MSc. Romeu Moreira dos Santos - Unesp · 2017-06-16 · • Testes de ligação primária •...
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2015
MSc. Romeu Moreira dos Santos
2017
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INTRODUÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Antígeno e Anticorpo
• Anticorpos: formas secretadas dos receptores de antígenos das células B.
• Por serem produzidos em grande quantidade em resposta ao antígeno, os
anticorpos podem ser estudados através de testes imunológicos
• Corpo humano: dois trilhões (2 x 1012)
• Antígenos são as moléculas reconhecidas pela resposta imune, enquanto os
epítopos são sítios nos antígenos aos quais os receptores das cél. B ou
anticorpos se ligam.
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INTRODUÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• INTERAÇÃO: Antígeno X Anticorpo
• É uma associação bi-molecular semelhante à interação de enzimas com
seus substratos ou de hormônios com seus receptores, com uma distinção
bem evidente o Ac não provoca nenhuma alteração química irreversível na
molécula de Ag, podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se
dissociar nos seus 2 componentes; isto é, Ag e Ac livres na solução.
AgAc(Imunocomplexos)
Ag+Ac
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INTRODUÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• INTERAÇÃO: Antígeno X Anticorpo
• Interação não-covalente reversível
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INTRODUÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• As respostas imunes são úteis de dois modos para diagnosticar uma
doença:
• Inicialmente Acs específicos podem ser utilizados para detectar ou
identificar um Ag de interesse.
• Ou por meio de detecção de Acs específicos no soro, é possível determinar
se um animal foi previamente exposto a um agente infeccioso.
• A mensuração das interações Ag x Ac com o propósito de diagnóstico é
denominada SOROLOGIA.
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INTRODUÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• As técnicas sorológicas podem ser classificadas em três grandes
categorias:
• Testes de ligação primária
• Mensura diretamente a ligação do Ag x Ac
• Testes de ligação secundária
• Mensura os resultados da interação Ag x Ac in vitro.
• Testes terciários
• Compreende os testes in vivo, que mensuram o real efeito protetor dos Acs em um
animal.
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REAGENTES UTILIZADOS EM TESES SOROLÓGICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Soro
• Antiglobulinas
• Anticorpos monoclonais
• Anticorpos policlonais
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TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Testes que detectam diretamente o Ag ou Ac de interesse.
• Permitem o reconhecimento do Ag pelo Ac e os complexos imunes
formados são, então, mensurados.
• Para mensuração desta reação, um dos reagentes deve estar
quimicamente marcado
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PRINCIPAIS TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Ensaios de imunofluorescência
• Ensaios imunoenzimáticos
• Imunohistoquímica
• Dispositivos descartáveis para imunoensaios rápidos com
partículas coloidais marcadas
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ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a
uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV,
emite luz no espectro visível.
A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um
microscópio com luz UV (microscópio de fluorescência)
Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –
FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos:
direta, indireta ou sanduíche.
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ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Teste direto - pesquisa de antígenos (células ou tecidos)
Teste indireto - pesquisa de anticorpos
Referência para sorodiagnóstico de várias doenças.
• Vírus, bactérias e protozoários
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ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Teste direto - pesquisa de antígenos
• Ex. – Raiva
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ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos
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ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução;
determinação de classes e subclasses de anticorpos
Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescência
sob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação.
Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Cor
Fluoresceína 495 525 Verde
Rodamina 552 570 Vermelho
Vermelho Texas 596 620 Vermelho
Ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja
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ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima (ELISA) Um dos mais importantes imunoensaios empregados na medicina
Utillizado para detectar e mensurar tanto Acs como Ags.
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ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Método direto – Ags
Método indireto – Acs
Sandwich e Competitivo –Ags e Acs
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ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS INDIRETOS - ETAPAS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
–Revista a superfície das cavidades de uma microplaca apropiada com Ags do agente
infeccioso que você está interessado em detectar Acs específicos.
–Adicione as amostras de soro de indivíduos a serem testados, se houver anticorpos
na amostra, eles vão se ligar aos Ags adsorvidos à superfície plástica
–Lave as cavidades da microplaca a fim de remover todos os anticorpos que não
forem específicos para o Ag em questão
–Adicione um outro tipo de Ac anti-Ig da espécie que você está pesquisando se as
amostras de soro têm ou não que deve ter sido previamente marcado com uma
enzima
–Adicione o substrato específico para a enzima e deixe a reação de degradação
enzimática prosseguir e conferir cor às cavidades da microplaca
–A intensidade da cor (DO) deve ser mensurada em leitor-fotômetro, sendo que as
leituras são proporcionais aos níveis dos Acs presentes nas amostras originais de
soro contra o Ag em questão.
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ELISA INDIRETO
Lavagens
Antígeno
Fonte de proteínas
estranhas ao sistema
LavagensLavagens
Soro anti
Conjugado anti
Lavagens
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
•Sandwich-ELISA (S-ELISA) / Duplo Ac-ELISA
–As amostras são adicionadas às cavidades de uma microplaca previamente
revestidas com Acs de captura específicos para Ag que se deseja detector
–As cavidades da microplaca são lavadas p/ remover o excesso de substâncias
ou Ags que não se ligaram especificamente aos Acs de captura
–Uma preparação de Ac secundário conjugado com uma enzima apropriada é
adicionada
–O substrato enzimático é então adicionada e haverá, no caso de presença de Ag
na amostra uma mudança de cor, que pode ser mensurada em leitor-fotômetro
apropriado. A intensidade de DO é proporcional à quantidade de Ag presente na
amostra.
