Modelagem preditiva do crescimento/morte de Saccharomyces...

VERÔNICA ORTIZ ALVARENGA

Engenheira de Alimentos

Orientadora: Profª Pilar Rodriguez de Massaguer, Ph D

Campinas – SP

8 de julho de 2008

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA DE ALIMENTOS

Modelagem preditiva do crescimento/morte de

Saccharomyces cerevisiae em co-cultura com

Lactobacillus fermentum em mosto de caldo de cana-

de-açúcar

Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos

da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do grau de

Mestre em Ciência de Alimentos

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA

BIBLIOTECA DA FEA – UNICAMP

Titulo em inglês: Predictive modeling growth/death of Saccharomyces cerevisae in coculture with Lactobacillus fermentum in sugar cane must

Palavras-chave em inglês (Keywords): Saccharomyces cerevisae, Lactobacillus fermentum,Alcoholic fermentation, Predictive

microbiology, Coculture Titulação: Mestre Ciência de Alimentos Banca examinadora: Pilar Rodriguez de Massaguer Fumio Yokoya Gláucia Maria Falcão Aragão Data de defesa: 08/07/2008 Programa de Pós Graduação: Programa em Ciência de Alimentos

Alvarenga, Verônica Ortiz Al86 Modelagem preditiva do crescimento/morte de Saccharomyces

cerevísiae em co-cultura com Lactobacillus fermentum em mosto de caldo de cana-de-açucar / Verônica Ortiz Alvarenga. -- Campinas, SP: [s.n.], 2008.

Orientador: Pilar Rodriguez de Massaguer Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas.

Faculdade de Engenharia de Alimentos 1. Saccharomyces cerevísiae. 2. Lactobacillus fermentum. 3.

Fermentação alcoólica. 4. Microbiologia preditiva. 5. Co-cultura. I. Rodriguez de Massaguer, Pilar. II. Universidade Estadual de Campinas.Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.

(cars/fea)

iii

BANCA EXAMINADORA

Profª Pilar Rodriguez de Massaguer, PhD (FEA/UNICAM P)

orientadora

Prof. Dr. Fumyo Yokoya (FEA/UNICAMP)

membro

Profª. Drª. Gláucia Maria Falcão Aragão (UFSC)

membro

Prof. Dr. Wilmer Edgard Luera Peña (CCA/UFES)

suplente

Profª. Drª. Lúcia Regina Durrant (FEA/UNICAMP)

suplente

iv

A minha família dedico

v

ACASO

"Cada um que passa em nossa vida, passa sozinho, pois cada pessoa é única

e nenhuma substitui outra. Cada um que passa em nossa vida,

passa sozinho, mas não vai só nem nos deixa sós.

Leva um pouco de nós mesmos, deixa um pouco de si mesmo.

Há os que levam muito, mas há os que não levam nada.

Essa é a maior responsabilidade de nossa vida, e a prova de que duas almas

não se encontram ao acaso. "

(Antoine de Saint-Exupéry)

" Tu te tornas eternamente responsável por aquilo q ue cativas"

(Antoine de Saint-Exupéry)

vi

Agradecimentos

A Deus pela onipotência.

Aos meus pais, Wenner e Marina, pelo dom da vida, pois sem vocês não estaria

aqui hoje.

Aos meus irmãos, Neto e Ana Luisa, pela alegria da convivência, com vocês

aprendo a cada dia.

Aos meus avós, Washington e Longina (In memorian), vocês que sempre

acreditaram e me incentivaram, e que hoje não estão aqui presentes fisicamente,

mas partilham desta vitória.

À minha avó Izabel Cristina, não tenho palavras para agradecer os seus

ensinamentos durante toda a minha vida escolar, e hoje vovó a senhora pode

compartilhar este momento comigo, pois sem a senhora não estaria aqui.

Ao tio Décio, muito obrigada por acretidar em mim.

Tio Nestor e tia Solange, vocês são muitos importantes para mim, e podem hoje

compartilhar de mais esta vitória comigo, sem vocês não estaria aqui.

À você Vínicius, tenho imensa gratidão, pois você aceitou a nossa distância em

função do meu sonho, hoje o destino nos separou, jamais esquecerei a sua

dedicação e carinho para comigo durante os nossos anos de convivência. Hoje

Deus nos reservou caminhos diferentes, mas estes caminhos são para a nossa

felicidade. A você muito obrigada!

A minha eterna mestre Valéria, pois foi você que me ensinou os primeiros passos

da microbiologia, desta forma, aprendi a amar esta ciência.

A Professora Pilar, minha gratidão, pelo seu voto de confiança, espero que tenha

correspondido as suas expectativas.

A Clélia pelo incentivo e credibilidade nos meus anos de graduação, muito

obrigada.

vii

A Patricia pelo incentivo.

As minhas professoras da graduação, Maria Isabel e Rosário, pelo incentivo e pela

amizade durante os anos da faculdade.

A Luciana, minha companheira de república e amiga de todas as horas, que nos

adotamos como irmãs, com você passei muitos momentos de alegria e tristeza,

todos eles especiais!!!

A Alessandra “mãe”, como o próprio apelido diz, me adotou. A você Ale não tenho

palavras para agradecer!!!!

A Ana e o Zedu, hoje também a Laís, meus grandes amigos, como vocês foram

importantes durante este período. Os momentos porpetagem dos fins de semana,

os passeios e as escapadinhas depois do trabalho para uma cervejinha, à vocês

só tenho a agradecer!!! Serão para sempre meus amigos!!!

Ao Anderson, meu companheiro de trabalho dos fins de semana e meu grande

amigo, como eram engraçadas e produtivas nossas longas conversas!!! Muito

obrigada pela oportunidade de conviver com você!!

A minha amiga Fran, com o nosso pouco tempo de convivência, você se tornou

essencial para os meus dias de trabalho!!!!

A minha amiga Andréia, sem você boa parte dos meus experimentos não teria

dado certo!!! Ao nosso companherismo dos finais de semana, das nossas aulas de

inglês e de tudo que passamos neste tempo de convivência.

Ao Sal você sempre com a sua implicância, tornave os meus dias de trabalho mais

divertidos!!! Muito Obrigada.

A Maricy pela nossa convivência, com você aprendi muitas coisas!!

Aos meus companheiros de laboratório, Cristiana, Márcio, Aline, Alline, Ana

Paula, Emerson, Cristina, Fernanda, Rafael e Kethlen.

Ao Jonas pelo fornecimento da matéria-prima para os experimentos, e também,

pelas dicas sobre fermentação alcóolica.

viii

Ao Wilmer pelos primeiros ensinamentos de microbiologia preditiva, e hoje pelo

prazer de tê-lo em minha banca examinadora.

A Aninha, você sempre brava, porém disposta a nos ajudar!!!

A Eli sem você o nosso trabalho seria impossível!!! Você sempre disposta a nos

ajudar!!!

A Norma muito obrigada pelos “empréstimos”, que eram essenciais para o nosso

trabalho.

Ao professor José Luiz, pelos empréstimos dos equipamentos. E também pelas

boas risadas durante o estágio docente!!! Foi de grande valia esta experiência.

A professora Lúcia Durrant, pelo empréstimo do cromatografo, e por ter me

acolhido em seu laboratório.

A Camila, foi um anjo, que Deus colocou em meu caminho.

A Fapesp pelo bolsa concedida.

A Danisco pela doação do Natamax®.

A professora Gláucia Aragão e o professor Fumio, membros da banca

examinadora, pelas correções e sugestões.

Ao Alysson pelos ensinamentos sobre Matlab, e pela paciência.

A todos que não foram citados, porém estão guardados em minha mente e meu

coração.

Aos que de alguma forma criaram empecilhos e dificuldades, fizeram críticas

durante a confecção deste trabalho, a vocês só tenho a agradecer, pois me

fizeram crescer e superar vários obstáculos me tornando uma pessoa mais forte.

ix

SÚMARIO

Resumo.................................................................................................................xxi

Abstract ............................................................................................................... xxiv

INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

2. Objetivos .......................................................................................................... 3

3. Revisão de literatura ........................................................................................ 5

3.1. Aspectos mercadológicos ......................................................................... 5

3.2. Características das leveduras................................................................. 13

3.3. Fermentação alcoólica ............................................................................ 18

3.4. Contaminantes do processo de produção de etanol ............................... 21

3.5. Características morfológicas e citológicas de Lactobacillus fermentum.. 24

3.6. Influência dos contaminantes no processo de fermentação alcoólcia .... 26

3.7. Modelagem do crescimento da levedura em bioprocessos .................... 30

3.8. Microbiologia preditiva ............................................................................ 32

3.9. Planejamento experimental para modelagem preditiva .......................... 32

3.9.1. Desenho composto central .................................................................. 34

3.10. Coleta de dados experimentais para a construção dos modelos

preditivos ........................................................................................................... 34

3.11. Influência do inóculo nos parâmetros de crescimento dos

microrganismos ................................................................................................. 36

3.12. Modelagem matemática ...................................................................... 38

3.12.1. Parâmetros de crescimento ............................................................. 39

3.12.1.1. Tempo de adaptação (λλλλ).................................................................. 39

3.12.1.2. Taxa específica de crescimento (µ) ................................................. 40

3.12.1.3. População máxima (Rg) .................................................................. 41

3.13. Modelagem primária............................................................................ 41

3.13.1. Modelo de Gompertz Modificado ..................................................... 42

3.13.2. Modelo de Baranyi ........................................................................... 43

3.14. Modelagem preditiva em co-cultura..................................................... 45

3.15. Modelo Quase-químico ....................................................................... 48

x

3.16. MODELAGEM SECUNDÁRIA............................................................. 51

3.17. Validação de modelos ......................................................................... 53

3.17.1. Fator de bias .................................................................................... 53

3.17.2. Fator de exatidão ............................................................................. 54

3.17.3. Erro do quadrado médio (MSE) ....................................................... 54

4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 56

4.1. Seleção das linhagens ............................................................................ 56

4.2. Delineamento experimental .................................................................... 56

4.2.1. Variáveis de controle do processo fermentativo.................................. 58

4.2.1.1. Temperatura do processo fermentativo ........................................... 58

4.2.1.2. Nível de inóculo de Lactobacillus fermentum................................... 59

4.3. Inoculação............................................................................................... 59

4.4. Preparo do inóculo .................................................................................. 60

4.4.1. Pré-inóculo da levedura (Saccharomyces cerevisiae)......................... 60

4.4.2. Pré-inóculo do lactobacilo (Lactobacillus fermentum) ......................... 61

4.4.3. Ajuste do inóculo da levedura ............................................................. 62

4.4.4. Ajuste do inóculo do lactobacilo .......................................................... 63

4.5. Coleta de amostras do processo fermentativo........................................ 64

4.6. Avaliação da viabilidade das células de levedura ................................... 65

4.7. Avaliação do crescimento ....................................................................... 66

4.7.1. Contagem das células da S. cerevisiae............................................... 66

4.7.2. Contagem das células do L. fermentum .............................................. 66

4.8. Medição do pH do mosto ........................................................................ 67

4.9. Avaliação da concentração de ácido láctico, ácido acético, etanol, frutose,

glicose, glicerol .................................................................................................. 67

4.9.1. Preparo da fase móvel ........................................................................ 68

4.9.2. Condicionamento da coluna ................................................................ 69

4.9.3. Curva padrão da glicose...................................................................... 69

4.9.4. Curva padrão frutose........................................................................... 69

4.9.5. Curva padrão etanol ............................................................................ 70

4.9.6. Curva padrão glicerol .......................................................................... 70

xi

4.9.7. Curva padrão ácido láctico .................................................................. 70

4.9.8. Curva padrão ácido ácetico................................................................. 71

4.9.9. Análise das amostras .......................................................................... 71

4.10. Modelagem preditiva ........................................................................... 72

4.10.1. Modelagem primária ........................................................................ 72

4.10.2. Modelo quase-químico..................................................................... 72

4.10.3. Modelagem secundário.................................................................... 73

4.10.3.1. Modelagem de superficie de resposta ............................................. 73

4.10.3.2. Modelo de Davey (1989) e Raíz quadrada ..................................... 74

5. Resultados e Discussão................................................................................. 75

5.1. Curvas experimentais de crescimento e declino de Saccharomyces

cerevisiae e Lactobacillus fermentum ................................................................ 75

5.2. Modelagem primária ............................................................................... 77

5.3. Índice de viabilidade da levedura (IV) ..................................................... 97

5.3.1 Efeitos da temperatrura de fermentação e nível de inóculo de L.

fermentum no índice de viabilidade da levedura em cultura mista .................. 101

5.4. Modelagem quase química ................................................................... 103

5.5. Modelagem secundária......................................................................... 114

5.5.1 Efeitos da temperatura e nível de inóculo de L. fermentum sobre a

concentração máxima de etanol ...................................................................... 114

5.5.2 Efeito da temperatura e nível de inóculo de L. fermentum µ, λ e Rg. 116

5.5.3 Análises da produção de metabólitos (etanol, glicerol, ácido láctico e

ácido acético) e açúcares (glicose).................................................................. 120

6. Conclusões .................................................................................................. 122

7. Referências bibliográficas ............................................................................ 124

Anexo A............................................................................................................... 141

Anexo B............................................................................................................... 147

Anexo C .............................................................................................................. 149

Curvas de crescimento/declínio geradas pelo modelo quase-químico................ 152

Anexo D .............................................................................................................. 196

Anexo E............................................................................................................... 199

xii

Lista de figuras Figura 1. Seqüência de reações enzimáticas pela fermentação alcoólica de

carboidratos endógenos (glicogênio e trealose) ou exógenos (sacarose e

maltose), conduzida por Saccharomyces cerevisiae (Lima et al, 2001)......... 19

Figura 2. Curva padrão do crescimento bacteriano a temperatura constante....... 35

Figura 3. Quadrado Médio da Câmara de Neubauer e sentido de contagem dos

quadrados médios.......................................................................................... 62

Figura 4. Determinação da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno.

As células coradas de azul são células mortas, enquanto as incolores são

células viáveis ................................................................................................ 65

Figura 5. Sistema de filtração a vácuo para a fase móvel. .................................... 68

Figura 6. Curvas experimentais de crescimento para o experimento 04 (31S6L7),

para as culturas mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum em mosto de

cana-de-açúcar. ............................................................................................. 76

Figura 7. Curvas de crescimento experimento 01(25S6L3) de L.fermentum e S.

cerevisiae , em culturas puras e culturas mistas. ........................................... 79

Figura 8. Curvas de crescimento experimento 02 (31S6L3) de L.fermentum e S.

cerevisiae, em culturas puras e culturas mistas............................................. 81



Figura 10. Curvas de crescimento experimento 04 (31S6L7) L.fermentum e S.






Figura 13. Curvas de crescimento do experimento 07 (28S6L1) de L.fermentum e

S. cerevisiae , em culturas puras e culturas mistas. ...................................... 87

Figura 14. Curvas de crescimento do experimento 08 (28S6L8) de L.fermentum e

S. cerevisiae, em culturas puras e culturas mistas. ....................................... 89

xiii



Figura 16. Índice de viabilidade de S.cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum

experimento 07(28S6L1), 08 (28S6L8) e 09 (28S6L5) e levedura em cultura

pura (28S6L0). ............................................................................................... 98

Figura 17. Índice de viabilidade de S.cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum

para o experimento 01 (25S6L3) e 03 (25S6L7) e levedura em cultura pura

(25S6L0). ....................................................................................................... 99

Figura 18. Índice de viabilidade de S. cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum

para o experimento 02(31S6L3) e 04(31S6L7) e levedura em cultura

(31S6L0). ....................................................................................................... 99

Figura 19. Índice de viabilidade de S. cerevisiae, em cultura pura em diferentes

temperaturas para os experimentos 01 (25S6L0), 02(31S6L0),05(24S6L0),

06(32S6L0), 09(28S6L0).............................................................................. 100

Figura 20. Efeitos da temperatura de fermentação e nível de inóculo de L.

fermentum no índice de viabilidade da levedura em cultura mista............... 102

Figura 21. Modelo quase-químico para o L.fermentum em cultura pura para o

experimento 05 ............................................................................................ 105

Figura 22. Modelo quase-químico para o L.fermentum em cultura pura para o

experimento 07 ............................................................................................ 105

Figura 23. Modelo quase-químico para o L.fermentum em cultura pura para

experimento 08 ............................................................................................ 106

Figura 24. Modelo quase-químico para o experimento 09, L.fermentum em cultura

pura.............................................................................................................. 107

Figura 25. Modelo quase-químico para a S. cerevisiae em cultura pura(28S6L0)

..................................................................................................................... 108

Figura 26. Modelo quase-químico para a S. cerevisiae em cultura (31S6L0) ..... 109

Figura 27. Modelo quase-químico para o S. cerevisiae em cultura mista (31S6L7)

..................................................................................................................... 110

Figura 28. Modelo quase-químico para o L.fermentum em cultura mista (28S6L1)

..................................................................................................................... 110

xiv

Figura 29. Efeito da temperatura e concentração de L. fermentum sobre a

concentração máxima de etanol em função da temperatura e nível e inóculo

..................................................................................................................... 116

Figura 30. Efeito da temperatura de fermentação e nível de inóculo de L.

fermentum sobre o logarítmo da população máxima do lactobacilo em cultura

mista............................................................................................................. 119

Figura 31. Curva de evolução da produção de etanol, ácido láctico, ácido acético e

glicerol; consumo de glicose; curva de crescimento do lactobacilo e levedura

em cultura mista para o experimento 07 (28S6L1). ..................................... 120

Figura 32. Curva de crescimento para o experimento 01 (25S6L3), para as

culturas mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum. ............................. 141

Figura 33.Curva de crescimento para o experimento 02 (31S6L3) para as culturas

mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum .......................................... 142

Figura 34. Curva de crescimento experimento 03 (25S6L7), para as culturas

mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum ........................................... 142

Figura 35.Curva de crescimento experimento 05 (24S6L5), para as culturas mistas

e puras de S. cerevisiae e L.fermentum....................................................... 143

Figura 36.Curva de crescimento experimento 06(32S6L5), para as culturas mistas

e puras de S. cerevisiae e L.fermentum...................................................... 143




mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum ........................................... 144


mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum .......................................... 145


e puras de S. cerevisiae e L.fermentum....................................................... 145



Figura 42. Modelo quase-químico para o L.fermentum cultura pura experimento 01

(25S0L3) ...................................................................................................... 152

xv

Figura 43. Modelo quase-químico para o L.fermentum em cultura pura

experimento 02 (31S0L3)............................................................................. 153


experimento 03 (25S0L7)............................................................................. 154


experimento 04 (31S0L7)............................................................................. 155


experimento 05 (24S0L5)............................................................................. 156


experimento 06 (32S0L5)............................................................................. 157


experimento 07 (28S0L1)............................................................................. 158


experimento 08 (28S0L8)............................................................................. 159


experimento 09 (28S0L5)............................................................................. 160


experimento 10 (28S0L5)............................................................................. 161


experimento 11 (28S0L5)............................................................................. 162

Figura 53. Modelo quase-químico para a S. cerevisiae em cultura pura

experimento 01 (25S6L0)............................................................................. 163


experimento 02 (31S6L0)............................................................................. 164

Figura 55. Modelo quase-químico para a S. cerevisiae em cultura puraexperimento

03 (25S6L0) ................................................................................................. 165


experimento 04 (31S6L0)............................................................................. 166


experimento 05 (24S6L0)............................................................................. 167

xvi


experimento 06 (32S6L0)............................................................................. 168


experimento 07 (28S6L0)............................................................................. 169


experimento 08 (28S6L0)............................................................................. 170


experimento 09 (28S6L0)............................................................................. 171


experimento 10 (28S6L0)............................................................................. 172


experimento 11 (28S6L0)............................................................................. 173

Figura 64. Modelo quase-químico para a L.fermentum em cultura mista

experimento 01 (25S6L3)............................................................................. 174

Figura 65. Modelo quase-químico para a S. cerevisiae em cultura mista

experimento 01 (25S6L3)............................................................................. 175


experimento 02 (31S6L3)............................................................................. 176


experimento 02 (31S6L3)............................................................................. 177


experimento 03 (31S6L3)............................................................................. 178


experimento 03 (31S6L3)............................................................................. 179


experimento 04 (31S6L7)............................................................................. 180


experimento 04 (31S6L7)............................................................................. 181


experimento 05 (24S6L5)............................................................................. 182

xvii


experimento 05 (24S6L5)............................................................................. 183


experimento 06 (32S6L5)............................................................................. 184


experimento 06 (32S6L5)............................................................................. 185


experimento 07 (28S6L1)............................................................................. 186


experimento 07 (28S6L1)............................................................................. 187


experimento 08 (285S6L8)........................................................................... 188


experimento 08 (28S6L8)............................................................................. 189


experimento 09 (28S6L5)............................................................................. 190


experimento 09 (28S6L5)............................................................................. 191


experimento 10 (28S6L5)............................................................................. 192


experimento 10 (28S6L5)............................................................................. 193


experimento 11 (28S6L5)............................................................................. 194


experimento 09 (28S6L5)............................................................................. 195

Figura 86. Curva padrão para a frutose .............................................................. 196

Figura 87. Curva padrão para a glicose .............................................................. 196

Figura 88. Curva padrão para o etanol................................................................ 197

Figura 89. Curva padrão para o glicerol .............................................................. 197

Figura 90. Curva padrão para o ácido láctico...................................................... 198

xviii

Figura 91. Curva padrão para o ácido ácetico..................................................... 198

xix

Lista de tabelas

Tabela 1. Desempenho do setor sucroalcooleiro no período de 2000 a 2007 ...... 10

Tabela 2.Exportações brasileiras de etanol .......................................................... 11

Tabela 3. Composição média da cana-de-açúcar ................................................. 11

Tabela 4. Principais constituintes de cana-de-açúcar ........................................... 12

Tabela 5. Resumo do mecanismo e das equações para o modelo quase-químico

....................................................................................................................... 50

Tabela 6. Desenho do planejamento experimental com valores codificados e

(reais). ............................................................................................................ 58

Tabela 7.Equivalência dos padrões McFarland.................................................... 63

Tabela 8. Resultados do teste Tukey para os parâmetros de crescimento do L.

fermentum e S. cerevisiae gerados pelo modelo de Baranyi e Roberts (1994).

....................................................................................................................... 92

Tabela 9. Parâmetros de crescimento do Saccharomyces cerevisiae e

Lactobacillus fermentum em cultura pura, estimados pelo de Baranyi e

Roberts (1994) ............................................................................................... 93


Lactobacillus fermentum em cultura mista, estimados pelo modelo de Baranyi

e Roberts (1994) ............................................................................................ 94


Lactobacillus fermentum em cultura mista, estimados pelo modelo de

Gompertz modificado (Zwietering et al, 1991)................................................ 95


Lactobacillus fermentum em cultura pura, estimados pelo modelo de

Gompertz modificado (Zwietering et al 1991)................................................. 96

Tabela 13. Efeitos da temperatura de fermentação e nível de inóculo de L.

fermentum no índice de viabilidade da levedura em cultura mista............... 101

Tabela 14. Parâmetros gerados pelo modelo quase-químico para as culturas puras

de S. cerevisiae e L.fermentum.................................................................... 112

Tabela 15. Parâmetros gerados pelo modelo quase-químico para as culturas

mistas de S. cerevisiae e L.fermentum ........................................................ 113

xx

Tabela 16. Efeitos da temperatura e nível de inóculo para a concentração máxima

de etanol em cultura mista ........................................................................... 115

Tabela 17. Comparação dos índices de validação dos modelos secundários para a

S.cerevisiae e L. fermentum para os parâmetros µ, λ e Rg ........................ 117

Tabela 18. Efeitos da temperatura e nível de inóculo para a população máxima do

lactobacilo em cultura mista ......................................................................... 118

Tabela 19. Índice de viabilidade para a levedura em cultura mista e pura a 28oC

..................................................................................................................... 199


..................................................................................................................... 200


..................................................................................................................... 201

Tabela 22. Índice de viabilidade para a levedura em cultura pura em diferentes

temperaturas ................................................................................................ 202

xxi

RESUMO

No Brasil e em outros países, a fermentação alcoólica é realizada sem

esterilização do caldo de cana-de-açúcar que constitui um ótimo substrato para o

crescimento microbiano tornando-se, assim, inevitável à presença de

contaminantes. Estes apresentam-se como os principais responsáveis pela

redução no rendimento e produtividade da fermentação. Esta pesquisa teve por

objetivo predizer os parâmetros de crescimento (taxa de crescimento (µ), tempo

de adaptação (λ) e população máxima (Rg)) da Saccharomyces cerevisiae e

Lactobacillus fermentum, quando cultivados individualmente ou em co-cultura

através da aplicação dos modelos primários de crescimento de Baranyi & Roberts

(1994) e Gompertz modificado (Zwietering et al, 1991). Em função de variações de

temperatura (28 – 32ºC) e concentração de inóculo de L. fermentum (101 -108

UFC/mL), mantendo-se fixo o nível de inóculo de S. cerevisiae em 106 UFC/mL.

Para a modelagem primária foi ajustado, também, o modelo quase-químico. Para

a construção deste modelo, foi utilizado o software Matlab versão 7.5. A

inoculação das culturas foi realizada em mosto de cana-de-açúcar clarificado

industrialmente, e ajustado a 21.5ºBrix. O material foi tratado termicamente a

121ºC por 40 minutos e mantido congelado a –20ºC até a realização dos ensaios.

Foram adicionados 200 mL de mosto, em elernmeyeres de 500mL esterilizados.

Para o ajuste do inóculo da levedura foi realizada a contagem da suspensão em

Câmara de Neubauer e para o lactobacilo o ajuste foi realizado com o auxílio do

Densimat™ (BioMérieux, S.A., France). Os ensaios de fermentação foram

conduzidos em incubadora com agitação contínua de 120 rpm (New Brunswick

xxii

Scientific, Model G-27, U.S.A.) e temperatura controlada. Para cada ensaio

realizado com a cultura mista, foram conduzidos outros dois ensaios da mesma

forma e com o mesmo substrato para as culturas puras de S.cerevisiae e L.

fermentum. Os dados obtidos foram ajustados com o software DmFit para os

modelos de Baranyi e Roberts (1994) e Gompertz modificado (Zwietering et al

1991). Não houve diferença significativa (p<0,10) para λ, µ e Rg da levedura e

para λ e µ. No entanto, para Rg do lactobacilo houve diferença significativa entre a

cultura pura e mista. Quando a levedura atinge a fase estacionária o lactobacilo

teve sua taxa de crescimento incrementada de sua população máxima aumentou

relevantemente no final da fase estacionária da levedura. O modelo de Baranyi e

Roberts descreveu melhor a fase de adaptação dos microrganismos. Já o modelo

quase-químico apesar de descrever crescimento/declínio não modela

adequadamente o plateau da fase estacionária, quando ele acontece. O modelo

secundário da população máxima do lactobacilo em função da temperatura de

fermentação e nível de inóculo demonstrou que o nível de inóculo e sua interação

com a temperatura foram significativos ao nível de 10% de significância. O indice

de viabilidade da levedura pura foi afetada por mudanças na temperatura. Porém,

para a cultura mista, com o tempo de fermentação fixo (21 horas) o nível de

contaminaçao pelo lactobacilo foi altamente significante. O melhor indice de

viabilidade foi observado para L=103UFC/mL e temperatura de fermentação a

25oC. Nas condições estudadas foi observado um máximo na produção de etanol

quando a temperatura de fermentação foi 28oC e o nível de inóculo de lactobacilo

de 105UFC/mL. O efeito quadrático da temperatura de fermentação foi mais

xxiii

significativo (p<0,10) que o nível de contaminação do lactobacilo na produçao

máxima de etanol. Os modelos determinados neste estudo poderão servir para

posterior otimização de processos fermentativos na indústria sucroalcooleira.

xxiv

ABSTRACT

In Brazil and other countries around the World, the sugar cane must fermentation

for alcohol production is carried out without sterilization of the sugar cane juice,

being an excellent medium for the multiplication of undesirable contaminants.

Among the contaminants of sugar cane must, Lactobacillus fermentum can be

considered one of the most relevant being able to cause the flocculation of yeasts

and to reduce ethanol yield and productivity of the fermentation. This research

aimed to predict the growth parameters lag time (λ), specific growth rate (µ) and

maximum population (Rg) of Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus

fermentum in individual and cocultures. Predictive modeling of microorganisms

growth in co-culture and pure culture was done through the application of primary

growth models of Baranyi and modified Gompertz, varying temperature (24 –

32ºC) and inoculum concentration of L. fermentum (101 – 108 CFU/mL) with a fixed

inoculums level of S. cerevisiae (106 CFU/mL). For the primary modeling it was

also, adjusted the quase-chemical model for the construction of this model Matlab

software version 7.5 was used. The inoculation of the cultures was carried out in

sugar cane must industrially clarified and adjusted to 21.5ºBrix, heat treated must

(121ºC per 40 minutes) were inoculated with the yeast and lactobacilli, the

adjustment of the inoculum was done respectively by counting the suspension in

Neubauer chamber and Densimat (BioMérieux, S.a., France). For each assay

carried out with the mixed culture, two others tests with pure culture were done for

comparison of growth parameters. The fermentation assays were conducted in an

incubator with continuous agitation (120rpm) (New Brunswick Scientific, Model G-

xxv

27, U.S.A.) and controlled temperature. From the data obtained, the growth

parameters were determined through the adjustment of the data with DMFIT

software for Baranyi and Roberts and Modified Gompertz. No siginificant diference

(p<0.10) was found for λ,µ and Rg for the yeast in pure culture neither for λ and µ

for Lactobacillus fermentum, but for lactobacilli Rg was significantly different for

pure a coculture. When the yeast reached the stationary phase the lactobacilli

growth rate was increased and its stationary phase it was observed after ward.

Baranyi and Roberts’s model best described lag phase was expected. The quasi-

chemical model even though it describes growth/decline it does not model the

stationary plateau. The secondary model for the maximum population of the

lactobacilli as function of fermentation temperature and inocullum level showed that

this last variable was significant and its interaction with temperature (p< 0.10). For

the pure culture temperature was significant on the viability index. But for mixed

culture for a fixed fermentation time (21h) the lactobacilli level of contamination

was highly significant. Best IV was observed for L=103UFC/mL and T=25oC. When

the maximum ethanol production was modeled for T, L independent variables. The

temperature was significant a maximum was observed at T=28oC, L=105UFC/mL.

These two models are practical application for the alcoholic fermentation industry.

1

INTRODUÇÃO

O Brasil é, mundialmente, o país com a maior tecnologia de processo da

fermentação alcoólica para produção de bioetanol e o produto possui mercado

interno garantido, devido ao álcool anidro adicionado à gasolina, ser obrigatório

por lei nacional em substituição ao chumbo, ou hidratado como combustível. Um

dos desafios atuais do país é aumentar a oferta de álcool combustível, pois a

agroindústria alcooleira, juntamente com a aguardente, representa um

considerável gerador econômico que movimenta 2% do Produto Interno Bruto

(PIB), algo em torno de 39 bilhões de reais por ano (Oliveira & Vasconcelos,

2006).

Com a crise do petróleo nos anos 70, o governo brasileiro desenvolveu o

Programa Nacional do Álcool (Proálcool), como forma alternativa à substituição da

gasolina (Andrietta et al, 2006), assim sendo o Brasil tornou-se o primeiro país do

mundo a desenvolver um programa de combustível alternativo. Nasceu então o

bioetanol, um combustível obtido a partir da fermentação do caldo de cana-de-

açúcar, melaço ou ambos (Andrietta et al, 2006).

Como toda a produção de álcool ocorre por via fermentativa, é

fundamental, o conhecimento do processo, que tem sido constantemente

aprimorado (Nobre, 2005).

Os processos industriais de produção de álcool existentes no Brasil

reutilizam o fermento em ciclos fermentativos consecutivos. Durante o processo de

centrifugação, os microrganismos contaminates também são reciclados

2

juntamente com o fermento e agravam os problemas associados com a

contaminação bacteriana (Cherubin, 2003).

Dependendo do nível de contaminação bacteriana podem ser ocasionados

problemas como: deterioração do mosto, aumento da floculação, redução da

viabilidade da levedura, redução na massa do fermento e a formação de produtos

indesejáveis que ocasionam consumo de sacarose e de outros nutrientes

presentes no mosto. Níveis elevados de contaminação também provocam muitos

inconvenientes como a dificuldade de centrifugação, aumento do uso de ácido no

tratamento, aumento do tempo de fermentação e elevação de açúcares não

fermentados que levam a reduções no rendimento da fermentação alcoólica.

