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NELYANE NAYARA MARTINS DE SANTANA

O NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO E O FOLHETO INTERGENICULADO DO

MORCEGO (Artibeus planirostris): PROJEÇÃO RETINIANA E

CARACTERIZAÇÃO NEUROQUÍMICA

NATAL/RN

2015

NELYANE NAYARA MARTINS DE SANTANA

O NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO E O FOLHETO INTERGENICULADO DO

MORCEGO (Artibeus planirostris): PROJEÇÃO RETINIANA E

CARACTERIZAÇÃO NEUROQUÍMICA

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em

Psicobiologia da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte.

Orientador: Expedito Silva do Nascimento Jr.

Co-Orientadora: Rovena C.G.J. Engelberth

NATAL/RN

2015

Título: O núcleo supraquiasmático e o folheto intergeniculado do morcego (Artibeus

planirostris): projeção retiniana e caracterização neuroquímica

Autor: Nelyane Nayara Martins de Santana

Data de defesa: 30/09/2015

Banca examinadora:

Prof. Dr. Eudes Euler de Souza Lucena

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - UERN

Prof. Dr. Fernando Vagner Lobo Ladd

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

“O conhecimento é orgulhoso por ter aprendido; a sabedoria é humilde por

não saber mais. Saber o que é possível é o começo da felicidade.”

(William Cowper)

AGRADECIMENTOS

“A Deus por me dar o presente da vida.”

“Aos meus pais, Nely e Joaquim, por toda dedicação, esforço e

ensinamentos de princípios éticos e morais.”

“Aos meus familiares pelo apoio, incentivo e generosidade para alcançar os

meus objetivos.”

“Aos meus colegas do Laboratório de neuroanatomia e do Laboratório de

estudos neuroquímicos pela paciência e por me ensinarem técnicas de pesquisa”

“Ao Prof. DR. Expedito Silva do Nascimento Júnior por ter me aceitado como

sua orientanda e pelos ensinamentos acadêmicos.”

“A Profª DRª Rovena C.J.G. Engelberth por ter me guiado nessa longa

jornada, por nunca desistir de mim e me apoiar nos momentos difíceis. Obrigada!”

“Ao Prof. DR. Ruthnaldo Rodrigues Melo de Lima, pela ajuda na elaboração

dos Charts”.

“Aos meus amigos Damião Diniz, Mariana Hortência, Fladjany Emanuelle,

Lara Laíse e Renata Pêssoa, pelo carinho, apoio e pelos momentos de alegria.”

“Aos colegas da Secretaria de Planejamento e Finanças de Parnamirim por

me proporcionarem um ambiente saudável de trabalho.”

“A Jamaranúbia de Melo Marinho pela compreensão, companherismo e

inspiração que me fazem ser mais forte a cada dia, além de me ensinar que não

existem barreiras para o amor.”

“A Maria Lúcia de Melo pelo acolhimento e por me permitir fazer parte da sua

família.”

“A minha avó Maria Leonardo dos Santos, que mesmo no céu, está guiando

os meus passos.”

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática simplificada do Sistema de

Temporização Circadiana de mamíferos................................................................ 16

Figura 2: Representação esquemática simplificada das vias

sincronizadoras....................................................................................................... 18

Figura 3: Representação esquemática simplificada das vias eferentes,

enfatizando as porções do NSQ............................................................................. 23

Figura 4: Representação esquemática simplificada das vias aferentes do

FIG.......................................................................................................................... 25

Figura 5: Representação esquemática simplificada das vias eferentes do FIG

em ratos.................................................................................................................. 26

Figura 6: Árvore molecular das famílias de morcegos existentes. Família do

modelo experimental em destaque........................................................................ 31

Figura 7: Macho adulto jovem do morcego Artibeus planirostris........................... 32

Figura 8: Distribuição geográfica do Artibeus planirostris..................................... 33

Figura 9: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do

A. planirostris nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

citoarquitetura do NSQ pelo método de Nissl........................................................ 41

Figura 10: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo

do A. planirostris nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a

distribuição de terminais retinianos imunorreativos a Ctb no NSQ........................ 42

Figura 11: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do NSQ do

A. planirostris, mostrando o padrão de imunorreatividade a VP (A) e VIP (B) no

nível caudal; a NPY (C) no nível médio e 5-HT (D) no nível rostral....................... 44

Figura 12: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do NSQ do

A. planirostris, mostrando o padrão de imunorreatividade a CB no nível caudal;

a CR (B) e GFAP (D) no nível médio e PV (C) no nível rostral.............................. 46

Figura 13: Esquemas obtidos a partir de fotomicrografias em campo claro de

secções coronais do NSQ do A. planirostris, no nível rostral, médio e caudal,

ilustrando o contorno citoarquitetônico; a distribuição de terminais retinianos

imunorreativos a CTb; distribuição de pericários positivos para VP e VIP........ 47



ilustrando a distribuição de fibras/terminais imunorreativos a NPY e 5-HT e

pericários positivos para CB e CR.....................................................................

48



ilustrando a distribuição de pericários positivos para PV e GFAP.....................

49

Figura 16: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do

encéfalo do A. planirostris nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C),

mostrando a citoarquitetura do FIG pelo método de Nissl................................

51


encéfalo do A. planirostris, no nível rostral (A), médio (B) e caudal (C),

evidenciado a distribuição de terminais retinianos imunorreativos a Ctb no

complexo geniculado lateral..............................................................................

52


complexo geniculado lateral do A. planirostris, mostrando o padrão de

imunorreatividade a NPY (A) e GFAP (C) no nível caudal e 5-HT (B) no nível

rostral.................................................................................................................

54



imunorreatividade a PLCa: CB (A) no nível rostral; CR (B) no nível médio e

PV (C) no nível caudal....................................................................................... 56


secções coronais do complexo geniculado lateral do A. planirostris, no nível

rostral, médio e caudal, ilustrando o contorno citoarquitetônico; a distribuição

de terminais retinianos imunorreativos a CTb; distribuição de pericários

positivos para NPY e fibras/terminais imunorreativas a 5-HT...........................

57


secções coronais do complexo geniculado lateral do A. planirostris, no nível

rostral, médio e caudal, ilustrando a distribuição de pericários positivos para

positivos para CB, CR, PV e GFAP...................................................................

58

Quadro 1: Especificações de anticorpos primários e anticorpos secundários

utilizados no procedimento imuno-histoquímico com as suas referidas

diluições e fabricantes.......................................................................................

39

Tabela 1: Conteúdo neuropeptidérgico e de PLCa no NSQ do Artibeus

planirostris..........................................................................................................

45

Tabela 2: Conteúdo neuropeptidérgico e de PLCa no FIG do Artibeus

planirostris..........................................................................................................

55

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HT - Serotonina

5-HT - IR - Imunorretivo (a) a 5-HT

BSA - Albumina de soro bovino

CB - Calbindina

CB - IR- Imunorretivo (a) a CB

CE - Ciclo claro/escuro

CR - Calretinina

CRF - Curva de resposta dependente de fase

CR - IR- Imunorretivo(a) a CR

CTb - Subunidade B da toxina colérica

DABtetra - Diaminobenzidina

DMH - Núcleo dorsomedial do hipotálamo

DMSO - Dimetilsufúrico

ENK - Encefalina

FIG - Folheto intergeniculado

Fos - Proteína do gene c-fos

GABA - Ácido gama amino-butírico

GFAP - Proteína acídica fribilar glial

GFAP - IR Imunorreatividade a GFAP

GLD - Núcleo geniculado lateral dorsal

GLV - Núcleo geniculado lateral ventral

GRP - Peptídeo liberador de gastrina

ipRGC - Células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis da retina

NEuN - Proteína nuclear neuronal

NPG - Núcleo pré-geniculado

NPY - Neuropeptídeo Y

NPY - IR - Imunorretivo (a) a NPY

NSQ - Núcleo supraquiasmático

NT - neurotensina

PBS - Tampão fosfato

PLCa Proteínas ligantes de cálcio

PV - Parvalbulmina

PVN- Núcleo paraventricular do hipotálamo

PVT - Núcleo paraventricular do tálamo

STC - Sistema de temporização circadiana

TGH - Tracto geniculo-hipotalâmico

TRH - Tracto retino-hipotalâmico

VIP - Polipeptídeo intestinal vasoativo

VIP- IR - Imunorretivo (a) a VIP

VP - Vasopressina

VP- IR - Imunorretivo (a) a VP

ZSPV - Zona subparaventricular

SUMÁRIO

RESUMO........................................................................................................................... 13

ABSTRACT....................................................................................................................... 14

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 15

1.1 Ritmos biológicos...................................................................................................... 15

1.2 Sistema de temporização circadiana (STC).............................................................. 15

1.2.1 Vias sincronizadoras........................................................................................ 16

1.2.2 Núcleo supraquiasmático (NSQ)..................................................................... 19

1.2.3 Vias eferentes.................................................................................................. 22

1.2.4 Folheto intergeniculado (FIG).......................................................................... 23

1.4 O morcego Artibeus planisrostris.............................................................................. 29

2. JUSTIFICATIVA........................................................................................................ 31

3. OBJETIVOS.............................................................................................................. 32

3.1 Geral.......................................................................................................................... 32

3.2 Específicos................................................................................................................ 32

4. METODOLOGIA....................................................................................................... 33

4.1 Sujeitos...................................................................................................................... 33

4.2 Procedimentos experimentais................................................................................... 33

4.2.1 Anestesia......................................................................................................... 33

4.2.2 Injeção intra-ocular de CTb.............................................................................. 34

4.2.3 Perfusão........................................................................................................... 35

4.2.4 Remoção dos encéfalos................................................................................... 36

4.2.5 Microtomia e Técnica de Nissl......................................................................... 36

4.2.6 Imuno-histoquímica.......................................................................................... 36

4.2.7 Montagem de lâminas e intensificação em Tetróxido de Ósmio...................... 38

4.3 Análise das lâminas.................................................................................................. 38

5. RESULTADOS.......................................................................................................... 40

5.1 Núcleo supraquiasmático.......................................................................................... 40

5.1.1 Citoarquitetura.................................................................................................. 40

5.1.2 Projeção retiniana............................................................................................ 40

5.1.3 Neuroquímica................................................................................................... 43

5.2 Folheto intergeniculado............................................................................................. 50



5.2.3 Neuroquímica................................................................................................... 53

6. DISCUSSÂO............................................................................................................. 59




6.1.3 Neuroquímica................................................................................................... 61

6.1.4 Organização neuroquímica do NSQ do Artibeus planirostris........................ 66




6.2.3 Neuroquímica................................................................................................... 67

6.3 Discussão funcional e filogenética da organização neuroquímica do NSQ e FIG... 70

7. CONCLUSÃO........................................................................................................... 71



7.3 Nicho temporal e os centros circadianos.................................................................. 72

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................................... 73

REFERÊNCIAS......................................................................................................... 74

ANEXOS................................................................................................................... 99

13

RESUMO

O sistema de temporização circadiana (STC) compreende um conjunto de

estruturas neurais, que incluem vias aferentes, como projeções retinianas, que

permitem a sincronização dos ritmos biológicos aos ciclos ambientais; um

marcapasso central que gera o sinal circadiano e vias eferentes, que conectam o

marcapasso aos efetores comportamentais. Entre os componentes centrais do STC,

destaca-se o núcleo supraquiasmático (NSQ), classicamente reconhecido como a

estrutura neural que rege a ritmicidade biológica, e o folheto intergeniculado (FIG) do

complexo geniculado lateral do tálamo, modulador do marcapasso. Nesse estudo,

ambos os centros circadianos foram avaliados quanto a sua citoarquitetura, padrão

de inervação retiniana e conteúdo neuroquímco por meio da técnica de Nissl, de

traçador neural e técnicas imuno-histoquímicas no morcego Artibeus planirostris,

microquiróptero comum no território brasileiro. Com base nessas técnicas foi

possível observar que o NSQ, no nível rostral, exibe um formato aproximadamante

triangular e no nível médio e caudal, assume um contorno arredondado, além de

apresentar inervação retiniana bilateral, com leve predominância contralateral. O

NSQ do Artibeus planirostris é dotado de células imunorreativas a vasopressina

(VP), polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP), calbindina (CB) e calretinina (CR);

fibras/terminiais imunorreativos a neuropeptídeo Y (NPY) e serotonina (5-HT), além

de marcação para proteína acídica fribilar glial (GFAP). O FIG recebe projeção

retiniana bilateral e nos níveis rostral e médio exibe a forma de um fino folheto

interposto entre o GLD e o GLV e a nível caudal expande-se medialmente

contornando o GLV, além de conter células que expressam NPY, CB e CR;

terminais imunorreativos a 5-HT e marcação para GFAP. Esse é o primeiro estudo a

examinar o STC dessa espécie de quiróptero. Os dados indicam que o NSQ e FIG

no Artibeus planirostris apresenta aferências retinianas e conteúdo neuroquímico

similar a outras espécies de mamíferos. Em contrapartida, o NSQ desse morcego

transcende os esquemas organizacionais clássicos descritos na literatura científica.

Estudos moleculares e hodológicos são necessários para estabelecer uma divisão

específica dessa estrutura nessa espécie de quiróptero.

Palavras-chaves: Núcleo supraquiasmático; Folheto intergeniculado; Sistema de

temporização circadiana; Projeção retiniana; Neuroquímica; Artibeus planirostris.

14

ABSTRACT

The circadian timing system (CTS) comprises a set of neural structures that

include input pathways, such retinal projections, which allow the synchronization of

the biological rhythms to environmental cycles; a central circadian pacemaker, which

generates the circadian signal and output pathways connecting the pacemaker to the

behavioral effectors. Among the major components of the STC, highlight the

suprachiasmatic nucleus (SCN), classically known as the neural structure that

governs biological rhythmicity, and the intergeniculate leaflet (FIG) of the thalamic

lateral geniculate complex, modulator pacemaker. In this study, both circadian

centers were evaluated in respect to their cytoarchiteture, pattern of the retinal

innervations and chemical content with a Nissl stain, neural tracer and

imunohistochemical techniques in bat Artibeus planirostris, common microchiropteran

in Brazil. Based on these techniques was observed in rostral sections, the SCN had

an approximately triangular shape and in middle and caudal sections, this nucleus

assumed an ellipsoidal contour. It receives bilateral retinal innervations, with discrete

contralateral predominance and contains vasopressin (VP), vasoactive intestinal

polypeptide (VIP), calbindin (CB) e calretinin (CR) immunoreactive cell bodies;

neuropeptide Y (NPY) and serotonin (5-HT) imunopositive fibers/terminals, besides

to glial fibrillary acidic protein (GFAP) labeling. The IGL contains NPY, CB and CR

immunoreactive perikarya and receives a bilateral retinal projection. The rostral and

middle IGL had a leaflet shape between the DLG and VLG. At a caudal level it had a

descending portions which outlines de VLG medially. This is the first report

examining the CTS of these species of chiropteran. The results indicate that retinal

input and chemical content of the SCN and IGL in Artibeus planirostris are similar

other mammalian species. In contrast, the SCN of these bat transcend the classical

organizational schemes proposed in the scientific literature. Hodological and

molecular studies are needed to stablish a specific division of this structure in these

species of chiropteran

Key-words: Suprachiasmatic nucleus; Intergeniculate leaflet; Circadian timing

system; Retinal projections; Neurochemistry; Artibeus planirostris.

