UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA

DIVERSIFICAÇÃO EVOLUTIVA DE GOBÍDEOS NO LITORAL BRASILEIRO:

PADRÕES CITOGENÉTICOS E ECOMORFOLÓGICOS

Paulo Augusto de Lima Filho

Natal-RN

2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA

DIVERSIFICAÇÃO EVOLUTIVA DE GOBÍDEOS NO LITORAL BRASILEIRO:

PADRÕES CITOGENÉTICOS E ECOMORFOLÓGICOS

Paulo Augusto de Lima Filho

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ecologia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, como parte

dos requisitos para a obtenção do título de

mestre em Ecologia.

Orientador: Dr. Wagner Franco Molina

Natal-RN

2011

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Lima Filho, Paulo Augusto de.

Diversificação evolutiva de gobídeos no litoral brasileiro: padrões citogenéticos e

ecomorfológicos / Paulo Augusto de Lima Filho. – Natal, RN, 2011.

90 f. : Il.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências.

Programa de Pós-Graduação em Ecologia

1. Gobiidae – Dissertação 2. Evolução cariotípica – Dissertação. 3. Morfometria geométrica –

Dissertação. I. Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 597.556.33

“Aprender é uma coisa

que nuca se cansa,

nunca se tem medo e

nunca se arrepende”

(Leonardo da Vinci)

“Dedico aos meus pais, familiares,

amigos e colegas, pelo apoio,

confiança e paciência”

AGRADECIMENTOS

Não só nesta trajetória, mas durante toda minha vida, agradeço a Deus, pois

me presenteou com a vida, a força e a coragem.

Agradeço a minha família pelo apoio, compreensão, carinho e paciência

demonstrado. Maior gratidão devo aos meus pais, Paulo Augusto de Lima, Maria da

Conceição Dutra de Andrade e minha “boa drasta” Geovana da Silva Nascimento,

pela palavra sempre oportuna.

À meus tios e tias dedico gratidão adicional por ter me apoiado neste sonho,

Dailva, Hugo, Dedé, Neide e Gracinete me acolhendo e auxiliando durante toda esta

trajetória no Rio Grande do Norte.

Agradeço também aos meus irmãos, Henrique, Ricardo, Isaura e Tatiane que

me deram forte base familiar, meus sobrinhos e primos.

A minha querida Dayse, agradeço pela ajuda neste projeto, pelo carinho,

apoio e compreensão estando sempre presente ao meu lado.

Agradeço aos meus antigos amigos e aos novos, que conquistei nesta

jornada, desde o Cursinho da Poli, CEDAP, graduação e pós-graduação na

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, colegas residentes das republicas

que fiz parte, especialmente a Rogerson Rodrigues, grande amigo que me apoiou e

incentivou durante toda minha peregrinação acadêmica.

Agradeço a todas as pessoas que realmente me ajudaram no

desenvolvimento deste trabalho, os quais considero como amigos e colegas de

ofício. A meu ver, verdadeiramente praticaram ciência, democratizando o

conhecimento e trabalhando em equipe.

Sou grato aos meus amigos de trabalho no laboratório, pelo ambiente que

promoveram e pelos ensinamentos que melhoraram decisivamente minha pesquisa:

Clóvis, Pantera, Gideão, Amanda, Emanuel, Uedson, Calado, Pablo, Eurico,

Washington, Layse, Alyson e Guinga.

Agradeço ao meu orientador, professor Dr. Wagner Franco Molina, por

acompanhar e contribuir no meu desenvolvimento acadêmico, orientando-me com

liberdade e exigência, permitindo o meu desenvolvimento científico e a realização

deste trabalho.

Agradeço ao programa de Pós-Graduação em Ecologia, pela oportunidade de

mestrado, sua equipe de funcionários e docentes pelo apoio e conhecimentos

adquiridos durante o decorrer deste trabalho.

Agradeço a Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), ao Centro

de Biociências (CB) e ao Departamento de Biologia Molecular e Genética (DBMG).

Agradeço a CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível

Superior), pela bolsa de estudos oferecida. Ao CNPq (Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo financiamento deste trabalho, sob

processo de número: Nº556793/2009-9 e ao IBAMA pela autorização de coleta das

espécies (Processo Nº 19135/1).

SUMÁRIO

Lista de Figuras VIII

Lista de Tabelas XI

Lista de Abreviaturas XII

Resumo XIII

Abstract XIV

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. Principal componente vertebrado marinho 1

1.2. Aspectos citogenéticos da família Gobiidae 3

1.3. A evolução refletida na morfologia 5

2. OBJETIVOS 8

3. MATERIAL E MÉTODOS 9

3.1. Material 9

3.2. Métodos 11

3.2.1. Técnica de estimulação mitótica 11

3.2.2. Técnica de obtenção de cromossomos mitóticos 11

3.2.3. Preparação das lâminas 12

3.2.4. Análises cromossômicas 12

3.2.5. Detecção de regiões organizadoras de nucléolos (RONs) 12

3.2.6. Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda-C) 14

3.2.7. Coloração com fluorocromos base-específico 14

3.2.8. Análises por morfometria geométrica (MG) 14

4. CAPÍTULOS 15

4.1. Caracterização da diversidade na família Gobiidae por meio da citogenética e morfometria geométrica

15

4.2. Análises citogenéticas e morfométricas interpopulacionais no peixe marinho Bathygobius soporator (Gobiidae - Perciformes)

44

5. CONCLUSÕES 61

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 71

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Desenho morfológico esquemático de Gobiidae (gênero Bathygobius). Em destaque (a) nadadeiras dorsais separadas, primeira nadadeira dorsal com raios, olhos grandes, ausência de linha lateral; (b) nadadeiras pélvicas fusionadas presentes na maioria das espécies

2

Figura 2. Mapa com pontos de coleta dos exemplares da família Gobiidae. Litoral do Maranhão (MA), Rio Grande do Norte (RN), Bahia (BA) e Atol das Rocas.

9

Figura 3. Espécies analisadas no presente estudo: a. Ctenogobius smaragdus, b. Ctenogobius boleosoma, c. Bathygobius soporator, d. Bathygobius

mystacium, e. Coryphopterus glaucofraenum.

10

CAPÍTULO I

Figura 1. Imagem digitalizada de Coryphopterus glaucofraenum retratando os 11 landmarks utilizados nas análises morfológicas interespecífica em Gobiidae. Descrição esquemática dos landmarks. 1. Ponto distal do osso pré-maxilar; 2. Origem da primeira nadadeira dorsal; 3. Término da primeira nadadeira dorsal; 4. Origem da segunda nadadeira dorsal; 5. Término da segunda nadadeira dorsal; 6. Término da nadadeira anal; 7. Origem da nadadeira anal; 8. Origem da nadadeira pélvica; 9. Margem anterior ocular; 10. Margem posterior ocular; 11. Base superior da nadadeira peitoral. Barra=0,5cm.

20

Figura 2. Cariótipo de Ctenogobius smaragdus a partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm.

22

Figura 3. Cariótipo de Ctenogobius boleosoma a partir de coloração convencional (a). Em destaque (b) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm.

22

Figura 4. Metáfase de C. smaragdus (a) e C. boleosoma (b), exibindo marcações CMA3

+ na maior parte dos cromossomos em posição centromérica e terminal. Barra=5µm.

22

Figura 5. Cariótipo de Bathygobius soporator a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (4º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm.

23

Figura 6. Cariótipo de Bathygobius mystacium a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (5º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm.

23

Figura 7. Cariótipo de Coryphopterus glaucofraenum a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm.

24

Figura 8. Distribuição dos padrões corporais das cinco espécies de Gobiidae analisadas ao longo da primeira e segunda Variável Canônica.

25

Figura 9. Gride de deformação a partir da primeira Variável Canônica, os vetores indicam a direção da deformação sofrida por cada landmark na representação espacial comparativa das cinco espécies de Gobiidae analisadas.

26

Figura 10. Análise morfométrica comparativa entre B. mystacium e B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa B.

mystacium e o desvio vetorial à espécie B. soporator.

26

Figura 11. Análise morfométrica comparativa, entre as espécies do gênero Ctenogobius, à partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa C. boleosoma e o desvio vetorial a espécie C. smaragdus.

26

CAPÍTULO II

Figura 1. Imagem digitalizada de B. soporator retratando os 09 landmarks definidos para análises morfológicas interpopulacionais. Descrição esquemática dos landmarks. 1. Ponto distal do osso pré-maxilar; 2. Origem da primeira nadadeira dorsal; 3. Término da primeira nadadeira dorsal; 4. Origem da segunda nadadeira dorsal; 5. Término da segunda nadadeira dorsal; 6. Término da nadadeira anal; 7. Origem da nadadeira anal; 8. Origem da nadadeira pélvica; 9. Base infra-ocular medial. Barra=1,5cm.

49

Figura 2. Cariótipo de B. soporator para populações contientais (MA, RN e BA) à partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (4º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra= 5µm.

50

Figura 3. Cariótipo de B. soporator população do Atol das Rocas, a partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra= 5µm.

50

Figura 4. Distribuição das amostras de B. soporator ao longo da primeira e segunda variável canônica (63,5% e 30,5% da variância respectivamente), a partir das variáveis morfométricas.

52

Figura 5. Distribuição das populações continentais amostradas de B. soporator ao longo da primeira e segunda variável canônica (76,2% e 23,5% da variância respectivamente). Os símbolos em destaque indicam a média morfométrica de cada população.

52

Figura 6. Gride comparativo entre população continental e insular de B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa população do RN e o desvio vetorial população do Atol das Rocas.

53

Figura 7. Gride comparativo entre populações continentais de B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa população do RN e o desvio vetorial população do Maranhão.

53

Figura 8. Gride comparativa entre populações continentais de B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa população do RN e o desvio vetorial população da Bahia.

54

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I

Tabela 1. Número de indivíduos utilizados para estudos morfométricos e citogenéticos.

19

Tabela 2. Dados citogenéticos das cinco espécies de Gobiidae analisadas. 21

Tabela 3. Resultados post-hoc ANOVA a partir de procrustes, classificadas com a média do centróide, efeito individual, para todos os espécimes em estudo e espécies dos gêneros Bathygobius e Ctenogobius.

24

Tabela 4. Dados citogenéticos disponíveis da família Gobiidae (Perciformes). 28

CAPÍTULO II

Tabela 1. Número de indivíduos coletados, seus respectivos pontos de coleta e sua utilização para estudos morfométricos e citogenéticos.

48

Tabela 2. Porcentagem de indivíduos alocados para cada população e suas interfaces baseados na CVA.

51

Tabela 3. Resultados post-hoc ANOVA a partir de procrustes, classificadas com a média do centróide, efeito individual, entre as populações continentais.

51

LISTA DE ABREVIATURAS

a – Acrocêntrico

AgNO3 – Nitrato de prata

Ag-RONs – Regiões organizadoreas de nucléolo evidenciadas pela impregnação com nitrato de prata

ANOVA – Análise de variância

AR – Atol das Rocas

AT – Adenina e Timina

BA – Bahia

BC – Bandamento C

BRA - Brasil

CMA3 – Cromomicina A3

CVA – Análise de variáveis canônicas

DAPI – 4`4’,6-diamidino-2-fenilindol

DNA – Ácido desoxirribonucléico

EUA – Estado Unidos da América

GC - Guanina e Citosina

LGRM – Laboratório de Genética de Recursos Marinhos

m – Metacêntrico

MA – Maranhão

MANOVA – Análise multivariada de variância

MG – Morfometria geométrica

NE – Nordeste

NF – Número de braços cromossômicos

N-S – Norte Sul

p – Probabilidade estatística do teste

RN – Rio Grande do Norte

sm - Submetacêntrico

st – Subtelocêntrico

UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte

VC – Variável canônica

RESUMO

Os peixes da ordem Perciformes caracterizam-se como um modelo importante para o entendimento da estrutura genética de populações marinhas, pois apresentam tanto exemplos de conservação cromossômica como de diversificação cariotípica para alguns grupos. Gobiidae é a família mais especiosa no ambiente marinho. Entre seus representantes, muitas espécies fazem parte de uma fauna críptica pouco percebida e estudada, apresentando ampla distribuição com características comportamentais e reprodutivas que as tornam propícias à ação de barreiras biogeográficas. Morfologicamente esta família apresenta estruturas corporais reduzidas através de simplificações e regressões. Dados citogenéticos, apesar da importância em inferências evolutivas, são incipientes frente sua diversidade de espécies, sobretudo para espécies do Atlântico Ocidental. Visando estimar a diversidade evolutiva em Gobiidae foram desenvolvidas análises citogenéticas e dos padrões corporais, através de morfometria geométrica, em cinco espécies presentes no litoral brasileiro, Coryphopterus glaucofraenum, Bathygobius mystacium, B.

soporator, Ctenogobius smaragdus e C. Boleosoma. Os dados obtidos demonstram marcante diversidade cariotípica e morfológica entre as espécies. As inversões pericêntricas e fusões desempenham papel importante na evolução cromossômica desta família, ocasionando diferenças cariotípicas estruturais e numéricas em todas as espécies. Comparações cariotípicas e morfológicas entre amostras geográficas de B. soporator provenientes do litoral do Maranhão, Rio Grande do Norte e Bahia evidenciaram padrões citogenéticos comuns, mas padrões morfológicos diferentes. Uma amostra proveniente do Atol das Rocas revelou conspícua diferenciação cariotípica e morfológica das demais populações continentais, confirmando a presença de uma nova espécie insular. As abordagens empregadas revelam diversificações compatíveis com um grupo com características de baixa vagilidade e amplamente sujeito a seleção ambiental decorrente de exigências ecológicas peculiares.

Palavras-Chave: Gobiidae, evolução cariotípica, morfometria geométrica,

Coryphopterus, Bathygobius, Ctenogobius.

