Niagara FallsCanadá - julho de 2001 W.J.Melo

Cataratas de IguaçuBrasil - julho de 2001

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Proteínas

CLASSIFICAÇÃO

!Composição

!Características físicas

!Função biológica

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Proteínas

CLASSIFICAÇÃO

!Com base na composição#Proteínas Simples#Proteínas Conjugadas

�Nucleoproteínas

�Lipoproteínas

�Glicoproteínas

�Fosfoproteínas

�Hemoproteínas

�Metaloproteínas

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Proteínas

PROTEÍNAS SIMPLES

!São aquelas proteínas que, por hidróliseácida, fornecem apenas aminoácidos.

!Usualmente contém:#C= 50%#H= 7%#O= 23%#N= 16%#S= 0 a 3%

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Proteínas

PROTEÍNAS CONJUGADAS

!São aquelas proteínas que, por hidrólise ácida, além de aminoácidos também libe-ram outras substâncias orgânicas e/ou inor-gânicas

!Todo componente que não é aminoácido,recebe a denominação de grupo prostético

!São classificadas de acordo com o tipo degrupo prostético existente#Nucleoproteínas, lipoproteinas, glicoproteí-

nas, fosfoproteínas, hemoproteínas, meta-loproteínas

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Proteínas

PROTEÍNAS CONJUGADAS

!Nucleoproteínas#O grupo prostético é um ácido nucleico

�Virus do mosaico do tabaco

!Lipoproteínas#O grupo prostético é um lipídeo

�Beta lipoproteína do sangue

!Glicoproteínas#O grupo prostético é um carboidrato

�Gama globulina do sangue

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Proteínas

PROTEÍNAS CONJUGADAS

!Fosfoproteínas#O grupo prostético contém fosfato

�Caseína do leite

!Hemoproteínas#O grupo prostético contém o grupo heme

�Ferroporfirina, hemoglobina, citocromo c

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HemeFe-protoporfirina

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Proteínas

!Metaloproteínas

#O grupo prostético é um ion metálico (Fe,Zn, Mn)�Desidrogenase alcoólica

�Anidrase carbônica

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Proteínas

CLASSIFICAÇÃO

!Em função das características físicas

#Proteínas fibrosas

#Proteínas globulares

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Proteínas

PROTEÍNAS FIBROSAS

!As cadeias polipeptídicas encontram-se esten-didas, de modo paralelo, ao longo de um eixo,formando uma fibra rígida em forma de cordãoou folha

!Apresentam as seguintes propriedades#Insolúveis em água#Fisicamente duras

!Têm a função de proteção ou estrutural!Exemplos#cabelo, pena, unha, pele, colágeno

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Proteínas

PROTEÍNAS GLOBULARES

!Apresentam a cadeia ou as cadeias arranja-das em forma esférica ou globular compacta

!Apresentam as seguintes propriedades#São solúveis em água#Difundem-se rapidamente

!Exemplos#quase todas as enzimas#proteínas plasmáticas com função de trans-

porte (soroalbumina, hemoglobina)

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PROTEÍNA GLOBULAR

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Proteínas

PROPRIEDADES

!Físicas#Efeito da temperatura#Solubilidade

!Químicas#Hidrólise

�Ácida

�Alcalina

�Enzimática

#Ponto isoelétrico#Reações coloridas#Reação com metais

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Proteínas

EFEITO DA TEMPERATURA

!As proteínas sofrem desnaturação, quandosubmetidas ao aquecimento.

!A desnaturação implica em perda de suaspropriedades.#Exemplos

�A albumina do ovo (clara do ovo)

�Proteína do leite (caseína)

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Proteínas

SOLUBIILIDADE

!Em água

#As proteínas apresentam solubilidade muitovariável em meio aquoso.

�Proteínas globulares - são solúveis em água

�Proteínas fibrosas - são insolúveis em água

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Proteínas

FATORES QUE AFETAM A SOLUBILIDADE

!Temperatura

!pH

!Concentração salina

!Ions metálicos

!Ânions

!Solventes orgânicos

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Proteínas

SOLUBILIDADE - EFEITO DA TEMPERATURA

!De um modo geral, a solubilidade das proteí-nas aumenta na faixa 0-40oC.

!Na faixa 40-50oC a solubilidade começa a di-minuir.