15

1. INTRODUÇÃO

1.1 Ritmos biológicos

Ao longo do processo evolutivo, os organismos desenvolveram diferentes

estratégias para manter uma organização temporal interna em resposta as mais

distintas oscilações ambientais (Rusak e Zucker, 1975; Hut e Beersma, 2011). Essa

dimensão temporal se expressa na forma de oscilações nos parâmetros

comportamentais e fisiológicos, denominada de ritmos biológicos (Cavalcante et al.,

2006).

A ritmicidade biológica é geneticamente determinada (Lowrey e Takahashi,

2011) e apresenta propriedades bem definidas, com o oscilações endógenas que se

repetem periodicamente (Tomotani e Oda, 2012), sincronização ao ciclo claro-

escuro (CE), ritmo em livre-curso sob condições constantes e compensação interna

da temperatura (Ukai e Ueda, 2010). Além disso, os ritmos biológicos são ubíquos,

estando presentes em vários níveis de organização e complexidade dos seres vivos

(Menna-Barreto e Díez-Noguera, 2011). Essa natureza ubíqua da ritmicidade

biológica sugere que estas oscilações conferem uma vantagem adaptativa ao

organismo, quanto ao ajustamento fisiológico e comportamental frente a alterações

ambientais (Foster e Kreitzman, 2013).

Para a adaptação dos organismos as flutuações ambientais, foi crucial o

desenvolvimento de um sistema auto-sustentado, continuamente oscilante, com

sincronização fótica ou não-fótica, responsável pela gênese e regulação dos ritmos

biológicos, o Sistema de Temporização Circadiana (STC) (Cavalcante et al., 2006)

(Fig.1). O STC é o aparato neural que orquestra os ritmos do corpo para coordenar

ações e ajustá-las as pistas ambientais (Kronfeld-Schor et al., 2013). Dessa

maneira, esse sistema aumentou a habilidade inata de organismos sobreviverem às

constantes modificações do meio, possibilitando-os antecipar eficientemente aos

mais diferentes eventos periódicos (Vitaterna et al., 2001; Panda et al., 2002).

1.2 Sistema de temporização circadiana (STC)

Para o organismo estabelecer uma organização temporal interna, é

necessário captar a informação ambiental, processá-la e responder adequadamente

a esse estímulo. Nessa perspectiva, o STC é responsável por realizar eficientemente

essa função (Golombek e Rosenstein, 2010). Em mamíferos, esse sistema é

16

composto basicamente por 3 elementos distintos: (1) vias aferentes, também

denominada de vias sincronizadoras, que permitem a sincronização dos ritmos

biológicos aos ciclos ambientais, (2) marcapasso central, que gera o sinal circadiano

e (3) vias eferentes, que conectam o marcapasso aos efetores comportamentais

(Rosenwasser, 2009).

Contudo, várias evidências têm demonstrado que o STC apresenta uma

configuração complexa, constituída de múltiplos osciladores hierarquicamente

organizados e interativos (glândula adrenal, coração, fígado e rins), no qual, o

marcapasso central coordenaria uma ampla rede de osciladores secundários, tanto

a nível de sistema nervoso central, quanto a nível periférico (Albrech, 2012).

Figura 1: Representação esquemática simplificada do Sistema de Temporização

Circadiana de mamíferos. Adaptado de Moore, 1999.

1.2.1 Vias sincronizadoras

O NSQ recebe informações ambientais e do estado fisiológico do indivíduo

para assegurar a correta sincronização com os ciclos geofísicos e endógenos. Essa

informação é conduzida para o marcapasso central através de projeções de uma

variedade de regiões encefálicas, mas principalmente da retina (Hendrickson et al.,

1972), do folheto intergeniculado (FIG) (Card e Moore, 1989) e os núcleos da rafe

(Meyer-Bernstein e Morin, 1996) (Fig. 2).

17

O tracto retino-hipotalâmico (TRH) conduz informação luminosa, sendo

formado por fibras originárias das células ganglionares intrinsecamente

fotossensíveis da retina (ipRGC) do tipo M1 e M2 (Baver et al., 2008; Paul et al.,

2009). Essas células expressam o fotopigmento melanopsina, sendo constituintes do

sistema não-formador de imagem (Dibner, 2010; Albrecht, 2012). Essa via percorre o

nervo óptico e destaca-se do quiasma óptico, ramificando-se bilateralmente no NSQ

(Hendrickson et al., 1972; Moore e Lenn, 1972; Moore, 1973). O TRH é considerado

a principal via sincronizadora dos ritmos circadianos ao ciclo claro/escuro, pois na

ausência de todas as outras vias visuais, esse trato é suficiente para manter a

sincronização comportamental (Klein e Moore, 1979) e a sua lesão resulta em perda

da sincronização, com persistência dos ritmos em livre-curso (Johnson et al., 1988a).

Embora o NSQ receba bilateralmente aferências retinianas através do TRH

em todos os mamíferos, esse padrão de inervação varia consideravelmente entre as

espécies, apresentando distribuição das projeções retinianas quase completamente

contralateral em sagüi (Costa et al.,1999), predominantemente ipsilateral em

mussaranho (Tokunaga et al.,1992) ou com quase completa simetria bilateral em

carneiro (Tessonneaud et al.,1994). Adicionalmente, no rato (Canteras et al., 2011),

gato (Murakami et al.,1989), rato-toupeira da Palestina (Negroni et al.,1997) e mocó

(Nascimento Jr et al., 2010), o TRH se ramifica predominantemente na porção

ventral do NSQ. Já no degus (Goel et al.,1999) e Arvicanthis niloticus (Smale e

Boverhof, 1999), o referido trato apresenta inervação ventral e lateral. Em

marsupiais, como o gambá-da-Virgínia (Didelphis virginiana) e Monodelphis

domestica (Cassone et al.,1988), o TRH ramifica-se dorsomedialmente. Já em

hamster (Johnson et al.,1988b) e camundongo esse trato preenche praticamente

todo o núcleo (Carneiro, 2000; Abrahamson e Moore, 2001).

Em ratos foi demonstrado que o TRH está dividido em dois componentes:

TRH-medial e TRH-lateral. O primeiro emerge diretamente do quiasma óptico,

inervando o NSQ, região peri-supraquiasmática e o núcleo hipotalâmico anterior,

fornecendo uma densa aferência bilateral para o NSQ, com clara prevalência

contralateral. O segundo se projeta para a área pré-óptica lateral e principalmente

para a parte retinorrecipiente da zona ventral do grupo anterior da área hipotalâmica

lateral e apresenta duas fontes área de fibras, um grupo de axônios que percorre

lateralmente o TGH-medial, e outra ascendente do tracto óptico (Canteras et al.,

2011).

18

A segunda via é o tracto genículo-hipotalâmico (TGH). Essa projeção aferente

ao NSQ é originada de neurônios retinorrecipientes do FIG e incide na porção

ventrolateral do NSQ (Harrington et al., 1987; Moga e Moore, 1997),

desempenhando a sua função através do NPY e do GABA (Harrington et al., 1985;

Moore e Card, 1994). O TGH foi confirmado anatomicamente em rato (Takatsuji e

Tohyama, 1989; Moore e Card, 1994), hamster (Harrington et al.,1985;1987; Morin e

Blanchard, 1995), degus (Goel et al.,1999) e Arvicanthis niloticus (Gall et al., 2014).

A terceira fonte de aferências para o NSQ é representada pela projeção

serotonérgica proveniente dos núcleos da rafe, mais especificamente, do núcleo

mediano (Moga e Moore, 1997; Yamakawa e Antle, 2010). Além disso, projeções

ascendentes serotonérgicas do núcleo dorsal da rafe inervam o FIG (Meyer-

Bernstein e Morin, 1996; Hay-Schmidt et al., 2003; Blasiak e Lewandowisk,

2003).Evidências indicam que a 5-HT originária do núcleo mediano da rafe modula

os efeitos fóticos do NSQ (Pontes et al., 2010) pelo controle da liberação de

glutamato a partir do TRH (Morin, 1999).

Figura 2: Representação esquemática simplificada das vias sincronizadoras.

Adaptado de Samuels et al. 2006. NSQ, núcleo supraquiasmático; FIG, folheto

intergeniculado; DR, núcleo dorsal da rafe; MR, núcleo mediano da rafe

19

1.2.2 Núcleo supraquiasmático (NSQ)

Dentre os componentes do STC de mamíferos, destaca-se um par de

aglomerados neuronais localizados no hipotálamo anterior, imediatamente dorsal ao

quiasma óptico e de cada lado do terceiro ventrículo, denominado de Núcleo

Supraquiasmático (NSQ) (van den Pol, 1991). Embora apresente variações quanto a

forma tridimensional, volume, densidade e tamanho de células, entre todas as

espécies estudadas, como rato (van den Pol, 1980; Moore, 1982; Morin et al., 2006),

camundongo (Abrahamsom e Moore, 2001; Morin et al., 2006), hamster (Card e

Moore, 1984), mocó (Kerodon rupestris) (Nascimento Jr et al., 2010) e diferentes

tipos de primatas (Moore, 1983; Bons et al., 1990; Mai et al., 1991; Costa et al.,

1998; Rocha et al., 2014), essa estrutura é considerada o marcapasso mestre,

responsável pelo controle da geração cíclica dos processos fisiológicos e

consequentemente dos comportamentos expressos pelos indivíduos (Cavalcante et

al., 2006; Golombek e Rosenstein, 2010).

Para corroborar a importância do NSQ, na geração dos ritmos biológicos,

diferentes abordagens experimentais foram utilizadas, como técnicas de ablações

(Moore e Eichler, 1972), eletrofisiológicas (Albus et al., 2005), neuroquímicas (Costa

et al., 1998; Morin, 2007), moleculares (Albrecht et al., 2001; Ueda et al., 2005) e de

transplante de tecido fetal (Lehman et al., 1987; Ralph et al., 1990).

Classicamente, os NSQ´s são núcleos heterogêneos quanto a sua natureza

neuroquímica e vias de projeções (aferentes e eferentes), sendo subdividido em

duas subregiões distintas, o cerne ou porção ventrolateral e a casca ou porção

dorsomedial (van den Pol, 1980; Mammen e Jagota, 2011). Essa subdivisão

evidencia a compartimentalização funcional dessa estrutura, tanto na decodificação

da informação fótica, quanto na geração da ritmicidade intrínseca de cada porção

(Moore et al., 2002; de la Iglesia et al., 2004).

Fenotipicamente, o cerne é definido pela presença de células imunorreativas

ao peptídeo intestinal vasoativo (VIP), peptídeo liberador de gastrina (GRP) (Antle e

Silver, 2005) e calbindina (CB), além de apresentar, embora de maneira escassa,

neurotensina (NT) e calretinina (CR) (Moore et al., 2002; Welsh et al., 2010).

Adicionalmente, essa porção recebe aferências retinianas, FIG e da área pré-tectal

através dos seus respectivos tractos, TRH, TGH e pretecto-hipotalâmico (Morin,

2013), bem como, projeções de fibras serotonérgicas do núcleo mediano e dorsal da

rafe (Meyer-Bernstein e Morin, 1999; Hay-Schmidt et al., 2003). Já em relação as

20

suas eferências, o cerne projeta para diferentes núcleos hipotalâmicos, como a área

peri-supraquiasmática, a zona subparaventricular (SZPV) e a área tuberal ventral;

talâmicos, incluindo o núcleo paratenial e o paraventricular (PVT) e

prosencenfálicos, abrangendo o núcleo septal lateral (Leak e Moore, 2001).

Acredita-se que a função do cerne pode ser usar informações visuais primárias e

secundárias para sincronizar os mecanismos do NSQ e convergir essa informação

para a casca e para regiões inervadas por essa própria porção (Leak e Moore,

2001).

A casca é caracterizada pela maciça presença de neurônios que expressam a

arginina vasopressina (VP-IR), além de angiotensina II, encefalina (ENK) e CB

(Abrahamson e Moore, 2001; Welsh et al., 2010). Além disso, essa porção recebe

aferências do cerne (Morin, 2006), do tronco encefálico (Bina et al., 1993),

hipotálamo (Panula et al., 1989; Wada et al., 1991), tálamo e sistema límbico (Moga

e Moore, 1997) e enviam densamente projeções para a SZPV, núcleo dorsomedial

(DMH) e paraventricular do hipotálamo (PVN), bem como, para o PVT (Abrahamson

e Moore, 2001; Leak e Moore, 2001). Teoriza-se que o papel predominante dessa

porção seria integrar as informações do cerne com aferências hipotalâmicas e

límbicas, para fornecer um sinal temporal preciso para os efetores comportamentais

(Leak e Moore, 2001).

Apesar do alto grau de variabilidade neuroquímica entre as espécies, vários

outros compostos neuroativos, que atuam como neurotransmissores e

neuromoduladores foram descritos em terminais ou pericários do NSQ. O

neuropeptídeo Y (NPY), principal composto neuromodulador da ritmicidade biológica

(Card e Moore, 1984; Albers et al., 1984) foi evidenciado apenas em terminais e

fibras, predominantemente na porção ventral do NSQ em camundongo

(Abrahamsom e Moore, 2001), hamster (Card e Moore, 1984), sagui (Callitrix jaccus)

(Costa et al., 1998; Cavalcante et al., 2002), macaco-prego (Cebus apella) (Pinato et

al., 2009), rato-toupeira da Palestina (Spalax ehrenbergi) (Negroni et al., 1997), rato-

toupeira da África do Sul (Cryptomys hottentotus) (Negroni et al., 2003), degus

(Octodon degus) (Goel et al., 1999), Arvicanthis niloticus (Smale e Boverhof, 1999) e

mocó (Nascimento Jr et al., 2010). Contudo, no ouriço Echinops telfairi (Künzle e

Unger, 1992) e em duas espécies de primatas, Microcebus murinus (Bons et al.,

1990) e em humanos (Mai et al., 1991), corpos celulares imunorreativos a NPY

(NPY-IR) foram encontrados no NSQ.