Em levantamento realizado em usinas do estado de São Paulo, houve

predominância de presença de bactérias lácticas como contaminates da

fermentação alcóolica. Estas bactérias são encontradas em diversos nichos

ecológicos, sendo bem resistentes a meios ácidos, especialmente os

Lactobacillus. Em diversos habitats, naturais e artificiais, se destacam aqueles em

que as bactérias convivem com leveduras em condições de fermentação

anaeróbica, como no caso da fermentação alcoólica. Como causam prejuízos

consideráveis ao processo, essa contaminação bacteriana deve ser monitorada e

os teores de ácido láctico poderiam ser utilizados para determinar o nível desta

contaminação (Costa, 2006).

3

2. OBJETIVOS

Os objetivos da presente pesquisa foram:

• Construir das curvas experimentais de crescimento e declínio da

Saccaharomyces cerevisae e Lactobacillus fermentum;

• Avaliar a influência do cultivo do Lactobacillus fermentum quando

em co-cultura com Saccharomyces cerevisae, sobre os

parâmetros de crescimento, tanto da levedura quanto do

lactobacilo;

• Ajustar os dados de crescimento dos microrganismos em culturas

pura e co-cultura, pelo modelo de crescimento de Baranyi e

Roberts (1994) e Gompertz modificado (Zwietering et al 1991),

calculando tempo de adaptação, velocidade de crescimento,

população máxima e tempo de geração;

• Avaliar o efeito da temperatura e do nível de inóculo de

lactobacilo no índice de viabilidade da levedura;

• Ajuste do modelo Quase-Químico aos dados experimentais de

crescimento/declínio dos microrganismos;

• Quantificar dos compostos (ácido láctico, glicerol e etanol)

excretados pelos microrganismos;

• Quantificar dos açúcares presentes no mosto de cana-de-açúcar

(frutose e glicose);

4

• Construção de modelos secundários para descrever o efeito da

temperatura e nível de inóculo nos parâmetros primários de

crescimento dos microrganismos (S. cerevisiae e L. fermentum).

5

3. REVISÃO DE LITERATURA

PARTE I: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

3.1. Aspectos mercadológicos

Durante milhões de anos, o etanol tem sido produzido para o consumo

humano, além de bebidas alcoólicas concentradas mediante destilação. O álcool

para uso como matéria-prima química é produzido por fermentação, desde o início

da microbiologia industrial. No entanto, era obtido durante muitos anos através de

procedimentos químicos, como na hidratação catalítica do etileno (Crueger &

Cureger, 1993).

No Brasil, as indústrias de açúcar e de álcool estiveram sempre

intimamente ligadas, desde o tempo do descobrimento. Deduz-se que a produção

de álcool iniciou na Capitania de São Vicente, porque nela foi montado o primeiro

engenho de açúcar do País, após a vinda das primeiras mudas de cana-de-

açúcar, trazidas da ilha da Madeira, em 1532. Certamente, transformava-se o

melaço residual da fabricação do açúcar em cachaça e, diretamente da garapa

fermentada produzia-se a aguardente. Por séculos, as bebidas destiladas foram o

único álcool produzido. A indústria de álcool industrial desenvolveu-se na Europa,

em meados do século XIX; no último quarto desse século iniciou-se a produção de

etanol no Brasil, com as sobras de melaço da indústria de açúcar, que ampliava

sua capacidade produtiva (Lima, 2001).

Em 1929, a grande crise internacional colocou em xeque as economias de

todos os países e, no Brasil, a indústria açucareira não ficou a salvo. Sobrava

açúcar e cana e faltavam divisas para a aquisição de combustível líquido. A

6

primeira destilaria de álcool anidro foi instalada e o Governo Federal, em 1931,

estabeleceu a obrigatoriedade da mistura de 5% de etanol à gasolina (Decreto

19.717), como medida de economia na importação de combustível e para amparar

a lavoura canavieira. Por muitos anos, não houve álcool suficiente para misturar a

todo o combustível consumido. Durante a guerra de 1939 a 1945, faltou gasolina e

fez-se necessário substituí-lo por gasogênio ou álcool. Terminada a guerra, voltou

a importação de gasolina e o combustível alternativo perdeu sua importância.

Entretanto, continuou-se a misturar o etanol à gasolina em larga escala (Lima,

2001).

Até os anos de 1975, quase não se moia cana para a produção de álcool,

este era elaborado nas destilarias anexas de forma secundária nesse complexo

agroindustrial. Muitas vezes, era preferível produzir melaço e comercializá-lo a

produzir álcool (Ramos & Souza,2005).

A importância do etanol, nessa cadeia produtiva, cresceu com o Programa

Nacional do Álcool (Proálcool), que lhe garantiu preço e mercado. O Proálcool

surge para a economia nacional, como uma proposta energética aos derivados de

petróleo e, no plano setorial, como uma alternativa aos empresários que haviam

aumentado a capacidade das unidades produtivas.

Isso ocorreu devido à crise internacional do petróleo que se deflagrou em

1974, fazendo com que se iniciasse, no Brasil, uma nova fase na produção de

álcool. Na busca de alternativas para combustível líquido, o álcool adquiriu uma

importância sem paralelo. Dos 700 milhões de litros por ano, em pouco tempo, a

indústria passou a produzir 15 bilhões de litros, para abastecer uma frota de mais

de 4 milhões de automóveis, que se movem com álcool puro e também, para

7

misturar-se com a gasolina usada no País. Com a utilização desse combustível

alternativo, ampliou-se o parque canavieiro, fez-se a modernização das destilarias,

a instalação de unidades autônomas, a criação de grande número de empregos

diretos e indiretos e uma rápida e importante evolução na construção de motores

para esse combustível. O plano de desenvolvimento da produção de álcool no

Brasil, denominado de Proálcool, não foi uma solução improvisada para a crise de

combustíveis; não foi mais do que a continuidade e evolução de um programa de

uso do álcool como combustível, iniciado em 1931 (Lima, 2001).

A iniciativa da implantação por parte do Estado de um programa de

prevenção de crise no setor açucareiro partiu em junho de 1975 dos Ministérios da

Indústria e do Comércio e de Minas e Energia. No centro da proposta conjunta

está a proteção do setor açucareiro de novas quedas nos preços, a manutenção

da ocupação da mão-de-obra no campo e a utilização produtiva dos altos

investimentos de expansão e da correspondente produção de equipamentos. Os

aspectos de política energética ainda desempenhavam um papel secundário, na

medida em que o álcool de cana só deveria ser produzido para ser adicionado à

gasolina em maior escala quando os preços do açúcar estivessem baixos. O

objetivo da proposta era, portanto, em primeiro lugar o aproveitamento da

capacidade produtiva existente, ou seja, das destilarias, dos equipamentos para a

produção de álcool, cuja capacidade produtiva estava sendo aproveitada em

apenas 50%, e dos equipamentos para a produção de açúcar através da

construção de instalações anexas para a produção de álcool (Borges, 1988).

Com a implantação do Proálcool o Brasil aumentou a capacidade dos

equipamentos e dos rendimentos, possibilitou maior aproveitamento de produtos e

8

subprodutos da cana-de-açúcar, além do fato da usina de açúcar e álcool ganhar

a definição de uma unidade produtora de energia e alimentos, sendo que existem

usinas que já oferecem produtos como: grãos, sementes de soja, açúcar, açúcar

líquido, álcool hidratado, álcool anidro, óleo fúsel, bagaço, metano, eletricidade. O

setor sucroalcooeiro viveu em 1998 um ano tumultuado de sua história. Começou

a safra carregando estoques de álcool, da ordem de 2 bilhões de litros,

concentrados em São Paulo, considerado o maior produtor do país e contando

com o maior número de destilarias modernas. O tumulto aumentou quando o

governo adiou até o mês de novembro a liberação dos preços do álcool hidratado

e da cana, antes prevista para maio desse mesmo ano. Isso ocorreu depois de

várias usinas, na iminência da desregularização do mercado, terem contratado a

venda de álcool com as distribuidoras, para entrega futura, a preços inferiores aos

de tabela que estava em vigor (Globo, rural, 1998).

A evolução na produção da cana-de-açúcar e do etanol no Brasil no período

de 2000 a 2007 está apresentada na tabela 1. Neste período, a produção passou

326,1 toneladas para aproximadamente 456 toneladas em 2007, representando

um aumento 40% na produção de cana-de-açúcar, e conseqüente aumento na

produção de etanol. Na safra 2007/08, há previsão de aumento de 16% na

quantidade da cana-de-açúcar a ser destinada à produção de etanol, em relação à

safra de 2006/07 (Strapasson, 2007). Esta indústria ostenta um dos maiores

índices de empregabilidade nacional, o setor absorve um contingente de mão-de-

obra que se aproxima de 1,5 milhões de pessoas e movimenta R$12,7 bilhões por

ano, entre faturamentos diretos e indiretos, o que corresponde a 2,3% do PIB

brasileiro (Cobra, 2001).

9

O panorama internacional ressalta os ganhos de competitividade da

produção brasileira no mercado mundial, pois nos Estados Unidos o gasto de

produção de um galão de álcool vai de US$1,05 a US$1,20, na Europa é de

US$2,00 a US$2,20 enquanto no Brasil fica entre US$0,57 a US$0,64 (Porto,

2005). O objetivo do governo brasileiro é transformar o etanol em uma grande

“commodity” internacional, em conjunto com outros países (Stapasson, 2007). Na

tabela 02 está apresenta o panorama de exportação do bioetanol no período de

1997 a 2006.

10

Tabela 1. Desempenho do setor sucroalcooleiro no período de 2000 a 2007 ANO - SAFRA 2000/01 2001/02 2002/03 2003/04 2004/05 2005/06 2006/07*

PRODUÇÃO DE CANA PARA TODOS OS USOS

(em mihões de ton) (1)

326,1 344,3 363,7 389,9 416,6 421,8 456,0

ÁREA PLANTADA

(em mihões de ha) (1) 4,88 5,02 5,10 5,50 5,69 5,87 6,16

CANA DESTINADA A FABRICAÇÃO DE

AÇÚCAR E ÁLCOOL (em milhões de ton) (2) 254,9 292,3 316,1 357,3 381,4 382,4 425,0

PRODUÇÃO DE AÇÚCAR POR

TONELADA DE CANA (em quilos) 132,8 131,5 137,8 139,4 137,5 137,7 138,0

PRODUÇÃO DE AÇÚCAR POR HECTARE

( em ton) 8,88 9,02 9,83 9,89 10,07 10,18 9,83

PRODUÇÃO DE ÁLCOOL POR

TONELADA DE CANA (em litros) 78,3 77,5 81,2 82,2 80,8 81,2 81,6

PRODUÇÃO DE ÁLCOOL POR HECTARE

( em mil litros) 5,23 5,32 5,80 5,83 5,92 5,75 6,00

Fonte: * Prognóstico MAPA 2006/07 e IBGE 2066/07 (1) Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - IBGE (2) Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA.

11

Tabela 2.Exportações brasileiras de etanol

ANO Milhões de US$ LITROS (bilhões) Preço médio US$/m³

1997 54 0,146 370,09 1998 36 0,118 301,21 1999 66 0,407 161,70 2000 35 0,227 153,07 2001 92 0,346 266,57 2002 169 0,759 222,86 2003 158 0,757 208,56 2004 498 2,408 206,68 2005 766 2,592 295,31 2006 1605 3,428 468,20 Fonte:MAPA, 2007

No Brasil, o açúcar é produzido a partir da cana, enquanto na Europa é

fabricado a partir da beterraba. Hoje, em nosso país, a cana é também utilizada

para a produção do álcool.

É importantíssimo um trabalho em conjunto entre a lavoura e a indústria, de

forma bem programada nas etapas de corte, escolha de variedades adequadas,

com maior teor de sacarose, e o processamento quase imediato, para evitar a

deterioração e perdas de açúcar (Coopersucar, 1987).

Basicamente, a sacarose é o principal componente (sólido) da cana-de-

açúcar, sendo indicada na tabela 03 a composição média da cana-de-açúcar e na

tabela 04 a distribuição dos vários constituintes dessa matéria-prima.

(Coopersucar, 1987)

Tabela 3. Composição média da cana-de-açúcar Composição Teor (%)

Água 65-75

Açúcares 11-18

Fibras 8-14

Sólidos Solúveis 12-23 Fonte: Coopersucar, 1987

12

Tabela 4. Principais constituintes de cana-de-açúcar Constituintes Sólidos Solúveis (%)

Açúcares 75 a 93

Sacarose 70 a 91

Glicose 2 a 4

Frutose 2 a 4

Sais 3.0 a 5.0

De ácidos inorgânicos 1.5 a 4.5

De ácidos orgânicos 1.0 a 3.0

Proteínas 0.5 a 0.6

Amido 0.001 a 0.05

Canas 0.3 a 0.6

Ceras e Graxas 0.05 a 0.15

Corantes 3 a 5

Fonte: Coopersucar, 1987

O mosto de cana de açúcar é obtido pelo esmagamento das canas nas

moendas misturado com água, tornando um substrato rico em sacarose e em

açúcares redutores e desta forma está convenientemente diluído para sofrer a

fermentação alcoólica. Segundo alguns autores a cana de açúcar libera caldo

quando submetidas a prensas sendo o resíduo prensado dos talos denominado de

bagaço. Este quando queimado, origina uma ótima fonte de energia no processo

de destilação (Crueger & Cureger, 1993)

O caldo de cana de açúcar, servindo diretamente como matéria-prima para a

fermentação, tem que ser diluído do seu teor de sólidos solúveis inicial de 16º-

16,5ºBirx para14°Brix (Rasovsky, 1973). Entretanto, para outros autores (Gava,

1998), a concentração de açúcares no mosto deve estar entre 16 a 20 °Brix. Além

disso, durante a fermentação é necessário o controle de sua densidade, acidez,

13

componentes nutritivos necessários ao crescimento das leveduras e da

temperatura de fermentação que deve ser mantida entre 28-30°C (Rasovsky,

1973; Gava, 1998). Na utilização de melaços, em alguns casos é preciso fazer sua

diluição com água. A diluição faz-se de modo contínuo, em misturadores

especiais, com freqüente supervisão para garantir as concentrações adequadas,

diluindo-se os melaços entre 15 e 25°Brix, com médi as de 18 a 20°Brix. Mostos

muito diluídos fermentam mais rapidamente e sujam menos as unidades de

destilação, mas exigem maior volume útil de fermentadores, mais espaço para

eles, mais consumo de vapor, mais água para diluição, exigem um período maior

de safra e favorecem as contaminações, além de outros inconvenientes. Por outro

lado, os muitos concentrados ocasionam maiores perdas em açúcares não

fermentados, temperaturas mais altas durante a fermentação, sujam mais os

aparelhos de destilação, e outros inconvenientes, ao lado das vantagens de

diminuírem o volume útil de dornas e o período de safra (Lima, 2001).

O caldo de cana, que apresenta rendimento perto de 80 litros de etanol por

tonelada de cana-de-açúcar, é até o presente momento a única matéria prima

utilizada em escala industrial para a produção do etanol no Brasil. A grandiosidade

do território brasileiro permite que o Brasil seja o maior produtor dessa cultura,

utilizando apenas 2.4% da área agricultável do solo brasileiro (Andrietta et al,

2006).

3.2. Características das leveduras

Leveduras são fungos predominantes unicelulares que possuem reprodução

vegetativa por brotamento ou fissão. A sua distribuição na natureza é ampla,

14

podendo, na sua maioria, ser encontradas em folhas, flores, frutos, grãos de

cereais e outros substratos contendo açúcares (Castro, 1995). Podem ser também

encontradas no solo, no ar, em águas de lagos, rios e mares, sobre a pele e no

intestino de animais e de alguns insetos. A distribuição na natureza ocorre por

vários vetores, como ventos e corrente de água e de ar (Potter & Hotchkiss, 1999).

As leveduras são empregadas, com alta freqüência, na obtenção de produtos

de consumo diários, entre eles o pão e as bebidas alcoólicas, destacam-se as

fermentadas e aquelas posteriormente destiladas. São microrganismos

eucarióticos e suas estruturas correspondem basicamente àquelas de outras

células eucarióticas, com uma membrana citoplasmática que apresenta

permeabilidade seletiva, regulando a entrada e saída de materiais da célula

(Copersucar, 1987). Caracterizam-se por apresentar alta resistência em condições

ambientais, crescimento a pH baixo de a faixa, presença de sais e temperatura de

até, aproximadamente, 35ºC. Têm alta taxa de reprodução, podendo reproduzir-se

sexuadamente, formando esporos, ou por reprodução assexuada, envolvendo

brotamento, gemulação ou fissão binária (Lodder, 1971).

As leveduras são, sem dúvida alguma, o grupo mais importante de

microrganismos explorado pelo homem. São também, reconhecidas como

economicamente importantes por causa de duas reações de produção de energia:

a respiração oxidativa e a fermentação (Halász & Lasztity, 1995). Ou seja, por

serem microrganismos anaeróbicos facultativos, as leveduras podem respirar ou

fermentar o substrato, e a contribuição de cada um desses eventos depende das

condições do meio (Gancebo & Serrano, 1989). As leveduras necessitam dos

mesmos elementos químicos que as outras formas de vida: carbono, hidrogênio,

15

oxigênio, nitrogênio, fósforo, potássio, enxofre, magnésio, ferro, zinco, etc. e,

também, de fatores de crescimento tais como vitaminas, que são ativos em

concentrações muito baixas (Copersucar, 1987). As leveduras apresentam

membrana celular bem definida, pouco espessa, em células jovens; rígidas em

células adultas, de constituição variável, com predominância de hidratos de

carbono, e menor quantidade de proteínas e graxas. Internamente delimitando o

citoplasma, existe a membrana citoplasmática, mais evidente em células adultas,

por plasmólise. No geral, as leveduras se apresentam sem cápsula, se bem que

algumas espécies de Torulopsis se apresentem com cápsula, constituída de

hidratos de carbono (Lima, 1998).

O substrato mais utilizado pelas leveduras, em nível industrial, é a sacarose.

Em estágios iniciais de fermentação, a sacarose é hidrolisada por ação da enzima

invertase em monossacarídeos estruturais, glicose e frutose, sendo transportada

através da membrana celular (De la Fuente & Sols, 1962). A Saccharomyces

cerevisiae é ascomicética, sendo a de maior importância industrial. Ela tem a

capacidade de absorver e fermentar uma grande variedade de açúcares, como por

exemplo, sacarose, glicose, frutose, galactose e maltose (D’Amore & Stewart,

1987). A espécie Saccharomyces cerevisiae e as espécies filogeneticamente

próximas são as mais empregadas pelo homem, que as utilizam em várias

indústrias de fermentação de substratos açucarados ou amiláceos previamente

hidrolisados. Isto fez com que através dos tempos, as melhores linhagens para as

diferentes indústrias pudessem ser selecionadas (Vitolo, 1989).

Em geral, leveduras são microrganismos manipulados com relativa facilidade

em processos industriais, sendo consideradas células grandes, “fortes” e robustas

16

por tolerarem certas condições desfavoráveis, além de não serem muito exigentes

nutricionalmente. Assume-se, portanto, que sejam células fáceis de manter (Vitolo,

1989). As células vegetativas da maioria das leveduras industriais variam em

tamanho, de 4 a 8µ de largura por 7 a 12 µ de comprimento, havendo,

evidentemente, espécies maiores e espécies menores que as citadas. Forma e

tamanho das células, mesmo em espécies monomorfas, podem variar de acordo

com o nutriente, as condições ambientais, o estado fisiológico ou a idade (Lima,

1998).

Atualmente, as leveduras usadas na indústria alcooleira, de acordo com a

literatura técnica mundial são classificadas em (Batista, 2003):

� Selvagens: quando apresentam as características favoráveis em níveis

pouco otimizados;

� Prensadas: são leveduras selecionadas para a indústria de panificação.

Conseqüentemente, são facilmente obtidos em grande quantidade no

comércio, pois embora muito procuradas, não são específicas para a

produção de álcool;

O crescimento a temperaturas elevadas acima de 40oC em meios com altos

teores de açúcares ou cloreto de sódio, o requerimento de vitaminas, a

susceptibilidade a certas drogas como a ciclohexamida e a produção de

determinados metabólitos são critérios também utilizados na descrição e

classificação de leveduras, e são importantes, uma vez que auxiliam no

agrupamento das linhagens de acordo com o habitat da levedura (Castro, 1995).

As características genéticas que os fermentos ou levedos teriam que ter para

uma boa produção industrial de álcool são (Batista 2003):

17

� Alta velocidade de fermentação: definida como a quantidade de açúcar

fermentada em determinada unidade de tempo por um determinado peso

de levedura. Essa característica é de relevante importância, pois se a

fermentação for mais rápida, o volume das dornas será menor e

conseqüentemente, o investimento nesse setor poderá ser reduzido, da

mesma forma que os riscos de contaminação por bactérias;

� Alta tolerância ao álcool: as leveduras mais tolerantes ao álcool produzem

vinho com teor alcoólico maior, porque podem desdobrar maiores

quantidades de açúcares. Leveduras com essas características aumentam

a capacidade de fermentação e de destilação das instalações industriais

tornando possível trabalhar com o vinho mais concentrado;

� Tolerância a altas temperaturas: embora as temperaturas elevadas (35 a

40°C) sejam indesejáveis, na medida em que possam f avorecer a

evaporação de álcool e o desenvolvimento de bactérias contaminantes, as

leveduras tolerantes juntamente com as técnicas de fechamento das dornas

e recuperação do álcool evaporado, podem superar esses problemas. Essa

característica é particularmente interessante para países tropicais como o

Brasil;

� Estabilidade: as características citadas anteriormente podem ser mantidas

em uma raça de levedura (fermento), em condições de fermentação

adequadas;

� Tolerância a meios de elevada acidez: as leveduras que superam

contaminações de bactérias, geralmente não são muito resistente a meios

muito ácidos.

18

Somente poucas espécies desses microrganismos são utilizadas na fabricação

de álcool, destacando-se o Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces

pombe, quando o substrato é constituído por hexoses, e Candida utilis, quando

uma parcela do substrato for constituída por pentoses (Batista, 2003).

3.3. Fermentação alcoólica

A fermentação alcoólica é a ação de leveduras sobre açúcares fermentescíveis

contidos em uma solução/suspensão. É um processo biológico no qual a energia

formada por reações de oxidação parcial pode ser utilizada para o crescimento de

leveduras e a oxidação parcial anaeróbia da hexose na produção de álcool e CO2

(Lima & Marcondes, 2002).

A transformação do açúcar em etanol e CO2 envolvem 12 reações em

seqüência ordenada, cada qual catalisada por uma enzima específica, conforme

apresentado na Figura 1. Tal aparato enzimático está confinado no citoplasma

celular dos microrganismos fermentativos, sendo, portanto, nessa região da célula

que a fermentação alcoólica se processa (Lima et al, 2001).

A simplificação se dá em três etapas (Lima & Marcondes, 2002):

1- Via aeróbia

C6H12O6 → respiração → CO2+H2O (crescimento celular rápido) Equação 1

2- Via anaeróbia

C6H12O6 → fermentação → C2H5OH+CO2 (crescimento celular lento) Equação 2

C6H12O6+2ADP +PO4-3

→ 2C2H5O+ 2CO2+2ATP+H2O Equação 3

19

Figura 1. Seqüência de reações enzimáticas pela fermentação alcoólica de carboidratos endógenos (glicogênio e trealose) ou exógenos (sacarose e maltose), conduzida por Saccharomyces cerevisiae (Lima et al, 2001).

20

O álcool produzido durante a fermentação é dependente da quantidade de

açúcares presentes no mosto. O processo se inicia por meio da atuação da

exoenzima invertase, a qual, por meio de hidrólise, transforma o açúcar (sacarose)

em glicose e frutose (monossacarídeos estruturais). Esses monossacarídeos

serão absorvidos pela célula da levedura (aeróbio facultativo), que em condições

de aerobiose serão utilizadas no processo de respiração da mesma (Nobre 2005).

O objetivo primordial da levedura, ao metabolizar anaerobicamente o açúcar, é

gerar uma forma de energia (ATP, adenosina trifosfato) que será empregada na

realização dos diversos trabalhos fisiológicos (absorção, excreção e outros) e

biossínteses, necessárias à manutenção da vida, crescimento e multiplicação,

para perpetuar a espécie. O etanol e CO2 resultantes se constituem, tão somente,

de produtos de excreção, sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose.

Entretanto, o etanol, bem como outros produtos de excreção, (como o glicerol e

ácidos orgânicos) podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e

biomassa, mas apenas em condições de aerobiose (Lima et al,2001).

O processo de produção de etanol difere drasticamente de outras

fermentações industriais. Existem várias peculiaridades no que se refere a esse

tipo de fermentação uma delas refere-se ao substrato; o mosto a ser fermentado

não sofre nenhum tratamento no sentido de eliminar a microbiota do caldo de

cana-de-açúcar (Andrietta, 2006).

A fermentação industrial envolve reciclo de células de leveduras, podendo

ocorrer também reciclo de células de microrganismos contaminantes. Os

principais contaminantes da fermentação são bactérias, estas acarretam ao

processo alguns problemas como: consumo de açúcar, queda na viabilidade

21

celular e morte das leveduras devido a toxinas lançadas no meio (Althertum et a

al, 1984).

3.4. Contaminantes do processo de produção de etano l

A presença de microrganismos no processamento de cana-de-açúcar

ocorre desde a lavoura até o setor de fermentação, sendo que a contaminação

bacteriana presente no caldo de cana e no mosto pode refletir a qualidade da

matéria-prima utilizada, pois, tanto o caldo quanto o mosto são ótimos substratos

para o crescimento de microrganismos devidos aos teores de nutrientes orgânicos

e inorgânicos, alta atividade de água, pH, além da temperatura que ocorrem nos

processo industriais de fermentação (Gallo, 1990; Gallo & Canhos, 1991; Amorim

& Oliveira, 1982).

Gallo e Canhos (1991) relatam que a contaminação total de mesófilos da

cana é da ordem de 105 a 107UFC/mL quando a cana é sadia, podendo atingir

valores de 108 UFC/mL quando a cana não é sadia ou ficou armazenada por

longos períodos. Os autores ressaltam ainda que o caldo misto, mistura dos

caldos de diversas moendas, é um meio favorável ao desenvolvimento de muitas

espécies microbianas por apresentar um teor de sólidos solúveis de 10-18°Brix,

pH 5,0-5,6, temperatura de 25-30ºC, aminoácidos, sais orgânicos e outros

nutrientes. Nolasco Jr (2005) analisou mosto de cana-de-açúcar proveniente da

saída do decantador e encontrou contagem média para esporos mesofílicos

aeróbios de 35esporos/mL, para esporos termofílicos aeróbios produtores de “Flat-

sour” de 35 esporos/mL, e para bactérias mesófilas totais de ordem de

102UFC/mL, no entanto, Nolasco e Finguerut (1998), ao analisarem os

22

fluxogramas de processo e preparo de mosto até a fermentação e os

equipamentos existentes nesse processo, verificaram invariavelmente que os

mostos à chegada na fermentação apresentavam contagens de bactérias lácticas

da ordem de 106UFC/mL além de esporos mesófilicos e termofílicos da ordem de

101esp/mL.

Um levantamento dos microrganismos em indústrias de álcool de São

Paulo indicou que cerca de 60% das espécies bacterianas isoladas eram do

gênero Lactobacillus seguido de Bacillus com 26,58%, destacando-se as

espécies: L. fermentun (15,04%) e L. helveticus (14,08%) e B.coagulans (15,09%)

e B. stearothermuphillus (6,91%) (Gallo, 1990).

A contaminação bacteriana na fermentação é um dos problemas que afeta

o rendimento do processo de produção de álcool (Alcarde,2001; Oliva-Neto &

Yokoya, 1997) , em média de 1.5% a 5% de queda no rendimento do processo

fermentativo dependendo da forma como é conduzido o processo fermentativo

(Formaggio e Finguerut, 1998). No entanto, Essia Ngang et al (1989) relataram

30% de perda no rendimento na produção de álcool de beterraba . Na

fermentação conduzida com cultura mista com lactobacilo, a levedura perde 96%

da viabilidade em aproximadamente 12 horas (Essia Ngang et al, 1992).

Os bacilos são microrganismos que habitam o solo, podendo ser

carregados, no corte da cana, com parte do solo que fica aderido na cana e

posteriormente contaminar o caldo e os equipamentos. E havendo condições

favoráveis para a multiplicação dos bacilos, estes causam transtornos ao processo

fermentativo, as principais espécies de bacilos contaminantes do processo de

etanol são o Bacillus coagulans e Bacillus stearothermophilus (Gallo, 1990). Em

23

trabalho realizado por Nolasco Jr (2005), foram determinados os parâmetros

cinéticos para B. stearothermophilus, para tanto foram utilizadas temperaturas

entre 98-130ºC, os valores obtidos para a energia de ativação e o valor z foram

249.52 kJ/mol e 11.48ºC, respectivamente. Ainda baseado no tempo de residência

médio no decantador, o autor pode constatar que os esporos de B.

stearothermophilus sofriam apenas 0.14 reduções decimais neste equipamento.

Leveduras e bactérias lácticas são freqüentemente encontradas juntas em

ecossistemas naturais e podem competir pelos mesmos nutrientes. Gallo (1990) e

Oliva-Neto (1990) constataram a predominância de bactérias lácticas no processo

de fermentação alcoólica. As características que levam à predominância das

bactérias lácticas no processo fermentativo são: o metabolismo fermentativo, o

que capacita o crescimento rápido em meio rico em açúcar fermentescível; alta

tolerância a pH baixo e particularmente sua habilidade de crescimento rápido em

soluções ácidas; muitas espécies apresentam cápsula polissacarídicas e secretam

gomas extracelulares as quais protegem as células dos efeitos letais do calor, de

agentes químicos e da desidratação; algumas espécies são capazes de crescer

em temperaturas relativamente altas (Gallo e Canhos, 1991; Narendranath et al,

1994).

A maioria dos trabalhos identificou e tornou evidente a predominância de

bactérias Gram positivas e em forma de bastonetes no processo industrial de

fermentação alcoólica com destaque para os gêneros Bacillus e Lactobacillus e

dentro do último gênero as espécies L.fermentum e L. helveticus. Como os

lactobacilos competem com as leveduras pelos açúcares presentes no mosto, e

têm maior incidência neste processo, foram escolhidos para este estudo.

24

3.5. Características morfológicas e citológicas de Lactobacillus fermentum

As bactérias lácticas são descritas como Gram positivas, não esporogênica,

catalase negativa, citocromo ausente, não aeróbia, mas aerotolerante, exigente

quanto aos fatores nutricionais, tolerante a ácido e estritamente fermentativa como

a formação de ácido láctico como principal produto da degradação do açúcar. São

geralmente associadas ao habitat rico em nutrientes como leite, carne e produtos

vegetais, mas alguns membros são associados à pele e mucosa de mamíferos

podendo até ser patogênico ao hospedeiro (Costa, 2006). Geralmente, este grupo

de microrganismos é caracterizado por serem fastidiosos, que exigem substratos

complexos com nucleotídeos, aminoácidos, carboidratos e vitaminas,

principalmente a vitamina B1 com destaque para pantotenato de cálcio, niacina e

tiamina. Desenvolvem-se em meio ligeiramente ácido, com pH entre 4.4 e 6.4 e

em condições microaerófilas.

As bactérias pertencentes ao gênero Lactobacillus apresentam uma grande

importância na indústria alimentícia, pois as mesmas são utilizadas tanto como

culturas iniciadoras em processos fermentativos, quantos nos leites fermentados

ou iogurtes na forma de probióticos (Kandler & Weiss, 1986).

O gênero Lactobacillus pode ser dividido em três grupos distintos quanto ao

modo como realizam a degradação dos carboidratos (Kandler & Weiss, 1986). Os

três grupos se assemelhem pelo fato de degradarem apenas hexoses, no entanto,

diferem pelo modo como o esqueleto carbono de tais compostos são

metabolizados:

25

� Homofermentativos obrigatórios: através da via de Embden-Meyerhof

convertem 1 mol de hexoses em 2 moles de ácido láctico e não fermentam

pentoses ou glucanato;

� Heterofermentativos facultativos: realizam a fermentação de forma

semelhante ao grupo homofermentativo, contudo, algumas espécies

produzem outros ácidos (acético) em condições limitantes de glicose.

Convertem pentoses em acido láctico e acético via fosfocetolase indutível;

� Heterofermentativos obrigatórios: convertem 1 mol de hexoses em 1 mol de

CO2, e 1 mol de ácido láctico através da via 6-fosfoglucanato. Pentoses são

convertidas a ácido láctico e acético.

