O DESEQUILÍBRIO PROTEOLÍTICO DA MATRIZ...
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1 Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto O DESEQUILÍBRIO PROTEOLÍTICO DA MATRIZ EXTRACELULAR E A DILATAÇÃO AÓRTICA NA SÍNDROME DE MARFAN: CORRELAÇÕES GENÓTIPO-FENÓTIPO. Ana Margarida Gomes Lebreiro Orientador: Professor Doutor Cassiano Abreu Lima Co-orientador: Mestre Elisabete Martins Porto, 2009
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Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular da Faculdade de Medicina da
Universidade do Porto
O DESEQUILÍBRIO PROTEOLÍTICO DA MATRIZ
EXTRACELULAR E A DILATAÇÃO AÓRTICA NA SÍNDROME
DE MARFAN: CORRELAÇÕES GENÓTIPO-FENÓTIPO.
Ana Margarida Gomes Lebreiro
Orientador: Professor Doutor Cassiano Abreu Lima
Co-orientador: Mestre Elisabete Martins
Porto, 2009
2
AGRADECIMENTOS
A dissertação de Mestrado que em seguida se apresenta não poderia existir sem a
prestável colaboração de um grupo de pessoas que desde o princípio se mostraram
empenhadas em tornar este projecto uma realidade.
Pela total disponibilidade e esforço conjunto que aplicaram na construção e
execução deste trabalho, não podia deixar de expressar o meu profundo agradecimento a
todos os membros desta equipa, realçando o espírito de cooperação e agradecendo
individualmente:
- Aos médicos que participaram na avaliação multidisciplinar dos doentes, Dra.
Cristina Cruz (Assistente Hospitalar de Cardiologia do H.S.João), Dr. Jorge Almeida
(Chefe de Serviço de Cardiologia do H.S.João), Dra. Sofia Pimenta (Assistente
Hospitalar de Reumatologia do H.S.João), Mestre José Miguel Bernardes (Assistente
Hospitalar de Reumatologia do H.S.João), Dr. Ricardo Pereira (Interno da Formação
Específica em Oftalmologia do H.S.João);
- À Professora Doutora Maria João Martins (Professora Auxiliar do Serviço de
Bioquímica da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto) e à Dra. Conceição
Gonçalves (Assessora Principal do Laboratório Nobre da Faculdade de Medicina da
Universidade do Porto) pelo trabalho desenvolvido na realização e interpretação dos
resultados laboratoriais;
- Ao Professor Doutor José Carlos Machado (Professor Associado da Faculdade de
Medicina do Porto e investigador do Instituto de Patologia e Imunologia da
Universidade do Porto) pelos estudos genéticos efectuados;
- À Mestre Patrícia Lourenço (Interna da Formação Específica em Medicina Interna
do H.S.João) pelo apoio na análise estatística dos resultados;
3
- Ao Dr. Manuel Campelo, como orientador do meu Internato de Formação
Específica em Cardiologia, pelo estímulo impulsionador que sempre incutiu na
realização deste projecto;
- À Professora Doutora Maria Júlia Maciel (Directora do Serviço de Cardiologia do
H.S.João e Professora Associada da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto),
ao Professor Doutor José Silva Cardoso (Professor Agregado da Faculdade de Medicina
da Universidade do Porto) e ao Professor Doutor Paulo Bettencourt (Director do
Serviço de Medicina Interna do H.S.João e Professor Agregado da Faculdade de
Medicina da Universidade do Porto) pelo seu incentivo e revisão crítica dos resultados.
- À Mestre Elisabete Martins (Assistente Hospitalar de Cardiologia) pela co-
orientação deste projecto e incansável participação em todas as suas etapas, desde a
concepção à revisão crítica e estruturação dos resultados obtidos.
- Ao Professor Doutor Cassiano Abreu Lima (Professor Catedrático Jubilado da
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto), pela orientação cuidadosa e dedicada
do projecto, e pelos seus valiosos conselhos na concepção, organização e apreciação
crítica dos resultados.
A todos reitero o meu muito obrigado.
4
ÍNDICE
Página
I. INTRODUÇÃO 5
1. Perspectiva histórica 5
2. Epidemiologia 5
3. Manifestações clínicas - Critérios de diagnóstico 5
4. Diagnóstico Molecular 9
5. Patogénese 12
6. Abordagem clínica actual da Síndrome de Marfan 15
7. Novas perspectivas da terapêutica farmacológica 16
II. ENQUADRAMENTO DO ESTUDO 18
III. OBJECTIVOS 22
IV. MATERIAL E MÉTODOS 23
População 23
Métodos 23
Ética 27
V. RESULTADOS 28
Características clínicas da população 28
Mutações identificadas 29
VI. ARTIGOS 31
Utility of molecular diagnosis in a family with Marfan syndrome
and an atypical vascular phenotype.
32
Higher plasma levels of TIMP-1 among Marfan Syndrome
patients with previous aortic root replacement: a marker of
improved proteolytic balance?
45
VII. DISCUSSÃO 60
VIII. CONCLUSÕES 68
IX. RESUMO 70
X. SUMMARY 71
XI. REFERÊNCIAS 72
5
I. INTRODUÇÃO
1. Perspectiva histórica
Em 1896, Antoine-Bernard Marfan, descreveu uma criança de 5 anos com várias
anomalias esqueléticas, realçando o excessivo crescimento dos ossos longos.
Posteriormente, outras manifestações foram sendo reconhecidas como parte integrante
do que hoje designamos como Síndrome de Marfan (SM – Online Mendelian
Inheritance in Man [OMIM] 154700). Em 1955, McKusick, integrou esta entidade, com
um padrão de hereditariedade autossómico dominante1, no grupo nosológico das
doenças do tecido conjuntivo.2
2. Epidemiologia
A SM tem uma distribuição geográfica global, afectando igualmente ambos os
sexos. A incidência da síndrome “clássica” é de 2-3 casos por 10 000 indivíduos.3 Este
valor pode, no entanto, estar subestimado uma vez que o espectro das manifestações
clínicas é muito variado e inclui características comummente encontradas na população
geral.
3. Manifestações clínicas - Critérios de diagnóstico.
A SM envolve tipicamente os sistemas cardiovascular, músculo-esquelético e os
olhos, mas pode também atingir o aparelho respiratório, o sistema nervoso central e a
pele. O diagnóstico depende assim da identificação de um conjunto de critérios clínicos,
revistos em 1996, designados por critérios de Ghent. Para que se estabeleça o
diagnóstico de SM é necessária a presença de um critério major em pelo menos dois
sistemas e envolvimento de um terceiro; se houver história familiar/genética é
necessária a presença de um critério major num sistema e envolvimento de um segundo
6
sistema (tabela 1)1. Numa revisão de 232 indivíduos, os critérios de Ghent permitiram
excluir o diagnóstico de SM em 63% dos probandos e 67% dos familiares. É importante
realçar, que estes critérios não se aplicam a menores de 18 anos, dada a frequente
expressão incompleta da doença nas crianças.4
O carácter multissistémico desta entidade requer uma abordagem multidisciplinar,
que deve incluir a avaliação por cardiologistas, ortopedistas, reumatologistas,
oftalmologistas e geneticistas.
• Manifestações cardiovasculares
Na SM é frequente o espessamento e/ou prolapso das válvulas
auriculoventriculares. As alterações da válvula mitral são muitas vezes as manifestações
mais precoces5 e ao condicionarem insuficiência valvular grave, constituem a principal
causa de mortalidade na infância.6 Curiosamente, a dissecção da aorta é extremamente
rara em crianças, independentemente das dimensões do vaso.3, 7
Nos adultos, os dois principais factores de risco para dissecção aórtica são o
diâmetro máximo da artéria e a presença de história familiar de dissecção da aorta.3
O diâmetro aórtico, medido ao nível dos seios de Valsalva, pode ser avaliado por
ecocardiograma, angioTC ou angioressonância e o valor obtido deve ser indexado à
superfície corporal e à idade do doente.1, 8 Após uma avaliação imagiológica basal, o
ecocardiograma deve ser repetido aos seis meses, para quantificar a taxa de progressão
da dilatação, e se estável, este exame deve ser realizado anualmente.
7
Sistemas envolvidos Musculo-esquelético
- Pectus carinatum Conjunto de pelo menos 4 dos seguintes constitui um critério major:
- Pectus excavatum, que necessite correcção cirúrgica - Proporção segmento superior/inferior < 0.86, proporção comprimento do braço/altura > 1.05 - Sinal do punho e do polegar - Escoliose > 20º ou espondilolistese - Redução da extensão do cotovelo (< 170º) - Deslocamento medial do maléolo interno, causando pés planus - Protrusio acetabulae
- Pectus excavatum (sobretudo se assimétrico) Critérios minor:
- Laxidez e hipermobilidade articular - Palato arqueado, com aglomeração dos dentes - Alterações faciais (dolicocefalia, hipoplasia malar, enoftalmia, retrognatia, fissuras palpebrais com inclinação inferior) Para que se estabeleça envolvimento do sistema musculo-esquelético têm que estar presentes pelo menos duas alterações correspondentes a critérios major, ou uma correspondente a critério major e duas correspondentes a critérios minor. Olhos
- Ectopia lentis Critérios major:
- Córnea plana Critérios minor:
- Aumento do comprimento axial do globo - Íris hipoplásica ou músculo ciliar hipoplásico, causando diminuição da miose. Para que se estabeleça envolvimento do sistema ocular têm que estar presentes pelo menos duas alterações correspondentes a critérios minor. Sistema cardiovascular
- Dilatação da aorta ascendente, com ou sem regurgitação aórtica, envolvendo pelo menos os Seios de Valsalva. Critérios major:
- Dissecção da aorta ascendente.
- Prolapso da válvula mitral, com ou sem regurgitação mitral. Critérios minor:
- Dilatação da artéria pulmonar, na ausência de estenose pulmonar valvular ou periférica, ou de qualquer outra causa evidente, num individuo com menos de 40 anos. - Calcificação do anel da válvula mitral num indivíduo com menos de 40 anos. - Dilatação ou dissecção da aorta torácica descendente ou abdominal num indivíduo com menos de 50 anos. Para que se estabeleça envolvimento do sistema cardiovascular só tem que estar presente uma alteração correspondente a um critério minor. Aparelho respiratório Critérios major: nenhum
- Pneumotorax espontâneo Critérios minor:
- Bolhas apicais pulmonares Para que se estabeleça envolvimento do sistema respiratório só tem que estar presente uma alteração correspondente a um critério minor. Pele Critérios major: nenhum
- Estrias atróficas sem aumento de peso marcado, gravidez ou stress repetitivo Critérios minor:
- Hérnias recorrentes ou incisionais Para que se estabeleça envolvimento da pele só tem que estar presente uma alteração correspondente a um critério minor. Dura mater
- Ectasia dural lombo-sagrada Critérios major:
Critérios minor: nenhum História familiar / genética Critérios major- Ter um progenitor, filho ou irmão, que cumpre os critérios de forma independente
(qualquer um dos seguintes):
- Presença da mutação no gene FBN1, que se saiba que é causadora de SM. - Presença de um haplotipo FBN1, herdado pela descendência, que se sabe estar associado a um diagnóstico inequívoco de SM na família. Critérios minor: nenhum
Tabela 1 - Critérios de Ghent.
8
• Alterações vasculares arteriais
As alterações identificadas nas paredes aneurismáticas da aorta de doentes com SM
incluem: fragmentação das fibras elásticas (elastólise) com desorganização da lâmina
elástica; degenerescência cística da média, com acumulação de glicosaminoglicanos;
apoptose das células de músculo liso vascular (CMLV); aumento da expressão de
metaloproteinases (MMPs) na matriz extracelular (MEC); ausência de infiltrado
inflamatório.8 Ocorre uma diminuição das ligações entre a lâmina elástica e as CMLV e
em condições de sobrecarga hemodinâmica pode exacerbar-se esta anomalia,
registando-se um aumento da produção de elementos da MEC.