21

A serotonina (5-HT), proveniente principalmente dos núcleos da rafe, também

foi descrita em fibras/terminais em camundongo (Abrahamsom e Moore, 2001),

hamster (Card e Moore, 1984), sagui (Costa et al., 1998; Cavalcante et al., 2002),

gato (Ueda et al.,1983), rato (Ueda et al.,1983; van den Pol e Tsujimoto, 1985), rato-

toupeira da Palestina (Negroni et al.,1997), rato-toupeira da África do Sul (Negroni et

al.,2003), Macaca fuscata (Ueda et al.,1983) e mocó (Nascimento Jr et al., 2010).

O ácido gama amino-butírico (GABA), que é sintetizado pela maioria dos

neurônios do NSQ (Moore e Speh, 1993), apresenta co-localização com uma

variedade de neuropeptídeos, evidenciando uma ampla distribuição espacial desse

neurotransmissor (Antle e Silver, 2005; Buijs et al., 1995).

A proteína acídica fibrilar glial (GFAP), proteína estrutural de astrócitos, foi

descrita no NSQ de hamster e rato (Morin et al., 1989), mocó (Nascimento Jr et al.,

2010), Arvicanthis niloticus (Smale e Boverhof, 1999) e em humanos (Mai et al.,

1991). Já a NeuN, proteína nuclear neuronal, foi observada no NSQ de macaco-

prego (Cebus apella) (Nascimento et al., 2010), hamster e camundongo (Morin et al.,

2011).

Além dessas substâncias supracitadas, elementos imunorreativos a

substância P (Smale et al., 1991; Costa et al., 1998; Moore et al., 2002),

somatostatina (Moore e Card, 1984; Abrahamsom e Moore, 2001; Moore et al.,

2002), galanina (Mai et al., 1991; Abrahamsom e Moore, 2001), fator liberador de

corticotrofina (Smale e Boverhof, 1999; Morin et al., 2006), colecistoquinina,

bombesina, dopamina e hormônio liberador de tireotropina (van den Pol e Tsujimoto,

1985) também foram identificados no NSQ. Sugere-se que a variabilidade no

conteúdo neuroquímico desse núcleo reflete o funcionamento diferenciado dos

mecanismos de sincronização de cada espécie (Cavalcante et al., 2006).

O NSQ apresenta proteínas ligantes de cálcio (PLCa), como CB, CR e

parvalbulmina (PV). Essas PLCa estão associadas a diminuição e controle da

concentração citoplasmática do íon cálcio, sendo responsáveis pela diminuição da

amplitude dos sinais de cálcio (Hof et al., 1999). A CB já foi descrita em neurônios

do NSQ de sagüi (Costa e Britto, 1997; Costa et al., 1998), rato (Celio, 1990; Rogers

e Résibois, 1992; Arvanitogiannis et al., 2000), Arvicanthis niloticus (Mahoney et al.,

2000), Rattus novergicus (Mahoney et al., 2000), mocó (Nascimento Jr et al., 2010),

camundongo (Ikeda e Allen, 2003), hamster (Silver et al., 1996), lêmure (Microcebus

murinus) (Cayetanot et al., 2007) e humano (Mai et al., 1991). CR foi identificada em

pericários de NSQ de Arvicanthis niloticus (Marshall et al., 2000), mocó (Nascimento

22

Jr et al., 2010), camundongo (Ikeda e Allen, 2003) e rato (Résibois e Rogers, 1992).

PV foi identificada no NSQ de gato (de Leon et al.,1995), contudo, está ausente no

sagüi (Costa et al., 1998), rato (Celio, 1990), macaco de cheiro (Saimiri sciureus)

(Fortin e Parent, 1997) e mocó (Nascimento Jr et al., 2010).

1.2.3 Vias eferentes

Sinais eferentes provenientes do NSQ transmitem informações de

temporização circadiana para as demais estruturas encefálicas e periféricas. Uma

das características das projeções do NSQ é que essas eferências percorrem

pequenas distâncias para inervar distritos talâmicos, hipotalâmicos e prosencefálicos

(Morin, 2013) (Fig.3). Apesar das variações intraespecíficas, as projeções do NSQ

se destinam às áreas hipotalâmicas anterior, posterior e lateral, às áreas

retroquiasmática e pré-óptica medial (Morin, 1994; Cavalcante et al., 2006).Dentro

do hipotálamo, as fibras se projetam para a SZPV, PVN (Leak e Moore, 2001),

núcleo ventromedial e DMH (Morin, 2013). Além disso, algumas projeções extra-

hipotalâmicas inervam o PVT, substância cinzenta periaquedutal rostral (Leak e

Moore, 2001), núcleo intersticial da estria terminal e o sistema límbico, nesse último,

principalmente através do PVN e PVT (Leak e Moore, 2001).

23

Figura 3: Representação esquemática simplificada das vias eferentes, enfatizando

as porções do NSQ. Adaptado de Leak e Moore, 2001. MSPVZ, porção medial da

zona subparaventricular; POA, área pré-óptica; DMH, núcleo dorsomedial do

hipotálamo; PVH, núcleo paraventricular do hipotálamo; BST, núcleo intersticial da

estria terminal; ZI, zona incerta; PVT, núcleo paraventricular do hipotálamo; PT,

núcleo paratenial; PSCN, região perisupraquiasmática; LSPVZ, porção lateral da

zona subparaventricular; VTU, área tuberal ventral e LS, núcleo septal lateral.

1.2.4 Folheto intergeniculado (FIG)

Em espécies não-primatas, interposta entre o núcleo geniculado lateral ventral

(GLV) e o núcleo geniculado lateral dorsal (GLD) do complexo geniculado lateral do

tálamo, encontra-se uma fina lâmina celular, o FIG (Hickey e Spear, 1976). Por

muitos anos, acreditava-se que essa estrutura fazia parte do GLV. Apenas com

métodos imuno-histoquímicos (Hickey e Spear, 1976; Mantyh e Kemp, 1983) e

radiográficos (Swason et al., 1974; Ribak e Peters, 1975) foi possível demonstrar a

sua distinta característica neuroquímica e morfológica, bem como, determinar suas

conexões e delimitações (Lewandowski e Blasiak, 2004). Nos primatas, a estrutura

homóloga ao FIG é o núcleo pré-geniculado (NPG) (Moore, 1989; Van der Gucht et

24

al., 2003) e no gato, é a divisão magnocelular do GLV (Pu e Pickard, 1996; Van der

Gucht et al., 2003; Nakamura e Itoh, 2004).

Como o NSQ, o FIG recebe aferência retiniana binocular direta das mesmas

ipRGC que se projetam para o marcapasso circadiano, atingindo ambas as

estruturas após a bifurcação dos seus axônios(Pickard, 1985; Morin et al., 2003). O

TGH origina-se parcialmente de células que expressam NPY, que se projetam

predominantemente a partir do FIG para o NSQ (Blasiak e Lewandowski, 2013).

Essa característica foi confirmada por estudos de lesões do FIG, o que provoca uma

drástica redução na quantidade de terminais NPY-érgicos no NSQ (Morin e

Blanchard, 2001).

Quanto ao seu aspecto neuroquímico, o FIG é caracterizado pela presença de

elementos imunorreativos a NPY (Card e Moore, 1989; Laemle et al.,1993;

Harrington et al., 1985; 1987; Ueda et al.,1986; Hostetler et al., 2013), GABA (Moore

e Speh, 1993; Agarwala et al., 1992a; 1992b), ENK (Mantyh e Kemp, 1983; Morin et

al.,1992; Moore e Speh, 1993; Conley e Freiderich-Ecsy, 1993), óxido nítrico

(Nascimento Jr et al., 2010) e Substância P (Takatsushi et al.,1989; Samuels et al.,

2006). Fibras/terminais imunorreativos a 5-HT (5-HT-IR) também foram detectadas

nessa estrutura (Morin et al.,1982; Card e Moore, 1984; Goel et al.,1999; Negroni et

al., 2003). Além disso, foi observada imunorreatividade a GFAP (Morin et al., 1989;

Smale e Boverhof, 1999; Nascimento Jr et al., 2010), CB (Celio, 1990; Carneiro,

2000; Cavalcante et al., 2008; Negroni et al.,2003) e CR (Arai et al., 1993; Carneiro,

2000; Cavalcante et al., 2008).

Em roedores, existem basicamente dois tipos populações celulares no FIG. A

primeira é caracterizada pela co-localização de GABA e ENK e, se projeta

exclusivamente para o FIG contralateral e a segunda, apresenta co-localização com

GABA e NPY, projetando-se predominantemente para o NSQ através do TGH

(Moore, 1992; Morin e Allen, 2006). Em hamster, ainda pode ser identificado um

terceiro tipo subpopulação, com co-localização com neurotensina e NPY (Morin e

Banchard, 1995).

As principais conexões aferentes para FIG são provenientes da retina, do

NSQ (bilateralmente) e do FIG contralateral (Moore e Card, 1994; Tang et al., 2002).

Além dessas projeções, o FIG também é inervado por áreas do córtex pré-frontal,

núcleo hipotalâmico ventromedial, área retroquiasmática, zona incerta, a parte

magnocelular do núcelo subparafascicular, núcleo dorsal da rafe, as camadas

25

profundas do colículo superior, núcleo cuneiforme e o locus coeruleus (Vrang et al.,

2003) (Fig.4).

Figura 4: Representação esquemática simplificada das vias aferentes do FIG.

Adaptado de Vrang et al. 2004. ZI, zona incerta; SPF, parte magnocelular do núcelo

subparafascicular; SCN, núcleo supraquiasmático; VMH, núcleo ventromedial do

hipotálamo; SC; colículo superior; CUN, núcleo cuneiforme; LC, locus coeruleus;

RCh, área retroquiasmática; DR, núcleo dorsal da rafe, IGL, folheto intergeniculado.

26

Em relação as suas eferências, o FIG, em ratos, se projeta para além do

NSQ, inervando as áreas hipotalâmicas anterior, posterior e dorsal; a área

retroquiasmática; a ZSPV; o núcleo dorsomedial; os núcleos talâmicos da linha

média, incluindo o reuniens, rhomboide e paraventricular; o núcleo lateral posterior

do tálamo; a substância cinzenta periaquedutal, a zona incerta; núcleo do tracto

óptico; a área pré-tectal medial; o núcleo olivar pré-tectal, a camada cinzenta

superficial do colículo superior e os núcleos terminais lateral e dorsal do sistema

óptico acessório (Moore et al., 2000) (Fig. 5).

Figura 5: Representação esquemática simplificada das vias eferentes do FIG em

ratos. Adaptado de Moore, 2000. RE, núcleo reuniens; RH, núcleo rhomboide; PVT,

núcleo paraventricular do tálamo; ZI, zona incerta; ZSPV, zona subparaventricular;

LP, núcleo lateral posterior do tálamo; LTN, núcleo terminal lateral do sistema óptico

acessório e DTN, núcleo termianal dorsal do sistema óptico acessório.

27

Em uma sequência de trabalhos, os pesquisadores Morin e Blanchard

demonstraram as eferências do FIG em hamster. Em um estudo inicial, com o uso

de fluorogold como traçador retrógrado, forma observadas projeções do FIG para o

NSQ, para o FIG contralateral e para o núcleo talâmico limitante posterior (Morin e

Blanchard, 1995). Em um trabalho posterior, esses autores descrevem conexões

com todo o complexo geniculado lateral, núcleo lateral posterior do tálamo, núcleo

limitante posterior, núcleo pré-tectal anterior, núcleo do tracto óptico, núcleo olivar

pré-tectal, núcleo pré-tectal comissural, núcleo pré-tectal medial, núcleo pré-tectal

posterior e colículo superior (Morin e Blanchard, 1998). A partir dos resultados desse

trabalho aventou-se a hipótese da participação do FIG no controle motor ocular.

Posteriormente, com o uso do traçador anterógrado PHA-L foram descritas

eferências do FIG para o prosencéfalo, incluindo a divisão anterior do núcleo

intersticial da estria terminal, porção horizontal da banda diagonal de Broca e porção

intermédia do núcleo septal (Morin e Blanchard, 1999). Áreas tronco-encefálicas,

como núcleo do nervo óculo-motor, do nervo troclear, de Edinger-Westpal, do trato

óptico, núcleo lateral e dorsal do pedúnculo-pontino, substância cinzenta

periaquedutal supra-oculomotora, núcleo intersticial do fascículo longitudinal medial,

oliva inferior, núcleo interpósito da rafe, os núcleos terminais e todas as camadas do

colículo superior foram descritas como alvos de projeções do FIG. A presença dessa

inervação no tronco encefálico permitiu a teorização da participação do FIG nos

mecanismos de regulação de sono-vigília e vísuomotores (Morin e Blanchard, 2005).

Quanto a sua funcionalidade, postula-se que o FIG participa da regulação do

ciclo sono-vigília, do controle visuomotor e da ritmicidade circadiana (Harrington

1997; Morin e Blanchard, 2005). Nesse último aspecto, estudos farmacológicos e/ou

de lesões revelam que o FIG não está diretamente envolvido com a sincronização

dos ritmos endógenos ao CE, mas na verdade, é responsável pela modulação fótica

e não fótica dos ritmos biológicos (Dark e Asdourian, 1975; Harrington e Rusak,

1986; Pickard et al., 1987; Johnson et al., 1989).

O fato do FIG ser uma área retinorrecipiente com projeções para o NSQ

permitiu à teorização de que essa estrutura poderia ser um relé para uma via

alternativa de sincronização fótica. Contudo, como citado anteriormente, foi

observado que o TRH é suficiente para esse tipo de sincronização (Klein e Moore,

1979). Em rato (Dark e Asdourian, 1975) e hamster (Harrington e Rusak, 1986;

Pickard et al., 1987; Johnson et al., 1989), a lesão bilateral do FIG não altera a

sincronização do ritmo de atividade a um CE em condições controladas e nem

28

modifica a fase do ritmo de N-acetil-serotonina da pineal de ratos (Cipolla Neto et al.,

1995).