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LOGOELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA
Lavagens
Antígeno
Fonte de proteínas
estranhas ao sistema
LavagensLavagensLavagens
Conjugadoanti
Soro anti
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOELISA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOELISA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA
Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais.
Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato incolor
em produto colorido (deposição pode ser observada diretamente ao
microscópio óptico).
Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -Galactosidase
e Glicose Oxidase.
Método direto Acs primários conjugados (antígenos).
Método indireto Acs secundários conjugados (antígenos ou anticorpos).
Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamento
inadequado dos conjugados.
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de
nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a
visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na
forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com
proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA).
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LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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PRINCIPAIS TESTES DE LIGAÇÃO SECUNDÁRIA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Testes de ligação secundária
• Mensura os resultados da interação Ag x Ac in vitro.
• Imunodifusão
• Aglutinação
• Fixação de Complemento
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IMUNODIFUSÃO
Técnica de Imunodifusão
• Termo utilizado para designar testes sorológicos realizados em meio
gelificado, no qual os reagentes só se misturam por difusão
• Dupla difusão em gel de ágar
• Reação de precipitação entre o Ag e o Ac específico em meio gelificado,
onde ambos os reagentes se difundem um contra o outro, formando uma
linha ou arco de precipitação na área de reação
• Essa técnica permite avaliar com relativa facilidade os "componentes
antigênicos" encontrados em misturas complexas
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IMUNODIFUSÃO
Técnica de Imunodifusão
• Permite também revelar se duas ou mais substâncias são imunologicamente
idênticas ou independentes
• Essa prova geralmente é feita sobre lâminas de microscopia ou placas de
Petri, revestida com uma camada de gel de ágar de 0,6 a 1,5% em solução
fisiológica ou tamponada
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LOGO40 µL
soro
40 µL
antígeno
Técnica de Imunodifusão
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40 µL
soro
40 µL
antígeno
Técnica de Imunodifusão
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LOGO40 µL
soro
40 µL
antígeno
Antígeno e Anticorpo encontrando-se
em proporções ótimas
Técnica de Imunodifusão
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TESTE DE AGLUTINAÇÃO
Técnica de Imunodifusão
Testes de Aglutinação: – simples,mais sensíveis!
baratos, um pouco
Teste qualitativo ou quantitativo
Existem Vários Tipos:
a)
b)
c)
d)
Hemaglutinação de Eritrócitos
Aglutinação Bacteriana
Aglutinação Passiva
Inibição da Aglutinação (Inib. Hemaglutinação –HI)
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AGLUTINAÇÃO / HEMAGLUTINAÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Definição: testes que tem como seu ponto final a aglutinação de um
antígeno de natureza particulado (cels. procarióticas ou eucarióticas).
- Acs: aglutinina/hemaglutinina, principalmente do isótipo IgM* e IgG
Teste de aglutinação qualitativa
- podem ser pesquisados Ag ou Ac (via de regra, é o Ag)
Ex. tipagem dos grupos sanguíneos
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AGLUTINAÇÃO / HEMAGLUTINAÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Células ou partículas insolúveis + Ac = aglutinação
Ex. tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)
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AGLUTINAÇÃO / HEMAGLUTINAÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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AGLUTINAÇÃO / HEMAGLUTINAÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível
(Aglomeração dos eritrócitos na placa teste)
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FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
TESTES SOROLÓGICOS SECUNDÁRIOS
Formação de imunocomplexos em soluções
Pode ser monitorizada pela capacidade desses complexos de fixar e
consumir as proteínas do complemento
Fácil e de baixo custo
Utilizados para a detecção de respostas imunológicas contra agentes
infecciosos (Ex. histoplasmose e coccidioidomicose)
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FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
TESTES SOROLÓGICOS SECUNDÁRIOS
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VANTAGENS DO IMUNODIAGNÓSTICO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Rapidez
• Simplicidade
• Possibilidade de automação
• Armazenamento de material biológico
• Baixo custo operacional
• Oferta de kits comerciais padronizados
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APLICAÇÕES DO IMUNODIAGNÓSTICO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
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Diagnóstico presuntivo e diferencialDiferenciação de fases da doença
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DiagnósticoDiagnóstico
Diagnóstico
dede
de
alergiasdoenças autoimunes
imunodeficiências congênitas
– Seleção de doadores de sangue
– Seleção de doadores de órgãos para enxertos– Dosagens hormonais
- Prognóstico da doença
10 –Avaliação da eficácia da terapêutica instituída11 –Avaliação da imunidade específica (vacinação)
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– Pesquisa de antígenos em células ou tecidos– Pesquisas epidemiológicas
- Pesquisa básica e aplicada
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Obrigado!
REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE