Caracterização bioenergética de Saccharomyces cerevisiae em ...

Lisboa, 2009

Orientador: Doutora Catarina Paula Guerra Geoffroy Prista

Co-orientador: Doutora Maria da Conceição da Silva Loureiro Dias

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Alimentar

Tiago Monteiro Lomba Viana

CARACTERIZAÇÃO BIOENERGÉTICA DE SACCHAROMYCES

CEREVISIAE EM FERMENTAÇÃO VINÁRIA

Júri:

Doutor Virgílio Borges Loureiro, Professor Associado do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Técnica de Lisboa.

Doutor José Martínez Peinado, Professor Catedrático da Facultad de Ciencias Biologicas da Universidad Complutense de Madrid, Espanha.

Doutora Maria da Conceição da Silva Loureiro Dias, Professora Catedrática Convidada do Instituto Superior de Agronomia da Univesidade Técnica de Lisboa.

Doutora Catarina Paula Guerra Geoffroy Prista, Investigadora Auxilar do Instituto Superior de Agronomia da Universiadade Técnica de Lisboa.

Presidente:

Vogais:

i

AGRADECIMENTOS

Terminada esta etapa da minha formação académica, gostaria de expressar o meu

reconhecimento e referir as pessoas e instituição que contribuíram para este trabalho, sem

as quais muito dificilmente teria sido levado a cabo.

As minhas primeiras palavras de agradecimento são dirigidas à Professora Doutora Maria

da Conceição Loureiro Dias, a quem devo grande parte do meu interesse no mundo da

Microbiologia, guiando os meus primeiros passos neste ramo da Ciência, mostrando-me o

seu encanto e incentivando o meu entusiasmo. Foi um enorme privilégio ter iniciado a minha

vida de investigação científica na sua equipa e poder contar com a sua sapiência. O seu

contributo não foi apenas importante no progresso deste trabalho, mas foi igualmente

essencial na minha formação científica/pessoal durante este tempo.

Gostaria de expressar à Doutora Catarina Prista o meu sincero agradecimento por tudo a

que este ano inesquecível diz respeito. Começo por lhe agradecer a sua amizade e o facto

de me ter recebido tão bem no laboratório, proporcionando-me todas as condições que se

podem desejar quando se desenvolve um trabalho desta natureza. A orientação de

excelência com que conduziu este trabalho, o acompanhamento incondicional das diferentes

etapas e a sua disponibilidade inolvidável em ajudar, discutir e iluminar todas as minhas

dúvidas e dificuldades foram inexcedíveis… Muito obrigado!

Um agradecimento especial também aos colegas de laboratório (Vanessa Salvador, Luís

Leitão, Ana Madeira e Maria José) e à equipa da Cooking Lab (Susana Dias e Joana

Moura), com quem aprendi muito e de tudo um pouco. Todos foram responsáveis por terem

tornado este local de trabalho único, repleto de companheirismo, boa-disposição e óptimo

espírito. No entanto, gostava de agradecer em especial à Vanessa e ao Luís, pela ajuda

concedida e pelos conhecimentos partilhados que permitiram, em determinados momentos

deste trabalho, formar teorias verdadeiramente hilariantes e revolucionárias. Não podia

deixar de agradecer às equipas dos laboratórios de Microbiologia e de Fisiologia, pela

cooperação e amizade concedidas. Em particular, ao André Barata por ter esclarecido as

minhas dúvidas relativas à ecologia de leveduras.

Ao Instituto Superior de Agronomia agradeço as facilidades concedidas para a realização

deste trabalho, bem como a oportunidade de, ao longo do curso, me ter cruzado com

diversos professores e colegas que, de uma forma directa ou indirecta, me marcaram e

contribuíram na minha formação académica/pessoal.

Finalmente os últimos e mais especiais agradecimentos à minha família e à Joana, por

tudo o que fizeram por mim, pertencendo-lhes também este meu caminho e trabalho. Ao

longo de todo este tempo, tem sido vital o apoio incondicional e a compreensão inexcedível

ii

dos meus pais e avó. São eles os verdadeiros responsáveis pelo trabalho diário nos

bastidores. Aos meus irmãos e famílias respectivas agradeço todo o apoio que me têm dado

ao longo do tempo. À Joaninha, minha fonte de inspiração, queria agradecer-lhe

profundamente o estar comigo nos momentos mais importantes da minha vida, desafiando-

me e apoiando-me constantemente. Obrigado por seres quem és e como és!

Muito obrigado a todos,

_____________________________________________

iii

RESUMO

Caracterização Bioenergética de Saccharomyces cerevisiae em Fermentação Vinária.

A fermentação vinária constitui um processo complexo ao longo do qual as leveduras são

sujeitas a vários tipos de stresse (pressão osmótica, etanol, pH baixo, esgotamento de

nutrientes, temperatura). O trabalho realizado avaliou o comportamento da estirpe industrial

de Saccharomyces cerevisiae ISA1000 durante fermentações em mosto de uva branca, a

15ºC e a 30ºC, simulando condições reais em adega. Determinou-se o pH intracelular (pHin),

e o efluxo e influxo de protões, em células cultivadas às duas temperaturas, como

indicadores de actividade catabólica e de permeabilidade a H+ da membrana plasmática. As

células foram recolhidas em diferentes fases da fermentação. Avaliou-se também o efeito do

etanol no efluxo e influxo de H+, às duas temperaturas.

Os resultados mais relevantes foram observados a 15ºC, em fase estacionária. Nestas

condições, S. cerevisiae ISA1000 evidenciou pHin baixo (pHin≈5), incapacidade de expulsar

H+ e muito baixa permeabilidade da membrana plasmática aos mesmos. A 30ºC, na mesma

fase, a mesma estirpe revelou-se pouco permeável a H+ e com baixa capacidade de os

expulsar, mantendo, no entanto, um valor de pHin mais elevado (pHin≈6). Para ambas as

temperaturas, observou-se um menor efeito do etanol na permeabilidade de membrana para

células em fase estacionária.

Palavras-chave: Fermentação vinária, etanol, temperatura, membrana plasmática,

permeabilidade, pH intracelular.

*Orientador: Catarina Prista, PhD – Instituto Superior de Agronomia; Universidade Técnica de Lisboa

iv

ABSTRACT

Bioenergetic Characterization of Saccharomyces cerevisiae on Wine Fermentation.

Wine fermentation is a complex process, during which yeast cells are submitted to a

number of adverse stress conditions (osmotic pressure, low pH, ethanol, nutrient limitation

and starvation, temperature). In this work, the performance of the industrial strain

Saccharomyces cerevisiae ISA1000 was evaluated during white grape must fermentations,

at 15ºC and 30ºC, in experiments simulating real winery conditions. Intracellular pH (pHi),

proton influx and proton extrusion through the plasma membrane were measured, at both

temperatures, as indicators of cell catabolic activity and plasma membrane permeability.

