INSTITUTO NACIONAL DE CNCER

INCA

Programa de ps-graduao stricto sensu em Oncologia

Waldemir Fernandes de Souza

PERDA DA ADESO CLULA-CLULA MEDIADA PELA E-CADERINA EM CNCER COLO-RETAL: VIAS DE SINALIZAO ENVOLVIDAS

Rio de Janeiro 2009

WALDEMIR FERNANDES DE SOUZA

PERDA DE ADESO CLULA-CLULA MEDIADA PELA E-CADERINA EM CNCER COLO-RETAL: VIAS DE SINALIZAO ENVOLVIDAS

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao stricto sensu em Oncologia do Instituto Nacional de Cncer INCa, para obteno do grau de Mestre em Oncologia, rea de concentrao Pesquisa Bsica.

Orientador Jos Andrs Morgado Daz

Rio de Janeiro 2009

S719p

Souza, Waldemir Fernandes de. Perda de adeso clula-clula mediada pela e-caderina em cncer colo-retal: vias de sinalizao envolvidas / Waldemir Fernandes de Souza. - Rio de Janeiro: INCA, 2009. 81f. il. Dissertao (Mestrado) - Instituto Nacional de Cncer. Programa de Ps-graduao Stricto Sensu em Oncologia do Instituto Nacional de Cncer (INCA-RJ), 2009. Orientador: Jos Andrs Morgado Daz. 1. Neoplasias Colorretais. 2. Junes Aderentes. 3. Caderinas. 4. ATPase Trocadora de Sdio-Potssio. 5. Quinases da Famlia src. 5. Quinases Reguladas por Sinal Extracelular. I. Daz, Jos Andrs Morgado. II. Ttulo. CDD 616.9944347

WALDEMIR FERNANDES DE SOUZA

PERDA DE ADESO CLULA-CLULA MEDIADA PELA ECADERINA EM CNCER COLO-RETAL: VIAS DE SINALIZAO ENVOLVIDAS

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao stricto sensu em Oncologia do Instituto Nacional de Cncer INCa, para obteno do grau de Mestre em Oncologia, rea de concentrao Pesquisa Bsica.

Aprovada em 30 de maro de 2009 pela banca examinadora:

Dra. Raquel Ciuvalschi Maia - Grupo de Resistncia s Drogas nas Neoplasias, INCa Dr. Ricardo Luis Alves Silva - Laboratrio de Oncologia Experimental, INCa Dr. Emanuela de Moraes Ribeiro Pinto - Setor de Oncologia, GlaxoSmithKline Brasil

iv

Esta dissertao de mestrado foi desenvolvida no Laboratrio de Biologia Estrutural da Diviso de Biologia Celular no Centro de Pesquisa do Instituto Nacional de Cncer (INCa), sobre a orientao do Dr. Jos Andrs Morgado Daz.

v

RGOS FINANCIADORES:Instituto Nacional de Cncer Ministrio da sade (INCa MS) Fundao Ary Frauzino para pesquisa e Controle do Cncer (FAF) Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) Fundao Carlos Chagas Filho de Amparo Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES)

vi

DEDICATRIA

Aos av

meus Ila (in

pais,

Valdelicio

e

Maria apoio

Auxiliadora, meu irmo, Waldener, e minha memoriam) pelo incondicional em todos os momentos.

vii

AGRADECIMENTOS

A toda minha famlia pelo estmulo constante nessa jornada, em especial Duda, por chamar a ateno do tio com suas constantes peraltices. A famlia Jogaib, em especial ao Gustavo e a Tatiana, que acreditaram no meu potencial e me deram o apoio necessrio para entrar no mundo da Biologia. Ao meu orientador e grande amigo, Jos Morgado, pelos ensinamentos e direcionamentos que conduzem a minha formao profissional, e por enfrentar comigo os mais diversos contratempos. famlia Bioestrutural: Simone (Sissi), Andria (Deir), Fernanda (F), Lilian (Lili), Flavia (Flavidal), Tlineee, Sarah, Wallace, Julio (X), Pedro (Obina) e Tanakaaaaaaa, pelas discusses acerca do trabalho, pela ajuda no dia-a-dia e, principalmente, pelos nossos momentos de descontrao. Aos ex-integrantes do Grupo, Silvia, Paloma, Patrcia, Ana, e aos agregados, Gabriel (Ozama) e Nakamura (Naka), pela amizade e papos sobre futebol. Ao Leandro Augusto, pela ajuda e vastas discusses e sugestes sobre o trabalho: valeu meu querido! Ao pessoal do INCa que de alguma forma contribuiu para este trabalho. A galera da Turma Francisco na Prancheta, em especial os amigos Chic, Maguila, Zuzu e Leandro: estamos juntos galera!

viii

A perseverana e a luta por um ideal norteiam a eterna busca do conhecimento.

ix

ResumoDurante a progresso do cncer colo-retal, alguns eventos so cruciais para iniciar o processo metasttico. Estes eventos envolvem a desorganizao dos contatos clula-clula, aumento da motilidade e invasividade celular, os quais fazem parte de um programa morfogentico conhecido como transio epitlio-mesenquimal (TEM). A adeso clula-clula controlada por um sistema de protenas de membrana, conhecido como complexo juncional apical, o qual formado pelas junes tight e aderentes. A glicoprotena transmembrana E-caderina a principal protena das junes aderentes e desempenha um importante papel na regulao da organizao e manuteno da adeso clula-clula, e de sinais intracelulares que medeiam a proliferao e motilidade celular. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares que regulam a desorganizao das junes aderentes mediada pela Ecaderina, no cncer colo-retal, ainda no esto definidos. No presente estudo usando uma linhagem celular de cncer de clon humano, Caco-2, foram avaliadas as vias de sinalizao envolvidas na perda de adeso clula-clula mediada pela Ecaderina e aumento do potencial migratrio causado por TPA e EGF, assim como o envolvimento da Na+/K+-ATPase na desorganizao das junes aderentes induzida pela ouabana. Nossos resultados mostraram que os tratamentos com 200 nM de TPA e 100 ng/mL de EGF causaram desorganizao das junes aderentes, e este evento foi modulado de forma diferencial pelas protenas ERK1/2 e Src. A protena ERK1/2 participando da modulao nos perodos iniciais dos tratamentos e a protena Src atuando em resposta tardia. Alm disso, o tratamento com estes agentes induziu um aumento da motilidade celular, sendo este efeito revertido pelo tratamento com o inibidor de Src, o PP1. Por outro lado, o tratamento com 10 e 100 M de ouabana tambm causou alteraes morfolgicas das junes aderentes e redistribuio da E-caderina. Este efeito parece ser modulado pela protena ERK1/2, considerando o aumento da atividade desta protena analisado em paralelo. Adicionalmente, foi observado que a ouabana causou reduo dos nveis proticos da subunidade 1 da Na+/K+-ATPase e um aparente acmulo citoplasmtico da mas no da -catenina. Em concluso, nossos resultados indicam que a desorganizao da adeso clula-clula mediada pela E-caderina, provocada por TPA e EGF, pode ser modulada inicialmente por ERK1/2 e posteriormente pela Src, sendo esta ltima tambm responsvel pelo aumento da motilidade celular. E, alm disso, os experimentos com ouabana mostraram um papel importante da subunidade 1 da Na+/K+-ATPase na desorganizao das junes aderentes e da protena ERK1/2 como moduladora deste evento. Nossos resultados podem contribuir para o entendimento dos mecanismos que medeiam a desorganizao dos contatos clula-clula mediado pela E-caderina e, de forma geral, da progresso do carcinoma colo-retal. Palavras-chave: Neoplasias Colorretais. Junes Aderentes. Caderinas. ATPase Trocadora de Sdio-Potssio. Quinases da Famlia Src. Quinases Reguladas por Sinal Extracelular.

x

AbstractDuring tumor development, some events are crucial to trigger the metastatic process. These events involve the disassembly of cell-cell contacts, increase of cell motility and invasivity, which are part of a morphogenetic program called epithelial mesenchymal transition (EMT). The cell-cell adhesion is controlled by a system of membrane proteins, known as the apical junctional complex, which is constituted for tight and adherent junctions. The transmembrane glycoprotein E-cadherin is the main adherens junction protein that plays a critical role in the organization and maintenance of cell-cell adhesion, and regulates intracellular signals to mediate cell proliferation and motility. Nevertheless, the cellular and molecular mechanisms that regulate the disassembly of the E-cadherin-mediated adherens junction in colorectal cancer, remain to be defined. In present study, using a human colon cancer cell line, Caco-2, we evaluate cell signaling pathways involved with the disassembly of Ecadherin-mediated cell-cell adhesion and the migratory potential caused by TPA and EGF. Furthermore, the roles of Na+/K+-ATPase on the adherens junction disassembly caused by ouabain, as well as cellular events involved also were analyzed. Our results show that treatment with 200 nM TPA and 100 ng/mL EGF caused adherens junction disruption in an event differentially modulated by ERK1/2 and Src proteins. ERK1/2 protein modulates adherens junction disassembly in early periods of treatment whereas Src protein in a later response. Besides, treatment with these agents induced an increase of cell motility, a process modulated by Src. On the other hand, treatment with 10 and 100 M ouabain also caused morphological alterations of adherens junction and E-cadherin redistribution, and these events seem to be modulated by ERK1/2, considering the increased activity of this protein analyzed in parallel. Additionally, we observed reduction of protein levels of the Na+/K+-ATPase 1-subunit and apparent accumulation of -catenin, but not -catenin at the cytoplasm, after treatment with ouabain. In conclusion, our results indicate that disassembly of E-cadherin-mediated cell-cell adhesion, promoted by TPA and EGF may be initially modulated by ERK1/2 and subsequently by Src. This later protein was also responsible by regulate the increase of cell motility induced by these agents. Furthermore, we showed that ouabain induces adherens junction disassembly concomitantly to decreasing protein levels of the Na+/K+-ATPase 1subunit, and these events may be modulated by ERK1/2. Our findings may contribute for the understanding of mechanisms that mediate disassembly of E-cadherinmediated cell-cell contacts and of a general manner on the progression of colorectal carcinoma. Key words: Colorectal Neoplasias. Adherens Junction. Cadherins. kinases of the Src Family. Sodium-Potassium. Exchange ATPase. Extracellular Signal-Regulated Kinases. aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

xi

LISTA DE FIGURAS

Pgina Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Representao esquemtica da estrutura do intestino grosso ................................................................................... 2 Modelo esquemtico do complexo juncional ........................... 3 Vias de transporte paracelular e transcelular ....................... 5 Estrutura e composio molecular das junes tight ........... 7 Modelo mostrando os constituintes moleculares da juno aderente ............................................................................... 10 Esquema da estrutura da E-caderina ................................... 11 Rede de sinalizao celular .................................................. 15 Estrutura geral das quinases da famlia Src mostrando suas configuraes inativa e ativa ........................................ 18 Modelo esquemtico mostrando a associao da Na+/K+ATPase com a E-caderina .................................................... 21