ABSTRACT

The fishes of the order Perciformes are characterized as an important model for understanding the genetic structure of marine populations, because besides they present examples of conservation chromosomal, also they present the karyotype diversification for some groups. Gobiidae family is the most specious in the marine environment. Among its representatives, many species are part of a cryptic fauna little noticed and studied, a wide distribution with behavioral and reproductive characteristics, that make them conducive to the action of biogeographical barriers. Morphologically this family presents reduced body structures through simplification and regressions. Despite their importance in evolutionary inferences, cytogenetics data are incipient facing their species diversity, especially with western Atlantic species. In order to estimate the evolutionary diversity in Gobiidae, it were developed cytogenetic analysis and the standards body, through geometric morphometrics in five species on the Brazilian coast, Coryphopterus glaucofraenum, Bathygobius

mystacium, B. soporator, Ctenogobius smaragdus e C. Boleosoma. The data show significant karyotype and morphological diversity among the species. The pericentric inversions and mergers play an important role in chromosomal evolution of this family, causing karyotypic structural and numerical differences in all species. Karyotypic and morphological comparisons among geographic samples of B. soporator from the coast of Maranhão, Rio Grande do Norte and Bahia showed cytogenetics patterns commons, but different morphological patterns. A sample from the Atol das Rocas revealed conspicuous morphological and karyotypic differentiation of another continental populations, confirming the presence of a new island species. The approaches done reveal diversification consistent with characteristics of a group of low vagile and largely able to environmental selection due from peculiar ecological requirements.

Keywords: Gobiidae, karyotype evolution, geometric morphometry, Coryphopterus,

Bathygobius, Ctenogobius.

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Principal componente vertebrado marinho

Os peixes constituem um grupo polifilético com certa de 28.000

espécies, o que corresponde a mais da metade das formas vivas de

vertebrados. Deste total, cerca de 60% vive no ambiente marinho e a sua

maioria habita as zonas costeiras (Nelson, 2006). Representam o grupo de

vertebrados com maior êxito em termos de diversificação devido à grande

variabilidade de habitats presentes no meio marinho e dulcícola.

A ordem Perciformes com 10.033 espécies é a mais diversificada de

todas as ordens de peixes, dominantes nos oceanos e em muitos ambientes

dulcícolas tropicais e subtropicais. Dentre os Perciformes a subordem

Gobioidei possui um número estimado de aproximadamente 2.211 espécies,

distribuídas em 270 gêneros, correspondendo a aproximadamente 22% dos

Perciformes (Pezold, 1984; Nelson, 2006). Nesta subordem, a família Gobiidae

é a que apresenta maior número de espécies (Robertson, 1998; Nelson, 2006),

considerada monofilética, possui 210 gêneros e um número estimado de 1.950

espécies (Pezold, 1984; Tracker, 2003; Nelson, 2006), o que corresponde a

cerca de 88% da subordem Gobioidei (Pezold, 1993).

Gobiidae compartilha características crípticas, tanto morfológicas,

biológicas e comportamentais, que aliadas a grande quantidade de espécies e

ao número insuficiente de informações biológicas existentes, contribui para a

imprecisão em algumas caracterizações taxonômicas.

Anatomicamente apresentam suas nadadeiras pélvicas fundidas

formando um disco de sucção que auxilia o animal em seu posicionamento no

ambiente, além disso, exibem nadadeiras dorsais separadas, primeira

nadadeira dorsal com espinhos, olhos grandes e ausência de linha lateral

(Nelson, 2006) (Figura 1). A maior parte das espécies é bentônica, vivendo em

tocas ou esconderijos em ambientes marinhos e estuarinos. Contudo, algumas

formas exibem inúmeras adaptações ecológicas, como por exemplo, formas

nectônicas ou habilidade para respirar o oxigênio atmosférico (Robertson,

2

1998; Tracker, 2003).

Quanto aos aspectos biogeográficos, este grupo demonstra-se

amplamente distribuído podendo ser encontrado ao longo do Atlântico, Pacífico

e Índico em áreas tropicais, subtropicais e temperadas (Menezes & Figueiredo,

1985; Mendes, 2000; Tracker, 2003; Nelson, 2006). Apresenta representante

em habitats estuarinos e dulcícolas, freqüentemente sendo os mais abundantes

em água doce no interior de ilhas oceânicas (Nelson, 2006).

Figura 1. Desenho morfológico esquemático de Gobiidae (gênero Bathygobius). Em destaque (a) nadadeiras dorsais separadas, primeira nadadeira dorsal com raios, olhos grandes, ausência de linha lateral; (b) nadadeiras pélvicas fusionadas presentes na maioria das espécies (adaptado de Nelson, 2006).

Os Gobídeos representam elementos dominantes em habitats

bentônicos nos recifes tropicais, podendo ser morfologicamente crípticos em

relação a membros da própria família e outras como Labrisomidae, Blenniidae

(Sale, 1991; Galvão, 2006) e Eleotridae, em áreas estuarinas. A maior parte

das espécies apresenta tamanho reduzido, não ultrapassando 10 cm de

comprimento, seu maior representante Glossogobius giuris, atinge cerca de 50

cm e o menor Trimmatom nanus corresponde ao menor vertebrado existente,

uma fêmea madura atinge 8-10mm (Nelson, 2006).

Seus hábitos alimentares são diversos, sendo em sua maioria carnívoros

e onívoros, com alguns representantes herbívoros. Muitas espécies que vivem

próximas a costa, se alimentam principalmente de invertebrados bentônicos e

algas. Em contraste a esta situação, espécies em habitats recifais podem

apresentar hábitos alimentares mais especializados. Diversas espécies são

semi-pelágicas e se alimentam de copépodas planctônicos. Espécies

b a

3

dulcícolas muitas vezes se alimentam de diatomáceas e microalgas

(Emmanuel & Ajibola, 2010). É comum uma estreita associação entre

diferentes espécies de gobídeos com outros animais, como esponjas, moréias,

camarões e ouriços do mar. Espécies de pequeno porte podem estar

associadas a peixes maiores, alimentando-se de ectoparasitas e realizando a

limpeza destes (Colin, 1975).

Os representantes de Gobiidae apresentam considerável importância

ecológica e comercial, sua elevada abundância em determinadas localidades

os tornam um componente fundamental na cadeia alimentar (De Sylva, 1975).

Várias espécies são pescadas e comercializadas de forma significativa, onde

são utilizados como iscas na pesca de peixes de maior porte (Emmanuel &

Ajibola, 2010). Em diversos países Ocidentais devido suas cores exuberantes,

comportamentos peculiares e tamanhos apropriados, algumas espécies são

intensamente comercializadas no segmento da aquariofilia, compondo de 5 a 7

% das vendas no mercado mundial de peixes ornamentais marinhos (Wabnitiz

et al., 2003). No Brasil a espécie Elacatinus figaro já foi uma das mais

importantes no comércio de exportação de peixes ornamentais marinhos do

país (Gasparini et al., 2005), mas atualmente encontra-se na lista de espécies

ameaçadas de extinção, resguardada do extrativismo (IBAMA, 2004).

A diversidade de espécies, amplo padrão de distribuição, características

ecológicas e comportamentais peculiares, evidenciadas por representes da

família Gobiidae demonstram a grande capacidade adaptativa dos peixes que a

compõe, cuja carência de informações existentes para o grupo, os torna

importante modelo para análises evolutivas no ambiente marinho.

1.2 Aspectos citogenéticos da família Gobiidae

Os Perciformes apresentam tanto exemplos de conservação

cromossômica, compartilhada por muitas espécies, quanto de diversificação

cariotípica em alguns grupos (Brum & Galetti, 1997), dos quais, polimorfismos

cromossômicos numéricos e estruturais, além de vários sistemas sexuais

recorrentes (Galetti et al., 2000). Aproximadamente 8% das espécies de

Perciformes foram cariotipadas (Galetti et al., 2000; Afonso & Galetti, 2005;

4

Galetti et al., 2006; Molina & Bacurau, 2006). Apesar da maioria dos seus

representantes serem marinhos, neste ambiente apenas 2% das espécies

apresentam dados citogenéticos (Almeida-Toledo et al., 1993; Brum, 1996).

Cerca de 60% dos Perciformes estudados até então, apresentam um

cariótipo caracterizado por 48 cromossomos monobraquiais, o que faz acreditar

que este seja um caráter plesiomórfico para o grupo (Galetti et al., 2000). As

informações cariotípicas disponíveis para Perciformes marinhos têm

confirmado esta hipótese (Klinkhardt et al., 1995; Brum & Galetti, 1997), o que

demonstra para estas espécies que a especiação em alguns grupos, parece

não ter sido seguida por diferenciação cariotípica significante.

A família Gobiidae destaca-se por apresentar grande diversidade

cariotípica (Galetti et al., 2000), com cariótipos variando de 2n=30, em

Neogobius euricephalus (Ene, 2003), a 2n=52, em Gobius niger (Vitturi &

Catalano, 1989). Apesar da grande diversidade cariotípica, a família exibe com

maior freqüência espécies que apresentam valores diploides com 44, 46 e 48

cromossomos (Ene, 2003). Dados cromossômicos estão disponíveis para

aproximadamente 4,5% das espécies da família Gobiidae (Klinkhardt et al.,

1995), sendo a sua maioria restrito a identificação dos valores diplóides e da

macroestrutura cariotípica (Caputo, 1998). No litoral brasileiro são encontradas

cerca de 40 espécies de Gobiidae (Menezes et al., 2003), destas apenas duas

possuem dados citogenéticos, Bathygobius soporator, com 2n=48 e Awaous

strigatus, com 2n=46 (Brum et al.,1996; Souza et al., 1998; Cipriano et al.,

2002).

Para representantes da ordem Perciformes, um dos mecanismos que

permite explicar a existência de diversificação cromossômica estrutural, é a

ocorrência de inversões pericêntricas, que constituem os rearranjos

cromossômicos mais frequentes nessa ordem (Cano et al., 1982; Galetti et al.,

2000; Ueno & Takai, 2000; Molina & Galetti, 2004). A variabilidade numérica

derivada de processos de fissão e fusão tem sido relatada em algumas famílias

como Pomacentridae, Labridae, Apogonidae, entre outras (Molina & Galetti,

2002; Sena & Molina, 2007; Araújo et al., 2010). Em Gobiidae rearranjos

Robertsonianos estão entre os principais mecanismos de diferenciação

cromossômica (Thode et al., 1988; Amores et al., 1990; Vasil’ev & Grigoryan,

1993; Caputo et al., 1997; Galetti et al., 2000; Ene, 2003).

5

A presença de variabilidade cariotípica intra e interpopulacional foram

constatadas em algumas espécies da família como, por exemplo, Aphia minuta

que apresentou cinco citótipos distintos em uma população de onze indivíduos

presentes na costa de Ortona, Itália (Caputo et al., 1999). Espécies do gênero

Gobius, como G. niger e G. paganellus, exibem populações cariotipicamente

monomórficas (Klinkhardt, 1992; Vasil'ev & Grigoryan, 1992; Caputo et al.,

1997) e populações com polimorfismo acentuado, envolvendo vários tipos de

rearranjos cromossômicos (Vitturi & Catalano, 1989; Amores et al., 1990;

Caputo et al., 1997).

As modificações frequentes e complexas na estrutura cariotípica dos

Gobídeos parecem estar ligadas ao padrão evolutivo deste grupo (Caputo et

al., 1997). Embora os estudos cromossômicos em gobídeos estejam longe de

ser completos, sua abrangência as espécies do oeste do Atlântico contribuirá

substancialmente para o conhecimento da diversidade cariotípica e seus

mecanismos regentes nesta região, o que até então é desconhecido.

1.3 A evolução refletida na morfologia

Pesquisas relacionadas ao formato corporal dos organismos assumem

importante papel em estudos biológicos, uma vez que podem refletir

experiências biológicas e evolutivas (Bookstein, 1991; Zelditch et al., 2004),

tendo como base o conceito de que o fenótipo apresentado por um organismo

decorre da interação existente entre um dado genótipo e o meio ambiente em

que se encontra (Ricklefs & Miles, 1994) e que a evolução de um mesmo

fenótipo em populações naturais pode ser evidência de seleção natural e

adaptação (Mcguigan et al., 2005).

Em contrapartida, variações morfológicas podem afetar o

comportamento e interação ecológica dos organismos, principalmente se

levarmos em conta características físicas e químicas do ambiente (Webb,

1984). Assim, o formato corporal pode ter relevância evolutiva e ecológica para

um dado organismo (Klingenberg et al., 2003). Diante disto, análises de

estruturas morfológicas como as morfométricas podem ser de grande valia

6

(Schluter, 1993), sendo utilizada em distintas abordagens biológicas durante

anos (Monteiro et al., 2002; Rosenberg, 2002).

A morfometria é a análise da forma do corpo em relação ao tamanho

através de métodos numéricos, propiciando a interpretação e comparação dos

padrões de variação de caracteres quantitativos (Blackith & Reyment, 1971;

Cavalcanti & Lopes, 1993).

Historicamente, o estudo da variação corporal consistia em medidas

relativas de estruturas anatômicas que eram analisadas por meio de arranjos

canônicos, componentes principais e outros recursos estatísticos multivariados,

configurando a técnica denominada de morfometria tradicional (Monteiro et al.,

2002).

A morfometria geométrica (MG) é um conjunto de técnicas

computacionais e estatísticas, que no estudo da forma de estruturas biológicas

possibilita, além de analisar e quantificar, visualizar graficamente a variação de

forma da estrutura estudada, considerando simultaneamente várias

características de uma estrutura corporal complexa, em que são utilizados

marcos anatômicos ou landmarks (Rohlf, 1993; Monteiro & Reis, 1999). A

utilização de landmarks comuns às amostras analisadas permite identificar as

variações de forma entre as mesmas estruturas morfológicas nos diferentes

exemplares em estudo.