Embora esses dados indiquem que o FIG não está diretamente envolvido com

a sincronização fótica, diversos aspectos comportamentais corroboram a sua

importância para a modulação da ritmicidade biológica. Em camundongos, a lesão

bilateral do FIG alonga o período do ritmo de atividade em livre-curso sob escuro

constante, mas não em claro constante (Pickard, 1994) e em rato, resulta na

perturbação da sincronização a um fotoperíodo esqueleto (Edelstein e Amir, 1999).

Em hamster, ablações do FIG prolongam o tempo de ressincronização a mudanças

de fases em ciclo claro/escuro (Harrington e Rusak, 1986; Johson et al., 1989),

modificam o ângulo de fase de sincronização a um ciclo escuro sinusoidal (Pickard,

1989).Também em hamsters, a lesão do FIG diminue a frequência do fenômeno de

bipartição (spliting) dos NSQ em condições de claro constante (Harrington e Rusak,

1988), altera mudanças de fase a pulsos de luz agudos em escuro constante e

suprime a resposta de alongamento do período normalmente provocado pelo claro

constante (Pickard et al., 1987).

Em espécies diurnas, como o degus, a lesão bilateral do FIG resulta em um

significativo avanço e alongamento da fase ativa do ciclo desse animal, sobre

condições controladas de iluminação (CE 12:12) (Goel et al., 2000). No Arvicanthis

niloticus, esse mesmo tipo de trauma induz o aumento do atividade locomotora após

pulsos de escuro em claro constante e diminui esse mesmo tipo de atividade após

pulsos de claro em escuro contante (Gall et al., 2013). Ablações do FIG também

aumentam a atividade locomotora principalmente durante a fase escura (CE12:12) e,

durante a noite subjetiva em condições constantes de iluminação nesse roedor

diurno (Gall et al., 2013).

Adicionalmente, evidências fornecidas por diferentes abordagens

experimentais apontam que o FIG/TGH modula a sincronização dos ritmos

circadianos a estímulos não fóticos (Challet e Pèvet, 2003). Mudanças de fase

induzidas por restrição alimentar em ratos (Challet et al., 1996); corrida forçada em

camundongos (Marchant et al., 1997); além de nova roda de atividade (Mrososovsky

et al.,1992; Biello et al.,1994; Wickland e Turek, 1994; Janik e Mrosovisky, 1994) e

injeções de triazolam (Johnson et al., 1988a; Schuhler et al., 1999) ou

clordiazepóxido (Biello et al., 1991; Meyer et al., 1993) em hamster são bloqueadas

ou suprimidas por lesões no FIG/TGH.

29

Outro indicador do papel do FIG na mediação de efeitos de mudança de fase

a estímulos não fóticos é apoiado pela própria estimulação elétrica dessa estrutura

(Rusak et al., 1989); por infusões de NPY (Albers et al., 1984; Huhman e Albers,

1994), anticorpos anti-NPY (Biello et al., 1994), N-metil-aspartato (Johson et

al.,1988c) ou glutamato (Meijer e Harrington, 1993) dentro do NSQ e por micro-

aplicações de NPY no NSQ in vitro (Medanic e Gillete, 1993; Shibata e Moore,

1993). Ambos os estímulos produzem uma curva de resposta dependente de fase

(CRF) diferente daquela produzida pela luz, assemelhando-se, na verdade, a um

CRF não-fótica. Essa similaridade nas CRF incluem o avanço de fase durante o dia

subjetivo e o atraso de fase ao longo da noite subjetiva. Sugere-se que esse

fenômeno é um mecanismo de retroalimentação, que regula a função do NSQ, de

maneira diferente do que faz a luz (Cavalcante et al., 2006).

A hipótese do papel não-fótico do FIG na ritmicidade circadiana é corroborada

pela expressão da proteína do gene c-fos (Fos) (Edelstein e Amir, 1995; Janik et al.,

1995; Mikkelsen et al., 1998). Para esse tipo de estímulo foi observado a maior

expressão de Fos no FIG durante o dia subjetivo (Mikkelsen et al., 1998),

principalmente nas células NPY-érgicas (Janik et al., 1995).

1.4 O morcego Artibeus planirostris

Os morcegos, em sua maioria, são exclusivamente noturnos (Rydell e

Speakman, 1995; Speakman, 2001) e constituem uma das ordens – Chiroptera –

mais diversificadas dos mamíferos, sendo os únicos que apresentam real

capacidade do vôo, como relata a denominação grega: cheir (mão) e pteron (asa)

(Reis et al., 2007). O esqueleto desses animais é adaptado ao vôo, com ossos finos,

tubulares e leves. A capacidade de voar e a ecolocalização são creditadas como as

mais importantes características responsáveis pela dispersão desses indivíduos no

planeta (Simmons, 2005). Essa ampla distribuição mundial não está apenas refletida

na variedade de habitats explorados por esses animais (regiões temperadas e

tropicais, com exceção de algumas ilhas oceânicas e a Antártica), mas também na

riqueza de espécies, formando a segunda maior ordem de mamíferos, com cerca de

200 gêneros e 1100 espécies (Kunz e Lumsden, 2003; Simmons, 2005).

Tradicionalmente, os quirópteros são divididos em duas subordens

monofiléticas, Megachiroptera e Microchiroptera, de acordo com características

moleculares (Madsen et al., 2001; Murphy et al., 2001; Springer et al., 2004) e

30

morfológicas (Simmons, 1994; Van Den Bussche et al., 1998). A primeira

compreende as maiores formas de morcegos, agrupadas em uma única família

(Pteropodidae), sendo encontrados em trópicos e subtrópicos apenas no Velho

Mundo (Neuweiler, 2000). Devido ao seu porte (1,7m de envergadura e 1,5kg de

peso) e as suas características faciais, os megaquirópteros são conhecidos

popularmente como “raposas-voadoras” (Reis et al., 2007). Já a segunda, apresenta

distribuição cosmopolita, não ocorrendo em regiões polares e ilhas muito afastadas

das massas continentais, sendo formada por 17 famílias e 928 espécies (Hutson et

al., 2000; Simmons, 2005). Esses animais pesam entre 2 e 196g (Aguiar e Taddei,

1995), com comprimento de antebraço variando de 22,5 a 115 mm (Hutson et al.,

2000).

Entretanto, essa classificação tem sido contrariada por estudos filogenéticos

baseados em dados moleculares (Van Den Bussche et al., 1998; Hutcheon et

al.,1998). Estudos apontam que alguns grupos de morcegos com ecolocalização

sofisticada compartilham um ancestral comum com as “raposas-voadoras”,

sugerindo a parafilia dos quirópteros (Van Den Bussche e Hoofer, 2004; Teeling et

al., 2005; Teeling, 2009). Dessa forma, a família Pteropodidae e mais cinco famílias

de microquirópteros foram agrupados na subordem Yinpterochiroptera, e as famílias

restantes, incluindo a Phyllostomidae, na subordem Yangochiroptera (Figura 3)

(Jones e Teeling, 2006; Teeling et al., 2012). No território brasileiro, são conhecidas

nove famílias de microquirópteros, dentre essas, a família Phyllostomidae, a qual

pertence o Artibeus planirostris (Figura 4). Esse animal tem tamanho médio, com

massa corporal entre 40 a 69 g, amplitude de braço de 62 a 73mm (Hollis, 2005) e

comprimento do corpo variando de 7,5 a 11 cm (Reis et al.,2013).

O morcego A. Planirostris apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo

em zonas tropicais de diversos países ao longo da metade norte da América do Sul

(Hollis, 2005). É um morcego comum em muitas regiões do Brasil (Zortéa, 2007),

inclusive no Rio Grande do Norte (Figura 5), habitando fragmentos de mata, em

áreas de floresta úmida ou xeromórfica, utilizando folhagem e ocos de árvores como

abrigo (Reis et al., 2013). Embora tenha sido registrada em diferentes horários ao

longo do período noturno, essa espécie é mais ativa no início da noite, sobretudo na

segunda e terceira hora após o crepúsculo (Bernard, 2002).

31

Figura 6: Árvore molecular das famílias de morcegos existentes. Família do

modelo experimental em destaque. Adaptado de Jones e Teeling, 2006

Morfologicamente, o A. planirostris possui pelagem castanho-clara ou cinza-

clara, curta, pouco densa e áspera; a face apresenta listras quase imperceptíveis; o

antebraço apresenta poucos pelos; as pontas das asas são esbranquiçadas; não

possui cauda; as orelhas são curtas com pontas arredondadas e o trago (apêndice

membranoso na abertura auricular) também é curto, ambos de coloração não

diferenciada (Simmons e Voss 1998; Haynes e Lee Jr., 2004; Hollis, 2005; Aguirre et

al., 2009; Miranda et al., 2011; Reis et al., 2013).

32

Figura 7: Macho adulto joven do morcego Artibeus planirostris

(Foto: Marília Barros).

33

Figura 8: Distribuição geográfica do Artibeus planirostris (em amarelo).

(Fonte: The IUCN Red List).

O mocego A. planirostris é solitário ou pode formar pequenas colônias de 6-

15 indivíduos, apresentando dieta predominantemente frugívora, no entanto, a sua

alimentação pode ser complementada com recursos florais (néctar e pólen)

(Beguelini et al., 2013). Esse quiróptero é oportunista, utilizando principalmente

habitats fechados, onde forrageia junto à vegetação (Bernard, 2002). Apresenta

estratégia de forrageio do tipo “coletor” (gleaning), caracterizada pela captura de

alimentos relativamente estacionários junto à superfície, diferentemente dos

morcegos “aéreos” (aerial), que capturam presas durante o vôo (Kalko et al., 1996).

Quanto à reprodução, esse quiróptero apresenta período gestacional de 3,5

meses, normalmente com o desenvolvimento de apenas um único filhote e exibe

poliestria bimodal sazonal, com pico reprodutivo de fevereiro a março e de outubro a

novembro (Beguelini et al., 2013).

31

2. JUSTIFICATIVA

Considerando a importância do STC na adaptação temporal dos organismos

vivos é fundamental conhecer a especificidade neuroquímica e das projeções

retinianas desse sistema em uma maior variedade de espécies, com o intuito de

melhor explorar sua função e elucidar muitas questões pertinentes a sua

constituição e ao seu padrão de desenvolvimento evolutivo.

No que se refere a estudos de mapeamento anatômico cerebral, o morcego

Artibeus planirostris é uma espécie pouco explorada, apresentando amplo campo de

estudos e uma oportunidade única de perceber adaptações relativas ao voo em um

mamífero voador.

Quanto a determinação do nicho temporal das espécies, esse estudo pode

fornecer subsídios para o entendimento dos padrões temporais de atividade de

animais diurnos, crepusculares e noturnos.

Em face ao cenário controverso quanto à monofilia dos quirópteros, a

pesquisa visa contribuir para esclarecer as relações filogenéticas desses animais e

também do próprio STC, oferecendo o substrato necessário para estudos

comparativos desse grupo e do referido sistema.

Adicionalmente, o trabalho também tem como objetivo estabelecer o morcego,

como modelo experimental para posteriores investigações filogenéticas e

cronobiológicas.

32

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Caracterizar neuroquímica e morfologicamente o NSQ e o FIG do morcego

Artibeus planirostris.

3.2 Específicos

Delimitar citoarquitetônicamente o NSQ e FIG;

Caracterizar o padrão de aferência retiniana para o NSQ e FIG;

Caracterizar o conteúdo neuroquímico do NSQ e FIG.

.

33

4. METODOLOGIA

4.1 Sujeitos:

Para a realização deste projeto foram utilizados 13 (treze) exemplares

machos do morcego Artibeus planirostris, pesando em média de 41,34g. Os

morcegos foram classificados como adultos jovens baseados na coloração da

pelagem, no desgaste dos dentes, na ossificação da articulação metacarpo-

falangeana das asas e na evidência dos testículos.

Os animais foram obtidos por captura na borda de um fragmento de

vegetação, no Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte (CB/UFRN) (Coordenadas em UTM: 25M 256251 / 9353764) e em um

agrupamento arbóreo, nas proximidades da Reitoria da referida instituição de ensino

(Coordenadas em UTM: 25M 256226 / 9354214), mediante autorização do Instituto

Brasileiro do Meio Ambiente (IBAMA) (Licença SISBIO Nº 25233-2).

Para a captura dos animais foram utilizadas de uma a três redes de neblina

Ecotone® de nylon, dimensões 12 x 3 m e tamanho de malha 19 x 19 mm. As redes

foram armadas no nível do solo e, em cada noite de captura, foram abertas logo

após o pôr do sol e permaneceram expostas por duas horas consecutivas.

Cada indivíduo capturado foi analisado quanto ao sexo e à faixa etária.

Foram mantidos em sacos de algodão até o término da amostragem e transportados

até o laboratório de Neuroanatomia. Os demais indivíduos que não eram

caracterizados como adultos jovens foram soltos no mesmo local da captura.

Antes do procedimento experimental e após a injeção intra-ocular de

traçador retrógrado, os animais foram acomodados no biotério do Departamento de

Morfologia da referida instituição de ensino (DMOR/UFRN), em gaiolas medindo

0,50 x 0,70 x 0,35m, onde havia caixas ninho medindo 0,15 x 0,13 x 0,29m. Os

animais foram expostos a condições naturais de luminosidade, temperatura e

umidade, com comida e a água ad libitum. Os morcegos foram acompanhados

durante a pesquisa por um médico veterinário, para atestar as boas condições de

saúde desses animais.

A totalidade dos procedimentos experimentais deste plano de trabalho foi

aprovada pela Comissão de Ética o Uso de Animais da Universidade Federal do Rio

34

Grande do Norte (CEUA/UFRN) (Protocolo nº 009/2012), sendo executados no

laboratório de Neuroanatomia, vinculado ao DMOR/UFRN.

Todos os cuidados foram tomados no sentido de evitar dor e sofrimento aos

animais durante os procedimentos experimentais, seguindo estritamente as normas

e princípios estabelecidos pela Lei Arouca (11.794/08), para o uso científico de

animais (Brasil, 2008) e pela National Research Council of the National Academy

publicadas no livro “Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience

and Behavioral Research”. Esta última possui uma versão em formato pdf,

disponível gratuitamente no site da Sociedade de Neurociências e Comportamento

(SBNeC) – http://www.sbnec.gov.br/links.

