Laboratório Virtual de Línguas incorporando novos métodos de ensino e aprendizagem de línguas
NOVOS MÉTODOS EMPREGADOS EM ANÁLISE MICROBIOLÓGICA.pptx
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NOVOS MÉTODOS EMPREGADOS EM ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
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Investigar presença / ausência de micro-organismos
Quantificar os micro-organismos de interesse
Identificar diferentes espécies microbianas presentes
Analise microbiológica de alimentos:
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• Métodos tradicionais ou convencionais
• Métodos rápidos ou alternativos ou novos métodos
Os Métodos Microbiológicos podem ser divididos em:
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Métodos tradicionais
• Desenvolvidos há muitos anos e desde então vem sendo empregados
como métodos oficiais na maioria dos laboratórios.
• Descritos em publicações de referência, internacionalmente aceitas:
Alguns exemplos:
- Bacteriological Analytical Manual (BAM) (FDA/AOAC)
- Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (APHA)
- International Organization for Standardization (ISO)
- International Dairy Federation (IDF)
- Food and Drug Administration (FDA).
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Métodos tradicionais
• São laboriosos e consomem muito tempo operacional
Dependendo do no. de análises:
- perigo de contaminação cruzada;
- muitas etapas a serem validadas;
- limitada área física e pessoal.
• A maioria dos testes são baseados na contagem de células viáveis
Injúria, alterações - processamento
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Métodos tradicionais
1. ANÁLISE QUANTITATIVA -
MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS
A) Contagem de colônias de micro-
organismos em placas de petri
-Em profundidade " pour-plate"
-Na superfície do meio
Técnica de contagem por membrana filtrante
Técnica da determinação do
número mais provável (NMP)
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Métodos tradicionais
2. ANÁLISE QUALITATIVA
-Técnica de presença/ausência
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Problemas com os métodos tradicionais:
Sensibilidade insuficiente – capacidade de detectar o que o método propõe
Especificidade: nem sempre ocorre (podem haver falsos negativos);
Repetitividade: nem sempre se o teste for repetido por um mesmo operador inúmeras vezes se obtém o mesmo resultado;
Reprodutibilidade: capacidade de gerar resultados estatisticamente iguais (nem sempre ocorre).
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Métodos rápidos ou novos métodos
Apresentam as seguintes vantagens:
Redução do tempo de análise;
Menor tempo de retenção do produto na indústria;
Diminuição de custos;
Simplificação das tarefas envolvidos na análise;
Facilidade de leitura dos resultados;
Especificidade;
Maior sensibilidade de alguns métodos quando comparados com os métodos convencionais.
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Métodos rápidos ou novos métodos
Importante:
1) Ter um microbiologista treinado para interpretação;
2) Ser aprovado pelos órgãos oficiais.
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Métodos rápidos ou novos métodos
3 grupos:
1) Automação laboratorial;
2) Métodos para avaliar a qualidade;
3) Métodos para avaliar inocuidade.
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1) AUTOMAÇÃO LABORATORIAL
Utilizado nas etapas da analise:
a . Pesagem- Por ex, através de um
aparelho chamado DILUTER - ajustado que
ao colocar a amostra, pesa a alíquota
desejada, e já dilui acrescentando a água
necessária para a diluição!
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1) AUTOMAÇÃO LABORATORIAL
b . Homogeneização- Uso do stomacher homogeneizador de pistão → não mais
os liquidificadores que “cortam” as células microbianas injuriando-as na análise!!!
c. Semeadura – Utilização de um aparelho
chamado “spiral plater” → amostra é semeada na
placa, através de uma cânula, que verte o inóculo,
e a placa fica numa superfície que gira.
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2. Métodos para avaliação da qualidade
Métodos de contagem: direta e
indireta
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MÉTODOS DE CONTAGEM DIRETA
Técnica de membrana filtrante: Utilizada para líquidos onde grande quantidade é necessitada para amostra: ex.: água e refrigerantes.
Aprovado pela AOAC para enumeração de bactérias totais, coliformes totais, Escherichi coli e Salmonella.
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MÉTODOS DE CONTAGEM DIRETA
Técnica fluorogênica: A enzima β-glicuronidase produzida pela maioria das cepas de Escherichia coli transforma o MUG (que é adicionado ao meio de cultura) em umbeliferona (que é fluorescente quando observado sob luz ultravioleta de onda longa).
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MÉTODOS DE CONTAGEM DIRETA
Sistemas prontos para uso:Placas de Petrifilm-3M, Placas de Simplate e diversos ágares adicionados de substratos cromogênicos ou fluorogênicos.