Na superposição de marcos anatômicos, a variação de forma é estudada

nas próprias coordenadas dos mesmos, após a retirada dos efeitos de

tamanho, orientação e posição. Logo, se as configurações estão centradas em

um ponto comum, proporcionalizadas de forma que tenham o mesmo tamanho

e rotacionadas, as coordenadas encontradas localizam um ponto no espaço de

forma (Shape Space), chamado de espaço da forma de Kendall (Kendall,

1984;1989; Dryden & Mardia, 1998; Rohlf, 1999).

Esta nova abordagem permite a descrição da variabilidade usando uma

análise estatística robusta bem como a utilização de Thin-plate spline (TPS)

para ilustrar e descrever os resultados em termos de deformações. Uma das

principais inovações da MG foi a reformulação das idéias de D’Arcy Thompson,

que visualizava as formas biológicas como distorções de um sistema de

coordenadas geométricas (Thompson, 1917).

7

O estudo da morfometria tem interessado diversas áreas do

conhecimento mostrando-se de grande importância na compreensão da

biologia evolutiva dos organismos (Blackith & Reyment, 1971). É considerada

uma ferramenta muito útil na sistemática, descrição de estruturas

populacionais, identificação de estoques pesqueiros, dimorfismo sexual e

fornecimento de conhecimento sobre o grau de variação intra e interespecífico

(Fonteles Filho,1989; Peres, et al., 1995; Ehliger, 1991; Vidales et al., 1997;

Fairbairn, 1997; Baras, 1999; Silva, 2000; Fulford & Rutherford, 2000; Rapp Py-

Daniel & Cox Fernandes, 2005; Aguirre & Shervette, 2005).

No caso dos peixes da família Gobiidae, que representam um

excepcional exemplo de especiação e diversificação, com alto índice de

endemismos nos recifes tropicais, o conhecimento do grau de variação

morfológico, seja ele interespecífico, intrapopulacional e interpopulacional,

associada a ferramentas citogenéticas e de genética molecular, pode nos

auxiliar na identificação dos mecanismos evolutivos atuantes na diversificação

desta família.

8

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Diante das informações disponíveis o presente trabalho se propôs

investigar aspectos de diversificação na família Gobiidae, analisando espécies

do Atlântico, por meio de análises citogenéticas resolutivas, aliadas a análises

dos padrões corporais existentes em níveis inter e intraespecíficos a fim de

identificar a presença de processos evolutivos neste peculiar grupo de peixes.

2.2 Objetivos específicos

· Analisar citogeneticamente as espécies Bathygobius mystacium, B.

soporator, Ctenogobius smaragdus, C. boleosoma e Coryphopterus

glaucofraenum, utilizando coloração convencional, bandamento C,

impregnação por nitrato de prata e coloração com fluorocromos base-

específicos (CMA3 e DAPI);

· Estabelecer uma comparação dos padrões morfológicos das espécies

Bathygobius mystacium, B. soporator, Ctenogobius smaragdus, C.

boleosoma e Coryphopterus glaucofraenum, por meio da técnica de

morfometria geométrica, com fins de aferição ecomorfológica,

taxonômica e sistemática;

· Analisar possíveis estruturações populacionais na espécie Bathygobius

soporator ao longo do litoral brasileiro (MA, RN e BA) e Atol das Rocas,

através da associação de características citogenéticas entre as

populações dessas localidades e os padrões corporais de cada

população.

9

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material

Os exemplares da família Gobiidae, foram coletados ao longo do litoral

brasileiro no litoral dos estados do Rio Grande do Norte, praia de Búzios

(5°41'57.41"S, 35°11'34.71"O) e Barra do Cunhaú (6°19'15.50"S,

35°2'29.31"O), da Bahia, cidade de Salvador (13° 0'39.61"S, 38°31'27.21"O),

do Maranhão, cidade de São Luís (2°28'14.06"S, 44°15'49.15"O) e Atol das

Rocas (3º51’’S, 33º49’’W) (Figura 2), com o auxílio de rede de confecção

própria e sacos plásticos.

Figura 2. Mapa com pontos de coleta dos exemplares da família Gobiidae. Litoral do Maranhão (MA), Rio Grande do Norte (RN), Bahia (BA) e Atol das Rocas.

10

As espécies utilizadas nas análises foram Bathygobius mystacium

(Ginsburg, 1947), n=23; Bathygobius soporator (Valenciennes, 1837), n=170;

Ctenogobius smaragdus, (Valenciennes, 1837), n=04; Ctenogobius boleosoma,

(Jordan e Gilbert, 1882), n=29 e Coryphopterus glaucofraenum (Gill, 1863),

n=13 (Figura 2). As mesmas foram identificadas a partir da chave de

classificação de Bohlke & Chaplin (1993) e Hoese & Murdy (2002).

Figura 3. Espécies analisadas no presente estudo. a. Ctenogobius smaragdus, b. Ctenogobius boleosoma, c. Bathygobius soporator, d. Bathygobius mystacium, e. Coryphopterus glaucofraenum. Barra=1 cm.

Os espécimes utilizados para estudos morfológicos e citogenéticos

foram mantidos em aquários aerados até serem fotografados e submetidos ao

processo de estimulação mitótica.

Exemplares testemunho de cada espécie se encontram preservados em

formol 5% no Laboratório de Genética de Recursos Marinhos, para posterior

depósito no Museu de Ciências Morfológicas da UFRN.

a b

c

d

e

11

3.2 Métodos

3.2.1 Técnica de estimulação mitótica

Os exemplares foram estimulados mitoticamente através da técnica

preconizada por Molina (2001) e Molina et al. (2010), que faz uso de complexos

de antígenos do ar, bacterianos e fúngicos (Munolan® e Aminovac®). Este

procedimento consiste na inoculação intramuscular de solução do composto (2

comprimidos/1ml de água destilada); na proporção de 1ml/50g de peso

corporal, por um período de 24 a 48 horas. Decorrido este tempo, os

exemplares foram anestesiados com óleo extraído de cravo (Syzygium

aromaticum) (Eugenol) e posteriormente sacrificados para extração do rim

cefálico.

3.2.2 Técnica de obtenção de cromossomos mitóticos

A técnica de obtenção de cromossomos mitóticos adotada seguiu o

método preparação in vitro descrito por Gold et al. (1990). Os exemplares

tiveram o rim anterior (cefálico) e posterior removidos e utilizados para

obtenção de suspensão celular. Estes foram colocados em 9 ml de meio de

cultura RPMI 1640 e dissociados com ajuda de seringas de vidro, transferindo

o material logo em seguida para tubos falcon de 15ml, completando o volume

até 10ml do mesmo. Foi adicionada solução de colchicina 0,025% por 30

minutos, para cessar a divisão mitótica, deixando agir em temperatura

ambiente. Em seguida o material foi centrifugado por 10 minutos a 900rpm.

Após o excedente ser removido acrescentamos 9 ml de solução hipotônica de

KCl (0,075M), por 28 a 30 minutos em temperatura ambiente, ao término

novamente centrifugado por 10 minutos. Solução fixadora de metanol e ácido

acético (3:1) foi utilizada para fixação do material em três ciclos de

centrifugação por 10 minutos, sendo o material conservado à -20ºC em tubos

de 1,5ml com tampa para análises posteriores.

12

3.2.3 Preparação das lâminas

Um total de três ou quatro gotas de suspensão celular foram gotejadas

sobre uma lâmina recoberta com um filme d’água destilada aquecida à 60oC,

após secar ao ar, foi corada com solução Giemsa 5%, diluído em tampão

fosfato pH 6,8, por um período de 08 minutos, posteriormente lavada com água

destilada e seca ao ar.

3.2.4 Análises cromossômicas

Lâminas previamente preparadas com as suspensões celulares de cada

indivíduo foram analisadas através de microscópio óptico, sob o aumento de

1000 vezes. Uma média de 30 metáfases foi analisada para cada exemplar,

visando o estabelecimento do valor diploide modal para cada espécie e a

definição dos tipos cromossômicos. As melhores metáfases foram fotografadas

em fotomicroscópio de epifluorescência (OlympusTM BX50), sob aumento de

1000X, por meio de sistema digital de captura (DP70, Olympus), com o uso dos

software DPController, v. 1.2.1.108 (Olympus Optical Co. Ltd.) e utilizadas na

definição da fórmula cromossômica e construção do cariótipo. Os

cromossomos foram definidos quanto à posição dos centrômeros em

metacêntricos (m), com a razão entre o braço maior e menor (RB) variando de

1,00 a 1,70; submetacêntricos (sm), RB = 1,71 – 3,00; subtelocêntricos (st), RB

= 3,01 – 7,00; e acrocêntricos (a), RB > 7,01 (Levan et al., 1964).

3.2.5 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)

As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram evidenciadas de

acordo com a técnica descrita por Howell e Black (1980), com pequenas

modificações. Uma solução gelatinosa contendo 1g de gelatina incolor

acrescido de 50 ml de água e 0,5ml de ácido fórmico foi depositada na lâmina,

misturada a quatro gotas de nitrato de prata (Ag-NO3) 50%, cobrindo-a em

seguida com lamínula. Logo após foi incubada em estufa a 60ºC entre cinto a

oito minutos, até que uma coloração âmbar aparecesse. Ao término do

13

processo a lâmina foi lavada com água destilada, seca ao ar e analisada ao

microscópio.

3.2.6 Detecção de Heterocromatina Constitutiva (Banda-C)

A observação de regiões de heterocromatina constitutiva foi realizada de

acordo com o método desenvolvido por Summer (1972) com pequenas

alterações, visando uma melhor qualidade das preparações. Inicialmente as

lâminas foram imersas em HCl 0,2 N à temperatura ambiente, por 14 minutos,

lavando-a logo em seguida em água destilada e seca ao ar. Após isto, as

lâminas foram incubadas numa solução saturada de Ba(OH)2.8H2O, à 5%,

durante um período de 1 à 2 minutos à 42ºC. Após incubação foram expostas à

HCl 0,2N rapidamente, lavadas com água destilada e mantidas em solução de

2xSSC à 60ºC por uma hora, sendo posteriormente coradas com solução à 5%

de Giemsa diluído em tampão fosfato, pH 6,8 por 6 minutos e visualizadas ao

microscópio.

3.2.7 Coloração com Fluorocromos base-específicos

Para a dupla coloração com os fluorocromos CMA3 e DAPI, as lâminas

foram envelhecidas por três dias, coradas com 30 µL de CMA3 0,5 mg/mL por 2

horas, e em seguida coradas com 30 µL de DAPI 2 µL/mL por 30 minutos,

segundo metodologia preconizada por (Carvalho et al., 2005), com algumas

modificações. Posteriormente as lâminas foram montadas em tampão glicerol-

McIlvaine pH 7,0 (1:1), preservadas em câmara escura, por três dias e então

analisadas. As metáfases foram fotografadas em fotomicroscópio de

epifluorescência (OlympusTM BX50) com filtros apropriados em aumento de

1000X.

3.2.8 Análises por Morfometria Geométrica

Para a análise da morfometria geométrica, imagens no formato JPEG

com dimensão 3264x2448, foram obtidas da face lateral esquerda dos

14

espécimes, com escala métrica, utilizando-se uma câmera digital Sony H10

(8,1 megapixels) acoplada a um tripé VF WT3540.

O programa tpsUtil foi utilizado para ordenar as imagens dos espécimes

num único arquivo com o formato TPS, possibilitando o acesso às imagens

pelos demais programas da série. O software tpsDig2 (Rohlf, 2006) foi utilizado

para localizar os landmarks ou marcos anatômicos nas imagens, que

posteriormente foram utilizadas nas análises morfométricas. Os landmarks

foram escolhidos segundo a classificação de Bookstein (1991), sendo nove

utilizados para estudos interpopulacionais e onze para distinção de espécies.

As coordenadas referentes ao posicionamento espacial de cada landmark

foram sobrepostas utilizando-se o software CoordGen6.

Com a utilização do software CVAGen6, análises das variáveis

canônicas (VC) e MANOVA permitiram comparações morfométricas entre as

espécies, populações e testes de alocação. O programa MorphoJ 1.02b

possibilitou a quantificação do discernimento morfológico através da distância

de Mahalanobis, ANOVA e a formação dos grides de deformação à partir da

variável canônica que se mostrou mais significativa.

15

4.1 Capítulo I

Caracterização da diversidade na família Gobiidae por

meio da citogenética e morfometria geométrica

Lima Filho, P. A. & Molina, W. F.

Resumo

A família Gobiidae é a mais especiosa no ambiente marinho, apresenta características morfológicas com simplificações e perdas em estruturas corpóreas. Tamanha diversidade parece ter sido acompanhada por alterações cromossômicas significativas quando comparada a outros representantes da Ordem Perciformes com elevado conservadorismo cromossômico. Poucas informações citogenéticas estão disponíveis para espécies sul-americanas. Neste trabalho cinco espécies de gobídeos do Atlântico foram caracterizadas citogeneticamente por meio de coloração convencional com Giemsa, bandamento C, identificação de cístrons ribossomais pela técnica de Ag-RONs, coloração com os fluorocromos CMA3/DAPI e comparadas morfologicamente por meio da morfometria geométrica. Identificou-se uma marcante diversidade cariotípica entre as espécies Coryphopterus glaucofraenum (2n=40; 2sm+38a; NF=42), Ctenogobius smaragdus (2n=48; 2sm+42a; NF=50), Ctenogobius

boleosoma (2n=44; 2sm+42a; NF=46), Bathygobius mystacium (2n=48; 2m+4st+42a; NF=54) e Bathygobius soporator (2n=48; 2m+6st+40a; NF=56). Quanto aos padrões morfológicos todas as cinco espécies apresentam perfis morfológicos distintos, contudo exibem maior proximidade morfológica entre espécies cogenéricas. Os dados cromossômicos ressaltam o papel das inversões pericêntricas, fusões e fissão na evolução cariotípica do grupo. A diversidade cariotípica e morfológica presente nesta família sugerem uma dinâmica na evolução compatível com grupos dulcícolas sujeitos a intensas fragmentações populacionais, aliado a diversificações morfológicas adequadas a exploração de habitats peculiares.