Oliveira et al (1995) referem-se à espécie L.fermentum como sendo bastonetes

de 0.5 a 0.9 µm de largura e comprimento bastante variável, apresentam-se

isolados e aos pares, Gram-positivos, não esporulados e raramente com

motilidade. Também apresenta as seguintes características fisiológicas: são

anaeróbios facultativos, heterofermentativos, apresentam catalase negativa, com

temperatura ótima entre 30ºC e 40ºC e pH ótimo na faixa de 5.5 a 5.9.

A espécie L.fermentum compreende muitas linhagens e a maior parte delas

fermenta frutose, galactose, glicose, gluconato, lactose, maltose, manose,

melobiose, rafinose, ribose e sacarose, porém determinadas espécies também

fermentam a arabinose, celobiose, trealose e xilose (Kandler & Weiss, 1986).

Durante o processo de fermentação do açúcar, podem ser produzidos ácidos

D-láctico e L-láctico, ou ainda a mistura racêmica dos isômeros em proporções

variáveis. Tal aspecto é decorrência da existência de enzimas desidrogenases

26

lácticas esteroespecíficas, produzindo separadamente os isômeros D e L (Costa,

2006).

Guchte et al (2002) relatam que o efeito do ácido láctico sobre a própria

bactéria não é conhecido em detalhes, mas é aceito que ocorre a difusão passiva

e que o acúmulo intracelular reduz o pH intracelular e então afeta a

permeabilidade da membrana. A proporção de ácidos graxos presentes na

membrana plasmática da bactéria determina a sua resistência aos estresses

causados pela presença de ácidos.

3.6. Influência dos contaminantes no processo de fe rmentação alcoólcia

De acordo com a reação estequiométrica de Gay-Lussac, o rendimento da

fermentação alcoólica é expresso em quantidade de produto formado (etanol) por

unidade de açúcar consumido. Em função disto, todo açúcar que não é convertido

em álcool, e sim em outros produtos, faz com que haja diminuição no rendimento

do processo de produção de etanol (Nobre, 2005).

O consumo da sacarose resultando na formação dos ácidos láctico e acético,

como os principais ácidos orgânicos formados, é um dos principais prejuízos

causados pelas bactérias contaminantes no processo de produção de etanol

(Nobre, 2005). Outros compostos como a formação de goma, que aumenta a

viscosidade do caldo e podem causar entupimento nas tubulações, centrífugas,

peneiras e trocadores de calor; a floculação do fermento, que diminui a velocidade

de fermentação, acarreta perda de células de leveduras pelo fundo da dorna e

dificulta a operação das centrífugas também são associados por diversos autores

à perda no rendimento alcoólico (Oliva-Neto e Yokoya, 1997).

27

As bactérias lácticas exercem um efeito inibidor sobre a levedura em função da

pressão osmótica exercida pela presença do ácido láctico no meio de cultivo

(Essia-Ngang et al, 1989). Essia- Ngang (1992) estudaram a estimulação no

desenvolvimento de L. casei em cultura mista com S. cerevisiae em meio de

melaço de beterraba e relataram que o estímulo, ao lactobacilo, também ocorre

devido à hidrólise da sacarose em hexoses proporcionando maior facilidade de

assimilação dos carboidratos pela bactéria.

A contaminação bacteriana é considerada a maior causa da redução na

produção de etanol durante a fermentação de meios amiláceos, de uísque

escocês e de mosto de cana, por S. cerevisiae. O estímulo no desenvolvimento do

Lactobacillus sp., quando em cultura mista é devido à excreção de nutrientes, da

levedura para o meio, como adenina, guanina, ácido aspártico e nicotínico,

triptofano, glicina, alanina e lisina, biotina e vitamina B12 (Narendranath et al,

1997; Chin & Ingledew, 1994).

Oliva-Neto & Yokoya (1997) pesquisaram o desenvolvimento de três linhagens

de L.fermentum, contaminantes isolados de destilarias brasileiras, em meios de

cultivo com diferentes composições em aminoácidos e em cultura mista com S.

cerevisiae. A análise dos resultados demonstrou que uma das linhagens

estudadas não se desenvolveu na ausência de algum dos seguintes aminoácidos:

fenilalanina, alanina, ácido glutâmico, cistina, prolina, histidina, arginina, teronina,

triptofano, serina e metionina. Também evidenciou que todas as linhagens

testadas não se desenvolveram em meios ausentes dos aminoácidos leucina,

isoleucina e valina, porém todas as linhagens desenvolveram-se em cultura mista

com a levedura. Portanto, o estímulo ao desenvolvimento bacteriano também é

28

causado pela liberação de aminoácidos e presença de aminoácidos no meio

fermentativo causada pela autólise das leveduras. O desenvolvimento bacteriano

é favorecido nos estágios finais do processo fermentativo (Oliva-Neto, 1995).

Chin e Ingledew (1994) relataram que a contaminação com aproximadamente

108 UFC/mL de bactérias produtoras de ácido láctico não afetou seriamente a

produtividade em etanol na fermentação de malte de trigo, mesmo com o aumento

gradual da concentração de ácido láctico ao longo de 5 fermentações, mas

ocasionou uma redução de 60% na viabilidade da levedura nas últimas

fermentações. No entanto, Essia Nang et al (1989) observaram uma redução de

30% na produtividade de etanol da fermentação do mosto de beterraba quando a

concentração de ácido láctico, produzido pelas bactérias contaminantes atingiu,

5.0g/L.

Alterthum et al (1984) relatam que a elevada porcentagem de leveduras

mortas, bem como o aumento da acidez do mosto, mostra a provável liberação de

substâncias tóxicas, como ácidos, pelas células bacterianas, no meio de cultura

promovendo a morte das leveduras ou mesmo dificultando seu desenvolvimento.

Da mesma forma, a grande quantidade de açúcares residuais presentes no mosto

fermentado confirma o fato de que as células de levedura existentes estão

enfraquecidas e incapacitadas de utilizar adequadamente o substrato disponível.

Por outro lado, a perda no rendimento do etanol não justifica a elevada

concentração de açúcares consumida, sugerindo que a mesma tenha sido

destinada para a formação de outros produtos ou que o etanol formado tenha sido

consumido pelos microrganismos infectantes.

29

Ferguglia (1997) relatou queda de 97% na viabilidade de S. cerevisiae após 12

horas e 98% após 30 horas em cultura mista com L.fermentum, quando cultivados

em meio de caldo de cana-de-açúcar suplementado com peptona e extrato de

levedura. Entretanto, o autor não destaca o nível de contaminação ao qual a

levedura foi exposta.

Thomas et al (2001) avaliaram as interações entre Saccharomyces cerevisiae

e algumas cepas de lactobacilos na fermentação de macerado de milho para a

produção de etanol. Com esta pesquisa, os autores verificaram que durante o

processo de fermentação houve decréscimo no rendimento do etanol, queda

rápida na viabilidade das leveduras após a exaustão dos açúcares

fermentescíveis, aumento no desvio de carboidratos para a produção de glicerol e

ácido láctico, redução na proliferação de leveduras, quando a contaminação do

lactobacilo atingia elevados níveis (~109UFC/mL). No entanto o crescimento do

lactobacilo é inibido quando a levedura está presente em maior número, ou

quando a S. cerevisiae é inoculada em igual concentração que o lactobacilo.

Qualquer correlação entre o tamanho da contaminação bacteriana e perdas no

rendimento em etanol precisa ser mais bem compreendida, embora seja óbvio que

cada molécula de açúcar direcionada para a produção de ácido láctico pela

bactéria resulta em perdas de duas moléculas de etanol que poderiam ser

produzidas pelas células de leveduras (Nobre, 2005). Por outro lado, apesar da

importância atual deste processo para o Brasil, não existem dados quantitativos na

literatura dos parâmetros básicos de crescimento como tempo de adaptação,

população máxima da levedura e do lactobacilo quando em cultura mista, apenas

dados para a velocidade de crescimento são descritos na literatura.

30

3.7. Modelagem do crescimento da levedura em biopro cessos

A modelagem dos bioprocessos é complicada, pois envolve crescimento

microbiano sob mudanças constantes nas condições de processo, impactando

diretamente na cinética da fermentação (Rivera et al, 2007).

Phisalaphong et al (2006) descreveram o efeito da temperatura no

crescimento de Saccharomyces cerevisiae em melaço de cana e verificaram que

temperaturas altas, por volta de 45ºC causavam decréscimo no rendimento de

etanol e na massa celular, e ainda que a taxa de crescimento da levedura variou

de 0.1h-1 a 0.78h-1. D’amore et al (1987) observaram que em temperaturas mais

elevadas (40°C) ocorre um aumento na permeabilidade da membrana plasmática

em conseqüência da alteração da composição de ácidos graxos. Ocorre que, em

temperaturas elevadas, há um acréscimo de ácidos graxos insaturados que

proporcionam ótima fluidização na membrana para atividades celulares. Segundo

Yamamura et al (1991), devido a esse aumento da fluidização da membrana,

células de leveduras crescendo a temperaturas elevadas são facilmente sujeitas à

lise celular.

Rivera et al (2007), utilizaram uma cepa de S.cerevisiae isolada de uma

planta industrial de fermentação, para modelagem do processo fermentativo

utilizando melaço de cana-de-açúcar. Estes autores verificaram que a 34ºC a

levedura tinha sua taxa de crescimento aproximadamente 0.4h-1. No entanto, a

esta temperatura apesar da levedura apresentar elevada taxa de crescimento, a

produção de etanol e o rendimento celular estes sofreram redução de 140 Kg/m3 a

30ºC para aproximadamente 76Kg/m3 e 90 Kg/m3 para aproximadamente 45

Kg/m3 respectivamente.

31

Além da influência da temperatura nos parâmetros de crescimento da

levedura, deve-se levar em consideração a contaminação bacteriana no mosto,

pois esta é a maior causa de perda de rendimento no processo fermentativo. A

influência do lactobacilo nos parâmetros de crescimento da levedura foi relatado

por Narendranath et al (1997) em fermentação de macerado de trigo. Variando a

concentração de células de lactobacilo de 105 a 108 UFC/mL, verificaram que, com

o aumento no nível de inóculo inicial de 105 para 109UFC/mL, a taxa de

crescimento da levedura sofria decréscimo de 0.42 para 0.36h-1, demonstrando

assim que o lactobacilo tem influência na taxa de crescimento da levedura.

As demais pesquisas realizadas (Oliva-Neto &Yokoya, 1997; Nobre, 2005)

para determinar a influência do lactobacilo nos processos fermentativos relatam

como resultados a utilização dos nutrientes excretados pela célula de levedura,

pelo lactobacilo para o crescimento durante o processo, e como conseqüência

deste fenômeno há a redução na viabilidade celular e na produtividade de etanol.

A informação quantitativa dos parâmetros de crescimento é escassa.

32

PARTE II: MICROBIOLOGIA PREDITIVA

3.8. Microbiologia preditiva

A microbiologia preditiva surgiu descendendo de duas linhas de pesquisas

isoladas. Uma delas é o controle da deterioração de peixe fresco, e a segunda

área é a prevenção de botulismo e outras intoxicações microbianas (Ross &

McMeekin, 1994). O conceito de microbiologia preditiva está baseado no

conhecimento detalhado da resposta microbiana a mudanças ambientais, sendo

possível predizer, através de observações passadas, a resposta dos

microrganismos em um novo ambiente similar (Jagannath & Tsuchido, 2003;

McMeekin et al, 2002; Dens & Van Impe, 2001). Essas mudanças podem ser

aplicadas para adotar medidas de segurança alimentar, avaliando o efeito de

operações como processamento, distribuição e estocagem dos alimentos e vida

de prateleira (McMeekin et al, 2002). Nos últimos dez anos, muitas pesquisas têm

sido desenvolvidas nessa área.

3.9. Planejamento experimental para modelagem predi tiva

A análise dos impactos dos fatores ambientais sob a resposta dos

microrganismos é a fonte primária de dados para desenvolver modelos preditivos.

Para a investigação desta influência com precisão, é necessário descrever esta

interação que é uma importante consideração para desenhar os experimentos

(Rasch, 2004). Na etapa de planejamento, devem ser definidas algumas

características relacionadas à(s) variável(eis) independente(s), à variável

dependente, ao inóculo e ao modelo experimental (Nakashima et al, 2000).

33

A faixa de condições, sobre as quais o modelo tem que operar tem que ser

definida, pois os modelos empíricos não são aplicados além da faixa definida na

qual o modelo foi gerado. Nessas condições, é requerido que os fatores de

crescimento possam ser alterados facilmente (Blackburn, 2000).

Os tempos da amostragem são considerações importantes para a aplicação

prática do planejamento e devem ser concentrados em torno das regiões de

mudanças mais rápidas da curva de crescimento, como o final da fase de

aceleração negativa para modelos de crescimento. A escolha das combinações

dos fatores deve também ser considerada. Pode ser o caso de um planejamento

composto central mais apropriado para gerar modelos particulares, como aqueles

para a inativação térmica. Entretanto, para outros modelos, tais como aqueles que

descrevem uma região de interesse, pode ser na área onde a resposta que está

sendo medida é mais variável (interface de crescimento / não crescimento) então

as medições poderão necessariamente ser tomada nestas regiões. O uso de

procedimentos de “screening” pode ser útil para definir as variáveis de interesse e

o uso de medidas de densidade ótica para acompanhar o crescimento pode ser

particularmente usado para este propósito (Blackburn, 2000).

34

3.9.1. Desenho composto central

O desenho composto central consiste em um desenho fatorial completo 2k,

acrescido dos pontos centrais e axiais (Rasch, 2004). O número de experimentos

é determinado através de 2k+2*k+no, onde k é o número de variáveis do processo

e n0 é o número de pontos centrais(n0≥1), por exemplo um planejamento com k=2

e 3 e n0= 2, resulta em 9 e 16 ensaios respectivamente (Rasch, 2004).

3.10. Coleta de dados experimentais para a construç ão dos modelos

preditivos

A parte mais minuciosa, do trabalho experimental, é a geração de dados de

crescimento, sobrevivência ou inativação térmica do microrganismo

(BlackBurn,2000). Para determinar a quantidade celular de microrganismos em

função do tempo, pode-se utilizar vários metódos de aquisição de dados. O

método mais utilizado para a modelagem preditiva é a contagem de células viáveis

por ser realizada por contagem em placas com meio de cultura. No entanto, é um

método laborioso considerando o grande volume de dados a serem coletados

(Rasch, 2004). Alguns métodos alternativos têm sido usados, como a medida de

densidade ótica, onde aumenta a turbidez do meio de cultura com o crescimento

microbiano (Rasch, 2004). Para o cultivo de fungos, usualmente utiliza-se a

medida do crescimento radial, sendo o modelo de Baranyi & Roberts (1994), o

mas utilizado para o ajuste dos dados (Rasch, 2004).

O crescimento microbiano pode ser caracterizado pela figura 2.

35

Figura 2. Curva padrão do crescimento bacteriano a temperatura constante

O significado biológico de cada uma das fases da curva de crescimento

microbiano (Figura 2) pode ser assim definido (Nakashima et al, 2000):

Fase de adaptação ou fase “lag”: ajuste da fisiologia e bioquímica das

células para que possam ser capazes de explorar o ambiente onde se encontram.

Fase exponencial: fase de crescimento balanceado, ou seja, a síntese de

cada componente celular (enzimas, moléculas estruturais, DNA, etc.) é ajustada

para que não exista síntese além do necessário para a produção de novas células.

Todo o metabolismo está direcionado para a reprodução. Nesta fase, todos os

componentes celulares estão presentes em proporções constantes e as células

são consideradas praticamente fisiologicamente idênticas. A velocidade de

crescimento, na fase exponencial, pode ser expressa como velocidade de

crescimento absoluta que indica o aumento da densidade da população com o

tempo, ou como .velocidade de crescimento relativa ou específica, que indica o

aumento da densidade da população em um determinado intervalo de tempo,

dividido pela densidade de células no tempo final deste intervalo. O tempo

36

necessário para a população microbiana dobrar é denominado de tempo de

geração .

Fase estacionária: morte celular e lise devido ao acúmulo de metabólitos

tóxicos no meio de crescimento. Nesta fase, a velocidade de morte celular é

equivalente à velocidade de crescimento. Em condições que permitam o

crescimento celular.

Fase de declínio: Maior acúmulo de substâncias tóxicas, determinando uma

velocidade de morte celular maior do que a capacidade do meio em proporcionar a

reprodução ou divisão celular.

A fase lag e a exponencial são as de maior interesse para os

microbiologistas de alimentos pois, para a maioria dos alimentos, a deterioração

ocorre antes dos microrganismos chegarem à fase estacionária.

No caso de um estudo de vida de prateleira de produto, quanto maior a fase

lag, maior a vida de prateleira, assim como quanto maior a velocidade de

crescimento na fase exponencial, menor a vida de prateleira.

3.11. Influência do inóculo nos parâmetros de cresc imento dos

microrganismos

Os modelos preditivos foram tradicionalmente desenvolvidos utilizando como

inóculo inicial concentrações celulares de microrganismos próximas aos níveis

encontrados em alimentos. Os pesquisadores desenvolveram os modelos de

forma a justificar a aproximação para a construção dos mesmos. O tamanho da

população inicial elevada também representa uma má aproximação conservadora

37

do caso a ser modelado, porém as altas concentrações celulares asseguram a

repetibilidade e simplificam a variabilidade microbiana (McKellar & Lu, 2004).

A densidade do inóculo inicial é um importante parâmetro (Malakar, et al,

2003). Nakashima et al (2000) relatam que uma mistura de 3 a 5 cepas de um

mesmo patógeno é freqüentemente utilizada para inocular um meio de

crescimento que será modelado. Esta prática é experimentalmente viável e resulta

em modelos para as cepas de crescimento mais rápido ou de maior resistência

nas condições ambientais de estudo. O uso de uma mistura de cepas aumenta a

probabilidade de se criar um modelo representativo da situação real.

Nakashima et al (2000) e Blackburn (2000) relataram que a duração da fase

lag pode ser influenciada pelo tamanho do inóculo, dependendo do limite de

detecção do método de determinação da variável de resposta a ser modelada.

Porém, McKellar & Lu (2004) afirmam que em alguns casos o tamanho do inóculo

não afeta a resposta a ser modelada (i.e. taxa de crescimento). O estado

fisiológico do microrganismo (estresse no ambiente versus preparação do inóculo

no laboratório) tem que ser considerado, pois afeta de forma mais intensa a fase

lag do que a taxa de crescimento (Miconnet et al, 2005).

Van Impe et al (2005) realizaram um estudo sob a influência da

concentração do inóculo de Lactobacillus lactis nos parâmetros de crescimento da

Listeria innocua e obtiveram como resultado que, com o aumento do inóculo de L.

lactis de 103UFC/mL para 107UFC/mL, não havia influência na taxa de

crescimento da listeria porém a população máxima de L.innocua diminuía de

106UFC/mL para 102UFC/mL com o aumento da concentração do inóculo em co-

cultura.

38

3.12. Modelagem matemática

O termo modelo foi definido em diversas e excelentes revisões de

modelagem matemática de processos microbiológicos. O termo modelo

matemático é mais rigoroso e se refere a um conjunto básico de hipóteses nos

processos estudados, alguns deles expressos por meios de funções e equações

(diferenciais). Portanto, de um ponto de vista mecanístico, função e modelo não

são termos equivalentes. Função é uma abstração matemática que torna mais

fácil a descrição de um modelo particular (Baranyi & Roberts, 1995).

A variável primária pode ser a taxa de crescimento, tempo inativação

térmica, ou tempo para um evento acontecer, ou ainda, condições para atingir, e

também a probabilidade de um evento acontecer em um tempo pré-determinado

(Jagannath & Tsuchido, 2003).

Em um consenso geral, um modelo é um sistema simplificado que usa

combinações de descrições, através de funções ou equações matemáticas, e com

condições iniciais específicas. Os modelos podem ser divididos em duas classes:

descritivos e explanatórios, sendo este último composto por modelos analíticos e

numéricos. Modelos descritivos (i.e. de observações, empíricos, “Black Box” ou

indutivos) têm dados dirigidos,sendo que as aproximações como as funções

polinomiais, redes neurais artificiais, e análise do componente principal é utilizada

para classificar os dados. È difícil fazer predições verdadeiras com essa classe de

modelo, pois os modelos obtidos não podem ser extrapolados além dos dados

utilizados para a construção do mesmo (McKellar & Lu, 2004).

Os modelos explanatórios (ou mecanístico, dedutivo, ou “White Box”), têm

como objetivo relacionar os dados com os princípios científicos fundamentais, ou

39

com um processo fisiológico mensurável. Muitos modelos de microbiologia

preditiva que têm seus parâmetros relatados a partir fenômenos observados são

considerados mecanísticos. Estes modelos analíticos são explicitados em forma

de equações que se ajustam aos dados experimentais. Para ser verdadeiramente

mecanístico um modelo deve, no entanto, levantar perguntas e hipóteses novas

que possam ser testadas (McKellar & Lu, 2004).

Os modelos são geralmente baseados em diversas hipóteses biológicas, na

interpretação das diferentes fases do crescimento microbiano, onde o principal

esforço está direcionado para estudar a fase lag cuja significância biológica ainda

é vaga (Baty & Delignette-Muller, 2004).

3.12.1. Parâmetros de crescimento

Microbiologistas usam classicamente três parâmetros para caracterizar a

curva de crescimento microbiano: tempo de adaptação (λ), a velocidade específica

de crescimento (µ) e a população máxima (Rg), os parâmetros estimam vários

campos notáveis na microbiologia de alimentos (Baty & Delignette-Muller, 2004).

3.12.1.1. Tempo de adaptação (λ)

È um fenômeno inerente à cinética microbiana, no qual tipicamente é

observado como uma resposta tardia da população microbiana à mudança de

ambiente. A fase lag ocorre em ambos os processos crescimento e inativação

(Swinnen et al, 2004). Durante a fase de adaptação, os microrganismos passam

40

por mudanças intracelulares, para adaptarem ao novo ambiente (Yates & Smoter,

2007).

Yates e Smoter (2007) desenvolveram um modelo para descrever a fase de

adaptação dos microrganismos. O modelo comportamental descrevia três

subpopulações: (i) as células inicialmente não duplicadas que se adaptariam e

posteriormente seriam duplicadas; (ii) a células adaptadas que cresceriam em um

novo ambiente; (iii) e as células que morreriam e não adaptariam ao novo

ambiente. Um modelo de crescimento foi apresentado, incluindo a fase de

adaptação, fase exponencial e a fase estacionária, onde as curvas de crescimento

dependiam da taxa de crescimento e morte das três subpopulações e da porção

inicial de cada uma delas.

3.12.1.2. Taxa específica de crescimento (µ)

A velocidade específica de crescimento é um importante parâmetro para

modelar o crescimento microbiano, pois avalia a capacidade de crescimento do

microrganismo mostrando se há dificuldades ou não (Perni et al, 2005).

Em pesquisa realizada por Perni et al (2005), comparou-se os valores da

taxa máxima de crescimento predita pelos modelos de Gompertz, Logístico e

Baranyi com dados experimentais do crescimento de Listeria monocytogenes e

Listeria innocua, usando a absorbância para quantificar a concentração de células.

Todos os modelos tiveram bons ajustes, no entanto, comparando o valor de µ

obtido a partir do Gompertz e o modelo logístico os resultados foram bastante

similares, porém quando comparado que ao modelo de Baranyi os valores

preditos eram substancialmente diferentes.

41

3.12.1.3. População máxima (Rg)

A população máxima é um importante parâmetro para trabalhos em cultura

mista, pois esta pode sofrer reduções significativas com relação a cultura pura,

levando-se em consideração fatores ambientais como temperatura e nutriente

presente no meio de cultura. Em trabalho realizado por Vam Impe et al (2005), a

Listeria innocua quando cultivada em cultura pura atinge uma população máxima

de 109UFC/mL, e sofre uma redução para 102UFC/mL quando cultivada com

107UFC/mL de Lactococcus lactis.

3.13. Modelagem primária

Os modelos primários de crescimento descrevem a cinética microbiana

definindo precisamente as fases de crescimento dos microrganismos. A população

microbiana é plotada contra o tempo, resultando usualmente em uma curva de 4

fases: adaptação, exponencial, estacionária e morte

Nos modelos cinéticos, a resposta da variável é expressa em unidades de

tempo para os parâmetros taxa de crescimento e tempo de adaptação, já para a

população máxima a unidade utilizada é UFC/mL (Ross & McMeekin,1994). Os

modelos cinéticos de primeira ordem mais importantes são o modelo de Baranyi &

Roberts (1994) e Gompertz modificado (Zwietering et al., 1991). Esses modelos

medem a resposta a uma condição específica em função do tempo. A resposta

pode ser medida direta ou indiretamente através da população microbiana ou de

produtos do metabolismo de microrganismos (Jagannath & Tsuchido, 2003).

O modelo de Baranyi e Roberts é mais usado por várias razões; (i) é fácil

de usar; (ii) é aplicável às condições dinâmicas de meio-ambiente; (iii) tem boa

42

capacidade de ajuste; (iv) a maioria dos parâmetros são biologicamente

interpretáveis (Van Impe, et al, 2005).

De acordo com os resultados obtidos por Baty & Delignette-Muller (2004),

dentre os três modelos utilizados Baranyi e Roberts, Gompertz e Lag-exponencial,

pôde-se notar que Baranyi, é definitivamente o mais constante dos modelos,

porque ele ajusta da melhor forma a maioria dos dados e assim gera

razoavelmente e estima de forma mais precisa o tempo de lag (λ).

3.13.1. Modelo de Gompertz Modificado

O modelo de Gompetz é uma função que descreve uma curva sigmoidal

assimétrica. A modificação proposta por Zwietering et al. (1991) foi reparametrizar

o modelo em função dos parâmetros microbiológicos de crescimento.

Equação 4

Onde: y= concentração de células, 0

lnN

Ny =

A= população máxima atingida µmáx = taxa máxima de crescimento λ = tempo de lag A equação não apresenta um período de aumento linear durante a fase de

crescimento exponencial, como é observado com a maioria das curvas de

crescimento. Sendo assim, como a velocidade de crescimento é determinada por

um ponto de inflexão na curva, o processo tende a fornecer valores que variam

mais do que as velocidades correspondentes determinadas por um período de

+

−⋅⋅

−⋅=1)( t

A

em

eeAyλ

µ

43

crescimento linear (Whiting e Buchanan, 1997), desta forma o tempo de geração

pode ser superestimando em até 13% (McKellar & Lu, 2004). Além disso, a função

da inclinação da curva não pode ser ajustada em zero, e assíntota inferior da

curva pode ser menor que o nível de inóculo, gerando λ negativo para alguns

casos (Mckellar & Lu, 2007).

3.13.2. Modelo de Baranyi

Baranyi e Roberts (1994) propuseram um modelo que inclui uma fase de

crescimento exponencial linear e uma fase lag determinada por uma função de

ajuste. A equação proposta por Baranyi & Roberts (1994) está demonstrada na

equação 5:

)1

1ln()()(max

max )(

maxoyy

tA

oe

etAyty −

−+−+=µ

µ Equação 5

Onde:

y(t) = concentração de células no tempo (t); onde:

0ln

N

Ny = yo = concentração inicial de células no tempo 0 (t=0);

ymax = concentração máxima de células; µmax = máxima taxa de crescimento;

O valor do tempo de adaptação é calculado pela equação 6

v

q )11ln(0

+=λ Equação 6

O coeficiente,q0, é representado por q0=P0/Kp, que expressa o estado

fisiológico do inóculo. Onde P0 é a concentração de células no inicio do

processo de crescimento, e Kp é a constante de Michaelis-Menten.

44

O valor da taxa específica do crescimento é representado pela

equação 7

dt

txdt

))((ln)( =µ Equação 7

Onde x(t) denota a concentração celular bacteriana aumentando em função

do tempo. O tempo de geração é expresso pelo G=ln2/µmax. Onde µmax é máxima

taxa de crescimento atingida pelo microrganismo.

A função A(t) é expressa como:

max

)ln()(

00

µ

µ hvht teeetA

−−−− −+= , para h0= -lnα0 Equação 8

Onde o parâmetro α0 é chamado de estado fisiológico das células no tempo

t= t0 conseqüentemente h0 usa-se para caracterizar o estado fisiológico inicial da

célula. Além de apresentar várias vantagens computacionais quando comparado a

outras funções sigmóides, seu uso principal é predizer a resposta de crescimento

bacteriano mesmo com alteração de temperatura durante a fase lag e

estacionária. Enfim, esta função considera as características do meio e do

microrganismo em questão; critério importante devidos às influências dos

diferentes fatores ou variáveis que provocam mudanças no meio e no

metabolismo do microrganismo de forma mais completa que a equação de

Gompertz( Peña, 2005).

O modelo de Baranyi & Roberts (1994) pode ser comparado a uma série de

equações diferenciais que ajustam um ambiente dinâmico, resultando em perfis de

temperatura não-isotérmicos, desta forma o modelo por se utilizado para

descrever comportamento de microrganismos em temperatura subótimas

(McKlellar & Lu, 2004).

45

Através da utilização do programa DMFit é possível se obter ambos os

modelos de crescimento citados acima. Considerando o modelo de Baranyi e

Roberts (1994) o programa ajusta uma função sigmoidal que descreve os

parâmetros: m. l, Rg, y0. E os parâmetros de curvatura m e n, que podem variar de

0 até 20. O parâmetro m representa a curvatura da transição da fase de

adaptação para a fase exponencial, enquanto que, o parâmetro n representa a

curvatura da fase exponencial para a fase estacionária. Além é importante se

considerar que o parâmetro yend(Rg) a assíntota superior de uma curva sigmoidal

de crescimento, ou inferior se a curva for de morte. Já quando se considera o

modelo de Gompertz gerado pelo programa (utilizado a equação de Zwietering et

al, 1991) é gerada uma função bifásica que consiste na junção de dois segmentos

lineares (Baranyi e Le Marc)

3.14. Modelagem preditiva em co-cultura

Muitas vezes na microbiologia preditiva, os microrganismos são modelados

em cultura pura, e as interações microbianas não são levadas em consideração.

Isso é feito apenas para simplificar a modelagem, mas este procedimento pode

causar discrepância entre as predições feita pelos modelos e evolução microbiana

real, particularmente para produtos que têm uma microbiota natural complexa,

como fermentados e minimamente processados (Janssen et al, 2006) onde os

sinergismos e antagonismos têm um papel importante.

A modelagem em co-cultura descreve as interações microbianas, onde a

inibição pode ser causada por (i) competição pelo substrato e/ou (ii) produção de

metabólitos tóxicos por um dos organismos (Van Impe et al, 2005).

46

A interação entre as bactérias lácticas (antagonistas) e microrganismos

patogênicos (indicador) foi discutida e modelada por Van Impe et al(2005),

Janssen et al (2006), Antwi et al(2007) e Poschet (2005).

Durante o processo de fermentação, o ácido láctico é produzido pela

bactéria láctica, e este ácido dissocia-se no meio de cultivo abaixando o pH do

meio, causando um efeito tóxico para os microrganismos. O efeito inbidor também

pode ocorrer para a bactéria láctica, que tem o seu crescimento cessado na fase

estácionaria, como um efeito auto-inibidor. Bactérias patogênicas, como a Yersinia

enterocolitca, são muito sensíveis ao efeito deste ácido. A presença da bactéria

láctica e, consequentemente, do ácido láctico, causa reduções na fase de

crescimento exponencial e na população máxima deste patogêno, conforme

verificado por Vereecken et al (2003). Estes autores cultivaram a Yersinia

enterocolitica em co-cultura com Lactobacillus sakei e observaram que, com o

aumento da concentração das células do lactobacilo de 103 para 107UFC/mL,

havia a redução de 4 ciclos logarítmicos na população máxima de Y.enterocolitca,

e também uma redução de 10 horas na duração da fase exponencial deste

microrganismo.

O modelo de inibição construído pelos autores referenciados acima está

descrito na equação (9). Este modelo descreve a fase estacionária em função de

Ni(t) (número de células) e Nmax (número máximo de células), onde começa o

fenômeno da inibição do crescimento pela produção do ácido láctico (Bernaerts et

al, 2004).

