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MARINA BRITO SILVA O Efeito do Losartan na morfologia do músculo esquelético do modelo Golden Retriever Muscular Dystrophy: uma droga promissora para a regeneração da musculatura distrófica? São Paulo 2009
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MARINA BRITO SILVA
O Efeito do Losartan na morfologia do músculo esquelético do
modelo Golden Retriever Muscular Dystrophy: uma droga promissora para a regeneração da musculatura distrófica?
São Paulo
2009
MARINA BRITO SILVA
O Efeito do Losartan na morfologia do músculo esquelético do
modelo Golden Retriever Muscular Dystrophy: uma droga promissora para a regeneração da musculatura distrófica?
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciências
Departamento: Cirurgia
Área de Concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e
Silvestres
Orientadora: Profa. Dra. Maria Angélica Miglino
São Paulo
2009
Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.2143 Silva, Marina Brito FMVZ O Efeito do Losartan na morfologia do músculo esquelético do modelo
Golden Retriever Muscular Dystrophy: uma droga promissora para a regeneração da musculatura distrófica? / Marina Brito Silva. – São Paulo : M. B. Silva, 2009. 88 f. : il.
Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Cirurgia, 2009.
Programa de Pós-Graduação: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres.
Área de concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres.
Orientador: Profa. Dra. Maria Angélica Miglino.
1. Losartan. 2. Golden Retriever (GRMD). 3. TGF-beta. 4. Distrofia muscular. I. Título.
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: SILVA, Marina Brito Título: O efeito do Losartan na morfologia do músculo esquelético do modelo
Golden Retriever Muscular Dystrophy: uma droga promissora para a
regeneração da musculatura distrófica?
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Anatomia dos Animais
Domésticos e Silvestres da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Mestre em Ciências
Data: ____/___/______
Banca Examinadora
Prof.Dr.______________________________Instituição:__________________ Assinatura___________________________ Julgamento: _________________ Prof.Dr.______________________________ Instituição:__________________ Assinatura____________________________________________________ Julgamento:___________________________________________________ Prof.Dr.______________________________Instituição:__________________ Assinatura____________________________Julgamento:_________________
DEDICATÓRIA
Dedico esta pesquisa a todos os
pacientes com Distrofia Muscular,
principalmente àqueles que tive a alegria
de conviver. Vocês foram o meu maior
incentivo e serão sempre um exemplo de
vida!
Aos queridos cães do canil GRMD-Brasil
que serviram não apenas como modelo
animal de pesquisa, mas como uma força
para enfrentar cada obstáculo!
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo dom da vida e por colocar no meu caminho as pessoas
e vivências necessárias para fazê-la valer a pena!
Aos professores Maria Angélica Miglino e Carlos Eduardo Ambrósio, pela
oportunidade e confiança na realização do tão desejado mestrado.
A prima Maria Helena, sempre disposta a ajudar o próximo, me abriu essa
oportunidade única.
Ao meu futuro marido e eterno companheiro, Rodrigo, pelo amor, apoio e
paciência dedicados em todos os momentos.
Aos meus pais, Joaquim e Dora, os grandes incentivadores do meu
crescimento pessoal e profissional.
Aos meus queridos irmãos, Cláudia, Elisa e Saulo, pela alegria do convívio em
família.
A todo o grupo do canil, pelos momentos de união e apoio. Pessoas que se
tornaram muito importantes não apenas para a realização dessa pesquisa, mas
como grandes amigos: Thais: que desde o início foi sempre tão solicita, suas
idéias e sugestões foram fundamentais para esse estudo. Levo comigo sua
determinação e otimismo! Angélica: difícil até achar palavras para dizer o
quanto você é especial para mim, obrigada pela amizade! Leandro: deixo aqui
meu eterno agradecimento pelas muitas horas de discussão e de amizade, não
consigo imaginar essa pesquisa sem seus ensinamentos e sugestões.
Karlinha: sempre com uma palavra de apoio e força, você é só sucesso!
Marininha: exemplo de determinação, obrigada pela ajuda! Os amigos Jú
Passos, Matheus, Sarmento, Cris, Renata, Carol, Di, agradeço pelos
momentos de alegria e contribuição dentro e fora do canil!
Ao querido funcionário do canil e amigo Augusto, pela sua caridade
incondicional.
A profa. Dr. Mayana Zatz, pela busca incessante ao tratamento da distrofia
muscular.
A professora Maria Helena Larsson, por disponibilizar sua atenção e serviços
de laboratório e cardiologia.
Aos queridos funcionários, Jaque, Maicon, Diogo e Ronaldo pela atenção e
ajuda necessária.
A professora Patrícia Gama e todo seu grupo de pesquisa, por me acolherem
tão bem em seu laboratório e me guiarem nas reações de imuno-histoquimica.
A FAPESP, pelo apoio financeiro.
RESUMO SILVA, M. B. O efeito do Losartan na morfologia do músculo esquelético do modelo Golden Retriever Muscular Dystrophy: uma droga promissora para a regeneração da musculatura distrófica? [The effect of Losartan in the skeletal muscle morphology of Golden Retriever Muscular Dystrophy: a promising drug for the dystrophic muscle regeneration?]. 2009. 88 f. Dissertação (Mestrado em Ciências)- Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.
A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) tem como característica marcante a
substituição do músculo pelo tecido fibroso, sendo este um dos maiores
obstáculos para a eficácia de terapias para a distrofia muscular. Intervenções
para preveni-la provavelmente poderão ser necessárias como parte de um
tratamento eficaz. Correlações significativas entre fibrose e a expressão do
TGF-beta, uma citocina fibrogênica multifuncional nas distrofias musculares
têm sido relatadas, enfatizando o papel dessa citocina no desenvolvimento da
fibrose muscular e sugerindo-a como alvo para terapias antifibróticas. Nesse
estudo avaliamos o efeito do Losartan sobre o desenvolvimento da fibrose na
musculatura esquelética do modelo canino Golden Retriever Muscular
Dystrophy (GRMD). Foi realizado previamente um estudo piloto com um cão
distrófico para estipular dosagem e eventuais efeitos colaterais ao
medicamento. Foram utilizados cinco cães adultos, sendo dois machos e duas
fêmeas e um animal controle. Utilizou-se a dose de 50mg de Losartan,
administrada via oral, uma vez ao dia. Os exames clínicos e laboratoriais não
evidenciaram reação adversa durante o período do experimento, portanto, o
Losartan mostrou-se como uma terapia segura. Os fragmentos da biopsia
muscular retirados antes de iniciar com o Losartan (T0) e após (Tf) foram
utilizados para histologia e imuno-histoquimica do TGF-beta1 para comparação
destes dois tempos. As avaliações de goniometria e perimetria juntamente com
os resultados de imuno-histoquimica e quantificação do colágeno ajudaram a
inferir sobre o efeito do Losartan na fibrose do músculo distrófico. Não foi
encontrada diferença significativa para os valores de goniometria e perimetria.
Já a porcentagem da área de deposição de colágeno dos animais nos Tf foi
estatisticamente menor do que o T0. A diminuição da presença do TGF-beta1
evidenciada nas imagens de imuno-histoquimica, com a diminuição do depósito
de colágeno, após o período de uso do Losartan, sugerem um efeito inibitório
do medicamento sobre esta citocina nos músculos dos cães GRMD estudados.
Palavras-chave: Losartan. Golden Retriever (GRMD). TGF-beta. Distrofia
Muscular.
ABSTRACT
SILVA, M. B. The effect of Losartan in the skeletal muscle morphology of Golden Retriever Muscular Dystrophy: a promising drug for the dystrophic muscle regeneration? [O efeito do Losartan na morfologia do músculo esquelético do modelo Golden Retriever Muscular Dystrophy: uma droga promissora para a regeneração da musculatura distrófica?]. 2009. 88 f. Dissertação (Mestrado em Ciências)- Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.
Duchenne Muscular Dystophy (DMD) has the substitution of the muscle by
connective tissue as its most relevant characteristic. Once fibrotic proliferation is
a major obstacle to the efficacy of therapies for muscular dystrophies, early
interventions to prevent it will probably be necessary as part of an effective
treatment. A significant correlation between fibrosis and the expression of TGF-
beta 1, a multifunctional cytokine, in Duchenne muscular dystrophies has been
reported, emphasizing the role of this cytokine in the development of muscle
fibrosis, and suggesting it as target for fibrotic therapies. In this study we
evaluated the effect of Losartan over the development of the connective tissue
on the skeletal musculature of the canine model GRMD. One dystrophic dog
was previously used in the pilot study to estipulate the dosage and any side
effects caused by Losartan. Five adults dystrophics dogs, two male and two
female and one control animal were used in the experiment. A dose of 50mg of
Losartan was orally given once a day. The clinical and laboratorial exams did
not show any adverse effect through the experimental period, therefore
Losartan utilization showed to be a safe therapy. Muscle biopsy fragments have
been removed before starting Losartan (T0) and after (Tf) were used for
histology and TGF-beta1 imunohistochemistry to compare this two times. The
evaluations range of motion and limb circumference measures within
imunohistochemistry and colagen quantification results helped to infer about
Losartan effect in the dystrophic muscle fibrose. Range of motion and limb
circumference values did not show statistical difference. Although the
percentage of connective tissue deposition area in the animals in Tf was
statistically lower than T0. The decrease of TGF-beta1 signalization showed in
imunohistochemistry pictures within the decrease of connective tissue
deposition, after Losartan, suggest an inhibitory effect of this medication
through this cytokine in the studied GRMD muscle.
Key Words: Losartan. Golden Retriever (GRMD). TGF-beta. Muscle
Dystrophy.
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1 INTRODUÇÃO
A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) constitui um distúrbio genético, de
caráter recessivo, com alta taxa de mutação em um gene localizado no braço curto
do cromossomo X. Apresenta como sinais clínicos a perda progressiva da força
muscular, resultando em fraqueza dos músculos respiratórios e cardíacos, sendo
que a grande maioria dos pacientes desenvolve cardiomiopatia. Ocorre,
principalmente, em pessoas do sexo masculino, sendo que as mulheres são
portadoras. Sua incidência é de cerca de um para cada 3500 nascidos vivos do sexo
masculino. No Brasil, ocorrem por ano, cerca de 700 novos casos de DMD. Ela
caracteriza-se pela deficiência ou ausência de proteína distrofina na superfície da
membrana da célula muscular, podendo acometer a musculatura cardíaca e o
sistema nervoso (CAROMANO, 1999).
A distrofina é o maior componente do complexo distrofina - glicoproteínas
(DGC), no qual liga o citoesqueleto da miofibrila com a matrix extracelular. A ruptura
desse complexo causa um aumento da susceptibilidade de lesão induzida pela
contração, e lesão do sarcolema, ocasionando necrose da miofibrila, levando à
perda progressiva da massa e função muscular (COULTON, 1988; PASTORET,
1995; TANABE, 1996).
O músculo distrófico apresenta variações no tamanho da fibra muscular e
acúmulo de núcleos centrais, infiltração de tecido conectivo e adiposo e elevado
nível de creatinoquinase no plasma. O estágio inicial da doença é caracterizado pela
presença de grupos focais de miofibras necróticas e hipertrofia muscular. Na fase
patológica, repetidos ciclos de degeneração desgasta a capacidade de regeneração
das células satélites, e estão associadas com repetidos ciclos de inflamação e
fibrose significante, no qual afeta os músculos de forma geral, podendo levar a uma
parada cardiorrespiratória (DECONINCK; DAN, 2007).
Embora o camundongo mdx seja o modelo animal mais utilizado em estudos
da patogênese e dos efeitos da terapia gênica e transplante celular, a lenta
progressão da doença nesse modelo o torna clinicamente pouco viável para se
transpor resultados para humanos portadores de DMD. O quadro clínico do mdx é
mantido relativamente normal, já que apresenta uma menor degeneração das fibras
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musculares, maior regeneração e menos fibrose do que encontrado nos pacientes
com DMD (PASTORET; SEBILLE, 1995; SHELTON, 2004).
O modelo canino Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) é o modelo
animal mais similar a DMD humana. Por ser geneticamente homólogo, compartilha
seu quadro de miopatia severa e desenvolvimento clínico letal. Em ambas as
doenças, a necrose e regeneração começam cedo no músculo esquelético e estão
associados com a proliferação do tecido conjuntivo (COOPER et al., 1988;
VALENTINE et al., 1988; VALENTINE et al., 1990).
Não existe até o momento uma terapia efetiva para bloquear ou reverter o
processo da distrofia muscular. Embora a terapia gênica e o transplante de células
tronco possam fornecer a cura para a DMD, resultados positivos podem demorar
algum tempo até serem clinicamente viáveis. Neste sentido, a busca de terapias
paralelas e medicamentosas que possam melhorar a condição vital do paciente, por
retardo da progressão dos sinais clínicos, é de grande importância, uma vez que,
melhoram a qualidade de vida dos mesmos (COHN, 2007).
Quanto ao tratamento de manutenção, principalmente de fisioterapia, a
literatura científica, ainda que escassa, recomenda diferentes programas de
exercício para as distrofias musculares e, aquelas encontradas, sugerem um efeito
benéfico da atividade física para a DMD, principalmente naqueles com alterações
mínimas da função muscular (DEMOS, 1983; RIDEAU, 1985; VIGNOS et al., 1996;
ANSVED, 2003).
Dentre os agentes terapêuticos propostos para uso no paciente DMD, o
Losartan, um bloqueador do receptor da angiotensina II, pode ser bastante
promissor, já com resultados positivos no modelo mdx, uma vez que equilibrou os
ciclos de degeneração e reparação (COHN et al., 2007).