Palavras-chave: Gobiidae; diversidade cariotípica; morfometria geométrica;

citogenética de peixes.

16

Characterization of the diversity of Gobiidae family by

cytogenetics and geometric morphometrics

Lima Filho, P. A. & Molina, W. F.

Abstract

Gobiidae family is the most specious in the marine environment, it shows morphologic features with simplifications and losses on body structure. Such diversity seems to have been accompanied by chromosomal changes significantly when compared to others representatives of the order Perciformes with high chromosomal conservatism. Few cytogenetic informations are available for South American species. In this study five species of Atlantic gobídeos were characterized cytogenetically by conventional Giemsa staining, C banding, identification of ribosomal cistrons by the technique of Ag-NORs, staining with the fluorochromes CMA3/DAPI, and also compared morphologically and by means of geometric morphometry. It was identified a remarkable karyotypic diversity among species Coryphopterus glaucofraenum

(2n=40; 2sm+38a; NF=42), Ctenogobius smaragdus (2n=48; 2sm+42a; NF=50), Ctenogobius boleosoma (2n=44; 2sm+42a; NF=46), Bathygobius

mystacium (2n=48; 2m+4st+42a; NF=54) e Bathygobius soporator (2n=48; 2m+6st+40a; NF=56). Against to the morphologic patterns, all five species have distinct morphological profiles, but exhibit greater proximity among morphological species co-generics. Chromosomes data underscore the role of pericentric inversions, merges and fission in karyotype evolution of the group. The karyotypic and morphological diversity present in this family suggests a dynamic evolution compatible with freshwater groups vulnerable to intense population fragmentation, morphological diversification with appropriate exploration of peculiar habitats.

Keywords: Gobiidae, karyotypic diversity, geometric morphometrics,

cytogenetics of fishes.

17

Introdução

Os peixes da família Gobiidae estão distribuídos nas regiões tropical,

subtropical e temperada em habitats costeiros e dulcícolas. Com cerca de

1.950 espécies, representam a maior família de peixes marinhos (Nelson,

2006), componente importante e predominante da fauna de peixes em

ambientes recifais. Devido à ocorrência de espécies morfologicamente crípticas

e de difícil amostragem, a biologia deste grupo permanece pouco estudada

(Thacker, 2003). Na costa brasileira existem cerca de 40 espécies (Menezes et

al., 2003), sendo a sua maioria compartilhada com a fauna caribenha.

Contrastando com outros grupos de Perciformes marinhos, a família

Gobiidae apresenta elevada diversidade cariotípica, o que a torna um modelo

particularmente importante para o entendimento da estrutura genética de

populações marinhas (Brum & Galetti, 1997). No que diz respeito aos aspectos

citogenéticos, a maioria das informacões para este grupo estão resumidas

prioritariamente a descrições numéricas e de morfologia cromossômica que

apesar da pouca ajuda no esclarecimento de relações filogenéticas (Ene, 2003;

Caputo et al., 1997), contribui substancialmente para o conhecimento da sua

diversidade para família (Vasil’ev & Grigoryan, 1993). Estudos citogenéticos

demonstraram uma tendência à ocorrência de translocações Robertsonianas

para a família, com demonstrações de variações cromossômicas intra e inter-

populacionais (Ene, 2003).

A dificuldade em classificar e identificar representates da família

Gobiidae, ocorre devido às características morfológicas escassas e marcante

variação morfológica interpopulacional (Springer, 1983; Winterbottom, 1984),

gerando para muitas espécies confusões taxonômicas e de nomenclatura

(Kottelat, 1997). No entanto, o uso de análises por morfometria geométrica já

utilizada com sucesso em diversos grupos de peixes (e. Ibañez et al., 2007;

Maderbacher et al., 2008; Chizinski et al., 2010), que permite identificar

variações geométricas da forma, com base numa configuração de pontos

anatômicos com redução dos efeitos inerentes ao tamanho, a localização e a

posição estrutural ocupada (Monteiro et al., 2002; Parsons et al., 2003), não foi

aplicada em espécies desta família com vistas a estabelecer comparações

ecomorfológicas e identificar diferenciações entre populações e espécies.

18

Em alguns grupos de peixes a estrutura cariotípica parece ter sofrido

poucas mudanças evolutivas quando comparadas às mudanças morfológicas

(Molina et al., 2002; Motta Neto & Molina, 2010). Não está claro se entre os

Gobiidae, diferentemente de inúmeras outras famílias de Perciformes (Molina,

2006), existem divergências nas taxas evolutivas entre os padrões

cromossômicos e morfológicos.

Neste sentido, a fim de se obter melhor compreensão da diversificação

cromossômica e mofológica desta família, aqui são apresentados os primeiros

registros citogenéticos de cinco espécies do Oeste do Atlântico, cujos padrões

são comparados citogeneticamente em associação com seus caracteres

ecomorfométricos.

Material e métodos

Foi coletado um total de 119 exemplares de cinco diferentes espécies de

Gobiidae (Tabela 1) provenientes do litoral do Estado do Rio Grande do Norte

(RN) (Praia de Búzios - 5º 46’ S, 35º 12’ W) e estuário de Barra do Cunhaú

(6°19'15.50"S, 35°2'29.31"O), NE do Brasil. Deste total apenas a espécie

Ctenogobius smaragdus foi coletada no estuário de Barra do Cunhaú e as

demais proveniente da praia de Búzios. Os espécimes foram capturados com

uso de rede de confecção própria, transferidos às dependências do laboratório

de Genética de Recursos Marinhos na UFRN e mantidos em aquários aerados

até serem fotografados para análises morfológicas e se procedesse à

realização de preparações cromossômicas.

Análises citogenéticas

Precedente aos métodos de obtenção de cromossomos metafásicos, os

exemplares foram submetidos à estimulação mitótica, “in vivo” com duas

aplicações intramuscular/peritoneal de Aminovac® (complexo de antígenos

bacterianos e fúngicos) na razão de um comprimido diluído em 0,5 ml de água

na proporção de 100 g de peso do animal (Molina et al., 2010).

Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do rim

anterior, segundo Gold et al. (1990). Cerca de trinta metáfases foram

19

analisadas de cada exemplar para se estabelecer o número modal, sendo que,

as melhores metáfases foram fotografadas em um microscópio OlympusTM

BX50, (1000x), acoplado à uma câmera digital (Olympus, modelo DP70), e

utilizadas na confecção do cariótipo. A morfologia cromossômica foi

determinada de acordo com Levan et al. (1964). As regiões heterocromáticas

foram evidenciadas a partir da metodologia desenvolvida por Sumner (1972),

enquanto que a detecção das Ag-RONs foi realizada conforme a técnica

descrita por Howell & Black (1980). A coloração com os fluorocromos CMA3 e

DAPI seguiu o protocolo de Carvalho et al. (2005).

Tabela 1. Número de indivíduos utilizados para estudos morfométricos e citogenéticos.

Espécies Análises

citogenéticas

Análises

morfométricas

Coryphopterus glaucofraenum (05♀, 03♂) 13

Ctenogobius boleosoma (02♀, 03♂) 29

Ctenogobius smaragdus (02♀, 02♂) 04

Bathygobius mystacium (02♀, 02♂) 23

Bathygobius soporator (09♀, 11♂) 50

Total 41 109

Análises morfológicas

Para as análises por morfometria geométrica (MG), imagens no formato

JPEG com dimensão 3264x2448, foram obtidas da face lateral esquerda dos

espécimes, com escala de métrica, utilizando-se uma câmera digital Sony H10

(8,1 megapixels) acoplada a um tripé VF WT3540.

O programa tpsUtil foi utilizado para ordenar as imagens dos espécimes

num único arquivo com o formato TPS. O software tpsDig2 (Rohlf, 2006) foi

utilizado para localizar 11 landmarks nas imagens (Figura 1), escolhidos

segundo a classificação de Bookstein (1991). As coordenadas referentes ao

posicionamento espacial de cada landmark foram sobrepostas utilizando-se o

software CoordGen6.

20

Com a utilização do software CVAGen6, análises das variáveis

canônicas (VC) e MANOVA permitiram comparações morfométricas entre as

espécies, testes de alocação e agrupamentos. Para realizar o teste estatístico

ANOVA, D2 (distância de Mahanalobis) e gerar matrizes (Gride) de deformação

comparativa, utilizou-se o programa MorphoJ 1.02b®.

Figura 1. Imagem digitalizada de Coryphopterus glaucofraenum retratando os 11 landmarks utilizados nas análises morfológicas interespecífica em Gobiidae. Descrição esquemática dos landmarks. 1. Ponto distal do osso pré-maxilar; 2. Origem da primeira nadadeira dorsal; 3. Término da primeira nadadeira dorsal; 4. Origem da segunda nadadeira dorsal; 5. Término da segunda nadadeira dorsal; 6. Término da nadadeira anal; 7. Origem da nadadeira anal; 8. Origem da nadadeira pélvica; 9. Margem anterior ocular; 10. Margem posterior ocular; 11. Base superior da nadadeira peitoral.Barra=0,5cm.

Resultados

As análises citogenéticas realizadas nos gobídeos C. glaucofraenum, C.

boleosoma, C. smaragdus, B. mystacium e B. soporator, indicaram um número

diplóide que variou de 40 a 48 cromossomos, com diferentes números

fundamentais, e cariótipos constituídos por elementos metacêntricos,

submetacêntricos, subtelocêntricos e na sua maioria acrocêntricos (Tabela 2).

Em todas as espécies analisadas pôde-se observar Ag-RONs simples

em posição terminal no braço curto de um dos maiores pares do cariótipo. A

única exceção foi observada em B. mystacium, cujos sítios ribossomais

ocupam posição intersticial. A coloração com os fluorocromos evidenciou um

padrão CMA3+/DAPI- verificando-se a presença de regiões ricas em bases GC

nas porções correspondentes às regiões organizadoras de nucléolos para

todas as espécies. Regiões heterocromáticas ricas em GC (CMA3+/DAPI-)

21

estavam presentes na maioria dos cromossomos nas regiões centroméricas e

terminais, das duas espécies do gênero Ctenogobius (Figura 4).

O bandamento C revelou a presença de blocos heterocromáticos

evidentes nas espécies C. smaragdus, B. soporator e B. mystacium e

reduzidos em C. glaucofraenum, preferencialmente localizados na região

centromérica da maioria dos cromossomos, com a presença de alguns blocos

em regiões terminais para todas as espécies e em posição pericentroméricas

em alguns cromossomos de B. mystacium.

A espécie C. glaucoraenum apresentou seus primeiros pares

acrocêntricos com tamanhos relativamente superiores (Figura 7), que configura

a seu cariótipo uma redução desequilibrada de tamanho cromossômico,

diferente do padrão de redução proporcional apresentado pelas demais

espécies analisadas.

Tabela 2. Dados citogenéticos das cinco espécies de Gobiidae analisadas.

Espécies 2n Fórmula

Cariotípica NF Ag-RONs Banda

C CMA3

+

DAPI-

Coryphopterus glaucofraenum 40 2sm+38a 42 Simples (1º T) C e T 1º T

Ctenogobius boleosoma 44 2sm+42a 46 Simples (1º T) - Múltiplas

Ctenogobius smaragdus 48 2sm+46a 50 Simples (1º T) C e T Múltiplas

Bathygobius mystacium 48 2m+4st+42a 54 Simples (5º I) C, T e I 5º I

Bathygobius soporator 48 2m+6st+40a 56 Simples (4º T) C e T 4º T

Tipos cromossômicos, m=metacêntrico, sm=submetacêntrico, st=subtelocêntrico, a=acrocêntrico; T=terminal, C=centromérica, I=intersticial, NF= número fundamental, - técnica não disponível.

22

Figura 2. Cariótipo de Ctenogobius smaragdus a partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm.

Figura 3. Cariótipo de Ctenogobius boleosoma a partir de coloração convencional (a). Em destaque (b) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm.

Figura 4. Metáfase de C. smaragdus (a) e C. boleosoma (b), exibindo marcações CMA3+ na maioria

dos cromossomos em posição centromérica e terminal. Barra=5µm.

CMA3

1º

DAPI

a b c

a b

1º

CMA3

DAPI

b a

23

Figura 5. Cariótipo de Bathygobius soporator a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (4º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm.

Figura 6. Cariótipo de Bathygobius mystacium a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (5º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm.

a b c

DAPI

CMA3

4º

a b c

DAPI

CMA3

5º

24

Figura 7. Cariótipo de Coryphopterus glaucofraenum a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm.

O teste de MANOVA utilizando as variáveis canônicas demonstraram

alto poder discriminante onde as variáveis 1 e 2 explicaram a maior parte da

variação morfológica observada (53%) para as espécies. A variação

morfológica foi significante (Wilks’ Lambda=0.0002; X2=496.9974; df=72;

p<0,001; distância de Mahalanobis >6.0) entre as espécies, permitindo ainda

agrupar com total precisão todos representantes das cinco espécies (Figura 8).

Obteve-se maior proximidade morfológica entre as espécies cogenéricas

pertencentes aos gêneros Bathygobius e Ctenogobius (Mahalanobis

equivalente a 8,36 e 14,24, respectivamente), no entanto, significativamente

distintas para Bathygobius. As espécies destes dois gêneros são discriminadas

entre si ao longo da variável canônica 1. Os exemplares de C. Glaucofraenum

são perfeitamente discriminados de B. soporator e B. mystacium pela variável

canônica 2.

Tabela 3. Resultados post-hoc ANOVA a partir de procrustes, classificadas com a média do centróide, efeito individual, para todos os espécimes em estudo e espécies dos gêneros Bathygobius e Ctenogobius.