Cells were harvested at different stages throughout fermentation. The effect of ethanol on

proton extrusion and proton influx was evaluated at the same temperatures.

The most relevant results were obtained at 15ºC, in stationary phase. Under these

conditions, S. cerevisiae ISA1000 exhibited low pHi (pHi≈5), inability to extrude H+ and very

low H+ permeability. At 30ºC, at the same fermentation stage, the cells presented low H+

permeability and low H+ extrusion capacity, although they had a higher pHi (pHi≈6) than at

15ºC. For both temperatures, the effect of ethanol on H+ permeability was less evident in

stationary phase cells.

Key-words: Wine fermentation, ethanol, temperature, plasma membrane, permeability,

intracellular pH.

*Supervisor: Catarina Prista, PhD – Instituto Superior de Agronomia; Technical University of Lisbon

v

ABSTRACT

Bioenergetic Characterization of Saccharomyces cerevisiae on Wine Fermentation.

Wine fermentation is a complex ecological and biochemical process. Though grape must

is relatively complete in nutrients content, it can support the growth of only a limited number

of microbial species due to its adverse conditions such as low pH, high sugar content,

pesticide residues and presence of SO2. The selectivity of fermenting must is further

strengthened by oxygen limitation, depletion of certain nutrients and increasing ethanol

concentrations.

This work was part of a project with the broad objective of improving the production/quality

of wine, as far as it depends on yeast fermentation. Specifically, the present work aimed to

characterize yeast proton homeostasis during must fermentation under experimental

conditions simulating real winery conditions for white wine and red wine production.

To accomplish this goal, an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae (ISA1000),

isolated from a commercial starter (FERMIVIN) was used. This strain was grown in white

grape must, under experimental conditions simulating a real winery, at 15 and 30ºC,

temperatures commonly used for white wine and red wine production, respectively.

Six different growth situations were selected for 15ºC: the beginning, the middle and the

final of exponential growth phase, the beginning and the middle stationary growth phase and

the end of fermentation (when no sugar was detected by standard methods). For 30ºC, the

same situations were chosen, except the first sample point. Results were compared with the

same strain grown at the same temperatures in mineral medium, 2% glucose (usual lab

conditions). To evaluate the efficiency of proton homeostasis, intracellular pH, proton

extrusion and proton influx through the plasma membrane were measured at both

temperatures. The effect of ethanol on proton extrusion and proton influx was also evaluated

at the same temperatures for the same cells.

Intracellular pH was assessed through the relative distribution of the non-metabolizable

substrate [7-14C] benzoic acid. Up to the end of the exponential phase, pHi was very similar

for both temperatures (between 6.1 and 6.4). Nevertheless, during the stationary phase,

mainly at 15ºC, a pronounced drop occurred in pHi, reaching pH 5.0 at the end of

fermentation. At 30ºC only a minor drop occurred (pHi 5.8 at the end of fermentation).

Proton influx and proton extrusion were measured in unbuffered cell suspensions, with a

standard pH meter connected to a recorder. H+ extrusion was calculated as the rate of

increase of the concentration of extracellular protons. The acidification curve is the result of

the H+ movements in both directions across the plasma membrane. Considering that H+

vi

extrusion is mainly due to the ATPase activity, results showed that, in general, H+ efflux rate

was higher at 30ºC than at 15ºC (for all the fermentation stages). At both temperatures, a

stronger inhibition of H+ efflux by ethanol was also noticed in exponential phase cells than in

stationary phase cells.

The rate of proton influx was calculated as the rate of the decrease of the concentration of

extracellular protons. All experiments were performed in the presence of 2-deoxy-D-glucose

and antimycin to minimize H+ movements created by the plasma membrane ATPase activity.

Comparing the slope of the curves at each temperature, differences were observed. At 15ºC,

in early fermentation stages (up to the end of the exponential phase), the H+ permeability was

high (≈0.4 mmol.g-1.h-1) and quite sensitive to the presence of ethanol (16-18% ethanol).

Nevertheless, during the stationary phase, cells presented very low H+ permeability, not

affected by ethanol present in the assay (up to 20%). At 30ºC, in general, the H+ permeability

was higher than at 15ºC, mainly at early stages, and once again ethanol increased the rate of

H+ influx.

Summarizing the most relevant results:

• The end of exponential phase represents a threshold, and the cells became much

less permeable to protons;

• This effect was more pronounced at 15ºC;

• This impermeability occurred even when ethanol was present in the assay (0-20%

ethanol);

• At 15ºC during the stationary phase the intracellular content was more acidic,

reaching pH 5.0 by the end of fermentation;

• Fermentation proceeded under these conditions up to sugar exhaustion.

These results open new gates for research on yeast performance during late stages of

wine fermentations.

Key-words: Wine fermentation, ethanol, temperature, plasma membrane, permeability,

intracellular pH.

*Supervisor: Catarina Prista, PhD – Instituto Superior de Agronomia; Technical University of Lisbon

vii

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS ............................................................................................................................ i

RESUMO ............................................................................................................................................... iii

ABSTRACT ............................................................................................................................................ iv

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................. x

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................ xi

LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................................. xiii

1. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................................... 1

1.1. Apresentação e enquadramento do tema ........................................................................ 1

1.2. Saccharomyces cerevisiae ................................................................................................. 2

1.2.1. Classificação taxonómica ............................................................................................ 2

1.2.2. Estrutura da célula ........................................................................................................ 4

1.2.2.1. Membrana plasmática .............................................................................................. 4

1.2.2.1.1. Composição da membrana plasmática ............................................................. 5

1.2.2.1.2. Fluidez de membrana .......................................................................................... 5

1.2.2.1.3. H+-ATPase membranar ........................................................................................ 6

1.3. Fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae ................................................. 9

1.3.1. Bioquímica do processo .............................................................................................. 9

1.3.2. Produtos secundários ................................................................................................ 10

1.4. Fermentação vinária........................................................................................................... 11

1.4.1. Factores físico-químicos que afectam as cinéticas de fermentação vinária ..... 12

1.4.1.1. Etanol ........................................................................................................................ 12

1.4.1.2. Temperatura ............................................................................................................ 17

1.4.1.3. Disponibilidade de oxigénio .................................................................................. 21

1.4.2. Respostas ao stresse ................................................................................................. 22

1.4.3. Biodiversidade de leveduras ..................................................................................... 24

1.5. Objectivos da dissertação ................................................................................................. 27

2. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 28

2.1. Microrganismo ..................................................................................................................... 28

2.2. Meios de cultura .................................................................................................................. 28

2.3. Condições de crescimento e recolha de amostras ....................................................... 29

2.3.1. Manutenção das culturas .......................................................................................... 29

2.3.2. Quantificação de biomassa ....................................................................................... 29

viii

2.3.2.1. Acompanhamento das culturas ............................................................................ 29

2.3.2.2. Peso seco ................................................................................................................ 29