Sendo estes ciclos os principais responsáveis pela perda progressiva de
massa e força musculares em portadores de DMD, novas pesquisas em um modelo
animal com maior similaridade clínica da doença, o GRMD, tornam-se necessárias,
com o objetivo de gerar novos conhecimentos sobre seu efeito na progressão desta
doença.
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2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)
Distrofia muscular é um termo amplamente utilizado para se referir a qualquer
doença de ordem primária da musculatura esquelética, que resulta em degeneração
progressiva, regeneração limitada e fibrose de mifobrilas (BERGMAN et al., 2002). A
DMD é a forma mais grave, comum e de evolução mais rápida dentre as miopatias
hereditárias. Teve seu primeiro gene identificado em 1986 e recebe esse nome em
alusão ao neurologista francês que forneceu a primeira descrição completa da
patologia, em 1868 (JORDE, 2004).
Mutações no gene da distrofia levam à deficiência da distrofina, uma proteína
associada ao sarcolema dos músculos lisos, cardíacos e esquelético, que ajuda a
manter a integridade da membrana durante o processo de contração muscular. Esta
proteína é codificada por um enorme gene localizado no cromossomo -X, sendo,
portanto, mais susceptível a mutações. Sendo assim, a deficiência da distrofina afeta
predominantemente o sexo masculino, pelo fato das pessoas deste sexo possuir
apenas um cromossomo X (BERGMAN et al., 2002).
Segundo Valentine et al. (1989), o músculo sem a proteína distrofina, fica
mais susceptível a lesões induzidas pelo exercício, evidenciada pelo rápido influxo
de enzimas musculares. Pelo fato desse complexo protéico estar embebido no
sarcolema e de fornecer a ligação entre o citoesqueleto interno da célula muscular e
a matrix extracelular, a perda desta proteína destrói essa ligação e então gera a
degeneração muscular (DAVIES, 1997).
Esta descoberta importante feita há mais de dez anos abriu novos caminhos
para investigações produtivas. O complexo processo relacionado à necrose da fibra
muscular não tem sido claramente descrito, portanto não existe ainda nenhum marco
de melhora no tratamento dos pacientes (TKATCHENKO et al., 2001).
Vainzof e Zatz (2003) relataram que estudos moleculares em indivíduos com
distrofias musculares, têm apresentado variabilidade clínica inter e intra-familiar em
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diferentes desordens genéticas, levantando a importância de outros fatores, que não
os genéticos, na determinação da expressão fenotípica.
As crianças afetadas apresentam fraquezas progressivas devido à perda da
massa muscular e as contraturas. A lesão da miofibrila sem uma total recuperação
tanto nas crianças quando no modelo canino GRMD, resultam em fibroses,
contraturas e fraqueza muscular (CHILDERS et al; 2002).
O diagnóstico de DMD pode ser estabelecido na maioria dos casos, através
da história familiar, de achados clínicos, laboratoriais e genéticos (analise de DNA),
podendo ser utilizados eventualmente, exames eletrofisiológicos e histológicos. Os
níveis enzimáticos, principalmente de creatinoquinase (CK), biopsia muscular e
análise de DNA são amplamente explorados na caracterização da doença
(CAROMANO, 1999).
A dosagem da CK é de extrema importância, uma vez que também servirá de
indicação no diagnóstico diferencial entre as formas de distrofias musculares
progressivas. Na DMD, os autores colocam que os níveis CK estão aumentados de
100 a 300 vezes na fase pré-clínica. Através de Western blot também pode-se
diagnosticar a DMD ao detectar menos de 3% de distrofina no músculo,associada à
diminuição de α-sarcoglicanas (ERAZO-TORRICELLI, 2004).
Na análise da estrutura do músculo esquelético a partir da biópsia, realizada
normalmente nos músculos quadríceps, gastrocnêmio ou deltóide, observa-se
padrão distrófico, ou seja, comum às distrofias musculares progressivas, mostrando
hipertrofia e atrofia de fibras, perda da forma poligonal em corte transversal, necrose
e regeneração de fibras com deposição de tecido conjuntivo e adiposo. Em algumas
distrofias, tais como as congênitas (DMC) e fascioescapulohumeral (DFEH), o
padrão distrófico da fibra muscular não se apresenta em idades precoces. Desta
forma, a ausência de alterações distróficas características, nem sempre descarta a
existência de uma distrofia muscular (CAROMANO, 1999; ERAZO-TORRICELLI,
2004).
Wang et al. (1999) investigaram trinta pacientes portadores de DMD e
notaram que alterações histopatológicas foram observadas em todos os casos
estudados, tais como degeneração, necrose e regeneração de fibras musculares.
Em relação às reações imuno-histoquímicas, todos os sujeitos mostraram reação
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negativa para anticorpos anti-distrofina Dys1-3. Em três dos trinta casos estudados,
com quadro clínico severo, foram observadas algumas características diferentes na
morfometria, como ausência de diferença no diâmetro das fibras do tipo I e II, e o
diâmetro das fibras do tipo I em um dos casos foi menor do que todos os outros
trinta, com grande proliferação de tecido conjuntivo e adiposo.
O estudo imuno-histoquímico permite detectar a presença ou ausência de
proteínas do sarcolema ou ligadas a esta membrana, incluindo a determinação da
porcentagem de núcleos centralizados e a variabilidade do tamanho das fibras.
Ambos os parâmetros juntos descrevem bem o processo de degeneração-
regeneração da musculatura esquelética (BRIGUET, 2004; ERAZO-TORRICELLI,
2004).
2.2 Modelo de estudo
Modelos animais são usados para fornecer hipóteses científicas na DMD.
Dentre eles, os mais estudados são o camundongo mdx e o canino Golden Retriever
Muscular Dystrophy (GRMD).
O camundongo mdx mantém relativamente seu quadro clínico devido à
patologia ser considerada moderada e a função mecânica muscular pouco
comprometida, além de não apresentar fibrose endomisial extensiva, uma das
características patológicas mais importantes na DMD (YAMAZAKI et al., 1994;
COLLINS & MORGAN, 2003). Por outro lado, o modelo canino GRMD além de
apresentar o curso rapidamente progressivo e fatal da doença, possui o
envolvimento muscular análogo aos pacientes com DMD. Portanto, os testes de
força muscular e de amplitude de movimento podem ser usados como parâmetros
em cachorros afetados, predizendo dessa forma os resultados do tratamento e a
patogênese (CHILDERS et al., 2002).
O GRMD é considerado o modelo animal mais relevante para o estudo da
DMD, embora o uso deste modelo animal para pesquisa requer um alto custo, além
de possuir uma variação intra-animal a qual dificulta uma padronização (COLLINS;
MORGAN, 2003; MCCLOREY et al., 2006).
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Mutações espontâneas do gene da distrofina, resultando na distrofia muscular
ligada ao cromossomo X têm sido identificadas em diversas raças de cães
domésticos: o Golden Retriever, o Rottweiller e o Beagle. Destes, o GRMD tem sido
o modelo animal mais amplamente estudado e o melhor caracterizado. Em 1958,
Méier documentou o primeiro caso de cão com distrofia em um filhote de Golden
Retriever. Desde as primeiras descrições, a mutação do gene da distrofina no
GRMD tem sido identificada e então, este modelo animal tem sido reconhecido e
amplamente utilizado nas avaliações experimentais de novos tratamentos
previamente aos estudos clínicos em humanos (COLLINS; MORGAN, 2003;
SHELTON; ENGVALL, 2004;).
O cruzamento de cães GRMD de uma fêmea heterozigota, ou seja, portadora
do gene com a distrofia, com um macho afetado gera machos normais, fêmeas
heterozigotas e machos e fêmeas afetados (NGUYEN, 2002).
Clinicamente, os cães machos afetados cansam-se com facilidade,
desenvolvem deformidades esqueléticas e marchas alternantes anormais,
caracterizadas por passadas rígidas e curtas. Podem, ainda, apresentar redução na
capacidade de abrir os maxilares e dificuldade na apreensão e deglutição de
alimentos; a maior parte da musculatura esquelética torna-se atrófica, porém, certos
grupos musculares e a língua apresentam-se com hipertrofia (NGUYEN et al., 2002).
Esta hipertrofia está associada com a disfunção da faringe e do esôfago resultando
em disfagia, sialorréia e regurgitação. A função respiratória está diminuída e
caracterizada pelo o aumento da freqüência respiratória de repouso e um excessivo
componente abdominal respiratório após mínimos esforços (SHELTON, 2005).
A patogênese do GRMD se manifesta intra – útero e pode ser identificado a
partir do nascimento, com importantes sinais de necrose dos músculos dos
membros, pescoço e tronco que progridem conforme o animal alcança a maturidade
(COLLINS; MORGAN, 2003). Os sinais clínicos progridem rapidamente entre os três
e seis meses de idade (KORNEGAY et al.,1994). O estágio inicial da doença é
caracterizado pela presença de grupos focais de miofibrilas necrosadas, hipertrofia
muscular e altos níveis anormais de CK. Em uma segunda fase (patológica),
repetidos ciclos de degeneração diminuem a capacidade de regeneração das
células satélites e mecanismos fibróticos causam o progressivo depósito de tecido
fibroso e colagenoso.
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Em humanos, este processo ocasiona contraturas articulares, perda da
marcha entre 10-12 anos de idade, e na maioria das vezes, assim como ocorre com
os seres humanos, os cães distróficos morrem por falência respiratória e/ou
cardíaca, embora alguns alcancem a idade adulta (COLLINS; MORGAN, 2003).
Estudos “in vivo” da musculatura pélvica têm mostrado que cachorros com
distrofia muscular de Duchenne são mais fracos que os cachorros normais em todas
as idades. Essas semelhanças clínicas na evolução e gravidade da distrofia entre
humanos com DMD e o modelo GRMD, justificam seu uso como modelo de estudo
para os mecanismos que contribuem para a lesão em músculos distróficos
(CHILDERS, 2001).
2.3 Regeneração Muscular/ Reparação tecidual
A distrofia muscular progressiva (DMP) é caracterizada pela necrose das
fibras musculares, regeneração e fibrose endomisial (YAMAZAKI et al., 1994).
Durante a lesão muscular o músculo esquelético tem a extraordinária
habilidade de iniciar um processo de reparação rápido e extensivo, prevenindo a
perda de massa muscular. A reparação do músculo esquelético é um processo
rapidamente sincronizado envolvendo a ativação de várias respostas celulares. A
fase inicial da reparação muscular é caracterizada pela necrose do tecido lesado e
ativação da resposta inflamatória. Esta fase é rapidamente seguida da ativação das
células miogênicas para proliferar, diferenciar e se fundirem, ocorrendo a formação
de uma nova miofibrila e reconstituição do aparato contrátil funcional (CHARGÉ,
2004).
As células satélites são células miogênicas que participam na reparação e
crescimento das fibras musculares (REIMANN et al., 2000). A ativação da célula
satélite adulta é o elemento chave neste processo. O fator de sinalização liberado
durante o processo de regeneração tem sido identificado, mas suas funções ainda
não foram totalmente definidas. Evidências recentes suportam a idéia de uma
possível contribuição das células troncos adultas no processo de regeneração
muscular (CHARGÉ, 2004).
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É sabido que a falta de distrofina na DMD resulta em necrose da fibra
muscular logo no início da doença e que a capacidade de regeneração fica
comprometida ao longo do curso da doença. Sabe-se também que o fator de
crescimento (TGF-beta) tem propriedades que podem causar inibição parcial
temporária de diferenciação das células satélites inibida. A remoção da sinalização
do TGF durante estágios tardios de regeneração podem resultar na fusão extensiva
das células satélites e subseqüente formação de novas fibras (ALLEN; BOXHORN,
1987).
Estudo feito por Cozzi et al. (2001), mostrou que a substituição do músculo
por tecido fibrótico foi claramente evidenciada bem antes de completar a maturação
muscular, mostrando que esta não é um fator crítico para a iniciação da necrose da
fibra no modelo canino, ao contrário do que é sugerido para a DMD.
Ainda nesse estudo, as porcentagens de fibras necrosadas e
hipercontraturadas mostraram declínio para níveis moderados e estáveis em animais
distróficos idosos. A regeneração, a qual mostrou-se prevalente durante o estágio
inicial da lesão, também declinou para níveis baixos em animais adultos. Este
declínio pode ser devido à exaustão do potencial de regeneração seguido de
repetidos ciclos de degeneração-regeneração (COZZI et al., 2001).
O aumento progressivo da fibrose intersticial no músculo acaba impedindo a
migração das células miogênicas, as quais são necessárias para a formação
muscular (LUZ et al., 2002). A proliferação do tecido conectivo é também variável
nos pacientes com DMD, e embora a fibrose geralmente aumente com a progressão
da doença, ela pode não estar relacionada com a idade (COZZI et al., 2001).
O papel da fibrose não tem sido bem esclarecido e ainda não é claro porque a
capacidade de regeneração declina na DMD e em camundongos mdx (LUZ et al.,
2002).
A fibrose é capaz de limitar a utilidade de terapias gênicas ou transplantação
mioblastica para corrigir o defeito primário, já que a proliferação de tecido conectivo
barra o suporte nutricional para a fibra muscular e a migração e fusão de novas
células implantadas. O tratamento anti-fibrose de pacientes DMD, tendo como alvo
os mediadores da citocina como o tratamento com antiinflamatórios ou TGF-beta,
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podem limitar a degeneração muscular e contribuir para a melhora do curso da
doença (PASSERINI et al; 2002).
