Introdução à Proteômica: técnicas e aplicações · • The analysis • involves the...
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Leonardo C. Alves Centro de Bio. Mol. Eng. Genética Pós graduação Gen. Bio. Molecular - UNICAMP
Introdução à Proteômica: técnicas e aplicações
1 gene
>1 mRNA “splicing”
edição
>>1 proteína modificações
pós-tradução
>>>1 função
Hoje
1 gene
1 mRNA
1 proteína
1 função
Dogma Central da Biologia Molecular
Transcrição
Tradução
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Genômica Funcional
Estudo da regulação dos genes, suas funções bioquímicas e fisiológicas, e interação entre genes
associados a diferentes processos biólógicos
! Transcriptoma: soma de todos os transcritos (mRNAs)
! Proteoma: soma de todas as proteínas
! Metaboloma: soma de todos os metabólitos
! Genoma: soma de todos os genes de um organismo
Genoma Sistemas complexos
Proteoma
Separação proteínas Transcriptoma
Biologia estrutural
Diferenças de expressão entre células do mesmo
tecido
Combinar partes para interpretar o sistema
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Vogel e Marcotte 2012
Correlação mRNA—proteína
40%
Eventos pós-transcricionais são
importantes
Relação muda de acordo com posição no tecido
Proteína-mRNA Tende para o lado das
proteínas (glicólise) Tende para lado dos
mRNAs (fotoss)
Proteína-mRNA Tende para o lado das
proteínas (fotoss) Tende para o lado dos
mRNAs (glicólise)
Ponnala et al. 2014 Plant J.
Proteômica
Em 1996
“Caracterização em larga escala do conjunto de proteínas expressas
(proteoma) em uma célula ou tecido”
WILKINS et al., 1996
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Proteômica: aplicações gerais - Identificação de proteínas presentes no proteoma
- Análise de expressão diferencial temporal e espacial de proteínas
- Mapas protéicos em diferentes condições - padrões
- Caracterização de modificações pós-traducionais: fosfo - Proteômica (biologia) estrutural raio X: selecionar alvos
http://world-2dpage.expasy.org/swiss-2dpage/viewer
Genes
Transcritos
Proteínas
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Proteômica de Plantas
Molassiotis et al. (2013) Proteomics
Proteômica de Plantas
Desenvolv tecido
Sensor de Ca2+
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• Atenção recente: qualidade $$
Proteômica de Plantas: Frutos
Ambiente Controle genético
Bioquímica Fisiologia Expressão proteínas
Mudanças temporais
Carboidratos e lignificação
Expansão/divisão celular
Energia
Resposta a stress
oxidativo
Resposta a patógenos
Proteômica de Plantas: Frutos
• Desenvolvimento do pêssego Lignificação x sabor adocicado Melhoramento poderia favorecer acúmulo de açúcares ao invés de lignificação.
Síntese de carboidratos
Lignificação
Hu et al. (2011)
Piruvato desidrogenase
Glicólise, TCA
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Proteômica de Plantas: Frutos
Firmeza da polpa: $$ SAM sintase receptor de etileno
Polpa firme
Marondedze e Thomas (2012) Appl. Biochem. Biotecnol.
Frio Proteção contra defeitos
Calcineurina B sinaliza LT stress
Yun et al (2012) J. Exp. Bot.
LT = stress Inibição de proteínas glicólise e Krebs
Sanchez-Bel et al (2012) J. Prot.
Proteômica em termos práticos: eletroforese 2D
• Proteômica • The analysis • involves the systematic separation, identification, • and quantification of many proteins simultaneously • from a single sample. Two-dimensional • electrophoresis is used in this technique • due to its unparalleled ability to separate thousands • of proteins simultaneously. Two-dimensional • electrophoresis is also unique in its ability • to detect post- and co-translational modifications, • which cannot be predicted from the • genome sequence. Applications of 2-D electrophoresis • include proteome analysis, cell differentiation, • detection of disease markers, monitoring • therapies, drug discovery, cancer research, • purity checks, and microscale protein • purification. New mass spectrometry techniques • have been developed that allow rapid • identification and characterization of very • small quantities of peptides and proteins extracted • from single 2-D spots.
2-D
- Separa >1500 spots
- Boa em detectar MPTs
- Detectar marcadores de doenças
-Purificar proteínas
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Eletroforese 2D: baseada em 2 parâmetros – Separação e visualização das proteínas – Separação por carga e massa
SDS-PAGE
Expressão diferencial
Eletroforese 2D: maior resolução
1D + -
pH 4 pH 7
Coffea arabica fruto
Peso m
olecular
2D
97 Kda
66 Kda
30 Kda
20 Kda
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Estes processos devem atingir os seguintes objetivos:
-Quebrar interações macromoleculares incluindo todas as interações não covalentes e as pontes dissulfeto -Prevenir modificações nas proteínas -Manter as proteínas em solução durante a 2D-PAGE
Redução DTT
Alquilação IAM
1ª Dimensão -Alto poder de resolução e possibilidade de determinação do ponto isoelétrico -Proteínas são anfotéricas: + / - / 0
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Voltagens altas para garantir o posicionamento das proteínas (7000 V!!)