2.3.3. Preparação do pré-inóculo ........................................................................................ 30

2.3.4. Ensaios em meio mineral .......................................................................................... 30

2.3.5. Ensaios em mosto estéril .......................................................................................... 30

2.3.6. Pontos de amostragem .............................................................................................. 30

2.4. Ensaios preliminares de crescimento .............................................................................. 31

2.4.1. Ensaios preliminares em meio mineral ................................................................... 31

2.4.2. Ensaios preliminares em mosto ............................................................................... 31

2.4.2.1. Determinação dos parâmetros físico-químicos .................................................. 31

2.4.2.2. Determinação dos parâmetros de crescimento ................................................. 32

2.5. Determinação do teor em glucose presente no mosto ................................................. 32

2.5.1. Base do método .......................................................................................................... 32

2.5.2. Procedimento experimental ...................................................................................... 32

2.6. Determinação do teor em etanol presente no mosto .................................................... 33

2.6.1. Base do método .......................................................................................................... 33


2.7. Determinação do pH intracelular ...................................................................................... 35

2.7.1. Base do método .......................................................................................................... 35

2.7.2. Características das soluções utilizadas .................................................................. 36


2.7.3.1. Ensaios em meio mineral ...................................................................................... 37

2.7.3.2. Ensaios em mosto .................................................................................................. 38

2.8. Avaliação do efeito do etanol sobre a permeabilidade da membrana a H+ .............. 40

2.8.1. Base do método .......................................................................................................... 40


2.8.2.1. Preparação das suspensões de células ............................................................. 41

2.8.2.2. Ensaios com células ressuspendidas em água desmineralizada ................... 41

2.8.2.3. Ensaios com células ressuspendidas a diferentes pH extracelulares............ 42

2.9. Avaliação do efeito do etanol sobre o efluxo de H+ através da membrana plasmática 42

2.9.1. Base do método .......................................................................................................... 42


2.9.2.1. Preparação de suspensões de células ............................................................... 42

ix

2.9.2.2. Ensaio experimental a diferentes temperaturas ................................................ 42

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................... 44

3.1. Ensaios preliminares .......................................................................................................... 44

3.1.1. Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 15ºC ................... 45

3.1.1.1. Avaliação dos parâmetros de crescimento da estirpe ...................................... 45

3.1.1.2. Avaliação dos parâmetros físico-químicos do mosto ........................................ 47

3.1.2. Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 30ºC ................... 51

3.1.2.1. Avaliação de parâmetros de crescimento ........................................................... 51

3.1.2.2. Avaliação dos parâmetros físico-químicos ......................................................... 52

3.2. Avaliação de parâmetros fisiológicos .............................................................................. 55

3.2.1. pH intracelular ............................................................................................................. 56

3.2.1.1. Em meio K ............................................................................................................... 56

3.2.1.2. Em mosto estéril ..................................................................................................... 60

3.2.2. Efluxo de H+ através da membrana plasmática ..................................................... 62

3.2.2.1. Em meio K ............................................................................................................... 63

3.2.2.2. Em mosto estéril ..................................................................................................... 64

3.2.3. Permeabilidade da membrana ao influxo de protões ........................................... 68

3.2.3.1. Em meio K ............................................................................................................... 68

3.2.3.2. Em mosto estéril ..................................................................................................... 69

3.2.3.2.1. Células suspensas e incubadas em água desmineralizada ........................ 69

3.2.3.2.2. Células suspensas e incubadas em tampões ................................................ 71

3.3. Discussão Geral .................................................................................................................. 72

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS .............................................. 79

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 81

ANEXO I .............................................................................................................................................. 99

ANEXO II ........................................................................................................................................... 100

ANEXO IV .......................................................................................................................................... 103

ANEXO V ........................................................................................................................................... 104

ANEXO VI .......................................................................................................................................... 106

ANEXO VII ......................................................................................................................................... 108

ANEXO VIII ........................................................................................................................................ 110

x

LISTA DE TABELAS

Nº Legenda Pág. 1 Classificação taxonómica de Saccharomyces cerevisiae. 2

2 Metabolitos presentes durante a fermentação alcoólica. 10

3 Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC. 33

4 Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC. 34

5 Dados utilizados nos ensaios de pHin. 39

6 Pontos de amostragem definidos para o crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentações conduzidas a 15ºC.

46

7 Teor de glucose e de etanol em fermentações conduzidas a 15ºC, para os 6 pontos de amostragem escolhidos.

50

8 Teor de glucose e de etanol em fermentações conduzidas a 30ºC, para os 6 pontos de amostragem escolhidos.

54

9 Valores de pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000 obtidos nos ensaios, para as diferentes fases de crescimento em mosto estéril, a 15ºC e a 30ºC.

61

10 Características técnicas da preparação comercial de levedura seca activa para vinificação FERMIVIN®.

99

11 Títulos alcoométricos de vinhos, expressos em % (v/v) 100

12 Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 15ºC. 103

13 Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 30ºC. 103

14 Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária a 15ºC.

104

15 Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária a 30ºC.

105

16 pHin de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada a 15ºC em meio mineral e em mosto estéril. 106

17 pHin de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada a 30ºC em meio mineral e em mosto estéril. 107

18 pHin de S. cerevisiae W-303, cultivada a 15ºC e a 30ºC em meio mineral. 107

19 Velocidades de efluxo de H+ (mmol.g-1.h-1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 15ºC.

108

20 Velocidades de efluxo de H+ (mmol.g-1.h-1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 30ºC.

109

21 Velocidades de influxo de H+ (mmol.g-1.h-1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 15ºC.

110

22 Velocidades de influxo de H+ (mmol.g-1.h-1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 30ºC.

111

xi

LISTA DE FIGURAS

Nº Legenda Pág. 1 (a) Saccharomyces sp. observada através de microscopia de contraste de fase,

ampliação de 1000x (b) Constituição de uma célula de levedura. 4

2 Representação do modelo de estrutura da cadeia polipeptídica da H+-ATPase membranar.

6

3 Via glicolítica, fermentação alcoólica e desvio para a produção de glicerol.

10

4 Representação das etapas de consumo de O2 na biossíntese de ergosterol.

21

5 Representação da transmissão de sinais ambientais através duma rede interligada de vias de transdução de sinais numa célula de levedura.

24

6 Sistema de filtração em vácuo utilizado na determinação da concentração de composto radioactivo presente no meio intracelular.

38

7 Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. cerevisiae ISA 1000 (100 mg/mL) após uma acidificação rápida de pH 5 para pH 4.

40

8 Representação do equipamento utilizado na medição da velocidade do movimento de H+ através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000.

40

9 Curva típica obtida nos ensaios de permeabilidade a H+ da membrana plasmática.

41

10 Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. cerevisiae ISA 1000 (100 mg/mL) após um pulso de glucose.