2.4 Losartan Losartan é uma potente droga anti-hipertensiva, inibidora dos receptores AT1
da angiotensina II, sendo que seu uso vem sendo sugerido promissoriamente como
opção terapêutica no tratamento de doenças musculares progressivas.
Os antagonistas da angiotensina II (AAIIs) foram introduzidos para o
tratamento da hipertensão arterial há cerca de 10 anos. Durante esse período eles
foram avaliados não apenas em termos de eficácia e segurança, mas também em
vários estudos grandes com desfechos clínicos (RIBEIRO; GAVRAS, 2006). Os
AAIIs são eficazes em todas as formas clínicas de hipertensão e em todos os grupos
étnicos. Foi visto que ele atua efetivamente abaixando a pressão sanguínea em
diversos modelos animais e humanos com hipertensão (CHRIST et al., 1993).
Os principais estudos clínicos do Losartan, em pacientes diabéticos com
nefropatia e proteinúria comprovaram, além de redução da pressão arterial, proteção
cardiovascular e renal (RIBEIRO; GRAVAS, 2006). Segundo Goa et al. (1996), o
efeito anti-hipertensivo do Losartan é evidenciado com uma semana de inicio de
uso.
Em paciente com hipertensão moderada, foi relatado que uma dose de 50 a
100 mg do Losartan uma vez ao dia como monoterapia é suficiente para abaixar a
pressão em uma semana, ou no máximo seis semanas, além de ser uma droga bem
tolerada. O tempo para atingir o pico de concentração no plasma é mais ou menos
de uma hora para o Losartan e de três a quatro horas para seu metabólico E 3174.
Essa droga pode ser administrada com ou sem comida e em pacientes com alto
risco de hipotensão e com disfunção hepática, a dose inicial deve ser de 25mg. Não
há necessidade de ajustar a dose para pacientes idosos ou com disfunção renal.
20
Dados obtidos em poucos pacientes e, evidências em diversos estudos em
animais sugerem que o Losartan causa regressão da hipertrofia no ventrículo
esquerdo (GOA; WAGSTAFF, 1996).
Estudos recentes também mostraram em camundongos mdx que o Losartan
normaliza a síntese de colágeno e assim reverte a fibrose ventricular esquerda em
ratos com hipertensão espontânea (SHR) (VARO et al., 2007). Estes achados
sugerem que o tratamento com Losartan restaura a atividade da colagenase no
ventrículo esquerdo de SHR. Portanto, o efeito antifibrótico desse medicamento em
SHR parece ser não apenas por sua habilidade em diminuir a síntese de colágeno
tipo I, mas também devido sua capacidade de estimular a degradação do colágeno.
Ainda nesse estudo, Varo et al. (2007) relataram que a administração do
Losartan resultou na diminuição da expressão do TGF-beta, um fator de crescimento
que está presente e aumentado no ventrículo esquerdo dos SHR.
Em um estudo feito em camundongos com hipertensão espontânea foi
administrado Losartan via oral em doses de 1a 30 mg/kg/dia por oito a vinte
semanas, e foi evidenciado um aumento da taxa de sobrevida e a prevenção no
desenvolvimento de infartos cerebrovascular e cardiovascular. O efeito foi evidente
durante o uso do Losartan e persistiu por oito semanas depois de parado com o
medicamento. Foi mostrado também que o Losartan (10mg/kg/dia) reduziu o
colágeno e, portanto a fibrose do miocárdio tanto em modelo hipertensivo com um
clampe quanto com dois clampes renais (GOA; WAGSTAFF, 1996).
A farmacocinética e a relação de efeito concentração – plasma do Losartan foi
determinada em uma pesquisa feita com cachorros anestesiados e conscientes. A
biodisponibilidade via oral de doses únicas de 5 a 20 mg/kg mostrou-se consistente
e previsível, porém a absorção foi baixa e rápida, com pico de nível no plasma
observados em 1 hora. O tempo de eliminação (meia vida) foi de 108 a 153 min. O
estudo mostrou alta significância entre a relação concentração e efeito (CHRIST et
al., 1993).
Outro estudo foi realizado avaliando o efeito do E-3174, seu metabólico ativo,
no sistema cardiovascular no modelo canino. Concluiu-se que este modelo de
estudo é apropriado para uso na caracterização dos efeitos do Losartan e seu
metabólico nos caninos com insuficiência cardíaca, não havendo diferença entre
21
eles. Para essa pesquisa foi utilizada uma dosagem de 1 mg/ml/kg do Losartan e 0.3
e 1mg/ml/kg do E-3174 em caninos, administrados pela veia femoral por 10 min de
infusão (SUZUKI et al., 2001).
Segundo Christ et al. (1993), o protótipo do antagonista do receptor de
angiotensina II, deveria permitir mais o uso racional desta droga em estudos
utilizando modelos animais apropriados.
Segundo Sweet et al. (1993), os modelos animais são bons preditores da
resposta humana. Embora a formação do maior metabólico do Losartan, o E 3174,
diferir de acordo com as espécies, estudos em ambos animais e humanos, sugerem
uma associação entre nível de droga no plasma e os antagonistas da angiotensina
II.
Goldberg et al. (1995) testaram a segurança e tolerância do Losartan em
aproximadamente 2900 pacientes hipertensos tratados em experimentos duplo
cego. Os efeitos adversos mais reportados foram dor de cabeça (14.1%), infecções
das vias áreas superiores (6.5%), tonturas (14.1%), astenia/fadiga (3.8%) e tosse
(3.1%), sendo que estes sintomas também foram freqüentemente reportados em
pacientes recebendo placebo. Apenas o sintoma tontura mostrou relação freqüente
com os efeitos adversos ao medicamento comparado ao placebo. Em pesquisas
clínicas controladas, o Losartan foi a droga mais bem tolerada quando comparada
aos outros agentes antihipertensivos, como foi determinado pela incidência de
pacientes reportando qualquer experiência relacionada com os efeitos adversos da
droga. Não houve nesse estudo nenhuma diferença clínica importante tanto nas
fichas clínicas, quanto laboratoriais nos subgrupos demográficos de idade, sexo ou
raça, demonstrando uma excelente tolerância.
Até agora, uma das únicas drogas utilizadas rotineiramente em pacientes com
DMD é a administração crônica de corticoesterioides (Predinisona). A maioria dos
médicos inicia a prescrição diária da Predinisona quando os pacientes começam a
apresentar progressivamente os sintomas (CHEN et al., 2005).
Wagner et.al. 2002 mostraram que a reposição por tecido fibrótico e
gorduroso em diafragma de camundongo mdx, como resultado de repetidos ciclos
de degeneração e diminuição de regeneração muscular, parece ser atenuado na
falta da miostatina (membro da família do TGF-beta). Estes achados, mais uma vez,
22
confirmam que a regeneração muscular pode ser relacionada com a inibição da
atividade do TGF-beta, cuja proposta está sendo elaborada com o uso do Losartan
(WAGNER et.al. 2002).
2.5 TGF- beta
Pelo fato da distrofina estar ausente na membrana sarcoplasmática, tanto nos
pacientes quanto no modelo GRMD, durante a contração muscular principalmente,
ocorre ruptura dessa membrana, causando o influxo de cálcio e posterior ativação da
protease endógena com a ativação da cascata inflamatória (COLLINS; MORGAN,
2003). Como conseqüência dessa inflamação, ocorre necrose e substituição do
tecido muscular por tecido fibroso e adiposo (KORNEGAY et al., 2003).
Embora a falta da distrofina tenha sido conhecida como a causa da
degeneração da fibra muscular, a patogênese da fibrose intersticial permanece
ainda desconhecida. Porém, sabe-se que envolve a ação de diversas citocinas,
como as de transformação do fator de crescimento (TGF-β 1) (GOSSELIN et al.,
2004).
TGF- β1 pertence à família multifuncional de peptídeos que promovem o
acúmulo da matriz extracelular, agindo diretamente para estimular a síntese de
diversas matrizes moleculares importantes como a fibronectina, colágenos e as
proteoglicanas. (KHALIL et al., 2000). Apresenta múltiplas funções, como, por
exemplo, pode estimular ou inibir o crescimento de células em cultura, sendo que a
proliferação de fibroblastos é aumentada, enquanto que o crescimento das células
epiteliais, endoteliais, linfóides e os mioblastos são suprimidos (YONG Li et al;
2003).
O TGF-beta, conhecido por acelerar o crescimento dos fibroblastos devido
suas propriedades fibrogênicas, é visto como o primeiro fator responsável pela
indução da fibrose em diversos tecidos lesionados, sendo um candidato que pode
causar fibrose na DMD e ter um impacto negativo no processo de regeneração
muscular, enquanto que em células musculares normais, ele está ausente
(YAMAZAKI,1994; YONG LI et al; 2003).
23
Esse fator de crescimento é pouco descrito no músculo de pacientes, com
poucos e recentes estudos sugerindo que a ativação desta via pode levar a
apoptose muscular na miopatia. Porém, o TGF-beta 1 é bem conhecido e estudado
como regulador de diversas respostas celulares como a proliferação, diferenciação,
migração e apoptose, e também é conhecido como um forte modulador da
inflamação. O RNAm e a proteína do TGF-beta1 estão aumentado em músculos de
pacientes sintomáticos com DMD e outras miopatias (CHEN et al., 2005).
Recente artigo publicado mostrou que o aumento da atividade do TGF-beta
no músculo esquelético impede a resposta fisiológica das células satélites de
regenerar os músculos nas várias formas de miopatia, um processo essencial para a
preservação da arquitetura do músculo e sua função (COHN et al., 2007). Este fator
de crescimento induz também o acúmulo de matriz extracelular em várias doenças
como as cirroses hepáticas e pneumonite intersticial.
Para investigar sua função na patogênese na Distrofia Muscular Progressiva
(DMP) um estudo feito por Yamazaki (1994) determinou o grau de expressão do
TGF-beta1 e seu local de imunoreatividade. Foi verificado que TGF-beta 1 apresenta
um papel importante na síntese e no acúmulo de matriz extracelular em DMP e está
também envolvido na fibrose da DMD (YAMAZAKI, 1994).
Yamazi et al. (1994) reportou que no músculo do paciente com DMD, ocorre
alta imunoreatividade do TGF-beta1 na fibra muscular e no espaço extracelular,
apesar disso, estes dados pouco indicam o tipo celular do RNA mensageiro (RNAm)
do TGF-beta1. Usando hibridização in situ, os dados do estudo de Gosselin et al.
(2004) indicam que no diafragma do modelo mdx, células mononucleadas,
presumamente células inflamatórias de infiltração parecem ser a fonte primaria do
RNAm do TGF-beta1. Numerosos estudos têm mostrado que o nível de células
inflamatórias está significantemente aumentado no músculo do mdx, incluindo
macrófagos, células T CD4 e CD8, eosinofilos. Destas células, macrófagos parecem
contar com o maior número no músculo do mdx.
Em marcação de imuno-histoquimica o TGF-beta geralmente está presente
em áreas do perimísio e endomisio do tecido conectivo, enquanto em indivíduos
normais não apresenta nenhuma marcação (BERNASCONI et al., 1995). Segundo
Andreetta et al. (2006) e Ishitobi et al. (2000), o TGF-beta está aumentado no
músculo e no plasma de pacientes com DMD.
24
Estudo feito por Chen et al. em 2005 mostrou que a via do TGF-beta está
altamente sinalizada em pacientes sintomáticos com DMD (idade entre 5 -12 anos)
mas não na idade infantil, apesar de mostrar uma forte evidencia da resposta
inflamatória nesse estágio de vida. Outro estudo relata um pico no nível de TGF-
beta1 entre 2- 6 anos de idade (BERNASCONI et al., 1995). Segundo esse mesmo
autor, a expressão dessa citocina está relacionada com a idade do paciente e com o
grau de fibrose muscular.
Em estudos dos músculos do diafragma em camundongos mdx, sinais de
fibrose estão presentes desde as seis semanas de idade e o aumento da
concentração de colágeno corresponde com o aumento do TGF-beta. Portanto, esta
citocina parece ter dois papéis na patogênese do músculo distrófico. Primeiro,
promovendo a fibrose muscular, e segundo, inibindo a diferenciação miogênica, no
qual poderia contribuir para a perda progressiva das fibras musculares (GOLDSPINK
et al., 1977). Juntamente com outros autores, este estudo mostrou que defeitos na
degradação do colágeno também têm papel na fibrose do músculo distrófico.
Foi observado em um estudo (YONG LI et al; 2003), que o aumento da
expressão do TGF-beta1, estimulou a diferenciação dos mioblastos em células
fibróticas in vivo, porém o tratamento com decorin, um inibidor de TGF-beta 1, como
visto em outros estudos em camundongos mdx (WAGNER, 2002; YONG LI et al.,
2003; GOSSELIN, 2004; COHN et al., 2007) preveniu este processo de
diferenciação. Estes resultados podem determinar o mecanismo envolvido no
desenvolvimento da fibrose na musculatura esquelética lesionada, e
conseqüentemente direcionar para o desenvolvimento de novas estratégias
terapêuticas, prevenindo este processo fibrótico e promovendo a regeneração
muscular.
Portanto, intervenções terapêuticas que visam neutralizar as citocinas podem
ser benéficas na diminuição da progressão patológica da doença (GOSSELIN;
WILLIAM, 2004).
Apesar de ser uma estratégia promissora para o aumento da massa e força
muscular em pacientes com doenças musculares degenerativas, incluindo a DMD,
essa terapia não irá corrigir o defeito molecular nestas patologias. O grande
impasse é se o aumento da massa muscular resultante da inibição da atividade da
25
miostatina (membro da família do TGF-beta) pode ser mantido ao longo do tempo
nas etapas repetidas dos ciclos de degeneração e reparação (WAGNER et al; 2002).
