão são providos de telas milimétricas para impedir o acesso de vetores e pragas urbanas.
I
12 As telas são removíveis para facilitar a limpeza periódica.
I
13 As telas são mantidas em bom estado de conservação.
N
14 Os ralos possuem dispositivos que permitem seu fechamento.
N
15 As caixas de gordura estão localizadas fora da área de preparo e armazenamento de alimentos.
N
16 As caixas de gordura são limpas periodicamente. N
Instalações sanitárias dos funcionários
17 As instalações sanitárias e os vestiários não se comunicam diretamente com a área de preparo e
I
119
armazenamento de alimentos ou refeitórios.
18 As instalações sanitárias e os vestiários são mantidos organizados e limpos.
N
19 As instalações sanitárias e os vestiários estão em adequado estado de conservação.
N
20 As instalações sanitárias e vestiários possuem porta com fechamento automático (mola ou similar).
R
21
As instalações sanitárias possuem lavatórios e estão supridas de produtos de higiene pessoal tais como: papel higiênico, sabonete liquido inodoro anti-séptico ou inodoro e produto anti-séptico e toalhas de papel não reciclado ou outro sistema de secagem das mãos.
I
Lavatório de mãos na área de preparo
22 Existe lavatório exclusivo para higiene das mãos, em localização estratégica com relação ao fluxo de preparo dos alimentos.
N
23
Os lavatórios possuem sabão inodoro anti-séptico ou sabão líquido inodoro e produto anti-séptico e toalhas de papel não reciclado ou outro sistema de secagem das mãos.
R
24 Os lavatórios apresentam coletores de resíduos dotados de tampas e acionados sem contato manual.
I
25 Nos lavatórios há instrução sobre a forma correta de higienização das mãos.
I
Instalações sanitárias dos clientes
26 As instalações sanitárias são mantidas organizadas e em adequado estado de conservação.
I
27 As instalações sanitárias possuem porta com fechamento automático.
N
28
Os lavatórios estão supridos de produtos de higiene pessoal tais como: papel higiênico, sabão líquido inodoro anti-séptico ou sabão líquido inodoro e produto anti-séptico e toalhas de papel não reciclado ou outro sistema de secagem das mãos.
I
Ambiência
29
A edificação e as instalações são projetadas de forma a evitar a contaminação cruzada, a possibilitar um fluxo ordenado e sem cruzamento das etapas de preparo dos alimentos.
N
30 A edificação e as instalações são projetadas de forma a facilitar as operações de manutenção, limpeza e desinfecção.
N
120
Iluminação Classificação C NC NA
31
A iluminação da área de preparo proporciona a visualização de forma a não comprometer a higiene dos alimentos, sem ofuscamento, reflexos fortes, sombras e contrastes excessivos.
N
32 As luminárias da área de preparo e armazenamento estão protegidas contra explosão e quedas acidentais.
I
Fluxo de ar artificial - ar condicionado.
33 O fluxo de ar artificial não incide diretamente sobre os alimentos.
I
34 É realizada a limpeza do filtro de ar, a cada seis meses ou sempre que estiverem sujos.
N
35 Existe planilha de controle das trocas dos filtros de ar.
N
36 Existe planilha de controle das limpezas realizadas nos componentes dos sistemas de climatização.
N
Total de itens=Itens do bloco-NA
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
BLOCO III. Equipamentos e utensílios Classificação C NC NA
1 Os equipamentos utilizados no preparo de alimentos estão em adequado estado de conservação.
I
2
As superfícies dos equipamentos utilizados no preparo, armazenamento, transporte e distribuição são lisas, impermeáveis, laváveis e estão isentas de rugosidades, frestas e outras imperfeições que possam comprometer a higienização dos mesmos e serem fontes de contaminação de alimentos.
I
3 É realizada manutenção periódica dos equipamentos.
N
4
Os equipamentos estão instalados em local adequado de forma a prevenir a ocorrência de contaminação cruzada e permitir o funcionamento adequado.
N
5 Os utensílios utilizados no preparo dos alimentos estão em adequado estado de conservação.
I
121
6
As superfícies dos utensílios utilizados no preparo, armazenamento, transporte e distribuição são lisas, impermeáveis, laváveis e estão isentas de rugosidades, frestas e outras imperfeições que possam comprometer a higienização dos mesmos e serem fontes de contaminação de alimentos.
I
Total de itens= (Itens do bloco-NA)
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
BLOCO IV. Higiene das instalações e utensílios Classificaçã
o C NC NA
1 As instalações físicas são mantidas em condições higiênico-sanitárias apropriadas.
I
2 Os utensílios de limpeza (vassouras, esfregões, esponjas e panos) são mantidos em condições higiênico-sanitária apropriadas.
N
3 Os produtos saneantes utilizados na higienização estão regularizados pelo Ministério da Saúde.
I
4 São utilizados produtos de limpeza sem odor. N
5
Os funcionários responsáveis pela atividade de higienização das instalações utilizam uniformes apropriados e diferenciados daqueles utilizados na manipulação de alimentos.
N
Área de higienização mecânica de utensílios.
6 A área de higienização mecânica de utensílios é mantida limpa.
I
7 A área de higienização mecânica de utensílios é mantida organizada.
N
8 A área de higienização mecânica de utensílios apresenta exaustão adequada.
N
9 A máquina de higienização de utensílios está em adequado estado de conservação.
I
10 A temperatura da máquina de higienização de utensílios está adequada. Lavagem: 55 a 65ºC; Enxágue: 80 a 90ºC.
I
Área de higienização manual de utensílios.
11 A área de higienização manual é mantida limpa. I
12 A área de higienização manual é mantida organizada.
N
13 Os itens são guardados de forma a evitar a recontaminação.
I
122
Total de itens= (Itens do bloco-NA)
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
BLOCO V. Manejo de resíduos sólidos Classificação C NC NA
1 Os coletores de resíduos sólidos são mantidos limpos e íntegros.
N
2 Os coletores de resíduos são dotados de tampas acionadas sem contato manual.
I
3
Os coletores de resíduos sólidos são mantidos fechados para evitar a atração de vetores e pragas urbanas e a contaminação do ar ambiente.
I
4 Os resíduos são frequentemente coletados da área de preparo.
I
5
O local de armazenamento temporário dos resíduos é isolado da área de preparo e armazenamento dos alimentos, de forma a evitar focos de contaminação e atração de vetores e pragas urbanas.
I
6 O local de armazenamento temporário dos resíduos é mantido fechado.
N
7 O local de armazenamento temporário dos resíduos é mantido limpo e organizado.
N
8 O acondicionamento do óleo até a sua retirada é feita em recipientes com tampa.
N
Total de itens= (Itens do bloco-NA)
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
123
BLOCO VI. Recursos humanos Classificação C NC NA
1 Há um coordenador de boas práticas de manipulação.
N
2 O coordenador é devidamente capacitado para implantação das boas práticas de manipulação.
N
3 Há documento que comprove a capacitação do coordenador.
N
Saúde dos manipuladores
4 É realizado controle da saúde dos manipuladores de alimentos conforme descrito na NR7.
I
5 Há registro do controle da saúde dos manipuladores.
I
6 É fornecido equipamento de proteção individual (EPI) ao trabalhador.
I
7 O manipulador é treinado quanto ao uso adequado do EPI.
I
8 Há controle do uso de EPI pelo manipulador. I
9
Os manipuladores que apresentam lesões e ou sintomas de enfermidades que possam comprometer a qualidade higiênico-sanitária dos alimentos são afastados da atividade de preparo dos alimentos enquanto persistirem essas condições de saúde.
I
Higiene pessoal
10 Os manipuladores apresentam-se com uniformes compatíveis à atividade desempenhada, conservados e limpos.
I
11
Os manipuladores apresentam comportamento adequado: evitam falar desnecessariamente, cantar, assobiar e outros, de forma que não contaminem os alimentos, durante o desempenho das atividades.
I
12 Os manipuladores usam cabelos presos e protegidos por redes, toucas ou outro acessório apropriado para este fim.
I
13 As unhas dos manipuladores são mantidas curtas e sem esmalte ou base.
I
14 Os manipuladores apresentam-se sem barba por fazer.
I
15 Os manipuladores retiram todos os objetos de adorno pessoal e a maquiagem durante o horário de trabalho.
I
16
Os manipuladores lavam cuidadosamente as mãos ao chegar ao trabalho, antes e após manipular alimentos, após qualquer interrupção do serviço, após tocar materiais contaminados, após usar os sanitários e sempre que se fizer necessário.
I
124
17
Estão afixados cartazes de orientação aos manipuladores sobre lavagem correta e anti-sepsia das mãos e demais hábitos de higiene, em locais de fácil visualização, inclusive nas instalações sanitárias e lavatórios.
N
Total de itens= (Itens do bloco-NA)
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
BLOCO VII. Preparo dos alimentos Classificaçã
o C NC NA
1 Os alimentos são submetidos ao descongelamento, sob refrigeração inferior à 5ºC.
I
2
Os alimentos que serão consumidos crus são submetidos a processo de higienização em solução clorada, quando necessário e enxágue em água potável.
I
3 Há planilha de controle da higienização dos alimentos que serão consumidos crus.
I
4 O processo de higienização dos alimentos é realizado de forma que não ocorra a contaminação cruzada.
I
5
Os óleos e gorduras são substituídos imediatamente sempre que houver alteração evidente das características fisico-químicas ou sensoriais, tais como aroma, formação de espuma e fumaça.
I
6 O estabelecimento mantém planilha de controle de temperatura, para o controle e a garantia da qualidade dos alimentos preparados.
I
Total de itens= (Itens do bloco-NA)
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
125
BLOCO VIII. Distribuição dos alimentos prontos para consumo
Classificação C NC NA
Exposição do alimento
1 Os alimentos preparados são armazenados sob temperatura adequada até o momento de sua distribuição.
I
2 Os alimentos que serão consumidos quentes são mantidos a temperatura acima de 60C por até 6h.
I
3 Os alimentos que serão consumidos frios são mantidos a temperatura entre 5 e 10C.
I
4 Os equipamentos de conservação de temperatura de alimentos prontos estão em adequado estado de higiene.
I
5
A temperatura dos equipamentos de conservação de alimentos prontos para consumo como: pass through e banho-maria é regularmente monitorada.