Sabe-se que a aorta é invulgarmente rígida nos doentes com SM9-10 e esta
característica pode ser indirectamente avaliada por ecocardiograma, através da
quantificação da velocidade da pressão de pulso. No entanto, devido ao aumento da
rigidez arterial com a idade, existe uma grande sobreposição de valores entre adultos
saudáveis e doentes com SM.11 Em crianças, estes índices podem ser úteis na
abordagem diagnóstica, sobretudo perante fenótipos atípicos.12 Os parâmetros da
elasticidade podem ainda ser utilizados no seguimento dos doentes, sendo a presença de
maior distensibilidade, um factor de bom prognóstico.13-14
• Outras manifestações
Algumas das anomalias esqueléticas da SM são comuns na população geral como,
por exemplo, a laxidez articular. Neste contexto, só a presença de uma combinação de
alterações permite aumentar a especificidade diagnóstica.1 A radiologia é útil para a
detecção de algumas anomalias, nomeadamente da protrusão acetabular. A escoliose
afecta cerca de 60% dos doentes e pode ter uma evolução rápida, nos surtos de
crescimento, conduzindo a deformidades graves que podem exigir correcção cirúrgica.4
9
A ectasia da dura mater, definida pelo alargamento do canal raquidiano ao nível da
região lombo-sagrada, está presente em 62 a 93% dos doentes, estando a sua
identificação dependente da realização de tomografia computorizada ou de ressonância
magnética.1 A associação desta alteração a queixas álgicas lombares permanece
controversa.3
A ectopia lentis afecta cerca de 60% dos doentes e requer a avaliação por
Oftalmologia. O deslocamento do cristalino pode ser uni ou bilateral, e ocorrer em
qualquer direcção, embora tipicamente, seja um deslocamento superior. O aumento do
comprimento axial do globo ocular, que conduz a miopia e uma maior propensão para
descolamento da retina é outra das possíveis manifestações da SM. 1, 3
O envolvimento pulmonar pode resultar das alterações esqueléticas, como da
deformação grave do esterno ou da coluna vertebral, que podem condicionar um padrão
ventilatório restritivo. As alterações do parênquima incluem o desenvolvimento de
bolhas (apicais) e pneumotórax espontâneo, algumas vezes recorrente.4
Em doentes com SM, ao contrário de outras doenças do tecido conjuntivo, as lesões
cutâneas não são usuais. A manifestação mais comum, que afecta cerca de dois terços
dos doentes é o aparecimento de estrias atróficas em locais não associados a distensão
cutânea, como nos ombros.3
4. Diagnóstico molecular
A SM tem, nos casos familiares, um padrão de transmissão autossómico dominante;
mas cerca de 25% dos casos, têm origem numa mutação de novo.3-4
Até ao momento foram descritas mais de 600 mutações distintas15, sendo a grande
maioria do tipo missense e exclusivas para cada caso-índex ou família.5
10
• Mutações no gene FBN1
O gene FBN1, localizado no cromossoma 15q21.1, codifica uma glicoproteína, a
profibrilina-1, com cerca de 350KDa e que após processamento, se designa por
fibrilina-1. A fibrilina-1 é um componente abundante das microfibrilas extra-celulares.
É constituída primariamente pela repetição de múltiplos domínios homólogos do
módulo de ligação ao cálcio do factor de crescimento epidérmico (cbEGF) e por
domínios contendo oito resíduos de cisteina, encontrados apenas nas fibrilinas e nas
proteínas latentes de ligação ao TGFß.16
As mutações no gene FBN1 encontram-se dispersas ao longo de todo o gene e a
maioria dos casos resulta de duas categorias de mutações: mutações missense e
mutações com formação de codões de terminação prematura (CTP).17 A taxa de
detecção de mutações no gene da FBN1 é actualmente de cerca de 90%, em doentes que
cumprem critérios de Ghent.18-19 Os restantes 10% dos casos poderão associar-se à
presença de mutações nas regiões promotoras ou regiões intrónicas não codificáveis, a
grandes rearranjos não detectáveis por técnica de análise de polymerase chain reaction
(PCR) ou à presença de mutações em outros genes que não o gene FBN1.20
Por outro lado, as mutações no gene FBN1 também não são específicas da SM,
estando associadas a outros síndromes como a ectopia lentis isolada, o fenótipo MASS
(myopia, mitral valve prolapse, aortic root dilatation without dissection, skin
abnormalitties, skeletal involvement), síndrome de craniossinostose Shprintzen-
Goldberg, síndrome de Furlong, e a associação familiar de aneurismas e dissecções da
aorta torácica (TAAD).19, 21
11
o Correlações genótipo-fenótipo
Apesar de não haver correlações genótipo-fenótipo estabelecidas, o risco relativo de
envolvimento de um determinado órgão ou sistema, apresenta diferenças
estatisticamente significativas de acordo com o tipo de mutações envolvidas. 22-23
A associação genótipo-fenótipo mais evidente relaciona-se com a SM neonatal, que
é a forma mais grave da síndrome; manifesta-se logo após o nascimento e conduz a
morte nos primeiros meses de vida, habitualmente por insuficiência cardíaca. Nesta
situação as mutações agrupam-se caracteristicamente nos exões 24-32. No outro
extremo da doença referem-se casos de mutações missense nos exões 1-10, que foram
associados a ausência de dilatação da aorta, e mutações localizadas nos exões 59-65
associadas por sua vez a manifestações cardiovasculares de aparecimento tardio e de
menor gravidade.17
As mutações missense correspondem a aproximadamente dois terços das mutações
do gene FBN1, e na sua maioria envolvem resíduos de cisteína associados às unidades
cbEGF, interferindo com ligações dissulfídicas e consequentemente com a estabilidade
proteica.23 Os indivíduos portadores de mutações missense com substituição de resíduos
de cisteína têm maior probabilidade de apresentar ectopia lentis, comparativamente com
portadores de outras mutações missense, e apresentam assim uma maior probabilidade
de cumprirem os critérios de Ghent (quando excluído o critério genético).23
Cerca de 25% das mutações são do tipo CTP e conduzem à formação de proteínas
incompletas que poderão interferir com a polimerização proteica normal (efeito
dominante negativo), ou à formação de proteínas funcionalmente inactivas (por
degradação preferencial do RNA mutante) reduzindo a síntese total de fibrilina-1
(haploinsuficiência).5 Não há uma relação estabelecida entre a gravidade do fenótipo e a
quantidade de mutante transcrito e, na literatura, têm sido descritos fenótipos de
gravidade variável, independentemente da quantidade de mutante transcrito.18, 24
12
Comparativamente aos doentes portadores de mutações com substituição de resíduos de
cisteína, os indivíduos com mutações CTP apresentam alterações morfológicas
musculoesqueléticas mais marcadas, nomeadamente com maior laxidez articular, e um
risco significativamente menor de envolvimento ocular.22 Em alguns estudos, mas não
noutros, foi ainda encontrada uma maior propensão para a dissecção aórtica nestes
doentes. 22, 25
• Mutações nos genes TGFβR1 e TGFβR2
As mutações nos genes TGFßR1 e TGFßR2 foram inicialmente descritas na
Síndrome Loyes-Dietz (SLD)21 e mais tarde foram também encontradas em doentes
com fenótipos “clássicos” de SM. Esta entidade foi designada como SM tipo 2, baseada
nas diferenças genéticas encontradas.19 As mutações nestes genes associam-se
habitualmente a um fenótipo vascular mais agressivo que se caracteriza por tortuosidade
arterial generalizada e dissecção aórtica em idades mais jovens e com diâmetros
arteriais mais reduzidos.26 A gravidade do fenótipo vascular parece relacionar-se, pelo
menos em parte, com a localização da mutação no gene TGFβR2.25 Caracteristicamente,
os doentes com SLD apresentam também hipertelorismo e úvula bífida e/ou fenda
palatina.26
De uma forma geral, verifica-se no entanto, uma grande sobreposição de fenótipos
entre doentes com SM, SM tipo 2 ou SLD, e a existência de SM tipo 2 e SLD como
entidades separadas é ainda um assunto em debate.19, 27
5. Patogénese
Na origem da SM, pensou-se inicialmente que estaria em causa uma perda de
integridade do tecido conjuntivo. As características clínicas, por seu turno,
nomeadamente o crescimento ósseo excessivo, as anomalias craniofaciais e as
13
alterações valvulares e pulmonares, sugeriam mais a presença de uma alteração dos
mecanismos celulares envolvidos na morfogénese.28
Foram desenvolvidos vários modelos animais da doença, que permitiram a
demonstração de outras funções das microfibrilas, para além do seu papel estrutural,
nomeadamente na modulação da sinalização pelo TGFβ.16, 29
• Sinalização via TGFβ
Com o objectivo de esclarecer os mecanismos que predispõem os doentes com SM
ao desenvolvimento de enfisema e pneumotórax espontâneo, Neptune e colaboradores
estudaram ratinhos deficientes em fibrilina-1: Fbn1mgΔ/mgΔ e Fbn1+/mgΔ. Estes autores
verificaram que os primeiros morriam sete a dez dias após o nascimento, por dissecção
e ruptura aórtica e os segundos, exibiam no período pós-natal imediato, alterações da
septação alveolar distal que evoluíam posteriormente para enfisema destrutivo. Da
análise histológica dos pulmões, os autores concluíram que as alterações eram devidas a
uma perturbação no desenvolvimento tecidular e não à sua destruição. A hipótese
colocada de que a perda de microfibrilas poderia condicionar o sequestro de complexos
latentes de TGFβ, tornando esta citocina mais acessível à activação, foi corroborada
pelo aumento da imunorreactividade da forma activa de TGFβ, no tecido pulmonar dos
ratinhos. Também a utilização de um anticorpo anti-TGFβ foi capaz de reduzir
significativamente a apoptose das células epiteliais pulmonares nos animais deficientes
em fibrilina-1.30
Mais recentemente, num estudo em animais heterozigóticos para uma mutação do
gene FBN1, foi possível demonstrar a associação entre o aumento da sinalização do
TGFβ e o desenvolvimento de aneurismas da aorta. Neste estudo, conhecendo o papel
do losartan como antagonista do TGFβ, foram comparados os efeitos deste fármaco
com os do propranolol após seis meses de tratamento. Apenas no grupo tratado com
14
losartan a espessura e a arquitectura da parede arterial, foram sobreponíveis às do grupo
de controlo (ratinhos normais). O grupo tratado com propanolol demonstrou uma
dilatação aórtica inferior ao grupo não tratado, mas superior ao grupo de ratinhos sem a
mutação.31
Face a estes resultados, considera-se actualmente que a activação da via de tradução
do sinal do TGFβ pode ser um dos principais mecanismos envolvidos na patogenia da
SM, nomeadamente através da activação de MMPs32, as quais promovem a proteólise
da MEC.