)(]).[],(.)([(.). max tNHLaHdt

dNilag

i += µµ Equação 9

47

Onde µ é a taxa de crescimento, onde µi(.) é a taxa especifica de

crescimento global (µlag – Taxa de crescimento na fase de adaptação ; µmax – Taxa

máxima de crescimento atingida na fase exponencial), [LaH] é a concentração de

ácido láctico e [H+] é a concentração de íons hidrogênio. A equação 9 descreve o

crescimento de ambos microrganismos, tanto da bactéria láctica quanto do

microrganismo indicador – particularmente para o antagonismo – requer a adição

de uma equação diferencial apresentada na equação 10.

)((.).)(][

tNdt

tLaHdi

total π= Equação 10

Onde π (.) é a taxa específica de produção de ácido láctico pela bactéria

antagonista. O [LaH]total se refere à concentração de ácido láctico, i. e. , a soma do

ácido láctico dissociado e não-dissociado( Bernaerts et al, 2004).

Para descrever o processo químico de dissociação de ácido láctico em um

meio complexo foi utilizada uma equação química clássica, apresentada na

equação 11.

LaHKH

PHLaH

+= +

+

][

].[][ Equação 11

Onde P é a concentração de ácido láctico, [H+] é a concentração de íons

hidrogênio e KLaH = 10-3.86M.(constante de dissociação do ácido láctico em Molar).

Para descrever a inibição foi uitilizada a equação 12

βα

µ

−

−= +

+

+

max

]

max, ][

[1.

][

][1

H

H

LaH

LaHHLaH quando [LaH]≤[LaH]max e [H+]≤[H+]max

Quando [LaH]>[LaH]max ou [H+] > [H+]Max Equação 12

48

Com [LaH]max a máxima concentração de ácido láctico quando cessa o

crescimento, [H+] a concentração de protóns no pH mimímo de crescimento e α e

β parâmetros positivos. O termo de inibição ( +HLaH ,µ )não tem efeitos na cinética

microbiana, contanto que os valores das concentrações de ácido láctico

dissociado e a concentração de prótons premaneçam abaixo do valor inibitório.

Para completar a estrutura do modelo, a taxa de produção de ácido láctico

precisa ser matemáticamente modelada. Esta taxa pode ser descrita pela equação

13

])[],([(.).(.) ,/++= HLaHYY imiNLaH i

µπ Equação 13

A estratégia de construção do modelo neste caso, começa com a

identificação do principal fenômeno que determina a dinâmica microbiana. Este

exemplo ilustra que o microrganismo pode crescer sozinho, porém causa

mudanças nas condições ambientais do meio de cultivo, i. e., produção de

metabólitos. O modelo descreveu a inibição do patógeno pela bactéria láctica.

3.15. Modelo Quase-químico

O modelo quase-químico combina os conceitos de cinética química e

modelagem preditiva em alimentos. O modelo quase-químico é um modelo

baseado na simples premissa de modelos matemáticos que compreendem uma

ou mais equações diferenciais (Ross et al, 2005). Esse modelo tem a vantagem de

ser capaz de descrever crescimento/morte sendo possível a avaliação da morte a

partir da fase estacionária do microrganismo. O modelo quase-químico postula um

Fase de crescimento Fase de manutenção

49

esquema de reações, que combinam reações de crescimento autocatalítico e

feedback negativo, e presumidamente a formação de um metabólito antagonista

hipotético, o qual induz a morte as células viáveis em multiplicação (Ross et al,

2005). Sendo assim este modelo pode ser definido como um modelo cinético que

relata 4 fases do ciclo de vida do crescimento microbiano (fase de adaptação, fase

exponencial, fase estacionária e a morte) baseado num sistema de equações

diferenciais ordinárias(ODEs) (Ross et al, 2005; Taub et al 2003).

O ciclo de vida microbiano que inclui os fenômenos de crescimento/morte

pode ser integrado dividindo-se o ciclo de vida das bactérias em 4 passos. A fase

de adaptação das células é denominada por M, a fase de crescimento M*, o

antagonista por A e as morte das células por D. (Taub, 2003):

1º passo (ativação): representa a ativação das células da fase lag para a

fase de exponencial (M → M*), e ocorre a uma taxa constante k1;

2º passo (multiplicação): representa a multiplicação das células (M*→2

M*+A), com uma taxa constante k2 .Há a formação concomitante de metabólitos

antagônicos (A) que interagem com as células em multiplicação.

3ºpasso (sensibilização): o microrganismo interage com os metabólitos

antagonistas que sensibilizam as células para morte (D) (A+M*→D) a uma taxa

constante k3.

4ºpasso (morte): ocorre a morte natural (M*→D), com taxa constante k4.

Taub et al (2003) apresentaram um modelo “quase-químico” para estudar a

cinética de crescimento/morte de S.aureus em pão para ração militar, onde o

modelo combina parâmetros como pH, atividade de água e temperatura.

50

A tabela abaixo apresenta as equações das velocidades e as ODEs

utilizados para a construção de um modelo quase-químico.

Tabela 5. Resumo do mecanismo e das equações para o modelo quase-químico

Passo Equações da velocidade

ODEs

M → M* Mkv 11 = MkvdtdM 11)( −=−= (1) M*→2

M*+A *

22 Mkv = )()( *14321

* AGMMkvvvvdtdM ε−+=−−+= (2)

A+M*→

D AMkv *

33 = )()( 2*

32 AkMvvdtdA ε−=−= (3)

)()( 4*

43 AkMvvdtdD ε+=−= (4) M*→D *

44 Mkv = )()()( * tMtMtU += (5)

Fonte: Ross (2005)

Onde: G = (k1-k2), taxa de crescimento natural;

U = M-M*, mudança na população.

ε = (0≤ε<<1), erro estocástico

vi= velocidade em função do tempo em cada passo

Para Taub et al (2003), quando o modelo quase-químico foi comparado ao

modelo de Gompertz observou-se que o modelo quase-químico foi capaz de se

ajustar aos dados de crescimento e morte de maneira contínua. Entretanto,

também se observou que a estimativa da taxa de crescimento para o modelo

ajustado com todos os dados, ou somente com os dados da fase de crescimento,

não foram significativamente diferentes.

O modelo quase-químico é um modelo versátil capaz de caracterizar a

cinética de crescimentos dos microrganismos nos alimentos, descrevendo os

cenários de crescimento, crescimento-morte e a morte (inativação), através de

pequenas mudanças no ambiente experimental (Doona et al, 2005).

51

3.16. MODELAGEM SECUNDÁRIA

Os que modelos descrevem os efeitos das condições ambientais físicas,

químicas e caracteristicas bióticas, nos parâmetros primários de crescimento são

chamados modelos secindários (Ross & Dalgaard, 2004) .

De acordo com McMeekin e Ross (2002), na modelagem secundária tem

que ser considerado o efeito individual de cada fator mas, em diferentes situações,

é necessário considerar como os diferentes fatores interagem restringindo o

crescimento microbiano.

3.16.1. Modelo de Belehràdek ou raiz quadrada

Em 1982, Ratkwosky apresentou um modelo simples para descrever a taxa

de crescimento como uma função da temperatura. O modelo era baseado na

observação da raiz quadrada da taxa de degradação do nucleotídeo no músculo

de carpa, em função da temperatura (Ross & McMeekin, 1994).

)( minTTbk −= Equação 14

onde:

k : taxa de crescimento; T: temperatura; Tmin: temperatura mínima de crescimento. O modelo da raiz quadrada foi desenvolvido primeiramente com o objetivo

de predizer o efeito da temperatura no crescimento bacteriano (Delignette-Muller

et al, 1995). Em 1983 Ratkwosky, estendeu a aplicabilidade da equação incluindo

as temperaturas superótimas de crescimento.

52

De acordo com Delignette-Muller et al (1995), variantes do modelo da raiz

quadrada foram propostos a partir do modelo original levando em conta outros

fatores como pH e atividade de água (aw).

Apesar de sua parcimônia, o modelo da Raiz Quadrada ajusta-se aos

dados tão bem quanto os outros utilizados em microbiologia preditiva, como o

modelo polinomial, e muitas vezes, melhor. Justamente por esta qualidade, é

muito mais geral que os modelos com muitos parâmetros (Ross & McMeekin,

1994).

3.16.2. Modelo de Arrhenius modificado ou modelo de Davey

O modelo de Davey (1989) foi baseado no modelo de Arrhenius.

22423

212110 .)ln( VCVCVCVCCK +++= + Equação 15

onde:

C1 ...C4 : são coeficientes a serem calculados; V1 e V2: são respectivamente fatores ambientais (aw, temperatura absoluta ou pH); K: Taxa de crescimento; 3.16.3. Modelos de superfície de resposta

São polinômios múltiplos ajustados por regressão padrão. Eles podem

conter termos lineares, quadráticos, cúbicos, recíprocos, e podem conter termos

de interações ou cruzados. Freqüentemente, o logaritmo da resposta é melhor

ajustado, e a equação pode ser apresentada na forma completa, ou simplificada

até os termos estatisticamente representativos (Ross & McMeekin , 1994).

A equação genérica de um modelo polinomial (superfície de resposta) está

apresentada abaixo:

53

ε++++++++++=

329318

217236

225

2143322110

**

*

xxbxxb

xxbxbxbxbxbxbxbby

Equação 16

Onde:

λ = tempo de adaptação (dias) x1 …x3 = parâmetros de controle bo...b9 = coeficientes do modelo ε = erro

3.17. Validação de modelos

Após coletar certo número de curvas e ajustar o modelo primário e

estabelecer o modelo secundário é importante testar a precisão do modelo com

novos dados e novas combinações dos fatores. A necessidade de desenvolver

índices interpretáveis, medidas baseadas na razão média entre o tempo predito e

o observado, originou os fatores de Bias e Exatidão (Ross,1996).

3.17.1. Fator de bias

O fator de bias é o antilogaritmo da razão média dos valores preditos e os

observados.

Por conveniência, este valor é nomeado Fator de Bias, e é definido

(Ross,1996):

∑

nobservado

predito

log10 Equação 17

onde:

predito: valor predito para a variável; observado: valores observados para a variável; n: número de observações utilizadas no cálculo.

54

O fator de Bias avalia quantitativamente onde o modelo prediz de maneira

segura determinando assim, em média, onde os dados preditos estão, por baixo

ou por cima da linha de equivalência (Ross,1996).

3.17.2. Fator de exatidão

O fator de exatidão é o valor absoluto do logaritmo da razão média do

predito e o observado.

Por conveniência, este valor é nomeado Fator de Exatidão, e é definido

(Ross,1996):

∑ nobservado

preditolog

10 Equação 18

onde:

predito: valor predito para a variável; observado: valores observados para a variável; n: número de observações utilizadas no cálculo.

O fator de exatidão, por se tratar de um valor absoluto, sempre terá valores

maiores que um. Este fator indica a distância entre cada ponto observado da linha

de equivalência da predição, a variabilidade dos dados, ou seja uma simples

medida do nível de confiança do modelo de predição (Ross,1996).

3.17.3. Erro do quadrado médio (MSE)

O erro do quadrado médio (MSE) é um índice estatístico, onde é definido pela

soma quadrática do resíduo divido pelo número de graus de liberdade. O MSE

representa o desvio entre a medida experimental e o valor predito. Quanto menor

o valor do MSE melhor será a adequação do modelo (George, 1999).

55

( )nn

SSEMSE preditoobser2µµ −

== Equação 19

56

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Seleção das linhagens

Foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae CCT 0759, não floculante,

por ser descrita como possuidora de alto potencial fermentador e muito utilizada

nas indústrias de álcool brasileiras. Para o estudo do antagonismo láctico foi

selecionado o Lactobacillus fermentum CCT1668, a bactéria láctica contaminante

com maior incidência nas plantas de produção de etanol (Gallo, 1990). As culturas

foram obtidas de isolados de usinas de álcool da coleção de culturas da Fundação

Tropical de Pesquisas e Tecnologia André Tosello.

A manutenção da S. cerevisiae foi feita em Agar Extrato de Malte (MEA)

formulado com pH 6.7, para o L.fermentum. O meio de manutenção foi Mann,

Rogosa & Sharpe (MRS) caldo (DIFCO), e as cepas estocadas a 4ºC. Antes de

cada experimentos as culturas eram repicadas três vezes.

4.2. Delineamento experimental

Para o delineamento experimental, foi selecionado um desenho composto

central rotacional (DCCR) com duas variáveis, incluindo 3 pontos centrais e 4

pontos axiais, totalizando 11 ensaios (2k+2*k+no). Os níveis deste planejamento

estão apresentados na tabela 6. Como variáveis do processo foram selecionadas

a temperatura de processo fermentativo (T) e nível de inóculo de Lactobacillus

fermentum (L). Os parâmetros do processo foram o nível de inóculo da levedura

mantido constante em 106 UFC/mL (Essia Ngang, 1990). No Brasil, a inoculação é

feita levando em consideração o peso seco da levedura, iniciando com 10 g de

57

fermento (Lima et al, 2001). O pH do mosto (6,1±0,1) e a quantidade de sólidos

solúveis, presentes no mosto de cana-de-açúcar foram ajustados em 21.5ºBrix .

Como respostas do planejamento foram obtidas a taxa específica de crescimento

(µ − h-1), população máxima (Rg – UFC/mL), tempo de geração (G- h), tempo de

adaptação (λ - h) de ambos microrganismos, tanto em cultura pura quanto em

cultura mista. Durante cada ensaio, foram coletadas amostras em intervalos

regulares de tempo (vide item 4.5), para a determinação da concentração de ácido

láctico, etanol, frutose, glicose e glicerol (análises descritas no item 4.9), e

avaliação do índice de viabilidade da levedura quando cultivada em cultura pura e

mista (vide item 4.6).

Para cada ensaio realizado com a cultura mista, foram realizados outros dois

ensaios, conduzidos da mesma forma e com o mesmo substrato, para as culturas

puras de L.fermentum e S.cerevisiae, como controle. Para a descrição dos

experimentos, foi utilizado a seguinte codificação (valor de T(ºC) – corresponde à

temperatura de fermentação) –(S seguido do número indicando– nível de inóculo

da S. cerevisiae) – (L seguido do número indicando–nível de inóculo de

L.fermentum)). Exemplo experimento realizado a 28ºC, com 105UFC/mL de

inóculo de L.fermentum e com 106UFC/mL de inóculo de S. cerevisiae codificado

como (28S6L5).

58

Tabela 6. Desenho do planejamento experimental com valores codificados e (reais).

Ensaios Temperatura (ºC) Nível de inóculo de L. fermentun (UFC/mL)

01 -1(25) -1(103) 02 +1(31) -1(103) 03 -1(25) +1(107) 04 +1(31) +1(107) 05 -1.4(24) 0(105) 06 +1.4(32) 0(105) 07 0(28) -1.4(101) 08 0(28) +1.4(108) 09 0(28) 0(105) 10 0(28) 0(105) 11 0(28) 0(105)

4.2.1. Variáveis de controle do processo fermentativo

Os níveis das variáveis independentes foram selecionados conforme os itens

4.2.1.1 e 4.2.1.2.

4.2.1.1. Temperatura do processo fermentativo

As temperaturas selecionadas para o processo fermentativo foram descritas,

por Costa et al (2001) levando em consideração que temperatura acima de 40ºC

causam decréscimo na viabilidade celular da levedura (Marañón et al 1999),

portanto, a faixa de temperatura selecionada foi de 24ºC a 32ºC (tabela 6). As

amostras foram inoculadas e incubadas em agitador, com agitação de 120rpm

(New Brunswick Scientific, Model G-27, U.S.A.) com temperatura controlada

(±0,5ºC). As variações de temperaturas foram registradas com o auxílio do

registrador de temperatura OMEGA CL526 mediante termopar tipo T flexível

Omega TT-T- 30-SLE, fio duplex cobre –constantan. Caso necessário, nas

temperatura mais baixas (24 e 25oC) era acionado manualmente o controle de

refrigeração do agitador.

59

4.2.1.2. Nível de inóculo de Lactobacillus fermentum

O microrganismo, L.fermentum, foi inoculado em mosto, previamente

preparado, em cinco níveis de inóculo variando de 101 a 108 UFC/mL, avaliando

níveis extremos de contaminação (tabela 6). O ponto central do desenho

experimental foi determinado conforme relatos de Gallo (1990) para a ocorrência

de L.fermentum no mosto de caldo de cana resfriado, que foi da ordem de 105

UFC/mL.

4.3. Inoculação

O caldo de cana-de-açúcar, composto por 15% (v/v) de caldo de cana

proveniente dos filtros a vácuo das usinas a 13,2ºBrix, e o restante 63% (v/v) de

caldo de cana do segundo terno de extração da moenda a 10ºBrix, clarificado

industrialmente, foi filtrado em algodão, para a retirada de sujidades (Nolasco Jr,

2005).

Para o ajuste do sólidos solúveis, 21.5ºBrix, foi utilizado mel a 78ºBrix, a

medição do teor de sólidos solúveis foi realizada com o auxilio de um refratômetro

manual (Atago,Type 500). O cálculo das proporções foi realizado pelo Quadrado

Pearson (vide representação a seguir), um método simples, o qual permite o

calculo das proporções de dois componentes de uma mistura.

ºBrix do caldo: 12ºbrix 55.3 21.5 ºBrix + 64.8 ºBrix do mel 76.8ºBrix 9.5

Proporção do mosto a 12ºBrix: %34.858.64

1003.55 =x

60

Proporção do mel a 76.8ºBrix: %66.148.64

1005.9 =x

Após misturas nas proporções calculadas, a concentração de sólidos

solúveis foi confirmada com o refratômetro.

O mosto a 21,5ºBrix, foi acondicionado em garrafões de vidro com

capacidade para 9L, e tratao termicamente a 121ºC por 40 minutos (Nolasco Jr,

2005).

Após o tratamento térmico para eliminação dos contaminantes, o mosto foi

transferido para garrafas PET (Polietilenotereftalato) com capacidade para 500mL,

previamente sanitizadas com Vortex ES® 0,03% conforme metodologia adaptada

de Petrus (2000), e estocadas a -20ºC até a realização dos ensaios.

4.4. Preparo do inóculo

O preparo do inóculo dos microrganismos foi realizado por 3 transferências

sucessivas em meio líquido Malt Extract broth (MEB) formulado com pH6,7 para a

levedura e MRS caldo (Man Rogosa Sharpe) (DIFCO) para o lactobacilo, num

período de 72 horas antecedentes a cada experimento.

4.4.1. Pré-inóculo da levedura (Saccharomyces cerevisiae)

A cultura da levedura foi repicada em tubos com Agar Extrato de Malte

(MEA, formulado pH.6,7) e incubada à 25ºC por 5 dias. Após este período, foram

realizadas 3 transferências sucessivas, como indicado a seguir, para a

multiplicação das células de levedura. O crescimento do tubo com MEA foi

transferido para 50 mL Caldo Extrato de Malte (MEB) e incubado com agitação de

61

120 rpm (New Brunswick Scientific, Model G-27, U.S.A.) por 24 horas à

temperatura do respectivo experimento (Tabela 6). Após este período, os 50mL de

meio com crescimento foram transferidos para 50mL de MEB, e incubados, com

agitação, por 24 horas à respectiva temperatura. Decorrido 24 horas de

incubação, 100mL de meio, com crescimento, foram transferidos para

erlenmeyeres contendo 100mL de MEB, e reincubados por 24 horas, com

agitação.

4.4.2. Pré-inóculo do lactobacilo (Lactobacillus fermentum)

A cultura da bactéria foi repicada em MRS caldo e incubada a 32ºC por 72

horas. Após este período, foram realizadas 3 transferências sucessivas para a

multiplicação das células bacterianas: foi retirado 1mL da suspensão bacteriana e

transferido para 50mL de MRS caldo. Esta suspensão foi incubada com agitação

(New Brunswick Scientific, Model G-27, U.S.A.) à temperatura do respectivo

experimento (Tabela 6) por 24 horas, com agitação de 120rpm. Decorrido o

período de incubação, 50mL da suspensão foram transferidos para frascos

erlenmeyeres, contendo 50mL de MRS caldo, e reincubados com agitação por 24

horas. Após o período de 24 horas, os 100mL da suspensão foram transferidos

para erlenmeyeres contendo 100mL de MRS caldo, incubados com agitação por

24 horas.

62

4.4.3. Ajuste do inóculo da levedura

A partir do pré-inóculo, a concentração inicial da levedura foi ajustada

mediante contagem em câmara de Neubauer (Nobre, 2006). A técnica consiste

em misturar partes iguais da suspensão de levedura, adequadamente diluída e da

solução corante (Azul de Metileno) (Lee et al, 1981). Com o auxilio da pipeta

Pasteur, foi transferida uma gota da amostra (suspensão de células + corante)

para a câmara e esta recoberta com uma lamínula, então levada ao microscópio

óptico na objetiva de 40X.

Para determinação do número de células, foram contados 5 quadrados

médios na diagonal da lâmina (Figura 3) . O cálculo do número de células foi

realizado de acordo com a equação 20 (Laluce et al,2007)

xDxNxC 41025= Equação 20

Onde: C: número de células/mL

N: média do número de células nos 5 quadrados médios

25: números de quadrados médios da câmara

104: correção do volume da Câmara de Neubauer (cm3 ou mL)

D: fator de diluição da suspensão de leveduras

Figura 3. Quadrado Médio da Câmara de Neubauer e sentido de contagem dos

quadrados médios

63

O cálculo da concentração do volume de suspensão a ser inoculada foi

realizado de acordo com a equação 21.

Volume a ser inoculado = Concentração de células desejada X Volume de meio no frasco

Concentração da suspensão

Equação 21

4.4.4. Ajuste do inóculo do lactobacilo

A partir do pré-inóculo, a concentração de células do lactobacilo foi ajustado

com o auxilio do aparelho Densimat® (BioMérieux, S.a, France). A concentração

da bactéria foi ajustada conforme os experimentos descritos na tabela 6. Os

padrões McFarland (Tabela 7) foram utilizados como referência para ajuste da

concentração de células bacterianas, o equipamento avalia a turbidez da

suspensão num comprimento de onda de 550nm.

Tabela 7.Equivalência dos padrões McFarland

Padrão Concentração

bacteriana X (106)

Densidade óptica teórica

a 550nm

0.5 150 0.125

1.0 300 0.25

2.0 600 0.50

3.0 900 0.75

4.0 1200 1.00

5.0 1500 1.25

Fonte: APHA, 2001.

O ajuste foi realizado considerando um volume de 200mL de mosto de

cana-de-açúcar.

64

Para as concentrações de inóculo de 105 e 103UFC/mL do lactobacilo, a

suspensão foi ajustada no padrão 2.0 (6.0X108UFC/mL). A partir do inóculo

ajustado, foram feitas diluições decimais sucessivas para concentração 107

UFC/mL e 105 UFC/mL, respectivamente. O cálculo do volume de inóculo foi

realizado de acordo com a equação 21. Para os experimentos com concentração

de células em 107UFC/mL, o inóculo foi ajustado no padrão 5 (1,5x109UFC/mL). O

cálculo do volume foi procedido da mesma forma descrita anteriormente. Na

concentração de 101UFC/mL, a suspensão foi ajustada no padrão

1(3,0x108UFC/mL) diluída até 3,0x103UFC/mL, o procedimento para o cálculo foi

realizado como os demais experimentos. Para o ajuste do inóculo de 108UFC/mL

foi utilizada o padrão 5(1,5x109UFC/mL). O cálculo do volume foi realizado

conforme equação 19.

4.5. Coleta de amostras do processo fermentativo

As coletas foram realizadas de 3 em 3 horas num período de 24 horas

iniciais de fermentação, 6 em 6 horas de 30 horas até 60 horas de processo, a

partir de 68 horas de fermentação até o término do ensaio, 100 horas, as coletas

foram de 8 em 8 horas.

Em cada coleta, foi retirada uma alíquota de 7mL de mosto fermentado,

2mL destinados à contagem por diluição e plaqueamento em superfície para e

levedura e profundidade para o lactobacilo, 1mL para a determinação do índice de

viabilidade de levedura, e 4mL para a análise das concentrações de etanol e ácido

láctico e aferição do pH. As amostras para a determinação da concentração de

65

etanol e ácido láctico foram acondicionadas em frascos vedados e mantidas

congeladas a -20ºC até a determinação posterior dos respectivos compostos.

4.6. Avaliação da viabilidade das células de levedu ra

Para avaliação da viabilidade, foi realizada contagem em Câmara de

Neubauer, conforme procedimento descrito no item 4.4.3.

As células com alta atividade fisiológica não se coloriram, enquanto as

células inativas (mortas) apresentaram-se coloridas de azul (Figura 4). O número

de células viáveis foi calculado pela equação 18, da mesma forma foi determinado

o número de células inviáveis (coloridas).

Figura 4. Determinação da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno. As células coradas de azul são células mortas, enquanto as incolores são células viáveis

Para o cálculo do índice de viabilidade foi utilizada a equação 22 (Lee et al,

1981).

66

Número de células incolores

Número de células incolores + Número de células coloridas

Equação 22

4.7. Avaliação do crescimento

4.7.1. Contagem das células da S. cerevisiae

A avaliação do crescimento foi realizada mediante análise microbiológica de

contagem de S.cerevisiae e L.fermentum. Para a levedura, foi utilizada a

metodologia descrita Beuchat e Cousin (2001). A contagem da levedura foi

realizada mediante diluições decimais sucessivas que foram inoculadas em

superfície utilizando como meio de cultura Malt Extract Agar (MEA) formulado com

pH 6.7 e suplementado de cloranfenicol (100mg/L) e tetraciclina (100mg/L). As

placas foram incubadas à temperatura ótima de crescimento (25ºC) por 5 dias.

Decorrido o crescimento, as placas foram contadas e as colônias presentes nas

placas foram avaliadas quanto a sua morfologia macroscópica (tipo de borda, cor

(topo e fundo), aspecto da colônia e tipo de crescimento) e microscópica.

4.7.2. Contagem das células do L. fermentum

Para o L.fermentum, foi utilizada a metodologia descrita por Hall et al.

(2001). Sendo assim foram realizadas diluições decimais sucessivas inoculadas

em profundidade utilizando como meio de cultura MRS Agar (Oxoid) acidificado

com a adição de ácido acético 1N até pH 5,5±0,1 e suplementado com Natamax®

(Danisco) (50mg/mL) (Botes et al, 2007; Jullian, 2005). As placas foram incubadas

à temperatura ótima de crescimento (35ºC) por 72 horas. Decorrido o crescimento,

as placas foram contadas e as colônias presentes nas placas foram avaliadas

Índice de viabilidade =

67

quanto a sua morfologia macroscópica (tipo de borda, cor (topo e fundo), aspecto

da colônia e tipo de crescimento) e microscópica.

4.8. Medição do pH do mosto

O pH foi aferido em potênciometro digital Digimed, modelo DMPH-2, a cada

coleta.

4.9. Avaliação da concentração de ácido láctico, ác ido acético, etanol,

frutose, glicose, glicerol

Os compostos foram detectados e quantificados por cromatografia líquida

de alta eficiência (CLAE/HPLC). A metodologia utilizada foi a proposta por López

& Gómez (1996). Para a análises foi utilizado um sistema cromatográfico líquido

de alta eficiência (HPLC) Shimadzu (Integrador – Shimadzu – CR4A), composto

por uma bomba (Shimadzu–CC-6A), um injetor manual, uma coluna para detecção

de ácidos orgânicos, etanol e açúcares (Sulpelco–Supelco Gel C.610H, Catalogue

Number 5-9320), forno (Shimadzu–CTO6A) e desgaseificador automático

(Shimadzu – DGU2A) conectados em série.

As aliquotas de mosto fermentado coletadas durante o processo

fermentativo foram centrifugadas a 15094xg/4ºC por 20 minutos, e posteriormente

filtradas em membrana PVDF (polivinilideno) material de 0,22µm, previamente a

injeção no equipamento.

As amostras foram eluídas em ácido sulfúrico 0,65mM, a uma taxa de fluxo

isocrática de 0,7mL/mim. A temperatura de operação da coluna foi de 75ºC. Os

68

compostos eluídos na fase móvel (ácido sulfúrico 0,65mM) foram analisados por

detector UV (Shimadzu–SPD6A), ajustado a 214nm, e detector de índice de

refração (RI) (Shimadzu–RI 10A), com a temperatura de cela do RI mantida a

50ºC durante os ensaios.

4.9.1. Preparo da fase móvel

Para o preparo da fase móvel, foi utilizada água ultra-pura (Milliq®, Millipore;

Milford, MA) e ácido sulfúrico (Merck, Alemanha). Foi preparada uma fase móvel,

diariamente, com concentração de 0,65mM de ácido sulfúrico, e filtrada, com

sistema de filtração (Millipore; Milford, MA) acoplado a uma bomba de vácuo

(Millipore; Milford, MA – Millipore vaccum pressure pump) (Figura 5) com

membrana de acetato de celulose com porosidade de 0,45µm (Millipore; Milford,

MA).

Figura 5. Sistema de filtração a vácuo para a fase móvel.

69

4.9.2. Condicionamento da coluna

Antes da injeção das amostras, a coluna foi condicionada com a respectiva

fase móvel e mantida na temperatura de 75ºC. O processo de condicionamento foi

conduzido por 12 horas.

4.9.3. Curva padrão da glicose

Para a preparação da curva padrão da glicose, foi utilizada Glicose Anidra

P.A. (Merck, Alemanha), com teor de pureza de 99,5%. Foram preparados 50mL

de solução estoque com concentração de 100g/L. A partir desta solução, foram

feitas diluições para a preparação das demais concentrações 75, 50, 25, 10, 5, 1 e

0,1g/L. Para a detecção da glicose foi utilizado o índice de refração, com

temperatura de cela de 50ºC, a taxa de fluxo isocrático de 0,7mL/min e

temperatura da coluna de 75ºC.

4.9.4. Curva padrão frutose

A curva padrão da Frutose P.A. (Synth, Brasil), com teor de pureza de

99,5%, foi construída nas concentrações de 100, 75, 50, 25, 10, 5, 1, 0,1g/L. Para

tanto foram preparados 50mL de uma solução estoque com concentração de

100g/L, e realizadas diluições para a preparação das demais concentrações. Para

a detecção da frutose, foi utilizada detecção por indice de refração (RI) com

temperatura de cela de 50ºC, a taxa de fluxo isocrático de 0,7mL/min e

temperatura da coluna de 75ºC.

70

4.9.5. Curva padrão etanol

Para a preparação da curva padrão do Etanol (VETEC, Brasil), grau HPLC

com 95% de pureza, foram utilizadas concentrações de 100, 75, 50, 25, 10, 5, 1,

0,1g/L. Foi preparada uma solução estoque de 100g/L. A partir desta solução,

preparadas as demais diluições. Para a detecção do etanol, foi utilizado o índice

de refração, com temperatura de cela de 50ºC, a taxa de fluxo isocrático de

0,7mL/min e temperatura da coluna de 75ºC.

4.9.6. Curva padrão glicerol

Para a preparação da curva padrão do Glicerol (Sigma Aldrich, Alemanha),

teor de pureza de 99,5%, foram utilizadas concentrações de 100, 75, 50, 25, 10,

5, 1, 0,1g/L. Foi preparada uma solução estoque de 100g/L. A partir desta

solução, preparadas as demais diluições. Para a detecção do glicerol, foi utilizado

o índice de refração, com temperatura de cela de 50ºC, a taxa de fluxo isocrático

de 0,7mL/min e temperatura da coluna de 75ºC.

4.9.7. Curva padrão ácido láctico

Para a preparação da curva padrão do ácido láctico (Sigma

Aldrich,Alemanha), teor de pureza de 99,8%, foram utilizadas concentrações de

10, 7, 5, 3, 1, 0.5, 0,1 mg/mL. Foi preparada uma solução estoque de 10mg/mL. A

partir desta solução preparadas as demais diluições. Para a detecção do ácido

láctico, foi utilizado o índice de refração, com temperatura de cela de 50ºC, a taxa

de fluxo isocrático de 0,7mL/min e temperatura da coluna de 75ºC. Para o ácido

láctico, foram testados os padrões dos isômeros D e L. No entanto, com a

71

metodologia utilizada não foi possível a diferenciação destes isômeros, portanto,

foi ultizada uma mistura racêmica do ácido como padrão de detecção.

4.9.8. Curva padrão ácido ácetico

Para a preparação da curva padrão do ácido acético (Vetec, Brasil), teor de

pureza de 99,5%, foram utilizadas concentrações de 10, 7, 5, 3, 1, 0.5, 0,1 mg/mL.

Foi preparada uma solução estoque de 10mg/mL. A partir desta solução,

preparadas as demais diluições. Para a detecção do ácido láctico, foi utilizado o

índice de refração, com temperatura de cela de 50ºC, a taxa de fluxo isocrático de

0,7mL/min e temperatura da coluna de 75ºC.