I
6 É mantido documento de controle da temperatura dos equipamentos de conservação.
N
7 As áreas de distribuição dos alimentos são mantidas organizadas e em adequada condições higiênicas.
I
8 Os manipuladores utilizam utensílios diferenciados para distribuição das preparações.
I
9 Os manipuladores utilizam luvas descartáveis para minimizar a contaminação dos alimentos.
R
10 Os balcões térmicos estão em adequado estado de higiene.
I
11
Os balcões térmicos dispõem de barreiras de proteção que previnam a contaminação das preparações em decorrência da proximidade ou da ação do consumidor e manipulador.
I
12 A temperatura do balcão é regularmente monitorada.
N
13 É mantido o documento de controle da temperatura do balcão de distribuição.
I
14 A troca dos utensílios utilizados na distribuição das refeições, como conchas e colheres de servir, é realizada a cada 4 horas.
I
15 Há termômetros disponíveis para o monitoramento das temperaturas dos alimentos e dos equipamentos de conservação.
N
126
Refeitório Classificação C NC NA
16 As mesas do refeitório são higienizadas durante a distribuição das refeições.
R
17 Os recipientes contendo farinha, vinagre, azeite e outros condimentos são higienizados diariamente.
N
18 Os utensílios (pratos, garfos, facas, sopeiras, saladeiras) utilizados no consumo dos alimentos estão sem sujidades.
N
19
Os utensílios (pratos, garfos, facas, sopeiras, saladeiras) que foram higienizados são armazenados em local protegido, na área de distribuição, de forma que não sejam contaminados.
N
Total de itens= (Itens do bloco-NA)
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
BLOCO IX. Controle integrado de vetores e pragas urbanas
Classificação C NC NA
1 A edificação, as instalações, os equipamentos, os móveis e os utensílios estão livres de vetores e pragas urbanas.
I
2 É realizada a desinsetização do serviço de alimentação por empresa especializada.
I
3 Há planilhas de controle de desinsetização das instalações realizada por empresa especializada.
I
4
É feito o controle preventivo ao abrigo e infestação de vetores e pragas urbanas como por exemplo: emprego de telas nas aberturas, ralos com fechamento automático e limpeza das imediações.
N
Total de itens= (Itens do bloco-NA)
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
127
BLOCO X. Abastecimento de água Classificação C NC NA
1 É utilizada somente água potável para a manipulação de alimentos.
I
2
Os reservatórios de água estão em estado adequado de conservação sem rachadura, vazamentos, infiltrações e outras não conformidades.
I
3 Há registro da higienização do reservatório de água com um intervalo máximo de seis meses.
I
4 É mantida a planilha de controle da higienização do reservatório de água.
I
5 A potabilidade da água é atestada a cada seis meses.
I
6 É mantida a planilha de controle da potabilidade da água.
N
7 Há filtro nas torneiras de água da área de preparo.
I
8 Há registro de troca periódica do elemento filtrante das torneiras de água da área de preparo, de acordo com o fabricante.
N
Total de itens= (Itens do bloco-NA)
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
128
BLOCO XI. Documentação Classificação C NC NA
1 O serviço de alimentação dispõe de manual de boas práticas impresso.
I
2 O manual de boas práticas retrata a realidade do serviço de alimentação.
I
3
O serviço de alimentação dispõe dos procedimentos operacionais padronizados (POP) exigidos pela legislação como: higienização das instalações, equipamentos, móveis e utensílios; controle de potabilidade da água; higiene e saúde dos manipuladores de alimentos e manejo de resíduos sólidos.
I
4 Aos POP são aplicados os princípios: monitorização, ação corretiva, verificação e registro.
N
5 Os POP são revisados periodicamente. N
6 Os POP estão escritos em linguagem acessível e de acordo com a Resolução - RDC 216 / 2004.
N
7 Os POP estão em locais acessíveis aos funcionários e à vigilância sanitária.
N
Total de itens= (Itens do bloco-NA)
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
129
BLOCO XII. Capacitação dos manipuladores Classificação C NC NA
1
Os serviços de alimentação possuem programa de capacitação dos manipuladores sobre, no mínimo, os seguintes temas: contaminantes alimentares, higiene pessoal, doenças transmitidas por alimentos e manipulação higiênica dos alimentos.
I
2
Os manipuladores são capacitados quanto aos procedimentos para Garantia da Qualidade como: uso de termômetro, anotação em planilhas, diluição de produtos para higienização e itens necessários a implantação das boas práticas de manipulação.
I
3 São realizadas capacitações dos manipuladores quando há troca de função.
I
4 São realizados programas de capacitação periodicamente, pelo menos a cada seis meses.
N
5 Há planilha de controle da capacitação dos manipuladores.
N
Total de itens= (Itens do bloco-NA)
Total de itens em conformidade
% itens em conformidade do bloco
Observações:
130
Cálculo do percentual de adequação das condições higiênico-sanitária
(PACHS) dos blocos e total.
Equação 1: ACH bloco
Equação 2: ACH total
1. Instruções para cálculo do percentual de adequação das condições higiênico-sanitárias por bloco e total.
2. Critérios para classificação qualitativa dos blocos e do estabelecimento. Adequado ACH ≥ 76% dos itens imprescindíveis. Parcialmente adequado = PACHS entre 51-75% dos itens imprescindíveis
Inadequado ACH ≤ 50% dos itens imprescindíveis.
Blocos avaliados Total de Itens (n)
Total de Itens
Conformes (n)
PACHS (%)
Classificação do PACHS
Bloco I. Recepção e armazenamento dos alimentos
Bloco II. Estrutura física
Bloco III. Equipamentos e utensílios
Bloco IV. Higiene das instalações e utensílios
Bloco V. Manejo de resíduos sólidos
Bloco VI. Recursos humanos
Bloco VII. Preparo dos alimentos
Bloco VIII. Distribuição dos alimentos prontos para consumo
Bloco IX. Controle integrado de vetores e pragas urbanas
Bloco X. Abastecimento de água
Bloco XI. Documentação
Bloco XII. Capacitação dos manipuladores
PACHS total
131
Apêndice I- Artigo 1.
Caracterização da comunidade microbiana das superfícies de serviços de
alimentação
Characterization of surface´s microbial community in a food service
Aline Gomes de Melloa*; Lauro Melob; Raquel Silva Peixotoc; Deborah
Catharine de Assis Leitec; Sergio Eduardo Longo Fracallanzac; Selma Gomes
Ferreira Leiteb; Luciléia Granhen Tavares Colarese; Marco Antônio Lemos
Miguelc,
a. Curso de Nutrição - Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus
Macaé;
b. Escola de Química - Universidade Federal do Rio de Janeiro
c. Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes - Universidade Federal
do Rio de Janeiro
d. Instituto de Nutrição Josué de Castro - Universidade Federal do Rio de
Janeiro
* Corresponding autor: Curso de nutrição UFRJ-Campus Macaé. Email:
[email protected] (AG Mello)
Acknowledgments
Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ)
132
RESUMO
O objetivo deste estudo foi caracterizar a comunidade microbiana das
superfícies de um serviço de alimentação, localizado no Rio de Janeiro- Brasil.
Através de métodos dependentes e independentes de cultivo. Pelo método
dependente de cultivo foram analisados swabs e lavados de 462 superfícies,
de talheres, pratos, mesas e bandejas, obtidas em diferentes momentos da
distribuição de refeições. Todas as amostras encontravam-se em condições
higiênico-sanitárias insatisfatórias. O método dependente de cultivo mostrou
que na comunidade de bactérias aeróbias cultiváveis, não fastidiosas havia a
predominância de enterobactérias (Enterobacter spp. e Klebsiella spp.) 47%,
Acinetobacter spp. (13%) e estafilococos (40%). Não foram detectadas
Micobactérias nas superfícies analisadas. As estirpes isoladas foram
identificadas por associação de métodos convencionais e espectrometria de
massa. Na caracterização da microbiota por métodos independentes de cultivo,
36 das 462 amostras foram analisadas por Polymerase Chain Reaction (PCR) -
Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE). As bandas
predominantes foram selecionadas e submetidas ao sequenciamento de RNAr
16s, em que foi detectada a predominância de Klebsiella pneumoniae e
Acinetobacter baumannii em todas as superfícies analisadas. Acinetobacter
baumannii é um microrganismos de importância clinica e está envolvido em
infecções relacionadas à assistência à saúde. A presença de Klebsiella
pneumoniae e Acinetobacter baumannii em todas as superfícies analisadas
sugere a ocorrência de contaminação cruzada, ou falhas pós-higienização no
serviço de alimentação. Os métodos dependentes e independentes de cultivo
mostraram resultados equivalentes, o que reforça a aplicabilidade da
associação das técnicas PCR-DGGE em ambientes de serviços de
alimentação, uma vez que esta técnica oferece resultados rápidos e um menor
volume de trabalho e de reagentes, quando comparadas com os métodos
tradicionais.
Keywords: food microbiology; food safety; foodborne pathogens; molecular
biology; mass espectrometry, Mycobacterium
133
1. INTRODUÇÃO
As doenças transmitidas por alimentos (DTA) têm sido consideradas um
problema de Saúde Pública devido à facilidade de disseminação dos
microrganismos (Bolton, Meally, Blair, McDowell, & Cowan, 2008). A ocorrência
de DTA vem aumentando de modo significativo em nível mundial, e alguns
fatores têm contribuído para isto, como o aumento da produção de alimentos
em grande escala, o crescimento populacional e a deficiência na fiscalização
dos serviços de alimentação (estabelecimentos que produzem e comercializam
alimentos e refeições) (Brasil, 2010). Governments’ attention to food safety has
been increased due to the potential health and economic impact of foodborne
outbreaks (Albrecht & Nagy-Nero, 2009; WHO, 2008).