!Acima dos 50oC começa a haver a desnatura-ção da molécula protéica, com perda de suaspropriedades.#Exemplos

�Albumina do ovo

�Caseína do leite

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Proteínas

SOLUBILIDADE - EFEITO DO pH

!O pH altera as cargas presentes na moléculaprotéica.

!No pH isoelétrico, a soma das cargas presen-tes na molécula protéica é nula e a mesma a-presenta sua menor solubilidade.

!Muitas proteínas se desnaturam (perdem a so-lubilidade e se precipitam) pela adição de áci-do ao meio.#Caseina do leite na presença de limão#O ácido tricloroacético é um poderoso agen-

te de precipitação de proteínas.

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SOLUBILIDADE EFEITO DO pH NA PRESENÇA DE SAIS

II I I I

-

-

-

4,8 5,0 5,2 5,4 5,6

1

2

3

pH

NaCl 0,001 mol L-1

NaCl 0,02 mol L-1

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Proteínas

SOLUBILIDADE - EFEITO DE SAIS

!Em baixas concentrações salinas, a solubili-dade das proteínas aumenta á medida que au-menta a concentração do sal.#Este efeito recebe o nome de salting-in

!Aumentando-se a concentração do sal, a solu-bilidade das proteinas começa a diminuir, vin-do a ocorrer sua precipitação.#Este efeito recebe o nome de salting-out#O comportamento depende do tipo de sal

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SOLUBILIDADE - EFEITO DE SAIS

II I I I

-

-

-

1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

Força Iônica

-

-

1,2

0,4

-0,4

-1,2

-2,0

2,0

NaCl

(NH4)2SO4

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Proteínas

SOLUBILIDADE - SOLVENTES ORGÂNICOS

!Solventes orgânicos como metanol, etanol,butanol, acetona diminuem a solubilidade dasproteínas e tendem a causar sua precipitação.

!Explicação#A explicação é dada pela lei de Coulomb#Os solventes orgânicos diminuem a constante

dielétrica do meio e, portanto, aumentam a a-tração entre as cargas, causando a desestabi-lização da estrutura da molécula protéica.

#A lei de Coulomb

F=q1*q2

r2*D

q1 e q2= cargas

r= distância entre as cargasD= constante dielétrica

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Proteína

REAÇÃO COM METAIS E ÂNIONS

!Reações de precipitação#As proteínas podem formar sais insolúveis com ions

metálicos ou com ânions# Ions de metais pesados como Pb, Cd, Ag, Zn, Ba for-

mam sais insolúveis com as proteínas, quando o pHdo meio se encontra acima do PI.

!Reações coloridas#Metais como Cu e Ni podem formar compostos de

coordenação com as proteínas, dando origem a com-plexos coloridos ou não.

#O Cu do reagente do biureto forma um complexo decoordenação com os grupamentos amina primária dos aminoácidos da cadeia polipetídica, o qual apre-senta coloração violeta.

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Proteínas

REAÇÃO COM BIURETO

!Biureto#Constituição

�CuSO4.5H2O - o Cu é o elemento ativo do rea-gente.

�tartarato duplo de sódio e potássio - complexar o Cu para evitar formação de óxido cúprico (pre-cipitado preto) sob aquecimento.

�hidróxido de sódio - alcalinizar o meio

�iodeto de potássio - evitar auto-oxidação do Cu#Reação

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R-C-H IO=C

NH

NH

IO=C

R1-C-H I

proteína

+ Cu +

IC=O

H-C-R I C=O

H-C-R1

HN

HN

Iproteína

R-C-H IO=C

NH

NH

IO=C

R1-C-H I

IC=O

H-C-R I C=O

H-C-R1

HN

HN

I

Cu

complexo de cor violeta W.J.Melo

REAÇÃODO

BIURETO

Proteínas

HIDRÓLISE DAS PROTEÍNAS

!As proteínas podem ser hidrolisadas por meiode ácidos, bases ou por meio de enzimas de-nominadas proteases.#Durante o processo de hidrólise ocorre o rom-

pimento da ligação peptídica, com liberaçãoda mistura de aminoácidos que constituiam amolécula protéica.