Corrente baixa 1mA – 10mA
Ampholytes: o gradiente de pH é formado sob ação de um campo elétrico.
Tamponam a região perto do PI
Gradiente de pH é essencial
- Acrilamida com radicais tamponantes “Immobilines”
CH = CH–C–NH–R2O
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Faixas de pH e resolução
Várias!
2ª Dimensão
• Transição da 1D para a 2D: mudança nos princípios e condições eletroforéticas
• Equilíbrio com SDS, IOD e DTT " desnatura, inibe agregação e mantém estado reduzido
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Eletroforese usual
2ª Dimensão
SDS-PAGE:
- Horizontal - SDS desnatura as proteínas, mascarando-as com carga negativa. - Separação baseada no tamanho.
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Coloração
DIGE – Differential Gel Electroforesis
-Permite correr duas amostras no mesmo gel
-Alta resolução
Alíquotas 10x menores Evita variação por problemas na eletroforese
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ImageMaster 2D Platinum PDQuest Progenesis Decodon CAROS!!!! IMaster R$34 mil Versões free sem algumas funções Melanie Viewer 7.0
Detecção e Análise das Imagens
Detecção e Análise das Imagens
Detecção de spots
Match de imagens
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Detecção e Análise das Imagens
Expressão diferencial = %Vol
1124
1130
Digestão com tripsina
-Excisão dos spots de interesse
-Digestão com tripsina
Queratina
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Espectrometria de Massas
Matrix Assisted Laser Dessorption/Ionization Time
Of Flight
Liquid Chromatography
fentomol a picomol
MALDI-TOF-MS Nobel Química 2002 Koichi Tanaka
ESI-LC-MS
Arte de medir a relação massa-carga dos íons
Espectrômetro de massas: esquema básico
premierbiosoft.com
Placa com amostras
Coluna-HPLC
MALDI (amostras fase
sólida)
Electrospray (ams em solução)
TOF
Quadrupolo
Ion trap
Ion
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Espectrometria de Massas MALDI-TOF
MALDI
TOF
http://www.shimadzu.com.br/analitica/produtos/biotech/axima.shtml
Espectrometria de Massas
ESI-LC-MS " HPLC com massas como detector Preparação amostras mais rápida e simples
Electrospray ionization
Alta voltagem
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Espectrometria de Massas
ESI-LC-MS " HPLC com massas como detector Pode ser mais rápido e simples
Electrospray ionization
Espectrometria de Massas
ESI-LC-MS " HPLC com massas como detector Pode ser mais rápido e simples
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Bioinformática
• Identificação de proteínas • MASCOT, NCBI, BLASTp e PepSeq • Peptide Mass Fingerprinting
Bancos de dados
teóricos de DNA e
proteínas
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Modificações pós-traducionais
Glicosilação
http://www.piercenet.com/method/protein-glycosylation
Prots ligadas à membrana Secretadas Ret Endo monitora status do folding proteico Facilita entrega para o destino correto
Endoglicanase
Modificações pós-traducionais
Fosforilação Sacarose fosfato sintase
http://planetorbitrap.com/phosphorylation#.U8W8x_ldVu4
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Proteômica e desenvolvimento do café
Desenvolvimento do café
• Brasil: líder em produção (35%) • U$$15,4 bi -- ~135 milhões sacas
• Bebida x qualidade Ciência!!
O Lavrador de Café Portinari, 1939
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• Duas variedades: ! tamanho ! estágios de maturação Síntese de etileno: climatérico MS " Expressão mais cedo em Ipr59 SAM-sintase " presença a partir de 90 DAF IPR59 Gdo
Proteômica: Desenvolvimento do café
Budzinski et al (2011)
IPR59 IPR59 Graúdo
MS
MS
MS
SAM Fruto: produção e reserva de precursores para síntese de etileno já no início da
maturação
Diferença entre as duas cultivares Maior tempo de enchimento do
perisperma
Alves et al. (em prep)
Proteômica: Desenvolvimento do café • Desenvolvimento celular - Inibidor de xilanase similar à quitinase (CLXIP) - Actina e actina 7 Ipr59 início da maturação Evitar demasiada degradação da parede celular Expressas em rápido desenvolvimento celular
Alves et al. (em prep)
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Proteômica: Desenvolvimento do café • Detoxificação ROS/resposta a stress Ascorbato peroxidase Late embriogenesis protein Polifenoloxidase Aldeído desidrogenase Lacase Cisteína peroxiredoxina
Alves et al. (em prep)
Stress oxidativo Seca Crescimento e involução perisperma
OBRIGADO [email protected]
Centro de Bio. Mol. Eng. Genética Pós graduação Gen. Bio. Molecular - UNICAMP
Luis Filipe Pereira - IAPAR Cesar Martins – IB/UNESP Guilherme Valente – FCA/UNESP Renato Vicentini - UNICAMP