Especialmente nos serviços de alimentação, a grande disponibilidade de
material orgânico contribui para a complexidade da ecologia microbiana destes
estabelecimentos. Falhas no processo produtivo de refeições podem acarretar
na manutenção de microrganismos indesejáveis, podendo ocasionar em
perdas ou surtos de DTA (OMS, 2006; Ebone, Cavalli, & Lopes, 2011).
A comunidade microbiana encontrada com maior frequência no serviço
de alimentação é composta por microrganismos que resistem aos tratamentos
empregados na higienização, assim como, por aqueles que entram no sistema
através da inadequação do procedimento de higienização.
A adequação da frequência e eficácia dos procedimentos de
higienização adotados podem ser verificados através de métodos dependentes
(culturas) e independentes de cultivo (microbiologia molecular), que fornecem
informações sobre a caracterização da microbiota do ambiente.
Embora os métodos dependentes de cultivo sejam mais difundidos por
não necessitarem de pessoal especializado, os métodos independentes vêm se
tornando mais frequentes nas rotinas de controle microbiológico, e trazem
como vantagem a possibilidade de detecção de microrganismos não cultiváveis
(Gandra, Gandra, de Mello & Godoi, 2008). Os métodos moleculares
possibilitam uma visão global da diversidade microbiana presente na amostra.
Entre eles destaca-se a Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante
(DGGE) que vem sendo utilizada para a caracterização de comunidades
134
microbianas ambientais (Brons & Elsas, 2008; Bresolin, Bustamante, Krüger,
Silva, & Perez, 2010; Zhao et al., 2012; Meynet et al.,2012). Até o momento
não foram encontrados estudos utilizando esta metodologia em serviços de
alimentação.
Levando-se em consideração a necessidade de detectar a presença de
microrganismos indesejáveis, em serviços de alimentação, localizado no
município do Rio de Janeiro-Brasil, este estudo teve como objetivo caracterizar
a microbiota de um serviço de alimentação e avaliar o uso da Polymerase
Chain Reaction - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE) e
sequenciamento do RNA ribossomal 16S como ferramentas alternativas aos
métodos convencionais.
2. Material e métodos
O estudo foi conduzido no período de fevereiro de 2012 a agosto de
2013 em um serviço de alimentação, localizado na cidade do Rio de Janeiro,
Brasil. O Serviço de alimentação serve aproximadamente 3500 refeições no
período do almoço e atende, principalmente, à população em vulnerabilidade
social, composta, principalmente, por população de rua e população de baixa
renda.
2.1 Avaliação higiênico-sanitárias das superfícies
Foram analisadas amostras das superfícies incluindo: utensílios (pratos,
talheres e bandejas) e mesas do refeitório. A coleta foi realizada em 2 dias
distintos e em 3 horários diferentes: 10:00 h (antes da abertura do restaurante),
12:00 h (durante o horário de distribuição) e 2:00 h (próximo ao fechamento do
restaurante). Para as análise moleculares foram empregados os mesmo
pontos, utilizando-se as amostras obtidas às 10:00 h.
2.1.1 Métodos de coleta de amostra: Para os utensílios utilizou-se a técnica
de lavagem de superfície com 50 ml de solução salina estéril a 0.85%. Cada
amostra era composta de 5 unidades de um dos utensílios analisados. As
amostras das mesas foram coletadas pelo método de esfregaço em superfície
com swab com molde estéril de 100 cm², que foi diluído em 10 ml de salina
estéril a 0.85% (Evancho, Sveum, Moberg, & Frank, 2001).
135
2.1.2 Métodos para teste microbiológico: Foram realizadas, segundo
(Evancho, Sveum, Moberg, & Frank (2001) e Kent & Kubica, (1985). As
suspensões iniciais foram homogeneizadas, diluídas decimalmente e
semeadas em triplicata nos meios de cultivo apropriados. Foram pesquisados
bolores e leveduras (agar batata dextrose, pH 3.5, Himedia, Mumbai, India);
assim como bactérias heterotróficas aeróbias mesófilas totais (agar padrão
para contagem, Himedia); micobactérias de crescimento lento, incluindo
Mycobacterium tuberculosis e de crescimento rápido (agar Löwenstein-Jensen,
BD, Curitiba, Brasil); coliformes totais (Caldo Lactose Bile Verde brilhante,
Himedia); coliformes termotolerantes (Caldo EC, Himedia); Escherichia coli
(IDEXX Laboratories, EUA); Bactérias Gram negativas totais (agar eosina azul
de metileno, Himedia) e Estafilococos (agar Baird-Parker, Himedia). A
semeadura foi realizada em triplicata e as placas de petri foram incubadas em
tempo e temperatura específicos para o crescimento de cada microrganismo
analisado. Os resultados obtidos foram expressos em unidade formadora de
colônia por cm² (UFC/cm²) e número mais provável (MPN/cm²). A área
aproximada dos utensílios foi calculada.
As estirpes de estafilococos foram presuntivamente caracterizadas pela
coloração de Gram e teste de produção das enzimas catalase, coagulase e
oxidase (FDA, 2006). Os isolados de estafilococos e Bactérias Gram negativas
totais foram criopreservadas à -20ºC em caldo Brain Heart Infusion (BHI,
Himedia) com 20% de glicerol.
2.1.3 Análise das condições higiênico-sanitárias: Para a avaliação das
condições higiênico-sanitárias dos utensílios e mesas foram consideradas as
recomendações brasileiras e internacionais. Conforme recomendação da
APHA (Evancho, Sveum, Moberg, & Frank, 2001), foram consideradas em
condições higiênico-sanitárias adequada os utensílios e mesa do refeitório
quando foram obtidas as seguintes contagens de 2 UFC/cm2 para bactérias
mesófilas aeróbias. Como não há uma legislação brasileira que defina os
padrões higiênico-sanitários para análise microbiológica de superfícies, utilizou-
se os parâmetros sugeridos por Silva Jr. (2007) que admite contagens de até
10² UFC/cm2 para bactérias mesófilas e ausência para Coliformes
termotolerantes e Staphylococcus aureus.
136
2.1.4 Identificação das estirpes isoladas por espectrometria de massa do
tipo MALDI-TOF: Foi realizado em um espectrômetro de massa – Microflex LT
(Brucker, Germany), segundo as especificações do fabricante. As estirpes
criopreservadas foram ativadas em placas de petri contendo Tripticase soy
agar (TSA) (Biomerieux, Brazil) e incubadas à 37ºC/18h. Uma fração da colônia
de Bactérias Gram negativas totais ou Staphylococcus sp foi depositada, em
triplicata, em uma placa de metal, sendo adicionado 1 µl de matriz composta da
solução saturada de ácido α-hidroxi-ciano-cinâmico (CHCA). O espectro de
massa gerado foi analisado e comparado com banco de dados MALDI Biotyper
(Bruker Daltonik, United Kingdom). Como calibrante utilizou-se uma colônia de
E. coli DH5α (Lartigue et al., 2009; Paim, Reiter, Oliveira, & Azevedo, 2013). Os
critérios de identificação utilizados foram baseados na confiabilidade fornecida
pelo equipamento, sendo considerados scores ≥ 2.000 em que há a
identificação em nível de gênero e espécie.
2.2 Caracterização da estrutura da comunidade microbiana presente na
superfície: Foi realizada a extração de DNA, em que três mililitros dos lavados
e swab das amostras originais de superfícies foram removidos e filtrados em
membrana de celulose 0.22µm, que foram criopreservadas a -20oC. A extração
do DNA total da amostra foi realizada utilizando-se o FastDNA® SPIN Kit for
Soil (MP Biomedicals), segundo as recomendações do fabricante. Foi utilizado
o par de iniciadores U968f GC e L1401r para o gene que codifica a subunidade
16S do RNA ribossomal (gene rrs) (Heuer & Smalla, 1997). Os fragmentos
amplificados foram separados pela técnica de DGGE (Muyzer, Waal, &
Uitterlinden, 1993), com a utilização do equipamento Dcode™ Universal
Mutation Detection System (BioRad, Richmond, USA), em géis de
poliacrilamida que foram submetidos à eletroforese a 75 V durante 16 horas a
60oC.
Excisão e sequenciamento das bandas: Para identificar as sequências de
DNA obtidas, as bandas que foram detectadas em todas as superfícies
analisadas foram selecionadas e excisadas do gel de poliacrilamida. As
amostras foram enviadas para sequenciamento (Macrogen, Seoul, Korea). Os
resultados obtidos foram comparados com as sequencias de gene depositadas
no GeneBank.
137
2.3 Análise estatística:
Para análise das condições higiênico-sanitárias foi empregada a Análise
de Variância (ANOVA), seguida de teste de Tukey, para a verificação de
diferenças estatísticas entre as médias da contagem dos horários, para cada
microrganismo pesquisado e para um mesmo dia de análise (nível de
significância de 5%). Foi utilizado o software XLSTAT (addinsoft, versão
2013.4).
Para avaliar o perfil de bandas do PCR-DGGE, foram geradas matrizes
utilizando o programa Bionumerics (Applied Maths, versão 6.5) de acordo com
as instruções do fabricante, transformando os perfis de bandas em valores
quantitativos relativos. As diversas matrizes foram ordenadas pela análise de
escalonamento multidimensional não métrico (NMS) (Kruskal, 1964) com a
distância de matrizes de Sørensen com o auxílio do programa PC-ORD
statistical package (MjM Software, Gleneden Beach, OR, versão 5). A
ordenação do NMS foi restringida a duas dimensões, com o objetivo de
simplificar a análise e a discussão dos dados. Também foi executado o
Procedimento de Permutação de Múltipla Resposta (MRPP) a fim de verificar
se havia diferença entre as superfícies analisadas.
3.Resultados
3.1 Características microbiológicas das superfícies do serviço de
alimentação
3.1.1 Superfícies dos utensílios e mesas do refeitório
Foram analisadas 462 amostras: 32.5% (n=150) provenientes dos
pratos, 32.5% (n=150) dos talheres, 32.5% (n=150) das bandejas e 2.5%
(n=12) amostras das mesas do refeitório. Na Tabela 1 e 2 pode-se verificar que
tanto no primeiro como no segundo dia de coleta 100% das amostras estavam
fora dos padrões higiênico-sanitários internacionais e os sugerido por Silva Jr.