Figura 10 - Histopatologia e principais mutaes durante o desenvolvimento do cncer colo-retal .................................. 25 Figura 11 - Esquema mostrando a via de sinalizao Wnt/-catenina ... 26 Figura 12 - Esquema mostrando alteraes celulares ocorridas durante a transio epitlio-mesenquimal (TEM) ................. 28 Figura 13 - Alteraes estruturais nas junes aderentes de clulas Caco-2 causadas por TPA e EGF so prevenidas pelo inibidor de Src, PP1 .............................................................. 40 Figura 14 - Src participa da redistribuio da E-caderina induzida por TPA e EGF ........................................................................... 42 Figura 15 - Anlise da distribuio subcelular da E-caderina ................. 43 Figura 16 - O Nvel protico da E-caderina no modificado pelos tratamentos com TPA e EGF ............................................... 44

xii Figura 17 - Tratamento com TPA aumenta a atividade de Src ............... 45 Figura 18 - O tratamento com TPA aumenta a atividade da protena ERK1/2 ................................................................................. 46 Figura 19 - Envolvimento da Src no aumento da motilidade celular induzida por TPA e EGF ....................................................... 48 Figura 20 - Ensaio de proliferao celular .............................................. 50 Figura 21 - Ouabana causa desorganizao do complexo juncional apical de clulas Caco-2 ...................................................... 52 Figura 22 - Tratamento com ouabana induz a redistribuio da Ecaderina ................................................................................ 54 Figura 23 - Anlise da distribuio subcelular da E-caderina aps tratamento com ouabana ..................................................... 55 Figura 24 - Ouabana reduz os nveis proticos da subunidade 1 da Na+/K+-ATPase ..................................................................... 57 Figura 25 - Tratamento com ouabana reduz a expresso da Na+/K+ATPase presente na superfcie celular ................................. 58 Figura 26 - Ouabana induz a ativao de ERK1/2 ................................ 59 Figura 27 - Tratamento com ouabana altera distribuio da - mas no da -catenina ................................................................ 61 Figura 28 - Modelo proposto para a regulao da desorganizao da adeso clula-clula mediada pela E-caderina e aumento yyyyyy da motilidade celular em clulas Caco-2 .............................. 70

xiii

LISTA DE TABELAS

Pgina Tabela 1 - Estimativas, para o binio 2008/2009, de nmero de casos novos por cncer, em homens e mulheres, segundo localizao primria ................................................................ 23

xiv

Siglas e Abreviaes-SMA - Alfa actina de msculo esqueltico 5AzaC - 5-aza-2-deoxicitidina AA - cido araquidnico ANOVA - Anlise de varincia AP-1 - Protena ativadora-1 aPKC - Protena quinase C atpica APC - Adenomatous poliposis coli BAD - Promotor de morte associado Bcl-2 BSA - Albumina bovina CAR - Receptor de coxsackievirus e adenovrus CBD - Domnio de ligao catenina CCR - Cncer colo-retal CDK - Quinase dependente de ciclina CIN - instabilidade cromossmica CK - Citoqueratina CKI- - Casena quinase I - Cox - Cicloxigenase CsK - Quinase reguladora do c-terminal da Src cPKC - Protena quinase C clssica DAG - Diacilglicerol DR4/5 - Receptor de morte 4/5 Dsh (Dvl) - Dishevelled Dsp - Desmoplaquina EC - Domnio extracelular da E-caderina EDTA - cido etilenodiamino tetra-actico EGTA - cido tetractico etileno-glicol EPLIN - Protena epitelial perdida em neoplasias ER- - Receptor de estrognio ERK - Quinase regulada por sinal extracelular ESAM - Molcula de adeso seletiva clula endotelial

xv FADD - Domnio protico de morte associado Fas FAK - Quinase de adeso focal FAP - Polipose adenomatosa familiar FasL - Ligante de Fas Fz - Frizzled GSK - Glicognio sintase quinase HIF - Fatores induzidos por hipxia HNPCC - Cncer colo-retal hereditrio no poliposo IkB - Protena inibitria Kappa b IkBK - Quinase da protena IkB JAM - Molcula de adeso juncional JMD - Domnio prximo membrana da E-caderina JNK - c-Jun N-terminal quinase LEF - Fator de aumento linfocitrio LRP - Protena relacionada receptor de lipoprotena MAGUK - Guanilato quinase associada membrana MAPK - Protena quinase ativada por mitgenos MDR - Resistncia a multidrogas MEK - Protena quinase quinase ativada por mitgenos MIN - Instabilidade de microssatlite MLH - Homloga MutL humana MMP -Metaloproteinase de matriz MMR - Reparo de mal-pareamento MSH - Homloga MutS MTOR - Alvo da rapamicina de mamfero Muc - Mucina NFkB - Fator nuclear Kappa b nPKC - Protena quinase C nova PAR - Protena de partio defeituosa PALS - Protena associada com Lin Seven PATJ - Protena de juno tight associada PALS PGE - Prostaglandina E PI - Fosfatidil-inositol PI3K - Fosfatidil-inositol-3-quinase

xvi PKA - Protena quinase A PLA - Fosfolipase A PLD - Fosfolipase D PP1 - {4-amino-1-tert-butil-3-(1-naftilmetil) pirazolo [3,4-d] pirimidina} PTEN - Fosfatase homloga tensina PTP-PEST - Fosfatase com uma sequncia rica em prolina, glutamato, serina e treonina Rb - Protena de retinoblastoma RSK - Protena ribossomal S6 quinase RTK - Receptor tirosina quinase SDS - Sdio dodecil sulfato SDS-PAGE - Gel de poliacrilamida contendo sdio dodecil sulfato sE-cad - E-caderina solvel SFK - Famlia de tirosina quinases Src SH - Domnio de homologia Src SHP-2 - Fosfatase com domnio SH2 STAT - Transdutor de sinal e ativador de transcrio TCF - Fator de clula T TGF - Fator de crescimento transformante TNF - Fator de necrose tumoral TPA - 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato TRAIL - Ligante induzido por apoptose relacionado com TNF VEGF - Fator de crescimento endotelial vascular

SumrioPgina RESUMO ............................................................................................... ix ABSTRACT ............................................................................................ x LISTA DE FIGURAS .............................................................................. xi LISTA DE TABELAS .............................................................................. xiii SIGLAS E ABREVIAES .................................................................... xiv 1 INTRODUO ................................................................................... 1 1.1 Epitlio entrico ............................................................................... 1 1.2 O Complexo juncional apical ........................................................... 2 1.2.1 Junces ocludentes (ou tight) ..................................................... 5 1.2.2 Junes aderentes ....................................................................... 9 1.2.2.1 E-caderina e cncer ................................................................... 12 1.3 Sinalizao celular e tumorignese epitelial .................................... 14 1.3.1 Protenas quinases ....................................................................... 15 1.3.1.1 Famlia MAPK ............................................................................ 17 1.3.1.2 Famlia Src ................................................................................. 17 1.3.2 Transportadores inicos (Na+/K+-ATPase) ................................... 19 1.3.3 steres de forbol, fatores de crescimento e glicosdios cardacos: ferramentas para estudo de vias de sinalizao .................. 21 1.4 Cncer colo-retal: incidncia e desenvolvimento ............................ 22 1.5 Transio epitlio-mesenquimal e cncer epitelial .......................... 27 1.6 Justificativa do estudo ..................................................................... 29 2 OBJETIVOS ........................................................................................ 31 Parte I 2.1 Geral ................................................................................................ 31 2.1.1 Objetivos especficos .................................................................... 31 Parte II 2.2 Geral ................................................................................................ 32 2.2.1 Objetivos especficos .................................................................... 32 3 MATERIAL E MTODOS ................................................................... 33 3.1 Anticorpos e Reagentes .................................................................. 33

3.2 Cultura de clulas ............................................................................ 33 3.3 Tratamentos com TPA e EGF ......................................................... 34 3.4 Tratamento com ouabana ............................................................... 34 3.5 Obteno de lisados totais e fraes solveis e insolveis em Triton X-100 ........................................................................................... 35 3.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo sdio dodecil sulfato (SDS-PAGE), imunoblotting e anlise densitomtrica ............... 35 3.7 Imunofluorescncia .......................................................................... 36 3.8 Microscopia eletrnica de transmisso ............................................ 37 3.9 Ensaio de migrao celular (Wound healing assay) ..................... 37 3.10 Ensaio de proliferao celular ....................................................... 37 3.11 Ensaio de ligao da 3H-ouabana s clulas Caco-2 ................... 38 3.12 Anlise estattica ............................................................................ 38 4 RESULTADOS ................................................................................... 39 Parte I 4.1 Vias de sinalizao envolvidas com a desorganizao da juno aderente e aumento do potencial migratrio causado por TPA e EGF . 39 4.1.1 Src est envolvida na desorganizao da juno aderente causada por TPA e EGF ........................................................................ 39 4.1.2 Src participa da redistribuio da E-caderina causada por TPA e EGF ....................................................................................................... 41 4.1.3 Src ativada em resposta tardia ao tratamento com TPA ........... 45 4.1.4 ERK1/2 ativada em etapas iniciais do tratamento com TPA e EGF ....................................................................................................... 46 4.1.5 TPA e EGF induzem aumento da motilidade celular e este evento modulado pela Src .................................................................. 47 Parte II 4.2 Envolvimento da Na+/K+-ATPase na perda da adeso clulaclula mediada pela E-caderina ............................................................ 51 4.2.1 Tratamento com Ouabana causa alteraes morfolgicas no complexo juncional apical de clulas Caco-2 ........................................ 51 4.2.2 Tratamento com Ouabana causa redistribuio da E-caderina .. 52 4.2.3 O tratamento com Ouabana reduz os nveis proticos da subunidade 1 da Na+/K+-ATPase ........................................................ 56

4.2.4 ERK1/2 parece modular os efeitos da ouabana sobre a desorganizao da adeso intercelular mediada pela E-caderina ........ 58 4.2.5 Ouabana induz uma aparente redistribuio da - mas no da -catenina .............................................................................................. 60 5 DISCUSSO ....................................................................................... 62 5.1 Vias de sinalizao envolvidas com a desorganizao das junes aderentes e aumento do potencial migratrio causado por TPA e EGF 62 5.2 Envolvimento da Na+/K+-ATPase na perda da adeso clulaclula mediada pela E-caderina ............................................................ 66 5.3 Consideraes finais ....................................................................... 69 6 CONCLUSES ................................................................................... 71 6.1 Parte I .............................................................................................. 71 6.2 Parte II ............................................................................................. 71 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................... 72