• A importância das metaloproteinases
As MMPs constituem uma grande família de enzimas que processam e degradam
inúmeros substratos extracelulares, como o colagénio e a elastina, e são reguladas por
quatro inibidores tecidulares (TIMP).33
A remodelagem progressiva da parede arterial nos doentes com SM, parece
associar-se a um aumento da actividade das MMP-2 e -9, favorecendo a proteólise da
MEC, no entanto, talvez porque as amostras histológicas traduzam apenas os eventos
numa determinada porção do aneurisma, numa fase específica do seu desenvolvimento,
os resultados obtidos não têm sido homogéneos.34-35
Vários estudos mostraram a existência de desequilíbrios na relação MMPs/TIMPs
em amostras de tecido aneurismático da aorta e o tipo de MMPs predominantemente
presente, parece correlacionar-se com o estadio de desenvolvimento do aneurisma. Por
exemplo, a MMP-2 é expressa em níveis elevados quando os aneurismas da aorta
abdominal (AAA) têm pequenas dimensões, enquanto a MMP-9 se encontra elevada
nos casos de aneurismas de maiores dimensões ou em risco de ruptura.36 Vários grupos
têm investigado a relação entre os níveis plasmáticos das MMPs e o risco de progressão
15
da doença vascular, bem como o seu valor na monitorização do sucesso terapêutico após
a exclusão cirúrgica ou endovascular de aneurismas aórticos.37-40
6. Abordagem clínica actual da Síndrome de Marfan
Os doentes com SM devem ter um acompanhamento multidisciplinar, incluindo
avaliações oftalmológicas anuais, e a observação por um cardiologista e realização de
ecocardiogramas inicialmente em intervalos semestrais e após a documentação de
estabilidade da doença aórtica, anualmente.7 Dado o risco acrescido de complicações
cardiovasculares, os doentes com SM devem ser aconselhados a evitar os desportos de
competição e de contacto, bem como os exercícios isométricos. Por outro lado, a prática
de exercício dinâmico em intensidade baixa ou moderada deve ser incentivada, de
forma a manter um condicionamento físico apropriado.41 Mulheres com SM apresentam
um maior risco de dissecção aórtica durante a gravidez, sobretudo se tiverem um
diâmetro da raiz da aorta superior a quatro centímetros no início da gravidez ou se
houver progressão da dilatação ao longo do período gestacional. Os bloqueadores-β não
devem ser descontinuados neste período e a gravidez deve ser planeada e acompanhada
de perto por especialistas em obstetrícia e cardiologia.42
Para além das alterações do estilo de vida, e do tratamento médico, que será
discutido adiante, a intervenção cirúrgica precoce é determinante no aumento da
esperança média de vida destes doentes.43 O tratamento cirúrgico profilático, com
substituição simultânea da raiz aórtica e válvula aórtica (cirurgia de Bentall), é
consensual para diâmetros ao nível da raiz da aorta superiores ou iguais a cinco
centímetros.44 Situações especiais, como nos casos de rápida progressão da dilatação
aórtica (superior a um centímetro por ano), história familiar de dissecção da aorta ou
insuficiência aórtica moderada a grave são também critérios a ter em conta e que
poderão antecipar a decisão cirúrgica.7 Se não houver alterações valvulares
16
significativas, a substituição da raiz da aorta mantendo a válvula é uma alternativa
aceitável, com resultados a curto prazo sobreponíveis à técnica de substituição total,
mas com resultados a longo prazo ainda por determinar.45-46 Não está preconizada a
avaliação seriada da aorta descendente nos doentes com SM, excepto se houver marcada
dilatação ou dissecção aórtica a este nível ou se existirem antecedentes de cirurgia na
aorta ascendente.7
7. Novas perspectivas da terapêutica farmacológica
• Bloqueadores β-adrenérgicos
Actualmente, o uso generalizado dos bloqueadores ß nos doentes com SM baseia-se
em resultados, provenientes de pequenos estudos, que demonstraram uma diminuição
da taxa de dilatação aórtica nos doentes tratados com estes fármacos47-48; contudo os
resultados não têm sido consensuais49 e uma metanálise recente não encontra mesmo
dados que demonstrem uma eficácia clara, a longo prazo, da terapêutica com
bloqueadores ß.50
• Inibidores da enzima de conversão da angiotensina II (iECA)
Num estudo que comparou o uso de enalapril versus propranolol ou atenolol, o
tratamento com iECA conduziu a uma melhoria da distensibilidade aórtica associada a
uma menor taxa de dilatação aórtica.51 Estes dados foram reforçados com um outro
trabalho em que, doentes previamente medicados com bloqueador ß, foram
adicionalmente tratados com perindopril, tendo-se demonstrado também neste grupo
uma redução significativa da taxa de dilatação aórtica.52
Os iECA poderão actuar aumentando a concentração da bradicinina em circulação,
com consequente vasodilatação e redução da rigidez da parede aórtica, ou então
reduzindo a apoptose das CMLV, mediada pela activação dos receptores AT2.51-53
17
• Antagonistas dos receptores da angiotensina II (ARA)
Um estudo num modelo animal de SM, demonstrou que o uso de losartan,
comparativamente com o propranolol, preservou a estrutura e dimensões aórticas e se
associou a uma diminuição das vias de sinalização do TGFß, um efeito que foi
independente da redução da tensão arterial e da frequência cardíaca.31 Um estudo em
jovens com SM comparando atenolol com losartan está a decorrer54 e uma análise
retrospectiva de um pequeno grupo de crianças que apresentavam uma rápida evolução
da doença cardiovascular, a quem foi introduzida terapêutica com ARA (a maioria dos
casos com losartan), demonstrou uma diminuição da taxa de dilatação aórtica nestes
doentes, face ao grupo que manteve apenas o tratamento com bloqueadores ß.55
• Inibidores das metaloproteinases
Com o objectivo de estabilizar a doença aneurismática e prevenir expansão futura,
atrasando ou mesmo evitando a necessidade de intervenção cirúrgica têm sido
investigadas outras substâncias com actividade inibitória sobre as MMPs. A doxiciclina,
através de mecanismos distintos dos que lhe conferem actividade antibiótica, é um
inibidor inespecífico das MMPs, com actividade inibitória máxima sobre as MMP-2 e
MMP-9. Um estudo em modelos animais com SM comparou a eficácia do tratamento
com doxiciclina versus atenolol, relativamente ao desenvolvimento de aneurismas da
aorta torácica. A doxiciclina mostrou-se mais eficaz do que o atenolol na prevenção da
formação de aneurismas, preservando a integridade das fibras elásticas, normalizando a
função vasomotora e suprimindo a activação do TGFß. Um estudo randomizado,
multicêntrico, comparando a terapêutica com doxiciclina, losartan e bloqueadores ß,
poderá ajudar a definir o tratamento óptimo, a longo prazo, dos doentes com SM.56
18
II. ENQUADRAMENTO DO ESTUDO
• Importância da avaliação multidisciplinar de doentes com suspeita de SM
Apesar dos avanços no conhecimento das vias moleculares envolvidas na SM, o seu
diagnóstico permanece ainda fundamentalmente clínico, assentando na avaliação e
integração de um conjunto de critérios morfológicos envolvendo os sistemas
cardiovascular, musculoesquelético, ocular, respiratório, pele e sistema nervoso central
(critérios de Ghent1). Contudo, a presença e a gravidade de envolvimento de cada um
destes sistemas, a nível inter- e intra-familiar, é muito variável e embora a penetrância
da SM seja completa, a sua expressão clínica depende da idade, e por esse motivo as
crianças apresentam frequentemente fenótipos incompletos. Há ainda que realçar a
sobreposição fenotípica parcial com outras síndromes, sendo por vezes difícil
estabelecer o correcto diagnóstico diferencial.
Face a tal variabilidade de apresentação e à grande prevalência de algumas das
manifestações clínicas na população geral, nomeadamente ao nível das alterações
musculoesqueléticas, os critérios de Ghent foram apresentados em 1996, com o
objectivo de diminuírem o número de diagnósticos de SM falsamente positivos. Estes
critérios restritos implicam a presença de um conjunto complexo de alterações
fenotípicas em múltiplos órgãos ou sistemas e a avaliação de cerca de trinta
características morfológicas.1 Tendo em conta a especificidade de cada um dos sistemas
orgânicos envolvidos, uma avaliação clínica multidisciplinar torna-se essencial para a
correcta identificação dos vários critérios, e consequentemente para o correcto
diagnóstico de SM.
19
• Relevância clínica do diagnóstico molecular
Em 1996, a par dos critérios clínicos já mencionados, a presença de uma mutação
patológica no gene FBN1, passou a ser considerada um critério major para o
diagnóstico de SM1.
Apesar da grande variabilidade fenotípica em portadores de mutações idênticas no
gene FBN1, o esforço multicêntrico com a publicação de inúmeras mutações e
correlações genótipo-fenótipo em múltiplas séries de doentes, levou à descrição de
associações entre determinados tipos de mutações e o risco relativo do envolvimento de
sistemas e órgãos específicos. Estas associações poderão vir a permitir uma antecipação
das consequências clínicas, baseada no tipo de mutações encontradas num indivíduo,
utilizando-as como preditores de prognóstico e orientadores terapêuticos.22
Além disso, o estudo molecular e a detecção de mutações no gene FBN1 permitem
estabelecer o diagnóstico de SM mesmo perante um fenótipo atípico ou incompleto.
Dada a morbi-mortalidadede associada à presença destas mutações o reconhecimento
precoce de portadores torna-se essencial, não só face à disponibilidade actual dos
tratamentos médicos e cirúrgicos, como também para, numa perspectiva futura, poder
vir a inclui-los como alvos preferenciais de novas estratégias terapêuticas.
O teste genético oferece ainda a possibilidade de aconselhamento genético, de
diagnóstico prenatal57 e pré-implantação de ovócitos58 e, em familiares de doentes com
SM, poderá evitar anos de rastreio clínico e imagiológico nos não portadores,
tranquilizando-os.
20
• Importância da avaliação do desequilíbrio proteolítico da matriz extracelular
em doentes com SM
Em 2003, Neptune e colaboradores, descreveram a associação da desregulação do
TGFß na patogénese da SM30 e desde então, múltiplos estudos têm corroborado este
achado. O aumento da activação do TGFß, demonstrou levar à degradação da MEC e à
produção de MMPs32; por outro lado também as MMPs podem conduzir à activação do
TGFß59, criando o substrato para a instalação de um ciclo vicioso que conduz, em
última análise, à formação do aneurisma aórtico.
As amostras histológicas de segmentos de aorta obtidos após a ressecção
aneurismática em doentes com SM e em modelos animais, mostraram um aumento da
actividade proteolítica traduzido por aumento dos níveis de MMPs.34-35 Uma abordagem
terapêutica que iniba esta cascata proteolítica parece uma via potencialmente atraente e
a doxiciclina, como inibidor inespecífico das MMPs, mostrou ser mais eficaz do que o
atenolol na prevenção de aneurismas aórticos num modelo animal de SM, melhorando a
integridade das fibras elásticas e normalizando a distensibilidade arterial, diminuindo a
activação do TGFß e aumentando a expressão dos TIMPs face às MMPs.56
O doseamento plasmático de MMPs e TIMPs, sobretudo em doentes com AAA,
tem sido alvo de inúmeras investigações e há alguns dados, embora não consensuais,
que parecem apontar para a sua utilidade clínica, nomeadamente através dos seguintes
achados: níveis aumentados de MMP-9 relacionaram-se com a expansão aneurismática
em doentes com AAA entre três e cinco centímetros de diâmetro37; a relação MMP-
9/TIMP-1 mostrou-se inversamente relacionada com o diâmetro, a distensibilidade e a
complacência da aorta abdominal suprarrenal numa coorte de doentes com AAA60; a
exclusão cirúrgica ou endovascular de AAA e da aorta torácica descendente associou-se
a inversão da relação MMP-9/TIMP-1 e a diminuição dos níveis plasmáticos de MMP-3
e MMP-9.38-40
21
Num estudo muito recente conduzido em dezassete doentes com SM, verificou-se
que após vinte e quatro semanas de tratamento com um iECA houve redução do
diâmetro da raiz da aorta que se acompanhou pela diminuição dos níveis plasmáticos de
TGFß, MMP-2 e MMP-3.61 Estes achados vêm corroborar a potencial utilização destes
biomarcadores como preditores de prognóstico e sobretudo na avaliação de resposta à
terapêutica em doentes com SM.
22
III. OBJECTIVOS
O trabalho de investigação subjacente à presente dissertação teve como objectivo
principal a caracterização de uma população de doentes com síndrome de Marfan, a dois
níveis distintos:
1. Procurar expandir o espectro de mutações identificadas em doentes
avaliados por uma equipa multidisciplinar;
2. Caracterizar o perfil plasmático de biomarcadores de proteólise da matriz
extracelular, independentemente de cirurgia aórtica prévia.
23
IV. MATERIAL E MÉTODOS
POPULAÇÃO
Os doentes foram identificados a partir de uma base geral de dados da nossa
instituição, usando como critério de selecção o diagnóstico de Síndrome de Marfan.
Nesta base constavam, no momento da pesquisa, doentes referenciados ao nosso
centro entre Janeiro de 1989 e Dezembro de 2008, e nela estão incluídos não só doentes
que são ou foram seguidos previamente em consultas médicas, mas também aqueles
com registo(s) de internamentos prévios no HSJ.
Os 45 doentes adultos identificados (vivos e com possibilidade de contacto através
do endereço ou telefone), foram contactados e os respectivos médicos assistentes
informados tendo em vista a inclusão dos primeiros no projecto de investigação.
Todos os familiares em primeiro grau de casos índex de SM foram convidados a
participar no estudo.
O critério de elegibilidade para efectuar o estudo molecular e caracterização
bioquímica foi a documentação objectiva da presença de critérios diagnósticos de
Ghent.
MÉTODOS
• Avaliação clínica
Todos os doentes foram observados em consultas de cardiologia, reumatologia e
oftalmologia entre Outubro de 2008 e Maio de 2009.
Do ponto de vista cardiológico, para além da avaliação clínica, que incluiu uma
investigação exaustiva dos antecedentes familiares, todos os doentes efectuaram um
electrocardiograma e um ecocardiograma transtorácico.
24
Para a realização dos ecocardiogramas foram utilizados um ecocardiógrafo Vivid 3
(GE Healthcare) e um iE33 (Phiplips) e em todos os estudos foram obtidas imagens nas
incidências paraesternal esquerda, apical, supraesternal e subcostal. O diâmetro da raiz
da aorta (ao nível dos Seios de Valsalva e junção sinotubular) e aorta ascendente foi
medido em paraesternal eixo longo, o diâmetro do arco aórtico foi medido em
incidência supraesternal e o diâmetro da aorta torácica descendente foi medido quer em
incidência supraesternal, quer em subcostal.