26
3 OBJETIVOS
Os objetivos do estudo foram divididos em objetivos geral e específicos
conforme citado abaixo.
3.1 Objetivo geral
Avaliar o efeito da droga Losartan no músculo esquelético distrófico no
modelo GRMD e sua relação com as alterações músculo-esqueléticas e efeitos
adversos do medicamento neste modelo de estudo da DMD.
3.2 Objetivos específicos - Observar possíveis efeitos adversos em fígado e rins, por meio de avaliação
bioquímica do sangue e da função renal, avaliando a viabilidade do uso do Losartan
nos cães afetados pela distrofia muscular.
- Identificar, por meio da imuno-histoquímica, a presença de TGF-beta 1 no músculo
esquelético de cada animal antes da aplicação do losartan e nos diferentes tempos
de aplicação do mesmo, comparando entre eles e também com o controle.
- Identificar, através da técnica de imuno-histoquimica, se houve alteração na
expressão da proteína distrofina na membrana das fibras esqueléticas dos animais
submetidos à terapia com Losartan e do controle.
- Avaliar a quantidade de tecido conjuntivo (fibrose muscular), antes da aplicação do
Losartan e nos diferentes tempos de aplicação do mesmo, comparando entre os
animais e também com o controle.
27
- Acompanhar a evolução das alterações músculo esqueléticas da doença por meio
de avaliações de Amplitude de movimento articular e Circunferência dos membros
nos diferentes tempos de aplicação do Losartan.
- Relacionar os achados moleculares e morfológicos com os dados das avaliações
músculo esquelética dos animais GRMD tratados e não tratados com Losartan,
antes e depois da aplicação do medicamento.
28
4 MATERIAIS E MÉTODOS
O projeto proposto foi conduzido após aprovação pela Comissão de Bioética
da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo
(FMVZ-USP), protocolo número 1175/2007.
A colônia de cães GRMD – Brasil, localizado na Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Departamento de Cirurgia –
Setor de Anatomia, possui dezenove animais afetados pela distrofia muscular
homóloga à Distrofia Muscular de Duchenne encontrada em humanos, estes com
idades compreendidas entre sete e trinta e nove meses de idade, destinados à
terapia medicamentosa e celular para a Distrofia Muscular. Além destes possuiu
ainda dezenove fêmeas portadoras, destinadas à reprodução.
4.1 Delineamento experimental
Foram selecionados cinco cães adultos da raça Golden Retriever afetados
pela distrofia muscular de Duchenne (GRMD), sendo três cães machos (um deles
controle) e duas fêmeas, pertencentes ao grupo de animais do canil GRMD Brasil
localizado no Departamento de Cirurgia da FMVZ-USP, coordenado pela Profa. Dra.
Maria Angélica Miglino (Quadro 1).
29
NOMES TATUAGEM NASCIMENTO PESO GRUPO
Bis 2L2 11/04/06 19kg Controle
Suflair 3H10 15/04/06 26kg experimental
Lucky CH5 24/02/05 21kg experimental
Traquinas 1X1 09/04/06 19kg experimental
Lola 3H6 15/04/06 25kg experimental
Quadro 1 –Animais selecionados do Canil GRMD Brasil/ USP para a pesquisa
Os critérios de seleção do estudo foram: animais distróficos adultos, que não
estivessem participando de outro estudo e nem usando outra medicação. Todos os
animais eram mantidos sob condições adequadas de cuidados médicos veterinários,
alimentação, higiene e recreação.
Devido ao número restrito de cães para o estudo, um animal foi considerado
controle (2L2) dos outros quatro, para avaliação da progressão da doença. Os
quatro animais experimentais foram comparados entre si, e com o controle, nos
tempos antes (T0) e após os diferentes tempos de uso do medicamento (Tf).
Os animais foram avaliados no primeiro momento determinado como tempo
zero (T0), antes de iniciar administração do medicamento, em Maio de 2008 com os
protocolos e parâmetros de avaliação descritos abaixo, e foram reavaliados após
aplicação do Losartan. O animal CH5 recebeu o medicamento durante seis meses, o
animal 3H6 e 3H10 durante quatro meses e o animal 1X1 durante dois meses, tendo
os mesmos parâmetros do T0 avaliados pelo mesmo examinador.
4.2 Estudo Piloto
Antes do início do experimento, foi realizado um estudo piloto com um animal
adulto do sexo masculino (CH5), data de nascimento (24/02/05) do canil GRMD para
estipular dosagem do medicamento e reações adversas do mesmo.
30
Foi realizado biopsia no T0 (antes de começar com medicamento) com a
finalidade de avaliar a morfologia das fibras musculares e também verificar por meio
de imuno-histoquimica a presença de TGF-beta 1 antes e após o tratamento com o
Losartan. Foi iniciado com o medicamento no dia 03/10/07. A dosagem inicial do
Losartan foi de 12,5mg, dobrando a intensidade em intervalos de dois meses, até
chegar na dosagem final estipulada de 50mg.
Os principais efeitos adversos a longo prazo do Losartan, verificados em
estudo duplo cego de Goal (1996) com 2800 pacientes humanos portadores de
hipertensão severa, estão descritos no quadro 2. Para identificá-los e também com o
objetivo de acompanhar a evolução da doença nos cães tratados, foi instituído
exame clínico semanal de acordo com ficha clinica estipulado pelos médicos
veterinários do Canil GRMD – USP (Figura 1).
EFEITOS ADVERSOS
Dores de cabeça (14,1 %)
Infecções das vias aéreas superiores (6,5%)
Tonturas (4,1%)
Astenia/fadiga ( 3,8%)
Tosse (3,1%)
Quadro 2– Efeitos adversos do Losartan
31
Figura 1 - Ficha clínica utilizada para avaliação semanal dos animais
32
4.3 Protocolo de uso do Losartan
O protocolo para uso do Losartan foi estabelecido depois de realizado estudo
piloto em um dos cães distróficos e com referência em experimentos previamente
feitos em cães e humanos usando o Losartan, porém com outra finalidade
(HASHIMOTO et al., 1999; SUZUKI et al., 2001; WAGSTAFF, 1996; WONG et al.,
1991; GOA).
A dose estipulada foi de 50mg, uma vez ao dia, via oral nos quatro cães
experimentais.
4.4 Parâmetros de Avaliação
Todos os animais foram avaliados no T0 e após a aplicação do Losartan, no
tempo final do experimento (Tf), com parâmetros que buscaram levantar dados
sobre: A Amplitude de movimento articular (ADM), a fim de acompanhar a evolução
da patologia através dos encurtamentos musculares e contraturas articulares;
Perimetria, para avaliar o ganho ou perda de massa muscular e aferição da Pressão
Arterial, para verificar se não ocorria hipotensão devido ao efeito vasodilatador do
medicamento Losartan.
33
4.4.1 Avaliação da amplitude de movimento articular ou Goniometria
Foram avaliadas no T0 e Tf as articulações do membro pélvico, como as
articulações do quadril, joelho e tarso, e do membro torácico, como as articulações
do ombro, cotovelo e carpo, a fim de acompanhar a evolução da fibrose muscular,
sabendo que esta, quando aumentada, pode levar a uma diminuição da amplitude
de movimento. Os dados foram coletados com um goniômetro universal médio da
marca ISP. Os animais foram posicionados em decúbito lateral, confortavelmente, e
a ADM medida a partir do ponto de flexão máxima da articulação avaliada, até a
extensão máxima, através da movimentação passiva e lenta da articulação pelo
avaliador.
Os animais não receberam sedação durante a coleta dos dados para permitir
a expressão normal de dor. O centro do goniômetro foi posicionado em cada eixo
articular durante as medidas. Os braços distais e proximais do goniômetro foram
posicionados nas marcações anatômicas selecionadas dos membros (Figura 2).
Figura 2 - Avaliação da amplitude de movimento articular usando o goniômetro
4.4.2 Avaliação da Circunferência do membro ou Perimetria
Foram avaliados no T0 e Tf os grupos musculares dos segmentos da coxa e
perna bilateralmente do membro pélvico, com intuito de analisar a massa muscular
34
dos animais, verificando se houve ganho, manutenção ou perda da massa muscular,
antes e após a aplicação do Losartan. Foi utilizada uma fita métrica padrão
posicionado no ventre muscular do músculo avaliado. Tanto para a perimetria,
quanto para a goniometria foram realizadas três medidas consecutivas de cada
membro e achado a média. Para análise dos valores de goniometria e perimetria, os
dados do membro esquerdo e direito foram expressos em média e desvio padrão.
4.4.3 Biópsia muscular
A coleta dos fragmentos musculares foi retirada do ventre do músculo bíceps
femoral do membro pélvico, alternando o lado direito e esquerdo de cada um dos
cães (experimental e controle), antes de iniciar a terapia com o Losartan (tempo
inicial) e ao final do protocolo terapêutico (tempo final) com a finalidade de avaliar a
morfologia das fibras musculares dos cães tratados e do controle e também verificar
por meio de imuno-histoquimica a expressão do TGF-beta1 nos dois momentos da
avaliação. Foi realizado biópsia do tipo aberta e retirado um fragmento de 1x 2 cm²
(Figura 3). Após canulação venosa e fluidoterapia de manutenção, os animais foram
submetidos ao seguinte protocolo anestésico: associação Maleato de Acepromazina
+ Cloridrato de Tramadol (0,05 mg/kg e 2mg/kg, respectivamente) via intramuscular.
Anestesia local infiltrativa à base de Cloridrato de Lidocaina 2% sem vasoconstrictor
(7mg/kg) para incisão de pele, divulsão de tecido subcutâneo e fascia muscular. No
momento da coleta do fragmento muscular será administrado Propofol (2,5 mg/kg)
via intravenosa. No pós-operatório imediato foi utilizada Dipirona (25mg/kg) e
Carprofeno (2,2mg/kg), ambos via intravenosa. A analgesia mediata e de
manutenção foi conduzida a partir da utilização dos mesmos fármacos administrados
por via oral durante 3 a 5 dias. Foi utilizada antibioticoterapia à base de Cefalexina
(20mg/Kg) BID, por 7 dias.
35
Figura 3 – A e B: Coleta do músculo bíceps femoral durante procedimento de
biópsia muscular
4.4.4 Protocolo Histológico – Morfometria
Os fragmentos musculares coletados a partir de biópsia aberta (T0 e Tf) de
cada animal foram incluídos em Paraplast, corados com Picrossírius para
identificação do colágeno entre as fibras musculares. Os fragmentos foram fixados
em paraformaldeido a 4% durante um período superior a 24 horas. Em seguida,
foram desidratados em série crescente de etanol (70 a 100%) para desidratação e
xilol para diafanização, utilizando-se procedimento convencional, para inclusão em
Paraplast® (Leica/Germany), confeccionando-se blocos retangulares com base de
3x4 cm.
Foram realizados cortes de 5μm em micrótomo (Leica RM 2065) para
obtenção das lâminas, e posteriormente desparafinizados em estufa a 60ºC por 2
horas. Utilizou-se a coloração de Hematoxilina e Eosina para análise estrutural e das
características histopatológicas do músculo distrófico, e a de Picrossírius para
identificação e quantificação das fibras colágenas musculares. As laminas foram
fotomicrografadas em Microscópio Olympus BX 60 acoplado a câmera Axio CAM
HRc, utilizando-se o software Zeiss® KS 400.
A B
36
Para a quantificação do colágeno muscular, foram padronizadas 10 fotos de
cada corte de cada animal referentes aos dois tempos: T0 e Tf. Foram analisados
um corte em cada lâmina, com objetiva de 40x, que possui área total por campo de
149774 micrômetros quadrados (µm2). A área ocupada pelas fibras colágenas em
cada imagem foi mensurada por um programa de histomorfometria específico do
software Zeiss® KS 400. Os valores das áreas de colágeno obtidos nos 10 campos
de cada corte foram somados e em seguida foi calculada a porcentagem de
colágeno em relação à área total dos 10 campos (2246610,0 μm2). Os cálculos
foram feitos segundo a fórmula: (Somatório das mensurações) x (área total
analisada)-1 x 100 = porcentagem de fibra de colágeno por área.
4.4.5 Protocolos de Imuno-histoquímica (IHC)
Foram utilizados dois protocolos de imuno-histoquímica como mostrado
abaixo.
4.4.5.1 Protocolo Imuno-histoquimica (IHC) para o TGF-beta 1
Foi estipulado protocolo de imuno-histoquimica (IHC) para avaliação do TGF-
beta1 no músculo dos cães distróficos. Como o Losartan pode levar a inibição do
TGF-beta1, que por sua vez está relacionado com o aumento da fibrose,
pretendemos verificar através da imuno-histoquimica a resposta desse medicamento
na musculatura esquelética dos cães GRMD.
A imuno-histoquimica foi realizada em cortes histológicos de 5µm de
espessura, dispostos em lâminas previamente tratadas com poli-D-lisina. Depois de
desparafinizados, os cortes foram hidratados em TBS 5mM.Triton X-100 0,1%, TBS
5mM, pH 7,4 e tratados com H2O2 3% diluído em metanol para inativação de
peroxidase endógena. Em seguida, os cortes foram lavados com H2O destilada,
receberam TBS, TBS 5mM.BSA 0,1%, e depois tratados com hialuronidase diluída
37
em tampão acetato para a recuperação do antígeno. Após estes procedimentos, os
cortes foram lavados com TBS 5mM.BSA 0,1% para em seguida receberem o soro
de cabra 40% diluído com TBS 5mM.BSA 0,1%. As lâminas foram incubadas com
anticorpo primário policlonal (rabbit anti TGF-β1 Imprint, 1:100) overnight a 4ºC, o
controle negativo não recebeu o anticorpo primário. Os cortes, inclusive o controle
negativo, foram incubados 2 h TA com anticorpo secundário (biotinylated goat anti-
rabbit, Jackson Immunoresearch) e em seguida com o complexo estreptavidina-
peroxidase (Jackson Immunoresearch 10μg/mL 1 h TA). As lâminas foram reveladas
com diaminobenzidina (DAB 0,05%- Dako) e contracoradas com Hematoxilina de
Mayer.