42

11 Curva típica obtida nos ensaios de efluxo protónico.

43

12 Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a 15ºC.

45

13 Evolução do (a) pH extracelular, da (b) massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do mosto, ao longo de fermentação de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 15ºC.

47

14 Consumo de glucose e produção de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de fermentações de mosto a 15ºC.

50

15 Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a 30ºC

51

16 Evolução do (a) pH extracelular, da (b) massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do mosto, ao longo de fermentação de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 30ºC.

53

17 Consumo de glucose e produção de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de fermentações de mosto a 30ºC.

55

18 Valores medidos para pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000, a 15ºC, cultivada em meio K, utilizando [1-14C] ácido propiónico.

57

19 pH intracelular de S. cerevisiae W-303, cultivada em meio K a 15ºC, utilizando [1 - 14C] ácido propiónico ou [7-14C] ácido benzóico.

58

20 pH intracelular de S. cerevisiae W-303, cultivada em meio K a 30ºC, utilizando [1-14C] ácido propiónico ou [7-14C] ácido benzóico.

58

21 pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K, a 15ºC e a 30ºC, utilizando [7-14C] ácido benzóico.

59

22 pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto estéril, a 15ºC, utilizando [7-14C] ácido benzóico.

60

23 pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto estéril, a 30ºC, utilizando [7-14C] ácido benzóico.

61

24 Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em meio K, a 15ºC e a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.

63

xii

25 Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.

64

26 Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.

66

27 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em meio K a 15ºC e a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.

68

28 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.

69

29 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.

70

30 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em fermentações de mosto a 15ºC, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água, Tris 10mM citrato pH 5 e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da estacionária e (b) final de fermentação.

71

31 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em fermentações de mosto a 30ºC, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água, Tris 10mM citrato pH 5 e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da estacionária e (b) final de fermentação.

72

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

ABREVIATURAS DESIGNAÇÕES COMPLETAS

∆ψ gradiente electroquímico

∆pH gradiente protónico

ºC graus Celsius

ADP adenosina-5’-difosfato

AMP adenosina-5’-monofosfato

ATP adenosina-5’-trifosfato

Cf concentração final

CPM contagens por minuto

D.O.640nm densidade óptica medida a λ=640nm

EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético

Final exp. final da fase exponencial /

início da fase de desaceleração

Final ferm. fase final de fermentação

GBq gigabecquerel

Iníc. est. início da fase estacionária

Iníc. exp. início da fase exponencial

MBq megabecquerel

mCi microcurie

Meio est. meio da fase estacionária

Meio exp. meio da fase exponencial

rL/L reagente rLuciferase/Luciferina

pHin pH intracelular

Pi fosfato inorgânico

p.s. peso seco

p/v peso por volume

RLU unidades relativas de luminometria

r.p.m. rotações por minuto

TCA ácido tricloro-acético

Tmaxf temperatura máxima final de crescimento

Tmaxi temperatura máxima inicial de crescimento

Top temperatura óptima de crescimento

Tris 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol

UFC unidades formadoras de colónias

UV ultravioleta

v.q.p.r.d. vinhos de qualidade produzidos em

regiões determinadas

YPD yeast extract peptone dextrose

INTRODUÇÃO GERAL

1

1. INTRODUÇÃO GERAL

1.1. Apresentação e enquadramento do tema

Durante a fermentação vinária as leveduras são expostas simultanea e sequencialmente

a uma gama muito variada de situações de stresse [Querol et al., 2003; Zuzuarregui & Olmo,

2004], que podem induzir múltiplas alterações no estado fisiológico das células, afectando o

crescimento, a capacidade fermentativa, a capacidade metabólica e a viabilidade celular

[Pérez-Torrado et al., 2005]. O mosto de uva representa a primeira situação de stresse,

devido ao seu elevado teor de açúcar (stresse osmótico), baixo pH, frequente carência de

nutrientes (e.g. azoto assimilável, vitaminas) e presença de agentes antimicrobianos (e.g.

resíduos de pesticidas, cobre e enxofre) [Carrasco et al., 2001; Querol et al., 2003;

Zuzuarregui & del Olmo, 2004]. Além disso, é-lhe frequentemente adicionado dióxido de

enxofre (SO2), como antioxidante e antisséptico, contribuindo para a criação de um ambiente

ainda mais adverso para as leveduras. Durante a fermentação vinária, as células estão

sujeitas à diminuição do teor de açúcar, ao abaixamento do pH extracelular e ao aumento do

teor de álcool e de CO2 e ao aumento da temperatura, que intensificam os efeitos das outras

formas de stresse referidas. Por estas razões, o estado fisiológico das leveduras altera-se

profundamente durante o processo. Inicialmente ocorre crescimento, em regra durante 7-8

duplicações. Com o decorrer da fermentação, a taxa de crescimento baixa, a cultura entra

em fase estacionária, decorrendo a maior parte do processo fermentativo com células nesta

fase (resting cells).

Embora tenham sido bem estudadas a fisiologia e a genética de estirpes laboratoriais de

Saccharomyces cerevisiae, a maior parte deste conhecimento tem sido obtido em condições

laboratoriais e com leveduras em fase exponencial de crescimento, nem sempre sendo

possível extrapolar tal informação para explicar o desempenho da levedura na vinificação.

Estudos prévios realizados no laboratório de Bioenergética Microbiana permitiram avaliar o

desempenho de uma estirpe industrial de S. cerevisiae durante fermentações a 25ºC, em

mosto real, confirmando a ideia de que o estado fisiológico das células em fase estacionária

é muito diferente do das células em fase exponencial. Particularmente interessantes foram

os resultados obtidos para o pH intracelular (pHin) e para os fluxos de protões para e do

interior das células que apontaram para um papel relevante de homeostase protónica na

tolerância ao etanol das células nas últimas fases de fermentação. Os ensaios foram

realizados paralelamente em meio mineral, de forma a permitir a comparação mais fiável

entre os dados obtidos e os dados da literatura [C. Prista, comunicação pessoal].

O presente trabalho surge enquadrado no projecto atrás mencionado procurando-se,

neste caso, dar um novo passo no sentido de aproximar as condições experimentais em

INTRODUÇÃO GERAL

2

laboratório e as condições reais em adega. Para tal, realizaram-se fermentações a

temperaturas normalmente utilizadas para a obtenção de vinho branco (15ºC) e de vinho

tinto (30ºC). Propusemo-nos estudar o comportamento fermentativo da mesma estirpe de S.

cerevisiae às temperaturas referidas, analisando diversos parâmetros fisiológicos (pHin,

efluxo de protões através da membrana plasmática e permeabilidade da mesma aos

protões) que poderão influenciar a capacidade da estirpe para manter a sua viabilidade e a

regulação da sua homeostase protónica.