Os exames foram realizados por dois operadores experientes e as medições
efectuadas seguiram as recomendações para a quantificação das câmaras cardíacas
publicadas pela American Society of Echocardiography em associação com a European
Association of Echocardiography.62 A raiz da aorta foi considerada dilatada quando
esse diâmetro, medido ao nível dos Seios de Valsalva, excedia o limite superior dos
valores normais, de acordo com a faixa etária e superfície corporal do doente.63
Em consulta de Reumatologia foi efectuada a avaliação clínica dos critérios de
Ghent correspondentes ao sistema musculoesquelético e à pele. O mesmo especialista
avaliou ainda a presença de escoliose e protusão acetabular através da análise de
radiografias da coluna vertebral e da anca, respectivamente.
A todos os doentes foi pedida uma consulta de oftalmologia, onde foi avaliada a
presença de ectopia lentis, como critério clínico major de SM.
O envolvimento do sistema respiratório foi apurado através da história clínica,
questionando os doentes sobre a existência de antecedentes de pneumotórax espontâneo.
Por dificuldade no agendamento e interpretação dos exames, não foram realizadas
ressonâncias magnéticas para avaliação de ectasia da dura mater.
25
Após a avaliação multidisciplinar, trinta e um doentes (dezasseis casos-índex, e
cindo famílias distintas) cumpriam os critérios de Ghent e foram incluídos na segunda
fase do nosso protocolo.
• Doseamento sérico de biomarcadores
Para o estudo da activação da casca proteolítica, foi obtida uma amostra de sangue
venoso (trinta doentes) recolhida em tubo com citrato, entre as oito e as nove horas da
manhã, em jejum. As amostras para posterior doseamento de MMPs e TIMPs foram
centrifugadas num intervalo de tempo após a colheita inferior a trinta minutos (a 4500
rpm, durante quinze minutos), os sobrenadantes foram removidos e armazenados de
imediato a -15ºC (ou menos) e a -80ºC em uma a duas horas. As amostras foram
analisadas após um tempo médio de armazenamento de 62,7± 12,4 dias, usando um
teste ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) comercialmente disponível (Biotrak
ELISA System, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) e seguindo as
instruções do fabricante. Os testes para doseamento de MMPs e TIMPs, têm os
seguintes níveis de detecção: MMP2 - 1,5 ng/mL; MMP3 - 3,75 ng/mL; MMP9 - 4
ng/mL; TIMP1 - 3,13 ng/mL; TIMP2 - 8 ng/mL.
Para o doseamento da α2-macroglobulina, a amostra se sangue venoso obtida na
mesma altura da previamente descrita, foi analisada no laboratório de imunologia da
nossa instituição, nas primeiras vinte e quatro horas após a colheita. Foi doseada com N
Antisoro de α2-macroglobulina Humana*, através de imunonefelometria em sistemas
BN* (*Simens Healtcare Diagnostics). O intervalo de referência do fabricante para
adultos normais é de 1.3-3.0 g/L. Todas as amostras foram processadas separadamente.
26
• Estudo molecular
O diagnóstico molecular foi efectuado no Instituto de Patologia e Imunologia
Molecular da Universidade do Porto, a partir de ADN obtido de amostras de sangue
periférico.
A pesquisa de mutações no gene FBN1 para a totalidade da sequência codificante
foi efectuada através da técnica de PCR com sequenciação directa dos produtos obtidos.
Nos casos onde não foram encontradas alterações patogénicas pela técnica atrás
descrita, foi pesquisada a presença de grandes rearranjos genómicos usando a técnica de
MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Todos os resultados
positivos foram confirmados replicando a análise na sua totalidade.
A patogenecidade das alterações encontradas foi validada por comparação com as
alterações do gene FBN1 descritas na literatura (UMD database).15 No caso de
mutações não descritas, foi confirmado que não se tratava de polimorfismos
nucleotídicos já descritos (Ensembl database)64 e foi avaliado o seu potencial funcional
usando o algoritmo informático PolyPhen (PolyPhen database).65
• Análise estatística
As variáveis contínuas são apresentadas como média ± desvio padrão, ou caso não
apresentem distribuição normal, como mediana (intervalos interquartis). As variáveis
categóricas são apresentadas como contagem de casos e proporções.
Comparações de variáveis contínuas com distribuição normal, entre grupos de
doentes, foram feitas recorrendo a testes t para amostras independentes, e teste de
Mann-Whitney-U nas de distribuição não normal.
Todas as análises foram realizadas no SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
27
ÉTICA
O estudo foi aprovado pelo Conselho de Administração e Comissão de Ética do
HSJ. Todos os participantes assinaram um consentimento informado escrito, de acordo
com as normas previstas na Declaração de Helsínquia e as normas internas da nossa
instituição.
28
V. RESULTADOS
• Características clínicas da população.
As características epidemiológicas e clínicas da população em estudo (trina e um
doentes), bem como a prevalência dos critérios de Ghent encontrados, estão descritas
nas tabelas seguintes (tabelas 2 e 3).
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E
EPIDEMIOLÓGICAS
N (%)
Idade média ± DP (anos) 37 ± 12
Sexo masculino 17 (54,8)
Factores de risco cardiovascular
DM tipo 2
HTA
Dislipidemia
3 (9,7)
3 (9,7)
8 (25,8)
TA média± DP sistólica / diastólica (mmHg) 115,7± 15,7 / 69,1 ± 10,7
FC média (bpm) 64 ± 9
Critérios cardiovasculares major 27 (87,1)
Cirurgia cardio-torácica prévia 14 (45,2)
Substituição da raiz da aorta
Substituição valvular aórtica
13 (41,9)
1 (3,2)
Anuloplastia ou valvuloplastia mitral 4 (12,9)
Medicação em curso
Bloqueadores ß
iECA
ARA
Estatina
21 (67,7)
7 (22,6)
6 (19,3)
7 (22,6)
Tabela 2 - Características clínicas e epidemiológicas da população.
Legenda: ARA, antagonistas dos receptores da angiotensina II; DM, Diabetes Mellitus; DP, desvio
padrão; FC, frequência cardíaca; HTA, hipertensão arterial; iECA, inibidores da enzima de conversão da
angiotensina; N, número de casos; TA, tensão arterial.
29
CRITÉRIOS DE GHENT Nº doentes/Total amostra estudada
(% válida)
Proporção Membros Superiores/Altura >1,05 16/31 (51,6)
Sinal do punho e polegar 13/31 (41,9)
Pectus carinatum 10/30 (33,3)
Pectus excavatum com cirurgia - sem cirurgia 1/30 (3,3) – 6/30 (20)
Pés planus 17/28 (60,7)
Protusão acetabular 18/20 (90)
Escoliose >20º 14/30 (46,7)
Hiperlaxidez articular 23/31 (74,2)
Alterações faciais (micrognatismo, hipoplasia malar,
palato arqueado, encavalgamento dentário)
29/31 (93,5)
Critérios major musculo-esqueléticos 17/26 (65,4)
Envolvimento musculo-esquelético (sem critérios major) 14/31 (45,2)
Dilatação aorta ascendente (sem cirurgia) – Com cirurgia
prévia da aorta ascendente
15/31 (48,4) – 12/31 (38,7)
Dissecção aórtica 8/31 (25,8)
Dilatação da aorta descendente 6/31 (19,4)
Prolapso da válvula mitral (com e sem cirurgia) 13/31 (41,9)
Dilatação da artéria pulmonar 2/31 (6,5)
Critérios major cardiovasculares 27/31 (87,1)
Envolvimento cardiovascular (sem critérios major) 2/31 (6,4)
Estrias 17/31 (54,8)
Hérnias 4/31 (12,9)
Envolvimento cutâneo 19/31 (61,3)
Pneumotórax espontâneo 4/31 (12,9)
Bolhas apicais 3/31 (9,7)
Envolvimento pulmonar 4/31 (12,9)
Critérios oculares major
(ectopia lentis com ou sem cirurgia)
5/21 (16,1)
Presença de história familiar ou de mutação FBN1 26/31 (83,8)
Tabela 3 - Descrição e prevalência dos critérios de Ghent na população estudada.
• Mutações identificadas: Em nove casos índex e dezanove dos respectivos
familiares foi efectuada pesquisa de mutações no gene FBN1. A descrição dos
resultados moleculares e as características clínicas dos casos índex e dos onze
familiares com teste genético positivo estão explicitadas na tabela 4.
30
Casos ìndex e familiares
Sexo Idade Exão Mutação (ADN)
Alteração na Proteína
Módulo Sistema Cardiovascular
Sistema Musculoesquelético
Olhos Sistema Respiratório
Pele
Família 1 16 C1995G Tyr665X TGFß-like#2 1 F 37 DisAo tB,PVM Maj. - - + 1-A M 36 DisAo tB, DA, PVM Maj. - - + 1-B F 39 DA Maj. - Pneum. + 1-C F 42 PVM Maj. - - - 1-D M 49 DA, DAA Envolv. - Pneum. + 1-E M 53 DA, PVM, IM Maj. - - - 1-F M 19 DisAo tA, DA Maj. - - + 1-G F 61 DA, IM - n.a - - Família 2 56 T6906A Cys2302X cbEGF-like#36 2 M 54 DA Envolv. na - + 2-A M 31 DisAo tA, DAA Envolv. na Pneum. + 2-B M 29 DA Envolv. na - - Família 3 65 8367insA Asn2786fsX2800 C-terminal 3 M 40 DisAo tA Maj. - - + 3-A M 35 DA Maj. na - + 3-B M 43 DA Envolv. na - + Restantes casos índex
4* M 44 24 G3043C Ala1015Pro TGFß-like#3 DisAo tA, DA, RA Envolv. na - - 5* M 24 29 G3676T Gly1226X cbEGF-like#15 DA, PVM Maj. Maj. - + 6 M 37 51 T6331C Cys2111Arg TGFß-like#6 DA Envolv. Maj. - - 7 F 27 45 5582insG Ser1861fsX1867 cbEGF-like#27 PVM Maj. na - - 8 M 56 36 G4472T Cys1491Phe cbEGF-like#22 DA Maj. na - + 9 F 30 - - - - DA, PVM, IM Maj. - - +
Tabela 4 - Características moleculares e clínicas de 9 casos índex e 11 familiares portadores de mutações FBN1. Legenda: ADN, Ácido Desoxirribonucleico; DA, Dilatação
Aórtica; DAA, Dilatação Aorta Abdominal; DisAo, Dissecção Aórtica (DisAo ta - tipo A, DissAo tB - tipo B); Envolv., Envolvimento musculoesquelético; F, Feminino; IM,
Insuficiência Mitral; M, Masculino; Maj, Critérios Major; n.a., não aplicável; Pneum., Pneumotórax; PVM, Prolapso Válvula Mitral; RA, Regurgitação Aórtica; -, sistema não
envolvido; + sistema envolvido. Notas: critérios major aparecem em negrito; *, doentes com história familiar de SM.
31
VI. ARTIGOS
Do trabalho de investigação efectuado resultou a elaboração de dois artigos
científicos, que em seguida se apresentam, e que foram submetidos para publicação em
revistas indexadas.
1. Utility of molecular diagnosis in a family with Marfan syndrome and
an atypical vascular phenotype.
2. Higher plasma levels of TIMP-1 among Marfan Syndrome patients
with previous aortic root replacement: a marker of improved
proteolytic balance?
32
Utility of molecular diagnosis in a family with Marfan syndrome
and an atypical vascular phenotype.
Authors: Ana Lebreiro1, MD; Elisabete Martins1, MD, MSc; Sofia Pimenta2, MD;
José Miguel Bernardes2, MD; Jorge Almeida3, MD; José Carlos Machado4, PhD;
Cassiano Abreu-Lima1,5 MD, PhD.
1 Cardiology Department, Hospital S. João, Porto
2 Rheumatology Department, Hospital S. João, Porto
3 Thoracic Surgery Department, Hospital S. João, Porto
4 Institute of Molecular Pathology and Immunology of Porto University, Porto
5 Medicine Department, University of Porto Medical School, Porto
Authors have no conflicts of interest to disclose.
Address for correspondence:
Ana Lebreiro
Hospital de S. João.
Alameda Prof. Hernâni Monteiro. 4202-451 Porto. Portugal.
Fax: +351225503015;
Telephone: +351966895567;
e-mail: [email protected]
33
ABSTRACT
Marfan Syndrome (MFS) is a connective tissue disorder, with autossomal dominant
inheritance, caused mainly by FBN1 mutations. Diagnosis usually relies on clinical
criteria, but phenotypic presentation varies widely among affected subjects. Aortic
dissection or rupture, are the cause of death in over 90% of untreated patients. Early
recognition of at risk individuals is important in view of the available medical and
surgical treatments that significantly improve life expectancy. Molecular studies may
provide an etiologic diagnosis in patients with milder or atypical clinical presentations
and contribute to preventive management and genetic counseling of carriers, as well as
in reassurance of unaffected individuals. In this paper, by describing a MFS family with
an atypical clinical presentation, we highlight the utility of FBN1 mutation’s screening in
selected cases.