4.4.5.2 Protocolo Imuno-histoquimica (IHC) para a Distrofina
Cortes da espessura de 5µm foram fixados em laminas previamente
silanizadas. As laminas foram desparafinadas em estufa a 37ºC por 24 horas,
seguido de protocolo de desparafinização e desidratação em xilol e alcoóis. Foi
realizado bloqueio com peroxidase a 3% em álcool etílico absoluto. Seguiu-se a uma
lavagem em água destilada, e as laminas foram feridas em tampão citrato por 14
minutos em microondas na potência de 80%. Em seguida, deixou-se que as laminas
esfriassem dentro do próprio tampão e foram lavadas em agua destilada sob
agitação. Foi realizado bloqueio de proteínas inespecíficas com Protein Block (Dako)
por 45 minutos em câmara úmida. Retirou-se o excesso de Protein block e o
anticorpo primário DYS-1 (Novocastra) na diluição de 1:10 foi aplicado em apenas
um corte overnight, deixando outro como controle negativo (PBS) afim de avaliarmos
a eficácia do protocolo e descartamos os testes falso-positivos. No dia seguinte, as
laminas foram lavadas três vezes de cinco minutos com PBS, e o anticorpo
secundário vimentina-sptreptavidina (LSAB+-Dako) foi aplicado nos dois cortes de
cada lamina deixando-os reagir 45 minutos cada. A revelação foi realizada por kit
DAB+ (Dako), e as laminas coradas com hematoxilina e novamente desidratadas em
bateria de alcoóis e xilol.
38
4.4.6 Pressão Arterial (P.A.)
A P.A foi aferida utilizando aparelho Doopler vascular portátil modelo DV2001,
antes de iniciar com o Losartan para se obter os valores iniciais do cão sem o
medicamento. Após dado início ao experimento a P.A foi aferida semanalmente
durante o primeiro mês, passando depois a ser aferida quinzenalmente. Caso fosse
verificado um quadro de hipotensão a dosagem do medicamento seria ajustada
(Figura 4).
Como valor normal de referência para P.A, considerou-se a pressão sistólica
entre 160-180 mm Hg (BROWN; HENIK, 1998).
Figura 4 - Aferição da P.A usando o Doppler 4.5 Exames laboratoriais
Foram realizados os exames de urina, hemograma e bioquímica.
39
4.5.1 Exame de Urina A urina foi obtida por micção espontânea ou sondagem vesical. Cada amostra
de urina foi avaliada fisicamente quanto à cor, aspecto, odor e densidade; este
ultimo em refratômetro com limite Maximo de mensuração de 1,040. O exame
químico foi realizado pela imersão rápida de fita reagente especifica para urinálise
(Combur - 10®, Roche) e leitura contra padrão de cores estabelecido pelo
fabricante, depois de ocorrido um minuto. A sedimentoscopia foi realizada após a
amostra ser centrifugada a 200 g por 10 minutos (Centrifuga Excelsa Baby II,
Fanem), segundo técnica rotineiramente empregada pelo Laboratório de Análise
Clínicas do Departamento de Clínica Médica do Hospital Veterinário da Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
4.5.2 Hemograma, bioquímicas sérica e urinária Pela punção da veia cefálica, colheu-se aproximadamente 4 mL de sangue,
divididos em duas alíquotas. Uma foi acondicionada em tubo estéril contendo
anticoagulante ácido etileno diaminotetracético (EDTA) a 7,5 % (Vacuntainer®,
Becton Dickinson) para a realização de hemograma e contagem de plaquetas,
sendo feita lamina de esfregaço sanguíneo com sangue in natura no momento da
colheita. Outra alíquota foi transferida para o tubo de vidro siliconizado contendo gel
separador de soro (Vacuntainer SST®, Becton Dickinson), centrifugado a 1500 g
durante 15 minutos para obtenção do plasma sanguíneo, no qual foram avaliadas as
demais provas laboratoriais. Todos os exames foram processados pelo Laboratório
Clínico do Departamento de clínica Médica da FMVZ-USP.
Para contagem de hemácias, leucócitos e plaquetas foi utilizado aparelho de
uso veterinário (Contador hematológico modelo ABX Vet). O exame diferencial dos
leucócitos e avaliação morfológica das hemácias e leucócitos foram realizados em
esfregaços de sangue corados pelo método de Rosenfeld, observados em aumento
de 500 vezes em microscópio (modelo Jenamed 2 Carl Zeiss).
40
As análises bioquímicas foram realizadas em analisador automático (Liasys,
Roche) utilizando “Kits” comerciais. Essas análises envolveram as determinações
das concentrações séricas de uréia, creatinina, alanina aminotransferase (ALT),
aspartato aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (FA), creatina quinase (CK),
gama-glutamil transferase (GGT), proteína total, albumina, cálcio, fosforo, sódio,
potássio e colesterol (Quadro 3).
Análises laboratoriais Parâmetros Analisados Urina Sangue Soro
Hemograma (hemo) -
Contagem total Hemoglobina Hematócrito Diferencial de leucócitos Contagem total de plaquetas
-
Perfil Hepático - -
Fosfatase Alcalina Alaninaminotransferase Aspartatoaminotransferase Creatina Quinase Proteína Total Albumina Bilirrubinas
Urinálise (urina)
Análise físico-química Sedimentoscopia
- -
Perfil Complementar - -
Uréia Creatinina Cálcio Fósforo Sódio Potássio Colesterol
Quadro 3 – Sumário dos parâmetros a serem analisados em correspondência com as análises laboratoriais
41
4.6 Análise Estatística
A diferença entre as médias encontradas para os valores da Amplitude de
Movimento Articular e Perimetria dos animais distróficos tratados e do controle, foi
calculada através do teste t de Student. Estabeleceu-se grau de confiança de 95% e
os valores considerados estatisticamente diferentes para p value < 0,05.
A média (μm2) encontrada para cada um dos animais, em relação à área de
colágeno, foi comparada com a média do T0 e do Tf de cada animal e com a média
entre os animais. Foi utilizado Análise de Variância com intervalo de confiança de
95%.
42
5 RESULTADOS
Os resultados foram divididos entre os do estudo piloto e do experimento.
5.1 Piloto
Durante estudo piloto com um dos animais distróficos (CH5), a dosagem
inicial usada nos dois primeiros meses do Losartan foi de 12,5mg (Outubro à
Novembro de 2007), tendo como referência o peso dos animais que é de
aproximadamente 20kg com a dosagem já estipulada em humanos. Como não foi
verificado efeito adverso que pudesse interferir no protocolo terapêutico a ser
implantado, após dois meses a dose foi aumentada para 25mg (durante período de
Dezembro à Janeiro de 2008), passando para 37,5mg (Fevereiro à Março de 2008),
até chegar a dosagem final de 50mg, que teve início em 19 de Março de 2008,
sendo avaliado um mês com essa dosagem (Março a Abril). Esse mesmo animal
usado no estudo piloto foi incluído no grupo experimental, sendo acompanhado
desde o início da dosagem de 50mg (Março de 2008) até completar seis meses do
tempo com o medicamento (Agosto de 2008), tempo que foi realizada a última
biopsia referente ao tempo final do experimento (Tf).
A pressão arterial (PA) foi aferida com intuito de verificar se esta mantinha
valores normais ou se mostrava valores inferiores ao normal, durante a aplicação do
medicamento, já que o Losartan por ser um vasodilator podia resultar na queda da
pressão arterial.
A pressão arterial antes de iniciar com Losartan foi aferida em dois dias
diferentes para se obter os valores de referencia daquele animal, obtendo valores de
13x10 mmHg e 12x90 mmHg respectivamente. Durante o primeiro mês de cada
mudança de dose, a PA foi aferida semanalmente, passando depois a ser feita
quinzenalmente. O mesmo critério foi feito para os exames laboratoriais: bioquímico,
hemograma completo (tabelas 1, 2 e 3) e urina.. Durante todo o tempo do
43
experimento os valores da PA (sistólica) ficaram entre 13, 14 e 15 mmHg, não
apresentando valores que indicassem quadro de hipotensão.
Durante exame clínico realizado semanalmente, de acordo com ficha clinica
estipulado pelos médicos veterinários do Canil GRMD-USP, não foi observada
nenhuma alteração relevante que pudesse ser evidenciada pelo uso do Losartan,
justificando o aumento da dosagem.
As principais alterações no exame bioquímico observado nesse cão do estudo
piloto foram aumento nos valores de ALT, CK e AST. Os valores variaram de 452 a
19690 UI/L para CK, 151 a 299,9 UI/L para ALT e 139,7 a 512,4 UI/L para AST
(Gráficos 1, 2 e 3), tendo como base a variação normal dos valores de 10 a 200 de
CK, até 50 de ALT e até 40 de AST (Gráficos 1 a 3).
Gráfico 1- Concentrações médias de CK (U/L) do animal CH5 durante administração do Losartan. Outubro de 2007 a Abril de 2008
44
Gráfico 2- Concentrações médias de ALT (U/L) do animal CH5 durante administração do Losartan. Outubro de 2007 a Abril de 2008
Gráfico 3- Concentrações médias de AST (U/L) do animal CH5 durante administração do Losartan. Outubro de 2007 a Abril de 2008
Os valores de potássio, uréia e creatinina se mantiveram com média entre 4,5
e 5,9 mEq/l, 25,8 a 51,2 mEq/l e 0,73 a 1,1mg/ dl respectivamente, tendo como base
a variação normal dos valores de 3,8 a 5,2 de potássio, 40 de uréia e 1,5 a 2,0 de
creatinina (Gráficos 4 a 6).
45
Gráfico 4- Concentrações médias de Potássio mEq/l do animal CH5 durante
administração do Losartan. Outubro de 2007 a Abril de 2008
Gráfico 5- Concentrações médias de Uréia mEq/l do animal CH5 durante administração do Losartan. Outubro de 2007 a Abril de 2008
Gráfico 6- Concentrações médias de Creatinina mg/ do animal CH5 durante administração do Losartan. Outubro de 2007 a Abril de 2008
46
Tabela 1- Média e Desvio padrão dos exames de bioquímica do cão CH5 no tempo zero e ao longo do estudo piloto
*Valores de referencia para cães adultos. Laboratório de patologia clinica- HOVET- USP
Creat: Creatinina; Ptns. t.: proteínas totais; Album.: Albumina; CK: creatina quinase; AST :aspartato aminotransferase ; Ca: cálcio; P: fósforo; Na: sódio; k: potássio
Tabela 2- Média e Desvio padrão dos exames de Leucograma e contagem de plaquetas do
cão CH5 no T0 e ao longo do estudo piloto
*Valores de referencia para cães adultos. Laboratório de patologia clinica- HOVET- USP Leuc: Leucócitos ; Segm: segmentados; Eos: eosinófilos; Bas: basófilos; Linf tip.: linfócitos típicos; Mon.: monócitos
Tabela 3- Eritrograma do cão CH5 durante T0 e ao longo do estudo piloto
*Valores de referencia para cães adultos. Laboratório de patologia Clinica- HOVET- USP
Hm: Hemácia; Ht: hematócrito; Hb: hemoglobina; VCM: volume corpuscular médio; HCM: hemoglobina corpuscular média; CHCM: concentração de hemoglobina corpuscular média.
Uréia (mg/dL)
Creat. (mg/dL)
Ptns t. (g/dL)
Album (g/dL)
CK (UI/L)
AST (UI/)
Ca (mg/d)
P (mg/dL)
Na (mEq/L)
K (mEq/
L)
Média 39,5 0,9 6,2 3,2 7828,4 271,9 10,2 4,4 146,2 5
Desvpad 7,2 0,1 0,4 0,3 4473,7 101,6 0,7 0,7 3 0,3
Valores referência* Até 40 Até 1,5-
2,0 5,5-8,5 2,7-4,6
10-200
Até 40
7,5-11,3
2,1-6,3 135-145 3,8-
5,2
Leuc. (µL-1)
Segm. ( µL-1)
Eos.( µL-1)
Bas.( µL-1)
linf tip.( µL-1)
Mon. ( µL-1) Plaquetas
Média
12576,9
7660,4 940,8 0 3070,2 480,5 544076,9
Desvpad 2738,5 2881,1 524,7 0 777,5 232,1 45657,8 Valores
referência* 6000-15000
3000-11800 0-750 raros 1500-
5000 0-800 200-500mil
Hm (x 106 µl)
Ht (%)
Hb (g/dL)
VCM (µm3)
HCM (µm3)
CHCM (%)
Média 5,1 36,8 12,5 72 24,3 33,8
Desvpad 0,3
2,1 0,7 2,8 0,9 0,9
Valores referência*
5,0-8,0 37-54 12,0-18,0
60,0-77,0 22,0-27,0 31,0-36,0
47
5.1.1 Exame de urina
Durante exames de urina do estudo piloto, o animal apresentou na maioria
deles proteinúria e hemoglobinúria à administração do Losartan. Não se observou
alterações quanto à presença de glicose, corpos cetônicos, urobilinogênio na urina
(Tabela 4).