1

1 INTRODUO

1.1 Epitlio entrico O tecido epitelial constitudo, geralmente, por clulas justapostas com pouca substncia extracelular. Estas podem apresentar formas variadas (cilndrica, cbica ou pavimentosa) e, de acordo com tipo de agregao, formar camadas celulares simples, estratificadas ou pseudoestratificadas. O tecido epitelial desempenha uma importante funo no revestimento da superfcie externa e cavidades corporais (Casasco et al, 2007). A camada epitelial externa que reveste o intestino e separa o interior do meio externo recebe o nome de mucosa. Nos humanos, o intestino dividido em duas pores: uma poro anterior (intestino delgado) e uma poro posterior (intestino grosso). O intestino grosso subdividido em ceco, clon, sigmide, reto e nus. O clon apresenta uma superfcie plana com numerosas criptas, tendo como principais funes a reabsoro de eletrlitos e gua presentes em seu lmem. A mucosa colnica necessita de uma renovao constante devido ao contnuo estresse fsico que submetida. A substituio dessas clulas feita atravs da diferenciao de clulas-tronco presentes na base das criptas: elas proliferam medida que migram para a parte superior da cripta e se diferenciam totalmente quando atingem a superfcie do epitlio (Fig. 1). Essa capacidade regenerativa fundamental para manuteno da homeostase intestinal, prevenindo o desgaste provocado pelo fluxo do lmen entrico (Sancho et al, 2004; Peifer, 2002). Este processo finamente controlado e qualquer desregulao pode levar a formao de plipos intestinais, podendo progredir para o desenvolvimento do cncer intestinal. Neste contexto, o complexo juncional apical, estrutura responsvel pela manuteno da adeso clula-clula em epitlios, desempenha um papel importante.

2

Figura 1: Representao esquemtica da estrutura do intestino grosso. Clulas-tronco, presentes na parte inferior da cripta, ocasionalmente geram clulas progenitoras que proliferam e migram para a regio superior da cripta. Assim que estas pram de proliferar, se diferenciam, renovando a mucosa entrica (Adaptada de Sancho et al, 2004).

1.2 O complexo juncional apical O epitlio apresenta uma forte adeso intercelular, sendo essa caracterstica tissular mantida pelo complexo juncional. O complexo juncional constitudo por estruturas de membrana especializadas que regulam a adeso clula-clula, sendo

3

essencial para morfologia e funo epitelial. Essas estruturas proticas adesivas (Fig. 2) so conhecidas como junes ocludentes (ou tight), junes aderentes e desmossomos (Rodriguez-Boulan et al, 2005). Elas se conectam ao citoesqueleto (junes aderentes e tight se conectam a microfilamentos, e desmossomos a filamentos intermedirios), estabilizando a adeso clula-clula (Braga, 2002).

Figura 2: Modelo esquemtico do complexo juncional. O esquema mostra a localizao das junes tight e aderentes e desmossomos, assim como os diferentes componentes moleculares destas estruturas (modificado de Thiery & Sleeman, 2006).

4

Conceitos atuais na literatura utilizam o termo complexo juncional apical para denominar a estrutura composta pelas junes tight e aderentes, e definir este complexo como responsvel pela manuteno da adeso clula-clula em epitlios (Hartsock & Nelson, 2008). Este complexo atua na determinao da polaridade celular, delimitando dois tipos de domnio de membrana, o apical e o basolateral, que apresentam composies lipdicas e proticas distintas. A distribuio assimtrica das protenas de membrana no intestino permite regular dois tipos de transportes, que so responsveis pela passagem do contedo luminal atravs da barreira do epitlio: o transporte transcelular e o transporte paracelular (Fig. 3). O transporte transcelular ocorre por dentro da clula, onde atravessa a superfcie celular, passa pelo citoplasma e alcana a parte basal da clula. Este tipo de transporte desempenha um papel importante na absoro de nutrientes, como monossacardeos, devido a presena de transportadores proticos no domnio apical da membrana plasmtica. A via paracelular ocorre entre clulas adjacentes, sendo regulada pelas junes tight. Este tipo de juno pode ter sua estrutura momentaneamente alterada para aumentar o fluxo paracelular de gua e solutos, uma funo importante para a absoro de nutrientes presentes no lmen entrico (Miyoshi & Takai, 2008). Dados recentes na literatura vm mostrando que os componentes do complexo juncional apical podem ainda atuar como reguladores de vias de sinalizao. Estas vias podem modular vrios eventos fisiolgicos, como o remodelamento do citoesqueleto de actina, aumentando o potencial migratrio das clulas, ou promover a ativao da proliferao celular (Nelson, 2008; Laprise et al, 2004).

5

Figura 3: Vias de transporte paracelular e transcelular. Estas vias controlam a passagem de fludos e solutos do lmen para o interstcio. A figura mostra que o fluxo paracelular menor no intestino quando comparado com o mesmo fluxo do tbulo proximal do epitlio renal, especializado na absoro de fludos e eletrlitos. JT, juno tight (modificada de Miyoshi & Takai, 2005).

1.2.1 Junes ocludentes (ou tight) A juno ocludente ou tight est presente na regio superior do complexo juncional apical, no epitlio de vertebrados. Desempenha um papel muito importante na modulao do fluxo paracelular, atuando como uma barreira semipermevel que regula a passagem de ons, solutos e gua. Possui tambm uma funo conhecida como cerca que atua na determinao da polaridade celular, discriminando um domnio apical e um domnio basolateral, os quais apresentam composio lipdica e protica distintas, refletindo diferenas de funcionalidade entre essas regies. Em nvel molecular, as protenas que constituem a juno tight participam de diversas vias de sinalizao, que atuam na regulao dos mais variados processos celulares, como proliferao e diferenciao (Fig. 4A). Estudos recentes tm relatado dois tipos de juno tight: a) a juno tight bicelular (bJT), que se apresenta como pontos de anastomose entre membranas plasmticas de duas clulas adjacentes, quando observada por microscopia eletrnica; e b) a juno tight tricelular (tJT), que se apresenta como pontos de contato entre trs clulas, sendo

6

formada por trs pares de elementos de selagem centrais (Fig. 4B). Estes dois tipos de junes tight (JT) desempenham um importante papel na selagem do espao intercelular (Cereijido et al, 2008; Chiba et al, 2008; Ikenouchi et al, 2005). As JTs so constitudas por protenas integrais de membrana, como a molcula de adeso juncional (JAM), ocludina, claudina e tricelulina, e por protenas scaffold responsveis pela associao da JT ao citoesqueleto, como as protenas zonula occludens (ZO), ZO-1, -2 e -3, e ainda por complexos proticos citoplasmticos que atuam na construo e manuteno da polaridade celular, como PAR6/PAR3/aPKC e CRB/PALS/PATJ (Fig. 4C). As JAMs so glicoprotenas que pertencem a superfamlia das imunoglobulinas. Elas possuem dois domnios extracelulares caractersticos de imunoglobulinas, uma regio transmembrana e um domnio C-terminal citoplasmtico. So protenas transmembrana de uma passagem e so subdivididas em JAM-A, -B, -C, CAR, ESAM e JAM4. Essas protenas participam da adeso celular, interagindo com seus domnios extracelulares de maneira homoflica ou heteroflica, atuando na adeso clula-clula e clula-matriz, atravs da ligao com as subunidades 1 e 2 da integrina. As JAMs tambm participam da formao da polaridade pico-basolateral, alm de estarem envolvidas na funo de barreira da juno tight (Chiba et al, 2008; Rehder et al, 2006). A ocludina uma protena que apresenta quatro passagens pela membrana, dois loops extracelulares e os domnios C- e N-terminal intracelulares. Foram as primeiras protenas integrais de membrana a serem identificadas nas JTs (Feldman et al, 2005). Estudos tm revelado a atuao da ocludina em diferentes eventos celulares relacionados a carcinognese. Por exemplo, Barrios-Rodiles e colaboradores (2005) relataram que a ocludina interage com o Receptor I de TGF- (TR-I), regulando a desorganizao das junes tight induzida por TGF-, durante a transio epitlio-mesenquimal (TEM). Experimentos usando hepatcitos de camundongos deficientes para ocludina mostraram que essa protena inibe a apoptose atravs da ativao das vias MAPK e Akt (Murata et al, 2005), demonstrando seu papel na sinalizao celular, alm da sua atuao como molcula de adeso.

7

B

C

Figura 4: Estrutura e composio molecular das junes tight. O esquema mostra as diferentes funes desempenhadas pela juno tight (A), a estrutura da juno tight tricelular (B), e a arquitetura molecular da juno tight bicelular (C). Adaptado de Chiba et al, 2008 e Ikenouchi et al, 2005.

8

As claudinas compreendem uma famlia de protenas com cerca de 24 membros em humanos. Possuem quatro passagens pela membrana, dois loops extracelulares e os domnios C- e N-terminal intracelulares, no entanto sem nenhuma similaridade com a ocludina. Alteraes nos nveis de expresso das claudinas podem causar perturbaes na funcionalidade de barreira paracelular e promover tambm o potencial tumorignico. Estudos feitos por nosso Grupo (Oliveira et al, 2005), demonstraram que as claudina-1, -3 e -4 esto superexpressas em cncer de clon. Tem sido relatado ainda, que em clulas de cncer de ovrio as claudina-3 e -4 so fosforiladas pelas protenas quinases A (PKA) e C (PKC), respectivamente, levando a um deslocamento destas protenas da membrana para o citosol, promovendo um aumento da permeabilidade paracelular (DSouza et al, 2005). Uma reviso detalhada sobre a expresso diferencial em diferentes tipos de cncer epitelial e a importncia dessas protenas como potenciais alvos teraputicos no cncer colo-retal foi recentemente discutida por Oliveira & Morgado-Daz (2007). As tricelulinas so protenas que possuem quatro passagens pela membrana. Elas se orientam de maneira vertical nas fitas de juno tight presentes nos contatos tricelulares. Possuem cerca de 32% de similaridade com o domnio Cterminal da ocludina. Ikenouchi e colaboradores (2005) tm relatado a atuao do repressor transcricional Snail na reduo da expresso da tricelulina em clulas Eph4. Ainda recentemente, foi mostrado que em clulas MDCKII, a perda da expresso da ocludina resultava na localizao da tricelulina na bJT (Ikenouchi et al, 2008). As protenas ZOs (ZO-1, -2 e -3) fazem parte da famlia de protenas guanilato quinase associadas membrana (MAGUK), possuem domnios PDZ que permitem a interao com as protenas integrais de membrana da juno tight, como JAM, ocludina e claudina, e atuam na ligao destas protenas ao citoesqueleto (Gonzlez-Mariscal et al, 2008). Dados experimentais publicados por Saito e colaboradores (2008), usando clulas MEF, tm sugerido que ZO-1/-2 atuam como protenas scaffold da quinase reguladora do c-terminal da Src (Csk), recrutando-a para ser inativada, um evento regulado por uma via sinalizao mediada pela protena Src. A ZO-2 pode participar tambm da regulao do ciclo celular, atuando na represso transcricional da ciclina D1, como visto em cultura de clulas MDCK (Huerta et al, 2007).