34
INTRODUCTION
Marfan Syndrome (MFS) is a connective tissue disorder, with autossomal dominant
inheritance, that typically affects cardiovascular, skeletal, ocular, pulmonary and central
nervous systems. It has a global geographic distribution, is equally distributed among
genders and has an incidence of 2-3 cases per 10 000 individuals.1 Aortic dissection or
rupture and cardiac failure due to severe mitral and aortic valves regurgitation,
represent the main cause of death in over 90% of untreated patients.2
Despite continuous advances in mutation detection, the diagnosis of MFS still
relies on Ghent nosology, a set of clinical criteria comprising evaluation of several
organ systems. The phenotypic presentation varies widely in severity and includes mild
clinical features common in general population.3
MFS is mainly caused by mutations in fibrillin-1 (FBN1) gene, a large gene located
on chromosome 15q21.1, made up of 65 coding exons and transcribed in a 10 Kb
messenger RNA (mRNA) that encodes a 2871 amino acid protein. FBN1 mutations
occur not only in MFS, but also in diseases that involve only one organ system.4
More than 600 pathogenic mutations were reported in the last update of the
Universal Marfan Database, and most of these are unique to individual families.5
Mutations have been found across the entire gene, and at molecular level, two
major mutation categories are distinguishable, missense mutations and mutations
leading to premature termination codons (PTC). Missense mutations correspond to
approximately two-thirds of FBN1 mutations, the majority of which are cysteine
substitutions potentially implicated in disulfide bonding and consequently implicated in
the correct folding of the fibrillin monomer6; the second mutation category, corresponds
to approximately 25% of mutations, and consists of frameshift or nonsense mutations
leading to PTC and production of truncated monomers7.
35
To date, there is no established genotype-phenotype correlation. Nevertheless, the
relative risk for specific organ involvement shows some statistically significant
differences among different types of mutations.7
On the other hand, patients with MFS phenotypes have also been found to be
carriers of mutations in the genes encoding receptors 1 and 2 of transforming growth
factor ß (TGFßR1 and TGFßR2). The condition has been designated as MFS type 2
(MFS2) and patients generally present with severer vascular consequences than FBN1
mutation-carriers.8
There is striking intra-familial variability among MFS patients, and early recognition
of at risk individuals is important in view of the available medical and surgical
treatments that significantly improve life expectancy.
In this paper we describe a family with several members expressing clinical
features compatible with MFS, but with peculiar phenotypic characteristics, in which
molecular diagnosis allowed a definitive diagnosis and family screening.
METHODS
Patients and their relatives were invited to a medical consultation with a
cardiologist, a rheumatologist and an ophthalmologist.
Clinical data
Echocardiographic evaluation was made using either a Vivid 3 (GE Healthcare) or
iE33 (Phiplips) ultrasound scanners. Left paraesternal, apical, suprasternal and
subcostal windows were recorded. Measurements of aortic root diameter (both at the
sinuses of Valsalva and sinotubular junction) and ascending aorta were made
according to recommendations for chamber quantification from the American Society of
Echocardiography in conjunction with European Association of Echocardiography.9
Aortic root was considered dilated when the maximum diameter at the sinuses of
36
Valsalva, measured by echocardiography, exceeded the upper normal limits for age
and body surface area.10
Scoliosis and protusio acetabulae were evaluated by spine and hip radiographs.
Only ectopia lentis was considered a positive ocular criterion. Magnetic resonance to
look up for dural ectasia was not performed.
After appropriate written informed consent, DNA was extracted from a peripheral
blood sample and all 65 exons of FBN1 were amplified. Mutation screening of the
entire coding sequence of FBN1 gene was then preformed, using Polymerase Chain
Reaction. All positive results were confirmed by a repeated analysis. Pathogenecity of
mutations was compared to FBN1 mutations previously described in literature
(
Molecular data
http://www.umd.be/FBN1/). In case of newly described mutations we confirmed that
they didn’t correspond to any known single-nucleotide polymorphism
(http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Sequence?g=ENSG00000166147) and
we used PolyPhen, a bioinformatic algorithm, in order to predict the impact of these
amino acid substitutions on protein function. (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)
RESULTS
Our proband (Figure 1 - III:7), a 37-year-old female was referred after a type B
aortic dissection, beginning 60 mm after the origin of left subclavian artery and
extending distally until iliac arteries bifurcation; ascending aorta and arch were within
normal values, the descending thoracic aorta presented a diameter of 42 mm. She
fulfilled Ghent’s skeletal system major criteria and had skin involvement.
Family description
37
Family history at that time, revealed that her father (II:3) had died suddenly at the
age of 48 (probable aortic dissection) and two uncles (II:19 and II:21) were already
followed for aortic disease. The oldest of these uncles, a 53-year-old male (II:19) had a
Bentall composite graft implanted at the age of 50, because of progressive aortic root
dilatation (60 mm), and mitral valvuloplasty because of mitral valve prolapsed (MVP)
and mitral regurgitation (MR). A second uncle with 48-years-old (II:21), presented with
a generalized arterial disease. He had left leg amputation because of occlusive arterial
disease at the age of 45, and exclusion of popliteal aneurysm on the right leg at the
age of 46. He also had mild abdominal aorta dilatation and aortic root aneurysm (34
mm and 46 mm of diameter, respectively).
By that time, family screening was started and our patient’s brothers were called in
for clinical evaluation. Four of them (three females and one male) were evaluated and
all of them fulfilled major skeletal system criteria; a 43-year-old sister (III:4) had also
minor involvement of the cardiovascular system (MVP); a 39-year-old sister (III:6) had
mild aortic root dilatation (40 mm), fulfilling major cardiovascular system criteria; the
youngest brother (III:8), a 36-year-old patient, also fulfilled major cardiovascular system
criteria, presenting aortic root dilatation (47 mm) and MVP. Four days after our clinical
and echocardiographic evaluation, this patient was admitted for acute type B aortic
dissection, starting immediately after de origin of subclavian artery; a computorised
tomography scan evidenced aortic dilatation (44 mm) at the level of aortic dissection.
A first-degree cousin (III:33), a 19-year-old patient, had acute type A dissection (at
the age of 19), extending throughout the entire aorta; the ascending aorta was
markedly dilated (82 mm) and he was submitted to emergent surgical aortic root and
valve replacement.
Another proband’s ant, a 61-years-old female (II:14), was found to have aortic root
dilatation (43 mm) and mild MR.
38
The other family members’ evaluated (nine subjects) showed no clinical or
molecular evidence of MFS. Table 1 shows the clinical features present in each of the
affected subjects.
Molecular study: A new pathogenic FBN1 mutation was identified in all
affected members of this family. The mutation found was a nonsense mutation, with
substitution C1995G, in exon 16 of FBN1 gene, leading to formation of a stop codon, in
position 665 of tyrosine (Tyr665X).
DISCUSSION
This family came to our attention because of two cases of type B aortic
dissections, occurring in young patients (III:7 and III:8), associated with aortic
diameters smaller than expected in these kind of complications; moreover another
family member, presented with an initial diagnosis of peripheral arterial disease
(popliteal aneurysm) and was subsequently diagnosed with abdominal and ascending
aortic dilatation. In face of such cardiovascular presentation, the presence of a
generalized arterial familial syndrome was suspected and we decided to search for
mutations in FBN1 and TGFßR genes. The molecular identification of a FBN1 mutation
was determinant to establish a definitive diagnosis of MFS in this family.
FBN1 gene mutations are found in about 90% of MFS patients fulfilling Ghent’s
criteria11. Causes for the remaining negative cases might be (1) the presence of
mutations in promoter or intronic sites; (2) presence of large rearrangements not
detectable by using PCR-based genomic analysis; (3) absence of a FBN1 mutation,
with mutations in other genes, such as TGFßR genes; (4) sensitivity of the technique
employed.12
In fact, patients with classic MFS phenotypes have also been found to be carriers
of TGFßR1 e TGFßR2 mutations (MFS2), the same mutations that cause Loyes-Dietz
39
Syndrome (LDS). These patients typically present with generalized arterial tortuousity
and aneurysms, and aortic dissection at an early age and with smaller aortic
diameters.13 In general, a broad clinical overlap exists among MFS, MFS2 and LDS,
and the existence of a MFS2 phenotype as a separate disorder of LDS is still a matter
of debate. 8, 14
Although penetrance of MFS-related FBN1 mutations is complete, the clinical
status of relatives carrying identical mutations can vary widely with respect to onset of
disease, organ-system involvement and severity of manifestations. It is still unknown if
mutations of different types and locations have different clinical consequences, and if
modifier genes, yet to be identified, have any influence on clinical expression of
disease. 15
Increased TGFß activity is currently thought to be a major contributor to the
pathogenesis of both MFS16 and LDS17. In MFS, lack of fibrillin-1 and structural deficits
in microfibrils may promote this abnormal activation of TGFß, probably through
reduced matrix sequestration of latent transforming growth factor ß binding proteins
(LTBPs), with deleterious consequences on muscle cell performance and tissue
remodeling.18
In this family we found a new FBN1 mutation leading to an early protein
sequence truncation, associated with a particularly aggressive cardiovascular
phenotype in most affected individuals. The nonsense mutation found was located in
the exon encoding the second of seven TGFß1-binding protein-like modules of fibrillin-
1, a domain present only in FBN1 and LTBPs. These globular domains have no known
specific function, although they may seem to mediate specific protein-protein
interactions.15
Mutations leading to premature termination codons (PTC) predict the production
of truncated monomers, which can interfere with the mechanisms necessary for
polymerization and stabilization of microfibrils (dominant negative effect), or reduce
total protein synthesis.19 This effect may be counterbalanced by instability of the mutant
40
messenger RNA (mRNA) transcripts that are preferentially degraded by the nonsense-
mediated mRNA decay mechanism. However no relation has been found between
phenotype severity and lower levels of mutant transcripts.7
Compared to patients with cysteine substitutions (missense mutations), those
with PTC mutations have more striking skeletal features and large-joint laxity with a
much lower risk of ocular involvement; in some studies aortic dissections seemed also
more frequent in PTC mutation’s carriers.7
CONCLUSION
Genotyping this family allowed a more comprehensive diagnosis of their
pathologic process. Detection of a FBN1 mutation disclosed the genetic nature of the
phenotypic features described, allowing diagnosis of patients with milder clinical
presentations and contributing to early diagnosis, genetic counseling, preventive
management of carriers and reassurance of unaffected individuals.
Differential diagnosis between classic MFS, MFS2 or a subtype of LDS,
wouldn’t otherwise be possible on clinical grounds alone.
Acknowledgments
This study was supported by a grant from the Research Department of Hospital S.
João, Porto.
41
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43
I
II
III 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
? 1 2
Figure 1 - Family pedigree. The proband is indicated with an arrow. Black symbols indicate affected subjects fulfilling
Ghent criteria; Symbols with a vertical black bar indicate affected subjects, not fulfilling Ghent criteria; Grey symbols
indicate normal clinical and molecular studies; ?, indicates a possibly affected subject.
44
Patient Sex Age Cardiovascular System Skeletal System Ocular
System (Ectopia lentis)
Lung
(Spontaneous pnemothorax)
Skin ADil ADis MVP PCar PExc ASp/H Scol W&T PPlan PAcet JointH FacF
II:14 F 61 + - - - - 1.03 - - - na - - na - -
II:19 M 53 +/Surg - +/Surg na na 1.08 + + + + - - - - -
II:21 M 48 + - - na na 1.03 - + - + - + - + +
III:4 F 43 - - + - + 1.04 + + + + - + - - +
III:6 F 39 + - - - + 1.02 +/Surg + + + + - - + +
III:7 F 37 - + + - + 1.04 + + + + + + - - +
III:8 M 36 + + + + - 1.06 + + + + + - - - +
III:33 M 19 + +/Surg - - - 1.08 - + - + + + - - +
Table 1 - Clinical features of the affected family members.
Legend: ADil, Aortic Dilatation: ADis, Aortic Dissection; Asp/H, Arm span to height ratio; F, Female; FacF, Facial Features; JointH, Joint
Hypermobility; MVP, Mitral Valve Prolapse; na, non available; PAcet, Protusio Acetabulae; PCar, Pectus carinatum; PExc, Pectus excavatum;
PPlan, Pes Planus; Scol, Scoliosis; Surg, Surgery; -, not present; +, present.