No exame do sedimento urinário, a descamação das vias urinarias foi vista na
maioria dos exames realizados, enquanto os cristais urinários estavam presentes em
quatro dos exames avaliados, apresentando fosfato triplo. A contagem de hemácias
apresentou valores entre 0 e 25 e os leucócitos entre 0 e 17. Quanto a presença de
bactérias, todos os exames apresentaram pelo menos uma cruz (+) durante os
quinze exames avaliados (Tabela 5).
48
Tabela 4- Exame de urina tipo I do cão piloto CH5 de acordo com as semanas de tratamento com o Losartan
Densid: Densidade; Amar: amarelo; Ptns :proteinas ; Corp cet: corpos cetonicos; Urobilin:urobilinogênio; pig biliar: pigmento biliar; Hb: hemoglobina
Exame de Urina
Semanas Odor
Aspecto
Cor
Ph
Densid.
Ptns.
Glicose
Corp cet.
Urobilin.
pig biliar
Hb
0 sui gen Turvo amar citr 8 1042 + - - - - ++
1 sui gen Límpido amar ouro 8,5 1046 - - - - + -
2 sui gen Turv amar ouro 7,5 1047 + - - - ++ +++
3 sui gen lig turv amar ouro 7,5 1045 + - - ´ ++ +
4 sui gen Turvo amar ouro 8,5 >1050 + - - - + -
6 sui gen lig turv amar ouro 8 1047 - - - - ++ -
8 sui gen Turv amar ouro 7,5 >1050 + - - - +++ ++
10 sui gen Lig turvo amar ouro 7 >1050 + - - - ++ -
12 sui gen Turvo Amar 8 1045 + - - - - -
Ouro
14 sui gen Turvo Amar ouro 8,5 1050 + - - - ++ ++
16 Aliaceo Turvo Amar citr 6 1050 + - - - - +
18 Aliaceo Lig turvo Amar ouro 8 >1050 + - - - - (+)
20 sui gen Lig turvo Amar ouro 7 >1050 + - - - ++ +++
22 Sui gen Turvo
Amar ouro 7,5 >1050 + - - - ++ +++
24 Sui gen Lig turvo
Amar ouro 8,5 1043 + - - - + +++
49
Tabela 5- Exame de sedimento urinário do cão piloto CH5 de acordo com as semanas de tratamento com o Losartan
Sedimento urinário
Semanas
Hm
Leuc.
Ept ren.
Pelv ren.
Desc v. u.
Trans bex.
Cristais
Gran.
Hial.
Cer.
Bact.
0 20-25 13 a 17
- (+) + - - - - - (+)
1 0 a 2 0-2 - - Raras - - - - - (+)
2 20 a 25
13 a 17
+ + + - - - - - +
3 2 a 4 6 a 8 + + (+) - - - - - (+)
4 0-2 8 a 10 + ++ + - Fosf tripl +
- - - (+)
6 0-2 6 a 8 (+) - (+) - - - + - (+)
8 8-10 2-4 - - (+) - - - - - +
10 0-2 4-6 - (+) + - - - - - +
12 0-2 2-4 - + (+) - - - - - +
14 8-10 4-6 ++ + + - Fosf tripl+ - - - +
16 6-8 0-2 - + Raras (+) - - - - (+)
18 6-8 8-10 - - (+) - Fosf.tripl++
- - - (+)
20 13-17 2-4 + + + - Fosf tripl+ - - - +
22 20-25 2-4 (+) - + - - - - - +
24 8-10 6-8 - (+) + - - - - - (+)
Hm: Hemácias; Leuc: leucócitos; Ept ren: epitélio renal; Pelv ren: pelve renal; Desc v.u: descamação de vias urinárias; Trans bex: transição da bexiga; Gran: cilindros granulosos; Hial: cilindros hialinos; Cer cilindros céreos; Bact: bactérias.
50
5.2 Experimento
Depois de finalizado o estudo piloto, foi dado início ao experimento com os
quatro animais em Maio de 2008.
O animal CH5 recebeu o Losartan durante seis meses (Março a Agosto de
2008) sendo avaliado o segundo e sexto mês com o Losartan (Biopsias feitas em
Maio e Agosto de 2008), os animais 3H6 e o 3H10 receberam Losartan por quatro
meses (Maio a Setembro de 2008) e o animal 1X1 recebeu o Losartan por dois
meses (Maio a Julho de 2008).
Foi realizado uma biopsia no T0, antes de iniciar com medicamento e no Tf de
cada um dos animais, a fim de avaliar a morfologia das fibras musculares e também
verificar por meio de imuno-histoquimica a expressão de TGF-beta 1 nesses dois
tempos. Foram também realizados os exames laboratoriais (bioquímico, hemograma
completo), aferição da P.A, avaliação de perimetria, goniometria e quantificação do
colágeno.
5.2.1 Exame clínico
Para avaliação semanal dos cães foi utilizada a ficha clinica padronizada
pelos Médicos Veterinários do Canil GRMD – USP (Figura 1). Cada animal possui
uma ficha individual, onde são avaliados: estado nutricional, temperatura retal,
auscultação cardiopulmonar, palpação abdominal, avaliação de mucosas e palpação
de linfonodos, de modo a identificar eventuais efeitos adversos do uso da droga e,
também, com o objetivo de acompanhar a evolução clínica da doença nos cães
tratados.
Durante o experimento, não foi observada nenhuma alteração relevante que
pudesse ser evidenciada pelo uso do Losartan.
A aferição da pressão arterial dos animais foi realizada antes de iniciar o
tratamento com o Losartan (T0) para verificar os valores de referência de cada
51
animal e durante uso do medicamento, sendo os dois primeiros meses avaliados
quinzenalmente e os meses seguintes mensalmente. Foram obtidos três valores
(sistólica) e feito a média para cada tempo (Quadro 4).
Como valor normal de referência para P.A, considerou-se a pressão sistólica
entre 160-180 mm Hg (BROWN; HENIK, 1998).
CH5 2L2
(controle)
3H6 1X1 3H10
T0 13 /14/15 19/20/20 20/20/20 18/19/19 15/15/15
10
mês/quinzena1
14/15/15 18/21/21 18/18/18 16/16/16 21/22/22
10
mês/quinzena2
15/15/16 18/18/18 21/22/22 20/21/21 18/18/18
20
mês/quinzena1
18/18/18 19/19/20 19/19/20 18/18/19 14/14/15
20
mês/quinzena2
15/15/16 19/20/20 15/16/16 19/19/20 22/22/24
30 mês 14/15/16 20/21/20 17/18/20 * 17/18/18
*óbito
Quadro 4- Valores da P.A dos animais nos T0 e Tf.
5.2.2 Exames de sangue
As principais alterações no exame bioquímico observado nesses cães foram
aumento nos valores de ALT, CK e AST, quando comparados aos valores de
52
referência para cães normais adultos, embora em cães distróficos esses valores já
estejam aumentados, como mostrados também no animal piloto.
Os valores de CK variaram de 5893 a 10586,2 UI/L para o animal 2L2; 1254 a
26749,6 UI/L para 3H10; 5674,5 a 15034,4 UI/L para 3H6; 1858,2 a 18846 UI/L para
1X1 e 5360,6 a 19690 UI/L para CH5.
Os valores de ALT variaram de 255,1 a 371,8 UI/L para 2L2; 298,9 a 402,9
UI/L para 3H10; 258,1 a 422, 1 UI/L para 3H6; 255,8 a 636, 4 UI/L para 1X1 e 158,8
a 299,9 UI/L para CH5.
Os valores de AST variaram de 144,7 a 230, 4 UI/L para 2L2; 186,8 a 606,3
UI/L para 3H10; 155,2 a 326,6UI/L para 3H6; 63,4 a 495,4 UI/L para 1X1 e 163,3 a
423 UI/L para CH5.
As tabelas a seguir mostram a variação mensal dos parâmetros de bioquímica
sérica e hemograma dos cães GRMDs durante o período com o Losartan e também
do animal controle, além dos valores de referência para animais normais adultos
(Tabelas 6 a 9).
53
Tabela 6 - Média ± Desvio padrão dos exames de bioquímica dos cães 2L2 (controle), 3H10, 3H6 e 1X1 ao longo do tempo de tratamento com o Losartan
Animais Ureia (mg/dL)
Creat (mg/dL)
Ptns.t (g/dL)
Album
(g/dL)
CK (UI/L)
AST (UI/L)
ALT (UI/L)
2L2 50,5±13,
1
0,9±0,1 6,8±0,
4
3,4±0,
1
8763,3±1911,6 184,5±31,3 299,6±38,
2
3H10 34,3±8,3 0,7±0,1 6,6±0,
8
3,4±0,
3
12575,7±7712,6 363,6±147,
1
404,3±16
2
3H6 36,1±6,7 0,7±0,2 6,3±0,
1
3,2±0,
2
17633,2±22988,
3
221,4±69,3 325,6±62,
2
CH5 34,8±7,6 0,8±0,0
7
6,4±0,
3
3,2±0,
1
11772,7±3946,6 310,7±79,7 249,6±45,
4
1X1 32,3±3 0,8±0,1 6,5±0,
7
3,3±0,
5
10577,4±6769,1 311,4±188,
8
467,9±15
9
valores referência*
Até 40 Até 1,5-
2,0
5,5-8,5 2,7-4,6 10-200 Até 40 Até 50
*Valores de referencia para cães adultos. Laboratório de patologia Clinica- HOVET- USP Creat: creatinina; Ptns. t: proteínas totais; Album: albumina; CK: creatina quinase; AST: aspartato aminotransferase; ALT: alanina aminotransferase .
Tabela 7- Média ± Desvio padrão dos íons dos exames de bioquímica dos cães 2L2
(controle), 3H10, 3H6 e 1X1 ao longo do tempo de tratamento com o Losartan
Animais Cálcio (mg/dL) Potássio (mEq/L)
Fósforo ( mg/dL) Sódio (mEq/L)
2L2 10,1±0,8 5,2±0,3 5,2±0,6 148,2±2,8
3H10 10,1±1 5±0,2 4,9±0,7 145,7±2,7
CH5 10,2±0,9 5±0,3 4±0,7 146,5±3,5
3H6 9,9±1,4 5,4±0,1 5,2±0,8 145±2,1
1X1 9,6±0,6 5±0,1 4,9±0,9 146,4±2,8 valores referência*
7,5-11,3 3,8-5,2 2,1-6,3 135-145
*Valores de referencia para cães adultos. Laboratório de patologia Clinica- HOVET- USP Ca: Cálcio; K: potássio; P: fósforo; Na: sódio.
54
Tabela 8- Média e Desvio padrão dos exames de Leucograma dos cães 2L2 (controle), 3H10, 3H6 e 1X1 ao longo do periodo de tratamento com o Losartan
Animais Leuc (µL) Segm (µL) Eos (µL) Linf.Tip (µL) Mon (µL)
2L2 19850±2639,3 13826,5±2420,1 586,4±237,4 4660,1±842 752,6±348,4
3H10 16000±850,2 9122,1±867,5 1242±496 5373±1151,9 261,151,3
CH5 13400±1796,2 7562,9±3055,9 1003±477 3275±789 470±264
3H6 18125±2149,9 10783,8±2269,5 1334±239 5477,8±792,9 509,3±185,8
1X1 19250±3985,3 13154,7±4210,9 569,7±493,6 9455,8±10449,9 569,8±460,2
valores referência*
6000-15000 3000-11800 0-750 1500-5000 0-800
*Valores de referencia para cães adultos. Laboratório de patologia Clinica- HOVET- USP Leu: Leucócitos; Neut: neutrófilos; Segm: segmentados; Eos: eosinófilos; Linf tip: linfócitos típicos; Mon: monócitos.C
Tabela 9- Média e Desvio padrão dos exames de Eritograma dos cães 2L2 (controle), 3H10, 3H6 e 1X1 ao longo do periodo de tratamento com o Losartan
Animais Hm
(x 106 µl) Ht
(%)
Hb (g/dL)
VCM (µm3)
HCM (µm3)
CHC (%)
2L2 5,4±0,3 37,8±1,7 13,1±0,7 69,1±4,2 24,4±0,6 34,7±0,9
3H10 5,6±0,4 39,8±2,4 13,8±0,9 68,3±1,4 23,6±0,9 34,6±0,8
CH5 5,7±0,3 37,7±1,8 12,8±0,8 70,4±1,5 23,9±0,5 34±1
3H6 5,6±0,4 39,8±2,4 13,8±0,9 71,6±1 24,9±0,5 34,7±0,8
1X1 6,0±0,3 40,8±1,8 14,3±1,1 68,4±0,9 23,9±0,6 34,9-1,1
valores referência*
5,0-8,0 37-54 12,0-18,0 60,0-77,0 22,0-27,0 31,0-36,0
*Valores de referencia para cães adultos. Laboratório de patologia Clinica- HOVET- USP Hm: Hemácias; Ht: hematócrito; Hb: hemoglobina ; VCM: volume corpuscular médio; HCM: hemoglobina corpuscular média; CHCM: concentração de hemoglobina corpuscular média.
55
5.2.3 Morfologia da fibra muscular Antes de iniciar a oferta do medicamento foi realizada biopsia para avaliar a
morfologia das fibras musculares, bem como verificar mediante a técnica de imuno-
histoquimica a expressão de TGF-beta 1 e da distrofina dos cinco animais.