1.2. Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae é uma espécie de levedura utilizada há milhares de anos na

panificação e na fermentação de bebidas alcoólicas, sendo a levedura fermentativa por

excelência, tendo sido utilizada igualmente nos últimos anos para produção de bioetanol. É

também muito importante como organismo modelo [Ostergaard et al., 2000], quer em

estudos fisiológicos (efeitos de diversos tipos de stresse - osmótico, oxidativo, etanol e

ácidos fracos), quer na área de Biologia Celular e Molecular, sendo o microrganismo

eucariótico mais estudado e aquele cujo genoma foi o primeiro a ser sequenciado [Williams,

1996].

1.2.1. Classificação taxonómica

A classificação taxonómica da espécie Saccharomyces cerevisiae foi proposta em 1883

por Meyen ex E.C. Hansen, e encontra-se descrita na Tabela 1.

Tabela 1: Classificação Taxonómica de Saccharomyces cerevisiae

Super Reino Eukaryota

Reino Fungi

Filo Ascomycota

Classe Saccharomycetes

Ordem Saccharomycetales

Família Saccharomycetaceae

Género Saccharomyces

Espécie Saccharomyces cerevisiae

Esta classificação baseia-se num conjunto de características definidas por vários autores

[Kreger-van Rig, 1984; Barnett et al., 1990; Ratledge & Hull, 1991], tais como: morfologia,

capacidade de fermentar diferentes substratos, capacidade de utilizar diferentes substratos,

temperatura de crescimento, entre outros.

INTRODUÇÃO GERAL

3

� Morfologia

As colónias apresentam uma coloração que varia entre o branco (predominantemente) e

o creme (ocasionalmente), são convexas e lisas. Este microrganismo pode formar pseudo-

hifas, que consistem em cadeias simples de células esféricas, elipsoidais ou cilíndricas.

Reproduzem-se na maioria das vezes por gemulação multilateral, onde a nova gémula é

formada na porção lateral da célula-mãe. A conjugação de células individuais conduz à

formação do asco, cuja composição pode variar entre um a doze ascósporos lisos, de forma

oval ou redonda, em cada célula.

� Fermentação

� Assimilação / Crescimento

As respostas aos testes estão indicadas pelos símbolos +, -, D, os quais significam

respectivamente respostas positivas, negativas e demorada.

� Características adicionais

Esta levedura não produz amido, não hidrolisa a ureia e a reacção com o composto azul

de diazónio B é negativa.

D-Glucose +

D-Galactose +, -

Maltose +, -

Me α-D-glucósido +, -

Sacarose +, -

α,α- Trealose +, -

Melibiose +

Lactose -

Celobiose -

Melezitose +, -

Rafinose +, -

Inulina -

Amido +, -

D-Galactose +, -

L-Sorbose -

D-Glucosamina -

D-Ribose –

D-Xilose –

L-Arabinose –

L-Ramnose –

Sacarose +, -

Maltose +, -

α,α-Trealose +, -

Me α-D-Glucosido +, -

Celobiose –

Salicina –

Arbutina –

Melibiose +, -

Lactose –

Rafinose +, -

Melezitose +, -

Inulina -

Amido +, -

Glicerol +, -

Eritritol –

Ribitol –

Xilitol –

L-Arabinitol –

D-Glucitol -, D

D-Manitol -, D

Galactitol –

myo-Inositol –

D-Glucano-1,5-lactona -, D

2-Ceto-D-Gluconato –

5-Ceto-D-Gluconato –

D-Gluconato -

D-Glucuronato –

DL-Lactato +, -

Succinato -, D

Citrato –

Metanol –

Etanol +, -

Nitrato –

Nitrito –

Etilamina –

L-Lisina –

Cadaverina –

Creatina –

Creatinina –

sem Vitaminas +, -

sem myo-Inositol +, -

sem Pantotenato +, -

sem Biotina +, -

sem Tiamina +, -

sem Biotina e Tiamina +, -

sem Piridoxina +, -

sem Niacina +

sem Ácido fólico +

sem PABA +, -

a 25ºC +

a 30ºC +

a 35ºC +, -

a 37ºC +, -

a 42ºC +, -

0,01% Cicloheximida –

0,1% Cicloheximida –

50% D-Glucose +, -

60% D-Glucose -

1.2.2. Estrutura da célula

Relativamente à estrutura da célula, esta possui um citoplasma com vários organelos e

um núcleo revestido por uma

como as células vegetais, as células de levedura têm dois envelopes celulares: a p

celular e a membrana. Na F

levedura.

1.2.2.1. Membrana plasmática

A composição e manutenção da integridade da membrana plasmática são essenciais

para o funcionamento das células e sua adaptação às constantes alterações do ambiente

extracelular [Konings, 2006]. Esta estrutura celular desempenha múltipl

Por um lado, funciona como barreira de separação entre o citoplasma e o ambiente exterior,

permitindo à célula manter uma composição relativamente constante e reter os constituintes

que lhe são próprios, o que é essencial para a manut

necessário à realização de uma variedade de processos de transporte activo secundário

[Konings & Velkamp, 1983; Konings

proteínas com múltiplas funções entre as quais transport

da célula, biossíntese de parede celular, constituição do citosqueleto e transdução de sinal

[Konings, 2006]. A membrana plasmática tem ainda que permitir a passagem de nutrientes

presentes no exterior e de produtos res

é, a membrana é permeável duma forma selectiva [Konings, 2006]. Esta característica deve

Figura 1: (a) Saccharomyces spobservada através de microscopia de contraste de fase, ampliação de 1000x (em Fugelsang & Edwards, 2007) (b) Constituição de uma célula de levedura (Gaillardin & Helslot, 1987)

Estrutura da célula


um núcleo revestido por uma membrana que assegura a protecção dos cromossomas. Tal

como as células vegetais, as células de levedura têm dois envelopes celulares: a p

celular e a membrana. Na Figura 1 está exemplificado a constituição de uma célula de

Membrana plasmática



extracelular [Konings, 2006]. Esta estrutura celular desempenha múltiplas funções na célula.



que lhe são próprios, o que é essencial para a manutenção do potencial de membrana


[Konings & Velkamp, 1983; Konings et al., 1995]. Por outro lado, a membrana possuí

proteínas com múltiplas funções entre as quais transporte de substratos de e para o interior



presentes no exterior e de produtos residuais do metabolismo que têm de ser libertados, isto

é, a membrana é permeável duma forma selectiva [Konings, 2006]. Esta característica deve

Saccharomyces sp. observada através de microscopia de contraste de fase, ampliação de 1000x (em Fugelsang & Edwards,

Constituição de uma llardin &

Vacúolo

Membrana plasmática

Complexo de Golgi

Grânulos lipídicos

DNA mitocondrial

Ribossomas “livres”

Gémulas Polimetafosfato

Espaço periplásmico

Parede celular

INTRODUÇÃO GERAL

4


membrana que assegura a protecção dos cromossomas. Tal

como as células vegetais, as células de levedura têm dois envelopes celulares: a parede

está exemplificado a constituição de uma célula de



as funções na célula.



enção do potencial de membrana


. Por outro lado, a membrana possuí

e de substratos de e para o interior



iduais do metabolismo que têm de ser libertados, isto

é, a membrana é permeável duma forma selectiva [Konings, 2006]. Esta característica deve-

Polimetafosfato

Retículo endoplasmático

rugoso

Plasmídio

Espaço periplásmico

Cromossoma

Mitocôndria

INTRODUÇÃO GERAL

5

se à sua composição lipídica e, em parte, aos seus sistemas de transporte que permitem à

célula controlar as suas trocas com o meio. O funcionamento destes transportadores é, por

sua vez, igualmente influenciado pela composição lipídica da membrana, da qual depende

também a fluidez desta [Henschke & Rose, 1991; Ribéreau-Gayon et al., 2006].