(2007).
138
Tabela 1: Contagem microbiana das superfícies dos utensílios e mesas previamente higienizados no primeiro dia de coleta, em
três horários diferentes.
Microrganismos Prato Talher Bandeja Mesa do refeitório
10h 12h 14h 10h 12h 14h 10h 12h 14h 10h 12h 14h
Bactérias
mesófilas
UFC*/cm²
7.8x104A
4.2x104AB
2.3x103B
4.5x100B
1.1x102AB
5.0x102A
6.1x104 4.3x10
4 4.8x10
4 1.5x10
3 1.6x10
4 1.8x10
4
Bolores e
leveduras
UFC/cm²
4.6x101 8.0x10
3 1.5x10
1 1.0x10
2 2.0x10
2 1.4x10
2 1.4x10
3 1.7x10
2 2.0x10
2 3.9x10
4 3.0x10
5 3.6x10
4
Coliformes
termotolerantes
NMP*/cm²
1.3x101 1.1x10
1 2.3x10
0 5.0x10
1A 1.1x10
0B 0.6x10
0B 5.9x10
0 5.6x10
0 4.3x10
0 3.4x10
1 6.7x10
1 1.3x10
1
Staphylococcus
aureus UFC/cm²
nd**** nd nd nd nd nd nd nd nd 3.2x102**
5.4x103 5.5x10
3
Estafilococos
coagulase
negativa
UFC/cm²
3.9x102 1.8x10
2 7.9x10
1 1.5x10
2 8.3x10
1 2.5x10
2 2.2x10
4 8.2x10
3 1.1x10
4 nd nd nd
*UFC: Unidades Formadoras de Colônias; **Número mais provável por centímetro quadrado; **** Não detectado.
Padrão: Bactérias aeróbias mesófilas: 10²UFC/cm² (Silva Jr., 2007) e 2UFC/cm² (Evancho, Sveum, Moberg, & Frank, 2001);
Bolores e leveduras: 10²UFC/cm² (Silva Jr., 2007); Coliformes termotolerantes e Staphylococcus aureus: Ausência (Silva Jr.,
2007).
Nota: itens com a mesma letra na coluna denota que não houve diferença significativa a nível de 5%.
139
Tabela 2: Contagem microbiana das superfícies dos utensílios e mesas previamente higienizadas no segundo dia de coleta, em
três horários diferentes.
Microrganismos Prato Talher Bandeja Mesa do refeitório
10am 12am 14pm 10am 12am 14pm 10am 12am 14pm 10am 12am 14pm
Bactérias
mesófilas
UFC*/cm²
3.1x105 5.1x10
4 7.2x10
4 1.6x10
3 7.8x10
2 2.0x10
2 2.6x10
4 3.9x10
4 3.0x10
4 7.7x10
4 1.1x10
4 3.6x10
5
Bolores e
leveduras
UFC/cm²
2.6x102 4.8x10
1 4.2x10
1 6.4x10
2 7.0x10
2 2.0x10
2 9.3x10
1 1.1x10
2 1.3x10
2 2.0x10
2 6.2x10
2 1.0x10
2
Coliformes
Termotolerantes
NMP*/cm²
1.5x101 1.4x10
1 8.2x10
0 5.7x10
1A 0.6x10
0B 2.0X10
0B 7.0x10
0 7.0x10
0 5.7x10
0 1.0x10
0 2.4x10
0 7.9x10
0
Staphylococcus
aureus UFC/cm²
nd**** nd nd nd nd nd nd nd nd 1.4x101**
3.9x101 7.0x10
1
Estafilococos
coagulase
negativa
UFC/cm²
2.7x102 2.2x10
4 2.6x10
0 1.6x10
3A 1.3x10
1B 2.5X10
1B 4.5x10
3 1.1x10
3 3.8x10
3 nd nd nd
*UFC: Unidades Formadoras de Colônias; **Número mais provável por centímetro quadrado; **** Não detectado.
Padrão: Bactérias aeróbias mesófilas: 10²UFC/cm² (Silva Jr., 2007) e 2UFC/cm² (Evancho, Sveum, Moberg, & Frank, 2001);
Bolores e leveduras: 10²UFC/cm² (Silva Jr., 2007); Coliformes termotolerantes e Staphylococcus aureus: Ausência (Silva Jr.,
2007).
Nota: Itens com a mesma letra na coluna denota que não houve diferença significativa a nível de 5%.
140
Houve diferença estatística significativa ( ≤0.05) no primeiro dia de coleta
entre a média das contagens dos diferentes horários de coletas na pesquisa de
bactérias mesófilas aeróbicas nos pratos (p=0.045) e talheres (p=0.019) (Tabela 1).
No segundo dia, houve diferença estatística significativa (p=0.024) entre a média das
contagens dos diferentes horários para pesquisa de estafilococos na superfície dos
talheres (Tabela 2).
Com relação à pesquisa de coliformes termotolerantes houve diferença
estatística significativa nos dois dias entre a média das contagens dos diferentes
horários de coletas dos talheres (Dia 1: p=0.002 e Dia 2: p=0.014) (Tabelas 1 e 2).
Não houve diferença estatística significativa entre a média das contagens de bolores
e leveduras nos três horários de coletas dos dois dias para todas as superfícies
analisadas (Tabelas 1 e 2).
Apenas no primeiro dia de coleta foi detectada a presença de Escherichia coli
nas bandejas e pratos antes da abertura do restaurante (10:00h) e nos talheres ao
longo dos três horários de coleta. Em nenhuma amostra analisada foi detectada a
presença de Micobactérias.
3.1.2 Identificação das estirpes de bacilos Gram negativos e
estafilococos isolados.
Foram isoladas um total de 239 estirpes de bactérias Gram negativas com
morfologia diferenciada das superfícies das bandejas, talheres e mesas do refeitório.
Na Figura 1, pode-se verificar a frequência e a superfície em que a espécie isolada
foi detectada.
141
Figura 1. Frequência das espécies de bacilos Gram negativos isoladas das superfícies das
bandejas, talheres e mesas.
Quanto aos Staphylococcus sp, foram isoladas 152 cepas, destes 27 (17.8%)
foram identificados como S. aureus, sendo isolados da mesa do refeitório e 125
foram classificados como estafilococos coagulase negativo: S. cohnii (2%) e S.
saprophyticus (0.7%) isolados das bandejas; S. pasteuri (2.6%) dos talheres; S.
epidermidis (3.9%); S. hemoliticus (1.3%); S. hominis (0.7%) e S. warneri (71%)
isolados dos talheres e bandejas.
Mesa do refeitório
Bandeja
Talher
142
3.2 Perfil da comunidade microbiana dos utensílios e mesas do refeitório.
Utilizando-se a técnica de sequenciamento das bandas de PCR-DGGE
(Figura 2) foram identificados microrganismos presentes nas superfícies analisadas
como pode ser observado na Tabela 3.
Legenda: B: bandeja; P: prato; T: talher; M: mesa. i: dia 1; ii: dia 2 e iii: dia 3 de coleta.
Figura 2. Perfil de bandas obtido por PCR-DGGE da região codificadora do RNAr 16S, das
superfícies de mesas e utensílios. As setas indicam as bandas selecionadas para
sequenciamento.
143
Tabela 3. Identificação das bandas obtidas por PCR- DGGE baseada no BLAST
(GenBank) usando primers universais para bactérias totais.
Banda Espécie de Referência Porcentagem de
similaridade (%)
Nº de acesso
GenBank
Nº de bases
analisadas (bp)
1 Klebsiella pneumoniae 100 JN969334 361
2 Aeromonas caviae 100 JF920476 385
3 Micrococcus luteus 99 JX262404 345
4 Acinetobacter
calcoaceticus subsp.
anitratus
99 AB302132 471
5 Micrococcus luteus 99 JX262404 387
6 Micrococcus luteus 99 JX262404 405
7 Acinetobacter sp. 99 JF772529 509
8 Acinetobacter baumannii 99 HE978267 405
9 Klebsiella sp. 98 GQ416644 387
10 Acinetobacter sp. 98 AM412161 248
11 Citrobacter sp. 98 HM536988 424
12 Aeromonas hydrophila 98 JX262991 357
13 Acinetobacter sp. 98 HM366447 345
14 Acinetobacter
calcoaceticus subsp.
anitratus
97 AB302132 370
15 Acinetobacter rudis 97 FR773879 353
16 Acinetobacter
calcoaceticus subsp.
anitratus
97 AB302132 465
17 Acinetobacter sp. 97 HM366447 317
As superfícies dos utensílios e mesas do refeitório apresentaram perfil
microbiano semelhante (Figura 3), sendo observada a persistência de Klebsiella sp.
e Acinetobacter sp. Os grupos propostos pela análise de escalonamento
multidimensional não métrico (NMS) apresentaram diferenças significativas quando
realizado o procedimento de permutação de múltipla resposta (PPMR) (A = 0.28; p <
0.01).
144
Figura 3. Ordenação multidimensional não métrica (NMS) realizada a partir das matrizes
obtidas do perfil de bandas da PCR-DGGE para as comunidades bacterianas presentes nos
utensílios e mesas.
4. Discussão
Com relação à avaliação das condições higiênico-sanitárias dos utensílios e
mesas do refeitório, a legislação brasileira não estabelece padrões microbiológicos e
as recomendações microbiológicas americanas são consideradas, devido às altas
temperaturas ambientais médias anuais, rígidas demais para o Brasil. Desta forma,
foram admitidas contagens de até 10²UFC/cm² para bactérias mesófilas e bolores e
leveduras, considerando a recomendação de Silva Jr. ( 2007).
Verificou-se, portanto, que em 100% das amostras a contagem de bactérias
mesófilas, bolores e leveduras, Staphylococcus sp, Coliformes termotolerantes e
Escherichia coli (Tabela 1 e 2) não atendiam as recomendações de Silva Jr. (2007) e
nem a internacional.