A análise histológica do músculo distrófico revela um padrão difuso da
patologia caracterizado pela degeneração, sendo possível identificar áreas de
infiltração de células inflamatórias com substituição por tecido adiposo e conjuntivo
(Figura 6-B).
Diferente do músculo esquelético normal, no qual as fibras musculares são
relativamente de tamanho homogêneo, uniformemente espaçadas e angulares, com
os núcleos localizados na periferia da célula (Figura 6-A), os cortes histológicos do
músculo distrófico apresentam variação no tamanho e formato das fibras, com
alguns núcleos localizados no centro das mesmas (Figura 6B).
A morfologia das fibras musculares antes de iniciar o tratamento com o
Losartan apresentava-se mais desorganizada e com maior quantidade de tecido
fibroso ao redor das fibras (Figura 6-C). Após o Tf pode-se observar, em um dos
cães estudados, uma melhor organização das fibras musculares e menor quantidade
de tecido conjuntivo ao seu redor (Figura 6-D).
56
Figura 6- Fotomicrografia de músculo bíceps femoral. A: músculo de cão sadio evidenciando arquitetura muscular organizada com núcleos localizados na periferia das fibras (*). B: músculo de cão distrófico com fibras de diferentes diâmetros (►), infiltrado inflamatório (→) e núcelos centrais (*). C: músculo de cão distrófico em T0. Fibras desorganizadas com presença de processo inflamatório infiltrativo (→) e significante deposição de tecido conjuntivo (c). D: biopsia no Tf. As fibras estão mais organizadas e com menos infiltrados inflamatórios (→) e tecido conjuntivo (c). Coloração: HE, aumento: A e B: Barra = 50µm; C e D: Barra = 25µm
5.2.4 Quantificação do Colágeno Os valores obtidos após a mensuração da área do colágeno nos cortes
microscópicos da musculatura esquelética dos cinco animais GRMD, sendo um
desses animais utilizado para controle, foram descritos em forma de porcentagem
em relação à medida do campo total.
O percentual de colágeno no Tf foi estatisticamente menor do que o T0,
quando comparado esses dois tempos em cada animal e quando comparado os
resultados entre os diferentes animais (Tabela 10).
57
Tabela 10- Porcentagens da área de colágeno muscular em relação à área muscular total
para cada um dos animais distróficos no T0 e Tf expressos em %
T0 Tf 2L2 (controle) 15,7 12,2 CH5 5,5 3,3 3H6 5,4 0.9 3H10 23 12 1X1 15,7 12.2
teste... considerando p < 0.05
As figuras abaixo ilustram cortes transversais corados com picrossírius e
fixados em Bouin, que caracterizam a coloração amarelada das fibras musculares, e
o colágeno aparece em vermelho (Figura 7).
58
Figura 7 – Fotomicrografia de músculo bíceps femoral. A: músculo de cão distrófico (CH5), corado com coloração de Picrossírius, evidenciando colágeno em região de endomísio e perimísio (→). B: Fotomicrografia polarizada desse mesmo cão. C: cão distrófico (3H6) no T0, evidenciando maior presença de tecido conjuntivo (→). D: cão 3H6 no Tf com menor deposição de tecido conjuntivo (→). Barra= 25µm
59
5.2.5 Imuno-histoquimica (IHC)
O protocolo de IHC para avaliação do TGF-beta1 foi estabelecido
primeiramente no animal do estudo piloto. Foram feitos cortes de fragmentos do
músculo bíceps femoral, coletados dos membros pélvicos direito e esquerdo,
alternadamente, nos momentos T0 e Tf do tratamento com Losartan, para analisar a
expressão do TGF-beta1 na musculatura esquelética dos cães GRMDs.
Ao analisar as imagens dos animais do grupo experimental no T0, observa-se
que existe uma maior marcação do TGF-beta1 quando comparado com o Tf.
Observa-se que as regiões ao redor das fibras musculares, onde há presença de
colágeno, são bastante marcadas, porém, nota-se também a presença do TGF-
beta1 em regiões de endomísio e perimísio.
As imagens mostram na seqüência a marcação do anticorpo TGF-beta1 no
músculo esquelético distrófico dos cães controle e tratados com Losartan (Figuras 8
e 9).
60
Figura 8- Imuno-histoquímica para localização do TGF-beta1 em cortes transversais do músculo bíceps femoral. A: controle negativo, barra = 25µm. B: controle negativo, aumento 40x. C: T0 do cão distrófico- controle (2L2). D: Tf. E: T0 do cão distrófico (1X1) evidenciando a marcação do TGF (em marrom) em endomísio (*) e tecido conjuntivo (→). F: Tf. Barra = 25 µm
→
*
61
Figura 9- Imuno-histoquímica para localização do TGF-beta1 em cortes transversais do músculo bíceps femoral. A: T0 do cão distrófico (CH5). B: Tf. C: T0 do cão distrófico (3H10). D: Tf. E: T0 do cão distrófico (3H6. F: Tf. Barra = 25µm
62
Os mesmos cortes de fragmentos do músculo bíceps femoral retirados para a
IHC do TGF-beta1 foram utilizados para analisar a expressão da distrofina na
musculatura esquelética dos cães GRMDs.
Ao analisar as imagens abaixo dos animais do grupo experimental no T0 e no
Tf e do animal controle não foi possível observar marcação para proteína distrofina.
Diferente do músculo de um animal normal onde essa proteína está presente
(Figuras 10 e 11).
63
Figura 10- Imuno-histoquímica para localização da distrofina em cortes transversais do
músculo bíceps femoral. A: cão sadio, evidenciando a marcação da distrofina (em marrom) na periferia da membrana sarcoplasmática das fibras. B: controle negativo. C: T0 do cão controle (2L2). D: Tf. E: T0 do cão 1X1. F: Tf. Barra = 25µm
64
Figura 11- Imuno-histoquímica para localização da distrofina em cortes transversais do músculo bíceps femoral. A: T0 do cão CH5. B:Tf. C: T0 do cão 3H10 D: Tf. E: T0 do cão 3H6. F: Tf. Barra = 25µm
65
5.2.6 Avaliação da Amplitude de movimento articular ou Goniometria Foram descritos os valores em graus da Amplitude de Movimento (ADM)
máxima de flexo-extensão das articulações do cotovelo, carpo, joelho e tarso, antes
de iniciar o experimento (T0), e, após o período de administração do Losartan, assim
como do animal controle.
O animal 1X1 não pôde ter seus dados de goniometria e perimetria avaliados,
pois foi a óbito antes de realizar a última avaliação, devido à própria evolução da
doença.
Os valores obtidos da avaliação da ADM dos três animais distróficos (3H6, 3H10 e
CH5) no T0 foram comparados com a média dos valores da ADM de cada animal no
seu Tf (sendo o animal CH5 com dois e seis meses de tratamento, os animais 3H10
e 3H6 com quatro meses de uso do Losartan) (Figuras 12 a 16).
Não foi encontrada diferença significativa entre as médias das articulações do
joelho, tarso e carpo, dos animais distróficos durante o T0 e o Tf (p > 0,05).
Figura 12- Médias das ADM das articulações do cotovelo, carpo, joelho e
Tarso do animal controle 2L2
66
Figura 13 - Médias das ADM das articulações do cotovelo, carpo, joelho e tarso do
animal CH5 nos tempos zero e com dois meses de losartan
Figura 14- Médias das ADM das articulações do cotovelo, carpo, joelho e tarso do
animal CH5 nos tempos zero e com seis meses de losartan
67
Figura 15- Médias das ADM das articulações do cotovelo, carpo, joelho e tarso do
animal 3H10 nos T0 e Tf
Figura 16- Médias das ADM das articulações do cotovelo, carpo, joelho e tarso do
animal 3H6 nos T0 e Tf
5.2.7 Circunferência do membro ou Perimetria
Foram avaliados, os grupos musculares dos segmentos do membro torácico
(braço e antebraço) e do membro pélvico (coxa e perna), bilateralmente de todos os
animais.
Os valores obtidos da avaliação da perimetria dos quatro animais distróficos
no T0 foram comparados com a média dos valores da perimetria de cada animal no
seu Tf. O animal CH5 foi avaliado em dois diferentes tempos: com dois e seis meses
68
de tratamento mediante biopsias realizadas com 2 meses e no final de 6 meses de
tratamento. Os animais 3H10 e 3H6 foram avaliados com quatro meses de uso do
Losartan (Figuras 17 a 21).
Não foram encontradas diferenças significativas entre as médias dos
segmentos do braço, antebraço, coxa e perna dos animais distróficos durante o T0 e
o Tf (p > 0,05).
Figura 17 - Médias da perimetria dos músculos do braço, antebraço, coxa e perna respectivamente, do animal controle 2L2
Figura 18 - Médias da perimetria dos músculos do braço, antebraço, coxa e perna respectivamente, do cão CH5 nos tempos zero e com dois meses de Losartan (Tf)
69
Figura 19 - Médias da perimetria dos músculos do braço, antebraço, coxa e perna
respectivamente, do cão CH5 nos tempos zero e com seis meses de Losartan (Tf).
Figura 20 - Médias da perimetria dos músculos do braço, antebraço, coxa e perna
respectivamente, do cão 3H10 nos T0 e Tf
70
Figura 21 - Médias da perimetria dos músculos do braço, antebraço, coxa e perna
respectivamente, do cão 3H6 nos T0 e Tf
71
6 DISCUSSÃO
Nesse estudo foi avaliado o efeito do Losartan, como função de inibidor do
TGF-beta 1, sobre o desenvolvimento da fibrose na musculatura esquelética do
modelo canino GRMD.
Observando os resultados encontrados entre os grupos de animais
experimentais e o controle, nota-se que os exames laboratoriais e clínicos (pressão
arterial) se mantiveram com valores bem aproximados.
Os valores da pressão arterial dos animais experimentais durante o estudo se
mostraram relativamente iguais aos valores do tempo zero, não sendo constatado
quadro de hipotensão referente ao uso do Losartan.
Os exames de bioquímica sérica dos animais distróficos de ambos os grupos
experimental e controle, mostraram aumento nos níveis séricos das enzimas CK,
ALT e AST quando comparados aos mesmos valores em animais normais. O
aumento dessas três enzimas está associado às lesões hepáticas, do músculo
esquelético e do miocárdio (VALENTINE et al., 1990). Segundo Anderson (1982) e
Walton (1988), em decorrência das anormalidades estruturais e funcionais da
membrana celular, ocorre um aumento de enzimas séricas em pacientes portadores
de distrofias. A dosagem dos níveis dessas enzimas, principalmente da CK é
utilizada no diagnostico da DMD e também no diagnóstico diferencial entre as
formas de distrofias musculares progressivas. Elevadas concentrações destas
enzimas são realmente notadas na deficiência da distrofina em camundongos mdx,
cães GRMD e humanos, devido à destruição do sarcolema.
Embora o decréscimo nos níveis séricos de CK ofereça evidências
bioquímicas e funcionais de uma melhora da função muscular nos cães GRMD
(BOGDANOVICH et al., 2002), tanto nos achados de Cohn et al. (2007) quanto na
nossa pesquisa, não houve relação do Losartan com descréscimos nos níveis de
CK. Como os valores das enzimas já estavam altos antes de iniciar o tratamento
com o Losartan e mantiveram altos no animal controle, desta forma, o Losartan na
dose estipulada para estes animais, não interferiu nos níveis, já elevados, de CK,
ALT e AST.
72
O tratamento com Losartan, pelo fato de ser um inibidor de angiotensina, está
relacionado com a queda nos níveis de aldosterona. Portanto, os pacientes podem
apresentar aumento nos níveis de potássio, uréia e creatinina. Porém, em pacientes
hipertensos com função renal normal, o aumento desses valores foi irrelevante
(MAZZOLAI; BURNIER, 1999).
Durante o estudo, os animais mantiveram esses valores dentro dos
parâmetros de normalidade. Apenas um animal apresentou pico do valor do potássio
durante um curto intervalo de tempo, logo retornando aos valores normais.
Segundo Goa (1996), a função renal está preservada durante administração
do Losartan em humanos. A freqüência de filtração glomerular, o fluxo sanguíneo
renal, o volume urinário ou outros parâmetros renais não foram alterados em
paciente normais recebendo dosagem única de 100 mg, assim como em pacientes
com hipertensão, os quais receberam 50 mg do Losartan diariamente, por períodos
de sete dias a um ano.
Em pacientes com disfunção renal a excreção da creatinina também não foi
alterada durante a terapia com Losartan durante 1 a 12 semanas. A excreção dos
eletrólitos urinários (incluindo o sódio e potássio) em indivíduos normaisapresentava-
se aumentada ou inalterada, enquanto que a uricosuria era normal.
Nos exames de urina, o animal do estudo piloto apresentou proteinúria
moderada em todos os exames realizados. Segundo Bush (2004) esses resultados
podem ocorrer na insuficiência renal, estresse, doenças infecciosas e na hematúria.
A hemoglobinúria estava presente na maioria dos exames deste cão, a qual poderia
estar relacionada às hemácias lisadas. Assim como a descamação presente nas
vias urinárias durante os exames, a hemoglobinúria pode ser explicada também pela
forma de colheita utilizada, ou seja, a cateterização.
Em relação às investigações histopatológicas do músculo, observamos no T0,
que as fibras musculares não apresentam-se uniformemente espaçadas,
relativamente do mesmo tamanho como aquelas encontradas no músculo
esquelético normal, tais quais as relatadas por Erazo- Torricelli (2004). Elas estavam
hipertrofiadas ou atrofiadas, apresentando um formato mais arredondado, seguidas
de concomitante heterogeneidade do diâmetro das mesmas. Este achado soma-se
aos relatos de Milhorat et al. (1966) e Valentine et al. (1986).