45
Higher plasma levels of TIMP-1 among Marfan Syndrome
patients with previous aortic root replacement: a marker of
improved proteolytic balance?
Authors: Ana Lebreiro1, MD; Elisabete Martins1, MD, MSc; Patrícia Lourenço2, MD,
MSc; M. João Martins3, PhD; Paulo Bettencourt2, MD, PhD; M. Júlia Maciel1, MD, PhD;
Cassiano Abreu-Lima1,4, MD, PhD.
1 Cardiology Department, Hospital S. João, Porto
2 Internal Medicine Department, Hospital S. João, Porto
3 Biochemistry Department, University of Porto Medical School, Porto
4 Medicine Department, University of Porto Medical School, Porto
Authors have no conflicts of interest to disclose.
Address for correspondence:
Ana Lebreiro
Hospital de S. João.
Alameda Prof. Hernâni Monteiro. 4200-319 Porto. Portugal.
Fax: +351225503015; Telephone: +351966895567;
e-mail: [email protected]
46
ABSTRACT
Introduction: Marfan Syndrome (MFS) is a connective tissue disorder that affects
multiple organ systems. Cardiovascular system is typically involved, mainly through
aortic dilatation or dissection, the principal cause of death in this population.
Imbalances of the proteolytic cascade involving metalloproteinases (MMPs) and its
inhibitors (TIMPs) have been implicated in aortic aneurysm formation and progression
in Marfan Syndrome (MFS) patients. We aimed to investigate the balance between
MMPs and TIMPs according to the severity of aortic disease and after aortic root
replacement.
Methods: Venous blood samples of 30 MFS patients, all of them fulfilling Ghent
criteria, were analyzed for MMP-2, -3, -9, TIMP-1, -2 and α2-macroglobulin. MMP and
TIMP levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay and α2-
macroglobulin levels were measured by immunonephelometry. All patients underwent
a comprehensive echocardiographic evaluation.
Results: In comparison with non operated patients (n=18), those with past history
of aortic root replacement (n=12) had higher plasma levels of TIMP-1 [mean (SD) –
134.9 (28.5) vs. 108.2 (21.0) ng/mL; p=0.006], and a decreased ratio of MMP-9/TIMP-1
[median (IQR) – 0.04 (0.03 - 0.09) vs. 0.07 (0.05 - 0.1); p=0.03]. No significant
differences were found between the levels of MMPs, TIMPs, α2-macroglobulin or the
ratio MMP/TIMP when comparing patients with and without aortic root dilatation.
Conclusions: Our results suggest that in aortic root replaced patients, a proteolytic
shift towards a more homeostatic pattern occurs. This better TIMP-1 plasma profile
may induce a less catabolic molecular milieu in the aortic wall contributing to disease
stabilization. These findings may open new lines of investigation on the role of MMPs
and TIMPs as biomarkers after aortic surgery in MFS patients.
47
INTRODUCTION
Marfan Syndrome (MFS) is a connective tissue disorder that affects multiple organ
systems. Cardiovascular system is typically involved, mainly through aortic dilatation or
dissection, the principal cause of death in this population.1 It is a rare syndrome
affecting 2-3 cases per 10 000 individuals, and is mainly caused by mutations in the
gene encoding fibrillin-1, an extracellular matrix (ECM) protein.2
ECM is essential both to provide physical support for cells and to act as a pool of
latent growth factors and cytokines. ECM regulates TGFβ activation, and the loss of
fibrilin-1 appears to result in an over-release of TGFβ from the ECM.3 Also, matrix
metalloproteinases (MMPs) can directly activate TGFβ via cleavage of latency-
associated peptide, sequestered within the ECM, and indirectly by releasing latent
TGFβ after ECM proteolysis.4 In both cases, an up-regulation of TGFβ signaling
pathway occurs, contributing to aortic dilatation.
MMPs constitute a large family of enzymes that process and degrade extracellular
substrates. They are grouped in classes, according to their substrates’ specificity.
MMPs transcription and activity is strictly regulated. There are 4 tissue inhibitors of
MMPs (TIMPs) and each TIMP inhibits the active forms of all MMPs.5 TIMP-1 is the
most studied of these inhibitors in the aorta and is produced by fibroblasts and smooth
muscle cells.6 Under normal circumstances, TIMP concentrations in extracellular fluids
and tissues exceed that of MMPs, thereby limiting the proteolytic activity of circulating
MMPs.7 The plasma proteinase inhibitor, α2-macroglobulin, can be regarded as the
major plasma inhibitor of MMPs. It also binds to TGFβ and cytokines, but its role in
MMPs’ regulation is still a matter of debate.5
Imbalances of the proteolytic cascade involving MMPs and TIMPs have been
implicated in aortic aneurysm formation and progression.8-9 Tissue and blood samples
from patients with abdominal aortic aneurysms (AAA) have been analyzed and MMPs
and TIMPs’ expression pattern correlated to aneurysm size and risk of rupture.9 MMPs
48
have also been implicated in the pathogenesis of thoracic aortic aneurysms (TAA) in
MFS patients, based on histological analysis of ascending aortic specimens.10
To the best of our knowledge this is the first human study in MFS patients in which
plasma levels of MMPs and its inhibitors (TIMPs and α2-macroglobulin) have been
simultaneously assessed.
We aimed to investigate the balance between MMP’s and TIMP according to the
severity of aortic disease and after aortic root replacement.
MATERIALS AND METHODS
Based on the research of our hospital’s database, and using an established
diagnosis of Marfan Syndrome as a discriminator, we found 45 adult patients referred
between January 1989 and December 2008.
Patients
Only patients fulfilling Ghent criteria11, were included. Index cases without
genetic/family history needed to fulfill major criteria in 2 different organ systems and
involvement of a third organ system; if there was a positive genetic/family history, 1
major criterion in an organ system and involvement of a second organ system was
required. Patients younger than 18 years old were excluded.
All patients were invited to a medical consultation with a cardiologist and a
rheumatologist. Thirty one met eligibility criteria. Visits occurred between October 2008
and May 2009.
In 30 patients, a fasting venous blood sample was collected between 8:00 and 9:00
a.m. and all patients underwent a comprehensive echocardiographic evaluation.
Written informed consent to participate in the study was provided by all patients
included. The study protocol conforms to the ethical guidelines of the declaration of
Helsinki and the study was approved by the institution’s ethics committee.
49
Echocardiographic data
We used either a Vivid 3 (GE Healthcare) or iE33 (Phiplips) ultrasound scanners.
Left paraesternal, apical, suprasternal and subcostal windows were recorded.
Measurements of aortic root diameter (both at the sinuses of Valsalva and sinotubular
junction) and ascending aorta were made in paraesternal long axis; measurements of
aortic arch were made using suprasternal window and descending aorta was measured
both in suprasternal and subcostal windows. These measurements followed the
recommendations for chamber quantification from the American Society of
Echocardiography in conjunction with European Association of Echocardiography.12
Aortic root was considered dilated when the maximum diameter at the sinuses of
Valsalva, measured by echocardiography, exceeded the upper normal limits for age
and body surface area.13
MMP and TIMP measurements
Venous blood samples for MMPs and TIMPs measurements were collected in
citrated tubes; samples were immediately (within 30 min) centrifuged (4500 r.p.m. for
15 min) and supernatants were removed and stored at -80º, within 2 h. Samples were
analyzed after a mean time of storage of 62.7 ± 12.4 days. MMPs and TIMPs were
measured using a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay
(Biotrak ELISA System; Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) and
according to manufacturer’s instructions. With these kits, MMPs and TIMPs have the
following minimum detection levels: MMP2 - 1.5 ng/mL; MMP3 - 3.75 ng/mL; MMP9 - 4
ng/mL; TIMP1 - 3.13 ng/mL; TIMP2 - 8 ng/mL.
α2-Macroglobulin
Venous blood samples were collected and analyzed within the first 24h, by means
of immunonephelometry on the BN* Systems, using N Antiserum to Human α2-
macroglobulin* (*Simens Healtcare Diagnostics, Marburg, Germany). The
50
manufacturer’s reference interval for healthy adults is 1.3-3.0 g/L. All samples were
processed separately, at our institution’s laboratory.
Statistical analysis
Continuous variables are presented as mean (standard deviation), or median
(interquartile range) if non-normally distributed. Categorical variables are presented as
counts and proportions.
Comparisons between groups of patients were made by use of independent
samples t-test for continuous variables that were normally distributed and Mann-
Whitney-U test for continuous variables with a skewed distribution.
All the analyses were conducted using SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL,
USA). P value <0.05 was considered to be statistically significant.
RESULTS
Epidemiological and clinical characteristics of patients are shown in Table 1. There
was an elevated number of familial cases (46.7%), with a very high proportion of cases
fulfilling cardiovascular system major criteria (86.7%). Fourteen patients had aortic root
dilatation [mean (SD) 24.2 (3.1) mm/m2] and seven of these had concomitant mitral
valve prolapse. Forty-three percent of the patients were under ß-blocker and 35.7%
were on angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACEi) or angiotensin receptor
blockers (ARB) therapy.
Twelve patients had history of previous cardiac surgery with aortic root
replacement. Two thirds of these were male aged 32.7 (13.4) years at the time of
surgery. In three cases, surgery was performed in an emergent basis due to type A
acute aortic dissection.
51
Eighteen patients had no past history of aortic root replacement. From these, 14
had aortic root dilatation and 4 had normal aortic diameters, with mean (SD) aortic root
diameters 24.2 (3.1) vs. 18.4 (2.1) mm/m2, respectively.
MMP and TIMP levels
We found no statistical significant differences between the levels of MMPs, α2-
macroglobulin, TIMPs or the ratio MMP/TIMP when comparing patients with and
without aortic root dilatation (Table 2).
In comparison with non operated patients, those with past history of aortic root
replacement had higher plasma levels of TIMP-1 and a decreased ratio of MMP-
9/TIMP-1. Figure 1 shows the distribution of TIMP-1 levels among operated and non-
operated patients. No significant differences were found in MMP-9, or other MMPs,
levels (Table 3).
DISCUSSION
In our MFS population, patients submitted to aortic root replacement had
significantly higher levels of TIMP-1 and lower MMP-9/TIMP-1 ratio, suggesting that the
procedure is associated with reversal of ECM proteolysis.
In aortic aneurysms, an imbalance between MMPs and TIMPs is thought to shift
the tightly controlled equilibrium towards matrix degradation.14 Altered MMP/TIMP
homeostasis has been reported, not only in aneurismal tissue, but also in non-
aneurismal aortic fragments of patients with AAA.15 This finding is consistent with the
concept of aortic aneurismal disease as a systemic process.16 Other studies carried out
in patients with AAA, have also evaluated plasma levels of MMPs and TIMPs and
found higher MMP-9 levels in these patients when compared to patients with occlusive
arterial disease and healthy subjects, and the results were even stronger in patients
with multiple aneurysms. Very interestingly, in this investigation authors found that
52
MMP-9 production in aneurismal tissue paralleled plasma MMP-9 levels in individual
patients, which suggests an aortic origin of MMPs in plasma.17
Recently, several studies observed significant decreases in plasma levels of MMP-
3 and -9 after successful open and endovascular repair of abdominal and descending
TAA.14, 18-19
In MFS, MMPs activation during TAA formation is probably multifactorial, involving
genetic predisposition, inflammatory cascade activation, as well as hemodynamic
factors.20 Increased amounts of MMP-2 and -9 have been demonstrated in the aortic
wall of patients and mouse models of MFS, but these results were not consistent
across studies. 10, 21-23 These controversial results could be due to the limited number of
patients, the wide age range (including simultaneously pediatric patients and older
adults) and the advanced stage of cardiovascular disease present in most of these
patients.22 On the other hand, histological analysis of specimens of aortic aneurysms
may reflect MMP and TIMP profiles of a specific stage in aneurysm progression.
Regional aortic heterogeneity of MMP and TIMP expression is also recognized as a
possible confounding element.24 Our approach using plasma levels of MMPs and
TIMPs could overcome the referred limitation, although there are conflicting results in
the interpretation of these parameters as reflecting true proteolytic aortic ECM
activity.25
Current longer life expectancy of MFS patients is mainly attributed to prophylactic
aortic root replacement.26 Our results suggest that in aortic root replaced patients
TIMP-1 plasma profiles are more favorable. This better profile may induce a less
catabolic molecular milieu in the aortic wall contributing to disease stabilization.
The importance of inhibitor expression in the pathogenesis of TAAs has been
clearly demonstrated in studies using TIMP-1 deficient animal models that showed
significant acceleration of aneurysm expansion.6
Our results give insight on mechanisms, beyond hemodynamic benefits, for the
known prognostic improvement after aortic root replacement in Marfan patients.