4.2 Procedimentos experimentais

4.2.1 Anestesia

Os animais foram anestesiados com uma combinação medicamentosa, de

propriedades analgésicas, anestésicas e de relaxamento muscular. A administração

dessa solução ocorreu por meio de injeção intramuscular, até que o sujeito

experimental atingisse o plano anestésico. As substâncias utilizadas foram o

cloridrato de tramadol (5mg/Kg), potente analgésico contra dores de intensidade

moderada a grave; o diazepam (0,5mg/Kg), benzodiazepina de ação central, que

induz ao estado de sedação, hipnose, amnésia e apresenta características anti-

convulsionantes; o cloridrato de cetamina(5mg/Kg), anestésico dissociativo, que

causa sedação, imobilidade e analgesia e o cloridrato de xilazina (0,5mg/Kg), um

relaxante muscular, que potencializa a ação da maioria das drogas anestésicas.

Acrescido a isso, foi instilado 1 gota de tetracaína oftalmológica, no olho submetido a

infusão de CTb.

4.2.2 Injeção intra-ocular

Após a aplicação do anestésico, os animais foram submetidos a uma injeção

intraocular unilateral de 15 µl de uma solução aquosa da subunidade B da toxina

colérica (CTb) (List Biological Laboratories, Inc., Campbell, CA) a 5 % contendo

dimetilsufóxico (DMSO) a 10% para aumentar a permeabilidade e

http://www.sbnec.gov.br/links

35

conseqüentemente melhorar a captação do CTb. A injeção foi aplicada no olho

esquerdo, utilizando-se uma agulha de calibre 30 (8,00mm x 0.3mm), lentamente,

sob pressão, com auxílio de uma micro-bomba propulsora. Esse equipamento

impulsiona a solução em um fluxo de 0,8 l/min. A agulha foi introduzida na junção

esclero-corneal, atingindo o corpo vítreo, em um ângulo de aproximadamente 45º,

sendo retirada 15 minutos após ter cessado o fluxo. Esse procedimento objetiva

diminuir um possível refluxo da solução.

Durante o período de recuperação (5 dias) os animais retornaram para as

gaiolas de origem onde receberam antibioticoterapia, com Cefalotina® e um

antiinflamatório, Meloxican® por via intramuscular, além de suplementação com o

complexo vitamínico Bionew® (Vetnil, Louveira, SP) pela via subcutânea. Após esse

período de sobrevida, os animais foram novamente anestesiados, com o mesmo

protocoloco anestésico do procedimento cirúrgico e, posteriormente foram

perfundidos.

4.2.3 Perfusão

Ao atingir o plano anestésico, cada animal foi perfundido transcardiacamente,

em capela de exaustão. O animal foi posicionado em decúbito dorsal, sobre tela de

arame sob ponto de água e submetido à toracotomia, com incisão de pele, músculos

e arco costal, sendo esses removidos em bloco, para exposição do coração. Logo

em seguida, foi realizada a cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando agulha

de 16G (1,6 x 17 mm), a qual foi direcionada para a aorta ascendente e, logo após

esse procedimento, seccionou-se o átrio direito para escoamento do líquido vascular.

A agulha foi conectada a uma bomba peristáltica (Masterflex, Cole-Parmer, Niles, IL),

infundindo-se pelo leito vascular 150 ml de solução salina a 0,9% em tampão fostato

(PBS) 0,1M, pH 7,4, acrescida com heparina (Parinex, 5000 UI/ml, Hipolabor, Belo

Horizonte, MG) na concentração de 2ml/L, à temperatura ambiente, com velocidade

de 6 ml/minuto. Posteriormente, foram infundidos 300 ml de solução fixadora

(formaldeído a 4%, Dinâmica, Diadema, SP) em PBS 0,1M, pH 7,4, passando-se a

primeira metade dessa solução, a um fluxo de 6 ml/minuto e o restante a 3

ml/minuto. Todos os animais foram perfundindos durante a fotofase (ZT10-12).

A utilização da solução heparinizada tem como objetivo lavar o sistema

circulatório do animal, prevenindo a formação de coágulos e possibilitando a melhor

penetração de fixador nos tecidos.

36

4.2.4 Remoção dos encéfalos

Concluída a etapa da perfusão, os encéfalos foram retirados da cavidade

craniana, por fratura dos ossos da calota craniana, com o uso de broca e trocater.

Em seguida, foram pós-fixados na mesma solução fixadora por duas horas e

posteriormente transferidos para uma solução de sacarose 30% (Dinâmica,

Diadema, SP) em PBS 0,1 M, pH 7,4 a 4°C, até serem submetidos à microtomia.

4.2.5 Microtomia e Técnica de Nissl

Finalizada a etapa de pós-fixação e imersão em tampão sacarose a 30%,

os encéfalos foram congelados em gelo seco e seccionados em um micrótomo

horizontal de deslizamento, obtendo-se cortes coronais de 30 µm. Essas secções

foram distribuidas sequencialmente em 6 compartimentos, em uma solução anti-

congelante (PBS 0,05 M, pH 7,4, Etileno glicol e sacarose). Cada um desses

compartimentos apresentava 1 de 6 secções, de modo que a distância entre uma

secção e a seguinte seja de aproximadamente 180 µm.

De cada sujeito experimental, as secções contidas em um dos

compartimentos foram submetidas à coloração citoarquitetônica pelo método de

Nissl, utilizando o corante tionina. Através dessa técnica todas as células são

marcadas, proporcionando a possibilidade de identificá-las através de seus

tamanhos, formas e localizações. Esse procedimento é feito com cada um dos

animais utilizados, uma vez, que podem ocorrer diferenças individuais nas

estruturas encefálicas.

Os cortes dos demais compartimentos foram armazenados em solução anti-

congelante e conservados a -20 ºC para posterior utilização em procedimentos

imuno-histoquímicos.

4.2.6 Imuno-histoquímica

As demais séries de secções foram submetidas à análise imuno-histoquímica,

empregando o protocolo ABC (avidina-biotina complexo peroxidadase; ABC, kit Elite,

Vector labs, Burlingame, CA) para marcação simples com imunoperoxidade. Nessa

análise, cortes de uma série foram submetidos a imuno-histoquímica para revelação

37

de CTb, com a finalidade de detectar-se os alvos das projeções retinianas e os

compartimentos restantes foram expostos ao mesmo procedimento, para identificar

a expressão de substâncias neuroativas, como VP, VIP, NPY, 5-HT, além de GFAP

e das PLCa, CB, CR, e PV. A concentração dos anticorpos utilizados seguiu as

especificações técnicas dos fabricantes.

Precedendo a técnica de imuno-histoquímica, foi necessário realizar um pré-

tratamento dos cortes, na perspectiva de atenuar ou abolir a presença de artefatos

As secções de um compartimento por vez foram submetidas a 5 lavagens, com

duração de 5 minutos cada, em PBS 0,1M, pH 7,4. Posteriormente, os cortes foram

submetidos à pré-tratamento, para inativação da peroxidade endógena do tecido,

sendo colocados em contato com o peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,3% diluído em

PBS 0,1M, pH 7,4 por 20 minutos. Em seguida, as secções foram lavadas

novamente (5 vezes de 5 minutos), em PBS 0,1M, pH 7,4. Todos os procedimentos

supracitados foram realizados em agitador orbital.

Após esse procedimento, os cortes foram incubados em uma solução de

bloqueio, contendo albumina de soro bovino (BSA) (Ebram, Belezinho, SP) a 22%

diluído em Triton X-100 a 0,4% (ICN Biomedical, Irvine, CA) durante 60 minutos,

com o propósito de bloquear sítios inespecíficos ao anticorpo primário. Em seguida,

as secções foram colocadas em contato com uma solução contendo o anticorpo

primário específico (Tabela1), Triton X-100 a 0,4%, BSA a 2% por 16 horas em rotor

com baixa velocidade (60 a 80rpm) a 24 °C. Finalizado esse processo, os cortes

foram lavados (5 vezes de 5 minutos) em PBS 0,1M, pH 7,4.

Ao final dessa etapa, as secções foram colocadas em contato com o

anticorpo secundário biotinilado (Quadro 1) em Triton X-100 a 0,4%, durante 90

minutos à 24 °C, sob agitação lenta (60 a 80 rpm), em rotor. Em seguida, os cortes

passaram por uma sessão de lavagens novamente em PBS 0,1M, pH 7,4 e foram

colocados na solução do complexo avidina-biotina-HRP (Protocolo ABC, Kit elite -

Vector) em Triton X-100 a 0,4%, contendo NaCl por 90 minutos. Essa solução foi

preparada anteriormente (30 minutos antes do procedimento com o anticorpo

secundário), para que ocorresse a formação de complexos avidina-biotina-

peroxidase. Ao fim da incubação nesse complexo, as secções foram lavadas

novamente (5 vezes de 5 minutos) em PBS 0,1M, pH 7,4.

Para evidenciar a reação, as secções foram expostas a uma solução de

diaminobenzidina (DABtetra) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) a 2,5% diluída em PBS

0,1M, pH 7,4, e como substrato, H2O2 a 0,3%. Ao adicionar o H2O2 a reação inicia e

38

o cromógeno começa a ser utilizado, deixando reagir até que fique com coloração

marrom. Por fim, os cortes foram submetidos uma série de lavagens com PBS 0,1M,

pH 7,4 em agitador orbital.

4.2.7 Montagem de lâminas e intensificação com Tetróxido de Ósmio

Após o procedimento imuno-histoquímico, os cortes foram montados

sequencialmente em lâminas gelatinizadas com gelatina-alúmen-cromo (VETEC

Química Fina, Duque de Caxias, RJ), que após secarem a temperatura ambiente,

foram imersas em solução de tetróxido de ósmio a 0,05% por 30 segundos, com o

intuito de intensificar a reação. Após as etapas de desidratação, em baterias de

álcool de graduação crescente até o álcool absoluto (70, 95 e 100%) (Cromato

produtos químicos, Diadema, SP) e diafanização em xilol (Cromato produtos

químicos, Diadema, SP), as secções foram cobertas com lamínulas usando-se DPX

(Aldrich, Milwauke, WI).

4.3 Análise das lâminas

Para avaliar os resultados imuno-histoquímicos e da coloração de Nissl nas

secções encefálicas, foi utilizado microscópio óptico (Nikon Eclipse Ni) em campo

claro. Imagens digitais foram obtidas por meio de uma videocâmera digital (Nikon

DS-Ri1) acopladas ao microscópio, ajustado com as objetivas de 4X e 10X. As

imagens foram analisadas, corrigidas minimamente no brilho e contraste, com auxílio

do programa Canvas 12. Os desenhos de coloração citoarquitetônica e de marcação

imuno-histoquímica foram elaborados utilizando também o software Canvas 12. Para

técnica de Nissl, os limites do NSQ e do FIG foram delimitados tomando como base

o atlas esteriotáxico do cérebro de rato (Paxinos e Watson, 2007) e de camundongo

(Franklin e Paxinos, 2008). Já para os procedimentos imuno-histoquímicos, o

contorno citoarquitetônico dessas estruturas foi identificado a partir da sobreposição

de imagens digitalizadas das secções adjascentes coradas com tionina. Os

resultados foram documentados em fotomicrografias.

39

Quadro 1: Especificações de anticorpos primários e anticorpos secundários

utilizados no procedimento imuno-histoquímico com as suas referidas diluições e

fabricantes.

ANTÍGENO ANTICORPO

PRIMÁRIO

ANTICORPO

SECUNDÁRIO

5-HT

α-5-HT obtido em coelho

[1:5000]

Sigma-Aldrich

α-coelho obtido em cabra

[1:1000]

Jackson Laboratories

CB

α-CB obtido em camundongo

[1:1000]

Sigma-Aldrich

α-camundongo obtido em cabra

[1:1000]


CR

α-CR obtido em coelho

[1:1000]

Sigma-Aldrich

α-coelho obtido em asno

[1:1000]


CTb

α-CTb obtido em cabra

[1:1000]

List Biological Laboratories

α-cabra obtido em asno

[1:1000]


GFAP

α-GFAP obtido em camundongo

[1:1000]

Sigma-Aldrich


[1:1000]


NPY

α-NPY obtido em coelho

[1:8000]

Sigma-Aldrich


[1:1000]


PV

α-PV obtido em camundongo

[1:1000]

Sigma-Aldrich


[1:1000]


VIP

α-VIP obtido em coelho

[1:5000]

Península Laboratories


[1:1000]


VP

α-VP obtido em cobaia

[1:1000]

Península Laboratories

α-cobaia obtido em cabra

[1:1000]


40

5. RESULTADOS

5.1 Núcleo supraquiasmático

5.1.1 Citoarquitertura

O método de Nissl, que utiliza o corante Thionina, mostrou-se eficiente para

a marcação celular e delimitação do NSQ do Artibeus planirostris. Nas secções

coronais coradas por esse método, o NSQ foi visualizado como uma estrutura

distinta no hipotálamo anterior, sendo caracterizado pela forte afinidade tintorial

das suas células, quando comparado aos grupos celulares adjacentes no

hipotálamo. No nível rostral, o NSQ exibe um formato aproximadamente triangular

e no nível médio e caudal, assume um contorno arredondado, com o seu maior

eixo direcionado para o sentido dorsal (Fig.9 e 13).

5.1.2 Projeção retiniana

As projeções retinianas para o NSQ foram demonstradas por transporte

anterógrado de CTb. Nos cortes coronais submetidos à imuno-histoquímica para

essa substância, foi observado que as fibras retinianas dispõem-se bilateralmente,

com uma leve predominância contralateral em todos os níveis. No nível rostral, as

fibras estão dispostas na porção ventral do núcleo, enquanto no nível médio

povoam a região ventromedial, estando ausente na porção laterodorsal e no nível

caudal ocupam uma posição mais centralizada dentro do NSQ (Fig. 10 e 13).

41

Figura 9: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do A.

planirostris nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a citoarquitetura

do NSQ pelo método de Nissl. (A’-C’) Respectivas imagens em maior aumento.

Abreviações: 3V, terceiro ventrículo; qo, quiasma óptico. Barra: 500 μm em (A-C) e

100 μm (A’-C’).

42


planirostris nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a distribuição de

terminais retinianos imunorreativos a Ctb no NSQ. (A’-C’) Respectivas imagens em

maior aumento. Abreviações: 3V, terceiro ventrículo; qo, quiasma óptico. Barra: 500

μm (A-C) e 100 μm (A’-C’).

43

5.1.3 Neuroquímica

Vasopressina – VP

Foram visualizados neurônios parvocelulares imunorreativos a VP (VP-IR),

imersos em uma moderada neurópila na porção dorsomedial do NSQ, nos seus

níveis médio e caudal (Fig.11 e 13). A imunorreatividade a VP também foi

evidenciada em outras regiões do hipotálamo anterior, como PVN e núcleo supra-

óptico, apresentando pericários magnocelulares e um denso plexo de

fibras/terminais.