9

Os

complexos

proticos

citoplasmticos

PAR6/PAR3/aPKC

e

CRB/PALS/PATJ so responsveis pela formao da juno tight e a polarizao epitelial. Durante a formao da adeso clula-clula, a interao entre as protenas E-caderinas de clulas adjacentes leva a associao das protenas citoplasmticas PAR6 e aPKC, que posteriormente interagem com PAR3. Quando o complexo PAR6/PAR3/aPKC est formado, a protena CRB3 pode interagir com aPKC ou PAR6, promovendo a diferenciao de um complexo juncional prematuro para um maduro. A CRB3 se associa com a protena PATJ atravs da PALS1, formando o complexo CRB3/PALS1/PATJ. PATJ interage com protenas da famlia ZO, atuando dessa forma na estabilizao da juno tight (Assmat et al, 2008). Trabalhos tm relatado a importncia da sinalizao da aPKC, e consequentemente da formao do complexo PAR6/PAR3/aPKC, na organizao da juno tight (Gopalakrishnan et al, 2007; Standaert et al, 1999) e a participao do complexo CRB3/PALS1/PATJ na biognese da polaridade epitelial (Michel et al, 2005; Shin et al, 2005).

1.2.2 Junes aderentes A juno aderente (JA) est presente no complexo juncional apical logo abaixo da juno tight. Desempenha um papel crucial na formao da adeso clula-clula, alm de atuar em diversas vias de sinalizao intracelular, podendo regular variados eventos, como o estabelecimento da polaridade pico-basolateral, migrao e proliferao celular. Em nvel molecular, as JAs podem ser subdivididas em dois tipos de complexos de adeso: o complexo nectina/afadina e o complexo Ecaderina/catenina (Niessen & Gottardi, 2008). Ambos complexos se associam ao citoesqueleto de actina, estabilizando a juno aderente (Fig. 5). As nectinas fazem parte da famlia de imunoglobulinas de molculas de adeso. Estas protenas compreendem principalmente quatro membros: nectina-1, 2, -3 e -4. Apresentam um domnio extracelular contendo trs regies caractersticas de imunoglobulinas e um domnio C-terminal citoplasmtico que geralmente possui um motivo de ligao PDZ. As nectinas podem se associar lateralmente, formando homodmeros. A formao de estruturas adesivas entre clulas adjacentes pode ser feita atravs da interao entre nectinas (interao homotpica) ou entre nectinas e receptores similares a nectinas (interao heterotpica). Na poro citoplasmtica,

10

interage com a protena afadina (tambm chamada de AF-6), responsvel pela ligao deste complexo de adeso ao citoesqueleto de actina (Niessen, 2007). As nectinas parecem atuar de maneira crucial no recrutamento de protenas para formao das junes tight e aderentes, como relatado por Okamoto e colaboradores (2005). Estudos tm mostrado que a reduo da expresso de nectina-1 est associada ao aumento do potencial maligno em queratincitos (Matsushima et al, 2003) e que a superexpresso dela est associada a formao da juno aderente em clulas de cncer gstrico (Peng et al, 2002).

Figura 5: Modelo mostrando os constituintes moleculares da juno aderente. O esquema mostra tambm a associao do complexo E-caderina/catenina e nectina/afadina aos filamentos de actina citoplasmticos. (Modificado de Niessen, 2007).

11

As caderinas pertencem a uma superfamlia de molculas de adeso dependentes de clcio, sendo dividida em seis subfamlias: caderinas clssicas do tipo I e do tipo II, caderinas desmossomais, caderinas transmembrana de sete passagens, grandes caderinas e protocaderinas (Stemmler, 2008). A E-caderina, integrante da subfamlia de caderinas clssicas do tipo I, a principal protena transmembrana presente na juno aderente de clulas epiteliais. A E-caderina possui cinco domnios extracelulares repetitivos (conhecidos como EC, do ingls Extracellular Cadherin), um domnio prximo membrana (conhecido como JMD, do ingls juxtamembrane domain) e um domnio de ligao catenina (conhecido como CBD, do ingls catenin binding domains), representados na figura 6 (Hartsock & Nelson, 2008).

Figura 6: Esquema da estrutura da E-caderina. Esse esquema mostra os domnios extracelulares repetitivos (EC), o domnio prximo membrana (JMD) e o domnio de ligao catenina (CBD). TM representa a regio de passagem pela membrana. Os asteriscos representam as regies que j foram demonstradas por interagir com as respectivas protenas descritas no lado esquerdo. Adaptado de Hartsock & Nelson, 2008.

Assim como as nectinas, as E-caderinas tambm se associam lateralmente, formando homodmeros. Os domnios EC so responsveis pela interao de E-caderinas de clulas adjacentes, a qual dependente de clcio, atuando na manuteno da funo de adeso intercelular. Os domnios intracelulares, JMD e CBD, permitem a interao da E-caderina com as protenas da famlia catenina. As cateninas compreendem uma famlia de protenas composta por trs membros principais: -, - e p120-catenina. A p120-catenina se associa ao domnio JMD da E-caderina, sendo responsvel pela regulao local dos filamentos de actina e estabilidade do complexo caderina-catenina (Pokutta & Weis, 2007). A -

12

catenina se liga ao domnio CBD de E-caderina, alm de interagir com a -catenina. Embora tenha sido demonstrado que -catenina no interage simultaneamente com filamentos de actina e -catenina (Nelson, 2008), tem sido proposto que monmeros de -catenina, ligados a -catenina, podem interagir com diversas protenas (como vinculina, -actinina, ZO-1 e EPLIN), que estariam atuando no ancoramento do complexo caderina-catenina ao citoesqueleto de actina (Abe & Takeichi, 2008; Stemmler, 2008). A desorganizao do complexo E-caderina/catenina tem sido associada a eventos que desencadeiam o processo tumorignico. Dessa forma, sua correta regulao atua de maneira crucial para modular processos fisiolgicos variados, tais como apoptose, proliferao e motilidade celular.

1.2.2.1 E-caderina e cncer A adeso clula-clula desempenha um importante papel na manuteno da homeostase do tecido epitelial. A ocorrncia de desorganizao do complexo juncional apical influencia no desenvolvimento da carcinognese epitelial. Durante o processo de formao de carcinomas, a ocorrncia de desestabilizao da juno aderente observada, tendo como principal indcio a expresso diminuda da E-caderina (Gloushankova, 2008) ou sua translocao da membrana plasmtica para o citoplasma. A diminuio da expresso da E-caderina pode amplificar tambm a resposta da via cannica Wnt, a qual est envolvida com a estabilizao do pool citoplasmtico de -catenina. Desta forma, a -catenina pode se translocar para o ncleo, podendo assim ativar fatores transcricionais da famlia Tcf, induzindo diversos eventos relacionados ao processo tumorignico, tais como aumento da proliferao celular, escape da apoptose e aumento do potencial invasivo (Jeanes et al, 2008; Fuchs et al, 2005). A desorganizao da adeso clula-clula pode ser mediada por diversos fatores. Por exemplo, um estudo tem mostrado que a desestabilizao da juno aderente pode ser regulada por uma via de sinalizao envolvendo endocitose da E-caderina. Este mecanismo regulado pela protena clatrina e pode

13

ser prevenido pela p120-catenina (Yap et al, 2007), mantendo a sua localizao na membrana, onde ela pode desempenhar sua funo na juno aderente. Na progresso de alguns carcinomas tambm pode ser observada a clivagem do domnio extracelular da E-caderina, resultando na E-caderina solvel (sE-cad) e na liberao do domnio intracelular para o citoplasma. Algumas metaloproteases, tais como MMP-3, -7 e 9, tm sido descritas atuando nesse processo de clivagem. Subsequentemente, a sE-cad pode atuar de maneira parcrina, se associando ao domnio extracelular da E-caderina de clulas adjacentes e levando uma desorganizao da juno aderente. J o domnio intracelular, pode ser translocado para o ncleo e ativar genes relacionados com o processo tumorignico, como ciclina D1, AP-1 e STAT1/STAT2 (Salahshor et al, 2007; Symowicz et al, 2007; Ii et al, 2006). No cncer colo-retal, a reduo da expresso da E-caderina indica um mal prognstico, sendo correlacionada com o aumento da invasividade tumoral, desenvolvimento de stios metastticos e uma menor taxa de sobrevida (Kwak et al, 2007). Em um estudo usando o modelo clssico de depleo do clcio extracelular, foi mostrado uma interrelao de vias de sinalizao celular, envolvendo PKA e GTPases da famlia Rho, para regular de forma concomitantemente a organizao do citoesqueleto de actina e das junes intercelulares, onde a E-caderina cumpre papel importante. Alm disso, neste estudo postulou-se que aps a depleo do clcio extracelular, acontece a formao de lamelipdios, um evento crucial para a malignizao celular (Leve et al, 2008). Eventos epigenticos tambm esto envolvidos na diminuio da expresso da E-caderina durante a progresso tumoral. A hipermetilao de uma ilha CpG, prxima a regio promotora do gene E-caderina, tem sido associada a reduo de sua expresso em carcinomas de mama, prstata e colo-retal. Agentes desmetilantes vm sendo usados para confirmar a associao desse evento com o processo de aumento do potencial maligno. Por exemplo, a utilizao do 5-aza-2deoxicitidina (5AzaC) provocou um aumento da agregao celular, diminuio da motilidade e supresso de metstase em clulas de cncer de mama (Van Roy & Berx, 2008). Recentemente, tambm foi relatado por Liu e colaboradores (2008) que a deacetilao da lisina 9 da histona H3 levava a diminuio da expresso da Ecaderina em cncer colo-retal.

14

Para modular a estrutura e funo das protenas das junes aderentes necessrio um mecanismo de regulao finamente controlado, que responda aos mais variados estmulos celulares. Essa regulao desempenhada por protenas que formam uma intrincada rede de comunicao, atravs de eventos moleculares, conhecida como via de sinalizao.