4.9.9. Análise das amostras

As amostras de mosto de cana-de-açúcar fermentadas foram filtradas

previamente à injeção no cromatográfo, em membrana de PDVF (Millipore) de

0,22um de poro e 13mm de diâmetro. Foram injetados 20µl de amostra na coluna

de detecção. Para o cálculo das concentrações dos compostos detectados, foram

comparados os tempos de retenção das amostras com o tempo de retenção dos

padrões e as concentrações foram calculadas de acordo com as curvas padrões

(ver anexo D).

72

4.10. Modelagem preditiva

4.10.1. Modelagem primária

Os modelos de Baranyi & Roberts (1994) e Gompertz modificado (Zwietering et

al, 1991) foram utilizados para predizer os parâmetros de crescimento, tempo de

lag (λ), taxa específica de crescimento (µ), tempo de geração (G) e população

máxima (Rg) de cada microrganismo até a fase estacionária, Lactobacillus

fermentum e Saccharomyces cerevisiae. Para a determinação dos parâmetros

descritos acima, foi utilizado o software DMFIT versão 2.1. Os dados utilizados

foram o logarítimo da população versus tempo de cada microrganismo.

4.10.2. Modelo quase-químico

Foi utilizado o modelo quase-químico proposto por Ross et al (2005) para a

descrição das etapas de crescimento e morte da levedura e do lactobacilo tanto

em cultura pura quanto em cultura mista, considerando que este modelo descrevia

crescimento/morte da população de forma contínua, pressupondo que tanto a

levedura quanto o lactobacilo iniciariam um rápido declínio após a fase

exponencial devido à presença de metabólito antagonista.

O modelo foi ajustado aos dados experimentais, mediante a utilização do

software MATLAB 7.5 através da função ODE15S, juntamente com análise de

regressão não linear pela função LSQNONLIN, para o modelo quase-químico.

Os dados de entrada para a preparação do modelo foram a contagem celular

de ambos microrgansimos, chamada xd, e o intervalo de tempo de coleta de

dados, chamado td. Para o cálculo das constantes k de crescimento/declíniode

73

cada fase foram assumidos valores iniciais para k1, k2, k3 e k4 para ajuste deste

parâmetro pela função LSQNONLIN (vide anexo C).

Para a execução do modelo, foram criadas 4 subrotinas (vide anexo C). O

script SD, que chama a função não-linear calculando o erro pelo método dos

mínimos-quadrados, tendo como dados de saída a função f(x) e a norma do

passo; A função ED que auxilia no ajuste dos dados e minimiza o erro da função

pelo método dos míminos quadrados; A função utilizada para a solução do

sistema de equações diferenciais (ODE) é definida como FD. O script PredOde é

onde são calculadas as soluções de M, M*,A, D e U, este script somente calcula

os valores das soluções das equações diferenciais, não envolvendo o ajuste dos

dados. Os dados de saída deste script são taxa de crescimento (µ), tempo de

adaptação (λ) e população máxima (Rg).

4.10.3. Modelagem secundário

4.10.3.1. Modelagem de superficie de resposta

Foi aplicada a modelagem de superfície de resposta para as variáveis

dependentes λ, µ e concentração máxima de etanol produzido durante a

fermentação pela cultura mista, em função da temperatura de fermentação e nível

de inóculo de lactobacilo. Em cada experimento a determinação da concentração

de etanol foi calculada a partir da equação da curva padrão de etanol para cada

tempo; a partir, destes dados foi selecionado o valor máximo de etanol produzido

para cada situação. Com os dados das variáveis indenpendentes e concentração

máxima de etanol, foi usado o procedimento Industrial Statistics & Six Sigma e a

74

função Experimental Design, Central composite, non factorial, surface design do

Software Statistica 7.0 e utilizando o procedimento ANOVA (p<0,10). O modelo

encontrado foi validado estatisticamente através de análise de variância. Os

fatores de bias e exatidão foram calculados conforme descrito por Roos (1996).

4.10.3.2. Modelo de Davey (1989) e Raíz quadrada

Os parâmetros µ e λ foram modelados em função da temperatura de

fermentação para tanto foi utilizado o procedimento de regressão não-linear

Advanced Linear/ Non linear models e a função Non linear estimation do software

Statisitica 7.0. O modelo encontrado foi validado estatisticamente através de

análise de variância. Os fatores de bias e exatidão foram calculados conforme

descrito por Ross (1995).

75

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Curvas experimentais de crescimento e declino de Saccharomyces

cerevisiae e Lactobacillus fermentum

As curvas de crescimento e declínio experimentais, do lactobacilo e da

levedura, apresentadas na figura 6 no Anexo A demonstram que com o inóculo de

levedura constante em 106UFC/mL para todos os experimentos, e

independentemente do nível de inóculo do lactobacilo ou da temperatura do

processo fermentativo, o crescimento do Lactobacillus fermentum apresenta um

máximo entre 40 e 60 horas. Em contra-partida, neste mesmo período, o

crescimento da levedura que estava no estado estacionário, começa a decrescer

exponencialmente.

Ao avaliar a duração da fase exponencial da levedura, esta tem duração de

aproximadamente 20 horas tanto em cultura pura, quanto em cultura mista, este

fenômeno é idependente da presença do L.fermentum. O lactobacilo entra na fase

exponencial após a fase estacionária da levedura, sendo que a duração da fase

exponencial do lactobacilo foi dependente da presença da levedura. Por outro

lado, observa-se na figura 18, que o índice de viabilidade da levedura neste

mesmo período, para as mesmas condições experimentais, foi menor que 40%.

Em pesquisa de estimulação de lactobacilo na fermentação alcoólica em melaço

de beterraba, Essia-Ngang et al (1992), constataram que com o nível de inóculo

inicial de 107UFC/mL, o lactobacilo em cultura mista com a levedura, tem o

máximo de crescimento exponencial ao redor de 25 horas de fermentação,

momento no qual observaram maior índice de morte da levedura. Sendo assim,

76

pode-se verificar, que quando a levedura está na fase de declínio o lactobacilo

atingiu o auge do seu crescimento exponencial, isto poderia ser devido a há o

excreção de aminoácidos e vitaminas no meio de cultivo (Oliva-Neto & Yokoya,

1997).

Pôde-se (ver curvas Anexo A) verificar o aumento de 5 a 6 ciclos

logarítmicos para o crescimento do lactobacilo a partir do inóculo inicial, enquanto

para a levedura este aumento é de apenas dois ciclos logarítmicos em todos os

processos fermentativos.

1,00E+00

1,00E+04

1,00E+08

1,00E+12

0 20 40 60 80 100 120

Lact

obac

illus

(UF

C/m

L)

Tempo (horas)

Lactobacillus cultura pura Lactobacillus cultura mista

Levedura cultura pura Levedura cultura mista

Figura 6. Curvas experimentais de crescimento para o experimento 04 (31S6L7), para as culturas mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum em mosto de cana-de-açúcar.

77

5.2. Modelagem primária

As curvas de crescimento do lactobacilo e da levedura apresentadas a

seguir foram modeladas até o final da fase estacionária conforme Baranyi e

Roberts (1994) e Gompertz modificado (Zwietering, 1991), utilizando o software

DMFIT 2.1. Os valores estimados dos parâmetros pelo modelo de Baranyi &

Roberts (1994), tempo de adaptação (lag), taxa de crescimento (µ.) e população

máxima estão apresentados nas tabelas 9 e 10 para as culturas mistas e puras,

respectivamente. Para as curvas ajustadas pelo modelo de Gompertz modificado

(Zwietering et al, 1991) (vide tabelas 11 e 12), em dois experimentos não tiveram

bom coeficiente de correlação dos dados (R2<0,90), um para a cultura pura de

lactobacilo 04(31S0L7), e outro para a cultura mista de levedura 02 (31S6L3). O

modelo de Gompertz modificado não foi capaz de predizer o tempo de adaptação

para a cultura mista de lactobacilo no caso dos experimentos 02(31S6L3), 03

(25S6L7), 06(32S6L5), 7(28S6L1), 09 (28S6L5), 10(28S6L5) e 11(28S6L5).

Pelo coeficiente correlação dos dados (R2> 0,92) pode-se observar muito

bom ajuste do modelo de Baranyi e Roberts (1994), indicando que este descreve

melhor, quando comparado ao modelo de Gompertz modificado, o fenômeno de

crescimento de ambos microrganismos.

Portanto, para a modelagem primária optou-se pelos parâmetros preditos

pelo modelo de Baranyi & Roberts (1994).

Observando a tabela 9 e figura 7 (25S6L3), pode-se observar que não há

diferença na taxa de crescimento da levedura quando em cultura pura (0,19h-1) ou

mista (0,18h-1), isto também pode ser observado para a população máxima, no

entanto houve uma pequena diferença entre o tempo de adaptação da cultura

78

pura e mista, de 7,04h para 5,61h, respectivamente. Porém para o lactobacilo há

um decréscimo na taxa de crescimento de 0,30h-1 para 0,21h-1quando este é

cultivado juntamente com a levedura. Este fato pode ser relacionado com a

diferença na concentração de células dos microrganismos, pois a levedura neste

experimento, foi inoculada em maior concentração (106UFC/mL) que o lactobacilo

(103UFC/ml), desta forma a S. cerevisiae reduziu o crescimento de L.fermentum

no mosto de cana-de-açúcar. Este resultado está de acordo como os

apresentados por Thomas et al (2001). No entanto, o lactobacilo, quando em co-

cultura com a levedura atinge a população máxima de 3,04x109UFC/mL, enquanto

que o lactobacilo quando cultivado em cultura pura atingiu população máxima de

5,83x108UFC/mL.

A população máxima da levedura, atingindo 108UFC/mL em todos os

experimentos, não sofre reduções consideráveis quando em co-cultura com a

bactéria láctica. Em cultura pura, a redução na população máxima do lactobacilo

pode ser devido à ausência de micronutrientes que são liberados com a autólise

das células da levedura, podendo-se destacar as vitaminas B12 e biotina,

permitindo desta forma que o lactobacilo, quando cultivado juntamente com a

levedura, atinja níveis elevados durante o processo de fermentação alcoólica. Na

figura 7, pode-se avaliar também a extensão da fase exponencial da levedura que

é de aproximadamente 10 horas, apresenta uma longa curvatura de aceleração

negativa antes da fase estacionária. A fase exponencial do lactobacilo é quase 3

vezes maior, aproximadamente 30 horas.

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0

1

2

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7

0 10 20 30 40 50 60 70 80Tempo (horas)

Log

N/N

0

Baranyi - lactobacilo puro Baranyi - lactobacilo mistoBaranyi - levedura pura Baranyi - levedura mistaDados experimentais - lactobacilo puro Dados experimentais - lactobacilo mistoDados experimentais - levedura pura Dados experimentais - levedura mista

Figura 7. Curvas de crescimento experimento 01(25S6L3) de L.fermentum e S. cerevisiae , em culturas puras e culturas mistas.

Analisando-se a figura 8 (31S6L3), pode-se observar que o tempo de

adaptação do lactobacilo sofreu redução quando cultivado em cultura mista com a

levedura, passando de 7,12 horas em cultura pura para 2,62 horas. A levedura foi

cultivada com o lactobacilo e teve seu tempo de adaptação de 1,26 horas e em

cultura pura sendo elevado 6 horas. Não foi encontrado na literatura relatos para a

comparação destes resultados, no entanto parece existir sinergismo entre ambos

os microrganismos, com relação ao tempo de adaptação, facilitando, em alguns

casos, a adaptação um para o outro. Este fato é importante pois, em cultura mista,

a levedura entra na fase exponencial num tempo 4 vezes menor do que quando

cultivada em cultura pura. Neste experimento, a taxa de crescimento do

lactobacilo, quando em co-cultura com a levedura foi 0,35h-1, sendo que a mesma

sofre uma redução para 0,17h-1 quando este microrganismo foi cultivado sem a

presença da levedura. Este acontecimento pode estar correlacionado ao fato do

80

lactobacilo requerer uma imensa variedade de fatores para seu crescimento,

sendo que dentre os mais importantes pode-se citar nucleotídeos, aminoácidos e

vitaminas, como Biotina e vitamina B12. É sabido que a biotina é um fator

essencial de crescimento para a S. cerevisiae, de modo similar quando suas

células são lisadas após algumas horas do processo fermentativo essa biotina vai

sendo liberado gradativamente no meio a partir do final da fase exponencial até o

inicio da fase estacionária, dando condições favoráveis para o desenvolvimento

para o lactobacilo (Oliva-Neto & Yokoya,1997). No entanto, para o mesmo

experimento, a levedura teve a taxa de crescimento afetada pela presença do

lactobacilo, quando em cultura pura a taxa foi de 0,24h-1, sofrendo uma redução

para 0,16 h-1, quando cultivada juntamente com a bactéria láctica, afetando desta

forma o tempo de geração da levedura de 2,88 horas para 4,30 horas (ver tabelas

8 e 9). Essia-Ngang et al (1989) quando avaliaram o efeito do ácido láctico,

intencionalmente adicionado, nos parâmetros de crescimento da levedura, em

concentração de 3x106UFC/mL em melaço de beterraba, verificaram que, com o

aumento da concentração de ácido láctico no meio de cultivo de 5 g/L para 30 g/L,

houve a redução da taxa de crescimento de 0,6h-1 para aproximadamente 0,2h-1.

No entanto, quando o inóculo de levedura foi incrementado para 5x107UFC/mL, a

redução na taxa de crescimento foi menos acentuada quando avaliada em mesmo

nível de concentração de ácido láctico, o decréscimo na taxa foi de

aproximadamente 0,95h-1 para a 0,8h-1.

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0

1

2

3

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8

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90Tempo (horas)

Log

N/N

0

Baranyi - lactobacilo puro Baranyi - lactobacilo misto

Baranyi - levedura pura Baranyi - levedura mista

Dados experimentais - lactobacilo puro Dados experimentais - lactobacilo misto

Dados experimentais - levedura pura Dados experimentais - levedura mista

Figura 8. Curvas de crescimento experimento 02 (31S6L3) de L.fermentum e S. cerevisiae, em culturas puras e culturas mistas.

A taxa de crescimento do lactobacilo no experimento 03 (25S6L7), em cultura

pura foi de 0,17h-1 (vide tabelas 9 e 10), quando este microrganismo foi cultivado

com a levedura, S=106UFC/mL, este parâmetro foi elevado para 0.26h-1 (tabelas 9

e 10). No entanto, não houve alteração na taxa de crescimento da levedura,

quando cultivada em cultura mista com o lactobacilo ou em cultura pura. O tempo

de adaptação da levedura sofreu um incremento de 8,61 horas quando cultivada

em cultura pura para 11,05 horas quando em co-cultura com a bactéria láctica.

Para o lactobacilo, não houve modificações consideráveis no tempo de adaptação

quando cultivado em cultura mista ou individualmente. A população máxima do

lactobacilo atingiu 4,37x1013 UFC/mL quando cultivada em cultura mista com o

levedura. Este valor sofreu uma redução para 2,18x1012UFC/mL quando o

82

microrganismo foi cultivado individualmente. Observa-se, na figura 9 que, quando

o lactobacilo está em cultura pura, no L=107UFC/mL, a fase estacionária foi

atingida com 50 horas, já no caso da levedura em 15 horas entra na fase

estacionária nestas condições. Em contrapartida quando o lactobacilo estava em

co-cultura com a levedura em mesmo nível de inóculo, a fase estacionária foi

atingida por volta de 68 horas de processo. Estes resultados confirmam, mais uma

vez, uma sinergia de convivência entre as duas culturas, onde quanto mais células

lisadas de levedura existirem maior o crescimento do lactobacilo, sendo que

muitos estudos têm atribuído este fato ao efeito da liberação de nutrientes no

meio, especialmente aminoácidos como resultados da autólise da levedura (Essia-

Ngang, 1992).

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2

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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110Tempo (horas)

Log

N/N

0






83

No experimento 04 (31S6L7), a levedura, quando cultivada em cultura mista

com o lactobacilo, tem a taxa de crescimento de 0,34h-1 (ver tabelas 9 e 10),

atingindo a fase estacionária com por volta de 18 horas de fermentação (vide

figura 10). Neste mesmo período de tempo, o lactobacilo estava em pleno

crescimento exponencial. Este fato pode ser entendido quando se considera que a

levedura tem uma taxa de crescimento elevada em presença de inóculo de

107UFC/mL de L.fermentum, isto implica na chegada mais rápida na fase de morte

celular, liberando assim no meio, aminoácidos essenciais ao crescimento do

lactobacilo (Oliva-Neto & Yokoya, 1997). A presença destes micronutrientes no

meio pode ser relacionada com a população máxima atingida pelo lactobacilo, pois

quando em co-cultura o L.fermentum atingiu 1,04x1012UFC/ml, enquanto quando

cultivada individualmente esta população foi reduzida a 7,38x1011UFC/mL. O

tempo de adaptação do lactobacilo passou de 30,42 horas, em cultura pura para

6,82 horas em cultura mista, demonstrando que a levedura permite melhor

adaptação ao meio do lactobacilo. É possível, que o tempo de adaptação do

lactobacilo seja afetado também pela temperatura de 31ºC na cultura pura. No

entanto, quando este microrganismo é cultivado juntamente com a levedura o o

tempo de adaptação, foi reduzido. A taxa de crescimento do lactobacilo sofreu

decréscimo de 0,20 h-1, em cultura pura para 0,15h-1 em co-cultura com a

levedura, onde o crescimento da bactéria láctica pode ser inibido durante a

fermentação não somente pela produção de ácidos orgânicos, mas também pela

limitação de nutrientes (Leroy & Vuyst, 2001), causando assim alterações nos

parâmetros de crescimento.

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4

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0 10 20 30 40 50 60 70Tempo (horas)

Log

N/N

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Figura 10. Curvas de crescimento experimento 04 (31S6L7) L.fermentum e S. cerevisiae, em culturas puras e culturas mistas.

A 24ºC com 105UFC/mL de inóculo de L.fermentum (24S6L5) (Figura 11, ver

tabelas 8 e 9), as taxas de crescimento dos microrganismos não sofreram

alterações consideráveis, quando cultivadas em cultura mista ou pura. No entanto,

o lactobacilo teve um incremento na taxa de crescimento de 0,17h-1 em cultura

pura para 0,19h-1 quando cultivado juntamente com a levedura. O término da fase

exponencial de crescimento do lactobacilo, tanto em cultura mista quanto em

cultura pura foi por volta de 40h. Demonstrando, desta forma o antagonismo entre

estes dois microrganismos, onde o lactobacilo compete com a levedura pelos

nutrientes do mosto, e os metabólitos excretados no meio, pela bactéria láctica,

inibem o metabolismo fermentativo da levedura (Chin e Ingledew, 1994).

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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90Tempo (horas)

Log

N/N

0






Quando a levedura é cultivada em cultura mista com o lactobacilo, a 32ºC

com concentração de células de lactobacilo em 105UFC/mL (32S6L5) (Figura 12,

ver tabelas 9 e 10), a sua taxa de crescimento é elevada de 0,16h-1, quando

cultivada individualmente, para 0,22h-1, quando cultivada em cultura mista com o

lactobacilo. No entanto, o lactobacilo tem a taxa de crescimento reduzida de

0,47h-1, quando em cultura pura, para 0,35h-1 quando cultivado em co-cultura com

a levedura. Em contrapartida, quando o lactobacilo está cultivado juntamente com

a levedura, a população máxima atingida é de 1,53x1012UFC/mL, sofrendo uma

redução para 2,07x1011UFC/mL, quando cultivado individualmente. Quando a

levedura atinge a fase estacionária, por volta de 20 horas, o lactobacilo estava em

pleno crescimento exponencial, evidenciando que a presença dos metabólitos

excretados pela lise das células de levedura durante o período estacionário, torna-

86

se importante fonte de nutrientes para o metabolismo da bactéria láctica (Oliva

Neto & Yokoya, 1997; Essia-Ngang et al 1992).

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0 20 40 60 80 100Tempo (horas)

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No experimento 07 (28S6L1), o lactobacilo não teve influência marcante

nos parâmetros de crescimento da levedura, a taxa de crescimento manteve-se ao

redor de 0.20h-1, o tempo de adaptação foi aproximadamente 6 horas, para as

culturas mista e pura e, conseqüentemente, o tempo de geração não foi afetado (3

horas). Este fato é importante pois neste nível de contaminação (101UFC/mL), o

lactobacilo não afeta os parâmetros de crescimento da levedura, λ, µ e população

máxima. Seria, portanto, interessante assim a contaminação do lactobacilo em

101UFC/mL.

87

Essia-Ngang et al (1992) cultivaram em melaço de beterraba, L.casei com

concentração inicial fixa em 3x106UFC/mL em co-cultura com S.cerevisiae com

concentração inicial variando de 5x106 a 1.2x108 UFC/mL. E, verificaram que

quando a levedura estava em maior concentração que o lactobacilo, a evolução do

consumo de sacarose e as atividades metabólicas das leveduras não foram

afetadas pelo crescimento da bactéria láctica. Contudo, quando os parâmetros do

lactobacilo foram avaliados, ao cultivá-lo em cultura mista com a levedura, a sua

taxa de crescimento foi incrementada de 0.16h-1 para 0.28h-1, com conseqüente

redução no tempo de geração de 4.47 horas, em cultura pura, para 2.52 horas, em

cultura mista. Demonstrando assim, o sinergismo de crescimento do lactobacilo

com a levedura.

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Figura 13. Curvas de crescimento do experimento 07 (28S6L1) de L.fermentum e S. cerevisiae , em culturas puras e culturas mistas.

88

Quando o lactobacilo foi inoculado na concentração de 108UFC/mL, no

experimento 08 (28S6L8) (figura 14 ver tabelas 8 e 9), implicou em inibição leve

da taxa de crescimento da levedura, sendo que quando cultivada em cultura pura

a taxa foi de 0.23h-1 sendo reduzida para 0.13h-1 quando em co-cultura com o

lactobacilo. Vereecken et al (2003) em pesquisa na qual cultivaram Yersinia

enterocolitica em co-cultura com L.sakei, demonstraram que a produção de ácido

láctico tem efeito tóxico para as células dos outros microrganismos em co-cultura,

pois, está associado com a redução do pH do meio de cultivo e simultaneamente

com a formação de ácido láctico na forma de lactato, o qual é capaz de penetrar

na membrana celular ocasionando queda no pH intracelular. Os autores

verificaram que, com aumento da concentração de células do lactobacilo, e

conseqüente aumento da produção de ácido láctico, o crescimento da Y.

enterocolitica era inibido. Desta forma, a bactéria láctica tornava o meio adverso

para o crescimento da Y.enterocolitica. Este fenômeno é conhecido como

antagonismo láctico para microrganismos patogênicos.

O lactobacilo em concentração de 108UFC/mL (Figura 14), quando

cultivado juntamente com a levedura, teve sua taxa de crescimento elevada de

0,16h-1, em cultura pura para 0,51h-1. Esta taxa foi a maior registradas nos

experimentos em cultura mista e este aumento na taxa de crescimento pode ser

observado quando a levedura passa para a fase estacionária (figura 14). Este

fenômeno deve-se ao fato do lactobacilo ser um microrganismo fastidioso que

requer inúmeros nutrientes para o seu crescimento. Estes nutrientes são liberados

no meio quando há autólise da célula da levedura, desta forma tornam-se

disponíveis para o metabolismo da bactéria láctica.

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Figura 14. Curvas de crescimento do experimento 08 (28S6L8) de L.fermentum e S. cerevisiae, em culturas puras e culturas mistas.

No experimento 09 (28S6L5) (Figura 15 ver tabelas 8 e 9), o lactobacilo

sofreu redução na taxa de crescimento de 0,53h-1 em cultura pura para 0,18h-1 em

cultura mista. O fato a levedura (106UFC/mL) ter sido inoculada em maior

concentração que o lactobacilo (105UFC/mL) levando a inibição do metabolismo

do L.fermentum, como observado por Thomas et al (2001) e Essia-Ngang (1992).

No entanto, a taxa de crescimento da levedura também foi afetada pela presença

do lactobacilo no meio de cultivo, decaindo de 0,20h-1 para 0,16h-1 quando

cultivado com o lactobacilo, mostrando que mesmo o lactobacilo em menor

concentração que a levedura, reduz o pH do meio de 6.07 para 4.86 em 36 horas

de fermentação. A concentração de ácido láctico era de 7,66g/L neste tempo de

90

processo que pode provocar a redução do pH intracelular da levedura, causando

danos às células . A população final do lactobacilo, no entanto, não foi afetada.

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Analisando, de forma geral, os dados das tabelas 9 e 10 pode-se inferir

que, na maioria dos casos, o lactobacilo tem seu tempo de adaptação reduzido

quando em co-cultura, e também pode-se verificar que há um efeito na taxa de

crescimento dado pela interação entre a temperatura e o nível de inóculo. A

população máxima é afetada pelo nível inicial de inóculo e pela presença da

levedura. No entanto, a população máxima da levedura não é afetada pela

presença do lactobacilo, porém a sua taxa de crescimento sofre decréscimo, em

alguns casos, quando cultivada em co-cultura. O tempo de adaptação da levedura,

91

na maioria dos experimentos, tem seu valor reduzido quando cultivado em cultura

mista.

Os parâmetros gerados pelo modelo de Baranyi e Roberts (1994) foram

avaliados estatisticamente através do Teste de Tukey. Não houve diferença

significativa para o tempo de adaptação, taxa de crescimento e população máxima

em cultura pura e mista da levedura. Para o lactobacilo, as taxa de crescimento e

o tempo de adaptação não tiveram diferença significativa em cultura pura e mista,

no entanto, ao avaliar-se a população máxima das culturas pura e mista, houve

diferença significativa ao nível de 10% de significância. Os testes estão

apresentados na tabela 8.

92

Tabela 8. Resultados do teste Tukey para os parâmetros de crescimento do L. fermentum e S. cerevisiae gerados pelo modelo de Baranyi e Roberts (1994).

Variável Média Desvio

Padrão N Diferença

Desvio

padrão da

diferença

t GL p

Lactobacilo

misto 5.66 4.31

Lactobacilo

puro 8.78 7.68

11 -3.13 7.69 -1.35 10 0.0208

Levedura

mista 6.78 3.53

Tempo de

adaptação

(h)

Levedura

pura 6.86 0.99

11 -0.0836 2.71 -0.102 10 0.9205

Lactobacilo

misto 0.255 0.11

Lactobacilo

puro 0.302 0.16

11 -0.047 0.229 -0.686 10 0.508

Levedura

mista 0.191 0.062

Taxa de

crescimento

(h-1)

Levedura

pura 0.208 0.023

11 -0.017 0.069 -0.820 10 0.431

Lactobacilo

misto 11.37 1.74

Lactobacilo

puro 11.01 1.74

11 0.367 0.0448 2.72 10 0.022

Levedura

mista 8.54 0.226

População

máxima

(UFC/mL)

Levedura

pura 8.46 0.242

0.241 0.077 0.217 1.166 10 0.271

Onde: média: médias dos parâmetros calculados pelo modelo; N: número de parâmetros avaliados; Diferença: diferença entre as médias das culturas puras e mistas; t: valor do teste Tukey GL: graus de liberdade p: p valor

93

Tabela 9. Parâmetros de crescimento do Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus fermentum em cultura pura, estimados pelo de Baranyi e Roberts (1994)

L.fermentum S. cerevisiae

Experimento Temperatura

(ºC)

Nível de

inóculo de

L.fermentum

(UFC/mL)

Taxa de

crescimento

(h-1)

Tempo de

adaptação

(h)

Tempo

de

geração

(h)

População

máxima

(UFC/mL)

R2

Taxa de

crescimento

(h-1)

Tempo de

adaptação

(h)

Tempo

de

geração

(h)

População

máxima

(UFC/mL)

R2

01 25 103 0,210 6,07 3,32 3,04E+09 0,99 0,180 5,61 3,84 7,46E+08 0,96

02 31 103 0,350 2,62 2,00 4,12E+09 0,98 0,160 1,26 4,30 2,66E+08 0,98

03 25 107 0,258 3,42 2,68 4,37E+13 0,99 0,233 11,05 2,98 8,03E+08 0,99

04 31 107 0,148 6,82 4,67 1,04E+12 0,97 0,347 14,96 1,99 1,82E+08 0,97

05 24 105 0,190 13,14 3,60 8,65E+11 0,99 0,140 5,96 4,82 4,52E+08 0,96

06 32 105 0,350 5,04 1,97 1,53E+12 0,98 0,220 4,66 3,12 2,67E+08 0,92

07 28 101 0,275 2,58 2,52 6,17E+07 0,98 0,216 6,12 3,21 2,02E+08 0,98

08 28 108 0,512 14,44 1,35 2,34E+13 0,96 0,127 5,40 5,48 2,41E+08 0,96

09 28 105 0,155 2,38 4,48 7,92E+11 0,98 0,167 6,45 4,15 2,79E+08 0,98

10 28 105 0,176 3,58 3,93 4,27E+11 0,96 0,154 6,68 4,50 5,94E+08 0,97

11 28 105 0,184 2,13 3,77 3,39E+11 0,96 0,155 6,38 4,48 2,88E+08 0,96

94

Tabela 10. Parâmetros de crescimento do Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus fermentum em cultura mista, estimados pelo modelo de Baranyi e Roberts (1994)



(ºC)

Nível de

inóculo de

L.fermentum

(UFC/mL)

Taxa de

crescimento

(h-1)

Tempo de

adaptação

(h)

Tempo

de

geração

(h)

População

máxima

(UFC/mL)

R2

Taxa de

crescimento

(h-1)

Tempo de

adaptação

(h)

Tempo

de

geração

(h)

População

máxima

(UFC/mL)

R2

01 25 103 0,300 5,00 2,33 5,83E+08 0,97 0,190 7,04 3,61 9,05E+08 0,98

02 31 103 0,170 7,12 4,06 4,05E+09 0,96 0,240 6,01 2,88 3,25E+08 0,96

03 25 107 0,166 4,94 4,19 2,18E+12 0,97 0,213 8,61 3,26 2,58E+08 0,94

04 31 107 0,200 30,42 3,46 7,38E+11 0,93 0,219 8,70 3,16 2,39E+08 0,93

05 24 105 0,170 5,92 4,08 6,93E+11 0,97 0,190 5,76 3,63 2,28E+08 0,97

06 32 105 0,470 5,44 1,46 2,07E+11 0,98 0,160 5,77 4,24 4,57E+08 0,96

07 28 101 0,155 2,32 4,47 3,26E+07 0,98 0,195 6,67 3,55 1,85E+08 0,99

08 28 108 0,166 13,47 4,19 4,91E+13 0,99 0,225 6,81 3,08 1,57E+08 0,95

09 28 105 0,461 7,29 1,50 3,60E+11 0,98 0,225 6,72 3,08 2,55E+08 0,99

10 28 105 0,546 7,48 1,27 1,80E+11 0,96 0,229 6,96 3,02 5,63E+08 0,96

11 28 105 0,524 7,22 1,32 2,02E+11 0,98 0,200 6,40 3,48 1,50E+08 0,91

95

Tabela 11. Parâmetros de crescimento do Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus fermentum em cultura mista, estimados pelo modelo de Gompertz modificado (Zwietering et al, 1991)



(ºC)

Nível de

inóculo de

L.fermentum

(UFC/mL)

Taxa de

crescimento

(h-1)

Tempo de

adaptação

(h)

Tempo

de

geração

(h)

População

máxima

(UFC/mL)

R2

Taxa de

crescimento

(h-1)

Tempo de

adaptação

(h)

Tempo

de

geração

(h)

População

máxima

(UFC/mL)

R2

01 25 103 0,239 7,80 2,99 3,91X109 0,98 0,126 4,10 5,50 7,54X108 0,96

02 31 103 0,176 - 3,94 4,25X109 0,97 0,188 1,49 3,69 2,79X108 0,89

03 25 107 0,130 - 5,33 3,12X1013 0,98 0,230 10,07 3,01 2,55X108 0,93

04 31 107 0,163 7,85 4,25 2,57X1012 0,95 0,209 7,99 3,31 3,34X108 0,94

05 24 105 0,181 10,99 3,83 1,52X1013 0,97 0,182 7,54 3,81 4,60X108 0,94

06 32 105 0,166 - 4,18 1,58X1012 0,97 0,239 4,75 2,90 2,70X108 0,92

07 28 101 0,144 - 4,81 6,32X107 0,97 0,269 6,85 2,58 2,02X108 0,97

08 28 108 0,243 13,50 2,85 1,66X1013 0,95 0,163 6,64 4,25 2,49X108 0,94

09 28 105 0,141 - 4,92 1,99X1011 0,97 0,204 8,48 3,40 2,96X108 0,96

10 28 105 0,150 - 4,62 5,54X1011 0,96 0,198 8,99 3,50 5,61X108 0,97

11 28 105 0,160 - 4,33 5,63X1011 0,97 0,206 8,99 3,36 2,77X108 0,96

(-) não houve ajuste do modelo

96

Tabela 12. Parâmetros de crescimento do Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus fermentum em cultura pura, estimados pelo modelo de Gompertz modificado (Zwietering et al 1991)



(ºC)

Nível de

inóculo de

L.fermentum

(UFC/mL)

Taxa de

crescimento

(h-1)

Tempo de

adaptação

(h)

Tempo

de

geração

(h)

População

máxima

(UFC/mL)

R2

Taxa de

crescimento

(h-1)

Tempo de

adaptação

(h)

Tempo

de

geração

(h)

População

máxima

(UFC/mL)

R2

01 25 103 0,198 7,66 3,50 9,94X108 0,98 0,133 3,36 5,21 5,52X108 0,96

02 31 103 0,154 4,20 4,50 3,30X109 0,93 0,280 6,48 2,48 3,38X108 0,93

03 25 107 0,152 4,19 4,56 2,23X106 0,97 0,176 7,82 3,93 2,55X108 0,93

04 31 107 0,080 10,86 8,66 2,97X1014 0,82 0,168 6,28 3,31 2,11X108 0,94

05 24 105 0,211 8,77 3,28 1,36X1012 0,96 0,140 5,32 4,95 2,76X108 0,96

06 32 105 0,212 0,85 3,27 1,869X1011 0,97 0,185 6,39 3,75 4,57Z108 0,95

07 28 101 0,198 4,34 3,50 2,70X108 0,92 0,246 7,51 2,82 1,89X108 0,98

08 28 108 0,202 15,05 3,43 5,63X1013 0,98 0,158 5,75 4,39 2,20X108 0,96

09 28 105 0,215 4,56 3,22 2,65X1011 0,97 0,202 6,67 3,40 2,96X108 0,96

10 28 105 0,216 5,54 3,20 2,83X1011 0,98 0,207 6,73 3,34 5,53X108 0,96

11 28 105 0,210 4,78 3,30 1,59X1011 0,97 0,201 6,32 3,44 2,49X108 0,90

97

5.3. Índice de viabilidade da levedura (IV)

As percentagens do indíce de viabilidade (IV) da levedura versus o tempo de

fermentação são apresentados para os experimentos 7 (28S6L1), 8 (28S6L8) e 9 (28S6L5)

(Figura 16), 1 (25S6L3) e 3 (25S6L7) (Figura 17), 2 (31S6L3) e 4 (31S6L7) e 1 (25S6L0), 2

(31S6L0), 5 (24S6L0), 6 (32S6L0) e 9 (28S6L0). Em todas as figuras foi apresentado o IV

para a levedura em cultura pura nas mesmas condições dos respectivos testes. Pode-se

observar, em todas as figuras, a correlação negativa da porcentagem de células viáveis de

levedura e o aumento da concentração de células de L.fermentum, portanto os resultados

demonstram que a presença de ácido no meio de cultivo produzido pela bactéria láctica,

provoca a diminuição da viabilidade celular. Os dados apresentados estão em concordância

com os resultados apresentados por Nobre et al (2007), que cultivou S. cerevisiae em cultura

mista com L.fermentum em meio de caldo de cana-de-açúcar ajustado a 5ºBrix e

suplementado com 1,0% de extrato de levedura e 1,0% de peptona. Os autores observaram

uma correlação entre o aumento da acidez do meio e a diminuição da viabilidade celular da

levedura em cultivo associado com bactérias lácticas.