Polipeptídeo Intestinal Vasoativo – VIP

Pericários VIP-IR foram identificados no NSQ do Artibeus planirostris, ao

longo de toda a sua extensão rostrocaudal. Esses neurônios eram esparsos e

estavam imersos em uma densa neurópila, sobretudo na porção ventrolateral desse

núcleo (Fig.11 e 13).

Neuropeptídeo Y- NPY

Um denso plexo de fibras/terminais NPY-IR foi encontrado no NSQ nos níveis

médio e caudal, com maior concentração na porção ventrolateral dessa estrutura

(Fig.11 e 14).

Serotonina – 5HT

Foram visualizadas fibras 5-HT-IR em toda a extensão rostrocaudal do NSQ.

No nível rostral, essas fibras distribuem-se predominantemente na porção

ventrolateral. Já no nível médio, esses elementos 5-HT-IR povoam a porção

ventromedial e no nível caudal incidem na região central do NSQ, preservando a

periferia desse núcleo (Fig.11 e 14).

44

Figura 11: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do NSQ do A.

planirostris, mostrando o padrão de imunorreatividade a VP (A) e VIP (B) no nível

caudal; a NPY (C) no nível médio e 5-HT (D) no nível rostral. Abreviações: 3V,

terceiro ventrículo; qo, quiasma óptico. Barra: 100 μm.

45

Proteínas ligantes de cálcio - PLCa

No NSQ do Artibeus planirostris foi detectada a presença neurônios

imunorreativos a CB (CB-IR) apenas no seu nível caudal (Fig.12 e 14). Essas céluas

foram mais abundantes na porção dorsal desse núcleo. A imunorreatividade a CR

também foi visualizada no NSQ, com pericários predominantemente localizados na

sua porção ventrolateral (Fig.12 e 14). Não foi observada imunorreatividade a PV na

referida estrutura (Fig.12 e 15).

Proteína acídica fibrilar glial – GFAP

Foi observada a imunorreatividade a GFAP (GFAP-IR) nos processos, assim

como, no corpo celular de astrócitos presentes no NSQ do Artibeus planirostris.

Essa marcação foi evidente ao longo de toda a extensão rostrocaudal desse núcleo.

A GFAP-IR é mais densa dentro do NSQ do que nas áreas hipotalâmicas

adjascentes (Fig. 12 e 15).

Tabela 1: Conteúdo neuropeptidérgico e de PLCa no NSQ do Artibeus planirostris

Neuropeptídeo/PLCa Células Fibras/terminais

VP + +

VIP + +

NPY - +

5-HT - +

CB + +

CR + +

PV - -

GFAP + -

Presença (+) ou ausência (-) de neurônios ou fibras/terminais imunorreativos.

46

Figura 12: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do NSQ do A.

planirostris, mostrando o padrão de imunorreatividade a CB no nível caudal; a CR

(B) e GFAP (D) no nível médio e PV (C) no nível rostral. Abreviações: 3V, terceiro

ventrículo; qo, quiasma óptico. Barra: 100 μm.

47



ilustrando o contorno citoarquitetônico; a distribuição de terminais retinianos

imunorreativos a CTb; distribuição de pericários positivos para VP e VIP.

48



ilustrando a distribuição de fibras/terminais imunorreativos a NPY e 5-HT e pericários

positivos para CB e CR.

49



ilustrando a distribuição de pericários positivos para PV e GFAP.

50

5.2 Folheto intergenicualdo


Nos cortes frontais do tálamo dorsal, corados pelo método de Nissl, com o

corante thionina, o complexo geniculado lateral apresenta o GLV e GLD. Entre essas

estruturas, foi identificada uma região com menor densidade celular, com o formato

de um fino folheto, a qual pela sua topografia foi identificada como FIG (Fig. 16 e

20).


As projeções retinianas para o FIG foram traçadas pelo uso de injeções

intravítreas de CTb. Fibras imunorreativas a esse composto foram visualizadas

bilateralmente ao longo da extensão rostro-caudal do FIG. Através desse padrão de

projeção, foi possível constatar que o FIG, em níveis rostral e médio, exibe sua

morfologia clássica, na forma de folheto interposto entre o GLD e o GLV e a nível

caudal expande-se medialmente contornando o GLV (Fig. 17 e 20).

51


planirostris nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), mostrando a citoarquitetura

do FIG pelo método de Nissl. (A’- C’) Respectivas imagens em maior aumento.

Abreviações: FIG, folheto intergeniculado; GLD, núcleo geniculado lateral dorsal;

GLV, núcleo geniculado lateral ventral Barra: 500 μm (A-C) e 100 μm (A’-C’).

52

Fig

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17

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FIG

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a:

500 μ

m e

100 μ

m.

53

5.2.3 Neuroquímica

Vasopressina – VP

No FIG do Artibeus planirostris não foi observado elementos imunorreativos a

VP. Esse mesmo padrão também foi visto no GLD e GLV.

Polipeptídeo Intestinal Vasoativo – VIP

Não foi visualizada imunorreatividade a VIP no FIG, assim como, no GLD e

GLV do Artibeus planirostris.

Neuropeptídeo Y- NPY

Foram encontradas no FIG do Artibeus planirostris raras células imunorreativas

a NPY (NPY-IR) ao longo de toda a sua extensão rostrocaudal. Esses neurônios

estavam imersos em um esparso plexo de fibras/terminais. Esse padrão de

distribuição de elementos NPY-érgicos não foi observado no GLD e GLV do referido

sujeito experimental (Fig.18 e 20).

Serotonina – 5HT

Um denso plexo de fibras/terminais serotonérgicas foi visualizado no FIG e no

GLV do Artibeus planirostris, diferentemente do GLD, no qual não foram detectados

elementos imunorreativos a essa substância (Fig.18 e 20).

54

Figura 18: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do complexo

geniculado lateral do A. planirostris, mostrando o padrão de imunorreatividade a

NPY (A) e GFAP (C) no nível caudal e 5-HT (B) no nível médio. Abreviações: FIG,

folheto intergeniculado; GLD, núcleo geniculado lateral dorsal; GLV, núcleo

geniculado lateral ventral. Barra: 100 μm.

55

Proteínas ligantes de cálcio - PLCa

Foram visualizados pericários e fibras/terminais CB-IR (Fig.16 e 18) e CR-IR

(Fig.19 e 21) no FIG e no GLD do Artibeus planirostris, ao longo de toda a extensão

rostrocaudal dessas estruturas. No GLV foi identificada esparsas células e

fibras/terminais que expressam CR. A imunorreatividade a PV não foi observada no

FIG, embora células marcadas para essa proteína foram vistas no GLD e GLV

(Fig.19 e 21).

Proteína acídica fibrilar glial - GFAP

No FIG do Artibeus planirostris foi visualizada GFAP-IR ao longo de toda a sua

extensão rostrocaudal. Essa marcação foi observada nos processos e no corpo

celular de astrócitos presentes nessa estrutura. GFAP-IR também foi identificada no

GLD e GLV. Essa marcação evidencia a atividade astrocitária nesses três núcleos

(Fig.18 e 21).

Tabela 2: Conteúdo neuropeptidérgico e das PLCa no FIG do Artibeus planirostris.

Neuropeptídeo/PLCa Células Fibras/terminais

VP - -

VIP - -

NPY + +

5-HT - +

CB + +

CR + +

PV - -

GFAP + -

Presença (+) ou ausência (-) de neurônios ou fibras/terminais imunorreativos.

56



imunorreatividade a PLCa: CB (A) no nível rostral; CR (B) no nível médio e PV

(C) no nível caudal. Abreviações: FIG, folheto intergeniculado; GLD, núcleo

geniculado lateral dorsal; GLV, núcleo geniculado lateral ventral. Barra: 100

μm.

57


secções coronais do complexo geniculado lateral do A. planirostris, no nível rostral,

médio e caudal, ilustrando o contorno citoarquitetônico; a distribuição de terminais

retinianos imunorreativos a CTb; distribuição de pericários positivos para NPY e

fibras/terminais imunorreativas a 5-HT.

58


secções coronais do complexo geniculado lateral do A. planirostris, no nível rostral,

médio e caudal, ilustrando a distribuição de pericários positivos para CB, CR, PV e

GFAP.

59

6. DISCUSSÃO


6.1.1 Citoarquitetura

De acordo com os nossos resultados, o NSQ do morcego Artibeus

planirostris, assim como em outros mamíferos, é um par de núcleos celulares

presente no hipotálamo anterior, localizado dorsalmente ao quiasma óptico e de

cada lado do terceiro ventrículo. Quanto ao seu aspecto morfológico, essa estrutura

apresenta forma semelhante a que é descrita no mocó (Nascimento Jr et al., 2010),

considerando que esse núcleo em ambos os animais apresenta forma seccional

triangular no nível rostral e um contorno arredondado no nível médio e caudal. A

localização do NSQ no Artibeus planirostris está em conformidade com o padrão

observado para todos os mamíferos estudados, como Rattus novergicus, hamster

(Mesocricetus auratus), gato (Felix domesticus), Macaca mulatta e macaco de cheiro

(Saimiri sciureus) (Lydic et al., 1982), cobaia (Cavia porcellus), gambá-da-Virgínia,

Monodelphis domestica, (Cassone et al., 1988), sagui (Costa et al., 1998), rato

espinhoso do Cairo (Acomys cahirinus), rato espinhoso dourado (Acomys russatus)

(Cohen et al., 2010) e mocó (Nascimento Jr et al., 2010), o que corrobora a ideia de

que o NSQ é um aparato neural filogeneticamente estável.


Com exceção do esquilo Spermophilus lateralis, única espécie que apresenta

um padrão de inervação exclusivamente contralateral (Smale et al., 1991), o NSQ

de todos os mamíferos estudados apresenta inervação bilateral pelas ipRGC,

embora diferenças entre as espécies sejam notadas quanto à intensidade de

distribuição das fibras ipsi e contralateralmente. No nosso estudo, pode-se observar

que o NSQ do Artibeus planirostris, recebe aferência retiniana bilateral, com

predominância contralateral ao longo de toda a sua extensão rostrocaudal. Em

estudos anteriores, esse padrão de distribuição foi observado em espécies não-

primatas, como rato (Johnson et al., 1988b; Levine et al., 1991), arganaz-toupeira

60

(Ellobius lutescens, Ellobius talpinus) (Herbin et al.,1994), rato-toupeira da Palestina

(Negroni et al., 1997),Tupaia glis (Moore, 1973; Magnin et al., 1989), furão (Mustela

pustorius) (Magnin et al., 1989), gato (Murakami et al., 1989; Matteau, 2003), mocó

(Nascimento Jr et al., 2010), Microtus montebelli (Uchiumi et al., 1995), coelho

(Juárez et al., 2013), cobaia (Cassone et al., 1988), Spermophilus beecheyi (Major et

al., 2003), hirace (Dendrohyrax dorsalis) (Magnin et al., 1989), gambá (Caluromys

philander) e ouriço (Hemiechinus auritus) (Moore, 1973).Uma distribuição bilateral e

quase simétrica das aferências retinianas sobre o NSQ foi descrita na preguiça

(Bradypus pilosa) (Magnin et al., 1989), marmota (Mustela vison) (Martinet et al.,

1992) e degus (Goel et al., 1999). Em mussaranho (Suncus murinus) (Tokunaga et

al., 1992), mussaranho das árvores (Tupaia belangeri) (Reuss e Fuchs, 2000),

Cryptomys anselli (Nemec et al., 2004), rato-toupeira da África do Sul (Negroni et al.,

2003) e na toupeira japonesa (Mogera kobeae) (Kudo et al., 1991) foi observado

uma predominância ipsilateral. Uma inervação bilateral e completamente simétrica

ou predominantemente ipsilateral foi vista em ovelhas (Tenosseaud et al., 1994)

Em quirópteros, estudos autoradiográficos detectaram projeções retinianas

bilaterais no NSQ do Pteropus giganteus, Myotis lucifugus (Cotter e Pentney, 1979),

Eptesicus fuscus e Artibeus jamaicenses (Cotter, 1985). Nesses dois últimos

morcegos, a maior concentração de aferências foi observada no lado contralateral.

No E.fuscus, fibras foram visualizadas na porção ventral e no A. jamaicenses, foram

encontradas na porção ventrolateral do lado contralateral e na porção ventromedial

do lado ipsilateral do NSQ (Cotter, 1985). Em Rhinolophus rouxi, com o uso do

traçador retrógrado peroxidade da raiz forte (HRP, do inglês, horseradish

peroxidade), projeções retinianas foram descritas como esparsas e a citoarquitetura

do NSQ não foi bem delimitada (Reimer, 1989). No Rousettus aegyptiacus e Carollia

perspicillata, essas fibras inervam bilateralmente e simetricamente o NSQ (Magnin et

al., 1989; Scalia et al., 2014).

Em hamters, camundongo e no Arvicantis niloticus existem registros

divergentes quanto ao padrão de distribuição retiniana para o NSQ. No Arvicantis

niloticus foi relatado que as aferências retinianas são predominantemente

contralaterais (Smale e Boverhof, 1999) ou bilateralmente simétricas (Gaillard et al.,

2013).Em hamsters, como o Phodopus sungaris, foi descrita uma predominância

ipsilateral no nível rostral; contralateral nos níveis médio e caudal (Reuss et al.,

1994) ou ainda contralateral assimétrica em indivíduos adultos e simétrico em jovens

(Yellon et al., 1993).No hamster turco (Mesocricetus blandt) e no Syrian ou Golden

61

hamster (Mesocricetus auratus) foi observado uma tendência ipsilateral no nível

rostral e quase simétrica no nível caudal (Pickard e Silverman, 1981; Youngstron e

Nunez, 1986) ou aproximadamente simétrica em todos os níveis (Youngstron et al.,

1991; Ling et al., 1998). Em camundongos foi vista uma distribuição bilateral, sendo

quase simétrica no Mus musculus (Abrahamsom e Moore, 2001; Hattar et al., 2006)

e com predominância contralateral no Peromyscus maniculatus bairdi e Peromyscus

leucopus (Youngstron e Nunez, 1986).