Grupos p F df

Todos os espécimes <0,0001 23,55 4

Bathygobius <0,0001 47,58 1

Ctenogobius 0,36* 0,88 1

* Valor não significativo.

a b c

CMA3

1º

DAPI

25

O gride de deformação das cinco espécies (Figura 9) evidencia

variações entre todos landmarks, com modificações mais expressivas quanto

ao posicionamento da boca e altura corporal. No gride referente as diferenças

morfológicas entre espécies do gênero Bathygobius (Figura 10), verificamos

maiores modificações quanto ao posicionamento da boca, altura corporal e

base superior da nadadeira peitoral. O gride comparativo entre espécies do

gênero Ctenogobius (Figura 11), demonstrou variações quanto ao tamanho do

olho, posição da boca, altura corporal e tamanho da nadadeira anal.

Figura 8. Distribuição dos padrões corporais das cinco espécies de Gobiidae analisadas ao longo da primeira e segunda Variável Canônica.

26

Figura 9. Gride de deformação a partir da primeira Variável Canônica, os vetores indicam a direção da deformação sofrida por cada landmark na representação espacial comparativa das cinco espécies de Gobiidae analisadas.

Figura 10. Análise morfométrica comparativa entre B. mystacium e B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa B. mystacium e o desvio vetorial à espécie B. soporator.

Figura 11. Análise morfométrica comparativa, entre as espécies do gênero Ctenogobius, á partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa C. boleosoma e o desvio vetorial a espécie C. smaragdus.

CV1

CV1

CV1

27

Discussão

Os gobídeos analisados demonstraram marcante diversidade cariotípica,

tanto numérica exibido por C. boleosoma (2n=44) e C. glaucofraenum (2n=40),

quanto estrutural entre as espécies C. smaragdus, B. mystacium e B.

soporator, que apresentam mesmo número cromossômico (2n=48), mas

divergências quanto ao número de elementos bibraquiais (NF=50, 54 e 56).

As espécies já analisadas citogeneticamente da família Gobiidae

demonstram cariótipos altamente variáveis (Galetti et al., 2000). Através do

levantamento de dados citogenéticos disponíveis para o grupo (Tabela 4),

encontram-se descrições citogenéticas de 81 espécies, o que corresponde a

4,15%, referente ao total de espécies da família, destas os números diplóides

mais frequentes correspondem a 2n=44 e 46, ambos com frequência

aproximada de 33%, seguido por 2n=48, com cerca de 10%. Acompanhado da

diversificação numérica, identifica-se notável variação na macroestrutura

cariotípica identificada por largos valores de variação para o número de braços

cromossômicos (NF= 38 a 98), com valor modal de 24,7% para espécies com

NF=46.

Os estudos cromossômicos em gobídeos estiveram concentrados nas

décadas de 70-90, desenvolvidos basicamente no continente europeu e

asiático. Diante das metodologias vigentes na maioria dos casos se

restringiram ao estabelecimento dos valores diplóides e macroestrutura

cariotípica, oferecendo informações limitadas ao uso de abordagens

filogenéticas (Caputo, 1998). Apesar disso, os dados disponíveis sugerem

diferentes mecanismos envolvidos na diferenciação cariotípica deste peculiar

grupo de peixes. Os principais mecanismos são as inversões pericêntricas,

fissões e fusões cêntricas, comum a muitos grupos de peixes (Amores et al.,

1990; Phillips & Rab, 2001), estes últimos responsáveis pelas intensas

divergências numéricas em Gobiidae (Cataudella et al., 1973; Thode et al.,

1985; Amores et al., 1990, Klinkhardt, 1992; Caputo et al., 1996, 1997).

Entre os rearranjos cromossômicos, as fusões robertsonianas têm sido

apontadas como um dos mecanismos mais comuns envolvidos na

diferenciação cariotípica deste táxon (Thode et al.,1988; Galetti et al., 2000),

responsável por modificações no número e estrutura cromossômica, relatado

28

para várias espécies de Gobiidae presentes no Mar Negro e Mediterrâneo

(Ene, 2003).

Tabela 4. Dados citogenéticos disponíveis para a família Gobiidae (Perciformes).

Subfamília Espécie 2n Fórmula cariotípica NF Referências Amblyopinae Odontamblyopus rubicundus** (=Gobioides rubicundus)

46 2m+26sm+10st+8a 84 Manna & Prasad (1974)

O. rubicundus 46 4m+16sm+26st/a 66 Arai & Sawada (1975) Trypauchen vagina 46 12m+6sm+10st+18a 74 Khuda-Bukhsh (1978)

Oxudercinae Apocryptes bato

46

24m+10sm+12a

80

Nayak & Khuda-Bukhsh (1987)

Boleophthalmus boddarti 46 46m/sm 92 Subrahmanyan (1969) B. glaucus 46 12m+20sm+2st+12a 80 Manna & Prasad (1974) B. pectinirostris 46 46st/a 46 Arai & Sawada (1975) Periophthalmus modestus** (=Periophthalmus cantonensis)

46 18m+12sm+16st/a 76 “

Pseudapocryptes elongatus** (=Apocryptes lanceolatus)

38 14m+22sm+2st 76 Nayak & Khuda-Bukhsh (1987)

Sicydiinae Sicyopterus japonicus

44

10m+10sm+24a

64

Arai & Fujiki (1979)

Gobiinae Acentrogobius pflaumi

50

48m/sm+2st/a

98

Nogusa (1960)

Amblygobius albimaculatus 44 2m+42st/a 46 Nishikawa et al. (1974) Aphia minuta

1 44 44a 44 Caputo et al. (1999)

“ 43 42a+1st 42 “ “ 42 1m+1st+40a 44 “ “ 42 1M+1m+40a 44 “ “ 41 2M+1st+38a 44 “ Bathygobius fuscus 48 48a 48 Arai & Sawada (1975) B. mystacium 48 2m+4st+42a 54 Presente estudo B. soporator 48 2m+46a 50 Brum et al. (1996) “ “ 2m/sm+46a 50 Cipriano et al. (2002) B. soporator 48 2m+6st+40a 56 Presente estudo Coryphopterus glaucofraenum 40 2sm+38a 42 Presente estudo Elacatinus macrodon** (=Gobiosoma macrodon)

38 38a 38 Musammil (1974)

E. zebrella** (=Gobiosoma zebrella)

38 38a 38 “

Glossogobius fasciatopunctatus 44 10m+28sm+2st+4a 84 Fei & Tao (1987) G. giuris 46 46a 46 Rishi & Singh (1982) Gobiodon citrinus 44 2m+42st/a 46 Arai & Sawada (1974) “ 43 1m+42st/a 44 “ G. quinquestrigatus 44 44a 44 Arai & Fujiki (1979) G. rivulatus 44 44a 44 “ Gobius bucchichi 44 2sm+42a 46 Thode & Alvarez (1983) G. cobitis 46 46a 46 Caputo et al. (1997) G. cruentatus 46 2st+44a 48 Thode & Alvarez (1983) G. fallax

1 38 8m/sm+30a 46 Thode et al. (1988) “ 39 7m/sm+32a 46 “ “ 40 6m/sm+34a 46 “ “ 40 7m/sm+33a 47 “ “ 41 5m/sm+36a 46 “ “ 42 4m/sm+38a 46 “ “ 43 3m/sm+40a 46 “ G. niger

1 52 2m+4sm+16st+30a 74 Vitturi & Catalano (1989)

“ 51 3m+4sm+16st+28a 74 Caputo et al. (1997) “ 50 4m+4sm+16st+26a 74 “ “ 49 5m+4sm+16st+24a 74 “ G. paganellus

1 48 2sm+46a 50 “

Gobiusculus flavescens 46 6m/sm+40a 52 Klinkhardt (1992) Mesogobius batrachocephalus 30 16m+14a 46 Ivanov (1975) Neogobius melanostomus** (=N. cephalarges)

46 46a 46 Vasil’ev (1985)

N. fluviatilis 46 46a 46 “

N. gymnotrachelus1 46 46a 46

Vasil’ev & Grogoryan(1992)

N. melanostomus 46 46a 46 Vasil’ev (1985) N. rhodioni 46 46a 46 Vasil’ev & Vasilieva (1994)

29

Padogobius bonelli** (= P. martensi)

46 1m+3sm+2st+40a 52 Cataudella et al. (1973)

Pomatoschistus lozanoi 37 3m+12sm+10st+12a 62 Webb (1980) P. microps 46 4m+16sm+20st+6a 86 Klinkhardt (1989) P. minutus 46 4m+16sm+16st+10a 82 “ “ “ 18sm+18st+10a 82 “ P. norvegicus 32 10m+10sm+8st+4a 60 Webb (1980) P. pictus 46 22m/sm+12st+12a 80 Klinkhardt (1992) Ponticola constructor** (=Neogobius constructor)1 42 4m/sm+38a 46 Vasil’ev & Vasilieva (1994)

P. cyrius** (=Neogobius cyrius)1

36 -- -- “

P. eurycephalus** (=Neogobius eurycephalus)1

32 12m+2sm+18a 46 Ene (2003)

“ 31 13m+2sm+16a 46 Ene (2003) “ 30 14m+2sm+14a 46 “ P. kessleri** (=Neogobius kessleri)

46 46a 46 Vasil’ev (1985)

Proterorhinus marmoratus 46 46a 46 Rab (1985) Rhinogobius similis** (=Gobius similis)

44 -- -- Nogusa (1960)

Zosterisessor ophiocephalus (=Gobius ophiocephalus)1

46 2m/sm+44a 48 Caputo et al. (1996)

Z. ophiocephalus

46 46a 46 Vasil’ev (1985)

“ 45 1st+45a 47 “ Gobionellinae Acanthogobius lactipes** (=Aboma lactipes)

40 40a 40 Arai & Sawada (1974)

A. flavimanus 44 44st/a 44 “ “ “ 36st+8a 80 Arai & Kobayashi (1973) “ “ 10m/sm/st+34a 54 Arai & Sawada (1975)

Awaous grammepomus 46 46st/a 46 Khuda-Bukhsh & Barat (1987)

A. strigatus 46 (♀) X1X1X2X2 -- Souza et al. (1998) “ 45 (♂)X1X2Y -- “

A. tajasica 46 46a 46 Stange & Passamani (1986)

Chaenogobius annularis 44 18sm+26st/a 62 Arai & Sawada (1975) “ “ 36m/sm+8a 80 Arai et al. (1974) “ “ 44a 44 Nogusa (1960) Gymnogobius castaneus** (=Chaenogobius castaneus)

44 36m/sm/st+8a 80 Nishikawa et al. (1974)

G. isaza**(=Chaenogobius isaza)

44 12sm+32st/a 56 Arai & Sawada (1975)

G. urotaenia** (=Chaenogobius urotaenia)

44 -- -- Nogusa (1960)

“ 42 14sm+28a 56 Yamada (1967) Chaenogobius annularis** (=Chasmichthys dolichognatus)

44 44st/a 44 Arai & Sawada (1975)

Chasmichthys gulosus 44 44st/a 44 “ “ “ 16m/sm/st+28a 60 Nishikawa et al. (1974) Ctenogobius boleosoma 44 2sm+42a 46 Presente estudo C. smaragdus 48 2sm+46a 50 Presente estudo C. shufeldti** (=Gobionellus shufeldti)

48 48a (♀) 48 Pezold (1984)

“ 47 46a+1m (♂) 48 “ Mugilogobius abei** (=Gobius abei)

46 -- -- Nogusa (1960)

Gillichthys mirabilis 44 12sm+32a 56 Chen & Ebeling (1971) Luciogobius grandis 44 -- -- Arai (1981) L. guttatus 44 -- -- Arai & Kobayashi (1973) Pterogobius elapoides 44 14sm+30st 88 “ P. zonoleucus 44 14sm+30st 88 Arai & Sawada (1975) Quietula guaymasiae 42 6m+4sm+32a 52 Cook (1978) Q. y-cauda 42 42a 42 “ Rhinogobius brunneus 44 44a 44 Nishikawa et al. (1974) R. flumineus 44 44a 44 Arai & Kobayashi (1973) R. flumineus** (=Tukugobius flumineus)

44 44a 44 Nadamitsu (1974)

R. giurinus 44 44a 44 Nishikawa et al. (1974) Tridentiger obscurus 44 10m/sm+34a 54 Arai et al. (1974) T. trigonocephalus 44 28m/sm/st+16a 72 Arai et al. (1973)

30

**Nomenclatura válida para a espécie; 1Espécies que apresentam polimorfismos cromossômicos decorrentes de fusão Robertsoniana.

Os rearranjos cromossômicos aparentemente envolvidos na

diversificação de Gobiinae (e. B. soporator, B. mystacium e C. glaucofraenum)

e Gobionellinae (e. C. boleosoma e C. smaragdus) são as inversões

pericêntricas, mecanismo de diversificação mais frequente em Perciformes

(Molina & Galetti, 2004), e fusões em tandem ou robertsonianas.

Sugere-se um cariótipo basal para Gobiidae caracterizado por 2n=46

cromossomos acrocêntricos, a partir do qual o aumento do número de

cromossomos bi-braquiais representaria cariótipos mais derivados (Vasil’ev &

Grigoryan, 1993). Apesar de C. glaucofraenum apresentar 2n=40, número

inferior ao considerado basal, os primeiros pares acrocêntricos apresentam

tamanho superior de forma desproporcional em relação aos demais, indicando

a ocorrência de fusão em tandem para a formação dos mesmos, mecanismo

comum observado na diversificação cariotípica de outros gobídeos como G.

paganellus (Amores et al., 1990).