53
Finally, some limitations of our study must be recognized. First, the small sample
size and the very high proportion of cardiovascular involvement in our MFS cohort may
have precluded the ability to detect differences in MMP and TIMP profiles between
patients with and without aortic dilatation. Second, an elevated proportion of patients
were under medications that interfere with MMPs levels 27-28 and the confounding effect
of such interference is difficult to predict.
CONCLUSIONS
Aortic root dilation in MFS patients does not seem to be paralleled by differences in
MMPs and TIMPs profiles. Our results suggest that a proteolytic shift towards a more
homeostatic pattern occurs after aortic root replacement.
Our results give insight on the mechanism of aortic replacement benefits and open
lines of investigation on the role of MMP’s and TIMP’s as biomarkers in aortic surgery
in MFS patients.
Acknowledgments
This study was supported by a grant from the Research Department of Hospital S.
João, Porto. We thank Dra Conceição Gonçalves for the careful handling of laboratory
measurements.
54
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56
FIGURES
Figure 1 - Box plot depicting tissue inhibitor of metalloproteinases -1 (TIMP-1)
distribution in patients with and without history of aortic root replacement. TIMP-
1 levels were significantly higher in operated patients (p = 0.006)
57
TABLES
Patient demographics N = 30 (%)
Age, years (mean ± SD) 37.7 ± 11.7
Male 16 (53.3%)
Mean systolic arterial pressure (mmHg) 116.2± 15.7
Mean heart rate (bpm) 64.4 ± 9.5
Cardiovascular risk factors
Diabetes Mellitus
Hypertension
Hyperlipidemia
3 (10)
3 (10)
8 (26.7)
Cardiovascular system (major criteria)
Aortic root dilatation 14 (46.7)
Aortic root replacement 12 (40)
Aortic dissection 6 (20)
Medication
ß Blocker
ACEi
ARB
Statin
20 (66.7)
7 (23.3)
6 (20)
7 (23.3)
Table 1 - Demographic data and patients’ characteristics.
Legend: ACEi, angiotensin-converting enzyme inhibitos, ARB, angiotensin
receptor bocker.
58
With aortic root dilatation
(n= 14)
Without aortic root
dilatation (n= 4)
p-
value
Α2-macroglobulina (mg/dL),
mean ± SD
172.7 ± 48.6 184.5 ± 45.2 0.67
MMP2 (ng/mL), mean ± SD 1072.9 ± 193.5 1012.5 ± 150.4 0.57
MMP3 (ng/mL), mean ± SD 37.8 ± 12.7 28.6 ± 14.7 0.23
MMP9 (ng/mL), mean ± SD 9.2 ± 5.3 17.6 ± 17.7 0.12
TIPM1 (ng/mL), mean ± SD 110.6 ± 17.0 99.8 ± 33.5 0.38
TIMP2 (ng/mL), mean ± SD 108.0 ± 25.4 101.2 ± 4.8 0.61
MMP2/TIMP2, mean ± SD 10.1 ± 1.8 9.9 ± 1.1 0.88
MMP9/TIMP1, mean ± SD 0.07 (0.05 – 0.10) 0.09 (0.06 – 0.59) 0.40
Table 2 - α2-Macroglobulin, MMPs and TIMPs profiles in patients with and
without aortic root dilatation
Legend: MMP, matrix metalloproteinase; TIMP, tissue inhibitor of
metalloproteinase; SD, standard deviation.
59
With aortic root
replacement (n= 12)
Without aortic root
replacement (n= 18)
p-
value
α 2-macroglobulina (mg/dL),
mean ± SD
175,2 ± 42,0 175,4 ± 46,8 0,99
MMP2 (ng/mL), mean ± SD 1038.5 ± 188.5 1059.5 ± 182.4 0.76
MMP3 (ng/mL), mean ± SD 38.7 ± 37.0 35.8 ± 13.3 0.76
MMP9 (ng/mL), median (IQR) 6.2 (5.1- 10.2) 8.1 (5.3 – 12.1) 0.32
TIPM1 (ng/mL), mean ± SD 134.9 ± 28.5 108.2 ± 21.0 0,006
TIMP2 (ng/mL), mean ± SD 103.6 ± 8.4 106.5 ± 22.5 0.67
MMP2/TIMP2, mean ± SD 10.0 ± 1.6 10.1 ± 1.7 0,90
MMP9/TIMP1, median (IQR) 0.04 (0.03 – 0.09) 0.07 (0.05 – 0.1) 0.03
Table 3 - α2-Macroglobulin, MMPs and TIMPs profiles in patients with and
without aortic root replacement
Legend: IQR, interquartile range; MMP, matrix metalloproteinase; TIMP,
tissue inhibitor of metalloproteinase; SD, standard deviation.
60
VII. DISCUSSÃO
Na escolha da SM como base do trabalho desenvolvido esteve o facto de, apesar de
se tratar de uma doença rara, esta se associar a uma elevada taxa de mortalidade em
idades jovens (terceira década de vida) na ausência de tratamento cirúrgico profilático,
com substituição da raiz da aorta.66
A este contexto, aliou-se o enorme desenvolvimento científico que tem surgido à
volta do tema e que tem conduzido à descoberta de novos mecanismos
fisiopatológicos30, com potenciais implicações terapêuticas futuras, nomeadamente ao
nível da complicação mais temida na SM, a ruptura ou dissecção da aorta torácica. 51, 55-
56 Estes dados poderão, em última análise, vir também a contribuir para um melhor
conhecimento de outros tipos de doença da aorta, mais prevalentes na população geral e
que habitualmente se caracterizam pelo risco de morte prematura ou pela importante
morbilidade cirúrgica.
A decisão de proceder à pesquisa mutacional prendeu-se, fundamentalmente, com
duas questões. A primeira relacionou-se com a intenção de estudar, numa população de
doentes que cumpriam os critérios de Ghent, a prevalência e o tipo de mutações no gene
FBN1 e possibilitar aos familiares destes doentes o rastreio genético; por outro lado,
apesar da publicação de um elevado número de mutações, não se conhecem muitos
dados (pelo menos publicados) referentes a casos portugueses de SM, e com este
trabalho pretendemos contribuir para a expansão desse conhecimento.
A enorme variabilidade genotípica e fenotípica (inter- e intra-familiar) da SM e a
ausência de correlações genótipo-fenótipo têm sido consecutivamente descritas em
diversos trabalhos e têm contribuído para uma maior dificuldade na identificação de
indivíduos em risco de complicações cardiovasculares.17, 23, 67
61
Com base no conhecimento do processo fisiopatológico subjacente à formação de
aneurismas aórticos, existe a possibilidade de que alguns biomarcadores de proteólise
da matriz extracelular possam, no futuro, vir a ser utilizados na prática clínica. A
utilização de biomarcadores séricos na monitorização da resposta terapêutica ou como
indicadores de prognóstico na patologia aórtica, pelas suas inerentes potencialidades
(rapidez de execução e interpretação, menores custos e possibilidade de utilização num
maior número de centros) tem sido intensamente investigada nos últimos anos.
O envolvimento da cascata proteolítica na SM, nomeadamente através de uma
excessiva activação de MMPs, foi demonstrado em estudos baseados na análise
histológica de fragmentos de aneurismas da raiz da aorta, conduzidos em modelos
animais e em doentes com SM.9, 34-35 Relativamente ao doseamento plasmático destes
biomarcadores, poucos estudos foram publicados até à data e a grande maioria incluiu
doentes com aneurismas da aorta abdominal ou torácica, não associados a SM.38, 40, 68 O
único trabalho onde foi efectuado o doseamento plasmático de MMPs em doentes com
SM, apresentado por Ahimastos e colaboradores52, 61, incluiu dezassete doentes e teve
como objectivo comparar a resposta clínica (através da medição do diâmetro da raiz da
aorta) após vinte e quatro semanas de tratamento com perindopril, com a evolução
analítica, através do doseamento plasmático de MMPs. Os autores verificaram que após
o tratamento com este fármaco havia uma ligeira diminuição do diâmetro aórtico que se
acompanhava da redução dos níveis de MMP-2 e MMP-3.
A potencialidade clínica destes biomarcadores, aliada à escassez de estudos
desenvolvidos em doentes com SM, levou-nos a proceder à quantificação de alguns
destes marcadores de proteólise na nossa população de doentes
Tendo em conta que este trabalho decorreu num hospital de referenciação, com
acesso à cirurgia torácica, a elevadíssima prevalência de critérios cardiovasculares
62
major na nossa população poderá traduzir um viés de selecção, já que doentes com
manifestações menos graves de SM são habitualmente seguidos em centros de cuidados
secundários.
Ainda relativamente aos critérios de Ghent, não foi possível realizar ressonância
magnética para avaliação de existência de ectasia da dura mater, e a avaliação
oftalmológica incluiu apenas dois terços dos doentes. Contudo, dada a elevada
prevalência de história familiar/genética positiva neste grupo, doentes que
apresentassem um critério major num sistema e o envolvimento de um segundo sistema
cumpriam já os critérios de Ghent, pelo que a ausência de avaliação dos critérios acima
mencionados não influenciaram o diagnóstico de SM na nossa população.
• Diagnóstico molecular
Neste trabalho foi possível a caracterização molecular de nove casos índex e o
rastreio genético de dezanove familiares. Sete novas mutações, e uma recorrente, foram
encontradas nos nove casos índex estudados; estas mutações encontraram-se dispersas
ao longo do gene; três envolviam unidades TGFß-like, quatro envolviam unidades
cbEGF-like e uma envolvia a região terminal COOH. Em um dos casos índex, embora
cumprindo critérios de Ghent, não foi encontrada nenhuma mutação no gene FBN1.
Apenas uma das mutações encontradas tinha sido publicada previamente
(Cys2111Arg)15, o que está de acordo com os conhecimentos actuais de que a maioria
das mutações na SM é exclusiva de um indivíduo ou família. Apesar do tamanho
reduzido da amostra, também a taxa de detecção de mutações na nossa população (90%
dos casos) se encontra dentro dos valores referidos na literatura.18
Por outro lado, a distribuição das mutações encontradas em cada categoria não
esteve de acordo com as percentagens previamente publicadas.22-23 De facto verificámos
63
quase uma inversão desta relação, encontrando mutações missense em 37,5% dos casos
e mutações conduzindo à formação de CTP em 62,5% dos casos. Perante uma amostra
tão reduzida, consideramos que estes resultados foram provavelmente fruto do acaso;
contudo, o estudo molecular dos restantes doentes observados em consulta poderá vir a
contribuir para o esclarecimento desta questão.
Também não completamente de acordo com o previamente descrito, está a presença
de dissecção e dilatação aórtica com necessidade de intervenção cirúrgica em dois dos
três doentes com uma mutação no exão 65, ao contrário do que era esperado, dada a
associação destas mutações a manifestações cardiovasculares mais tardias e de menor
gravidade.17 Este achado poderá no entanto, reflectir apenas a grande variabilidade
fenotípica dos doentes com SM e a escassa correlação genótipo-fenótipo nesta
síndrome.
Oito dos nove doentes, portadores de mutações conduzindo à formação de CTP, que
foram observados por um oftalmologista, não apresentavam ectopia lentis, e estes dados
encontram-se de acordo com os dados previamente publicados.22 Por outro lado, apenas
dois doentes eram portadores de mutações com substituição de resíduos de cisteína, pelo
que não nos foi possível aferir sobre a associação desta mutação e a prevalência de
ectopia lentis.
O tipo de envolvimento do sistema musculoesquelético foi também muito díspar, e
independente do tipo de mutação presente. A elevada prevalência de dilatação da raiz da
aorta e/ou dissecção aórtica na nossa população (ausentes em apenas dois dos vinte e
um portadores de mutações no gene FBN1) não permite estabelecer nenhum padrão de
associação genótipo-fenótipo a este nível.
Não encontrámos nenhum portador assintomático, isto é, portador de mutações no
gene FBN1 sem manifestações clínicas, mas o rastreio familiar permitiu a identificação
64
de indivíduos que apresentavam alterações morfológicas ligeiras e insuficientes para o
diagnóstico clínico inequívoco, possibilitando assim o seu adequado acompanhamento e
aconselhamento genético.
O estudo molecular permitiu ainda estabelecer um diagnóstico de certeza, de SM,
numa família com apresentação clínica atípica, onde a doença se manifestou
inicialmente num indivíduo através do envolvimento arterial periférico e noutros dois
casos através da dissecção da aorta torácica descendente em idade jovens e com
diâmetros aórticos menores do que o esperado em tal complicação. Por outro lado, a
exclusão de SM em oito dos vinte familiares rastreados trouxe a vantagem destes
indivíduos poderem ser tranquilizados, dispensando avaliações clínicas e imagiológicas
periódicas.