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HIDRÓLISE DE PROTEÍNAS

C

O

N

HI

R1

C

IICI

HI

Nooo

R2

I CIIO

OH+ n H OHH OH

n

NH2 I R - C - COOH I H

mistura de aminoácidos W.J.Melo

Proteínas

PONTO ISOELÉTRICO

!Os radicais R dos aminoácidos que consti-tuem a molécula protéica podem se encon-trar ionizados em função do pH da solução.

!Em pH abaixo do PI, a proteína se apresentacom carga líquida positiva.

!Em pH acima do PI, a proteína se apresentacom carga líquida negativa.

!No ponto isoelétrico, a proteína se apresentacom carga líquida igual a zero.

!Pela presença de carga em função do pH domeio, as proteínas podem ser separadas poreletroforese. W.J.Melo

Proteínas

REAÇÕES COLORIDAS!Reação xantoprotéica#As proteínass que aprsentam na sua consti-

tuição o núcleo aromático, reagem com o á-cido nítrico, dando um complexo de cor ama-rela.

!Reação de Millon#As proteínas que apresentam a tirosina na

sua constituição, tratadas por mercúrio, ácidonítrico e ácido nitroso, sob aquecimento, dão origem a um precipitado pardo avermelhado.

!Reação com o biureto#As proteínas reagem com o biureto, dando o-

rigem a um complexo de cor violeta.W.J.Melo

Proteínas

BIURETO

!O biureto é formado pela reaçao entre 2 mo-léculas de uréia.

!O biureto é tóxico para as plantas acima decerta concentração.

!Aparece como contaminante na uréia e a le-gislação estabele o máximo permitido.

2 NH2-CO-NH2Uréia

NH2-CO-NH-CO-NH2Biureto

+ NH3

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Proteínas

AVALIAÇÃO QUANTITATIVA

!Há vários métodos para determinação quantita-tiva de proteínas em amostras de tecido animal,vegetal, de microrganismos, alimentos, etc.

!A seleção de um ou outro método depende dasensibilidade desejada e do tipo de equipamen-to disponível.

!Métodos: titulométricos, colorimétricos, turbi-dimétricos, espectrofotométricos,

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Proteínas

MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DE PROTEÍNAS

!Métodos titulométricos#Determinação do N-total#Proteína= 6,25 x N-total

!Métodos colorimétrocs#Macrobiureto, microbiureto, Lowry, Hartree

!Métodos turbidimétricos#Precipitação da proteína com TCA

!Métodos espectrofotométricos#Leitura da absrobância no UV (E280, E260)

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Proteínas

MÉTODO MACROBIURETO!Método espectrofotométrico

!Baseia-se na reação da proteína com o rea-gente macrobiureto#As proteínas reagem com o biureto, forman-

do um complexo de cor violeta

!Componentes do macrobiureto#sulfato de cobre pentaidratado, tartarato du-

plo de sódio e potássio, hidróxido de sódio,iodeto de potássio

!Sensibilidade#O método macrobiureto consegue determi-

nar proteínas em concentrações de 30 a 250mg L-1

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Proteínas

MÉTODO DO MACROBIURETO

R-C-H IO=C

NH

NH

IO=C

R1-C-H I

IC=O

H-C-R I C=O

H-C-R1

HN

HN

I

Cu

complexo de cor violetaW.J.Melo

Proteínas

MÉTODO MACROBIURETO

ETAPAS CURVA DE CALIBRAÇÃO

EXTRAÇÃO

APLICAÇÃOCÁLCULOS

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Proteínas

MÉTODO DO MACROBIURETO

!Curva de calibração

#Tem o objetivo de relacionar a concentração de uma solução protéica padrão (soroalbu-mina bovina) com a absorbância.

#A vários tubos de ensaio, colocam-se con-centrações diferentes de uma proteína pa-drão, aplica-se a reação de cor e lê-se a ab-sorbância do complexo colorido.

#A relação absorbância/concentração é uma reta dentro de certos limites concentração.

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Proteínas

MÉTODO DO MACROBIURETO

!Curva de calibração

#A 7 tubos de ensdaio, adicionar, respectiva-mente, 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 e 1,4 mL dasolução padrão de proteína (albumina bovi-na 1%)

#Completar o volume a 4 mL com água des-tilada

#Adicionar a cada tubo 4 mL da solução demacrobiureto

#Aguardar 15 minutos e ler a absorbância a540 nm

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Proteínas

MÉTODO DO MACROBIURETO -EXTRAÇÃO

!Aplicação a uma amostra de folha

#Pesar 1,0 g de tecido fresco de folha e colocarem almofariz.