Corroborando com os resultados obtidos no presente estudo, Staskel, Briley,
Leanne, Field, & Barth, (2007) realizaram estudo em cozinhas escolares localizadas
no Texas (EUA), relataram que em 41% das superfícies analisadas foram
145
detectadas com microrganismos da família das Enterobacteriaceae. Yoon et al.
(2008) que avaliaram as superfícies de cozinhas escolares de Jinju, South Korea
relataram a presença de Escherichia coli e Staphylococcus aureus.
Apesar de não ter sido detectada a presença de micobactéria de crescimento
lento ou rápido, a pesquisa deste microrganismo é necessária, já que estão
associados a graves patologias. Este microrganismo apresenta uma grande
resistência às condições ambientais, sendo reconhecido por permanecer viável por
longos períodos no ambiente (Fijan, Koren, Cencic, & Sostar-Turk, 2007). Os
serviços de alimentação, que apresentam falhas no processo de higienização podem
viabilizar a presença de micobactérias, principalmente os que atendem populações
em vulnerabilidade social que podem estar mais expostos a este tipo de
contaminação.
Para o controle microbiológico em serviços de alimentação é comum o uso
das técnicas dependentes de cultivo, que estão relacionadas com a caracterização
de culturas puras isoladas em laboratório e fundamentam-se na utilização de testes
morfológicos e bioquímicos para tipagem, subtipagem e identificação de gêneros,
espécies e subespécies microbianas (Gandra, Gandra, Mello, & Godoi, 2008). Os
métodos dependentes de cultivo utilizados na detecção de microrganismos, embora
confiáveis e eficientes, requerem vários dias e até mesmo semanas antes que os
resultados sejam obtidos (Gandra, Gandra, Mello, & Godoi, 2008). Além disso, as
propriedades fenotípicas das bactérias podem não ser expressas ou podem ser de
difícil interpretação, classificação e no ambiente a ser analisado podem haver
células viáveis, porém não-cultiváveis (Torsvik, Goksøyr, & Daae, 1990).
A maioria dos bacilos Gram negativos são frequentemente isolados nos
serviços de alimentação (Staskel, Briley, Leanne, Field, & Barth, 2007; Yoon et al.,
2008), mas Wautersiella falsenii foi descrita por Kämpfer et al. (2006) a partir de 26
amostras clinicas obtidas de laboratórios Belgas no período de 1980 a 2004 e até o
momento, não foram encontrados relatos deste microrganismo em serviços de
alimentação ou indústria de alimentos. Neste estudo Wautersiella falsenii foi isolada
em todas as superfícies do restaurante (Figura 1). Além disso, nas mesas do
refeitório foram identificados Staphylococcus aureus, o que sugere que o método de
higienização manual utilizado não é capaz de eliminar estes microrganismos.
A presença de altas concentrações de estafilococos coagulase negativa nas
superfícies analisadas também representa um risco à saúde da população que
146
frequenta o restaurante. Estes microrganismos têm sido reconhecidos como agentes
etiológicos de processos infecciosos, principalmente em indivíduos
imunocomprometidos e podem causar infecções cutâneas e oculares como
carbúnculos, furúnculos, conjuntivite purulenta e blefarite, um processo inflamatório
das pálpebras, comumente associada à infecção por estafilococos (Barreto & Picoli,
2008)
Em associação às técnicas dependentes de cultivo utilizou-se as técnicas
independentes de cultivo como as análises moleculares para conhecer a
comunidade microbiana dos serviços de alimentação e orientar a escolha do
princípio ativo do produto químico de limpeza, assim como na técnica de
higienização empregada.
Dentre as técnicas moleculares, tem-se a reação em cadeia de polimerase
(PCR), que é uma alternativa viável aos métodos convencionais dependentes de
cultivo microbiano, para conhecer o perfil microbiano de um ambiente (Marlony et
al.,2003). Para a diferenciação de comunidades microbianas tem sido utilizado o
padrão de bandeamento do gene ribossomal por eletroforese em gel com gradiente
desnaturante (DGGE) (Muyzer, Waal, & Uitterlinden, 1993). O PCR-DGGE tem sido
amplamente utilizado associado ao sequenciamento das bandas obtidas, e tem se
mostrado bastante eficiente na identificação e caracterização bacteriana presente
nas comunidades (Vaerewijck, Sabbe, Baré, & Houf, 2008). Zhao et al. (2012)
utilizaram a técnica para caracterizar a comunidade microbiana do solo e Al-Radha,
Pal, Pettemerides, & Jenkinson (2012) para identificar bactérias associadas a
doenças peri-implante, no entanto, não foram encontrados relatos do emprego do
PCR-DGGE para a caracterização da comunidade microbiana de serviços de
alimentação.
No presente estudo, a partir do emprego do PCR-DGGE pode-se observar
não só a presença de uma comunidade bacteriana especifica em cada superfície,
como também representantes distribuídos em todas as superfícies estudadas, a
exemplo dos gêneros Klebsiella e Acinetobacter.
Não há relatos na literatura da detecção de Acinetobacter sp. em serviços de
alimentação. No entanto, trata-se de uma bactéria de grande importância clínica,
sendo causa de diversas IRAs, incluindo bacteremia, pneumonia e meningite e está
envolvido com infecções nosocomiais (Iwashkiw et al., 2012). Desta forma, o
147
predomínio destes microrganismos nas superfícies analisadas indica que há falhas
no processo de higienização e que ocorre contaminação cruzada.
A presença de enteropatógenos na microbiota do restaurante evidencia o
risco a que são expostos os comensais. Estes achados reforçam a necessidade de
rigoroso controle microbiológico nos serviços de alimentação a fim de analisar se os
procedimentos empregados na higienização das superfícies estão adequados, de
forma a evitar a multiplicação e a disseminação desses microrganismos para outros
ambientes.
5. Conclusão
As superfícies do serviço de alimentação estudado estavam acima dos
valores máximos recomendados quantos aos microrganismos indicadores de
condições higiênico-sanitárias. Através dos métodos dependentes e independentes
de cultivo pôde-se detectar que a microbiota prevalente do restaurante era composta
por bastonetes Gram negativos. Acinetobacter, uma bactéria frequentemente
associada a infecções relacionadas à assistência à saúde foi um dos
microrganismos predominantes nas superfícies do SA. O resultado obtido com a
técnica de PCR-DGGE apresentou resultados equivalentes aos obtidos pela técnica
dependente de cultivo.
O emprego das técnicas moleculares permitiu a obtenção de resultados de
forma rápida e precisa, favorecendo a adoção de medidas de controle mais rápidas
do que as técnicas convencionais, o que pode auxiliar na redução da disseminação
de microrganismos patogênico no ambiente.
Por fim, vale ressaltar a importância da caracterização da microbiota de
serviços de alimentação, seja por métodos convencionais ou moleculares, uma vez
que neste ambiente podem estar presentes microrganismos patogênicos de
interesse para saúde pública, com possibilidade de serem disseminados para outros
ambientes.
148
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151
APÊNDICE II – ARTIGO 2
Validação de conteúdo e Confiabilidade de Instrumento de Avaliação
Higiênico-sanitária
Content Validation and Reliability of the Instrument to Assessment Hygienic-
Sanitary
Validação conteúdo e confiabilidade de instrumento
Aline Gomes de Mello1, Cleber Nascimento do Carmo¹; Selma Gomes Ferreira
Leite2, Marco Antônio Lemos Miguel3, Luciléia Granhen Tavares Colares4
1. Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus Macaé;
2. Universidade Federal do Rio de Janeiro - Programa de pós-graduação em
Ciência de Alimentos;
3. Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes - Universidade Federal do Rio
de Janeiro;
4. Universidade Federal do Rio de Janeiro - Instituto de Nutrição Josué de Castro
Endereço
1. Avenida do Aloizio, 50. Glória, Macaé. CEP. 27930-560. E-mail:
2.Avenida Athos da Silveira Ramos 149 Bloco A, 7° andar, CEP 21941-909
Cidade Universitária - Rio de Janeiro - RJ.
3. Avenida Carlos Chagas Filho, 373. Centro de Ciências da Saúde, Bloco I, 2°
andar, Laboratório 224, Ilha do Fundão, Cep: 21941-902. Rio de Janeiro, RJ.
152
4. Avenida Carlos Chagas Filho, 373. Centro de Ciências da Saúde, Bloco J, 2°
andar, Ilha do Fundão, Cep: 21941-902. Rio de Janeiro, RJ.E-mail:
Colares LGT e Mello AG participaram da concepção, tabulação, análise e
interpretação dos dados, elaboração e análise critica do artigo; Carmo CN participou
da análise estatística; Miguel MAL e Leite SGF participaram da análise dos dados e
análise crítica do artigo. Todos os autores leram e aprovaram a versão final do
artigo.
Artigo elaborado a partir da tese de AG, MELLO, intitulada “Perfil da microbiota de
um serviço de alimentação e análise da eficácia dos métodos empregados no
controle higiênico-sanitário”. UFRJ: rograma de ós-Graduação em Ciência de
alimentos. Com previsão de defesa para 2014.
AGRADECIMENTOS
À Favilla, AL pelo apoio técnico.
153
RESUMO
OBJETIVO: elaborar, validar o conteúdo deum roteiro de avaliação das condições
higiênico-sanitárias em Serviço de Alimentação (RACHS-SA) e verificar a
confiabilidade interavaliadores.
MÉTODOS: A elaboração do RACHS-SA baseou-se na legislação sanitária vigente,
sendo submetido aos especialistas para validação do conteúdo pela Técnica Delphi.