1.2.2.1.1. Composição da membrana plasmática

Sendo a membrana constituída por lípidos e proteínas, a sua composição determina as

suas características e condiciona vários processos metabólicos.

Os três principais fosfolípidos de membrana plasmática são fosfatidiletanolamina (PE),

fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilinositol (PI), representando 70-85% do total, existindo

fosfatidilserina (PS) e difosfatidilglicerol (PG) em menor quantidade. Os ácidos gordos das

membranas fosfolipídicas contêm maioritariamente entre 14 a 24 átomos de carbono. Os

mais abundantes são os ácidos em C16 e os ácidos em C18, que podem ser saturados,

como o ácido palmítico (C16) e o esteárico (C18), ou insaturados, como o oleico (C18, com

dupla ligação na posição 9), linoleico (C18, com duas duplas ligações nas posições 9 e 12) e

linolénico (C18, com 3 duplas ligações nas posições 9, 12 e 15) [Ribéreau-Gayon et al.,

2006].

A membrana plasmática é ainda constituída por ergosterol, considerado por vários

autores como o principal esterol da membrana plasmática de leveduras [Parks & Casey,

1995; Snoek & Steensma, 2007; Guan et al., 2009]. As enzimas responsáveis pela sua

biossíntese foram localizadas na mitocôndria [Altmann & Westermann, 2005]. Relativamente

às proteínas membranares, destacam-se os múltiplos transportadores e os receptores

celulares específicos, responsáveis pela reacção da célula de levedura a vários estímulos

do meio externo, tais como hormonas sexuais ou alteração da concentração externa de

nutrientes [Ribéreau-Gayon et al., 2006].

1.2.2.1.2. Fluidez de membrana

A composição da membrana em ácidos gordos e a sua proporção em esteróis controlam

a sua fluidez. As cadeias de hidratos de carbono dos ácidos gordos da bicamada

fosfolipídica membranar podem estar num estado rígido e ordenado [Ribéreau-Gayon et al.,

2006], onde algumas ou todas as ligações de carbono dos ácidos gordos são do tipo trans.

No estado fluido, algumas dessas ligações tornam-se cis. A transição de um estado rígido

para um estado fluido acontece quando a temperatura atinge valores superiores aos da

temperatura de fusão, dependendo esta do comprimento das cadeias de ácidos gordos e do

seu grau de insaturação. As cadeias rectilíneas dos ácidos gordos saturados interagem

fortemente entre si [Ribéreau-Gayon et al., 2006], intensificando-se as interacções com o

aumento do comprimento da cadeia. A temperatura de transição, por consequência, sobe à

INTRODUÇÃO GERAL

6

medida que as cadeias de ácidos gordos se tornam mais longas. As duplas ligações de

ácidos gordos insaturados são geralmente cis, conferindo uma “curvatura” à cadeia. Esta

“curvatura” compromete a organização das cadeias de ácidos gordos, diminuindo a

temperatura de transição. O ergosterol, por sua vez, está perpendicularmente inserido na

bicamada lipídica. Os seus grupos hidroxilo associam-se através de pontes de hidrogénio

com a cabeça polar dos fosfolípidos e a sua terminação está inserida na região hidrofóbica

da bicamada lipídica. O ergosterol encontra-se, desta forma, intercalado com os fosfolípidos

da membrana, inibindo a cristalização das cadeias de ácidos gordos a baixas temperaturas.

Por outro lado, à medida que a temperatura vai aumentando, o ergosterol regula o excesso

de fluidez da membrana, reduzindo o movimento das cadeias de ácidos gordos [Zinser et

al., 1991; Alexandre et al., 1994].

1.2.2.1.3. H+-ATPase membranar

A H+-ATPase membranar constitui 5 a 10% do total de proteína da membrana plasmática

de leveduras [Bowman et al., 1981]. Tem um tamanho aproximado de 100 kDa e pertence

ao grupo de ATPases de tipo P2 transportadoras de catiões, no qual estão incluídas a

Na+/K+-ATPase e a Ca2+-ATPase de membranas plasmáticas de mamíferos [Kühlbrand,

2004]. A H+-ATPase apresenta como propriedades principais uma elevada afinidade para o

ATP (Km entre 0,8 e 4,8 mM), um pH óptimo entre 5,0 e 6,7 para a hidrólise do ATP,

sensibilidade ao vanadato, dietilstilbestrol e diciclohexilcarbodimida e insensibilidade à

oligomicina, à azida e ao nitrato [Sigler & Hofer, 1991].

Através da análise do perfil de hidrofobicidade da H+-ATPase membranar foi proposto um

modelo de organização estrutural da enzima [Hager et al., 1986; Serrano et al., 1986],

representado na Figura 2, com 10 regiões transmembranares (10 hélices α hidrofóbicas) e

extremidades N e C-terminal voltadas para o citosol.

Figura 2: Representação do modelo de estrutura da cadeia polipeptídica da H+-ATPase membranar. A posição marcada com um P é o local de fosforilação (Adaptado de Bowman & Bowman, 1986).

As 3 maiores porções de polipéptidos no citosol são: a cauda terminal azotada de cerca

de 115 aminoácidos e dois grandes ganchos de cerca de 130 e 300 aminoácidos [Bowman

& Bowman, 1986]. O maior gancho contém o local onde a enzima é fosforilada durante o

ciclo reaccional, julgando-se também que esteja envolvido na ligação e hidrólise de ATP. Os

dois ganchos citosólicos são as partes mais conservadas da proteína [Bowman & Bowman,

Exterior

Interior

Membrana

INTRODUÇÃO GERAL

7

1986; DeWitt et al., 1998].