1.3 Sinalizao celular e tumorignese epitelial Nos organismos multicelulares, a comunicao intercelular e entre as clulas e o meio externo atua de maneira crucial no controle da fisiologia celular. Atravs desses mecanismos, uma clula pode induzir o crescimento, morte, proliferao e vrios eventos intracelulares. A molcula sinal atua como principal componente desse processo, possibilitando a modulao das mais variadas protenas intracelulares e consequentemente modulando as funes que estas desempenham. As molculas sinal (tambm conhecidas como sensores) ativam protenas presentes nas vias de sinalizao intracelular (tambm conhecidas como aceptores), as quais atuam na transduo de sinal at as protenas alvo (efetores), responsveis pelo controle do comportamento celular (Liberali et al, 2008). Dentre as molculas sinal podemos encontrar citocinas, quimiocinas, ons, fatores de crescimento e hormnios. As protenas de sinalizao intracelular possuem um importante papel, pois atuam na mediao da transduo de sinal externo at as protenas ou genes alvo, atuando numa intrincada rede de sinalizao celular, que leva ao desencadeamento de um fentipo especfico, como mostrado na figura 7. Diversas vias de sinalizao esto relacionadas com o processo tumorignico. Dentre essas, podemos destacar aquelas relacionadas com as protenas quinases e com os transportadores inicos.

15

Figura 7: Rede de sinalizao celular. O esquema um exemplo de vias de sinalizao mostrando as principais vias de transduo de sinal envolvidas na proliferao celular, apoptose e angiognese. Alteraes em componentes dessas vias podem desencadear o processo tumorignico. Modificado de Hornberg et al, 2006.

1.3.1 Protenas quinases As protenas quinases so enzimas que atuam na modificao pstraducional de protenas, catalisando a transferncia de um radical fosfato do nucleotdeo adenosina trifosfato (ATP) para resduos de aminocidos especficos, processo conhecido como fosforilao. As principais protenas quinases so aquelas que fosforilam resduos serina/treonina ou tirosina. Variados tipos de protenas pertencentes a estes dois grupos de quinases participam da modulao da adeso clula-clula. A famlia da protena quinase C (PKC) compreende serina/treonina quinases que podem ser subdivididas em 3 grupos: as PKCs clssicas (cPKC), as PKCs novas (nPKC) e as PKCs atpicas (aPKC). Dentre elas, a ativao de aPKCs pela protena Cdc42 tem sido descrita como crucial para formao das junes tight e da polaridade epitelial. Foi relatado que a interao de nectinas com E-caderina nos contatos clula-clula imaturos ativa a protena Cdc42, que por sua vez interage com o complexo PAR6-aPKC, induzindo ativao de aPKCs. Uma vez ativada,

16

aPKC participa do estabelecimento da adeso clula-clula (Cereijido et al, 2008). Em cncer gstrico, o fator de crescimento epidermal (EGF) tem sido associado com a ativao de protenas da famlia PKC, levando organizao da junes tight devido a translocao das protenas ZO-1 e ocludina do citoplasma para os contatos clula-clula (Yoshida et al, 2005). Por outro lado, protenas da famlia PKC tambm podem estar envolvidas no processo de tumorignese. Em cncer colo-retal, tem sido descrita a participao de protenas da famlia PKC e EGFR na desorganizao da adeso clula-clula dependente de E-caderina (Barbosa et al, 2003). Alm disso, PKC est envolvida na via PKC/ERK/NFkB, conhecida por induzir a expresso de fosfolipase D1 (PLD1), levando ao escape da apoptose e aumento do potencial invasivo em clulas de cncer de clon (Kang et al, 2008). Recentemente, foi demonstrado por Tanaka e colaboradores (2008) que protenas da famlia PKC esto envolvidas na desorganizao do complexo juncional apical causada pela prostaglandina E2 (PGE2), atravs de um evento que requer a participao dos receptores EP1 e EP2 e a protena claudina-1, em clulas de adenocarcinoma de clon humano. A famlia de receptores ErbB constituda por protenas tirosina quinase transmembrana que atuam na transmisso de sinais extracelulares para o citoplasma. Pode ser dividida em quatro subfamlias: EGFR, ErbB2, ErbB3 e ErbB4 (Lafky et al, 2008). A ativao fisiolgica desses receptores dependente de dimerizao, homoflica ou heteroflica, entre os membros da famlia, resultando na fosforilao em resduos de tirosina. O EGFR tem sido associado ativao da via de sinalizao PI3K-Akt, relacionada com sobrevivncia celular, e da via RasERK1/2, que induz proliferao celular, ambos processos cruciais para o aumento do potencial tumorignico. Alm disso, foi relatado que a ativao da via EGFR-RasERK1/2 pode levar ao aumento da motilidade celular em clulas epiteliais da crnea, facilitando o processo de cicatrizao (Lyu et al, 2006), e pode tambm atuar no aumento do potencial invasivo. O EGFR tambm pode se associar com a protena Ecaderina presente na membrana plasmtica, prevenindo a dimerizao do receptor e a ativao das vias de sinalizao subsequentes, responsveis pelo aumento da migrao, proliferao e sobrevivncia celular (Bremm et al, 2008).

17

1.3.1.1 Famlia MAPK A famlia de protenas quinases reguladas por mitgenos (MAPK) so serina/treonina quinases que atuam na transduo de variados sinais extracelulares at o ncleo, regulando processos como apoptose, migrao e proliferao celular. As MAPKs podem ser divididas em 3 principais subgrupos: as c-Jun N-terminal quinases (JNKs), as p-38 e as quinases reguladas por sinal extracelular, chamadas de ERKs (Pimienta & Pascual, 2007). As JNKs possuem um papel ainda controverso no processo tumorignico. Em modelos de camundongos, por exemplo, foi relatado que a perda da expresso de JNK1 causa diminuio da expresso de ciclina D e do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), levando a diminuio da proliferao de hepatcitos e neovascularizao tumoral, sendo um alvo teraputico atrativo para carcinomas hepticos. Porm, trabalhos tambm relatam a participao da via JNK em processos pr-apoptticos, em resposta a tratamentos quimioterpicos. Ento, a modulao da via JNK depende do contexto celular, exibindo respostas variadas (Johnson & Nakamura, 2007). A p-38 tem sido relacionada a mecanismos de resistncia quimioterpica por induzir a expresso do gene de resistncia a multidrogas (MDR) em clulas de cncer gstrico (Guo et al, 2008). Alm disso, foi relatada a participao da via Src/Rac1/p-38 na ativao da protena Akt, induzindo o processo de radioresistncia em clulas de carcinoma cervical (Kim et al, 2008). As protenas da subfamlia ERK tm sido caracterizadas como participantes da transduo de sinais proliferativos. A clssica ativao de ERK1/2, pela via EGFR/Ras/Raf/MEK, pode induzir a expresso de genes como AP1 que, por sua vez, induz a expresso de ciclina D, causando um aumento da proliferao celular. A ativao sustentada de ERK1/2 tambm tem sido relacionada ao aumento da motilidade celular e do potencial invasivo, aumentando consequentemente o potencial metasttico, em variados tipos de carcinomas (Wu et al, 2008). 1.3.1.2 Famlia Src A famlia de tirosina quinase Src (SFK) pertence ao grupo de quinases no-receptores e rene oito membros divididos em duas subfamlias: a subfamlia Src (Src, Yes, Fyn e Fgr) e a subfamlia Lyn (Lyn, Hck, Lck e Blk). Possuem uma

18

regio N-terminal (50 - 70 resduos de aminocidos) que varia entre os membros da famlia (Fig. 8). Esta regio compreende um stio de miristoilao ou palmitoilao, seguido por um domnio de homologia a Src 3 (SH3), com aproximadamente 50 aminocidos, que se associa a um motivo consenso rico em prolina (PXXP). Essa regio est associada com o domnio de homologia a Src 2 (SH2), constitudo por aproximadamente 100 aminocidos, que pode interagir com o domnio quinase (ou SH1), responsvel pela atividade enzimtica, presente na regio C-terminal (Ingley, 2008).

Figura 8: Estrutura geral das quinases da famlia Src mostrando suas configuraes inativa e ativa. Note que na configurao de ativao basal ou inativa, o domnio SH2 interage com o resduo fosforilado Tyr 530, presente no C-terminal. O domnio quinase (SH1) e o SH3 tambm interagem, resultando numa estrutura molecular fechada. J na configurao ativa, a interao intramolecular entre os domnio SH1 e SH3 desfeita, resultando numa configurao molecular mais aberta, o resduo Tyr 530 desfosforilado e ocorre tambm a fosforilao do resduo Tyr 419, induzindo a atividade cataltica da enzima. M: Miristoilao; P: fosforilao. Adaptada de Yeatman, 2004.

As SFKs atuam na modulao de diversas vias de sinalizao, podendo regular eventos como crescimento celular, migrao, sobrevivncia e invaso. A desregulao da atividade dessas protenas pode desencadear um

19

processo carcinognico. A protena Src tem sido associada com a progresso do cncer de clon devido a sua atuao na ativao da via PI3K-Akt, a qual est relacionada com eventos de escape da apoptose e de aumento da proliferao celular (Chen, 2008). Alm disso, um estudo mostrou que o aumento de expresso da Src ou diminuio da expresso de tirosinas fosfatases, como a fosfatase com domnio SH2 (SHP-2) e a fosfatase com uma sequncia rica em prolina, glutamato, serina e treonina (PTP-PEST), pode induzir a progresso do carcinoma colo-retal atravs do aumento da migrao e invaso celular mediada pela protena vilina, uma protena responsvel pela regulao do citoesqueleto de actina (Mathew et al, 2008). A formao de um complexo protico envolvendo Src e a protena quinase de adeso focal (FAK) tambm tem sido associada com a formao de lamelipdios, aumento da protelise de componentes da matriz extracelular e aumento da expresso de VEGF, induzindo migrao, invaso e angiognese (Mitra & Schlaepfer, 2006). Diversos estudos relacionaram a atividade de Src com a desorganizao da juno aderente e desenvolvimento do cncer colo-retal. Coluccia e colaboradores (2006), por exemplo, relataram que Src pode atuar na fosforilao da protena -catenina, levando a desorganizao do complexo Ecaderina/catenina e ativao da via -catenina/Tcf4 em clulas de cncer colo-retal. Porm, recentes estudos tm mostrado que a protena Src pode desempenhar um papel dbio na juno aderente, induzindo a sntese ou degradao da E-caderina, dependendo do estmulo celular (Shindo et al, 2008). Mais estudos so necessrios para definir a funo desta quinase no desenvolvimento do cncer colo-retal.

