Nuclei Watershed Separation Objetivo: separar núcleos muito próximos em uma mesma imagem. Obs: o...
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Nuclei Watershed Separation
Objetivo: separar núcleos muito próximos em uma mesma imagem.
Obs: o link http://fiji.sc/Nuclei_Watershed_Separation fornece a imagem das células caso alguém queira
repetir os passos.
Antônio Augusto Rocha
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Abra a imagem apenas arrastando-a até a barra do Fiji.
A imagem tem que estar em 8 bits.
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Aplique o filtro “Gaussian Blur”
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Use 3.00 para o Radius (esse valor já é suficiente para que as bordas fiquem lisas, mas vocês podem tentar valores menores ou maiores dependendo do critério.
Dê um OK.
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A imagem ficará mais “blur”, ou seja, borrada.
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Use o “threshold” para mostra ao programa o que é “background” e o que é “forground”.
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Nesta janela, você deverá ajustar da melhor maneira para deixar o fundo BRANCO e o objetos a serem separados e contados PRETOS. Isso é feito clicando no botão “Dark background”. Em seguida click em “Apply”.
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Agora é a hora de separar os núcleos que estão muito próximos. Aplique o plugin “Watershed”.
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Linhas claras irão aparecer separando aqueles núcleos que na imagem original estavam muito próximos.
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Por fim, proceda da maneira que for mais útil para você. Neste exemplo, os núcleos foram separados para em seguida serem contados.
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Como discutido em aula, essa janela serve para estabelecer os critérios de inclusão do que vai ser contado (tamanho e circularidade).
Uma dica: não se esqueçam de DESMARCAR a opção “Exclude on edges”, pois assim o programa pode incluir objetos que ficaram fora da contagem por estarem em planos diferentes.
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Várias janelinhas irão aparecer. Janela 1- “Summary”: dá um resultado geral de todas as contagens. Janela 2- “Results”: dá os resultados individuais de cada objeto contado. Janela 3- “ROI manager”: aqui, você pode analisar individualmente cada objeto usando outros critérios, como volume, dimensão, etc..