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PetrifilmTM - 3M
• São filmes de papel quadriculado revestido com polietileno, recobertos de nutrientes desidratados e géis hidrossolúveis a frio com corante indicador (cloreto de trifeniltetrazolio – TTC) - exceção fungos. Cada placa tem um filme superior de polipropileno. Aprovado pela AOAC!
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Petrifilme Análise de Escherichia coli
6
32
4 5
1
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Petrifilme Análise de Enterobacteriaceae
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Petrifilme Análise de bolores e leveduras
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Petrifilme Análise de Staphylococcus aureus
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Placas de Simplate - BIOCONTROL
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Placas de Simplate - BIOCONTROL
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Placas de Simplate - BIOCONTROL
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MÉTODOS DE CONTAGEM INDIRETA
• Medição da atividade metabólica dos micro-organismos nos alimentos;
• construção de curvas-padrão: correlação entre os parâmetros medidos e o número de células viáveis;
• Princípio básico: quanto maior o número de micro-organismos presentes mais intenso é o fenômeno medido.
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MÉTODOS DE CONTAGEM INDIRETA
Bioluminescência
• Emissão de luz por organismos vivos.
• Princípio: quantidade de ATP detectada a partir de células metabolicamente ativas (células microbianas; sangue, carne,...).
• ATP reage com a enzima luciferase, na presença de luciferina e íons Mg++, formando um complexo que, em contato com o oxigênio, sofre uma descarboxilação, com emissão simultânea de luz.
http://www2.uol.com.br/sciam/reportagens/o_universo_luminoso_dos_fungos_bioluminescentes.html
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Bioluminescência
Mg+2
E + LH2 + ATP E - LH2 - AMP +
PP
E - LH2 - AMP + O2 oxiluciferina + CO2 + AMP +
luz
Princípio do método: emissão de bioluminiscência por ATP
A luz emitida pode ser medida em luminômetro, um fluorímetro ou em um espectrofotômetro de cintilação líquida.
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Bioluminescência
Aplicação comum: Monitoramento de Higienização em plantas processadoras de alimentos.
Quanto mais sujo, + luz!
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MÉTODOS DE CONTAGEM INDIRETA
Impedância/Condutância
Principio: Micro-organismos alteram a corrente elétrica de um meio de cultura devido atividades metabólicas.
Na multiplicação, moléculas grandes (proteínas, lípideos) se transformas em moléculas menores (aminoácidos, ac. graxos), que são quimicamente ativas. Resultado: acumulo destes compostos leva alterações mensuráveis na condutância e impedância elétrica do meio .
Curva-padrão: Determina micro-organismos presentes
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3. Métodos para avaliar a inocuidade
BIOQUIMICOS
IMUNOLOGICOS
MOLECULARES
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BIOQUIMICOS
• Baseados na avaliação da capacidade dos microrganismos de utilizarem determinados substratos ou de produzirem determinados metabólitos
• Testes normalmente executados em “kits”.
• Ex: Galerias API_ Bio-Mérieux
• BBLRapid test- Salmonella- OXOID
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IMUNOLOGICOS
• Imunoenzimáticos;
• Imunocaptura;
• Imunoimobilização;
• Coaglutinação.
Grande sensibilidade e elevada especificidade.
Baseados em reações específicas entre antígenos e anticorpos.
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IMUNOLOGICOS → Imunoenzimáticos
A reação é baseada na ligação do antígeno com o anticorpo específico, no qual um desses reagentes é marcado com uma enzima, normalmente cromogênica
A cor formada pode ser observada a olho nu ou em espectrofotômetro.
Tipo mais empregado: sandwich
O patógeno PROCURADO é capturado da amostra por anticorpos adsorvidos à superfície de uma matriz sólida (esferas de poliestireno, placas de microtitulação, etc)
Ex.: VIDAS (Bio Merieux- automatizado) → Salmonella, Listeria, E. coli e E. aureus Unique (Tecra) → Salmonella e Listeria
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IMUNOLOGICOS → Imunocaptura
• Anticorpos ficam ligados a partículas metálicas
• Após a ligação com o antígeno, as partículas metálicas são atraídas por um imã.
• Após a retirada do imã, obtém-se um produto concentrado que pode, então, ser submetido aos testes de escolha para pesquisa do micro-organismo de interesse.
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IMUNOLOGICOS → Imunoimobilização
Princípio: Bactérias móveis cultivadas em meios semi-sólidos tem sua mobilidade bloqueada pela adição de anti-corpos flagelares específicos.
Forma uma banda de precipitação visível na interface ANTI-CORPO/BACTÉRIA.
Aplicável a qualquer micro-organismo flagelado (móvel).