1.3.2 Transportadores inicos (Na+/K+-ATPase) Os transportadores inicos fazem parte de uma superfamlia de protenas transportadoras com funo ATPase, sendo subdividida em quatro grupos principais, designados como tipo P, F, V e ABC. Essas protenas se localizam em membranas biolgicas, hidrolisam ATP e transportam ao menos uma substncia atravs de membranas biolgicas, via hidrlise de ATP. Os transportadores do tipo P esto envolvidos com o transporte de diversos tipos de ctions, como clcio, sdio, potssio e cobre, atravs de

20

membranas biolgicas. Um dos membros mais estudados desse grupo a Na+/K+ATPase (Pederson, 2007). As Na+/K+-ATPases so transportadores transmembrana que atuam no transporte de trs ons sdio para fora e dois ons potssio para dentro da clula, gerando um gradiente de sdio e de potssio atravs da membrana plasmtica. Consistem de heterodmeros proticos constitudos por uma subunidade (responsvel pela atividade cataltica), uma subunidade e, ocasionalmente, uma subunidade (responsveis pela modulao da atividade da Na+/K+-ATPase). Em mamferos, tm sido identificadas quatro diferentes isoformas da subunidade e trs distintas isoformas da subunidade (Lefranc & Kiss, 2008; Rajasekaran et al, 2008). A Na+/K+-ATPase desempenha um importante papel na manuteno da homeostase celular. Como transportador inico, pode atuar como regulador da comunicao neuronal, da contrao muscular e do volume celular, atravs da modulao da presso osmtica. Pode atuar tambm na transduo de sinais para vias de sinalizao intracelulares, modulando a ativao de Src, EGFR, NFB, RasERK1/2, entre outras protenas. Alm disso, a Na+/K+-ATPase pode ainda regular a formao e manuteno da adeso clula-clula (Mijatovic et al, 2007). Rajasekaran e colaboradores (2008) tm sugerido que a atuao da Na+/K+ATPase na regulao da adeso intercelular depende da interao da subunidade com a E-caderina. Ainda, recentemente, foi relatada que essa interao estabilizada por N-glicanos (Fig. 9), responsveis por manter esses transportadores nos stios de adeso clula-clula (Vagin et al, 2007). A associao da Na+/K+ATPase com a E-caderina pode atuar tambm na modulao da organizao do citoesqueleto de actina mediado pela protena RhoA, induzindo o recrutamento de protenas para formao da juno tight e o estabelecimento da polaridade celular (Mijatovic et al, 2007). Diversos trabalhos tm relatado a atuao da Na+/K+-ATPase no processo carcinognico. Foi mostrado que a inibio da subunidade 1 pode levar reduo da proliferao e migrao, em clulas de glioblastomas (Lefranc & Kiss, 2008). Em cncer de pulmo de clulas no pequenas, a diminuio da expresso da subunidade 1 tem sido associada desregulao do complexo Ecaderina/catenina, causando perda de adeso clula-clula e facilitando o processo

21

de invaso individual. Esse mecanismo parece ser regulado pelo repressor transcricional Snail, responsvel pela diminuio da expresso de E-caderina e da subunidade 1 (Mijatovic et al, 2007). Em cncer colo-retal, o papel destas ATPases ainda no conhecido.

Figura 9: Modelo esquemtico mostrando a associao da Na /K -ATPase com a E-caderina. O modelo postula que essa interao, mediada pela presena de N-glicanos e lectinas, confere estabilidade s junes aderentes. Adaptado de Vagin et al, 2007.

+

+

1.3.3 steres de forbol, fatores de crescimento e glicosdios: ferramentas para estudo de vias de sinalizao A utilizao de agentes promotores tumorais ou de inibidores proticos tem sido empregada amplamente no estudo de vias de sinalizao que atuam no processo tumorignico. Por exemplo, steres de forbol (como o 12-O-

22

tetradecanoilforbol-13-acetato, TPA) so potentes promotores tumorais, conhecidos por ativar a via de sinalizao das protenas PKCs. Os steres de forbol mimetizam a ao do diacilglicerol (DAG), ativador endgeno das PKCs clssicas e novas (Kang et al, 2008; Mackay & Twelves, 2007). Os fatores de crescimento (como o fator de crescimento epidermal, EGF, e o fator de crescimento transformante-, TGF-) atuam na ativao de receptores tirosina quinase, como EGFR, c-KIT e cMET, presentes na superfcie celular, desencadeando cascatas de sinalizao intracelular que regulam proliferao e diversos outros processos celulares (Lafky et al, 2008; Amit et al, 2007). Os glicosdios, como a ouabana e a oleandrina, so substncias inibidoras da Na+/K+-ATPase, se ligando com grande afinidade subunidade . Diversos trabalhos tm utilizado os glicosdios, a fim de destrinchar o papel da Na+/K+-ATPase nos mais variados processos celulares, usando clula MDCK (Mijatovic et al, 2007; Contreras et al, 2004).

1.4 Cncer colo-retal: incidncia e desenvolvimento O Cncer representa uma das principais causas de morte no mundo. Em 2004 foi estimado que cerca de 7,4 milhes de pessoas morreram de cncer e, continuando com a tendncia atual, estima-se que cerca de 11,8 milhes de pessoas morrero de cncer no ano de 2030 (World Health Organization, 2008). O cncer colo-retal (CCR) apresenta-se como o quarto mais incidente na populao brasileira (Tabela 1) e, desconsiderando os tumores de pele no melanoma, a sua incidncia estimada de aproximadamente 54 mil novos casos para o binio 2008/2009 (Instituto Nacional de Cncer & Ministrio da Sade, 2007).

23

Tabela 1- Estimativas, para o binio 2008/2009, de nmero de casos novos por cncer, em homens e mulheres, segundo localizao primria.

Fonte: Instituto Nacional de Cncer & Ministrio da Sade, 2007.

Os principais fatores de risco para este tipo de neoplasia so a histria familiar de cncer de clon e reto, a predisposio gentica ao desenvolvimento de doenas crnicas do intestino (como as poliposes adenomatosas), assim como uma dieta rica em gorduras animais, baixa ingesto de frutas, vegetais e cereais, e ainda o consumo excessivo de lcool e o tabagismo. Tambm so considerados fatores de risco o sedentarismo, a obesidade e a idade, visto que tanto a incidncia como a mortalidade aumenta de maneira proporcional idade (Instituto Nacional de Cncer & Ministrio da Sade, 2007; Van den Brandt & Goldbohm, 2006). O desenvolvimento do cncer colo-retal resulta da instabilidade gentica, possibilitando a proliferao descontrolada das clulas normais. O acmulo de mutaes que levam ativao de oncogenes e inativao de genes supressores de tumor pode aumentar a proliferao celular, acarretando formao de leses neoplsicas benignas ou malignas. Os principais oncogenes que apresentam anormalidades genticas encontrados em cncer de clon so o K-RAS e catenina, e dentre os genes supressores de tumor encontramos o APC, p53 e alguns pertencentes a famlia de reparo de mal-pareamento (MMR), como o MSH2, MLH1, MSH6 (Houlston & Tomlinson, 2001).

24

Estimativas apontam que aproximadamente 75% dos casos de cncer colo-retal so de origem espordica, sendo o restante de origem familiar (Kitisin & Mishra, 2006). O cncer espordico resulta da ao cumulativa de agentes carcingenos ambientais ou alimentares. Dentre as causas de origem hereditria destacamos o cncer colo-retal hereditrio no poliposo (HNPCC), que representa uma incidncia 2 % a 5 % dos casos herdveis, e a polipose adenomatosa familiar (FAP), com incidncia aproximada de 1 % dos cnceres colo-retais hereditrios (Rowley, 2005). Esta ltima resultado de uma mutao do gene APC (Adenomatous poliposis coli), responsvel por desempenhar importantes funes na adeso clula-clula, regulao do ciclo celular e apoptose (Fearnhead et al, 2001). Em CCR, dois tipos de instabilidade gentica tm sido identificados: a) quelas referentes instabilidade de microssatlite (MIN) e b) s referentes a instabilidade cromossmica (CIN). A MIN tem sido associada inativao somtica de genes MMR, responsveis pela manuteno da fidelidade de replicao do DNA, principalmente por silenciamento epigentico. A CIN caracterizada pela perda de alelos e aneuploidia. Dentre os casos espordicos de CCR, cerca de 85 % apresentam CIN e o restante dos casos se enquadram na MIN. Nos casos herdveis, a FAP se enquadra como bom exemplo de CIN, apresentando um caritipo aneuplide, desencadeando mutaes em genes supressores tumorais e oncogenes, como APC, p-53 e K-RAS (Fig. 10). A HNPCC se enquadra como modelo para MIN, podendo apresentar mutaes nos mais variados tipos de genes MMR, sendo os mais frequentes os genes MLH1 e MSH2 (Michor et al, 2005; Sancho et al, 2004).

25

Figura 10: Histopatologia e principais mutaes durante o desenvolvimento do cncer coloretal. Durante o processo carcinognico, o tecido colnico passa por diversas alteraes morfolgicas, resultantes das mutaes em oncogenes (K-RAS) e genes supressores tumorais (APC, SMAD2/4, TP53). Em particular, a perda de funo do gene APC parece dar incio cascata de eventos que eventualmente culminam na transformao maligna do epitlio colnico. Modificado de Fodde et al, 2001.

Alteraes na via Wnt so as mais frequentes em cncer colo-retal, onde so encontradas mutaes no gene APC em cerca de 80 % dos casos (Shitashige et al, 2008). A via Wnt/-catenina (tambm conhecida como via Wnt cannica) desempenha um importante papel na renovao tecidual, motilidade e sobrevivncia celular. Nesta via, protenas solveis Wnt so secretadas pelas clulas e se associam aos receptores Frizzled (Fz) e LRP5/6. Essa associao desencadeia uma cascata de sinalizao que impede que o complexo formado pelas protenas APC/Axina/CK1/GSK3 direcione a protena -catenina para degradao dependente de proteassoma (Fig. 11). Dessa forma, a -catenina pode acumular no citoplasma e se translocar para o ncleo, associando-se aos fatores transcricionais Tcf/Lef e induzindo a expresso de diversos genes relacionados com proliferao celular, escape da apoptose e invasividade celular. Quando mutaes no gene APC induzem a perda da sua funo, como acontece na FAP, a via Wnt cannica passa a desempenhar uma ativao crnica, levando a expanso de adenomas benignos, que na maioria das vezes progridem para um carcinoma de clon invasivo (Barker & Clevers, 2006; Fuchs et al, 2005).

26

Outra via frequentemente envolvida com o CCR aquela relacionada com a protena K-Ras, ativa em aproximadamente 50 % dos casos. Mutaes, que desencadeiam a ativao constitutiva de K-Ras, atuam de maneira crucial na progresso do cncer colo-retal e levam ativao da via MAPK, relacionada com aumento do potencial metasttico, proliferao e motilidade celular (Wu et al, 2008; Sancho et al, 2004).