#Adicionar 7 mL de água destilada, um pouco de areia lavada e extrair a proteína solúvelem água.

#Transferir para tubo de centrífuga e centrifu-gar (15 minutos a 17.000 rpm).

#Transferir o sobrenadante para balão volu-métrico de 10 mL e completar o volume comágua destilada.

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MACROBIURETO - EXTRAÇÃO

!Pipetar 4 mL do extrato para tubo de centrí-fuga e adicionar 1 mL de solução de TCA50%.

!Agitar e centrifugar (10 minutos a 3.500 rpm).

!Suspender o precipitado em 5 mL de aceto-na gelada (5oC).

!Centrifugar e ressuspender em 5 mL de ace-tona gelada. Repetir a operação até que osobrenadante se apresente sem coloração.

!Suspender o precipitado em 2 mL de solu-ção de NaOH 0,1 mol L-1.

!A solução obtida é o extrato de proteína. W.J.Melo

Proteínas

MACROBIURETOAPLICAÇÃO AO EXTRATO OBTIDO

!O extrato de proteína obtido deve ser submetido à mesma seqüência usada para a obtenção da cur-va de calibração.#Pipetar um volume menor que 4 mL do extrato de proteína para tubo de ensaio (no caso, 0,6

mL).#Adicionar volume de água para completar o volu-

me de extrato usado a 4 mL (no caso, 3,.4 mL).#Adicionar 4 mL do reativo do macrobiureto, agi-

tar bem e aguardar 15 minutos.#Ler a absorbância do complexo colorido em com-

primento de onda de 540 nm.W.J.Melo

Proteína

MÉTODO MACROBIURETO CÁLCULOS

!Curva de calibração

#1. Método da relação Absorbância/Conentração#2. Método da Regressão Linear

!Concentração de proteína na amostra de folha

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MÉTODO DA RELAÇÃO

CONCENTRAÇÃO/ABSORBÂNCIA

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A RELAÇÃOCONCENTRAÇÃO/ABSORBÂNCIA

É CONSTANTE

concentração

tg =absorbância

concentração

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MACROBIURETO - RESULTADOS

Tubo Padrão Água Abs Abs-Br Conc. Conc./Abs-BrmL mL g L-1

1

2

3

4

5

6

7

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,4

4,0

3,8

3,6

3,4

3,2

3,0

2,4

0,155

0,184

0,252

0,301

0,347

0,398

0,420

0,000

0,029

0,097

0,146

0,192

0,243

0,265

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,5

17,24

10,31

10,27

10,42

10,29

13,21

--

Média 11,96

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MÉTODO

DA

REGRESSÃO LINEAR

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MACROBIURETOCURVA DE CALIBRAÇÃO

I II I

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0

-

-

-

0,1

0,2

0,3

0,0

Proteína (g L-1)

y= 0,0829x + 0,0086r2= 0,095

x= 12,0627y - 0,1037

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MACROBIURETO - CÁLCULOSPROTEÍNA NO EXTRATO PROTÉICO

!Absorbâncias#Amostra: 0,420#Branco: 0,155

!Método da relação Conc/Abs#proteína (mg mL-1)= 11,95 x (Aa - Ab)#proteína (mg mL-1)= 11,95 x (0,420-0,155)#proteína (mg mL-1)= 3,17

!Método da regressão linear#proteína (mg mL-1)= 12,06 x (Ab - Ab) -0,10

!Proteína (mg mL-1)= 12,06 x (0,420 -0,155) -0,10#proteína (mg mL-1)= 3,10

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MACROBIURETO - PROTEÍNA NAAMOSTRA

!Diluições do extrato#1. 1,0 g de folha 10 mL#2. 0,6 mL extrato ¾ 4 mL#Fd= 10/1 x 4/0,6= 66,67

!Concentrações do extrato#1. 4 mL ¾ 2 mL#Fc= 4/2= 2

!Proteína na amostra de folha#proteína (mg kg-1)= Conc extrato x Fd/Fc#proteína (mg kg-1)= 3,17 x 66,67/2#proteína (mg kg-1)= 105,67

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