Foram selecionados os especialistas que tinham experiência e/ou desenvolviam
pesquisas em segurança dos alimentos e vigilância sanitária e conhecimento sobre
a construção de instrumentos de boas práticas. O conteúdo foi validado quando
houve concordância entre especialistas ≥70% na classificação dos itens em
imprescindível ou necessário ou recomendável. Depois de ter o conteúdo validado, o
RACHS-SA foi aplicado por quatro nutricionistas em um Serviço de Alimentação. As
condições higiênico-sanitárias do Serviço de Alimentação foram classificadas em
adequada, parcialmente adequada ou inadequada, de acordo com o percentual de
conformidade observado. A comparação da variância entre as respostas foi
realizada pelo teste Kruskal-Wallis. A confiabilidade interavaliadores foi verificada
pelo cálculo do coeficiente de correlação intraclasse (CCI), ao nível de significância
de 5%.
RESULTADOS: O RACHS-SA contém 12 blocos e 159 itens. Dos itens, 58.5% foram
classificados como imprescindíveis. O serviço de alimentação foi avaliado com
condições higiênico-sanitárias parcialmente adequadas, não havendo diferença
estatística significativa (p-valor= 0,457). Foi obtido CCI acima de 0,75 para 75% dos
blocos, indicando excelente concordância entre os avaliadores.
CONCLUSÃO: O RACHS-SA com o conteúdo validado atende a legislação vigente e
possui confiabilidade para avaliação das condições higiênico-sanitárias em serviços
de alimentação.
Termos de indexação: Estudos de validação; Condições sanitárias; Serviços de
alimentação; Confiabilidade e validade
154
ABSTRACT
OBJECTIVE: It was development and content validity of the script on evaluation of
the sanitary conditions in Foodservice (SESC-FS) and also verify interrater reliability.
METHODS: The development of the SESC-FS was based on the current legislation
of public health. The instrument was value by experts to content validity by Delphi
technique. Experts were selected by experience in food safety and knowledge on
development in good practice instruments. The content was validated when there
was agreement among experts ≥70% in the classification of essential or necessary or
recommended items. After content had been validated the SESC-FS was applied by
4 dietitians in a restaurant. The food service sanitary conditions were evaluated and
classified as adequate, or partially adequate, or inadequate. The Kruskal-Wallis test
was conducted to compare the variance between responses. The interrater reliability
was analyzed by Intraclass Correlation Coefficient (ICC) were used and significance
level of 5% was adopted.
RESULTS: The SESC-FS made of 12 blocks and 159 items. From those items
58.5% were classified as essential. The food service was reported with partially
adequate sanitary conditions. No statistically significant difference was observed (p-
value= 0,457). The 75% of the blocks showed ICC above 0.75, this indicating
excellent interrater reliability.
CONCLUSION: The content of SESC-FS was validated and could be a reliable
instrument to assessing the hygienic and sanitary conditions in food service.
Index terms: Validation studies; sanitary conditions; Food services; Reliability and
validity
155
INTRODUÇÃO
As doenças transmitidas por alimentos (DTA) têm sido consideradas um
relevante problema de saúde pública. Diariamente ocorrem diversos casos de DTA,
porém muitos não são notificados, fato que reduz a verdadeira dimensão do
problema.29
No Brasil, entre 2010 e 2011, foram registrados 8663 surtos de DTA, com 112
óbitos. Destes, 15,4% estavam relacionados com os alimentos consumidos em
serviços de alimentação.5
Alguns fatores estão associados aos surtos de DTA como: adoção de
procedimentos inadequados durante o preparo das refeições, deficiência na
higienização de equipamentos e inadequação da higiene pessoal dos
manipuladores.15
A importância do setor de alimentação fora do lar está relacionada com a
geração de empregos, com estimativa em 2013 de 195 mil postos de trabalho
diretos e indiretos, com o consumo de alimentos (11 mil toneladas) e a produção de
refeições (18milhoes/dia).3 A Pesquisa de orçamento familiares (POF)
2008/200910revelou que 31% dos gastos com alimentação do brasileiro são
realizados fora do lar. Sendo necessário adotar procedimentos de boas práticas (BP)
durante o processo produtivo de refeições para minimizar os surtos de DTA e os
danos à saúde pública.
Para avaliação da adoção das BP em serviços de alimentação é comum a
utilização de roteiros de inspeção, pois propiciam análise detalhada dos aspectos
relativos ao processo produtivo de refeições e aos procedimentos higiênico-
sanitários adotados.4
Há alguns instrumentos disponíveis como os sugeridos pela Legislação
sanitária: CVS 5/201322 e RDC 275/200224, e por alguns autores como Akutsu et al.8
e Kassa et al.13,porém,são necessários estudos de validação para estabelecer a
confiabilidade e relevância dos instrumentos.
A validação de um instrumento indica se os resultados de uma aferição se
aproximam do estado verdadeiro dos fenômenos que estão sendo medidos14 e pode
ser classificada em: critério, constructo e conteúdo.16
A validação de critério é realizada pela comparação de um instrumento de
medição com um critério externo, que representa o padrão.16 A de construto examina
156
a definição e operacionalização de variáveis que se encontram o mais próximo do
significado teórico do conceito e a de conteúdo avalia o grau em que cada elemento
do instrumento de medida é relevante e representativo de um específico constructo
(neste caso, as condições higiênico-sanitárias) com um propósito particular de
avaliação.9
Alguns estudos da prática clínica utilizaram a Técnica Delphi para validação do
conteúdo de seus instrumentos.2,25,7 Essa técnica está baseada na reunião de
especialistas para buscar o consenso sobre determinado assunto a partir de uma
sequencia de rodadas com feedback controlado, sendo a única forma de
comunicação entre os especialistas.20
O anonimato dos especialistas é mantido, favorecendo a expressão de opinião
precisa, sem interferência.20 A necessidade de longo periodo de tempo para
aplicação da técnica, pode desencorajar a participação dos especialistas.27 No
entanto a técnica Delphi, é uma estratégia apropriada para estabelecer a validade de
conteúdo de instrumentos, pois permite analisar, de forma sistemática, as opiniões
dos especialistas.28
Um instrumento, mesmo tendo seu conteúdo validado, deve ser reprodutível
sendo o teste de confiabilidade um critério utilizado. Este teste se baseia na
verificação do grau de correspondência entre avaliações independentes.8
Considerando que a validação de conteúdo representa a associação de
conceitos abstratos com indicadores observáveis e mensuráveis, os objetivos deste
trabalho foram elaborar e validar o conteúdo de um roteiro de avaliação das
condições higiênico-sanitárias em Serviços de alimentação (RACHS-SA) e verificar a
confiabilidade interavaliadores.
MÉTODOS
Tratou-se de um estudo descritivo, não experimental com delineamento
transversal realizado no período de fevereiro de 2011 a junho de 2012. Amparou-se
em princípios éticos, da Resolução 016/2000 do Conselho Federal de Psicologia e
pela Resolução 196 do Conselho Nacional de Saúde, com aprovação do Comitê de
Ética em Pesquisa do Instituto de Estudos em Saúde Coletiva da Universidade
Federal do Rio de Janeiro (parecer 118/2010) e constou das seguintes etapas: 1ª)
Elaboração do roteiro; 2ª) Submissão do roteiro ao comitê de especialistas para
157
validação do conteúdo e 3ª) Avaliação do roteiro validado quanto a reprodutibilidade
e confiabilidade.
1ª) Elaboração do RACHS-SA:
O instrumento foi elaborado a partir da pesquisa e análise de ferramentas
disponíveis na literatura para avaliação das condições higiênico-sanitárias de
estabelecimentos que manipulam, preparam, armazenam e/ou comercializam
alimentos, tomando por base a Resolução RDC 216/200423 e as exigências da
Norma Brasileira ABNT/NBR 15635/200819, que estabelece os requisitos e controles
operacionais essenciais para adoção das boas práticas.
Na elaboração do roteiro foram considerados os seguintes aspectos
relacionados às boas práticas: estrutura físico-funcional; recebimento e
armazenamento de alimentos, pré-preparo, preparo e distribuição de refeições;
higiene pessoal e ambiental, e documentação.
Foi proposto o cálculo do percentual de adequação das condições higiênico-
sanitárias (PACHS) parcial, para cada bloco que compõe o instrumento, ou total,
levando em consideração todos os blocos como mostram as equações 1 e 2.
Equação 1: ACH bloco
Equação 2: ACH total
Para a classificação qualitativa das condições higiênico-sanitárias do serviço
de alimentação foi proposta a categorização adaptada da Resolução 275/200224,
sendo classificadas como condições adequadas quando o ACH apresentar ≥76%
de conformidade; parcialmente adequadas quando o PACHS ficar entre 51 e 75% e
inadequadas quando o ACH for ≤ 50%.
2ª) Validação do conteúdo do RACHS-SA por comitê de especialistas:
158
Para estabelecer a validação do conteúdo do instrumento foi utilizada a
técnica Delphi, que consistiu em três fases: 2.1) seleção dos especialistas; 2.2)
apresentação do instrumento e orientação para avaliação do conteúdo do roteiro
quanto à aplicabilidade, relevância, pertinência e clareza e 2.3) classificação dos
itens dos instrumento de acordo com o risco oferecido à qualidade higiênico-
sanitária das refeições prontas.
2.1) Seleção do comitê de especialistas:
Foram convidados para o processo de validação dez especialistas que
atendiam a, pelo menos, dois dos seguintes critérios de inclusão, comprovados pelo
Curriculum vitae baseado na plataforma Lattes do CNPQ: a) experiência profissional
ou acadêmica mínima de cinco anos em segurança dos alimentos e vigilância
sanitária; b) possuir publicação e desenvolver pesquisas sobre boas práticas em
serviços de alimentação; c) conhecimento metodológico sobre a construção de
instrumentos de boas práticas em serviços de alimentação e d) pós-graduação
Strictu e/ou Lato sensu em vigilância sanitária ou áreas afins. Priorizou-se a escolha
de profissionais de diferentes áreas da saúde para que a avaliação do instrumento
fosse realizada de forma complementar. Após o aceite, foi enviado aos dez
especialistas uma carta explicando sobre o processo de validação de conteúdo do
instrumento elaborado por correio eletrônico. Todos os dez participantes do comitê
de especialistas assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
2.2) Apresentação do instrumento e orientação para avaliação do conteúdo
quanto à aplicabilidade, relevância, pertinência e clareza:
Considerada como uma fase exploratória, o RACHS-SA foi apresentado aos
especialistas acompanhado de formulário de orientação para análise do mesmo
quanto à aplicabilidade, relevância e pertinência para avaliação higiênico-sanitária
de serviços de alimentação, bem como clareza dos itens, quanto à forma de redação
dos mesmos.1 O julgamento dos especialistas foi tabulado em planilha eletrônica do
Excel®, sendo considerados os comentários e sugestões.