Na figura 16, ao tempo de 20 horas de processo com L=101UFC/mL, o índice de

viabilidade era de aproximadamente 90%,quando o pH era 4,95 e a concentração de ácido

láctico era 7,55g/L e quando o inóculo foi elevado para 105UFC/mL o índice de viabilidade

sofreu redução para 50% com valor de pH 4,83 e concentração de ácido láctico de 8,82g/L,

e quando o L foi incrementado para 108UFC/mL o índice de viabilidade foi menor que 20%,

ao mesmo tempo de processo, com pH do mosto fermentado de 4,23 e concentração de

ácido láctico 10,97g/L. Levando em consideração o processo de fermentação industrial, em

torno de 10 horas, para uma contaminação baixa com L=101UFC/mL de lactobacilo, o IV da

levedura foi de 100%, no entanto ao elevar a contaminação para 105 ou 108 UFC/mL IV da

levedura foi reduzido para 80%.

98

Como o processo brasileiro de fermentação alcoólica faz uso de reciclo de fermento,

as leveduras ficam expostas por tempos crescentes a ação das bactérias lácticas, podendo

acarretar no decréscimo da viabilidade celular.

0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

100,00%

120,00%

0 20 40 60 80 100 120

Cél

ulas

viá

veis

Tempo (horas)

L=10^1 L=10^5 L=10^8 Levedura pura

Figura 16. Índice de viabilidade de S.cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum experimento 07(28S6L1), 08 (28S6L8) e 09 (28S6L5) e levedura em cultura pura (28S6L0).

A T=25ºC e com L=103UFC/mL (figura 17), o IV foi de aproximadamente 98% a 10

horas de processo. Com o aumento de L=107UFC/mL, o IV decai para aproximadamente

90%, e a partir deste período o índice de viabilidade decresce oscilatoriamente e de forma

rápida. O mesmo fenômeno pode ser observado a 31ºC (Figura 18).

99

0.00%

20.00%

40.00%

60.00%

80.00%

100.00%

120.00%

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Cél

ulas

viá

veis

Levedura pura L=10 3̂ L=10 7̂

Figura 17. Índice de viabilidade de S.cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum para o experimento 01 (25S6L3) e 03 (25S6L7) e levedura em cultura pura (25S6L0).

0.00%

20.00%

40.00%

60.00%

80.00%

100.00%

120.00%

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Cél

ulas

viá

veis

Levedura pura L=10 3̂ L=10 7̂

Figura 18. Índice de viabilidade de S. cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum para o experimento 02(31S6L3) e 04(31S6L7) e levedura em cultura (31S6L0).

100

A análise da figura 19 demonstra que a variação na temperatura afetou

consideravelmente o índice de viabilidade celular, com incremento de 7ºC na temperatura, de

25 para 32ºC, há o decréscimo do índice de viabilidade de aproximadamente 80% para 0%

em 100 horas de fermentação. Phisalaphong et al (2006) relatam que altas temperaturas

causam decréscimo no rendimento celular, e no caso de levedura para a produção de etanol,

a causa pode ser relacionada com a mudança na atividade de transporte celular ativo, ou no

nível de saturação dos compostos solúveis e dos solventes intracelulares. McMeekin et al

(2002) relatam que o efeito indireto de altas temperaturas pode estar associado à

desnaturação dos ribossomos e enzimas, ou ainda problemas de permeabilidade da

membrana celular. Sendo assim, como o uso do reciclo de fermento é uma prática comum na

indústria brasileira, quando o processo ocorre a temperaturas acima de 30ºC, a levedura fica

exposta por um período longo de tempo a temperaturas altas que causam decréscimo no

índice de viabilidade celular. No entanto, as indústrias fazem injeção de células novas de

levedura em um período de 8 a 12 horas de processo.

0.00%

20.00%

40.00%

60.00%

80.00%

100.00%

120.00%

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Cél

ulas

viá

veis

24ºC 25ºC 28ºC 31ºC 32ºC

Figura 19. Índice de viabilidade de S. cerevisiae, em cultura pura em diferentes temperaturas para os experimentos 01 (25S6L0), 02(31S6L0),05(24S6L0), 06(32S6L0), 09(28S6L0).

101

5.3.1 Efeitos da temperatrura de fermentação e nível de inóculo de L. fermentum no

índice de viabilidade da levedura em cultura mista

Para o índice de viabilidade (IV) foi gerado um modelo polinomial de segunda ordem,

tendo como variáveis indepedentes temperatura e nível de inóculo, e variável dependente o

índice de viabilidade. Para o ajuste do modelo foi selecionado o valor de IV em 21 horas de

fermentação. Como pode-se verificar nas figuras 16, 17 e 18, neste período de tempo o valor

de IV apresenta um decréscimo relevante. O nível de inóculo de S. cerevisiae foi mantido

constante em 106UFC/mL.

Avaliando-se a tabela 13 pode-se verificar que o nível de inóculo quadrático tem maior

efeito significativo (p<0,10).

Tabela 13. Efeitos da temperatura de fermentação e nível de inóculo de L. fermentum no índice de viabilidade da levedura em cultura mista

Effect Estimates; Var .:IV; R-sqr=.85116; Adj:.70233 (dados de entrada do modelo.sta)2 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Residual=309.4796DV: IV

FactorEffect Std.Err. t(5) p -95.%

Cnf.Limt+95.%

Cnf.LimtCoeff. Std.Err.

Coeff.-95.%

Cnf.Limt+95.%

Cnf.LimtMean/Interc.(1)Temperatura(L)Temperatura(Q)(2)Lactobacilo(L)Lactobaci lo(Q)1L by 2L

95,5994 10,15664 9,41249 0,000228 69,4909 121,7078 95,5994 10,15664 69,4909 121,7078-14,6882 12,45799 -1,17902 0,291435 -46,7125 17,3361 -7,3441 6,22899 -23,3562 8,6681-22,7870 14,86562 -1,53286 0,185885 -61,0003 15,4264 -11,3935 7,43281 -30,5001 7,7132-41,2634 12,45799 -3,31220 0,021189 -73,2877 -9,2391 -20,6317 6,22899 -36,6438 -4,6196-55,5268 14,86562 -3,73525 0,013498 -93,7401 -17,3134 -27,7634 7,43281 -46,8700 -8,656725,2800 17,59203 1,43701 0,210215 -19,9418 70,5018 12,6400 8,79602 -9,9709 35,2509

O modelo polinimial de segunda ordem está apresentado na equação 23. Este modelo

apresentou bom coeficiente de correlação dos dados com R2 0,85.

2*76,27*63,2060,95 LLIV −−= Equação 23

Pela avaliação da figura 20 pode-se inferir que a levedura apresentou maior IV à 25oC

com L=103 UFC/mL. Essas condições são favoráveis a manutenção do IV da levedura

próximo a 100% ao crescimento (vide figura 19). O menor IV foi apresentado quando o

lactobacilo estava em concentração 108UFC/mL e T=28oC, isso indica que a temperatura

102

apesar de apresentar um pequeno efeito sobre IV o efeito mais significativo é notato pela

mudanca no nível de inóculo de lactobacilo.

Figura 20. Efeitos da temperatura de fermentação e nível de inóculo de L. fermentum no índice de viabilidade da levedura em cultura mista

103

5.4. Modelagem quase química

Para a construção do modelo quase-químico foi utilizada a metodologia proposta por

Ross et al (2004), descrito no item 4.10.2, utilizando o software Matlab 7.5. Este modelo foi

escolhido para descrever o crescimento/morte, pois pressupõe-se que ambos

microrganismo, lactobacilo e levedura, teriam uma curta fase estacionária e entrariam no

processo de declínio instantâneo, e também porque este modelo prediz crescimento e morte

de forma contíniua, e os demais modelos ultilizados, Baranyi & Roberts e Gompertz

modificado, ajustam os dados somente da fase de adaptação até a fase estacionária.

Os resultados desta modelagem estão no Anexo C, e as figuras do crescimento/morte

estão graficadas apresentando o logartimo da contagem de colônias (Log Cols) experimental

(o) e calculado pelo modelo ( – ) versus tempo (horas) O modelo prediz o crescimento/morte,

não contemplando a fase estacionária (vide figura 20). A morte, segundo Ross et al (2005),

seria devido à produção de um metabólito antagonista hipotético quorum sense, uma

quantidade de metabólito produzido pelo próprio microrganismo que inibiria o crescimento

celular. Em alguns casos, como no experimento 09 para a levedura em cultura mista onde o

SSE (Soma do quadrado dos erros) é igual a 1, este modelo se ajusta bem aos dados

experimentais, pois os microrganismos entram em processo de declínio imediatamente após

a fase exponencial que pode ser devido ao esgotamento de açúcares. No entanto, a medida

da fase de adaptação (λ) não fica bem definida neste modelo. Isto foi devido ao ajuste linear

realizado pelo modelo em cada fase do ciclo de crescimento do microorganismo (vide anexo

C – experimento 01). Pode-se verificar uma relação direta entre o aumento do valor de k1

(constante da fase de adaptação) e a redução de tempo na fase de adaptação.

Ao comparar os experimento 01 (25S0L3), 02 (31S0L3), 03 (25S0L7) e 04 (31S0L7)

para a cultura pura de lactobacilo, pode-se verificar que o valor de k1 sofre variação pela

104

interação do nível inóculo com a temperatura de cultivo do lactobacilo, onde o lactobacilo

quando cultivado a 25ºC com 103 UFC/mL, tem taxa constante k1= 44,53 de ativação das

células (M→ M*) e, conseqüentemente, tem o menor tempo de adaptação com o valor de

0.0225 h, já nos demais experimentos (02, 03 e 04) o valor da constante k1 tem valores entre

12 e 14, e os valores de λ 0,07 e 0,08 (vide tabela 13).

O modelo quase-químico subestima a população máxima para o experimento 04

(31S0L7), pois o modelo prediz Rg=1,77X1011UFC/mL (vide anexo C) enquanto a população

máxima experimental é 1,10X1012UFC/mL, e o modelo de Baranyi & Roberts (1994) prediz

uma população máxima próxima de 7,38X1011UFC/mL mais próximo da população verificada

experimentalmente. No entanto, as duas predições são subestimadas. Ao avaliar o

parâmetro estatístico SSE, no caso deste experimento 04, que tem um valor de 3,00,

demonstrando desta forma que o modelo não tem bom ajuste aos dados experimentais.

No caso do experimento 05 (24S0L5) para o L. fementum em cultura pura, o modelo se

ajusta bem aos dados experimentais, com o valor de SSE=1,92 (vide figura 21), pois o

lactobacilo tem uma curta fase estacionária entrando imediatamente em fase de declínio, o

que pode ser devido à redução da glicose disponível que em 60 horas de fermentação atinge

uma das menores concentrações medidas com valor de 25,14g/L.

Em todos os experimentos o valor de k3, a constante para as células sensibilizadas pelo

metabólito antagonista, tem valores próximos de zero, portanto esta etapa, torna-se

praticamente desprezível (Ross et al, 2005). A morte para o lactobacilo cultura pura ocorre

de forma natural, segundo definição de Roos (2005) pois, a partir de de 48 horas, houve o

esgotamento de glicose (vide anexo C – Figura 41 a 51).

105

Figura 21. Modelo quase-químico para o L.fermentum em cultura pura para o experimento 05 (24S6L5)

Para o experimento 07 (28S0L1), não há bom ajuste do modelo apresentando um

valor de SSE igual a 3,08. O lactobacilo não entra na fase de declínio, após 54 horas de

fermentação este microrganismo se mantém na fase estacionária plana, e o modelo não

contempla uma fase estacionária (vide tabela 12 e figura 22).

Figura 22. Modelo quase-químico para o L.fermentum em cultura pura para o experimento 07 (28S0L1)

106

O experimento 08 (vide figura 23), para o lactobacilo em cultura pura (28S0L8) o

modelo teve bom ajuste para fase de adaptação, λ=10,44h; este resultado quando

comparado ao valor obtido pelo ajuste do modelo proposto por Baranyi & Roberts (1994)

λ=13,47h, mostra-se próximo. O mesmo pode ser verificado para a taxa de crescimento, o

modelo quase-químico prediz 0,132h-1 e o modelo de Baranyi & Roberts (1994) prediz

0,166h-1. No entanto, a predição para a população máxima pelo modelo quase-químico é de

4,94x1014UFC/mL, o valor obtido com este modelo está próximo do verificado

experimentalmente que foi de 1,65X1014UFC/mL.Sendo a predição obtida pelo modelo de

Baranyi & Roberts (1994) de 4,93X1012 UFC/mL um ciclo logarítmico menor que o valor

experimental.

Figura 23. Modelo quase-químico para o L.fermentum em cultura pura para experimento 08 (28S0L8)

Os experimento 09, 10 e 11 (28S0L5) apresentam boa repetibilidade. Para estes

experimentos, o modelo quase-químico não caracteriza fase de adaptação nestas condições

experimentais utlizadas (vide figura 24 – para o experimento 09 e tabela 12 para os demais

experimentos)

107

Figura 24. Modelo quase-químico para o experimento 09, L.fermentum em cultura pura (28S0L5)

Para os experimentos realizados com a levedura em cultura pura, a medida do tempo

de adaptação (λ) pelo modelo quase-químico não fica bem definida para nenhum dos onze

experimentos. Para os experimentos 09,10 e 11 não houve boa reprodutibilidade do modelo,

para o parâmetro k1 como relatado anteriormente este modelo não realiza bom ajusta para a

fase lag, portanto os valores de λ gerados pelo modelo são discrepantes para as três

repetições. Ao avaliar a taxa de crescimento, a diferença entre os valores gerados não é

relevante. No entanto, a população máxima do experimento 10(20S6L0) é um ciclo

logarítimico maior que as demais (09 e 11) (vide tabela 12), devido ao ajuste do modelo,

porque este não descreve um plateau da fase estacionária e tende a ajustar pelo ponto de

maior valor (vide figura 25).

108

Figura 25. Modelo quase-químico para a S. cerevisiae em cultura pura(28S6L0)

Os valores de k1 para os experimentos com a levedura em cultura pura variam de 15 a

30 (vide tabela 12), isto demonstra a rápida transição das células (M→M*) da fase lag para a

fase exponencial do crescimento (vide figura 26). Ao avaliar os SSE do modelo para a

levedura em cultura pura estes têm menor valor que os SSE dos modelos ajsutados para o

lactobacilo em cultura pura, onde o maior valor de SSE para a levedura foi de 2,34, sendo

que para o lactobacilo em cultura pura o maior erro foi de 3,10, demonstrando assim que o

modelo se ajustou melhor aos dados experimentais da levedura em cultura pura.

109

Figura 26. Modelo quase-químico para a S. cerevisiae em cultura (31S6L0)

Para os experimentos em cultura mista, todos os experimentos, tanto para o lactobacilo

quanto para a levedura, apresentam elevados valores de k1 (vide tabela 13), demonstrando a

ativação rápida das células inoculadas (Figura 27).

Os valores de k3, constante da fase de sensibilização das células pelo metabólito

antagonista, são maiores que zero para a levedura cultivada em co-cultura, onde na

passagem da fase exponecial para a fase estacionária há uma sensibilização das células da

levedura, provocando a morte deste microrganismo. Quando esta mesma constante (k3) é

avaliada para o lactobacilo em cultura mista, o valor é desprezível para todos os

experimentos, com exceção do experimento 07 (28S6L1) (Figura 28), onde a levedura se

sobrepõe ao lactobacilo devido à diferença de nível de inóculo de 5 ciclos logarítimicos. No

experimento 04 (31S6L7) em 36 horas de processo, onde a levedura passa para a fase de

morte, a concentração de ácido láctico medida foi de 9,05g/L, sendo que no final do processo

de fermentação (100 horas), onde a levedura atingiu sua menor concentração celular, a

110

quantidade de ácido láctico era 13,71g/L, demonstrando assim, que este ácido tem efeito

maléfico para as células de leveduras.

Figura 27. Modelo quase-químico para o S. cerevisiae em cultura mista (31S6L7)

Figura 28. Modelo quase-químico para o L.fermentum em cultura mista (28S6L1)

111

Ao avaliar as constantes geradas pelo modelo, pode-se verificar que, quando a

levedura é cultivada com o lactobacilo, a constante k3 (vide tabelas 14 e 15) sofre um

aumento, demonstrando que houve um efeito antagônico para a levedura em presença de

lactobacilo, mesmo o modelo não contemplando o cultivo de dois microrganismos juntos.

112

Tabela 14. Parâmetros gerados pelo modelo quase-químico para as culturas puras de S. cerevisiae e L.fermentum.


Exp. Temperatura

(ºC)

Nível de

inóculo de

L.fermentum

(UFC/mL)

µµµµ (h-1) λλλλ (h) Rg(UFC/mL) K 1 K2 K3 K4 SSE µµµµ (h-1) λλλλ(h) Rg(UFC/mL) K 1 K2 K3 K4 SSE

01 25 103 0,1124 0,02 2,35X109 44,53 1,50 0,005 1,25 2,30 0,0674 0,03 1,39X109 29,00 1,41 0,006 1,25 1,69

02 31 103 0,1117 0,07 1,02X1010 14,58 1,50 0,002 1,25 3,00 0,0842 0,03 6,00X108 29,86 1,38 0,024 1,18 2,33

03 25 107 0,0892 0,08 1,62X1013 12,48 1,60 0,000 1,39 3,04 0,0590 0,03 9,88X108 34,05 1,41 0,007 1,27 2,13

04 31 107 0,0822 0,08 1,77X1011 12,39 1,55 0,000 1,36 2,41 0,0872 0,06 5,32X108 17,65 1,44 0,028 1,25 1,60

05 24 105 0,1389 0,08 1,23X1012 13,17 1,57 0,000 1,25 1,92 0,0619 0,05 1,05X109 18,77 1,41 0,007 1,27 1,70

06 32 105 0,1241 0,05 2,53X1012 19,23 1,53 0,000 1,25 2,76 0,0733 0,05 9,88X108 20,80 1,42 0,011 1,25 1,97

07 28 101 0,1298 0,05 4,37X109 21,39 1,55 0,007 1,25 3,10 0,0772 0,04 6,89X108 26,92 1,42 0,017 1,25 1,94

08 28 108 0,1321 10,44 4,95X1014 0,013 1,33 0,000 1,02 2,45 0,0755 0,03 5,93X108 39,94 1,42 0,020 1,25 1,83

09 28 105 0,1295 0,08 1,42X1012 12,89 1,55 0,000 1,25 2,34 0,0748 0,03 5,03X108 33,79 1,42 0,022 1,25 1,63

10 28 105 0,1383 0,08 2,20X1012 12,50 1,57 0,000 1,25 2,57 0,0795 0,05 1,30X109 18,37 1,42 0,009 1,25 2,34

11 28 105 0,1351 0,08 1,16X1012 12,21 1,55 0,000 1,24 3,10 0,0711 0,06 6,78X108 15,44 1,41 0,015 1,25 2,24

113

Tabela 15. Parâmetros gerados pelo modelo quase-químico para as culturas mistas de S. cerevisiae e L.fermentum


Exp. Temperatura

(ºC)

Nível de

inóculo de

L.fermentum

(UFC/mL)

µµµµ (h-1) λ λ λ λ (h) Rg(UFC/mL) K 1 K2 K3 K4 SSE µµµµ (h-1) λ λ λ λ (h) Rg(UFC/mL) K 1 K2 K3 K4 SSE

01 25 103 0,1267 0,03 4,44X1010 37,65 1,53 0,0007 1,24 3,03 0,0689 0,03 1,57X109 38,01 1,41 0,006 1,25 1,79

02 31 103 0,1204 0,07 2,57X1010 14,66 1,53 0,001 1,25 2,80 0,0767 0,01 7,78X108 86,96 1,40 0,015 1,23 2,54

03 25 107 0,1049 0,07 9,65X1012 13,69 1,57 0,000 1,33 2,01 0,0675 0,01 1,15X109 89,66 1,40 0,008 1,25 2,64

04 31 107 0,1112 0,07 7,27X1011 13,46 1,56 0,000 1,30 2,99 0,1167 0,08 6,91X108 12,06 1,52 0,037 1,25 1,69

05 24 105 0,1256 0,02 9,76X1011 47,05 1,53 0,000 1,24 2,17 0,0649 0,01 1,24X109 85,26 1,40 0,007 1,25 2,51

06 32 105 0,1215 0,08 2,57X1012 13,07 1,52 0,000 1,25 2,63 0,0842 0,08 1,22X109 12,59 1,44 0,011 1,25 2,46

07 28 101 0,1052 0,01 1,87X108 165,54 1,44 0,115 1,20 2,25 0,0667 0,03 7,14X108 38,99 1,40 0,012 1,25 2,32

08 28 108 0,0950 0,08 4,95X1013 12,52 1,71 0,000 1,49 3,08 0,0797 0,08 8,72X108 12,60 1,53 0,013 1,35 1,91

09 28 105 0,1136 0,03 9,72X1011 29,44 1,51 0,000 1,25 2,16 0,0830 0,08 8,32X108 12,53 1,44 0,016 1,25 1,35

10 28 105 0,1180 0,07 1,37X1012 13,29 1,52 0,000 1,25 2,10 0,0787 0,08 8,67X108 12,41 1,43 0,014 1,25 1,00

11 28 105 0,1255 0,01 1,45X1012 96,60 1,53 0,000 1,24 2,31 0,0752 0,08 5,99X108 12,39 1,42 0,018 1,25 1,42

114

5.5. Modelagem secundária

5.5.1 Efeitos da temperatura e nível de inóculo de L. fermentum sobre a concentração

máxima de etanol

Para a concentração máxima de etanol, foi gerado um modelo polinomial de segunda

ordem, em função de temperatura e nível de inóculo de lactobacilo, utilizando os valores

codificados para as variáveis, como fatores significativos (Tabela 16), a p<0.10,o modelo foi

construído a partir das variáveis significativas, temperatura e nível de inóculo (linear e

quadrático) e a interação entre a temperatura e o nível de inóculo. Este modelo apresentou

um alto coeficiente de correlação dos dados, demonstrando que 94.7% dos dados estão de

acordo com o modelo proposto, e os parâmetros de performance do modelo (bias e exatidão)

demonstram excelente concordância Os parâmetros de performance do modelo foram

calculados, onde o valor de bias é 1.00 e o valor do fator de exatidão é de 1.02.

Avaliando a tabela 16, a temperatura quadrática tem maior efeito, ou seja, menor p

valor = 0.001746, na concentração máxima de etanol. Este efeito pode ser verificado na

superfície de resposta apresentada na figura 29.

Considerando a cultura mista dos microrganismos S.cerevisiae e L.fermentum, a

produção máxima de etanol ocorre a 28ºC com L=105UFC/mL (vide figura 28), e

S=106UFC/mL, a quantidade de etanol produzida é de 84.83g/L.

115

Tabela 16. Efeitos da temperatura e nível de inóculo para a concentração máxima de etanol em cultura mista

O modelo polinomial de 2ª ordem está apresentado na equação 24

LTLLTTole *3625,2*87,4*253359,4*36750,5*43815,053,84max]tan[ 22 −−−−−=

Equação 24

A maior concentração foi gerada pelo ponto central, seguindo este raciocínio o ponto

de inflexão para maior produção de etanol corresponde a 84.5g/L, o que bem similar ao real

observado que é de 84.83g/L. Este modelo pode ser aplicado na indústria para predizer a

quantidade máxima de etanol produzida, quando se conhece o nível da contaminação por

lactobacilo e a temperatura de fermentação, dentro da faixa estudada. A superfície de

resposta (figura 28) demonstra o efeito quadrático da temperatura e do nível de inóculo de

lactobacilo na faixa estudada, sobre a concentração máxima de etanol.

116

Figura 29. Efeito da temperatura e concentração de L. fermentum sobre a concentração máxima de etanol em função da temperatura e nível e inóculo

5.5.2 Efeito da temperatura e nível de inóculo de L. fermentum µµµµ, λλλλ e Rg

Considerando as culturas mistas da levedura e do lactobacilo o modelo de raiz

quadrada (Ratwosky) não foi capaz de ajustar com precisão os dados experimentais para o

tempo de adaptação (λ). Onde o coeficiente de correlação dos dados, para o modelo do

lactobacilo R2 foi 0,22 (vide tabela 17), e apesar do fator de exatidão apresentar 31% dos

dados discordantes do modelo e o fator de exatidão aproximadamente 96% dos dados estão

preditos na região segura do modelo, este modelo não prediz de forma coerente a relação

entre a temperatura e o tempo de adaptação. O mesmo fato ocorre com o modelo da raiz

Concentração m

áxima de etanol (g/L)

Con

cent

raçã

o La

ctob

acill

us

ferm

entu

m

(ÛF

C/m

L)

117

quadrada (Ratwosky) para a levedura, que apresenta um R2 de 0,43, demonstrando baixa

concordância do modelo com os dados experimentais. Estes dados demonstram que λ do

lactobacilo e da levedura tem baixa dependência do fator temperatura. O mesmo ocorre com

o modelo de Davey (1989) testado para o tempo de adaptação apresenta baixo coeficiente

de correlação, com menos de 50% dos dados em concordância com o modelo, o fator de

bias com um valor de 0,934 e o fator de exatidão com um valor de 1,34, demonstrando da

mesma forma do modelo da raiz quadrada, a baixa dependência da temperatura na faixa

estudada.

Tabela 17. Comparação dos índices de validação dos modelos secundários para a S.cerevisiae e L. fermentum para os parâmetros µ, λ e Rg

Modelo

Arrhenius modificado Raiz Quadrada Polinomial de 2ª ordem

Levedura mista R² Bias Exatidão R² Bias Exatidão R² Bias Exatidão

µ 0,450 0,988 1,129 0,430 0,992 1,10 0,636 1,009 1,131

λ 0,301 0,890 1,330 0,352 0,960 1,220 - - -

Res

post

as

Rg - - - - - - - - -

Arrhenius modificado Raiz Quadrada Polinomial de 2ª ordem

Lactobacilo misto R² Bias Exatidão R² Bias Exatidão R² Bias Exatidão

µ 0,243 0,964 1,230 0,244 0,980 1,15 0,585 1,022 1,195

λ 0,480 0,934 1,340 0,220 0,956 1,310 - - -

Res

post

as

Rg - - - - - - 0,975 1,000 1,020

Onde (-) não houve significância das variáveis

Como estes modelos avaliam somente a influência da temperatura, e os dados

avaliados são provenientes de uma cultura mista de microrganismos com várias

concentrações de lactobacilo (101 a 108UFC/mL) e uma concentração de levedura fixa

(106UFC/mL), onde há uma interação complexa entre estes dois microrganismos (lactobacilo

e levedura) que não é descrita pelos modelos da raiz quadrada e Davey, portanto estes

modelos não se ajustaram aos dados experimentais.

118

Como os modelos da raiz quadrada e de Davey não ajustam dados para a população

máxima, foi gerado um modelo polinomial de segunda ordem, utilizando valores codificados

para as variáveis (temperatura e nível de inóculo), tendo como fatores significativos (Tabela

18), a p<0,10, nível de inóculo (linear e quadrático) e a interação entre a temperatura e o

nível de inóculo. Este modelo apresentou um alto coeficiente de correlação dos dados,

demonstrando que 97,5% dos dados estão de acordo com o modelo proposto, e os

parâmetros de performance do modelo (bias e exatidão) demonstram excelente

concordância. Pelo cálculo do fator de bias 100% dos dados estão na região segura da

predição do modelo, e somente 2% dos dados, de acordo com o fator exatidão, estão em

discordância com o modelo predito.

Tabela 18. Efeitos da temperatura e nível de inóculo para a população máxima do lactobacilo em cultura mista

Ao avaliar o efeito das variáveis, a que apresenta maior significância é L inóculo linear

do lactobacilo com um p valor de 0.000045 (vide tabela 18 e figura 30), demonstrando assim

que a população máxima é influenciada pelo inóculo inicial de lactobacilo. A equação do

modelo está apresentada abaixo (equação 25). Esta equação permite calcular a população

máxima atingida em um processo de fermentação alcoólica, a partir da população inicial de

lactobacilo, dentro da faixa estudada.

LTLLRgLog **43887,0*58622,0*80619,168645,11)( 2 −−+=

Equação 25

A superfície de resposta (figura 30) demonstra o efeito quadrático do nível de inóculo de

lactobacilo e o efeito quase linear da temperatura na faixa analisada.

119

Figura 30. Efeito da temperatura de fermentação e nível de inóculo de L. fermentum sobre o logarítmo da população máxima do lactobacilo em cultura mista

Para os modelos secundários testados para a levedura em cultura mista (vide tabela

17), os modelos de Davey e Ratwosky não apresentaram bom coeficiente de correlação dos

dados (R2< 0,90), demonstrando desta forma a baixa dependência da taxa de crescimento e

do tempo de adaptação do fator temperatura. Para a taxa de crescimento da levedura foi

testado um modelo polinomial quadrático em função de temperatura e nível de inóculo de

lactobacilo, porém o R2 foi de 0,636, demonstrando da mesma forma a baixa dependência da

temperatura e do nível de inóculo de lactobacilo, apesar dos indíce de performance do

modelo bias e exatidão apresentarem valores bons, 1,009 e 1,131, respectivamente.