73
Para Valentine et al. (1990) investigações histopatológicas nos músculos de
cães GRMD revelam necrose precoce de fibras, e regeneração associada com
fibrose endomisial e perimisial. Disto resulta severa miopatia, similar ao processo
que ocorre na DMD. A infiltração de neutrófilos e macrófagos aparece no interior das
fibras musculares necrosadas, e, ao redor de vasos sanguíneos, ilustrando a
penetração destas células no tecido muscular.
O aumento do tamanho da fibra muscular se deve a um mecanismo
compensatório tardio para mitigar a perda funcional das fibras nesses cães GRMD
(PASSERINI et al; 2002). De acordo com Nguyen e colaboradores (2002), as fibras
de músculos distróficos apresentam núcleo central indicando estagio tardio de
regeneração, juntamente com áreas de fibrose endomisial.
Foi possível observar em um animal desse estudo mediante técnica
histológica do músculo esquelético, que após o tratamento com o Losartan (Tf) foi
verificada melhora na organização das fibras musculares, como demonstrado em
imagem do músculo esquelético.
Em termos de degeneração miopática, o modelo GRMD é o que mais se
assemelha a DMD, e também o mais indicado para desenvolvimento de testes
terapêuticos, como alternativa para a doença em humanos. O estudo do processo
de formação de fibrose nestes animais é importante, uma vez que a restauração da
função da distrofina em DMD só se torna possível com o controle efetivo da fibrose
(PASSERINI et al., 2002).
De acordo com Valentine et al. (1990) o desenvolvimento gradual da fibrose
endomisial e perimisial é uma característica comum de humanos e cães do modelo
GRMD, porém ausente no camundongo mdx. Os autores sugerem que o aumento
do colágeno intersticial pode interferir no metabolismo muscular normal resultando
em uma regeneração anormal e diminuindo a perfusão vascular, re-inervação e
ainda, impor restrições mecânicas.
Em alguns cortes histológicos foi possível identificar no perimísio muscular a
presença de fibroblastos entremeados à um tecido conjuntivo abundante, indicando
a importância destas células na fisiopatologia da distrofia muscular, uma vez que
temos a substituição do músculo lesado pelo tecido fibroso constituído por fibras
colágenas.
74
No presente trabalho, foi estudada a fibrose a partir da quantificação das
fibras colágenas no tecido muscular e pela expressão do TGF-beta1 em nível
molecular e suas correlações.
Comparando a quantidade, em porcentagem, de tecido fibroso durante o T0 e
Tf, podemos observar uma diminuição na média entre o tempo antes e após o
tratamento com Losartan em todos os cães experimentais, inclusive o controle, o
que dificulta afirmar que o Losartan tenha conseguido inibir o TGF-beta1 que por sua
vez, diminuiu a proliferação de tecido conjuntivo na musculatura esquelética.
Cohn et al. (2007) comparando camundongos mdx tratados e não tratados
com Losartan durante 6-9 meses, observaram um decréscimo na deposição do
colágeno no diafragma.
É importante lembrar que durante este estudo, cuidados especiais foram
tomados em relação à quantificação de colágeno, para excluir as áreas que
representassem artefatos e pudessem assim confundir com as áreas de fibrose.
Embora a fibrose não seja evidenciada no primeiro mês de vida dos cães
distróficos, as anormalidades encontradas na musculatura tais como fibras
hipercontraturadas, macrófagos antes do nascimento, ou seja, este microambiente
patológico podem contribuir para a síntese e ativação dos fatores fibrogênicos, tais
como os TGF-beta1 (PASSERINI et al; 2002).
Embora todos os músculos dos cães distróficos apresentem deficiência de
distrofina, os níveis de fibrose e a capacidade de regeneração e função variam entre
os animais, sugerindo que a ausência de distrofina é necessária, porem não
suficiente para determinar o padrão de extensão da fibrose (ANDERSON et al. 1988;
PORTER et al. 2003). Esse dado justifica a variação do grau de fibrose encontrada
entre os cães do estudo.
Para avaliar o importante papel do TGF-beta1 na dosagem do colágeno
nesse estudo, procuramos neutralizar a via do TGF-beta1 através da administração
do Losartan.
Estudos demonstraram que o TGF-beta1 está significantemente mais
expresso no músculo de pacientes distróficos do que em controles, estando
relacionado o grau de fibrose muscular com a idade do paciente (BERNASCONI et
al; 1995).
75
Esse mesmo autor mostrou que a extensão da marcação positiva da imuno-
histoquimica para o TGF-beta1 varia de animal para animal, dado esse também
encontrado nesse estudo. Embora mostrado no estudo de Passerine et al. (2002),
que os tecidos conectivos perimisial e endomisial marcados para o TGF-beta1 foi
mais evidente na fase inicial da doença, ele afirma que uma nova onda de síntese e
ativação do TGF-beta1 pode ocorrer em adultos, possivelmente agindo para
sustentar a fibrose presente na fase mais tardia, como ocorre nos cães desse
estudo.
Porém, diferente dos achados de Passerine et al. (2002), os quais mostraram
níveis de TGF-beta1 em GRMD adultos semelhantes aos cães normais, este estudo
mostrou que a marcação de TGF-beta estava presente e aumentada nos cães
GRMD adultos em estagio avançado de fibrose, suportando a idéia de que essa
citocina está elevada não somente no inicio da fibrogênese.
Estudos mostrando a imunolocalização do TGF-beta em pacientes saudáveis,
controles de todas as idades mostraram rara marcação e quando presente estava
geralmente marcado nos capilares ou ocasionalmente presente no perimísio. Já os
animais GRMD de todas as idades apresentaram marcação positiva em região do
perimísio e endomisio próximo as áreas de fibras musculares desarranjadas. Aos 30
dias de vida a marcação do TGF- beta estava presente em áreas de tecido
conjuntivo e nos GRMD adultos foi fortemente evidenciado em perimísio e endomisio
(PASSERINI et al., 2002).
Em estudo feito por Bernasconi et al. (1999) os pacientes com miopatia, no
caso a distrofia muscular congênita, a marcação do TGF-beta1 estava presente em
perimísio e também no endomisio da maioria dos músculos dos pacientes.
No presente estudo a extensão de TGF-beta positivamente marcado estava
também presente, em geral, em região de perimísio, endomísio e em áreas de tecido
conjuntivo.
Os achados desse estudo usando bloqueador de TGF-beta como inibidor da
fibrose, ou Losartan, junto com os achados de Gosselin et al. (2004) e Cohn et al.
(2007), constituem evidências adicionais para o envolvimento do TGF-beta1 no
desenvolvimento da fibrose. É importante lembrar que o tratamento com o Losartan
76
não elimina a citocina dos músculos, porém traz para níveis similares aos indivíduos
saudáveis controles.
A diminuição da sinalização do TGF-beta1 evidenciada nas imagens de
imuno-histoquimica após o período de uso do Losartan, juntamente com a
diminuição da deposição de colágeno, sugerem um efeito inibitório do medicamento
sobre essa citocina nos músculos dos cães GRMD estudados.
As imagens de imuno-histoquimica da distrofina não mostraram marcação em
nenhum dos animais experimentais nos dois tempos nem do controle. Portanto, não
se pode observar correlação da expressão da distrofina com a aplicação do
Losartan, sendo que devido à doença essa proteína continua sendo ausente.
Dentre os métodos de avaliação utilizados, além da quantificação das áreas
de colágeno e imuno-histoquimica, estão também a goniometria e perimetria como
parâmetros de avaliação física. A perimetria e a gonimetria são duas ferramentas
freqüentemente utilizadas pela fisioterapia em pacientes humanos. Suas aplicações
foram validadas no modelo animal GRMD, obtendo medidas confiáveis e capazes de
acompanhar a progressão da doença, trazendo alguma contribuição para a perda
muscular e a deterioração da motilidade nos cães distróficos (JAEGGER et al.,
2002).
A amplitude de movimento articular (ADM) está relacionada com a deposição
de colágeno nos músculos e tecidos adjacente. Normalmente, a movimentação
constante dos segmentos corporais em si, mantém a flexibilidade dos tecidos moles
periarticulares e a lubrificação da articulação com a produção de líquido sinovial.
Platt e Garosi (2004) atribuem às contraturas musculares como a causa da limitação
do movimento, característica das doenças musculares.
Os valores de ADM das articulações analisadas (cotovelo, carpo, joelho e
tarso) nos cães do experimento, não mostraram alterações estatisticamente
significantes. Porém, comparando as médias dos valores retratados nos gráficos no
tempo após o uso do Losartan, com os valores iniciais, pudemos notar um discreto
aumento da amplitude das articulações do joelho e tarso em todos os animais do
experimento, inclusive do controle, o que dificulta a análise dos dados. Gaiad (2006)
observou em seus estudos valores de ADM de tarso e joelho diminuídos em GRMD
77
adultos, porém, quando comparados aos valores de cães normais. Estes achados
sugerem uma limitação do movimento causada por encurtamento muscular devido
ao acúmulo de tecido conjuntivo característico da doença. Porém, não podemos
inferir que a diminuição do colágeno encontrado nos Tf dos animais do nosso
estudo, com o uso do Losartan, refletiu numa tendência a mobilidade das estruturas
moles periarticulares destas articulações, visto que o animal controle apresentou
aumento semelhante.
A amplitude articular do cotovelo também aumentou no Tf em todos os
animais, com exceção do animal 3H6. Diferente dos achados de Gaiad (2006);
Howell et al. (1997) e Kornegay et al. (1994), que encontraram valores aumentados
para a amplitude de movimento do carpo em seus animais GRMD, nesse estudo o
carpo se mostrou com valores menores ou iguais no animais experimentais e
controle, no Tf.
De acordo com Kornegay et al. (1994), assim como os meninos com DMD
apresentam contraturas que produzem limitações funcionais, muitas vezes mais
importantes que a própria fraqueza muscular, contraturas articulares no animais
GRMD alteram a conformação e restringem a marcha progressivamente,
principalmente entre os três e seis meses de idade.
Para que os valores desse estudo sejam mais fidedignos, será necessário o
acompanhamento em longo prazo da variação dessas articulações, com mais de um
animal controle e as medidas feitas com mais de um avaliador.
Analisando os resultados da Perimetria no animal CH5 nos tempos com dois
e seis meses de tratamento, observa-se aumento ou manutenção nas medidas de
circunferência de todos os grupos musculares avaliados (braço, antebraço, coxa e
perna). A medida do braço foi praticamente mantida nos animais 3H6 e 3H10 com
quatro meses de Losartan, quando comparado com o controle, que teve essa
medida diminuída ao longo de quatro meses. Porém, os valores de perimetria
analisados não foram estatisticamente significantes.
As medidas dos segmentos do antebraço, coxa e perna tiveram variações
distintas entre os animais 3H6 e 3H10. As discrepâncias observadas nos valores da
perimetria podem ser explicadas pelas diferenças de fenótipos e sexo dos cães
GRMDs avaliados no presente estudo.
78
As circunferências dos membros torácico e pélvicos não foram ainda descritas
no modelo GRMD, porém, assim como a goniometria, elas são medidas de
avaliação bastante usadas em humanos, e têm a finalidade de estabelecer a perda
de massa muscular. Esse método de avaliação é amplamente usado na fisioterapia
em pacientes portadores de disfunções, tais como as neuromusculares e consegue
retratar de forma indireta a progressão da DMD.
Durante o estudo uma das fêmeas distróficas foi a óbito por insuficiência
cardiorrespiratória súbita, devido ao curso natural da doença, já que apresentava os
exames clínicos e laboratoriais estáveis. Dessa forma, foi avaliado apenas o tempo
de dois meses com uso do Losartan.
Os parâmetros de avaliação citados acima para avaliar o efeito do Losartan
no músculo distrófico dos cães não relatam uma diferença expressiva entre os
animais do grupo experimental e do controle, já que tanto os valores da
quantificação do colágeno, quanto os valores de goniometria mostraram
semelhanças entre os dois grupos. Porém, quando comparado cada animal
experimental no T0 com seu Tf, a diminuição tanto da quantidade de tecido fibroso e
principalmente na marcação do TGF-beta, corroboram para um efeito benéfico do
uso do Losartan nesses cães.
79
7 CONCLUSÕES
1 - Os achados suportam a idéia de que o tratamento em curto prazo (dois
meses) com a dosagem de 50mg oral diária do Losartan possui efeito antifibrótico no
músculo esquelético do modelo GRMD, além de ser bem tolerado.
2 - Uma vez que a fibrose parece ser resultado de diversos mecanismos
envolvendo outras moléculas além do TGF-beta1, outras citocinas, ou fatores de
crescimento podem estar envolvidos na prevenção e/u redução da fibrose tardia.
3- Estudos avaliando a influência do Losartan na musculatura esquelética
devem ser acompanhados no GRMD desde idade pré-púbere e em prazo mais
longo (“follow up”), usando um maior número de animais controles tanto distróficos
quanto normais, para desta forma, buscar melhores resultados.
4 - A variabilidade fenotípica dos animais GRMD estudados dificulta a análise
e comparação entre os animais e o animal controle.
5 - Os achados de amplitude de movimento articular e perimetria não
mostraram relação direta com os achados da quantificação do colágeno e de imuno-
histoquimica pelo fato de não terem sido estatisticamente significantes e
apresentarem valores semelhantes com o do animal controle.
6 - Novas pesquisas poderão utilizar esses achados no modelo animal GRMD
para elucidar influência e contribuição do Losartan no tratamento com crianças
portadoras de DMD.
80
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