159
2.3) Classificação dos itens do instrumento elaborado de acordo com o risco
oferecido à qualidade higiênico-sanitária das refeições prontas:
Esta fase, seguindo o preconizado na Técnica Delphi, foi composta de
rodadas para análise do instrumento pelos especialistas, a fim de classificar cada
item do RACHS-SA de acordo com o risco oferecido à manutenção da qualidade
higiênico-sanitária das refeições prontas, conforme recomendações do Ministério da
Saúde18 em: Imprescindível (I), Necessário (N), Recomendável (R), quando esses
contribuíssem, respectivamente, de forma crítica, menos crítica e não crítica para a
contaminação dos alimentos. Ainda nessa fase, os especialistas puderam sugerir a
inclusão, modificação ou eliminação de itens. Foi recomendado aos especialistas
que esta etapa fosse realizada em ambiente tranquilo e sem interrupções de outras
pessoas de forma a não interferir na qualidade da análise.
Os resultados foram escrutinados e as tendências centrais, assim como as
dispersões calculadas foram enviadaspor correio eletrônico aos especialistas, para
que eles pudessem ver as respostas dos demais, conforme sugerido por Jairath &
Weinstein.11 Os itens que não obtiveram concordância, assim como os novos itens
inseridos foram reavaliados pelo comitê em uma nova rodada, até que fosse obtida
concordância interespecialistas mínima de 70% na classificação de cada item, sendo
considerado validado o conteúdo do instrumento.
3ª)Análise da confiabilidade e reprodutibilidade do instrumento validado.
Para medir a qualidade do RACHS-SA foram convidadas quatro nutricionistas
que atuavam na área de Alimentação Coletiva, para aplicar o roteiro com o conteúdo
validado em um serviço de alimentação localizado na cidade do Rio de Janeiro que
produzia e distribuía 3500 almoços de segunda a sexta-feira para coletividade sadia,
tendo como objetivo a avaliação das condições higiênico-sanitárias do serviço de
alimentação, sua classificação segundo o PACHS por bloco e total e analisar a
confiabilidade e reprodutibilidade do instrumento.
A aplicação do RACHS-SA foi realizada por todos os nutricionistas no mesmo
dia entre 8h00min e 12h00min. Os avaliadores foram orientados a não consultarem
as demais colegas durante a aplicação do RACHS-SA e para não comunicarem os
resultados obtidos, a fim de evitar influência nas respostas.
160
Para comparar os percentuais de adequação das condições higiênico-
sanitárias do serviço de alimentação, obtidos a partir da avaliação dos quatro
nutricionistas, foi utilizada a análise de variância não paramétrica, sendo aplicado o
Teste de Kruskal-Wallis. O nível de significância de 5% foi considerado em todas as
análises.
Para análise dos dados foi utilizado o pacote estatístico SPSS, versão 20. O
coeficiente de correlação intraclasse (CCI),26 que avalia a homogeneidade de duas
ou mais medidas, foi utilizado para verificar a confiabilidade e a reprodutibilidade do
instrumento. Quando o CCI foi ≥0,75, a confiabilidade foi considerada excelente,
entre 0,4 e 0,75 houve confiabilidade satisfatória e confiabilidade pobre quando o
CCI foi < 0,4. O nível de significância de 5% foi considerado em todas as análises.
RESULTADOS
Elaboração do instrumento para avaliação das condições higiênico-sanitária.
O RACHS-SA foi desenvolvido tomando como base a estrutura do roteiro
disponível na legislação vigente,24 sendo composto inicialmente por 103 itens com
variáveis dicotômicas para avaliação (conforme= 1 e não conforme= 0), que foram
agrupados em 12 blocos: I. Armazenamento dos alimentos; II. Estrutura física; III.
Equipamentos e utensílios; IV. Higiene ambiental; V. Manejo de resíduos sólidos; VI.
Manipuladores de alimentos; VII. Preparo de alimentos; VIII. Distribuição; IX.
Controle integrado de vetores e pragas urbanas; X. Abastecimento de água; XI.
Documentação e XII. Capacitação dos manipuladores de alimentos.
Validade do conteúdo do instrumento pela Técnica Delphi.
Caracterização do comitê de especialistas.
O comitê de especialistas composto pelos dez profissionais que aceitaram
em participar dessa etapa da pesquisa possuía, em média, dezoito anos de
experiência em uma das seguintes áreas: segurança dos alimentos e vigilância
sanitária. Com relação à formação acadêmica, 60% era nutricionista, 10%
pedagoga, 10% química e 10% farmacêutica. Dos especialistas, 40% possuíam
doutorado, 40% mestrado e 20% especialização em vigilância sanitária ou áreas
161
afins. Quanto à área de atuação, 40% trabalhavam como docente, 40% eram
consultores em serviços de alimentação e 20% trabalhavam na Vigilância Sanitária.
Análise dos itens quanto à aplicabilidade, relevância, pertinência e clareza.
O RACHS-SA foi avaliado positivamente por 100% dos especialistas com
relação à clareza na leitura, objetividade e relevância dos itens, sendo o conteúdo do
instrumento considerado adequado para avaliar as condições higiênico-sanitárias de
serviços de alimentação.
Com relação à aplicabilidade e relevância os especialistas julgaram que o
RACHS-SA é uma ferramenta útil para visitas fiscais e para avaliação dos serviços
de alimentação, sendo de simples aplicação e relevante, visto que engloba os
principais aspectos relacionados à inspeção sanitária, podendo auxiliar os
profissionais da área, estudantes e gestores na avaliação do estabelecimento
quanto aos aspectos sanitários.
Classificação dos itens do instrumento elaborado de acordo com o risco
oferecido à qualidade higiênico-sanitária das refeições prontas.
Para essa fase da pesquisa foram realizadas três rodadas de avaliação pelo
comitê de especialistas, até que houvesse concordância entre os mesmos. Na
primeira rodada, dos 103 itens avaliados, de acordo com o risco oferecido para a
manutenção da qualidade higiênico-sanitária, 90% obtiveram consenso entre os
especialistas (Tabela 1), sendo 80% dos itens classificados como imprescindíveis. O
Comitê de especialistas solicitou a inclusão 17 itens (35% no bloco 1) e a subdivisão
de 5 itens resultando em 15 novos itens de avaliação (Tabela 1).
Os especialistas apontaram a necessidade de incluir a aferição das
temperaturas de armazenamento e distribuição dos alimentos, assim como a
periodicidade de troca de filtros de água e limpeza da caixa d’agua e dos
condicionadores de ar, medidas necessárias para orientar a adoção das boas
práticas. Além disso, 17 itens sofreram alteração quanto à sintaxe, para torná-los
mais objetivos. As sugestões dos especialistas foram incorporadas no instrumento.
Na segunda rodada, os especialistas receberam o instrumento contendo 135
itens (Tabela 1), no entanto foram orientados a avaliarem os 27 itens (referente aos
162
itens incluídos e aqueles sem concordância) (Tabela 1). Dos 135 itens avaliados,
100% obtiveram consenso entre os especialistas, no entanto, o comitê solicitou a
inclusão de 20 novos itens (Tabela 1).
Conforme sugerido por um dos especialistas, foi inserida a instrução de
utilização e preenchimento do RACHS-SA para orientar a inspeção sanitária e a
avaliação quali-quantitativa do serviço de alimentação, a fim de auxiliar na aplicação
do mesmo.
TABELA 1
Na terceira e última rodada, para a classificação dos itens conforme o risco
oferecido à qualidade das refeições servidas, os especialistas receberam o
instrumento contendo 159 itens, mas foram orientados a julgarem apenas os 20
itens incluídos na segunda rodada (Tabela 2), assim como a instrução de utilização
e preenchimento do RACHS-SA. Nesta rodada, a maioria dos itens (58,5%) foi
classificada como imprescindível e não foram solicitadas alterações (Tabela 2).
Todos os especialistas julgaram a instrução de preenchimento adequada.
O comitê avaliou os itens do instrumento e sugeriu as alterações necessárias
para que o conteúdo do RACHS-SA pudesse se tornar o mais objetivo e
compreensível possível.
TABELA 2
Avaliação das condições higiênico-sanitárias do serviço de alimentação e
análise da confiabilidade e reprodutibilidade interavaliadores.
O percentual de adequação das condições higiênico-sanitárias do serviço de
alimentação (PACHS total) foi considerado parcialmente adequado (Tabela 3). Já o
PACHS dos blocos III, IV e VI, respectivamente, Equipamentos e utensílios; Higiene
ambiental e Preparo de alimentos foram classificados como inadequados (Tabela 3).
Ressalta-se que o bloco VI possui 100% dos itens classificados como
imprescindíveis (Tabela 2).
163
O teste de Kruskal-Wallis mostrou que não houve diferença estatística
significativa entre as avaliações obtidas tanto para PACHS total, como para o
PACHS dos blocos (Tabela 3).
TABELA 3
Após o cálculo do coeficiente de correlação intraclasse, encontrou-se que 75%
dos CCI foram classificados como excelente, 8% como satisfatórios e 17% como
pobre (Tabela 4).
TABELA 4
DISCUSSÃO
A elaboração de instrumento para avaliação das condições higiênico-
sanitárias de serviços de alimentação viabiliza a uniformização da identificação das
não conformidades e auxilia aos gestores na implantação das normas sanitárias
vigentes.15
O RACHS-SA foi avaliado por um comitê de especialistas que possuía
formação acadêmica e profissional heterogênea, com experiência necessária para
avaliação do instrumento já que o sucesso da técnica Delphi depende do
conhecimento e habilidade deste grupo.12,21
O comitê de especialistas classificou todos os itens dos blocos VI e VII,
respectivamente, manipuladores de alimento e preparo de alimentos como
imprescindíveis, ou seja, aqueles que podem influenciar de forma critica na
qualidade das refeições servidas e causar danos à saúde do consumidor.