Log da população máxim

a

120

5.5.3 Análises da produção de metabólitos (etanol, glicerol, ácido láctico e

ácido acético) e açúcares (glicose)

Os dados de crescimento, juntamente com a produção de metabólitos e

consumo de açúcares estão apresentados na figura 31, para o experimento 07

(28S6L1).

0,00

40,00

80,00

120,00

160,00

200,00

-2,000

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

0 20 40 60 80 100 120

Glic

ose/

Eta

nol/

Glic

erol

(g/L

)

Leve

dura

e L

acto

baci

lo (L

og N

/N0)

Áci

do lá

ctic

o e

acét

ico

(g/L

)

Tempo (horas)

Levedura (log n/N0) Lactobacilo (Log N/N0) Ácido acéticoEtanol Ácido Láctico GlicoseGlicerol

Figura 31. Curva de evolução da produção de etanol, ácido láctico, ácido acético e glicerol; consumo de glicose; curva de crescimento do lactobacilo e levedura em cultura mista para o experimento 07 (28S6L1).

Pela análise da figura 31, pode-se verificar que o valor mínimo de glicose

(8,77 g/L) coincide com o inicio da fase estacionária da levedura em 30 horas de

processo de fermentação, e a produção de etanol atinge o seu máximo em 48

horas, o glicerol acompanha a produção de etanol atingindo seu máximo também

em 48 horas com 21g/L. Os ácidos láctico e acético têm o auge de sua produção

121

no final da fermentação em 84 horas, onde a levedura atingiu sua menor

população, demonstrando assim que os ácidos orgânicos produzido pelo

lactobacilo inibem o crescimento da levedura.

122

6. CONCLUSÕES

• O índice de viabilidade da levedura em cultura pura foi afetado

por mudanças na temperatura. Porém para a cultura mista, num

tempo fixo de fermentação (21h) o nível de inóculo de lactobacilo

foi altamente significante. O melhor índice de viabilidade foi

observado para L=103Ufc/mL e T=25oC;

• Altas temperaturas reduzem o rendimento celular do lactobacilo

em cultura pura, a 31ºC;

• Não houve diferença significativa, ao nível de 10% de

significância, para o tempo de lag, taxa de crescimento e

população máxima da levedura em cultura pura e mista;

• Para o lactobacilo, não houve diferença significativa, ao nível de

10% de significância, para a taxa de crescimento e tempo de lag.

No entanto, para a população máxima houve diferença

significativa quando o microrganismo foi cultivado em cultura pura

e mista;

• A população máxima do lactobacilo em cultura mista é afetada

pela quantidade inicial de inóculo do mesmo;

• A quantidade de ácido láctico produzido no meio de cultivo

influencia a atividade celular da levedura;

• A glicose é um fator limitante para o crescimento do lactobacilo;

• Quando a levedura atinge a fase estacionária, o lactobacilo teve

sua taxa de crescimento incrementada;

• O modelo quase-químico não caracteriza bem a fase de

adaptação dos microrganismos (L. fermentum e S. cerevisiae)

devido ao ajuste linear realizado pelo modelo. Este modelo não

se ajustou muito bem aos dados experimentais, pois os

microrganismos (lactobacilo e levedura) não entram em processo

de morte instataneamente após a fase exponencial, nos casos

em que ocorrem esta situação (morte instantânea) o ajuste do

modelo é muito bom;

123

• O modelo desenvolvido para a população máxima do lactobacilo

pode ser aplicado, dentro da faixa estudada, na indústria de

processamento de cana-de-açúcar pois, conhecendo a

concentração inicial do lactobacilo, pode-se predizer a população

máxima atingida num processo fermentativo;

• Considerando os processos de fermentação industrial a melhor

condição para a produção máxima de etanol com a levedura em

cultura mista e foi com concentração inicial de lactobacilo em

105UFC/mL e a temperatura de fermentação à 28ºC.

• O modelo encontrado para descrever a produção máxima de

etanol demonstra a interação significativa entre a temperatura de

fermentação e o nível de inóculo de lactobacilo no processo

fermentativo. No entanto, o efeito mais importante é o da

temperatura quadrática. Sendo assim, este modelo pode ser

aplicado na prática, dentro da faixa estudada, pois conhecendo a

temperatura de fermentação e o nível de inóculo do lactobacilo

pode-se estimar a quantidade máxima de etanol a ser produzida

durante o processo fermentativo realizado dentro das condições

estudadas.

124

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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141

ANEXO A

Nas figuras abaixo estão apresentadas as curvas de crescimento. Os dados

experimentais estão apresentados no Anexo C nas matrizes do modelo quase-

químico.

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Tempo (horas)

Con

tage

m (

UF

C/m

L)

Lactobacilo cultura pura Lactobacilo cultura mistaLevedura cultura pura Levedura cultura mista

Figura 32. Curva de crescimento para o experimento 01 (25S6L3), para as

culturas mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum.

142

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

1,00E+11

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Con

tage

m (

UF

C/m

L)


Figura 33.Curva de crescimento para o experimento 02 (31S6L3) para as culturas

mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum

1,000E+02

1,000E+03

1,000E+04

1,000E+05

1,000E+06

1,000E+07

1,000E+08

1,000E+09

1,000E+10

1,000E+11

1,000E+12

1,000E+13

1,000E+14

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Con

tage

m (

UF

C/m

L)

Lactobacilo cultura pura Lactobacillo cultura mistaLevedura cultura mista Levedura cultura pura



143

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

1,00E+11

1,00E+12

1,00E+13

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Con

tage

m (

UF

C/m

L)



e puras de S. cerevisiae e L.fermentum

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

1,00E+11

1,00E+12

1,00E+13

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Con

tage

m (

UF

C/m

L)




144

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Con

tage

m (

UF

C/m

L)




1,000E+04

1,000E+05

1,000E+06

1,000E+07

1,000E+08

1,000E+09

1,000E+10

1,000E+11

1,000E+12

1,000E+13

1,000E+14

1,000E+15

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Con

tage

m (

UF

C/m

L)




145

1,000E+03

1,000E+04

1,000E+05

1,000E+06

1,000E+07

1,000E+08

1,000E+09

1,000E+10

1,000E+11

1,000E+12

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Con

tage

m (

UF

C/m

L)

Lactobacilo cultura pura lactobacilo cultura mistaLevedura cultura pura Levedura cultura mista



1,000E+03

1,000E+04

1,000E+05

1,000E+06

1,000E+07

1,000E+08

1,000E+09

1,000E+10

1,000E+11

1,000E+12

1,000E+13

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Lact

obac

ilo (

UF

C/m

L)




146

1,000E+04

1,000E+05

1,000E+06

1,000E+07

1,000E+08

1,000E+09

1,000E+10

1,000E+11

1,000E+12

1,000E+13

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (horas)

Con

tage

m (

UF

C/m

L)


Figura 41.Curva de crescimento experimento 11 (28S6L5), para as culturas


147

ANEXO B

Preparo das soluções de antibiótico

1. Tetraciclina

Dissolver 500mg de cloridrato de tetraciclina em 200mL de etanol (Manual Merck,

1996). Estocar a solução em frasco escuro estéril, sob refrigeração. Adicionar ao

meio de cultura 40mL/L após a esterilização do meio de cultura.

A solução não deve ser mantida em estoque por mais de uma semana.

2. Cloranfenicol

Dissolver 0.1g de cloranfenicol em 100 ml de água destilda, adicionar 40mL/L

desta solução antes de autoclavar o meio de cultura (Tournas et al, 1998). A

solução deve ser estocada em frasco escuro e sob refrigeração, por no máximo 1

semana.

3. Natamicina

Dissolver 1g em 200mL de ácido acético 1N (Thomas & Delves- Broughton, 2001),

esterilizar a solução por filtração com membrana de 0.22µm (Millipore, Miliford,

USA). Acondicionar em frasco escuro estéril, estocar sob refrigeração, por no

máximo 1 semana.

4. Preparo do corante Azul de Metileno para coloração de células viáveis (Lee et

al, 1981)

Azul de Metileno 0.025g

NaCl 0.9g

KCl 0.042g

CaCl2.6H2O 0.048g

NaHCO3 0.02g

Glicose 1g

Água 100 mL

Estocar o corante em frasco escuro.

148

5. Formulação do Agar Extrato de Malte (Pitt & Hocking, 1985)

Extrato de Malte 20g

Glicose 20g

Peptona 1g

Agar 20g

Água destilada 1L

Autoclavar 121ºC por 15 minutos.pH final 6.7

149

ANEXO C

Programa para a resolução do modelo quase-químico

(%) – comentários feitos no programa

(xd) – contagem do número de células

(x0) - contagem celular no tempo 0

(td) – intervalo de tempo de dados

(Lx) – logaritimo da concentração celular experimental

(Ld) – logartimo da concentração celular do microrganismo predito pelo modelo

(h) – erro estocástico do modelo

(mesh) – tempo em que o modelo calculará o valor de Ld

(L0) – concentração celular inicial predita pelo modelo

(MuL) – taxa de crescimento do microrganismo (µ)

(LB) – limite inferior

(UB) – limite superior

152

Curvas de crescimento/declínio geradas pelo modelo quase-químico

Figura 42. Modelo quase-químico para o L.fermentum cultura pura experimento 01 (25S0L3)

Tempo (horas) Lx Ld (Lx-Ld) 0 3.2175 3.2175 0

3.0000 3.2214 3.5522 -0.3308 6.0000 3.2822 3.8894 -0.6073 9.0000 3.8062 4.2267 -0.4205 12.0000 4.1959 4.5639 -0.3680 15.0000 4.4502 4.9011 -0.4509 18.0000 5.5011 5.2384 -0.2627 21.0000 5.5911 5.5756 -0.0155 24.0000 6.9217 5.9128 1.0089 30.0000 7.2380 6.5871 0.6509 36.0000 7.5502 7.2609 0.2893 42.0000 8.5378 7.9317 0.6061 48.0000 8.7160 8.5891 0.1268 54.0000 8.8513 9.1879 -0.3368 60.0000 9.2304 9.5824 -0.3523 68.0000 8.6385 9.4749 -0.8371 76.0000 8.2368 8.8551 -0.6191 84.0000 8.3365 8.0961 -0.2395 92.0000 7.5798 7.3116 0.2673

100.0000 7.4571 6.5230 0.9333 SSE = 2.3007 k = 44.5282 1.5043 0.0055 1.2455 µ = 0.1124 Lambda = 0.0225 Rg = 6.4154

153

Figura 43. Modelo quase-químico para o L.fermentum em cultura pura experimento 02 (31S0L3)


3.0000 3.1206 3.4675 -0.3469 6.0000 4.3522 3.8027 0.5494 9.0000 4.5315 4.1380 0.3935

12.0000 5.1761 4.4732 0.7029 15.0000 6.1351 4.8084 1.3267 18.0000 6.4779 5.1436 1.3342 21.0000 6.3129 5.4789 0.8340 24.0000 6.4201 5.8141 0.6059 30.0000 6.4802 6.4845 -0.0044 36.0000 7.2175 7.1548 0.0626 42.0000 8.3936 7.8241 0.5694 48.0000 8.5539 8.4890 0.0647 54.0000 8.5769 9.1339 -0.5573 60.0000 8.3222 9.6954 -1.3739 68.0000 9.5263 10.0046 -0.4803 76.0000 9.4807 9.6144 -0.1367 84.0000 9.4579 8.9105 0.5441 92.0000 8.5539 8.1389 0.4116

100.0000 7.0414 7.3554 -0.3174 SSE = 3.0033 k = 14.5763 1.5067 0.0023 1.2494 µ = 0.1117 Lambda = 0.0683 Rg = 6.8699

154



3.0000 6.4232 7.8680 1.4448 6.0000 6.8976 8.1356 1.2380 9.0000 8.5605 8.4033 0.1572

12.0000 9.5982 8.6710 0.9273 15.0000 9.3892 8.9386 0.4505 18.0000 9.5250 9.2063 0.3188 21.0000 9.6335 9.4739 0.1596 24.0000 9.5119 9.7415 0.2297 30.0000 11.5533 10.2767 1.2766 36.0000 11.6180 10.8114 0.8067 42.0000 11.7520 11.3445 0.4076 48.0000 11.3608 11.8723 0.5115 54.0000 12.3522 12.3822 0.0300 60.0000 12.6675 12.8363 0.1689 68.0000 12.3979 13.1930 0.7950 76.0000 12.4579 13.0660 0.6081 84.0000 12.4031 12.5847 0.1816 92.0000 12.2799 11.9772 0.3027

100.0000 12.0512 11.3373 0.7139 SSE = 3.0432 k = 12.4826 1.5961 0.0000 1.3906 µ= 0.0892 Lambda = 0.0798 Rg = 5.6009

155



3.0000 7.3324 7.5922 -0.2598 6.0000 8.0737 7.8388 0.2349 9.0000 8.5011 8.0854 0.4157 12.0000 8.1367 8.3319 -0.1952 15.0000 8.2430 8.5783 -0.3353 18.0000 8.2900 8.8246 -0.5346 21.0000 8.6990 9.0706 -0.3716 24.0000 8.9031 9.3161 -0.4130 30.0000 8.8129 9.8037 -0.9908 36.0000 9.0414 10.2798 -1.2384 42.0000 11.0210 10.7218 0.2992 48.0000 12.0368 11.0745 0.9623 54.0000 12.0418 11.2441 0.7977 60.0000 11.7789 11.1678 0.6111 68.0000 10.5315 10.7743 -0.2428 76.0000 10.0607 10.2322 -0.1715 84.0000 9.4900 9.6459 -0.1559 92.0000 8.8228 9.0478 -0.2250

100.0000 8.2041 8.4469 -0.2428 SSE = 2.4090 k = 12.3929 1.5520 0.0001 1.3627 µ = 0.0822 Lambda = 0.0801 Rg = 3.8962

156



3.0000 5.7597 5.7791 -0.0194 6.0000 6.1973 6.1957 0.0016 9.0000 6.0969 6.6124 -0.5155

12.0000 6.8293 7.0290 -0.1997 15.0000 7.2978 7.4456 -0.1479 18.0000 6.7520 7.8622 -1.1102 21.0000 8.3617 8.2789 0.0829 24.0000 9.4526 8.6955 0.7571 30.0000 9.8261 9.5282 0.2979 36.0000 10.3811 10.3577 0.0234 42.0000 11.5058 11.1659 0.3397 48.0000 12.1903 11.8479 0.3411 54.0000 11.9320 12.0777 -0.1497 60.0000 11.4338 11.7162 -0.2882 68.0000 10.4928 10.8586 -0.3727 76.0000 9.4314 9.9200 -0.4961 84.0000 9.0273 8.9723 0.0474 92.0000 8.2565 8.0236 0.2250

100.0000 7.9004 7.0748 0.8177 SSE = 1.9166 k = 13.1701 1.5718 0.0000 1.2521 µ = 0.1389 Lambda = 0.0752 Rg = 6.7161

157



3.0000 5.1523 5.7229 -0.5706 6.0000 5.2304 6.0952 -0.8648 9.0000 6.2516 6.4675 -0.2159 12.0000 7.2718 6.8398 0.4320 15.0000 8.3874 7.2122 1.1752 18.0000 8.7033 7.5845 1.1188 21.0000 8.8513 7.9568 0.8945 24.0000 8.5502 8.3291 0.2211 30.0000 9.6527 9.0737 0.5790 36.0000 10.2636 9.8179 0.4457 42.0000 10.5453 10.5598 -0.0145 48.0000 11.2480 11.2893 -0.0414 54.0000 11.4241 11.9552 -0.5315 60.0000 11.4749 12.3705 -0.8971 68.0000 11.5384 12.1622 -0.6269 76.0000 11.0374 11.4333 -0.3994 84.0000 11.0065 10.5916 0.4112 92.0000 10.3892 9.7330 0.6521

100.0000 9.1367 8.8723 0.2601 SSE = 2.7615 k = 19.2275 1.5325 0.0000 1.2467 µ= 0.1241 Lambda = 0.0518 Rg = 7.0469

158



3.0000 0.7782 1.4625 -0.6844 6.0000 1.4624 1.8519 -0.3895 9.0000 2.0414 2.2413 -0.2000 12.0000 2.8261 2.6307 0.1953 15.0000 3.1931 3.0202 0.1730 18.0000 3.9614 3.4096 0.5518 21.0000 4.6675 3.7990 0.8685 24.0000 4.9345 4.1884 0.7461 30.0000 6.0414 4.9673 1.0741 36.0000 6.5051 5.7461 0.7590 42.0000 6.5911 6.5248 0.0663 48.0000 7.6580 7.3028 0.3552 54.0000 8.2695 8.0763 0.1933 60.0000 8.3032 8.8237 -0.5205 68.0000 8.2742 9.5660 -1.2918 76.0000 8.2683 9.4536 -1.1853 84.0000 8.3589 8.7171 -0.3582 92.0000 8.3170 7.8441 0.4729

100.0000 8.2480 6.9520 1.2960 SSE = 3.1012 k = 21.3874 1.5462 0.0071 1.2473 µ = 0.1298 Lambda = 0.0466 Rg = 8.5617

159



3.0000 7.3118 8.1614 -0.8496 6.0000 7.5740 8.2089 -0.6349 9.0000 7.8261 8.3249 -0.4988 12.0000 7.6484 8.5342 -0.8858 15.0000 8.0334 8.8295 -0.7961 18.0000 8.7202 9.1797 -0.4596 21.0000 9.6484 9.5570 0.0913 24.0000 10.4472 9.9460 0.5012 30.0000 11.0550 10.7350 0.3200 36.0000 11.5441 11.5275 0.0166 42.0000 12.7634 12.3197 0.4437 48.0000 13.6284 13.1077 0.5206 54.0000 14.2175 13.8693 0.3479 60.0000 13.9912 14.4930 -0.5026 68.0000 13.7672 14.6166 -0.8524 76.0000 13.4571 13.9755 -0.5220 84.0000 13.4487 13.1290 0.3156 92.0000 12.3811 12.2518 0.1251

100.0000 12.1658 11.3706 0.7907 SSE = 2.4386 k = 0.0132 1.3257 0.0000 1.0214 µ = 0.1321 Lambda = 10.4422 Rg = 6.5435

160



3.0000 5.1303 5.7515 -0.6211 6.0000 5.5682 6.1400 -0.5718 9.0000 5.9868 6.5286 -0.5418 12.0000 6.6232 6.9171 -0.2939 15.0000 7.1931 7.3056 -0.1125 18.0000 8.3617 7.6941 0.6676 21.0000 9.1106 8.0827 1.0279 24.0000 9.5441 8.4712 1.0729 30.0000 9.7520 9.2480 0.5040 36.0000 10.0374 10.0237 0.0138 42.0000 10.2672 10.7921 -0.5250 48.0000 11.3054 11.5196 -0.2142 54.0000 11.6335 12.0548 -0.4213 60.0000 11.4807 12.0980 -0.6173 68.0000 11.7435 11.4795 0.2640 76.0000 11.1973 10.6269 0.5704 84.0000 9.9031 9.7388 0.1643 92.0000 8.4409 8.8463 -0.4054

100.0000 7.9614 7.9531 0.0083 SSE = 2.3408 k = 12.8992 1.5453 0.0000 1.2471 µ = 0.1295 Lambda = 0.0768 Rg = 6.7786

161

Figura 51. Modelo quase-químico para o L.fermentum em cultura pura experimento 10 (28S0L5).


3.0000 5.2672 5.7263 -0.4592 6.0000 5.4698 6.1414 -0.6715 9.0000 5.8603 6.5564 -0.6961 12.0000 6.7889 6.9714 -0.1826 15.0000 7.6021 7.3865 0.2156 18.0000 8.2822 7.8016 0.4806 21.0000 9.3243 8.2166 1.1076 24.0000 9.6679 8.6317 1.0362 30.0000 9.9777 9.4616 0.5161 36.0000 10.4949 10.2900 0.2049 42.0000 10.7709 11.1083 -0.3374 48.0000 11.0881 11.8627 -0.7746 54.0000 11.6248 12.3205 -0.6957 60.0000 11.9845 12.1721 -0.1876 68.0000 11.4241 11.3969 0.0271 76.0000 11.3936 10.4729 0.9207 84.0000 9.8893 9.5300 0.3593 92.0000 8.3434 8.5852 -0.2418

100.0000 7.1139 7.6403 -0.5263 SSE = 2.5714 k = 12.5047 1.5656 0.0000 1.2470 µ= 0.1383 Lambda = 0.0792 Rg = 7.0199

162



3.0000 5.1139 5.5453 -0.4313 6.0000 5.3233 5.9507 -0.6274 9.0000 5.7324 6.3561 -0.6237 12.0000 6.3979 6.7615 -0.3636 15.0000 7.6946 7.1670 0.5276 18.0000 8.4232 7.5724 0.8508 21.0000 9.4472 7.9779 1.4693 24.0000 9.0864 8.3833 0.7030 30.0000 9.6180 9.1940 0.4240 36.0000 10.2553 10.0032 0.2520 42.0000 10.6902 10.8031 -0.1129 48.0000 11.0550 11.5462 -0.4912 54.0000 11.1492 12.0262 -0.8770 60.0000 11.0253 11.9337 -0.9084 68.0000 11.0212 11.2047 -0.1835 76.0000 11.9165 10.3051 1.6113 84.0000 9.4771 9.3827 0.0945 92.0000 8.1156 8.4577 -0.3421

100.0000 7.4548 7.5324 -0.0775 SSE= 3.1000 k = 12.2141 1.5473 0.0000 1.2361 µ = 0.1351 Lambda = 0.0811 Rg = 6.9129

163

Figura 53. Modelo quase-químico para a S. cerevisiae em cultura pura experimento 01 (25S6L0)


3.0000 6.4843 6.5617 -0.0774 6.0000 6.6484 6.7639 -0.1156 9.0000 7.0253 6.9659 0.0594 12.0000 7.7118 7.1676 0.5442 15.0000 8.0107 7.3687 0.6420 18.0000 8.1538 7.5690 0.5848 21.0000 8.1717 7.7679 0.4038 24.0000 8.2945 7.9648 0.3297 30.0000 8.5855 8.3467 0.2388 36.0000 8.8633 8.6958 0.1675 42.0000 8.9542 8.9746 -0.0204 48.0000 8.4232 9.1278 -0.7045 54.0000 8.7745 9.1136 -0.3391 60.0000 8.8482 8.9446 -0.0964 68.0000 8.1123 8.5672 -0.4549 76.0000 8.0899 8.1105 -0.0206 84.0000 7.9566 7.6256 0.3310 92.0000 7.8293 7.1314 0.6979

100.0000 6.6180 6.6340 -0.0160 SSE = 1.6898 k = 29.0034 1.4078 0.0064 1.2524 µ = 0.0674 Lambda = 0.0344 Rg = 2.7811

164


Tempo (horas) Lx Ld (Lx-Ld)

0 6.2292 6.2292 0 3.0000 6.1959 6.4789 -0.2830 6.0000 6.5911 6.7310 -0.1399 9.0000 7.1461 6.9824 0.1637 12.0000 7.6721 7.2325 0.4396 15.0000 8.4843 7.4804 1.0039 18.0000 8.6532 7.7243 0.9289 21.0000 8.7243 7.9612 0.7631 24.0000 8.3274 8.1862 0.1412 30.0000 8.7202 8.5658 0.1543 36.0000 8.6990 8.7670 -0.0680 42.0000 8.1599 8.7148 -0.5549 48.0000 8.2625 8.4504 -0.1879 54.0000 7.9217 8.0711 -0.1494 60.0000 7.0000 7.6434 -0.6434 68.0000 7.2109 7.0472 0.1636 76.0000 5.9956 6.4420 -0.4464 84.0000 5.6817 5.8349 -0.1532 92.0000 5.7754 5.2272 0.5481

100.0000 5.7559 4.6194 1.1364 SSE = 2.3328 k = 29.8631 1.3762 0.0240 1.1823 µ = 0.0842 Lambda = 0.0333 Rg = 2.5492

165

Figura 55. Modelo quase-químico para a S. cerevisiae em cultura puraexperimento 03 (25S6L0)


0 6.4065 6.4065 0 3.0000 6.3118 6.5818 -0.2700 6.0000 6.6990 6.7587 -0.0597 9.0000 6.4843 6.9353 -0.4510

12.0000 7.5966 7.1116 0.4850 15.0000 7.5740 7.2874 0.2866 18.0000 7.9217 7.4624 0.4592 21.0000 8.1987 7.6364 0.5623 24.0000 8.6721 7.8086 0.8635 30.0000 9.0550 8.1446 0.9104 36.0000 8.4843 8.4587 0.0256 42.0000 8.9731 8.7287 0.2444 48.0000 8.2967 8.9199 -0.6232 54.0000 8.2856 8.9945 -0.7090 60.0000 8.4074 8.9368 -0.5294 68.0000 8.4472 8.6913 -0.2442 76.0000 8.2343 8.3323 -0.0980 84.0000 8.4393 7.9227 0.5166 92.0000 7.5949 7.4933 0.1017

100.0000 7.5694 7.0563 0.5130 SSE = 2.1307 k = 34.0544 1.4081 0.0069 1.2722 µ = 0.0590 Lambda = 0.0293 Rg = 2.5881

166



3.0000 5.8949 6.5704 -0.6755 6.0000 6.9542 6.8312 0.1231 9.0000 6.8751 7.0909 -0.2158 12.0000 7.4158 7.3487 0.0671 15.0000 8.0969 7.6028 0.4941 18.0000 8.1987 7.8506 0.3480 21.0000 8.3181 8.0872 0.2309 24.0000 8.4771 8.3046 0.1725 30.0000 8.4472 8.6320 -0.1848 36.0000 8.2529 8.7210 -0.4681 42.0000 8.6902 8.5441 0.1461 48.0000 8.0569 8.1940 -0.1371 54.0000 7.9614 7.7660 0.1954 60.0000 7.6767 7.3086 0.3681 68.0000 6.8543 6.6838 0.1705 76.0000 5.2254 6.0544 -0.8289 84.0000 5.0869 5.4239 -0.3371 92.0000 5.0471 4.7933 0.2538

100.0000 4.6325 4.1625 0.4700 SSE = 1.5979 k = 17.6457 1.4460 0.0276 1.2452 µ = 0.0872 Lambda = 0.0563 Rg = 2.4119

167



3.0000 6.1177 6.3030 -0.1853 6.0000 6.2249 6.4886 -0.2638 9.0000 6.7924 6.6742 0.1182

12.0000 7.1271 6.8595 0.2676 15.0000 7.5441 7.0446 0.4995 18.0000 7.6721 7.2292 0.4429 21.0000 8.0952 7.4131 0.6821 24.0000 8.0899 7.5960 0.4939 30.0000 8.5315 7.9563 0.5751 36.0000 8.2095 8.3019 -0.0923 42.0000 8.2753 8.6151 -0.3398 48.0000 8.9614 8.8643 0.0971 54.0000 8.5911 9.0054 -0.4144 60.0000 8.6628 9.0050 -0.3423 68.0000 8.4065 8.7993 -0.3928 76.0000 8.1523 8.4453 -0.2930 84.0000 8.1446 8.0244 0.1202 92.0000 8.2978 7.5779 0.7199

100.0000 7.2765 7.1220 0.1545

SSE = 1.7012 k = 18.7728 1.4092 0.0071 1.2666 µ = 0.0619 Lambda = 0.0530 Rg = 2.9030

168



3.0000 6.2028 6.4963 -0.2935 6.0000 6.3892 6.7160 -0.3269 9.0000 6.8357 6.9354 -0.0998 12.0000 7.5185 7.1543 0.3642 15.0000 7.8808 7.3724 0.5084 18.0000 7.8893 7.5890 0.3003 21.0000 8.5966 7.8033 0.7933 24.0000 8.5315 8.0138 0.5177 30.0000 8.9217 8.4127 0.5090 36.0000 8.6580 8.7490 -0.0910 42.0000 8.8261 8.9584 -0.1324 48.0000 8.5315 8.9787 -0.4472 54.0000 7.9542 8.8120 -0.8577 60.0000 8.3711 8.5202 -0.1491 68.0000 7.7818 8.0382 -0.2565 76.0000 7.6075 7.5168 0.0907 84.0000 7.9638 6.9832 0.9806 92.0000 6.6075 6.4461 0.1615

100.0000 6.0253 5.9080 0.1173 SSE = 1.9748 k = 20.7972 1.4194 0.0106 1.2506 µ = 0.0733 Lambda = 0.0479 Rg = 2.7151

169



3.0000 6.0086 6.3060 -0.2974 6.0000 6.0934 6.5373 -0.4438 9.0000 6.6675 6.7682 -0.1008 12.0000 7.1658 6.9986 0.1672 15.0000 7.7745 7.2280 0.5465 18.0000 8.2240 7.4558 0.7682 21.0000 8.2788 7.6809 0.5979 24.0000 8.3222 7.9014 0.4209 30.0000 8.2672 8.3149 -0.0478 36.0000 8.4314 8.6496 -0.2182 42.0000 8.1761 8.8269 -0.6508 48.0000 8.2430 8.7881 -0.5451 54.0000 8.3892 8.5614 -0.1723 60.0000 8.1875 8.2238 -0.0363 68.0000 8.0846 7.6996 0.3850 76.0000 7.5378 7.1464 0.3914 84.0000 7.3118 6.5853 0.7265 92.0000 6.0065 6.0219 -0.0154

100.0000 4.8357 5.4579 -0.6222 SSE = 1.9404 k = 26.9208 1.4254 0.0168 1.2477 µ = 0.0772 Lambda = 0.0370 Rg = 2.7611

170



3.0000 5.9420 6.2679 -0.3259 6.0000 6.1746 6.4941 -0.3195 9.0000 6.8096 6.7200 0.0896 12.0000 7.0626 6.9453 0.1173 15.0000 7.4150 7.1697 0.2453 18.0000 7.7443 7.3925 0.3518 21.0000 8.3324 7.6127 0.7197 24.0000 8.1206 7.8285 0.2921 30.0000 8.3979 8.2345 0.1634 36.0000 8.1367 8.5675 -0.4308 42.0000 8.1367 8.7548 -0.6181 48.0000 8.5563 8.7365 -0.1802 54.0000 8.0149 8.5311 -0.5162 60.0000 8.4065 8.2106 0.1960 68.0000 8.0022 7.7031 0.2990 76.0000 7.9469 7.1633 0.7836 84.0000 7.0107 6.6139 0.3969 92.0000 6.0128 6.0619 -0.0491

100.0000 4.7672 5.5092 -0.7421 SSE = 1.8338 k = 39.9377 1.4197 0.0188 1.2459 µ = 0.0755 Lambda = 0.0250 Rg = 2.7296

171



3.0000 6.0607 6.2556 -0.1949 6.0000 6.1038 6.4798 -0.3760 9.0000 6.6021 6.7036 -0.1016 12.0000 7.0212 6.9268 0.0944 15.0000 7.6628 7.1490 0.5138 18.0000 7.9294 7.3694 0.5601 21.0000 8.0000 7.5869 0.4131 24.0000 8.4257 7.7997 0.6260 30.0000 8.1875 8.1977 -0.0102 36.0000 8.2041 8.5186 -0.3144 42.0000 8.2480 8.6898 -0.4418 48.0000 8.2368 8.6571 -0.4203 54.0000 8.0969 8.4443 -0.3474 60.0000 8.1599 8.1221 0.0377 68.0000 8.1206 7.6167 0.5039 76.0000 7.2095 7.0806 0.1289 84.0000 7.0253 6.5356 0.4897 92.0000 6.0881 5.9880 0.1001

100.0000 4.9934 5.4397 -0.4463 SSE = 1.6283 k = 33.7917 1.4200 0.0217 1.2477 µ= 0.0748 Lambda = 0.0295 Rg = 2.6686

172



3.0000 6.1319 6.4773 -0.3453 6.0000 6.2999 6.7157 -0.4157 9.0000 6.6064 6.9538 -0.3474 12.0000 7.5563 7.1914 0.3649 15.0000 7.9614 7.4282 0.5332 18.0000 7.9731 7.6636 0.3096 21.0000 8.6902 7.8964 0.7938 24.0000 8.4914 8.1250 0.3664 30.0000 8.6180 8.5560 0.0621 36.0000 8.8603 8.9086 -0.0483 42.0000 8.9269 9.0995 -0.1726 48.0000 8.6335 9.0624 -0.4289 54.0000 8.0212 8.8266 -0.8055 60.0000 8.0986 8.4762 -0.3776 68.0000 8.1818 7.9348 0.2470 76.0000 7.8692 7.3652 0.5041 84.0000 7.7672 6.7878 0.9793 92.0000 6.8921 6.2086 0.6835