Em primatas, o mesmo padrão de dominância contralateral observado no

Artibeus planirostris foi encontrada em sagui (Costa et al., 1999), macaco-prego

(Cebus apella) (Pinato et al., 2009) e Saguinus oedipus (Moore, 1973). Uma

distribuição assimétrica ipsilateral foi visualizada em chimpanzé (Pan troglodytes)

(Tigges et al., 1977), gibão (Hylobates concolor), potto (Peridictus potto), bush baby

(Galago alleni, Galago demidovii) e Macaca fascicularis (Magnin et al., 1989;

Hannibal et al., 2014). No lêmure Microcebus murinus (Magnin et al., 1989) e no

macaco de cheiro (Tigges e O’Steen, 1974) foi descrita uma tendência bilateral e

simétrica das fibras retinianas. Na Macaca mulatta, a inervação retiniana sobre o

NSQ apresenta relatos contraditórios, sendo descrita como contralateral (Hendrikson

et al., 1972; Moore, 1973) ou ipsilateral (Hannibal et al., 2014).

A relevância funcional da variabilidade na distribuição do TRH sobre o NSQ

ainda não é completamente compreendida. Postula-se que essas divergências

reflitam apenas variações individuais ou diferentes abordagens metodológicas

(Major et al., 2003), como por exemplo, uma alta sensibilidade ao traçador por parte

de determinados grupos de ipGRC nas diferentes espécies estudadas (Costa et al.,

1999).

6.1.3 Neuroquímica

Quanto ao conteúdo neuropeptidérgico (Tabela 1), o NSQ do Artibeus

planirostris apresenta neurônios VP-IR na sua porção dorsomedial. Esse padrão de

distribuição das células vasopressinérgicas foi visualizado em rato (van den Pol e

Tsujimoto, 1985; Buijs et al., 1995; Moore et al., 2002; Morin et al., 2006),

camundongo (Abrahamson e Moore, 2001), esquilo da toca (Spermophilus

tridecemlineatus e Spermophilus richardsonii) (Reuss et al.,1989), Tupaia belangeri

chinensis (Ni et al., 2014), rato espinhoso do Cairo, rato espinhoso dourado (Cohen

et al., 2010), gambá-da-Virgínia, Monodelphis domestica (Cassone et al., 1988) e

62

hamster (Card e Moore, 1984). No esquilo palmado comum (Funambulus palmarum)

(Mammen e Jagota, 2011), macaco-prego (Sapajus apella) (Rocha et al., 2014) e

degus (Goel et al., 1999), pericários VP-positivos foram descritos na porção

dorsomedial e ventral do NSQ. Na Macaca fuscata (Ueda et al., 1983), Spermophilus

lateralis (Smale et al., 1991), rato-toupeira da Palestina (Negroni et al., 1997),

Arvicanthis niloticus (Smale e Boverhof, 1999), mocó (Nascimento Jr et al., 2010) e

humanos (Mai et al., 1991), células VP-IR foram observadas predominantemente na

porção dorsal do referido núcleo. No rato-toupeira da África do Sul, pericários VP-IR

foram localizados na região ventral e medial do NSQ, extendendo-se parcialmente

para o polo dorsal dessa estrutura (Negroni et al., 2003).

Em quirópteros, como o Miniopterus schreibersii fuliginosus, neurônios

parvocelulares VP-IR foram observados no NSQ (Mikami et al.,1988) e no

Rhinolophus ferrumequinum, esse mesmo tipo de célula foi visualizada na porção

dorsal e dorsomedial desse núcleo (Kumamoto et al., 1992). No sagui, existem

relatos divergentes quanto à presença de elementos imunorreativos a VP no NSQ.

Pericários VP-IR foram descritos como esparsos (Wang et al., 1997) ou ausentes no

referido núcleo (Costa et al., 1998). Células vasopressinérgicas não foram

identificadas no NSQ do musaranho mascarado (Tokunaga et al.,1992), rato-

toupeira-pelado (Heterocephallus glaber) (Rosen et al., 2007) e marmota (Larsen e

Mikkelsen, 1993; Martinet et al.,1995). Sugere-se que as células vasopressinérgicas

podem estar envolvidas na retransmissão da informação acerca da atividade do

NSQ para outras partes do cérebro (Bult et al., 1993).

O NSQ do Artibeus planirostris contém uma população neural que expressa

VIP na sua região ventromedial. Essa mesma distribuição de células VIP-IR foi

descrita no degus (Goel et al., 1999) e no mocó (Nascimento Jr et al., 2010). Um

padrão ventrolateral foi obervado em rato (van den Pol e Tsujimoto, 1985; Moore et

al., 2002; Morin et al., 2006), hamster (Card e Moore, 1984), Tupaia belangeri

chinensis (Ni et al., 2014), esquilo palmado comum (Mammen e Jagota, 2011) e

degus (Goel et al., 1999). No macaco-prego (Sapajus apella) (Rocha et al., 2014),

Arvicanthis niloticus (Smale e Boverhof, 1999), Spermophilus lateralis (Smale et al.,

1991), rato-toupeira da África do Sul (Negroni et al., 2003), rato-toupeira da

Palestina (Negroni et al., 1997), rato espinhoso do Cairo, rato espinhoso dourado

(Cohen et al., 2010), esquilo da toca (Reuss et al.,1989), camundongo (Abrahamsom

e Moore, 2001; Morin et al., 2006) e ouriço (Erinaceus europeus) (Antonopoulos et

al., 1987), pericários VIP-IR apresentaram maior concentração na porção ventral do

63

NSQ. No gambá-da-Virgínia, Monodelphis domestica (Cassone et al., 1988) e no

sagui (Costa et al., 1998), neurônios VIP-IR foram observados na porção

dorsomedial da referida estrutura. No NSQ do morcego Myotis lucifugus foi

visualizada uma densa concentração de elementos VIP-IR (Laemle e Cotter, 1988).

Postula-se que neurônios que expressam VIP estão relacionados com a

sincronização fótica dos ritmos circadianos (Ibata et al., 1989; Jacomy et al., 1999).

Diferentemente do Microcebus murinus (Bons et al., 1990), humanos (Mai et

al., 1991) e Echinops telfairi (Künzle e Unger, 1992), no NSQ do Artibeus planirostris

não foram identificados neurônios NPY-érgicos, mas sim um plexo de

fibras/terminais imunorreativas a essa substância na sua porção ventrolateral. Esse

tipo de configuração foi observada em degus (Goel et al., 1999), rato-toupeira da

África do Sul (Negroni et al., 2003) e esquilo da toca (Reuss et al.,1989). Uma

regionalização ventral das fibras/terminais NPY-IR dentro do NSQ foi observado em

rato (Van den Pol e Tsujimoto, 1985; Ueda et al., 1986; Moore et al., 2002; Morin et

al., 2006), sagui (Costa et al., 1998; Cavalcante et al., 2002), mocó (Nascimento Jr

et al., 2010), rato-toupeira da Palestina (Negroni et al., 1997), Arvicanthis niloticus

(Smale e Boverhof, 1999), Spermophilus lateralis (Smale et al., 1991), rato

espinhoso do Cairo e rato espinhoso dourado (Cohen et al., 2010). Nessas duas

últimas espécies, no nível caudal também foi observado a maior concentração

dessas fibras na região central do NSQ. Na Macaca fascicularis, exitem descrições

divergentes quanto à presença de imunorratividade a NPY no NSQ. A densidade de

fibras NPY-IR tem sido relatada como alta (Moore, 1989; Chevassus-au-Louis e

Cooper, 1998), moderada (Thind et al., 1993) ou ausente (Ueda et al., 1986). Esse

tipo de fibras também foram identificadas no NSQ do arganaz-da-pradaria (Microtus

ochrogaster) e arganaz-do-prado (Microtus pennsylvanicus)(Hostetler et al., 2013).

No quiróptero Myotis lucifugus não foram identificados elementos imunorreativos a

NPY (Laemle e Cotter, 1992).

Apesar de existir uma tendência interespecífica a concentração de fibras

NPY-IR na parte ventrolateral do NSQ, pode ocorrer variações na distribuição

dessas fibras sobre esse núcleo. Em camundongo (Cassone et al., 1988;

Abrahamsom e Moore, 2001) e hamster (Card e Moore, 1984; Ueda et al., 1986;

Morin et al., 1992), terminais NPY-IR preenchem todos os limites citoarquitetônicos

do NSQ. No macaco-prego (Cebus apella), a densidade de fibras/terminais NPY-

érgicos varia de esparso a moderado ao longo do eixo rostrocaudal do NSQ. No

nível rostral, esses elementos foram esparsamente distribuídos na periferia e, nos

64

demais níveis estavam mais densamente concentrados, principalmente na porção

central e lateral do NSQ (Pinato et al., 2009). Teoriza-se que o NPY está envolvido

na modulação da atividade do NSQ a estímulos fóticos e não-fóticos via TGH

(Mrosovsky, 1995; Muscat e Morin, 2006).

No Artibeus planirostris, um denso plexo de fibras serotonérgicas foi

observado predominantemente na porção ventral do NSQ. Esse padrão é similar ao

encontrado em rato, hamster, gato (Ueda et al., 1983), camundongo (Abrahamson e

Moore, 2001), degus (Goel et al., 1999), rato-toupeira da África do Sul (Negroni et

al., 2003), rato-toupeira da Palestina (Negroni et al., 1997), Arvicanthis niloticus

(Smale e Boverhof, 1999), Spermophilus lateralis (Smale et al., 1991), rato

espinhoso do Cairo e rato espinhoso dourado (Cohen et al., 2010). Na cobaia, fibras

5-HT-IR são distribuídas por todo o núcleo (Cassone et al., 1988). No sagui, esse

tipo de fibras formam um denso plexo que preenchem todo o NSQ, principalmente

na região central e dorsal, sendo quase completamente ausente na porção ventral

(Costa et al., 1998; Cavalcante et al., 2002). A distribuição de fibras serotonérgicas

no NSQ do macaco-prego (Cebus apella) é esparso e não apresenta uma

regionalização específica (Pinato et al., 2007). Em roedores, a fonte mesencefálica

dessas fibras é proveniente do núcleo mediano da rafe (Meyer-Bernstein e Morin,

1996; Moga e Moore, 1997; Hay-Schmidt et al., 2003), contudo, no Artibeus

planirostris, a identificação de pericários 5-HT-IR nos núcleos da rafe combinados

com técnicas hodológicas são necessários para determinar a fonte dessa inervação

no NSQ. Postula-se uma ação serotonérgica modulatória sobre os estímulos fóticos

no NSQ (Morin, 1999).

No presente trabalho, as PLCa foram estudadas no NSQ do Artibeus

planirostris. Pericários CB-IR foram visualizados apenas no nível caudal do NSQ,

com maior predominância na sua porção dorsal. A distribuição de células CB-IR

dentro dessa estrutura é similar a descrita no Arvicanthis niloticus (Mahoney et al.,

2000) e rato (Morin et al., 2006). No Rattus novergicus, esparsos neurônios CB-IR

foram observados, sem nenhuma concentração dessas células dentro de uma

subdivisão específica do NSQ (Mahoney et al., 2000). No camundongo, essa

população celular foi encontrada ao longo das subdivisões do NSQ, por toda a sua

extensão rostrocaudal (Abrahamson e Moore, 2001), enquanto no hamster forma um

subnúcleo central na metade caudal dessa estrutura (Silver et al., 1996). No rato-

toupeira da África do Sul (Negroni et al., 2003) e no mocó (Cavalcante et al., 2008)

neurônios CB-IR mostraram uma densa e uniforme distribuição ao longo de todo o

65

NSQ, concentrando-se na região central desse núcleo. No rato espinhoso do Cairo e

rato espinhoso dourado, esses neurônios formam um subnúcleo central na porção

médio-lateral do NSQ (Cohen et al., 2010). Em primatas, como o sagui, neurônios

CB-IR preenchem todos os limites citoarquitetônicos do NSQ (Cavalcante et al.,

2008), enquanto, em humanos e no Microcebus murinus concentram-se,

respectivamente, na porção central e ventral desse núcleo (Mai et al., 1991;

Cayetanot et al., 2007).

Células CR-IR foram encontradas ao longo de todo o NSQ, com maior

predominância na sua porção ventrolateral. Esse resultado é semelhante ao descrito

em camundongo (Marshall et al., 2000; Abrahamson e Moore, 2001; Morin et al.,

2006), hamster (Marshall et al., 2000) e macaco de cheiro (Fortin e Parent, 1997).

No Arvicanthis niloticus, neurônios CR-IR não encontrados em uma subdivisão

específica e foram distribuídos uniformemente ao longo de toda extensão

rostrocaudal dessa estrutura (Marshall et al., 2000). No mocó, pericários e uma

densa neurópila CR-IR foram observados em toda a extensão do NSQ, preenchendo

todos os seus limites citoarquitetônicos, enquanto no sagui, esses elementos são

preferencialmente distribuídos na porção ventral e dorsal do NSQ, com ausência de

imunorreatividade em um subnúcleo central (Cavalcante et al., 2008).

A imunorreatividade a PV não foi observada no FIG do Artibeus planirostris,

resultado similar aos dados encontrados na maioria das espécies estudadas, como

rato (Célio, 1990), mocó (Cavalcante et al., 2008), sagui (Costa et al., 1998;

Cavalcante et al., 2008) e macaco de cheiro (Fortin e Parent, 1997), divergindo dos

resultados descritos em gato, onde foram encontrados pericários no NSQ (De León,

1995).

De acordo com os nossos resultados, o NSQ do Artibeus planirostris apresenta

intensa GFAP-IR, quando comparado a outras regiões do hipotálamo. Em rato,

hamster (Morin et al., 1989), camundongo (Moriya et al., 2000; Santos et al., 2005),

Arvicanthis niloticus (Smale e Boverhof, 1999) e Spermophilus lateralis (Smale et al.,

1991), o NSQ é marcado por uma densa GFAP-IR, a qual é significativamente mais

alta que nas áreas hipotalâmicas adjascentes. No mocó, esse tipo de marcação

também foi detectada no NSQ, embora com a mesma intensidade de outras

estruturas hipotalâmicas circundantes (Nascimento Jr et al., 2010). A expressão

dessa proteína também foi observada no sagui (Moreira et al., 1997) e humano (Mai

et al., 1991; Stopa et al., 1999). Estudos em rato (Hajós, 2008) e camundongo

66

(Santos et al., 2005) evidenciam variação circadiana na expressão dessa proteína

no NSQ.