Figura 11: Esquema mostrando a via de sinalizao Wnt/-catenina. A) Na ausncia de Wnt, o complexo APC/Axina/CK1/GSK3 formado e as protenas CK1 e GSK3 fosforilam -catenina, levando-a para degradao via proteassoma. B) Quando Wnt se liga aos receptores Frizzled (FZ) e LRP5/6 desencadeia uma cascata de sinalizao que inibe a formao do complexo APC/Axina/CK1/GSK3, permitindo a acumulao citoplasmtica da -catenina e posterior translocao para o ncleo, onde se associa a fatores transcricionais para induzir a expresso de genes alvos Wnt. Modificado de Takahashi-Yanaga & Sasaguri, 2008.

27

1.5 Transio epitlio-mesenquimal e cncer epitelial O tecido epitelial se organiza em camadas celulares, onde as clulas se encontram fortemente aderidas umas as outras, atravs do complexo juncional apical. Em condies normais, o estabelecimento dessa adeso intercelular interfere no movimento das clulas, dificultando sua motilidade. Por outro lado, clulas mesenquimais se associam entre si somente nos contatos focais e no formam uma camada celular organizada, o que permite uma maior motilidade celular. No processo morfogentico conhecido como transio epitlio-mesenquimal (TEM), as clulas perdem suas caractersticas epiteliais e passam a apresentar um fentipo similar quele das clulas mesenquimais (Berx et al, 2007). A TEM desempenha um papel crucial durante a organognese, na manuteno da integridade epitelial e no processo de progresso tumoral. Durante a TEM, as clulas epiteliais desregulam seu sistema de adeso clula-clula, perdem sua polaridade, e adquirem um fentipo mesenquimal com reduzida relao intercelular e com a capacidade migratria aumentada. A TEM contribui de maneira significativa na plasticidade da clula tumoral e no aumento do seu potencial invasivo. Em nvel molecular, durante a progresso de um carcinoma, as clulas podem ativar o programa de TEM, caracterizado pela perda ou redistribuio subcelular de marcadores epiteliais (como E-caderina e -catenina) e expresso de marcadores mesenquimais, como vimentina e N-caderina (Fig. 12). A ativao do programa de TEM nas clulas tumorais denota um aumento do seu potencial maligno, visto que a TEM est relacionada a processos de invaso tecidual, metstase e resistncia drogas (Sabbah et al, 2008).

28

Figura 12: Esquema mostrando alteraes celulares ocorridas durante a transio epitliomesenquimal (TEM). Num entercito, ocorre a perda das microvilosidades, desagregao da adeso intercelular e destacamento da matriz extracelular (MEC). Essas clulas adquirem um fentipo maligno que pode progredir para um completo programa de TEM, onde marcadores epiteliais so perdidos ou redistribudos para lugares diferentes da sua localizao (exemplo: E-caderina, catenina) e passam a expressar marcadores mesenquimais (exemplo: vimentina, fibronectina e Ncaderina). -SMA: Alfa actina de msculo esqueltico, Muc-1: Mucina-1, CK: Citoqueratina, Dsp: Desmoplaquina, ER-: Receptor de estrognio-. Adaptado de Sabbah et al, 2008.

Durante a TEM, a perda de adeso clula-clula principalmente dirigida pela E-caderina, que frequentemente se encontra menos expressa ou realocada em clulas derivadas de carcinomas. A subsequente desorganizao do complexo juncional apical atua de maneira primordial no processo de migrao e invaso de clulas individuais, aumentando o potencial metasttico (Baum et al, 2008; Wells et al, 2008). A E-caderina atua como a principal molcula reguladora da TEM, sendo modulada por diversas vias de sinalizao, como aquelas desencadeadas pelos receptores de TGF- (TR), a via Wnt e a via Src. O fator de crescimento transformante- (TGF-) um potente indutor de TEM. Ele pode se associar ao TR-I ou TR-II e desencadear uma cascata de sinalizao dependente de Smad, para ativar fatores transcricionais, como Lef-1/Tcf, conhecidos por atuar em processos como escape da apoptose e degradao da matriz extracelular. TGF- tambm pode atuar numa cascata de sinalizao independente de Smad, mimetizando um sinal desencadeado por um receptor tirosina quinase e ativar vias de sinalizao, como a Ras/MAPK, PI3K, Rho e Rac. A

29

ativao da via Ras/MAPK por TGF- conhecida por acentuar a expresso de Snail, um repressor transcricional da E-caderina (Medici et al, 2006). Uma vez que a sinalizao Wnt pode induzir a expresso de Slug, conhecido por atuar na represso transcricional da E-caderina, a sinalizao Wnt/catenina representa uma das principais vias relacionadas com o processo da TEM (Baum et al, 2008). Por ltimo, a via Src tambm tem sido mostrada participar do processo de TEM. Recentes estudos vm mostrando que a protena Src pode atuar na fosforilao da protena -catenina, causando desorganizao do complexo Ecaderina/catenina, perda da adeso clula-clula e liberando a -catenina para o citoplasma, podendo assim atuar na via de sinalizao Wnt. Alm disso, a protena Src atua tambm na fosforilao de diversas protenas associadas ao citoesqueleto, como a vinculina, paxilina e cortactina, sugerindo sua participao na migrao e invaso celular, eventos que requerem a reorganizao do citoesqueleto de actina (Baum et al, 2008; Guarino et al, 2007).

1.6 Justificativa do estudo Dados recentes na literatura vm apontando que a TEM um evento de elevada frequncia durante a aquisio de um fentipo maligno em cncer coloretal (Natalwala et al, 2008; Vincan & Barker, 2008). Como antes mencionado, um dos reguladores chave desse processo a E-caderina, protena responsvel por atuar no estabelecimento e manuteno da adeso clula-clula. Porm, ainda no esto bem esclarecidos os mecanismos celulares e moleculares que modulam a perda da adeso clula-clula mediada pela E-caderina e sua contribuio no desenvolvimento da TEM. Visto que: a) foi demonstrado que PKC e EGFR esto envolvidas na desorganizao da adeso clula-clula mediada pela E-caderina, faltando elucidar a participao das protenas Src e ERK1/2 nesse processo, em clulas de cncer colo-retal (Barbosa et al, 2003), e b) que a desregulao na expresso da subunidade 1 da Na+/K+-ATPase tem sido associada desestruturao do complexo E-caderina/catenina, em clulas MDCK (Mijatovic et al, 2007), faz-se necessrio avaliar os mecanismos moleculares que estariam modulando estes processos. O esclarecimento da regulao do processo de perda

30

de adeso clula-clula mediada pela E-caderina, contribuir no entendimento do desenvolvimento da TEM e consequentemente da progresso do cncer colo-retal.

31

2 OBJETIVOS

Parte I 2.1 Geral Avaliar o envolvimento das protenas Src e MAPK na desorganizao das junes aderentes e aumento do potencial migratrio causado por TPA e EGF, usando como modelo uma linhagem celular de adenocarcinoma de clon humano, Caco-2. 2.1.1 Objetivos especficos 2.1.1.1 Analisar os efeitos dos tratamentos com TPA e EGF sobre a organizao das junes aderentes, dando nfase expresso e localizao subcelular da protena E-caderina; 2.1.1.2 Determinar a participao das protenas ERK1/2 e Src na perda da adeso clula-clula mediada pela E-caderina, induzida pelo tratamento com TPA e EGF; 2.1.1.3 Caracterizar o efeito da perda de adeso clula-clula mediada pela Ecaderina na capacidade migratria das clulas em estudo.

32

Parte II 2.2 Geral Caracterizar o envolvimento da Na+/K+-ATPase na perda de adeso clula-clula mediada pela E-caderina, em clulas Caco-2. 2.2.1 Objetivos especficos 2.2.1.1 Analisar o efeito do tratamento com diferentes concentraes de ouabana na organizao das junes aderentes e distribuio da protena E-caderina; 2.2.1.2 Avaliar o envolvimento das subunidades alfa e beta da Na+/K+-ATPase na organizao das junes aderentes, sob o tratamento com ouabana; 2.2.1.3 Determinar a participao da protena ERK1/2 na transduo de sinal induzida por ouabana na organizao do processo de adeso clula-clula mediada pela E-caderina.

33

3 MATERIAL E MTODOS

3.1 Anticorpos e reagentes Os seguintes anticorpos primrios foram usados: monoclonais produzido em camundongo, anti-E-caderina, clone 36 (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) e anti-1 Na+/K+-ATPase, clone M17-P5-F11, e o produzido em coelho, anti-p-Src, ambos obtidos da Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, EUA); policlonais produzidos em coelho, anti-p-ERK1/2 (Biomol Research Laboratories Inc, PA, EUA), anti-MAPK (EMD Chemicals Inc, Gibbstown, NJ, EUA) e anti-- e -catenina, ambos obtidos da Sigma Chemical Co., e o produzido em camundongo anti-v-Src (EMD Chemicals Inc). Para deteco destas protenas por quimiluminescncia, utilizou-se os anticorpos secundrios conjugados peroxidase anti-camundongo IgG e anticoelho IgG (Sigma Chemical Co.). J para deteco da E-caderina por imunofluorescncia, foi utilizado o anticorpo secundrio anti-camundongo IgG conjugado a Alexa fluor 488 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA). O ster de forbol 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) e o inibidor da subunidade 1 da Na+,K+-ATPase (ouabana) foram obtidos da Sigma Chemical Co. , o fator de crescimento epidermal (EGF) obtido da Invitrogen Co. e o inibidor da protena Src, o 4-amino-1-tert-butil-3-(1-naftilmetil) pirazolo [3,4-d] pirimidina (PP1), obtido da EMD Chemicals Inc. Solues estoque de TPA (1,6 mM), ouabana (10 mM), EGF (100 g/mL) e PP1 (1,7 mM) foram preparadas e estocadas a 20 C.