Estudos realizados por Yoon et al;30 Veiros et al;27 Cunningham et al6 e Kassa
et al¹3 têm relatado que a adoção de condutas inadequadas de higiene pessoal pelos
manipuladores de alimentos, assim como a existência de não conformidades
164
durante a etapa de preparo de refeições podem colocar em risco a qualidade das
refeições servidas. Yoon et al30 verificaram a presença de microrganismos
patogênicos como Samonella e Staphylococcus aureus nas mãos dos
manipuladores de alimentos e Cunningham et al6 verificaram a existência de
bactérias mesófilas na área de preparo de refeições. Estes estudos reforçam a
necessidade de um controle rigoroso destes blocos e a classificação dos mesmos
como imprescindível, pelo comitê de especialistas, é necessária para auxiliar na
manutenção da saúde pública.
O RACHS-SA permite avaliar se o serviço de alimentação está em adequação
com a legislação vigente de forma direta, através da classificação dos itens que
compõem o instrumento em conformes e não conformes. A classificação qualitativa
das condições higiênico-sanitárias do serviço de alimentação está baseada no
percentual de adequação das condições higiênico-sanitárias (PACHS).
Para Veiros et el,27 a possibilidade de pontuar e classificar os blocos e o
serviço de alimentação como um todo torna-se necessário, já que se pode obter
uma análise detalhada, o que torna a avaliação objetiva, sendo ressaltadas as
necessidades de correção das não conformidades, a fim de cumprir as exigências
legais.
Após o cálculo do percentual de adequação das condições higiênico
sanitárias do serviço de alimentação e de cada bloco de avaliação, verificou-se que
o RACHS-SA foi capaz de identificar os itens que necessitam de medidas corretivas
imediatas, uma vez que podem interferir de forma crítica na qualidade das refeições
servidas. Além disso, não houve diferença estatística significativa entre as
avaliações dos nutricionistas, mostrando que existência de confiabilidade e
reprodutibilidade do instrumento.
De acordo com Streiner & Normann26 para que um instrumento apresente
confiabilidade o valor do CCI deve ser ≥ 0,75. Como a maioria dos blocos (75%)
apresentou CCI acima de 0,75, reforça a existência de confiabilidade do instrumento.
No bloco X, o CCI ficou instável devido à ocorrência de muitos valores iguais,
dificultando o cálculo da variância dos itens.
Os resultados obtidos indicam que o RACHS-SA pode ser aplicado com boa
reprodutibilidade pelos profissionais que atuam na área de segurança dos alimentos
e vigilância sanitária, a fim de avaliar as condições higiênico-sanitárias dos serviços
165
de alimentação, auxiliar na adoção das boas práticas de manipulação, favorecendo
a manutenção da saúde pública.
A contribuição do estudo foi colocar à disposição de profissionais um
instrumento para avaliação das condições higiênico-sanitárias de serviços de
alimentação com o conteúdo validado e reprodutível.
CONCLUSÃO
Além disso, o RACHS-SA da forma como foi elaborado reúne os principais
tópicos exigidos pelas normas sanitárias (Resolução RDC 216/2004 e da NBR
15635/2008) e pode ser aplicado de forma sistemática, concisa e possibilita o
controle dos itens imprescindíveis, que podem contribuir de forma mais critica na
qualidade das refeições servidas, a fim de orientar a adoção das boas praticas de
manipulação.
Os resultados obtidos pelos testes estatísticos permitem concluir que o
RACHS-SA com conteúdo validado possui reprodutibilidade e confiabilidade para
avaliação das condições higiênico-sanitárias.
A heterogeneidade do comitê de especialistas foi de fundamental importância,
pois permitiu um olhar diversificado e complementar a cerca da análise do
instrumento elaborado.
Dentre as limitações da pesquisa, pode-se destacar a carência de estudos de
validação de conteúdo sobre o tema que pudessem alimentar a discussão.
O RACHS-SA com o conteúdo validado pode auxiliar os profissionais da área
de segurança dos alimentos e vigilância sanitária e gestores de serviços de
alimentação na avaliação da adoção das boas práticas nestes estabelecimentos,
contribuído para a melhoria das Boas práticas e oferta de alimentação segura.
166
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169
Tabela 1. Alterações e discordância entre os especialistas, por bloco, nas três rodadas de avaliação do instrumento, Rio de Janeiro 2013.
Blocos
1ª
Rodada
2ª
Rodada
3ª
Rodada
Itens
N
I¹ D² SC³ Itens
N
I D SC Itens
n n n n n n n
I. Armazenamento de alimentos 15 6 6 0 27 3 0 0 30
II. Estrutura física 29 1 4 1 34 2 0 0 36
III. Equipamentos e utensílios 6 0 0 0 6 0 0 0 6
IV. Higiene ambiental 4 1 0 1 5 8 0 0 13
V. Manejo de resíduos sólidos 5 0 1 1 6 2 0 0 8
VI. Recursos humanos 11 0 3 2 14 0 0 0 14
VII. Preparo de alimentos 5 1 0 1 6 1 3 0 10
VIII. Distribuição de refeições 12 2 0 1 14 0 0 0 14
IX. Controle integrado de vetores e pragas urbanas 3 1 0 0 4 0 1 0 5
X. Abastecimento de água 6 0 1 1 7 4 0 0 11
XI. Documentação 5 2 0 2 7 0 0 0 7
XII. Capacitação dos manipuladores de alimentos 2 3 0 0 5 0 0 0 5
Total 103 17 15 10 135 20 4 0 159
1. I = Total de Itens incluídos; ². D= Total de itens divididos; ³. SC: Total de itens sem
concordância.
170
Tabela 2. Classificação dos itens quanto ao risco oferecido para a manutenção da qualidade higiênico-sanitária das refeições, conforme julgamento dos especialistas,
Rio de Janeiro 2013.
Blocos Itens
Classificação dos itens
Imprescindível Necessário Recomendado
N N % N % N %
I. Armazenamento de alimentos
30 20 66,7 10 33,3 0 0,0
II. Estrutura física 36 12 33,3 22 61,1 2 5,6
III. Equipamentos e utensílios
6 4 66,7 2 33,3 0 0,0
IV. Higiene ambiental 13 7 53,8 6 46,2 0 0,0
V. Manejo de resíduos sólidos
8 4 50,0 4 50,0 0 0,0
VI. Recursos humanos 17 13 76,5 4 23,5 0 0,0
VII. Preparo de alimentos 6 6 100,0 0 0,0 0 0,0
VIII. Distribuição de refeições
19 11 57,9 6 31,6 2 10,5
IX. Controle integrado de vetores e pragas urbanas
4 4 100,0 0 0,0 0 0,0
X. Abastecimento de água 8 6 75,0 2 25,0 0 0,0
XI. Documentação 7 3 42,9 4 57,1 0 0,0
XII. Capacitação dos manipuladores de alimentos
5 3 60,0 2 40,0 0 0,0
Total 159 93 58,5 62 39,0 4 2,5
171
Tabela 3. Percentual de adequação das condições higiênico-sanitárias do serviço de alimentação a partir da avaliação dos quatro nutricionistas, Rio de Janeiro, 2013.
Bloco
Nutricionistas
A
(%)
B
(%)
C
(%)
D
(%)
p-valor²
I. Armazenamento de alimentos 76 76 70 53 0,12
II. Estrutura física 41 55 41 39 0,34
III. Equipamentos e utensílios 33 16,6 0 0 0,55
IV. Higiene ambiental 54 46 46 39 0,84
V. Manejo de resíduos sólidos 62,5 87,5 62,5 50 0,23
VI. Recursos humanos 71,4 71,4 71,4 71,4 1,00
VII. Preparo de alimentos 33,3 50 33,3 33,3 0,78
VIII. Distribuição de refeições 72,2 55,5 66,6 44,4 0,33
IX. Controle integrado de vetores e pragas urbanas 50 75 50 50 0,67
X. Abastecimento de água 57 100 100 100 0,66
XI. Documentação 77,7 66,6 66,6 66,6 0,87
XII. Capacitação dos manipuladores de alimentos 60 80 80 80 0,82
PACHS¹ 59,2 58 58 51 0,64
3. Percentual de adequação das condições higiênico-sanitárias: Adequado ≥76%; parcialmente adequado 51-75%; inadequado ≤50%
4. Não foram obtidas diferenças estatisticamente significativas pelo teste de Kruskal-Wallis.
172
Tabela 4. Coeficiente de correlação intraclasse obtidos das respostas dadas pelos quatro nutricionistas para cada bloco do RACHS-SA, Rio de Janeiro 2013.
Blocos CCI¹ IC 95% p-valor
I. Armazenamento de alimentos 0,872 0,777 - 0,933 0,000
II. Estrutura física 0,784 0,635 - 0,882 0,000
III. Equipamentos e utensílios 0,667 -0,374 - 0,962 0,063
IV. Higiene ambiental 0,769 0,420 - 0,930 0,001
V. Manejo de resíduos sólidos 0,346 -0,108 - 0,874 0,225
VI. Recursos humanos 0,822 0,586 - 0,939 0,000
VII. Preparo de alimentos 0,957 0,847 - 0,993 0,000
VIII. Distribuição de refeições 0,918 0,824 - 0,968 0,000
IX. Controle integrado de vetores e pragas urbanas 0,941 0,701 - 0,996 0,000
X. Abastecimento de água 0,000 -0,851 - 0,737 0,455
XI. Documentação 1 - -
XII. Capacitação dos manipuladores de alimentos 0,933 0,725 - 0,992 0,000
¹. Coeficiente de correlação intraclasse: CCI>0,75 excelente; 0,4-0,75 satisfatória; <0,4 pobre.
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