Apresentando cariótipos caracterizados por 2n=48, as espécies C.

smaragdus, B. mystacium e B. soporator, possuem padrões cariotípicos

considerados derivados para família, com possibilidade de ação de diferentes

processos à estruturação cromossômica dessas espécies. É provável que

inversões pericentroméricas seguidas de fissões cromossômicas, tenham

fornecido um passo crucial no estabelecimento do valor diplóide destas

espécies e influenciado à formação dos valores diplóides presentes nas

espécies Yongeichthys criniger (Arai & Sawada, 1974), Ctenogobius shufeldti

(Pezold, 1984), Gobius niger (Vitturi & Catalano, 1989) e G. paganellus (Caputo

et al., 1997).

As divergências na macroestrutura cariotípica entre B. mystacium

(2n=48; 2m+4st+42a) e B. soporator (2n=48; 2m+6st+40a), podem ser

explicadas pela ocorrência de uma inversão pericentromérica, envolvendo as

regiões portadoras dos sítios ribossomais. A presença de um número maior de

elementos acrocêntricos no cariótipo de B. mystacium (NF=54) poderia indicar

a ocorrência de um cariótipo basal em relação ao de B. soporator (NF=56).

“ 46 16sm+6st+24a 68 Fei & Tao (1987) Yongeichthys criniger** (=Ctenogobius criniger) 50 34m/sm+6st+10a 90 Arai & Sawada (1974)

31

Entretanto a presença de RONs intersticiais em um par cromossômico

acrocêntrico em B. mystacium (5o par) indica que inversões pericêntricas

ocorreram tanto em cromossomos acrocêntricos como, neste caso, podem ter

ocorrido em cromossomos bibraquiais.

Outras espécies de gobídeos têm demonstrado marcações

cromossômicas de Ag-RONs intercaladas a regiões heterocromáticas ricas em

bases GC (Mandrioli et al., 2001; Ene, 2003), fato observado para as espécies

C. glaucofraenum, C. boleosoma, C. smaragdus, B mystacium e B. soporator,

podendo favorecer a ocorrência de rearranjos envolvendo os pares portadores

destas regiões (Vicari et al., 2003).

É provável que o cariótipo mais basal dentre as espécies analisadas,

seja o de C. boleosoma (NF=46), o qual apresenta RONs em cromossomos bi-

braquiais, como as demais apresentam cariótipos considerados derivados para

o grupo, é possível que esta localização de RONs seja uma característica

plesiomórfica entre as espécies analisadas.

Registros de RONs disponíveis para gobídeos são escassos, entretanto

indicam diferentes padrões de disposição (Ene, 2003). Caputo (1998)

identificou quatro fenótipos de RONs para gobídeos: (1) posição terminal-

centromérica em braços curtos de um par de cromossomos

acrocêntricos/subtelocêntricos em G. fallax (Thode et al., 1983),

Potamoschistus minutus (Klinkardt, 1992; Caputo, 1998), P. pictus (Klinkardt,

1992), P. marmoratus (Caputo, 1998); (2) braços curtos de dois pares de

cromossomos submetacêntricos em Gobiusculus flavescens (Klinkardt, 1992) (3) porção terminal no braço longo em Zosterisessor ophiocephalus (Caputo,

1998) e (4) intersticial/pericêntrica em um par de cromossomos acrocêntricos

Gobius cobitis (Caputo, 1998). Ene (2003) aponta mais dois possíveis

fenótipos, que corresponderia: (5) região pericentromérica em um par

acrocêntrico Proterohinus marmoratus (Ra´b, 1985) e (6) posição

pericentromérica em cromossomo metacêntrico N. eurycephalus (Ene, 2003).

Apesar da constatação de RONs múltiplas em Gobius fallax (Thode et

al.,1983), G. paganellus (Caputo, 1998), Gobiusculus flavescens (Klinkardt,

1992) e Gobius niger (Mandrioli et al., 2001) o padrão encontrado caracterizado

por marcações do tipo simples nas espécies analisadas é considerado um

caráter comum não apenas aos teleósteos, como também para a maioria dos

32

vertebrados (Ameniya & Gold, 1986).

Mesmo com total distinção entre as espécies, a partir da macroestrutura

cariotípica, o mapeamento de regiões heterocromáticas, heterocromatinas GC-

ricas e cístrons ribossomais, fornece indícios da existência em algum grau de

homeologias cromossômicas entre as espécies. A presença destas regiões

associadas configurando marcações simples em cromossomos de tamanho e

configuração semelhante pode ser indício de uma provável manutenção de

regiões cromossômicas sintênicas ao longo da diferenciação de linhagens

filéticas para família Gobiidae.

A presença de grandes blocos heterocromáticos nas porções terminais

dos cromossomos como nos cariótipos das espécies de Gobiidae, poderia ter

um papel facilitador em eventos de fusões em tandem ou robertosonianas.

Nesta família, heterocromatinas heterogêneas tem sido identificadas em

diversas espécies, como G. paganellus, G. niger, G. cobitis e Zosterisessor

ophiocephalus (Caputo et al., 1997), o que associa a variabilidade

cromossômica encontrada no grupo às características estruturais e

composicionais das heterocromatinas centroméricas e teloméricas.

A existência de heterocromatinas GC-ricas localizadas em posição

centromérica e terminal dos cromossomos das espécies do gênero

Ctenogobius, C. boleosoma e C. smaragdus, é similar aquelas encontradas na

maioria dos cromossomos mono e bi-braquiais de Neogobius eurycephalus,

que exibe cariótipos com 2n=30, 31, 32 e mesmo número de braços

cromossômicos (NF=46), resultado de múltiplas fusões entre elementos mono-

braquiais (Ene, 2003).

Para os peixes marinhos, onde o isolamento geográfico é menos comum

que em sistemas de água doce, o surgimento de cromossomos sexuais pode

ter desempenhado um papel decisivo no processo de especiação (Galetti et al.,

2000), sendo gerados frequentemente por eventos robertsonianos (Almeida &

Toledo, 1984; Brum et al., 1992). Em outras espécies do gênero Ctenogobius,

como C. shufeldti o mecanismo de translocação robertsoniana está envolvida

na origem de um sistema sexual múltiplo X1X1X2X2\X1X2Y (Pezold, 1984). De

forma geral a presença de heterocromatinas ricas em bases GC

equilocalmente à sítios ribossomais, têm sido também apontadas como

precursoras de rearranjos em outras espécies (Vicari et al., 2003).

33

Diferentemente de outros grupos Perciformes (Molina, 2006), em

Gobiidae existe uma estreita relação entre rearranjos cromossômicos e

processo de especiação. Um fator decisivo para grande diversidade

cromossômica que a família Gobiidae apresenta, parece estar relacionado à

sua diversidade ecológica e evolutiva que propiciou ocupação de múltiplos

habitats. A maioria dos membros desta família são bentônicos, habitantes de

recifes de corais cuja alta produtividade (Fraser & Currie, 1996), elevada

complexidade espacial (Lingo & Szedlmayer, 2006) e complexidade ecológica

tem sido implicada nos altos níveis de diversidade (Bellwood & Wainwright,

2002). Estes fatores associados levam a uma alta taxa de cladogênese que

aliado a eventos vicariantes paleogeográficos favorecem a especiação dos

peixes residentes (Alfaro et al., 2007).

Adaptações ecológicas se traduzem em modificações morfológicas

substanciais. Muitas espécies de peixes apresentam grande variação

morfológica, entretanto possuem cariótipos crípticos (Molina et al., 2005).

Análises citogenéticas e de morfometria geométrica em cinco espécies da

família Haemulidae, demonstraram elevada constância citogenética, e

completa diversidade morfológica relacionada a adaptações ecomorfológicas

funcionais para cada espécie (Motta Neto & Molina, 2010). Associadas,

técnicas genéticas e de comparações morfológicas vêm sendo crescentemente

utilizadas na família Gobiidae (Taylor & Hellberg, 2003; Tornabene et al., 2010),

auxiliando na compreensão dos processos envolvidos na diversificação

filogenética de diferentes espécies.

A perfeita distinção dos padrões corporais entre as cinco espécies,

associada a cariótipos conspicuamente diversos indica que o processo de

especiação na família atrelou processos adaptativos a eventos alopátricos em

populações capazes de fixar novos rearranjos. Esta diversidade cariotípica

presente associada à morfológica, sugerem uma dinâmica na evolução

cariotípica compatível com grupos dulcícolas (Cipriano et al., 2008) sujeitos a

intensas fragmentações populacionais, aliado a diversificações morfológicas

adequadas a exploração de habitats peculiares (Pouilly et al., 2003; Freitas et

al., 2005; Ready et al., 2006; Concheiro-Pérez et al., 2007).

Morfologicamente as modificações encontradas entre as espécies estão

relacionadas à altura corporal, posicionamento da boca e posição da nadadeira

34

peitoral. Alterações no posicionamento da nadadeira peitoral e aumento da

altura, refletem adaptações relacionadas ao processo de natação, com

implicações diretas sobre o uso de habitat (Wainwright et al., 2002) e

interações bióticas (Werner, 1977). As demais adaptações, referentes ao

posicionamento ou tamanho da boca, indicam diferentes graus de

especialização alimentar para as espécies, podendo estar relacionado ao

tamanho potencial da presa (Piorski et al., 2005). Espécies do mesmo gênero

demonstraram maior proximidade morfológica como B. soporator/ B. mystacium

e C. smaragdus/ C. boleosoma, sendo as últimas não significantemente

discriminadas entre si.

Os perfis ecomorfológicos para Bathygobius e Ctenogobius, sugerem

diferenças no padrão alimentar, devido a modificações no posicionamento da

boca e características natatórias, com diferenças no posicionamento das

nadadeiras peitorais, responsáveis pela elevação da parte anterior do corpo por

estar à frente do centro de gravidade (Gosline, 1971) e altura corporal menor,

garantindo a B. mystacium e C. boleosoma maior maneabilidade, agilidade

(Breda et al., 2005) e estabilidade local (Horn & Gibson, 1988).

Os representantes da família Gobiidae estudados demonstraram

diversidade cariotípica e morfológica, evidência para o grupo de relação entre

processo especiativo e modificação cromossômica. Devido a grande

diversidade de espécies e imprecisões taxonômicas, a utilização de

ferramentas citogenéticas e de morfometria geométrica associadas, podem

auxiliar a identificação da composição real desta família e processos evolutivos

que permitiram tamanha diversificação.

35

Referências

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Teleosts? Evidence from the pufferfishes and their allies (Order Tetraodontiformes). Evolution, 61-9: 2104–2126.

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44

4.2 Capítulo II

Análises citogenéticas e morfométricas interpopulacionais no

peixe marinho Bathygobius soporator (Gobiidae - Perciformes)

Lima Filho, P. A. & Molina, W. F.

Resumo

Bathygobius soporator, também conhecido como amboré, espécie bentônica de baixa vagilidade, habitante de zonas intertidais apresenta uma extensa distribuição anfi-Atlântica. Diante de condições propícias ao fracionamento populacional e indícios de ausência de coesão genética em toda sua área de distribuição, persistem dúvidas sobre o real status desta espécie. Aqui são comparadas por meio de técnicas citogenéticas e de morfometria geométrica quatro populações geograficamente distribuídas em largo espaço oceânico, ao longo do litoral brasileiro, no Maranhão (MA), Rio Grande do Norte (RN), Bahia (BA) e Atol das Rocas (AR), único atol do Atlântico. Exceto para a amostra do AR, todas as amostras exibiram um cariótipo similar, com 2n=48 cromossomos, composto por 2m+6st+40a (NF=56). As Ag-RONs são simples localizadas em posição terminal no braço curto do 4o par (st). Blocos heterocromáticos estão distribuídos em regiões centroméricas e terminais da maioria dos pares cromossômicos. A população do AR exibe uma fórmula cariotípica diferenciada (2n=48; 28st+20a; NF=76) com ausência do par metacêntrico característico de outras populações da espécie. Os sítios ribossomais nesta amostra se apresentam sobre o braço curto do 1o par cromossômico (st). Morfologicamente as populações continentais (MA, RN e BA) apresentam médias significativamente distintas, com alguma sobreposição em parte da amostra, entretanto exibem total distinção com a população do AR. A combinação de dados citogenéticos e morfométricos sugere que as populações continentais aparentemente se encontram respondendo a regimes seletivos distintos, mas sem indicações de divergências cromossômicas dentro do nível de análise empregado, por outro lado, os padrões conspicuamente diversos na população do Atol das Rocas, parecem confirmar a existência de uma nova espécie.

Palavras-chave: Gobiidae; citogenética de peixes; Atol das Rocas;

morfometria geométrica; nova espécie.

45

Cytogenetics and morphometric analyses interpopulation in

marine fish Bathygobius soporator (Gobiidae – Perciformes)

Lima Filho, P. A. & Molina, W. F.

Abstract

Bathygobius soporator, also known as Amboró, benthic specie of low vagile, it lives in intertidal zones and it has an extensive distribution amphi-Atlantic. Given the conditions conducive to population fragmentation and lack of evidence of genetic cohesiveness throughout its distribution area, there remain doubts about the real status of this species. Here, they are compared by means of cytogenetic techniques and geometric morphometric four populations geographically distributed in wide ocean, along the Brazil's coast: Maranhao (MA), Rio Grande do Norte (RN), Bahia (BA) and Atol das Rocas (AR), the only atoll in the Atlantic. Except for the sample from AR, all samples showed a similar karyotype with 2n=48 chromosomes, consisting by 2m +6 st +40 a (FN=56). As Ag-RONs are simply located in terminal position on short arm of 4o pair (st). Heterochromatic blocks are distributed in centromeric regions and terminals of the most of the chromosomes pairs. The population from AR displays dinstinctive karyotype (2n=48; 28st+20a; NF=76) without metacentric pair, characteristic of the populations from the specie. The ribosomal sites in this sample are presented on the short arm from chromosome first pair (st). Morphologically, the continental populations (MA, RN and BA) have significantly different averages, with some overlap in the sample, however they show total distinction from AR population. The combination of cytogenetic and morphometric data suggests that continental populations are apparently responding to different selective regimes, but there are not indications of chromosomal differences within the analysis level considered, on the other hand, conspicuously different patterns in the population from Atol das Rocas , seem to confirm the new specie existence.