100.0000 4.6180 5.6289 -1.0108 SSE = 2.3377 k = 18.3705 1.4321 0.0095 1.2489 µ = 0.0795 Lambda = 0.0541 Rg = 2.8700

173



3.0000 6.1319 6.3948 -0.2628 6.0000 6.0663 6.6078 -0.5415 9.0000 6.6180 6.8205 -0.2025 12.0000 7.4232 7.0327 0.3905 15.0000 7.5911 7.2440 0.3471 18.0000 7.7160 7.4538 0.2622 21.0000 8.1673 7.6613 0.5060 24.0000 8.5798 7.8651 0.7147 30.0000 8.1303 8.2512 -0.1209 36.0000 8.8603 8.5784 0.2820 42.0000 8.0864 8.7879 -0.7015 48.0000 8.4771 8.8208 -0.3437 54.0000 8.2553 8.6740 -0.4187 60.0000 8.1303 8.4016 -0.2712 68.0000 8.0414 7.9410 0.1004 76.0000 7.9614 7.4373 0.5242 84.0000 7.8228 6.9197 0.9031 92.0000 6.9294 6.3979 0.5316

100.0000 4.7959 5.8748 -1.0789 SSE = 2.2388 k = 15.4443 1.4138 0.0146 1.2501 µ = 0.0711 Lambda = 0.0643 Rg = 2.6451

174

Figura 64. Modelo quase-químico para a L.fermentum em cultura mista experimento 01 (25S6L3)


3.0000 3.2253 3.5996 -0.3742 6.0000 3.3655 3.9798 -0.6143 9.0000 4.0334 4.3600 -0.3266 12.0000 4.7745 4.7402 0.0343 15.0000 5.0899 5.1204 -0.0305 18.0000 5.1430 5.5007 -0.3576 21.0000 6.4871 5.8809 0.6062 24.0000 7.1239 6.2611 0.8627 30.0000 8.3892 7.0216 1.3676 36.0000 8.5315 7.7818 0.7497 42.0000 9.2330 8.5407 0.6923 48.0000 9.2430 9.2926 -0.0495 54.0000 9.8692 10.0051 -0.1359 60.0000 9.1903 10.5382 -1.3479 68.0000 9.4346 10.5125 -1.0779 76.0000 9.3365 9.8266 -0.4902 84.0000 9.1931 8.9786 0.2145 92.0000 8.9370 8.1062 0.8309

100.0000 7.9085 7.2307 0.6778 SSE = 3.0353 k = 37.6478 1.5337 0.0007 1.2419 µ = 0.1267 Lambda = 0.0266 Rg = 7.4247

175

Figura 65. Modelo quase-químico para a S. cerevisiae em cultura mista experimento 01 (25S6L3)


3.0000 6.9031 6.6522 0.2509 6.0000 6.7672 6.8588 -0.0917 9.0000 7.1903 7.0653 0.1251 12.0000 7.7559 7.2713 0.4846 15.0000 8.0374 7.4767 0.5607 18.0000 8.1461 7.6811 0.4650 21.0000 8.1875 7.8839 0.3036 24.0000 8.7853 8.0842 0.7011 30.0000 8.8096 8.4702 0.3392 36.0000 8.9661 8.8159 0.1499 42.0000 8.9590 9.0763 -0.1180 48.0000 8.6767 9.1919 -0.5165 54.0000 8.3424 9.1304 -0.7899 60.0000 8.8195 8.9208 -0.1036 68.0000 8.1931 8.5088 -0.3183 76.0000 8.1106 8.0320 0.0759 84.0000 7.8893 7.5333 0.3532 92.0000 7.7202 7.0274 0.6899

100.0000 6.5623 6.5194 0.0402 SSEE = 1.7885 k = 38.0075 1.4079 0.0060 1.2491 µ = 0.0689 Lambda = 0.0262 Rg = 2.7480

176



0 3.2695 3.2695 0 3.0000 3.0934 3.6224 -0.5290 6.0000 3.7076 3.9835 -0.2760 9.0000 5.1492 4.3446 0.8046 12.0000 5.3385 4.7057 0.6327 15.0000 5.6284 5.0668 0.5616 18.0000 6.2529 5.4279 0.8250 21.0000 6.5832 5.7890 0.7942 24.0000 7.2014 6.1501 1.0513 30.0000 7.5224 6.8722 0.6502 36.0000 7.4249 7.5941 -0.1692 42.0000 8.1139 8.3148 -0.2009 48.0000 9.3692 9.0291 0.3401 54.0000 9.3945 9.7106 -0.3163 60.0000 9.3345 10.2497 -0.9156 68.0000 9.3945 10.3364 -0.9430 76.0000 9.3181 9.7419 -0.4253 84.0000 9.2718 8.9442 0.3261 92.0000 9.1106 8.1119 0.9972

100.0000 7.2900 7.2744 0.0141 SSE = 2.8023 k = 14.6626 1.5258 0.0010 1.2487 µ = 0.1204 Lambda = 0.0678 Rg = 7.1411

177



0 6.2253 6.2253 0 3.0000 6.5623 6.4546 0.1077 6.0000 7.3711 6.6845 0.6865 9.0000 7.3424 6.9141 0.4284 12.0000 7.8573 7.1429 0.7144 15.0000 8.7076 7.3706 1.3370 18.0000 8.2553 7.5963 0.6589 21.0000 8.0212 7.8188 0.2024 24.0000 8.9469 8.0359 0.9111 30.0000 8.2695 8.4379 -0.1684 36.0000 8.6484 8.7501 -0.1018 42.0000 8.4065 8.8933 -0.4868 48.0000 8.3139 8.8207 -0.5069 54.0000 7.7745 8.2269 -0.1855 68.0000 8.1430 7.7010 0.4420 76.0000 6.9845 7.1499 -0.1654 84.0000 6.8162 6.5915 0.2247 92.0000 6.8513 6.0314 0.8199

100.0000 5.6435 5.4707 0.1727 SSE = 2.5396 k = 86.9615 1.4085 0.0147 1.2318 µ = 0.0767 Lambda = 0.0115 Rg = 2.6707

178



0 7.4843 7.4843 0 3.0000 7.3424 7.7915 -0.4490 6.0000 7.9614 8.1062 -0.1448 9.0000 8.2201 8.4211 -0.2009 12.0000 9.1523 8.7358 0.4164 15.0000 9.4298 9.0506 0.3791 18.0000 9.7076 9.3654 0.3422 21.0000 9.9217 9.6801 0.2416 24.0000 10.1173 9.9948 0.1225 30.0000 11.4425 10.6236 0.8189 36.0000 11.3962 11.2499 0.1463 42.0000 11.7160 11.8658 -0.1498 48.0000 12.0569 12.4394 -0.3825 54.0000 12.6767 12.8687 -0.1920 60.0000 12.8451 12.9728 -0.1277 68.0000 13.0170 12.5740 0.4430 76.0000 10.8865 11.9029 -1.0164 84.0000 10.7324 11.1691 -0.4367 92.0000 10.6812 10.4235 0.2578

100.0000 10.6180 9.6758 0.9423 SSE = 2.0147 k = 13.6880 1.5673 0.0000 1.3257 µ = 0.1049 Lambda = 0.0727 Rg = 5.5001

179



0 6.3979 6.3979 0 3.0000 6.3118 6.5995 -0.2878 6.0000 6.3892 6.8017 -0.4126 9.0000 6.6532 7.0036 -0.3504 12.0000 8.2368 7.2051 1.0317 15.0000 7.7782 7.4059 0.3723 18.0000 7.7853 7.6055 0.1798 21.0000 8.9320 7.8034 1.1285 24.0000 8.9191 7.9985 0.9205 30.0000 8.4150 8.3735 0.0413 36.0000 8.6721 8.7066 -0.0347 42.0000 8.9708 8.9537 0.0166 48.0000 8.3551 9.0586 -0.7045 54.0000 8.9518 8.9936 -0.0430 60.0000 8.9518 8.7872 0.1631 68.0000 7.4314 8.3845 -0.9548 76.0000 7.3617 7.9183 -0.5583 84.0000 7.4314 7.4301 -0.0005 92.0000 7.5237 6.9345 0.5874

100.0000 7.4962 6.4367 1.0578 SSE = 2.6357 k = 89.6554 1.4006 0.0078 1.2452 µ= 0.0675 Lambda = 0.0111 Rg = 2.6625

180



0 7.1903 7.1903 0 3.0000 7.8122 7.5159 0.2964 6.0000 8.0453 7.8496 0.1957 9.0000 8.1761 8.1834 -0.0073 12.0000 8.6085 8.5171 0.0914 15.0000 8.9191 8.8507 0.0683 18.0000 9.8312 9.1842 0.6469 21.0000 9.8156 9.5172 0.2981 24.0000 10.1430 9.8494 0.2929 30.0000 10.8228 10.5064 0.3134 36.0000 12.2695 11.1267 1.1294 42.0000 12.2695 11.6070 0.6128 48.0000 11.6902 11.7403 -0.1712 54.0000 10.3010 11.4683 -1.3466 60.0000 9.9614 10.9786 -1.2199 68.0000 9.8451 10.2231 -0.5881 76.0000 9.5623 9.4416 -0.0907 84.0000 9.7243 8.6561 0.8567 92.0000 9.3160 7.8698 1.2347

100.0000 8.0212 7.0835 0.7263 SSE = 2.9920 k = 13.4607 1.5557 0.0000 1.2995 µ= 0.1112 Lambda = 0.0736 Rg = 4.6712

181



3.0000 5.8865 6.5761 -0.6896 6.0000 6.1239 6.9253 -0.8015 9.0000 6.9294 7.2727 -0.3433 12.0000 7.7782 7.6158 0.1624 15.0000 7.9661 7.9494 0.0168 18.0000 8.3096 8.2630 0.0467 21.0000 8.5250 8.5366 -0.0115 24.0000 8.3979 8.7388 -0.3409 30.0000 8.1461 8.8085 -0.6624 36.0000 8.4314 8.4641 -0.0327 42.0000 8.2788 7.9279 0.3508 48.0000 8.0170 7.3344 0.6826 54.0000 6.9777 6.7258 0.2519 60.0000 6.3404 6.1137 0.2267 68.0000 5.4150 5.2964 0.1186 76.0000 4.2430 4.4788 -0.2358 84.0000 3.2788 3.6612 -0.3825 92.0000 2.5378 2.8435 -0.3057

100.0000 1.9031 2.0259 -0.1228 SSE = 1.6879 k = 12.0653 1.5174 0.0368 1.2485 µ = 0.1167 Lambda = 0.0818 Rg = 2.6042

182



0 5.2833 5.2833 0 3.0000 5.6857 5.6574 0.0284 6.0000 6.0792 6.0342 0.0450 9.0000 6.0755 6.4110 -0.3354 12.0000 6.4518 6.7877 -0.3359 15.0000 6.9590 7.1645 -0.2054 18.0000 7.2122 7.5413 -0.3291 21.0000 7.4698 7.9180 -0.4482 24.0000 8.2122 8.2948 -0.0826 30.0000 8.9217 9.0481 -0.1264 36.0000 10.1461 9.8004 0.3457 42.0000 11.2672 10.5470 0.7202 48.0000 12.2810 11.2620 1.0191 54.0000 11.5966 11.8288 -0.2322 60.0000 11.2553 11.9732 -0.7179 68.0000 11.0969 11.4546 -0.3577 76.0000 9.9269 10.6427 -0.7158 84.0000 9.7745 9.7812 -0.0067 92.0000 9.4232 8.9131 0.5101

100.0000 9.0212 8.0441 0.9771 SSE = 2.1688 k = 47.0463 1.5324 0.0000 1.2432 µ = 0.1256 Lambda = 0.0214 Rg = 6.7060

183



0 6.0531 6.0531 0 3.0000 6.1492 6.2469 -0.0977 6.0000 6.7033 6.4415 0.2618 9.0000 6.4472 6.6359 -0.1888 12.0000 7.2695 6.8302 0.4393 15.0000 7.4698 7.0243 0.4455 18.0000 7.9138 7.2179 0.6959 21.0000 8.1931 7.4109 0.7822 24.0000 8.8388 7.6030 1.2358 30.0000 8.8751 7.9819 0.8932 36.0000 8.2227 8.3459 -0.1232 42.0000 8.7118 8.6764 0.0355 48.0000 8.2279 8.9375 -0.7097 54.0000 8.3856 9.0794 -0.6938 60.0000 8.6484 9.0656 -0.4172 68.0000 8.5119 8.8299 -0.3180 76.0000 8.0969 8.4458 -0.3489 84.0000 8.0899 7.9993 0.0906 92.0000 8.4800 7.5301 0.9499

100.0000 7.3222 7.0530 0.2693 SSE = 2.5115 k = 85.2642 1.4030 0.0067 1.2537 µ = 0.0649 Lambda = 0.0117 Rg = 3.0400

184



0 5.2989 5.2989 0 3.0000 5.1818 5.6541 -0.4723 6.0000 5.3560 6.0186 -0.6627 9.0000 6.2553 6.3831 -0.1280 12.0000 6.5185 6.7476 -0.2293 15.0000 7.3404 7.1121 0.2281 18.0000 8.3945 7.4766 0.9175 21.0000 8.5315 7.8412 0.6900 24.0000 9.3522 8.2057 1.1461 30.0000 9.4914 8.9347 0.5562 36.0000 9.8261 9.6634 0.1621 42.0000 10.2122 10.3904 -0.1791 48.0000 10.8949 11.1089 -0.2159 54.0000 11.0531 11.7838 -0.7371 60.0000 11.4150 12.2761 -0.8838 68.0000 12.5328 12.2376 0.2376 76.0000 12.0453 11.5827 0.3916 84.0000 11.7443 10.7679 0.9037 92.0000 9.5623 9.9270 -0.4376

100.0000 8.4150 9.0827 -0.7404 SSE = 2.6305 k = 13.0790 1.5253 0.0000 1.2455 µ = 0.1215 Lambda = 0.0759 Rg = 7.1115

185



0 6.0212 6.0212 0 3.0000 6.3139 6.2671 0.0468 6.0000 6.2095 6.5194 -0.3099 9.0000 7.6857 6.7717 0.9141 12.0000 7.5250 7.0235 0.5016 15.0000 8.0607 7.2746 0.7861 18.0000 8.2810 7.5245 0.7565 21.0000 8.5740 7.7722 0.8018 24.0000 8.3979 8.0161 0.3819 30.0000 8.6946 8.4790 0.2156 36.0000 8.1523 8.8626 -0.7103 42.0000 8.5250 9.0718 -0.5468 48.0000 8.4983 9.0282 -0.5299 54.0000 8.1523 8.7682 -0.6159 60.0000 8.5185 8.3896 0.1289 68.0000 7.9217 7.8132 0.1085 76.0000 7.7243 7.2114 0.5129 84.0000 7.5911 6.6030 0.9881 92.0000 5.6721 5.9932 -0.3211

100.0000 5.2175 5.3831 -0.1656 SSE = 2.4643 k = 12.5871 1.4434 0.0112 1.2496 µ = 0.0842 Lambda = 0.0788 Rg = 3.0649

186



0 1.0607 1.0607 0 3.0000 0.7404 1.3756 -0.6352 6.0000 1.4624 1.6912 -0.2288 9.0000 2.1303 2.0067 0.1236 12.0000 3.0414 2.3223 0.7191 15.0000 3.5855 2.6378 0.9476 18.0000 3.7709 2.9534 0.8174 21.0000 3.6990 3.2690 0.4300 24.0000 3.9004 3.5846 0.3158 30.0000 4.8692 4.2157 0.6535 36.0000 5.3711 4.8468 0.5242 42.0000 5.6335 5.4777 0.1557 48.0000 5.8420 6.1077 -0.2657 54.0000 6.4518 6.7337 -0.2819 60.0000 7.2175 7.3430 -0.1255 68.0000 7.5966 8.0343 -0.4377 76.0000 7.5185 8.2609 -0.7424 84.0000 7.5315 7.8706 -0.3392 92.0000 7.3784 7.2072 0.1712

100.0000 7.1614 6.4801 0.6813 SSE = 2.2544 k = 165.5408 1.4463 0.1152 1.2041 µ = 0.1052 Lambda = 0.0063 Rg = 7.2105

187



0 6.2175 6.2175 0 3.0000 6.0969 6.4159 -0.3190 6.0000 6.3802 6.6160 -0.2358 9.0000 6.9269 6.8157 0.1112 12.0000 7.5911 7.0150 0.5761 15.0000 8.0719 7.2135 0.8584 18.0000 8.8122 7.4109 1.4013 21.0000 8.4624 7.6066 0.8558 24.0000 8.3617 7.7995 0.5622 30.0000 8.1761 8.1701 0.0060 36.0000 8.2695 8.4996 -0.2300 42.0000 8.0531 8.7450 -0.6920 48.0000 8.3222 8.8520 -0.5298 54.0000 8.4698 8.7923 -0.3225 60.0000 8.4232 8.5924 0.0279 76.0000 7.7443 7.7377 0.0066 84.0000 7.6021 7.2552 0.3469 92.0000 6.9494 6.7649 0.1845

100.0000 6.5185 6.2723 0.2463 SSE = 2.3262 k = 38.9966 1.3999 0.0123 1.2462 µ = 0.0667 Lambda = 0.0256 Rg = 2.6360

188



0 8.3212 8.3212 0 3.0000 7.6128 8.5988 -0.9860 6.0000 7.7924 8.8839 -1.0915 9.0000 8.3334 9.1690 -0.8356 12.0000 8.5740 9.4542 -0.8802 15.0000 8.7284 9.7393 -1.0110 18.0000 9.3424 10.0244 -0.6820 21.0000 10.2636 10.3095 -0.0459 24.0000 11.2967 10.5946 0.7021 30.0000 12.0294 11.1644 0.8650 36.0000 12.1931 11.7328 0.4603 42.0000 13.2625 12.2964 0.9661 48.0000 12.0473 12.8421 -0.7949 54.0000 13.9934 13.3275 0.6659 60.0000 13.3551 13.6452 -0.2901 68.0000 13.0550 13.5943 -0.5393 76.0000 12.8573 13.1056 -0.2483 84.0000 12.2355 12.4601 -0.2246 92.0000 12.1206 11.7772 0.3434

100.0000 11.6284 11.0865 0.5419 SSE = 3.0799 k = 12.5152 1.7130 0.0000 1.4942 µ = 0.0950 Lambda = 0.0792 Rg = 5.3738

189



0 6.2455 6.2455 0 3.0000 6.0026 6.4782 -0.4756 6.0000 6.1361 6.7169 -0.5808 9.0000 6.8603 6.9553 -0.0949 12.0000 7.1614 7.1929 -0.0315 15.0000 7.6675 7.4292 0.2383 18.0000 7.6812 7.6633 0.0179 21.0000 8.3802 7.8938 0.4864 24.0000 8.3010 8.1180 0.1831 30.0000 8.6767 8.5285 0.1482 36.0000 8.5623 8.8322 -0.2699 42.0000 8.2945 8.9404 -0.6459 48.0000 8.2175 8.8172 -0.5997 54.0000 9.1861 8.5245 0.6616 60.0000 8.1614 8.1447 0.0166 68.0000 7.9345 7.5859 0.3486 76.0000 7.8573 7.0076 0.8497 84.0000 6.0314 6.4243 -0.3929 92.0000 5.9165 5.8397 0.0767

100.0000 4.6075 5.2549 -0.6474 SSE = 1.9062 k = 12.5994 1.5349 0.0131 1.3514 µ = 0.0797 Lambda = 0.0787 Rg = 2.6949

190



0 5.4393 5.4393 0 3.0000 5.4314 5.7763 -0.3449 6.0000 5.2304 6.1171 -0.8866 9.0000 6.6128 6.4579 0.1549 12.0000 7.3589 6.7987 0.5602 15.0000 7.9287 7.1395 0.7892 18.0000 7.8293 7.4803 0.3490 21.0000 8.1889 7.8211 0.3679 24.0000 8.0607 8.1619 -0.1012 30.0000 9.2577 8.8434 0.4143 36.0000 9.3692 9.5244 -0.1552 42.0000 10.2911 10.2030 0.0881 48.0000 11.0191 10.8703 0.1489 54.0000 11.3775 11.4865 -0.1090 60.0000 11.5211 11.9156 -0.3945 68.0000 11.5145 11.8563 -0.3417 76.0000 11.5484 11.2471 0.3013 84.0000 9.4639 10.4836 -1.0197 92.0000 9.8951 9.6920 0.2032

100.0000 9.8212 8.8960 0.9251 SSE = 2.1612 k = 29.4372 1.5086 0.0000 1.2470 µ = 0.1136 Lambda = 0.0339 Rg = 6.5482

191



3.0000 6.0453 6.2637 -0.2184 6.0000 6.2443 6.5126 -0.2684 9.0000 6.4472 6.7613 -0.3142 12.0000 6.9294 7.0094 -0.0800 15.0000 7.3118 7.2566 0.0551 18.0000 7.9058 7.5021 0.4037 21.0000 8.1492 7.7447 0.4046 24.0000 8.5378 7.9821 0.5557 30.0000 8.7634 8.4246 0.3388 36.0000 8.4878 8.7694 -0.2816 42.0000 8.5441 8.9189 -0.3748 48.0000 8.3766 8.8189 -0.4424 54.0000 8.3617 8.5286 -0.1669 60.0000 8.1538 8.1403 0.0135 68.0000 7.9370 7.5646 0.3725 76.0000 7.3838 6.9682 0.4156 84.0000 6.2135 6.3667 -0.1532 92.0000 5.9542 5.7639 0.1903

100.0000 5.0000 5.1609 -0.1609 SSE = 1.3486 k = 12.5337 1.4413 0.0160 1.2501 µ = 0.0830 Lambda = 0.0791 Rg = 2.8987

192



0 5.4639 5.4639 0 3.0000 5.3395 5.8091 -0.4697 6.0000 5.5211 6.1632 -0.6420 9.0000 6.9186 6.5173 0.4013 12.0000 7.0792 6.8713 0.2079 15.0000 7.0212 7.2253 -0.2042 18.0000 7.5099 7.5794 -0.0695 21.0000 8.2162 7.9334 0.2827 24.0000 8.5664 8.2875 0.2789 30.0000 9.3334 8.9955 0.3380 36.0000 9.6375 9.7029 -0.0654 42.0000 10.7889 10.4075 0.3813 48.0000 11.7202 11.0980 0.6222 54.0000 11.5843 11.7218 -0.1377 60.0000 11.5809 12.1056 -0.5255 68.0000 11.0294 11.9167 -0.8891 76.0000 11.2405 11.2324 0.0061 84.0000 9.9165 10.4311 -0.5170 92.0000 9.9469 9.6104 0.3342

100.0000 9.9031 8.7871 1.1138 SSE = 2.0970 k = 13.2939 1.5191 0.0000 1.2474 µ = 0.1180 Lambda = 0.0747 Rg = 6.6724

193



0 6.1790 6.1790 0 3.0000 6.3464 6.4086 -0.0623 6.0000 6.3560 6.6443 -0.2883 9.0000 6.8482 6.8797 -0.0316 12.0000 6.9542 7.1145 -0.1603 15.0000 7.2833 7.3483 -0.0650 18.0000 7.3263 7.5803 -0.2539 21.0000 8.0645 7.8092 0.2552 24.0000 8.3075 8.0331 0.2744 30.0000 8.3560 8.4500 -0.0940 36.0000 8.7520 8.7779 -0.0259 42.0000 8.8325 8.9328 -0.1002 48.0000 8.7243 8.8617 -0.1374 54.0000 8.6128 8.6070 0.0058 60.0000 8.6902 8.2504 0.4398 68.0000 7.9638 7.7100 0.2538 76.0000 7.0492 7.1448 -0.0955 84.0000 6.0086 6.5727 -0.5641 92.0000 5.8949 5.9991 -0.1042

100.0000 5.6675 5.4249 0.2426 SSE = 1.0081 k = 12.4107 1.4323 0.0139 1.2512 µ= 0.0787 Lambda = 0.0799 Rg = 2.7575

194



0 5.1106 5.1106 0 3.0000 5.0212 5.4858 -0.4647 6.0000 5.2672 5.8624 -0.5952 9.0000 6.9269 6.2390 0.6879 12.0000 7.2253 6.6155 0.6098 15.0000 7.6902 6.9921 0.6981 18.0000 7.6180 7.3687 0.2494 21.0000 8.1461 7.7452 0.4009 24.0000 8.7202 8.1218 0.5983 30.0000 9.4771 8.8749 0.6022 36.0000 9.6902 9.6275 0.0627 42.0000 10.2553 10.3775 -0.1222 48.0000 11.0792 11.1129 -0.0337 54.0000 11.6232 11.7729 -0.1497 60.0000 11.4281 12.1468 -0.7187 68.0000 11.2577 11.8635 -0.6058 76.0000 11.2553 11.1053 0.1500 84.0000 9.9845 10.2523 -0.2678 92.0000 9.1818 9.3856 -0.2037

100.0000 9.7076 8.5171 1.1905 SSE = 2.3076 k = 96.6022 1.5317 0.0000 1.2427 µ = 0.1255 Lambda = 0.0105 Rg = 7.0499

195



0 6.1931 6.1931 0 3.0000 5.7818 6.4127 -0.6310 6.0000 6.2175 6.6381 -0.4206 9.0000 6.8129 6.8630 -0.0501 12.0000 6.8513 7.0871 -0.2359 15.0000 7.5563 7.3100 0.2463 18.0000 7.8451 7.5307 0.3144 21.0000 8.1072 7.7479 0.3593 24.0000 8.1790 7.9593 0.2197 30.0000 8.3711 8.3485 0.0226 36.0000 8.7853 8.6460 0.1393 42.0000 8.4472 8.7763 -0.3292 48.0000 8.3522 8.6983 -0.3461 54.0000 8.4065 8.4529 -0.0463 60.0000 8.2553 8.1127 0.1425 68.0000 7.9638 7.5964 0.3674 76.0000 7.2833 7.0550 0.2283 84.0000 5.8949 6.5062 -0.6113 92.0000 5.7889 5.9555 -0.1666

100.0000 5.8482 5.4043 0.4439 SSE = 1.4234 k = 12.3860 1.4227 0.0184 1.2494 µ = 0.0752 Lambda = 0.0801 Rg = 2.5846

196

ANEXO D

Curvas padrão de açúcares e ácidos e etanol

y = 15166x + 74018R² = 0,999

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

18000000

0 20 40 60 80 100 120

Área

Concentração (g/L)

Figura 86. Curva padrão para a frutose

y = 16236x + 41790R² = 0,999

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

18000000

0 20 40 60 80 100 120

Áre

a


Figura 87. Curva padrão para a glicose

197

y = 66610x + 28896R² = 0,992

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

0 20 40 60 80 100 120

Áre

a


Figura 88. Curva padrão para o etanol

y = 12726x + 76770R² = 0,994

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

0 20 40 60 80 100 120

Áre

a


Figura 89. Curva padrão para o glicerol

198

y = 14941x + 52056R² = 0,984

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

0 2 4 6 8 10 12

Áre

a

Concentração (mg/mL)

Figura 90. Curva padrão para o ácido láctico

y = 79824x + 13185R² = 0,950

0100000200000300000400000500000600000700000800000900000

1000000

0 2 4 6 8 10 12

Áre

a

Concentração (mg/mL)

Figura 91. Curva padrão para o ácido ácetico

199

ANEXO E

Dados do índice de viabilidade da levedura

Tabela 19. Índice de viabilidade para a levedura em cultura mista e pura a 28oC Tempo L=101UFC/mL L=105UFC/mL L=108UFC/mL Levedura pura

0 99,67% 90,00% 98,25% 100,00% 3 99,80% 85,71% 75,86% 100,00% 6 99,85% 86,96% 96,92% 100,00% 9 99,65% 56,67% 88,89% 100,00%

12 96,30% 86,94% 64,44% 88,06% 15 99,63% 89,61% 59,00% 87,67% 18 96,53% 53,93% 55,56% 92,82% 21 57,89% 51,96% 16,03% 96,06% 24 93,14% 37,26% 26,64% 87,70% 30 89,90% 52,73% 24,79% 88,73% 36 97,55% 36,26% 18,83% 44,00% 42 97,49% 78,97% 37,06% 77,12% 48 95,90% 72,08% 28,24% 77,40% 54 50,51% 38,24% 20,74% 65,99% 60 41,51% 59,50% 25,91% 43,37% 68 42,86% 59,09% 24,28% 53,06% 76 48,28% 33,33% 13,27% 37,04% 84 41,50% 12,20% 3,39% 22,58% 92 47,16% 5,71% 2,08% 21,99% 100 31,47% 2,83% 0,14% 0,72%

200

Tabela 20. Índice de viabilidade para a levedura em cultura mista e pura a 25oC Tempo L=107 UFC/mL L=103UFC/mL Levedura pura

0 98,25% 96,88% 100,00%

3 75,86% 95,92% 100,00%

6 96,92% 95,83% 100,00%

9 88,89% 73,86% 100,00%

12 64,44% 95,83% 99,92%

15 59,00% 62,96% 99,50%

18 55,56% 93,42% 99,26%

21 19,29% 94,08% 99,07%

24 26,64% 39,49% 99,08%

30 24,79% 82,11% 98,46%

36 18,83% 65,52% 98,37%

42 37,06% 14,74% 98,44%

48 28,24% 20,00% 97,75%

54 20,74% 57,10% 98,18%

60 25,91% 42,97% 97,84%

68 24,28% 46,67% 89,86%

76 13,27% 44,86% 82,56%

84 3,39% 43,33% 81,06%

92 2,08% 42,64% 69,87%

100 0,14% 54,85% 74,16%

201

Tabela 21. Índice de viabilidade para a levedura em cultura mista e pura a 31oC Tempo L=107 UFC/mL L=103UFC/mL Levedura pura

0 100,00% 97,62% 100.00% 3 81,82% 98,15% 100.00% 6 82,54% 98,20% 100.00% 9 79,12% 96,15% 100.00%

12 81,79% 97,83% 98.23% 15 67,55% 98,86% 97.27% 18 35,71% 43,40% 89.02% 21 50,93% 78,42% 90.35% 24 69,33% 81,74% 97.79% 30 49,28% 81,98% 82.11% 36 40,14% 74,14% 95.02% 42 56,66% 54,84% 98.01% 48 55,61% 44,06% 99.39% 54 36,14% 41,70% 93.65% 60 38,40% 52,38% 92.13% 68 8,06% 9,97% 50.00% 76 0,00% 12,37% 16.42% 84 0,00% 21,52% 19.40% 92 0,00% 12,78% 11.27% 100 0,00% 0,96% 0.00%

202

Tabela 22. Índice de viabilidade para a levedura em cultura pura em diferentes temperaturas

Tempo (horas) 24ºC 25ºC 28ºC 31ºC 32ºC 0 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 3 100,00% 100,00% 100,00% 81,82% 100,00% 6 100,00% 100,00% 100,00% 82,54% 100,00% 9 100,00% 100,00% 100,00% 79,12% 84,62%

12 89,69% 99,92% 88,06% 81,79% 95,35% 15 97,30% 99,50% 87,67% 67,55% 91,11% 18 97,56% 99,26% 92,82% 35,71% 97,67% 21 98,53% 99,07% 96,06% 50,93% 89,61% 24 98,97% 99,08% 87,70% 69,33% 98,18% 30 98,18% 98,46% 88,73% 49,28% 96,97% 36 97,78% 98,37% 44,00% 40,14% 97,96% 42 98,29% 98,44% 77,12% 56,66% 95,48% 48 97,59% 97,75% 77,40% 55,61% 96,88% 54 96,77% 98,18% 65,99% 36,14% 73,02% 60 98,24% 97,84% 43,37% 38,40% 69,17% 68 95,24% 89,86% 53,06% 8,06% 57,71% 76 94,44% 82,56% 37,04% 0,00% 66,14% 84 81,33% 81,06% 22,58% 0,00% 30,74% 92 61,04% 69,87% 31,50% 0,00% 21,94% 100 80,37% 74,16% 18,50% 0,00% 0,88%

Modelagem preditiva do crescimento/morte de Saccharomyces...

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