6.1.4 Organização neuroquímica do NSQ do Artibeus planirostris

Historicamente, tem sido proposto dois esquemas de organização do NSQ,

baseado em estudos com rato e hamster (Morin e Allen, 2006). Nessa primeira

espécie, a distribuição distinta de células que expressam VP e VIP, junto com o

padrão de inervação das principais vias aferentes, como TRH, TGH e rafe-NSQ,

permitiu a divisão do NSQ nas porções ventrolateral e dorsomedial (van den Pol e

Tsujimoto, 1985; Card e Moore, 1991). Em hamster, a região caudocentral do NSQ

apresenta pericários produtores de VIP, GRP, SP e CB (Lesauter, 2002). Essa

região, denominada de subnúcleo central, aparentemente é homóloga a uma região

contendo, GRP no NSQ de camundongo (Abrahamson e Moore, 2001; Morin et al.,

2006), ENK no Spermophilus lateralis (Smale et al., 1991), NT no rato (Moore et al.,

2002) e CB no rato espinhoso do Cairo e no rato espinhoso dourado (Cohen et al.,

2010). A descoberta desse subnúcelo no hamster, fundamentou o uso da

terminologia “cerne” e “casca” (Morin, 2007), sendo adotada também para rato

(Moore, 1996) e camundongo (Abrahamson e Moore, 2001). No rato, o cerne

equivale aproximandamente a região que contém neurônios VIP e GRP, assim

como, aferências da retina, FIG e do núcleo mediano da rafe. Já a casca, é descrita

como uma região que contém pericários VP e CR (Moore et al., 2002).

Embora ainda utilizada, a ideia da setorização em duas porções do NSQ tem

sido contestada (Morin et al., 2006; Morin e Allen, 2006; Morin, 2007). Dentre outros

fatores, o nível do NSQ, a ausência de padronização do plano de corte e variações

circadianas na expressão de substâncias neuroativas são fatores limitantes para o

conceito de “divisão” desse núcleo (Morin, 2007). Provavelmente, existem divisões

correspondendo a especializações funcionais do NSQ, próprias de cada espécie, e

que qualquer terminologia pode encontrar dificuldades de generalização. Essa

nomenclatura deve ser flexível para permitir reflexões sobre a organização intrínseca

do NSQ (Nascimento Jr et al., 2010).

O padrão de distribuição das células VIP e das aferências retinianas e

serotonérgicas sugerem que o NSQ do Artibeus planirostris trancede os esquemas

organizacionais clássicos, como as subdivisões ventrolateral-dorsomedial e casca-

67

cerne. Estudos moleculares e hodológicos são necessários para estabelecer uma

divisão específica desse centro circadiano nessa espécie de quiróptero.

6.2 Folheto intergenicualdo


Examinando as secções coronais do tálamo dorsal, o FIG do Artibeus

planirostris, como na maior parte das espécies de mamíferos não-primatas (Hickey e

Spear, 1976; Moore e Card, 1994; Goel et al., 1999; Negroni et al., 2003) está

localizado entre o GLV e GLD, na forma de uma fina lâmina de células, mal definidas

citoarquitetônicamente e melhor delimitada pelas projeções retinianas e conteúdo

neuropeptidérgico.


Como na maioria dos mamíferos não primatas (Tang et al., 2002; Morin et al.,

2003; Gaillard et al., 2013; Scalia et al., 2014), o FIG do Artibeus planirostris recebe

aferência retiniana bilateral. A inervação dessa estrutura pode apresentar uma forte

predominância contralateral, sendo observada em mocó (Nascimento Jr et al.,

2010), rato-toupeira da África do Sul (Negroni et al., 2003), mussaranho mascarado

(Mizuno et al., 1991), Microtus montebelli (Uchiumi et al., 1995), Spermophilus

beecheyi (Major et al., 2003), Cryptomys anselli (Nemec et al., 2004) e degus (Goel

et al., 1999). Em hamster (Morin et al.,1992), ouriço (Erinaceus europeus)

(Dinopoulos et al., 1987), coelho (Takahashi et al., 1977) e em duas espécies de

esquilo (Citellus tridecemlineatus e Spermophilus lateralis)(Agarwala et al.,1989;

Smale et al., 1991), o padrão de distribuição das projeções retinianas apresenta

discreta predominância contralateral. Uma inervação predominantemente ipsilateral

foi vista em arganaz-toupeira (Herbin et al.,1994) e completamente simétrica no

morcego Carollia perspicillata (Scalia et al., 2014). No Artibeus planirostris, a

aplicação de métodos quantitativos é necessário para determinar a predominância

das projeções retinianas no FIG.

68

6.2.3 Neuroquímica

O FIG foi pela primeira vez descrito como uma fina lâmina celuar localizada

entreo GLD e GLV do complexo geniculado lateral do tálamo (Hickey e Spear,

1976). Além da identificação topográfica dessa estrutura pelo padrão das projeções

retinianas, a presença de imunorreatividade a NPY é outro critério para delimitar os

seus limites citoarquitetônicos. No FIG do Artibeus planirostris foram visualizadas

raras células NPY-IR imersas em uma trama de fibras e terminais ao longo de toda a

sua extensão rostrocaudal, divergindo com a ausência desses neurônios no GLD e

GLV. Esse resultado é semelhante ao descrito em mocó (Nascimento Jr et al., 2010)

e rato-toupeira da África do Sul (Negroni et al., 2003). Em degus (Goel et al., 1999),

Arvicanthis niloticus (Smale e Boverhof, 1999), rato (Moore e Card, 1994) e hamster

(Morin et al., 1992) existe uma maior expressividade de células e fibras/terminais

NPY-érgicos, facilitando ainda mais a identificação dessa estrutura. Nessas duas

últimas espécies de roedores, a NPY-IR no FIG é co-localizada com células que

expressam GABA (Moore e Speh, 1993; Moore e Card, 1994).

Elementos NPY-IR também foram observados no FIG do Spermophilus

lateralis (Smale et al., 1991), arganaz-da-pradaria e arganaz-do-prado (Hostetler et

al., 2013), divergindo do morcego Myotis lucifugus, onde pericários positivos pra

essa substância não foram identificados (Laemle e Cotter, 1992). No homólogo

primata, NPG, neurônios NPY-IR também foram identificados no macaco-prego

(Cebus apella) (Pinato et al., 2009), sagui (Costa et al., 1998; Chevassus-au-Louis e

Cooper, 1998; Lima et al., 2012), Microcebus murinus, Macacca Fascicularis

(Chevassus-au-Louis e Cooper, 1998) e humanos (Moore, 1989).

As células que expressam NPY no FIG são consideradas a origem do TGH

em roedores (Moore e Card, 1994; Morin et al., 1992). Esse tracto é a fonte de

todas as fibras a NPY no NSQ de hamster (Morin et al., 1992) e rato (Card e Moore,

1982). A presença dessa população celular no FIG, embora de maneira esparsa,

assim como, de fibras NPY-érgicas na região ventrolateral do NSQ, sugerem a

existência do TGH no Artibeus planirostris.

Células 5-HT-IR não foram identificadas no FIG do Artibeus planirostris,

embora um denso plexo de fibras/terminais serotonérgicos foram visualizadas ao

longo de todo eixo rostrocaudal dessa estrutura. Esse padrão também foi descrito

em rato (Mantyh e Kemp, 1983), hamster (Morin et al., 1992) e no NPG de primatas,

69

como sagui (Lima et al., 2012) e macaco prego (Cebus apella) (Pinato et al., 2009),

divergindo do Arvicanthis niloticus, que apresenta um moderado plexo dessas fibras

(Smale e Boverhof, 1999). No degus, fibras/terminais 5-HT-IR são restritas a porção

lateral do FIG (Goel et al., 1999). A presença de fibras/terminais 5-HT-IR no FIG do

Artibeus planirostris pode ser um indicativo de que o sistema serotonérgico pode ter

um efeito modulatório na atividade desse centro circadiano. Além disso, a presença

de 5-HT no NSQ e FIG sugere a participação desse neurotransmissor no controle da

ritmicidade biológica no referido quiróptero.

Quanto ao conteúdo das PLCa (Tabela 2), o FIG do Artibeus planirostris

apresenta imunorreatividade a CB e CR, além de total ausência de expressão de PV

em pericários ou em terminais. Células contendo CB estão presentes no rato (Celio,

1990), camundongo (Carneiro, 2000), rato-toupeira da África do Sul (Negroni et al.,

2003) e mocó (Cavalcante et al., 2008). Neurônios que expressam CR são

encontrados no camundongo (Carneiro, 2000), mocó (Cavalcante et al., 2008) e rato

(Arai et al., 1993). PV está ausente no FIG de mocó (Cavalcante et al., 2008), rato-

toupeira da África do Sul (Negroni et al., 2003), rato (Celio, 1990, Moore e Card,

1994) e camundongo (Carneiro, 2000). No NPG de sagüi, neurônios positivos para

CB (Costa et al., 1999), CR (Cavalcante et al., 2007) e PV (Costa et al., 1999)

também foram observados, além de fibras/terminais para essa última proteína

(Costa et al., 1998; Cavalcante et al., 2008).

A GFAP está presente em toda a extensão do FIG do Artibeus planirostris. Os

nossos resultados estão em conformidade com os descritos em Arvicanthis niloticus

(Smale e Boverhof, 1999), rato, hamster (Morin et al., 1989), Spermophilus lateralis

(Smale et al., 1991), mocó (Nascimento Jr et al., 2010) e camundongo (Carneiro,

2000). Nesse último animal foi demonstrada uma variação na expressão circadiana

de GFAP no FIG (Morya et al., 2000).

Em conformidade com os resultados descritos em degus (Goel et al., 1999),

Spermophilus lateralis (Smale et al., 1991) e Arvicanthis niloticus (Smale e

Boverhof,1999), não foi identificada imunorreatividade a VP e VIP no FIG do

Artibeus planirostris. Em rato (Sprague-Dawley), existem relatos contraditórios

quanto à presença de fibras VIP-IR no FIG. Mantyh e Kemp (1983) apontam que não

foi observada imunorreatividade a VIP no FIG, GLD e na porção medial do GLV.

Fibras VIP-IR foram visualizadas apenas na porção lateral do GLV. Em

contrapartida, Moore e Card (1994) descrevem a presença de um moderado plexo

dessas fibras no FIG, bem como, a concentração desses mesmos elementos no

70

GLD, além da presença de varicosidades na porção medial e lateral do GLV. Esses

autores postulam que essas fibras podem ser provenientes do NSQ.

6.3 Discussão funcional e filogenética da organização neuroquímica do NSQ e FIG

O crescente conjunto de dados comparativos no tocante à organização do

NSQ e FIG nas diferentes espécies estudadas permite a discussão de aspectos

evolutivos e funcionais desses centros circadianos. Alguns elementos presentes

nessas estruturas são invariáveis, como a presença de células produtoras de VIP no

NSQ, ENK no FIG e de GFAP em ambos os centros. A invariabilidade desses

neurotransmissores, possivelmente persistiu a partir de um ancestral comum, em um

estágio evolutivo inicial. Nesse sentido, o fato de nenhuma espécie examinada ter

perdido essas características sugere a sua importância funcional e universal entre as

espécies. Em contrapartida, outros compostos neuroativos são variáveis, como a

pericários que expressam de SP, sendo encontrados no NSQ de Macaca

fasciculares (Mick et al., 1992) e hamster (Morin et al., 1992), divergindo do padrão

descrito no Arvicanthis niloticus (Smale e Boverhof 1999), Clethrionomys ratius

(Samuel et al., 2006) e mocó (Nascimento Jr et al., 2010). Essa varabilidade não

esclarece o padrão evolutivo dessa substância e sugere que ela tenha sido perdida

e novamente recuperada por neurônios do NSQ em diferentes momentos da história

evolutiva dos mamíferos.

Quanto a determinação do nicho temporal das espécies, apesar da aparente

similaridade em relação a diversos aspectos organizacionais do STC, nenhum

elemento da anatomia intrínsica do NSQ foi identificado para distinguir animais

diurnos e noturnos (Smale et al., 2003). Isso sugere que a alocação temporal deve

estar na dependência de outros fatores, como as projeções eferentes (Smale et al.,

2003), além da organização estrutural do NSQ ou FIG (Nascimento Jr et al., 2010).

71

7. CONCLUSÕES

Diante da análise dos resultados supracitados, pode-se chegar as seguintes

conclusões:


7.1.1 O NSQ do Artibeus planirostris apresenta topografia em conformidade com o

padrão observado para todos os mamíferos estudados;

7.1.2 A projeção retiniana para o NSQ dispõe-se bilateralmente, com leve

predominância contralateral;

7.1.3 A caracterização neuroquímica do NSQ demonstrou a presença dos seus

principais neurotransmissores, como VP, VIP, NPY e 5-HT, além de marcação

para PLCa e GFAP;

7.1.4 Apesar da existência de uma setorização do NSQ do Artibeus planirostris,

essa caracterização é singular e própria da espécie. Nesse sentido, a

caracterização neuroquímica desse núcleo não permite enquadrá-lo em

nenhum dos esquemas organizacionais clássicos descritos na literatura;

7.2 Folheto intergeniculado

7.2.1 O FIG do Artibeus planirostris apresenta localização conforme a maior parte

das espécies de mamíferos não-primatas.

7.2.2 A projeção retiniana para o FIG é bilateral, semelhante à maioria das espécies

estudadas;

7.2.3 O FIG apresenta elementos imunorreativos a NPY, 5-HT, GFAP e PLCa;

72

7.3 Nicho temporal e os centros circadianos

7.3.1 Não foi possível estabelecer qualquer relação entre o padrão das aferências

retinianas sobre ambos os centros circadianos e o nicho temporal desse

quiróptero;

7.3.2 Não foi possível estabelecer qualquer relação entre o padrão neuroquímico do

ambos os centros circadianos e o nicho temporal dessa espécie de morcego.

73

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Esse estudo é o primeiro a caracterizar os principais centros circadianos do

STC do morcego Artibeus planirostris, um quiróptero endêmico da América do Sul.

Nossos resultados descrevem a citoarquitertura, o padrão de inervação retiniana e o

conteúdo neuroquímico desses centros. Este trabalho representa um instrumento

fundamental para estabelecer o referido morcego como modelo experimental

envolvendo o sistema nervoso. Adicionalmente, os resultados aqui discutidos

oferecem a possibilidade de compreender os aspectos filogenéticos dos quirópteros

e do próprio STC. Quanto à alocação temporal das espécies, nenhuma relação

aparente foi encontrada entre o padrão das aferências retinianas e o conteúdo

neuroquímico do NSQ e FIG. Nesse sentido, a determinação do nicho temporal

entre animais diurnos, crepusculares e noturnos ainda não foram totalmente

esclarecida. Estudos neuroquímicos e cronobiológicos devem ser realizados com o

intuito de elucidar o verdadeiro papel da organização anatômica no controle da

ritmicidade biológica.

74

*American Psychological Association

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ANEXOS

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