Keywords: Gobiidae; fishes cytogenetics; Atol das Rocas, geometric morphometrics, new specie.

46

Introdução

A família mais especiosa presente no ambiente marinho, Gobiidae é

composta por indivíduos de pequeno porte presentes em todos os mares

tropicais e subtropicais, sendo constituída por cerca de 1.950 espécies (Nelson,

2006). Dentre os gobídeos a espécie Bathygobius soporator (Valenciennes,

1837), apresenta distribuição anfi-atlântica, no oeste do Atlântico distribui-se da

Flórida (EUA) ao Rio Grande do Sul (BRA) (Cervigo´n, 1966; Robins & Ray,

1986; Miller & Smith, 1989; Burns et al., 2010), e no Atlântico leste, pode ser

encontrado na costa da África, do Senegal a Angola (Cervigo´n, 1966; Miller &

Smith, 1989; Afonso et al., 1999).

Apesar da ampla distribuição geográfica, B. soporator apresenta

deslocamento limitado, é uma espécie bentônica sedentária, euritérmica,

eurialina (Fanta, 1997). Litorâneo residente (Demartini, 1999), pode ser

encontrado em poças de maré na zona intertidal de regiões costeiras e ilhas

oceânicas. Apresenta acentuado comportamento de homing (Gibson &

Yoshiyama, 1999) e provavelmente quando em habitat adequado se limite a

uma área reduzida por toda sua vida, uma vez que os adultos exibem

fidelidade à poça ou toca (Martins et al., 2006).

A princípio, tamanha distribuição geográfica pode ser explicada pela

difícil caracterização de barreiras físicas absolutas no ambiente marinho, que

associado a fase larval livre natante e influência de correntes marinhas, altas

taxas de dispersão seriam promovidas (Imron et al., 2007), ocasionando

conectividade entre as populações marinhas e possibilitando processos

genéticos evolutivos interdependentes (Luttikhuizen, 2003). No entanto, com o

deslocamento limitado de B. soporator associado a características reprodutivas

como ovos adesivos, curto período pelágico larval (Tavolga, 1953; Peters,

1983) e características ambientais locais, sua capacidade de dispersão e

efetivação em fluxo gênico torna-se questionável e o isolamento de

populações, seguido de especiação, possível.

Diante de condições propícias ao fracionamento populacional, não pode

ser descartada a possibilidade que B. soporator constitua um complexo de

espécies, como muitas outras marinhas, que a princípio detinham de grande

distribuição geográfica, e foram consideradas sob um exame minucioso,

47

complexos morfologicamente similares, mas geneticamente distintas

(Knowlton, 2000).

Uma vez que a família Gobiidae apresenta elevada diversidade

cariotípica (Galetti et al., 2000), e que especiações são frequentemente

associadas a rearranjos cromossômicos (Mandrioli et al., 2001), visando

identificar possíveis diferenciações populacionais cariotípicas e morfológicas, o

presente trabalho compara populações de B. soporator geograficamente

distribuídas no atlântico sul, ao longo do litoral brasileiro e no Atol das Rocas,

por meio de técnicas citogenéticas e de morfometria geométrica.

Material e métodos

Foram coletados um total de 170 exemplares de Bathygobius soporator

provenientes de quatro áreas da costa nordeste brasileira, praia do Araçagi, em

São Luís (MA) (2°28'14.06"S, 44°15'49.15"O), praia do Farol da Barra, em

Salvador (BA) (13°0'39.61"S, 38°31'27.21"O), praia de Búzios, em Nísia

Floresta (RN) (5°41'57.41"S, 35°11'34.71"O) e Atol das Rocas (3º51’’S,

33º49’’W) (Tabela 1). Os espécimes foram capturados com uso de rede de

confecção própria, submetidos aos protocolos de obtenção de cromossomos

mitóticos e fotografados em campo, ou acondicionados em sacos plásticos com

água e oxigênio e transportados às dependências do Laboratório de Genética

de Recursos Marinhos na UFRN, sendo mantidos em aquários aerados até

serem fotografados para análise morfológica e se procedesse à realização de

preparações cromossômicas. Para identificação taxonômica utilizou-se a chave

de classificação de Bohlke & Chaplin (1993).

Preparações cromossômicas

Precedente aos métodos de obtenção de cromossomos metafásicos, os

exemplares foram submetidos à estimulação mitótica, “in vivo” com duas

aplicações intramuscular/peritoneal de Aminovac® (complexo de antígenos

bacterianos e fúngicos) na razão de um comprimido diluído em 0,5 ml de água

na proporção de 100g de peso do animal (Molina et al., 2010).

Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do rim

48

anterior, segundo Gold et al. (1990). Cerca de trinta metáfases foram

analisadas para cada exemplar para se estabelecer o número modal, sendo

que, as melhores metáfases foram fotografadas em um microscópio OlympusTM

BX50 (1000x), acoplado à uma câmera digital (Olympus, modelo DP70), e

utilizadas na confecção do cariótipo. A morfologia cromossômica foi

determinada de acordo com Levan et al. (1964).

As regiões heterocromáticas foram definidas segundo Sumner (1972), a

detecção das marcações Ag-RONs foi realizada conforme a técnica descrita

por Howell e Black (1980). A coloração com os fluorocromos CMA3 e DAPI

seguiu o protocolo de Carvalho et al. (2005).

Tabela 1: Número de indivíduos coletados, seus respectivos pontos de coleta e sua utilização para estudos morfométricos e citogenéticos.

Pontos de Coleta Análises

morfométricas Análises

citogenéticas Maranhão 50 14 (09♀ / 05♂)

Rio Grande do Norte 50 20 (09♀ / 11♂)

Bahia 50 16 (10♀ / 06♂)

Atol das Rocas 20 10 (06♀ / 04♂)

Total 170 60

*Todos os espécimes coletados foram utilizados para análises morfométricas.

Análises morfológicas

Para as análises por morfometria geométrica (MG), imagens no formato

JPEG com dimensão 3264x2448, foram obtidas da face lateral esquerda dos

espécimes, com escala métrica, utilizando-se uma câmera digital Sony H10

(8,1 megapixels) acoplada a um tripé VF WT3540.

O programa tpsUtil foi utilizado para ordenar as imagens dos espécimes

num único arquivo com o formato TPS. O software tpsDig2 (Rohlf, 2006) foi

utilizado para localizar nove landmarks nas imagens (Figura 1), escolhidos

segundo a classificação de Bookstein (1991). As coordenadas referentes ao

posicionamento espacial de cada landmark foram sobrepostas utilizando-se o

software CoordGen6.

Com a utilização do software CVAGen6, análises das variáveis

canônicas (VC) e MANOVA permitiram comparações morfométricas entre as

49

populações, testes de alocação e agrupamentos. Para realizar o teste

estatístico ANOVA, D2 (distância de Mahanalobis) e gerar matrizes (Gride) de

deformação comparativa utilizou-se o programa MorphoJ 1.02b®.

Figura 1. Imagem digitalizada de B. soporator retratando os nove landmarks definidos para análises morfológicas interpopulacionais. Descrição esquemática dos landmarks: 1. Extremidade distal do osso pré-maxilar; 2. Origem da primeira nadadeira dorsal; 3. Término da primeira nadadeira dorsal; 4. Origem da segunda nadadeira dorsal; 5. Término da segunda nadadeira dorsal; 6. Término da nadadeira anal; 7. Origem da nadadeira anal; 8. Origem da nadadeira pélvica; 9. Base infra-ocular medial. Barra=1,5cm.

Resultados

As populações de B. soporator provenientes da costa brasileira (litoral do

MA, RN e BA) apresentaram características citogenéticas semelhantes, com

2n=48, e fórmula cariotípica consistindo de 2m+6st+40a (NF=56).

Sítios Ag-RONs foram localizados no braço curto do quarto par

cromossômico subtelocêntrico (Figura 2). Estas regiões se mostraram

heterocromáticas apresentando um padrão CMA3+ DAPI-. Além destas, o

bandamento C evidenciou segmentos heterocromáticos em regiões

centroméricas na maioria dos cromossomos e terminal em alguns, estendendo-

se nos braços curtos de cromossomos subtelocêntricos.

Os espécimes provenientes do Atol das Rocas demonstraram 2n=48,

estrutura cariotípica de 28st+20a (NF=76) e padrões diferenciados quando

submetidos aos diferentes bandamentos, comparados aos apresentados pelas

demais populações. A impregnação com nitrato de prata revelou sítios Ag-

RONs em posição terminal no braço curto do 1º par cromossômico (Figura 3),

intercalado a blocos heterocromáticos ricos em GC (CMA3+/DAPI-). O

50

bandamento C revelou a presença de conspícuos blocos heterocromáticos em

posição centromérica em grande parte dos cromossomos, de forma mais

evidente em braços curtos em todos os cromossomos subtelocêntricos.

Figura 2. Cariótipo de B. soporator para populações contientais (MA, RN e BA) à partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (4º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra= 5µm.

Figura 3. Cariótipo de B. soporator população do Atol das Rocas, a partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra= 5µm.

a b c

4º

CMA3

DAPI

a c

1º

CMA3

DAPI

b

51

As populações continentais exibiram médias morfométricas

significativamente diferentes (Figura 5), embora apresentem indivíduos com

morfologia intermediária entre os grupos (Tabela 2). A população do Atol das

Rocas por sua vez, apresentou total distinção morfológica (distância de

Mahalanobis >4,9) em relação a todas as populações continentais (Figura 4).

Tabela 2. Porcentagem de indivíduos alocados para cada população de B. soporator e suas interfaces baseados na CVA.

Origem da População Identidade comum* Intermediários** N

Pop. MA 76% 24% 50

Pop. RN 90% 10% 50

Pop. BA 82% 18% 50

Pop. Atol das rocas 100% 0% 20

*Porcentagem de indivíduos da população que compartilham um morfotipo comum; **morfótipos correspondentes a outras populações.

Através de MANOVA, as variáveis canônicas 1 e 2 utilizadas para o

estudo mostraram-se significativas para F (p<0,0001), explicando cerca de

63,5% e 30,5% respectivamente, da variação morfológica observada para as

populações. Os resultados da ANOVA a partir de análises procrustes

confirmaram a distinção morfológica das populações continentais (Tabela 3).

Tabela 3. Resultados post-hoc ANOVA a partir de procrustes, classificadas com a média do centroide, efeito individual, entre as populações continentais.

População p F df

RN x MA < 0, 0001 25,69 1

RN x BA < 0, 0001 33,15 1

MA x BA < 0, 0001 390,24 1

52

Figura 4. Distribuição das amostras de B. soporator ao longo da primeira e segunda variável canônica (63,5% e 30,5% da variância respectivamente), a partir das variáveis morfométricas.

Figura 5. Distribuição das populações continentais amostradas de B. soporator ao longo da primeira e segunda variável canônica (76,2% e 23,5% da variância respectivamente). Os símbolos em destaque indicam a média morfométrica de cada população.

Ao verificarmos os grides de deformação comparativos, a partir da

primeira variável canônica entre as populações, verificamos modificações em

todos os landmarks. O gride comparativo formado para populações do RN x

53

Atol das Rocas (Figura 6) demonstra um morfotipo para espécies do AR com

significativa redução no conjunto de nadadeiras dorsais e anal estabelecendo

modificações no seu posicionamento, aumento corporal e da região anterior.

Entre as populações do RN x MA (Figura 7) observa-se para a população do

MA redução na altura corporal e modificações no posicionamento da boca e

base infra-ocular medial. A comparação entre as populações RN x BA (Figura

8) aponta modificações expressivas na altura corporal, região anterior mais

fusiforme e alterações no posicionamento da nadadeira anal e pélvica para

população da BA.

Figura 6. Gride comparativo entre população continental e insular de B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa população do RN e o desvio vetorial população do Atol das Rocas.

Figura 7. Gride comparativo entre populações continentais de B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa população do RN e o desvio vetorial população do Maranhão.

54

Figura 8. Gride comparativa entre populações continentais de B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa população do RN e o desvio vetorial população da Bahia.

Discussão

Os dados citogenéticos para as populações continentais monstraram-se

coincidentes, com 2n=48 e fórmula cariotípica consistindo de 2m+6st+40a

(NF=56). No entanto a população do Atol das Rocas com 2n=48 apresentou

estrutura caríotipica 28st+20a (NF=76) e total distinção morfológica (distância

de Mahalanobis >4,9) com as populações continentais, estes novos dados

associados à distinção molecular constatada (Lima et al., 2005), deixa claro a

existência de uma nova espécie para o gênero Bathygobius presente no oeste

do Atlântico.

Teleósteos marinhos apresentam baixa variabilidade no número de

cromossomos e alta uniformidade na macro-estrutura cariotípica (Cipriano et

al., 2008), entretanto representantes da família Gobiidae demonstram

cariótipos altamente variáveis (Caputo, 1998; Ene, 2003) e uma estreita relação

entre rearranjos cromossômicos e processo de especiação (Cap. I), que auxilia

a identificação de espécies crípticas através de caracteres cromossômicos e

marcadores citotaxonômicos.

As diferenças encontradas na estrutura cariotípica das populações

continentais e AR podem ser atribuídas a diferentes mecanismos de

modificação cromossômica como eventos de inversões pericêntricas frequente

55

em Perciformes (Molina & Galetti, 2004), fissão cromossômica e fusões

Robersonianas, são importante fonte de diversificação cariotípica não apenas

para família Gobiidae (Cataudella et al., 1973; Thode et al., 1985; Vitturi &

Catalano, 1989; Amores et al., 1990; Klinkhardt, 1992; Caputo et al., 1996;

1997), como para Pomacentridae (Ojima & Kashiwagi, 1981) e Cichlidae

(Martins et al., 1995).