A principal H+-ATPase membranar é codificada pelo gene essencial PMA1 [Serrano et al.,

1986]. O gene PMA1 é fortemente expresso e é homólogo ao gene PMA2 que codifica, por

sua vez, para uma H+-ATPase membranar que apresenta 89% de identidade com a proteína

codificada por PMA1, para além de lhe ser funcionalmente semelhante [Schlesser et al.,

1988]. Sob condições normais de crescimento o gene PMA2 é muito menos expresso do

que o gene PMA1 e não é considerado essencial [Schlesser et al., 1988; Supply et al.,

1993a,b]. Em condições de stresse de crescimento que estimulem a activação da H+-

ATPase membranar de Saccharomyces cerevisiae verificou-se, através de ensaios de

quantificação imunológica, que as células apresentaram uma menor quantidade de H+-

ATPase, sendo este facto consistente com a menor expressão do gene PMA1 nessas

mesmas condições de stresse [Monteiro et al., 1994; Viegas et al., 1994, 1995; Fernandes et

al., 1997].

A H+-ATPase presente na membrana plasmática de S. cerevisiae é conhecida por ser

essencial a diversas funções celulares, entre as quais a absorção de nutrientes [Kotyk,

1994], a regulação do pH intracelular [Goffeau & Slayman, 1981] e do potencial de

membrana [Carmelo et al., 1997], o crescimento celular [Portillo & Serrano, 1989] e a

osmorregulação [Martínez de Marãnón et al., 2001]. A actividade da enzima associa a

hidrólise de ATP à expulsão de protões, resultando no estabelecimento de um gradiente

protónico electroquímico transmembranar que conduz o transporte secundário [Serrano,

1984; van Uden, 1985; Cartwright et al., 1987; Serrano, 1988]. Quando a H+-ATPase não

está funcional, muitos simportes de H+ não podem prosseguir, mesmo que a diferença de pH

medida entre os meios intra e extracelular seja suficiente para conduzir os simportes [Kotyk,

1983]. Para além disso, o gradiente electroquímico é igualmente utilizado na regulação da

actividade de algumas enzimas intracelulares sensíveis ao pH [Serrano, 1984].

Johannson e colaboradores (1981) constataram que os ácidos gordos de cadeia longa

aumentam a actividade da H+-ATPase membranar. A razão esterol/fosfolípido parece

influenciar a actividade da H+-ATPase membranar [Johannson et al., 1981]. Arami e

colaboradores (1997) relataram um decréscimo da actividade da H+-ATPase membranar

provocado por uma modificação estrutural da membrana, resultante da decomposição

fotoquímica do ergosterol [Arami et al., 1997].

Martínez de Marãnón e colaboradores (2001) estudaram de que forma a redução do

volume celular provocado pelo aumento da pressão osmótica extracelular afectou a taxa de

expulsão de H+ in vivo. Após terem constatado que uma redução de 50% do volume celular

provocou uma inibição total do processo de expulsão de H+, estes autores postularam que a

inibição da acidificação extracelular poderia ser uma consequência da inibição da H+-

INTRODUÇÃO GERAL

8

ATPase induzida por modificações conformacionais da enzima, como resultado de

deformações na membrana plasmática [Martínez de Marãnón et al., 2001].

De acordo com alguns autores, a hipótese mais provável para a activação da H+-ATPase

resulta da modificação pós-tradução da enzima PMA1 [Monteiro et al., 1994; Viegas et al.,

1994, 1995], nos casos de esgotamento de fonte de glucose e de azoto [Portillo et al., 1989;

Benito et al., 1992; Eraso & Portillo, 1994; García-Arranz et al., 1994]. Para além disso, é

possível que a activação da H+-ATPase esteja também, pelo menos parcialmente,

relacionada com a alteração dos lípidos constituintes da membrana plasmática de células

cultivadas sobre condições inibitórias, tal como foi proposto para a activação induzida por

ácido decanóico [Alexandre et al., 1996].

A glucose foi identificada como um factor que estimula a expulsão de protões em S.

cerevisiae uma vez que rapidamente activa a H+-ATPase membranar da levedura [Sigler &

Hofer, 1991; Brandão et al., 1994]. Serrano (1983) demonstrou a necessidade de se

proceder a uma pré-incubação com glucose para que se dê a activação da H+-ATPase

membranar e se observem taxas significativas de transporte activo em leveduras [Borst-

Pauwels, 1981; Serrano, 1983].

Para além disso têm sido descritos vários factores ambientais de stresse que estimulam a

actividade desta enzima in vivo, tais como o etanol [Rosa & Sá-Correia, 1991; Rosa & Sá-

Correia, 1992; Monteiro et al., 1994], o ácido octanóico [Viegas & Sá-Correia, 1991; Viegas

et al., 1994], o pH extracelular ácido [Eraso & Gancedo, 1987], o cobre [Fernandes et al.,

1997; Fernandes & Sá-Correia, 1999] e temperaturas supra-óptimas (inferiores a 40ºC)

[Viegas et al., 1995], constituindo a activação da H+-ATPase uma resposta de defesa da

célula face à dissipação da força protomotriz através da membrana e/ou ao decréscimo do

pH interno [Cartwright et al., 1986; Eraso et al., 1987; Sá-Correia et al., 1989; Rosa & Sá-

Correia, 1991; Viegas & Sá-Correia, 1991; Rosa & Sá-Correia, 1992; Monteiro et al., 1994;

Viegas et al., 1994; Viegas et al., 1995].

Relativamente ao efeito do etanol, muito embora seja considerado por vários autores

como um factor que estimule a actividade da H+-ATPase [Rosa & Sá-Correia, 1992;

Monteiro et al., 1994; Monteiro & Sá-Correia, 1998], existem paralelamente evidências de

outros autores [Cartwright et al., 1986; Cartwright et al., 1987; Pascual et al., 1988] de

redução da actividade da H+-ATPase membranar para a gama de concentrações que

reduzem significativamente a taxa de fermentação em ensaios em vesículas. Este efeito

poderá resultar do efeito conjugado da inibição da actividade da H+-ATPase membranar e

do estímulo do influxo passivo de protões, devido a um aumento não especifico da

permeabilidade da membrana descrito por vários autores [Leão & van Uden, 1984a; van

Uden, 1985; Salgueiro et al., 1988].

INTRODUÇÃO GERAL

9

Estudos realizados por Malparida e Serrano (1981) demonstram que a H+-ATPase

membranar mantém o pH intracelular de S. cerevisiae entre 6,0 e 7,0, mesmo quando

ocorrem grandes variações no pH externo [Malpartida & Serrano, 1981]. O crescimento de

leveduras em meios ácidos demonstrou provocar um aumento na actividade da H+-ATPase

[Eraso & Gancedo, 1987], comprovando-se paralelamente a existência de uma correlação

muito forte entre o aumento da actividade da enzima e o aumento da actividade catalítica

[Eraso et al., 1987]. A regulação dos pH’s intra e extracelular foi igualmente confirmada em

mutantes com baixos níveis de H+-ATPase que apresentaram baixo pH intracelular,

demonstrando uma maior sensibilidade à presença de ácidos fracos [McCusker et al., 1987]

e ao baixo valor do pH do meio extracelular. A H+-ATPase demonstrou ser essencial para o

crescimento celular e para a expulsão de protões in vivo, facto comprovado através da

letalidade das mutações null [Serrano et al., 1986]. Para além disto, estudos com mutantes

pma1 demonstraram que esta proteína é também essencial para a resistência a baixas

temperaturas, ao pH ácido e a algumas drogas inibitórias, tais como vanadato metilamina e

TPP+ [McCusker et al., 1987; Ulaszewski et al., 1987a,b; Vallejo & Serrano, 1989].