3.2 Cultura de clulas Clulas Caco-2, uma linhagem derivada de adenocarcinoma de clon humano, foram obtidas da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA; n HTB-37). As clulas foram cultivadas em meio DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium), suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB), 60 mg/L de estreptomicina, 100 mg/L de penicilina G (todos adquiridos da Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA), e mantidas a 37 C em uma atmosfera de 5 % CO2. Para expanso da cultura, clulas em confluncia foram lavadas com soluo

34

salina (PBS) e soltas da garrafa incubando-se com uma soluo de 0,25% de tripsina (Invitrogen Co.) em PBS, por 5 - 7 minutos a 37 C. Posteriormente, as clulas foram transferidas para garrafas de 25 cm2 para ensaios bioqumicos, ou placas de 6 poos para ensaios de migrao celular, ou sobre lamnulas de vidro em placas de 24 poos para imunofluorescncia, ou de 96 poos para o ensaio de proliferao, todas obtidas da TPP (Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Sua). Para microscopia eletrnica, as clulas foram crescidas sobre membranas de policarbonato Transwell, com 6,5 mm de dimetro e poros de 0,4 m (Corning Incorporated, NY, EUA). Todos os experimentos foram realizados quando as clulas atingiram confluncia. 3.3 Tratamentos com TPA e EGF Visando induzir desorganizao do sistema de adeso clula-clula mediada pela E-caderina, monocamadas de clulas Caco-2 crescidas em diferentes substratos, como acima mencionado, foram submetidas ao tratamento com 200 nM de TPA ou 100 ng/mL de EGF por 24 h. Em paralelo, para verificar o papel da protena Src na modulao deste processo, clulas foram pr-incubadas com 10 M do inibidor da protena Src, PP1, por 1 h a 37 C, antes dos respectivos tratamentos. As clulas foram cultivadas por 12 h em meio DMEM sem SFB antes dos diferentes tratamentos.

3.4 Tratamento com ouabana Com a finalidade de avaliar o papel da Na+/K+-ATPase na adeso clula-clula mediada pela E-caderina, clulas Caco-2, aps atingirem a confluncia, foram tratadas com ouabana nos seguintes tempos e concentraes: 100 nM por 15 min e 6 h, e 10 e 100 M por 5 e 15 min, ou por 6 e 8 h. Para verificar se os efeitos causados pela ouabana no foram resultantes de um desbalano inico, monocamadas de clulas foram tratadas com 250 mM de NaCl, por 1,5 h. Aps os respectivos tratamentos, as clulas foram lavadas e submetidas s diferentes anlises.

35

3.5 Obteno de lisados totais e fraes solveis e insolveis em Triton X-100 Aps os respectivos tratamentos, e com a finalidade de determinar a localizao subcelular das protenas em estudo, monocamadas de clulas foram lavadas trs vezes com PBS e homogeneizadas em tampo CSK (NaCl 50 mM, TrisHCl 10 mM, pH 6,8, MgCl2 3 mM, Triton X-100 0,5 %, sacarose 300 mM), contendo ortovanatado de sdio 1 mM, fluoreto de sdio 20 mM, e um coquetel de inibidores de proteases (1:100), obtido da Sigma Chemical Co., por 20 minutos a 4o C. Aps centrifugao por 10 min (10000 g) a 4o C, o sobrenadante correspondente frao solvel em Triton X-100 (protenas citoplasmticas) foi cuidadosamente removido e guardado. O pellet resultante foi homogeneizado em tampo SDS (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5; EDTA 5 mM e SDS 1 %), fervido a 100o C por 10 min e aps centrifugao a 10000 g por 10 min , o sobrenadante correspondente frao insolvel em Triton X100 (protenas ligadas ao citoesqueleto) foi cuidadosamente removido e estocado. Para anlise dos nveis totais e das formas ativas (fosforiladas) das protenas em estudo, monocamadas de clulas foram lavadas trs vezes com PBS e homogeneizadas em tampo de extrao (Triton X-100 1 %; deoxicolato de sdio 0,5 %; SDS 0,2 %; NaCl 150 mM; Hepes 10 mM, pH 7,3; EDTA 2 mM), contendo ortovanadato de sdio 2 mM, fluoreto de sdio 20 mM e um coquetel de inibidores de proteases (1:100), obtido da Sigma Chemical Co., por 30 min a 4 C. O homogeneizado foi centrifugado a 10000 g por 10 min e o sobrenadante coletado para anlise posterior. 3.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo sdio dodecil sulfato (SDSPAGE), imunoblotting e anlise densitomtrica Os extratos proticos totais (60 g) e as fraes solveis e insolveis em Triton X-100 (30 g) foram separados por SDS-PAGE em gis de 7,5; 10 e 12 % (Laemmli, 1970). Aps a eletroforese, as protenas foram transferidas para membranas de nitrocelulose utilizando-se o aparelho de transferncia semi-seco (Bio-Rad Laboratories Inc, Hercules, CA, EUA) a 10 V por 60 min, como descrito por Towbin e colaboradores (1979). As membranas foram incubadas em tampo de bloqueio TBS-T: Tris-HCl 20 mM, pH 7,6; NaCl 137 mM e Tween 20 0,1 %, contendo leite desnatado 5 %, durante 60 min. Logo aps, foram incubadas por 3 h

36

ou overnight com os anticorpos primrios: anti-E-caderina, diluio 1:5000; antiMAPK, diluio de 1:1000; anti-p-ERK1/2, diluio 1:5000; anti-v-Src, concentrao de 2,5 g/mL; anti-p-Src, diluio 1:250; anti--catenina, diluio 1:3000; anti-catenina, diluio 1:4000; e anti-1 Na+/K+-ATPase, diluio 1:450. Aps sucessivas lavagens com TBS-T, as membranas foram incubadas com os anticorpos secundrios correspondentes, anti-camundongo ou anti-coelho conjugados peroxidase, diluio de 1:50000, por 60 min. As membranas passaram por vrias lavagens com TBS-T e a deteco da imunomarcao foi realizada atravs de reao de quimiluminescncia utilizando um kit ECL (Amersham Biosciences GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). A quantificao dos nveis proticos foi realizada por anlise densitomtrica usando software LabWorks 4.6 (BIO RAD, Upland, CA, EUA). 3.7 Imunofluorescncia Aps os respectivos tratamentos, clulas cultivadas sobre lamnulas de vidro foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldedo 4 % durante 10 min a 37 C. Depois foram lavadas com PBS/CM (PBS contendo CaCl2 100 mM e MgCl2 100 mM, pH 8,0), incubadas com NH4Cl 10 mM (preparado em PBS) por 10 min e permeabilizadas com Triton X-100 0,5 % em PBS (pH 8,0) por 5 min temperatura ambiente e posteriormente em soluo de bloqueio (BSA 0,2% em PBS) por 60 min. Logo aps, foram incubadas por 2 h com o anticorpo primrio monoclonal anti-Ecaderina (diluio 1:500), e por mais 1 h com o anticorpo secundrio conjugado a Alexa fluor 488 (diluio 1:500). Posteriormente, as clulas foram lavadas 5 vezes com PBS e montadas em soluo contendo N-propril-galacto, e analisadas usando um microscpio invertido AXIOVERT S100 (Carl Zeiss Inc, Alemanha). As imagens foram digitalizadas utilizando uma cmera CCD (VarioCam, PCO Computer Optics, Alemanha) acoplada ao programa de processamento de imagens KS 300 (Carl Zeiss Inc).

37

3.8 Microscopia eletrnica de transmisso Monocamadas de clulas cultivadas em membranas Transwell, aps serem submetidas aos diversos tratamentos, foram fixadas em tampo de Karnovsky (glutaraldedo 2,5 %, paraformaldedo 1 %, sacarose 8 % e CaCl2 2 mM em tampo cacodilato de sdio 0,1 M, pH 7,2) por 1 hora. Logo aps, foram lavadas em tampo cacodilato 0,1 M por 3 vezes, durante 10 min cada, e ps-fixadas por 45 min em uma soluo contendo tetrxido de smio 1 %, ferrocianeto de potssio 0,8 % e 5 mM de CaCl2 em tampo cacodilato 0,1 M. As membranas foram ento lavadas em tampo cacodilato 0,1 M por 3 vezes, durante 10 min cada , desidratadas em concentraes crescentes de acetona (50%, 70%, 90%, 2 vezes em 100% e outras 2 vezes em super seca) por 10 min cada, sendo includas posteriormente em resina Epxi. Cortes ultrafinos, entre 60 70 nm, foram obtidos usando um Ultramicrtomo (Leica Microsystem, Wetzlar, Alemanha), contrastados com acetato de uranila 5 % (45 min) e citrato de chumbo (5 min) e analisados usando um microscpio eletrnico de transmisso Zeiss 900 (Carl Zeiss Inc). 3.9 Ensaio de migrao celular (Wound healing assay) Antes dos respectivos tratamentos, uma regio da monocamada celular foi raspada com uma ponteira estril de 10 L. Aps os tratamentos, a migrao das clulas a partir da regio raspada foi acompanhada, usando o microscpio invertido AXIOVERT S100. As imagens foram capturadas usando a cmara CCD VarioCam acoplada ao programa de processamento de imagens KS 300. A distncia de migrao foi feita a partir de trs experimentos independentes e foi medida utilizando o programa Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems Inc, CA, EUA). As medidas foram referentes a mdia obtida entre as distncias percorridas pelas clulas nas bordas e no meio da regio raspada. 3.10 Ensaio de proliferao celular Com a finalidade de analisar o efeito dos tratamentos na proliferao celular, 2 X 104 clulas foram semeadas em placas de 96 poos. Aps o perodo de aderncia (aproximadamente 4 horas), as clulas foram tratadas ou no com TPA e

38

EGF por 0, 24 e 48 h. Posteriormente a estes perodos de tratamento, foram lavadas com PBS e fixadas em etanol 100 % por 10 min e incubadas, subsequentemente, com soluo contendo cristal violeta (cristal violeta 0,05 % em etanol 20 %) por 10 min. Aps lavagem com gua destilada e com metanol por 5 min, a quantificao da proliferao celular foi realizada por colorimetria usando um leitor de Elisa Spectra Max 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA), a um comprimento de onda de 595 nm. 3.11 Ensaio de ligao da 3H-ouabana s clulas Caco-2 Monocamadas de clulas Caco-2 foram incubadas em meio DMEM suplementado com 10 M (6 h) ou 100 M (6 e 8 h) de ouabana no marcada. Posteriormente, as clulas foram incubadas por 1 h com novo meio DMEM, contendo 500 M de3

H-ouabana (650000 cpms), para permitir a ligao do

glicosdio. Ao final do tratamento as clulas foram raspadas e homogeneizadas, sendo centrifugadas posteriormente a 4000 g. Os valores foram obtidos a partir de trs experimentos independentes e so correspondentes diferena entre a quantidade total de3

H-ouabana utilizada no tratamento e a

3

H-ouabana

quantificada no sobrenadante celular. Controles negativos foram obtidos aps lavagens das clulas tratadas com ouabana no marcada, mostrando a especificidade da 3H-ouabana, assim como ausncia de dano celular. 3.12 Anlise estatstica Anlise estatstica de trs experimentos independentes foi realizada com o programa GrafPad Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA), utilizando 1-way ANOVA, seguido pelo teste de Bonferroni ou Dunnetti. Os dados so expressos como mdia desvio padro. Diferenas foram consideradas significativas quando p