O gênero Bathygobius apresenta 26 espécies (Eschmeyer, 2010),

destas apenas quatro possuem descrição citogenética B. mystacium (Cap. I),

B. soporator litoral brasileiro (Brum et al., 1996; Cipriano et al., 2002), B.

soporator presente no AR e B. fuscus (Arai & Sawada, 1975) costa japonesa.

Estas espécies compartilham 2n=48 cromossomos, caracterizado como padrão

aos Perciformes (Galetti et al., 2000), indicativo de derivação cariotípica para

representantes da família Gobiidae, que considera 2n=46 cromossomos

(NF=46) cariótipo ancestral/basal (Vasil’ev & Grigoryan, 1993). Este aumento

no número cromossômico pode ser decorrente de inversões pericêntricas

seguidos de fissão cromossômica, processos aparentemente comum ao

gênero e ocasional a família, presentes em Yongeichthys criniger (Arai &

Sawada, 1974), Ctenogobius shufeldti (Pezold, 1984), C. smaragdus (Cap. I),

Gobius niger (Vitturi & Catalano, 1989), G. paganellus (Caputo et al., 1997).

A quantidade de heterocromatina, assim como seus aspectos

composicionais possuem um papel importante na diversificação cariotípica de

muitos peixes (Caputo et al., 1997; Canapa et al., 2002; Molina et al., 2002;

Molina & Galetti, 2002). A análise da heterocromatina constitutiva presente no

cariótipo da população do AR aponta blocos conspícuos, deflagrando a

ocorrência de um cariótipo mais sujeito à macro mudanças cariotípicas. É

provável que a ocorrência de inversões pericêntricas tenha configurado tais

mudanças, justificado pelo elevado número de cromossomos bi-braquiais com

braços curtos completamente heterocromáticos, que normalmente é apontado

como resultado de inversões cromossômicas (King, 1993).

A heterocromatina constituiva apresentada em populações continentais

dispõe de posição centromérica e terminal em alguns pares cromossômicos,

com blocos na sua maioria pouco heterocromáticos, distintos do padrão

apresentado pela população AR. Entretanto seu posicionamento levanta

indícios da ocorrência de fusão Robertsoniana à formação dos cromossomos

56

metacêntricos, devido sua ocupação em posição centromérica evidente e

diferencial aos demais blocos heterocromáticos. Estudos realizados nos

gobídeos G. niger e N. eurycephalus com polimorfismo cromossômico,

apontam características estruturais e de composição da heterocromatina

centromérica GC-ricas, como facilitadoras a ocorrência de fusões

Robertsonianas (Caputo et al.,1997; Ene, 2003).

O uso de Ag-RONs constitui um efetivo marcador citotaxonômico para

peixes (Affonso, 2000). Sua utilização tem ajudado a formular hipóteses

filogenéticas em alguns grupos (Cross et al., 2006) e na identificação de fauna

críptica, como aqui apresentado. A presença de único par portador de sítios

compartilhado às populações continentais e AR, localizadas em posição

terminal-centromérica em braços curtos de cromossomos

submetacêntricos/subtelocêntricos é comum a diferentes espécies de Gobiidae

como Potamoschistus minutus (Klinkardt, 1992; Caputo, 1998), P. pictus

(Klinkardt, 1992), P. marmoratus (Caputo, 1998) e idicativo de possível

característica plésiomórfica às espécies presentes no litoral brasileiro (Cap. I).

A associação entre RONs e heterocromatina CMA3+ observada nas

populações analisadas, é freqüentemente descrita em peixes (Ameniya & Gold,

1986; Almeida-Toledo et al., 1996), sendo as regiões GC-ricas propensas a

uma alta taxa de recombinação que pode favorecer processos de fusões ou

fissões cêntricas (Redi et al., 1990), e quando adjacentes, sobrepostas ou

intercaladas às RONs pode favorecer rearranjos aos pares portadores (Vicari et

al., 2003).

Apesar da proximidade do AR com a costa brasileira, sua colonização

pela espécie B. soporator é proveniente da região caribenha e parece ter

ocorrido após as espécies da costa brasileira e caribenha terem se separado

(Lima et al., 2005). As diferenças apresentadas na macroestrutura cariotípica,

posicionamento dos sítios Ag-RONs equilocais à heterocromatinas ricas em

bases GC evidenciadas pela dupla coloração apresentando um padrão

CMA3+/DAPI- e blocos heterocromáticos, entre populações continentais e AR

são significativas e podem ser utilizadas como indicativo carioevolutivo à

espécies do gênero Bathygobius, presentes na província biogeográfica

caribenha e brasileira.

57

Estudos citogenéticos realizados em populações localizadas na baía de

Paranaguá, Paraná e litoral do Rio de Janeiro apresentaram cariótipos com

2n=48 cromossomos, 2m+46a (NF=50) (Brum et al., 1996; Cipriano et al.,

2002). Apesar da diferença ao padrão encontrado no presente trabalho, a não

detecção de cromossomos submetacêntricos pode ser atribuída ao menor grau

de condensação cromossômica e não utilização de técnicas citogenéticas para

detecção das regiões organizadoras de nucléolos (Ag-RONs), heterocromatina

constitutiva (Banda C) e coloração com os fluorocromos CMA3 e DAPI.

No ambiente marinho barreiras físicas entre populações de peixes são

difíceis de caracterizar (Joyeux et al., 2001), a fase larval pelágica garante

potencial à dispersão (Palumbi, 1994; Mora & Sale, 2002) e pode promover

conectividade entre populações. Entretanto, a identificação de quebra

filogeográfica entre populações de gobídeos no mar do Caribe, com retenção

local de larvas ao redor das ilhas (Taylor & Hellberg, 2005; 2006) traz indícios

da possibilidade de especiação na presença de barreiras geográficas

transitórias ou fracas.

Análises moleculares em diferentes populações continentais de B.

soporator demonstraram alta estruturação populacional, sugerindo níveis

limitados no fluxo gênico desta espécie ao longo da costa brasileira (Lima et al.,

2005). A presença de deslocamento limitado associado a características

reprodutivas como ovos adesivos, curto período pelágico larval (Tavolga, 1953;

Peters, 1983) e eventos vicariantes históricos, podem ter contribuído com este

cenário de redução do fluxo gênico.

Espécies do gênero Bathygobius presentes na costa atlântica americana

são consideradas altamente conservadas morfologicamente, o que dificulta a

determinação do número de espécies válidas para o gênero, usando apenas

caracteres morfológicos (Tornabene et al., 2010). Caracteres merísticos

tradicionais usados em chaves taxonômicas não são capazes de distinguir as

amostras populacionais de B. soporator presente no Atol das Rocas e da costa

brasileira (Lima et al., 2005). Entretanto, a análise utilizando morfometria

geométrica evidenciou total distinção morfológica entre estas duas populações,

o que demonstra eficácia e sensibilidade à técnica para o reconhecimento de

58

fauna críptica e aplicabilidade a resolução de problemas taxonômicos presente

para o gênero Bathygobius.

A associação de técnicas genéticas e morfométricas vêm auxiliando

extensivamente no reconhecimento de espécies crípticas de gobídeos e seus

mecanismos evolutivos atuantes. Evidências de especiação simpátrica

(ecológica) foram demonstradas no gênero Gobiodon, onde a separação em

nível de espécie não seguia a geografia, mas a mudanças no coral anfitrião

(Munday et al., 2004). Taylor & Hellberg (2003) analisando o gobídeo

Elacatinus evelyna, evidenciaram uma abrupta descontinuidade genética entre

populações separadas por apenas 20 km, com diferenças nos padrões de

coloração por habitat, os quais teriam desempenhado papel importante em sua

diversificação.

Análises morfométricas apontaram distinção à população AR de B.

soporator, que demonstrou apresentar estrutura corporal mais fusiforme com

região anterior e altura corporal maiores, modificações no posicionamento da

boca e do olho e redução nas nadadeiras anal e dorsais, em relação à

população continental do RN. Estas modificações morfológicas em conjunto

podem garantir maior velocidade de locomoção (Breda et al., 2005),

estabilidade na natação (Bond, 1979) e especialização alimentar (Piorski et al.,

2005), adaptações estas que podem estar relacionadas às condições

ecológicas peculiares dessa região insular.

Morfologicamente as populações continentais de B. soporator

apresentam médias corporais significantemente distintas. A principal variação

morfológica relaciona-se a altura corporal, que demonstra elevação progressiva

conforme o aumento da latitude. Embora a variação térmica entre as

populações distribuídas não seja visivelmente drástica (média anual 57 anos:

MA 26,3ºC e BA 25,2ºC) (EMBRAPA, 2003), ela pode estar relacionada ao

aumento da altura média do corpo das populações distribuídas no sentido

Norte-sul. Esta distribuição clinal se adequa a regra de Bergman que associa o

aumento da latitude/diminuição da temperatura com um aumento do volume

corporal do organismo (Gaston et al., 2008), descrita para diversos grupos de

vertebrados (Lomolino et al., 2006) inclusive peixes (Macpherson & Duarte,

1994; Smith & Brown, 2002) na costa brasileira, como pomacentrídeo

Abudefduf saxatilis (Molina et al., 2006).

59

O gobídeo B. soporator é uma espécie encontrada principalmente em

áreas intertidais habitando poças de maré, com alta capacidade de reação a

mudanças rápidas, desenvolvendo ao longo de sua evolução estratégias

fisiológicas para sobreviver em ambientes variáveis (Fanta, 1997). Estas

características evitam que a espécie tenha que se deslocar, o que associado

ao comportamento reprodutivo e limitação no fluxo gênico, sugerem a seleção

de morfótipos melhores adaptados a cada área.

Em função de características ambientais, muitas espécies de peixes

apresentam considerável plasticidade fenotípica que as permite aumentar sua

aptidão em determinado ambiente (Mérona et al., 2009), sugere-se que a

capacidade de um padrão genotípico, produzir múltiplos fenótipos em resposta

a variações no meio ambiente (Pfennig et al., 2010), seja uma importante

estratégia de adaptação à populações que enfrentam ambientes varáveis

(Stearns, 1989; Scheiner, 1993), desempenhando um papel importante na sua

diversificação (West-Eberhard, 1989).

As variações intrapopulacionais e interpopulacionais identificadas na

espécie são comuns em peixes. A variação morfológica intrapopulacional é

normalmente relacionada ao habitat dos indivíduos (Smith & Skúlason, 1996),

onde a competição intraespecífica atua na correlação entre a morfologia e

escolha do habitat (Wilson & Turelli, 1986). Variações morfológicas do tipo

interpopulacionais normalmente estão relacionadas à disponibilidade de

recursos e competição com outras espécies (Lindsey, 1981; Lavin & McPhail,

1985, 1986; Magnan, 1988; Mittelbach et al., 1992; Walker, 1997).

Apesar das variações no posicionamento da boca nas populações

continentais de B. soporator, análises alimentares em três populações

distribuídas ao longo da costa brasileira, Pará (Norte), Bahia (Nordeste) e São

Paulo (Sudeste), evidenciaram semelhanças tróficas caracterizando um hábito

onívoro, com consumo principal de crustáceos e algas (Lopes & Oliveira-Silva,

1998; Corrêa & Uieda, 2007; Oliveira-Raiol et al., 2011), discernível ao padrão

exibido pela espécie na costa da Nigéria, Atlântico Oriental (Lawson & Thomas,

2010). Estas características ecológicas diferenciadas ao longo da extensa

distribuição geográfica de B. soporator, quando associadas ao reduzido fluxo

gênico apresentado por suas populações ao longo da costa brasileira, sugerem

uma distinção marcante de B. soporator nas porções Leste e Oeste do

60

Atlântico. Estudos genéticos e morfométricos são indicados para auxiliar esta

possível imprecisão taxonômica.

A combinação de variação genética e morfológica tem sido aplicada no

esclarecimento do padrão evolutivo de gênero Bathygobius. Análises utilizando

ambas as abordagens realizadas em representantes da costa da Flórida (EUA)

à Venezuela e áreas insulares, como Bahamas e Belize, permitiram identificar

duas novas espécies para o gênero, Bathygobius geminatus e Bathygobius

antilliensis, presentes no oeste do Atlântico (Tornabene et al., 2010).

A diversidade encontrada na família Gobiidae tem sido explicada

principalmente por processos vicariantes levando à alopatria (Huyse et al.,

2004). Os dados cromossômicos aliados as análises morfológicas parecem

corroborar um cenário evolutivo de fragmentações populacionais e adaptação a

novos habitats como promotores da extrema diversidade presente no grupo.

61

5. CONCLUSÕES

· Os gobídeos analisados demonstram marcante diversidade cariotípica e morfológica, evidenciando estreita relação entre rearranjos cromossômicos e processo de especiação para família;

· Rearranjos cromossômicos envolvidos na diversificação de B. soporator, B. mystacium, C. glaucofraenum, C. boleosoma e C. smaragdus são as inversões pericêntricas, mecanismos fissão e fusão cromossômica;

· A diversidade cariotípica e morfológica sugere uma dinâmica na evolução cariotípica, compatível com grupos dulcícolas sujeitos a intensas fragmentações populacionais;

· A utilização da citogenética e morfometria geométrica demonstra eficiência à identificação das espécies da família Gobiidae, mesmo quando crípticas como B. soporator e B. mystacium;

· Os dados citogenéticos e morfométricos para populações continentais e AR de B. soporator confirmam a existência de uma nova espécie para o gênero Bathygobius presente no oeste do Atlântico;

· As populações de B. soporator provenientes da costa brasileira (litoral do MA, RN e BA) apresentam morfotipos distintos. A principal variação morfológica relaciona-se a altura corporal e se adequa a regra de Bergman;

· Os dados cromossômicos aliados as análises morfológicas corroboram um cenário evolutivo de fragmentações populacionais e adaptação a novos habitats como promotores da extrema diversidade presente na família.

62

Referências

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