A nossa pequena amostra ilustra a já conhecida variabilidade de apresentação
clínica da SM, quanto à idade de início, tipo e gravidade de envolvimento orgânico.
Embora a penetrância das mutações do gene FBN1 seja completa, a caracterização
genotípica através da identificação de portadores sem manifestações clínicas óbvias de
SM, numa fase mais precoce da doença, acarreta importantes implicações prognósticas.
• Doseamento plasmático de biomarcadores de desequilíbrio proteólitico da
matriz extracelular
Alguns estudos em doentes com SM, documentaram níveis aumentados de MMP-2
e -9 em amostras histológicas de aneurismas da aorta, mas os resultados não foram
consensuais, o que pode ser explicado pelo uso de pequenas amostras de doentes, com
grande variabilidade de idades (incluindo simultaneamente doentes com idade
pediátrica e adultos idosos) e doença cardiovascular concomitante.34-35, 69 Por outro lado,
65
as amostras histológicas reflectem apenas alterações locais, provavelmente
heterogéneas, e de uma determinada fase de progressão da doença.69-70
Com a realização de doseamentos plasmáticos das MMPs e TIMPs como
marcadores de actividade proteolítica aórtica em doentes com SM, tentámos ultrapassar
esta limitação. O envolvimento destas moléculas na patofisiologia dos aneurismas
aórticos nos doentes com SM poderá constituir a oportunidade terapêutica para a
introdução de novas moléculas e/ou monitorização do tratamento nestes doentes.
Na nossa amostra de doentes com SM previamente submetidos a cirurgia de
substituição da raiz da aorta, verificámos que, comparativamente aos indivíduos não
operados, estes apresentavam níveis mais elevados de TIMP-1 e relação MMP-9/TIMP-
1 mais baixa. Já referimos que a cirurgia de substituição aórtica é a principal
responsável pelo aumento da sobrevida nestes doentes.43 Neste trabalho demonstrámos
que, após a cirurgia, estes doentes apresentam perfis plasmáticos de TIMP-1 mais
favoráveis o que, adicionalmente aos factores hemodinâmicos, poderá induzir um
ambiente molecular menos propício ao catabolismo e assim contribuir para a
estabilização da doença e para o melhor prognóstico observado nos doentes com SM
submetidos a cirurgia de substituição da raiz da aorta. Face ao número reduzido de
doentes submetidos a cirurgia de substituição aórtica, não foi possível investigar a
existência de uma correlação entre os níveis de TIMP-1 e o tempo decorrido desde a
cirurgia, bem como entre os níveis de TIMP-1 e a evolução da patologia aórtica após a
intervenção. Consideramos que tal investigação poderá trazer resultados com potenciais
aplicações clínicas no seguimento destes doentes.
No grupo de doentes não submetido a cirurgia aórtica, não encontrámos diferenças
estatisticamente significativas nos níveis de MMPs e seus inibidores, entre os doentes
com e sem dilatação aórtica. Apesar de não haver estudos semelhantes em doentes com
66
SM para comparação destes resultados, tendo por base os resultados dos estudos acima
descritos, consideramos que o facto de se tratar de uma amostra de pequenas dimensões
e com uma elevada percentagem de doentes a cumprirem critérios major do sistema
cardiovascular pode ter limitado a capacidade para encontrar diferenças nos níveis
plasmáticos de MMPs e TIMPs entre doentes com e sem dilatação aórtica.
Por outro lado, o doseamento plasmático das MMPs e TIMPs poderá não
representar a verdadeira actividade proteolítica da MEC aórtica, contudo, a
demonstração prévia de que os níveis plasmáticos de MMP-9 acompanhavam a sua
produção na parede do aneurisma aórtico68, e a constatação de que estes níveis
diminuem após a exclusão cirúrgica ou endovascular de aneurismas aórticos torácicos e
abdominais38-40, sustentam o seu uso como potenciais biomarcadores na doença
aneurismática da aorta.
Realça-se ainda que um grande número de doentes estava medicado com
bloqueadores ß e/ou iECA ou ARA, moléculas que se sabe interferirem com os
doseamentos das MMPs e TIMPs, embora se desconheça o verdadeiro impacto de cada
uma delas nestes valores.71-72 No sentido de tentar clarificar esta interferência
comparámos o perfil plasmático de MMPs e TIMPs entre doentes medicados ou não
com bloqueadores ß, e entre doentes medicados ou não com iECA ou ARA e não
encontrámos diferenças entre os grupos. Não podemos contudo excluir que a sua
utilização não tenha influenciado os doseamentos plasmáticos das MMPs e TIMPs, e
não tenha de alguma forma contribuído para a ausência de diferenças entre grupos.
Em suma, este estudo sugere haver alterações do equilíbrio proteolítico após a
substituição da raiz da aorta em doentes com SM, conduzindo a uma relação mais
favorável, apontando para a existência de mecanismos moleculares ainda não
explorados que, adicionalmente aos benefícios hemodinâmicos já conhecidos, poderão
67
contribuir para o melhor prognóstico após a substituição aórtica nestes doentes. Permite
ainda abrir novas portas à investigação do papel das MMPs e TIMPs como potenciais
biomarcadores no seguimento pós-operatório dos doentes com SM.
68
VIII. CONCLUSÕES
Com este trabalho e realçando a vertente clínica dos resultados, consideramos
pertinente realçar os seguintes aspectos:
• A importância da avaliação por uma equipa multidisciplinar, para um
diagnóstico precoce e acompanhamento adequado de doentes com SM,
constituída por profissionais experientes e receptivos à observação de casos com
manifestações mais frustres ou atípicas;
• A mais-valia do diagnóstico molecular em doentes com SM, no sentido de poder
acrescentar novos dados sobre correlações genótipo-fenótipo, nomeadamente
em patologias da aorta que não se enquadrem totalmente nos critérios de Marfan
ou síndromes relacionadas, esclarecendo diagnósticos etiológicos;
• O papel primordial do diagnóstico molecular no rastreio familiar,
aconselhamento genético, diagnóstico pré-natal e pré-implantação de ovócitos.58
Apesar de uma elevadíssima penetrância das mutações do gene FBN1, uma vez
que existe uma grande variabilidade fenotípica na SM, um diagnóstico pré-natal
de SM coloca frequentemente os pais perante um dilema ético e emocional. O
diagnóstico pré-implantação surge como uma alternativa a estes casos,
permitindo evitar decisões futuras sobre uma possível interrupção da gravidez.
• Os avanços no conhecimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na
SM permitiram a exploração de novos biomarcadores, que poderão vir a ser
integrados na prática clínica, num horizonte próximo, sobretudo ao nível da
monitorização da resposta terapêutica. Mais estudos nesta área são contudo
necessários antes de se poderem tirar mais conclusões.
69
• Aguardam-se os resultados de estudos com antagonistas do TGFß (neste
momento a decorrer com o losartan) que, a serem favoráveis, vão
necessariamente criar a necessidade de identificar o mais precocemente possível
os indivíduos em risco, nomeadamente os portadores assintomáticos.
Fontes de Financiamento
O trabalho apresentado foi financiado por uma Bolsa do Centro de Investigação do
Hospital de S. João, Porto, Portugal.
70
IX. RESUMO
A Síndrome de Marfan (MS) é uma doença do tecido conjuntivo, com hereditariedade
autossómica dominante, que é causada essencialmente por mutações no gene FBN1. O seu
diagnóstico baseia-se em critérios clínicos (critérios de Ghent) e apresenta uma grande
variabilidade fenotípica. A dissecção ou ruptura aórtica e a insuficiência cardíaca, são a
principal causa de morte e ocorrem em mais de 90% dos doentes não tratados. Um
reconhecimento precoce dos indivíduos em risco é de extrema importância dada a
disponibilidade de tratamentos médicos e cirúrgicos que aumentam significativamente a sua
esperança média de vida. Neste contexto, os estudos moleculares podem contribuir para
estabelecer um diagnóstico etiológico em doentes com apresentações clínicas atípicas ou
frustres, bem como para instaurar medidas preventivas e aconselhamento genético aos
indivíduos afectados. Por outro lado permite ainda tranquilizar os familiares não portadores de
mutações no gene FBN1.
Com este trabalho pretendemos expandir o número de mutações conhecidas, apresentando
dados de uma coorte portuguesa de doentes com SM e realçando a sua variabilidade fenotípica
inter- e intra-familiar. O teste genético foi possível em nove casos índex e dezanove familiares,
e permitiu-nos encontrar uma mutação recorrente e sete novas mutações no gene FBN1.
Os nossos resultados poderão dar um pequeno contributo para aumentar o número de
mutações descritas e permitir uma subsequente análise estatística com um maior número de
dados, obtidos em todo o mundo.
Adicionalmente, tendo em conta que desequilíbrios na cascata proteolítica envolvendo as
metaloproteinases (MMPs) e os seus inibidores (TIMPs) têm sido implicados na génese e
progressão dos aneurismas aórticos na SM, investigámos ainda a relação entre MMPs e TIMPs
de acordo com a gravidade da doença aórtica e após a cirurgia de substituição da raiz da aorta
neste grupo de doentes. Encontrámos níveis plasmáticos de TIMP-1 mais elevados e uma
diminuição da relação MMP-9/TIMP-1 em doentes previamente submetidos a cirurgia de
substituição da raiz da aorta, comparativamente a doentes não operados. Não encontrámos
diferenças estatisticamente significativas nos níveis de MMPs, TIMPs, α2-macroglobulina ou na
relação MMP/TIMP entre doentes com e sem dilatação aórtica. Estes resultados poderão estar
relacionados, pelo menos em parte, com o reduzido tamanho amostral, com a elevada
prevalência de doentes com dilatação aórtica e com o uso generalizado de medicações que
poderão interferir com o doseamento de MMPs, nesta população.
O perfil plasmático de TIMP-1 parece ser mais favorável nos doentes submetidos a cirurgia
de substituição aórtica e poderá estar associado a regressão da proteólise da matriz extra-celular.
Estes achados abrem novas linhas de investigação sobre o papel das MMPs e TIMPs como
potenciais biomarcadores após a cirurgia aórtica em doentes com SM.
71
X. SUMMARY
Marfan Syndrome (MFS) is a connective tissue disorder, with autossomal dominant
inheritance, caused mainly by FBN1 mutations. Diagnosis usually relies on clinical criteria
(Ghent criteria), but phenotypic presentation varies widely among affected subjects. Aortic
dissection or rupture, are the cause of death in over 90% of untreated patients. Early recognition
of at risk individuals is important in view of the available medical and surgical treatments that
significantly improve life expectancy. Molecular studies may provide an etiologic diagnosis in
patients with milder or atypical clinical presentations and contribute to preventive management
and genetic counseling of carriers and reassurance of unaffected individuals.
With this work we aimed to expand the number of known mutations by providing data from
a portuguese cohort of MFS patients, highlighting both inter- and intra-familial phenotypic
variability. Genetic testing was possible in nine probands and nineteen relatives and we found
one recurrent and seven new FBN1 mutations in this group of patients.
Our results may give a small contribute to increase the number of mutations available for a
subsequent larger statistical analysis, including worldwide data.
Moreover, since imbalances of the proteolytic cascade involving metalloproteinases
(MMPs) and its inhibitors (TIMPs) have been implicated in aortic aneurysm formation and
progression in MFS, we also investigated the balance between MMPs and TIMPs according to
the severity of aortic disease and after aortic root replacement in this group of patients.
We found higher plasma levels of TIMP-1 and a decreased ratio of MMP-9/TIMP-1 in
patients with previous history of aortic root replacement in comparison with non operated
patients. No significant differences were found between the levels of MMPs, TIMPs, α2-
macroglobulin or the ratio MMP/TIMP when comparing patients with and without aortic root
dilatation, which may be attributable, at least in part, to the small number of patients included,
the elevated percentage of patients fulfilling major cardiovascular system criteria and the
widespread use of medications that may interfere with MMPs levels.
TIMP-1 plasma profiles in aortic root replaced patients seem more favorable and may be
associated with reversal of extracellular matrix proteolysis. These findings may open new lines
of investigation on the role of MMPs and TIMPs as biomarkers after aortic surgery in MFS
patients.
72
XI. REFERÊNCIAS
ENDEREÇOS DA INTERNET UTILIZADOS
UMD database, http://www.umd.be/FBN1/
Ensembl database, http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Sequence?g=ENSG00000166147
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