Ex. Teste 1-2 da Bio-Control p/ Salmonella: Duas câmaras de plástico interligadas em L . Na câmara horizontal fica o caldo de enriquecimento seletivo p/ Salmonella e na vertical o meio semi-solido onde se coloca o antisoro flagelar polivalente.
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IMUNOLOGICOS → Coaglutinação
Conhecido como aglutinação de látex(passivareversa)• Uso: toxinas microbianas• Aglutinação de partículas de látexsensibilizadas com anti-corpos anti-toxinas.• Ex.: RPLA kits_ OXOID p/ pesquisa deenterotoxinas estafilocócicas.
![Page 38: NOVOS MÉTODOS EMPREGADOS EM ANÁLISE MICROBIOLÓGICA.pptx](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022082218/55cf9cd3550346d033ab2f29/html5/thumbnails/38.jpg)
MOLECULARES
- Segurança e rapidez nos resultados.
- Disponível para patógenos e bioindicadores
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MOLECULARES
Sondas genéticas
• material genético do micro-organismo é liberado e separado em duas
fitas simples;
• adicionam-se sondas, que são fragmentos de DNA ou RNA específicos
para o patógeno alvo, marcadas com enzimas cromogênicas;
• quando há hibridização com a sonda, há desenvolvimento de cor e,
portanto, a presença do micro-organismo.
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MOLECULARES
Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)
O que é PCR?
Reação em Cadeia da Polimerase
Desenvolvido em 1983 por Kary Mullis.
Prêmio Nobel em Química – 1993;
AMPLIFICAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO DE MICRORGANISMOS
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• Extrair o material genético da célula (DNA ou RNA) sem danificá-lo.
Adiciona:
1. dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com três fosfato;
2. primers também chamados de oligonucleotídeos;
3. enzima DNA polimerase em solução tampão;
• Toda esta mistura é colocada no termociclador - faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).
Metodologia
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MOLECULARES
Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)
PCR tradicional
- Dependente da seleção e qualidade do “primer”;
- Necessidade de otimização das reações;
- Muitas e delicadas etapas;
- Mão de obra especializada; ambiente adequado;
- Perigo de contaminação.
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MOLECULARES
Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)
BAX – PCR automatizado
- “Primers” já testados e validados;
- Aprovações e validações.
FACILITA A ROTINA E DIMINUI INTERFERÊNCIAS !
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MOLECULARES
Ribotipagem
Feita em um equipamento sofisticado, totalmente automatizado, no qual bactérias podem ser identificadas rapidamente (menos de 8 horas) em nível de espécie.
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INDÚSTRIA ALIMENTOS NECESSITA MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS QUE SEJAM:
• Precisos
• Rápidos
• Fáceis de utilizar
• Flexíveis
• Confiáveis
• Econômicos
• Acompanhamento e
suporte técnicos
contínuos
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devido à necessidade de rapidez de resultados, hoje, já são encontrados no
mercado varias técnicas que possibilitam resultados muito rápidos, essas
técnicas são conhecidas por “métodos rápidos de análise microbiológica”, os
mais usados na área da pesquisa são PCR, o ELISA, placas petrifilm e placas
simplate.
Os métodos rápidos possuem muitas vantagens, como boa exatidão, além
de minimizar os custos de uma empresa, sendo de rápida e fácil leitura, porém,
possuem algumas desvantagens, como o elevados custo de algumas técnicas e
mesmo aqueles já aprovados pela AOAC, os resultados positivos ainda não são
considerados confirmatórios.
CONSIDERÃÇÕES FINAIS
![Page 51: NOVOS MÉTODOS EMPREGADOS EM ANÁLISE MICROBIOLÓGICA.pptx](https://reader036.fdocumentos.tips/reader036/viewer/2022082218/55cf9cd3550346d033ab2f29/html5/thumbnails/51.jpg)
Métodos rápidos oficiais AOAC para análise microbiológica de alimentos e sistemas para monitoramento de higienização.
Métodos Simplate™ - para contagem total de bactérias em 24 horas; contagem de bolores e leveduras em 48 a 72 horas e contagem de coliformes totais e E.coli em 24 horas
VIP, 1-2 Test® e Assurance EIA - métodos imunoezimáticos AOAC OMA para análise de patógenos como Salmonella, Listeria, Campylobacter e E.coli O157:H7
GDS - Sistema de detecção genética de última geração - PCR - com aprovação AOAC para análise de patógenos com Salmonella, Listeria spp, Listeria monocytogenes, E.coli 0157:H7, Enterobacter sakazakii
Lightning MVP™ - Sistema para monitorar e avaliar a efetividade dos procedimentos de limpeza através da bioluminescência por ATP em conjunto com medidas de controle de qualidade pH, temperatura, concentração em ppm e condutividade. Possibilita a calibração de todos os parâmetros
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DUVIDAS?