1.3. Fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae

1.3.1. Bioquímica do processo

Quando uma hexose é transportada para o interior de uma célula de S. cerevisiae é

degrada através da via glicolítica em duas moléculas de piruvato. Durante a glicólise há

produção de 2 molécula de ATP e de duas moléculas de NADH, por molécula de hexose.

As enzimas piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase convertem o piruvato em

etanol e em dióxido de carbono e re-oxidam 2 moléculas de NADH que são produzidas na

glicólise [Barnett, 2003], sendo este o processo conhecido como fermentação alcoólica. Do

ponto de vista energético, a glicólise (Figura 3) seguida de fermentação alcoólica fornece à

levedura 2 moléculas de ATP por molécula de glucose degradada, ou, 14,6 Kcal

(biologicamente utilizável) / mole de glucose fermentada. Do ponto de vista termodinâmico,

a alteração de energia livre durante a degradação de uma mole de glucose e a consequente

formação de etanol e CO2 é de -40Kcal. A diferença (25,4 Kcal) é dissipada sob a forma de

calor [Ribéreau-Gayon, 2006], traduzindo-se frequentemente no aumento de temperatura ao

longo do processo fermentativo.

A capacidade de S. cerevisiae

crescimento em condições anaeróbias [Snoek

grupo de leveduras Crabtree positivas (súbita resposta fermentativa sob condições de

aerobiose e de adição de excesso de açúcar)

de NADH produzido pelo aumento do fluxo de hexoses para o interior da célula. Outro factor

que contribui para que a fermentação se realize em condições de anaerobiose é o efeito de

Pasteur, que é definido como a

fermentação não consegue competir eficientemente com a respiração, em termos de

rendimento em ATP, conduzindo a uma diminuição da taxa de fermentação sob condições

aeróbias [Lagunas, 1986]. Em

aeróbias com limitação de açúcar e em suspensões de células em fase estacionária (devido

às baixas taxas de consumo de açú

1.3.2. Produtos secundários

Durante a fermentação alcoólica,

etanol, produzindo igualmente um elevado número de compostos voláteis responsáveis pelo

aroma do vinho, tais como ácidos gordos, álcoois superiores e ésteres (Tabela

et al., 2008].

Tabela 2: Metabolitos presentes

Metabolitos primários

Ácidos orgânicos superiores

Glucose Citrato Frutose Malato Glicerol Acetato IsoamilaEtanol 2

Figura 3: Via glicolítica, fermentação alcoólica e desvio para a produção de glicerol. (Adaptado de RibéreauGayon, 2006)

S. cerevisiae fermentar açúcares é absolutamente vital para o seu

crescimento em condições anaeróbias [Snoek & Steensma, 2007]. Esta espécie pertence ao


aerobiose e de adição de excesso de açúcar), que produzem etanol para remover o excesso



Pasteur, que é definido como a inibição do consumo de açúcares em aerobiose. A



aeróbias [Lagunas, 1986]. Em S. cerevisiae o efeito de Pasteur ocorre em culturas


s baixas taxas de consumo de açúcares) [Weusthuis, 1994].

Produtos secundários

Durante a fermentação alcoólica, S. cerevisiae converte os açúcares fermentescíveis em


do vinho, tais como ácidos gordos, álcoois superiores e ésteres (Tabela

durante a fermentação alcoólica, adaptado de [Rossouw

Álcoois superiores Ésteres Ácidos

Metanol Acetato de etilo Ácido valéricoPropanol Acetato de hexilo Ácido propiónico

Isoamilalcool Acetato de isoamilo Ácido isovalérico2-feniletanol 2-etilfenilacetato Ácido isobutíricoIsobutanol Ácido butírico

Butanol

INTRODUÇÃO GERAL

10

Via glicolítica, fermentação alcoólica e desvio para a produção de glicerol. (Adaptado de Ribéreau-

çúcares é absolutamente vital para o seu

Steensma, 2007]. Esta espécie pertence ao


, que produzem etanol para remover o excesso



inibição do consumo de açúcares em aerobiose. A



o efeito de Pasteur ocorre em culturas contínuas


converte os açúcares fermentescíveis em


do vinho, tais como ácidos gordos, álcoois superiores e ésteres (Tabela 2) [Rossouw

[Rossouw et al., 2008]

Ácidos gordos

Ácido valérico Ácido octanóico Ácido propiónico Ácido decanóico

valérico Caprilato de etilo butírico Lactato de etilo

butírico Caprato de etilo

INTRODUÇÃO GERAL

11

O estudo de Rossouw e colaboradores (2008) permitiu constatar que apesar de se ter

observado um aumento constante na concentração dos compostos aromáticos (referidos na

Tabela 2) durante a fermentação em mosto sintético, o período em que ocorreu a maior

acumulação de compostos aromáticos foi o início de fermentação [Rossouw et al., 2008].

Os ácidos produzidos por S. cerevisiae durante a fermentação alcoólica pertencem ao

grupo dos ácidos orgânicos fracos, que são compostos lipofílicos pertencentes a uma

importante classe de aditivos alimentares antimicrobianos [Freese et al., 1973; Warth, 1977;

Cole & Keenan, 1987]. O mecanismo de actuação dos ácidos fracos é dependente do pH

extracelular, na medida em que são tanto menos eficazes, quanto mais alcalino for o meio

extracelular [Viegas et al., 1989]. As moléculas não dissociadas atravessam a membrana

plasmática por difusão simples até se atingir o equilíbrio, de acordo com o gradiente de pH

que se estabelece entre o lado interno e o lado externo da membrana [Booth & Kroll, 1989;

Pampulha & Loureiro-Dias, 1989; Viegas et al., 1989]. A acumulação de aniões [Eklund,

1983; Eklund, 1985] e a diminuição do pH extracelular [Pampulha & Loureiro-Dias, 1989;

Warth, 1991; Viegas & Sá-Correia, 1995] estão entre as causas possíveis de redução da

taxa específica de crescimento [Pampulha & Loureiro-Dias, 2000], redução do rendimento

em biomassa [Verduyn et al., 1992] e perda de viabilidade [Prudêncio et al., 1998] de células

expostas a ácidos fracos.

O glicerol é o terceiro composto, a seguir ao etanol e ao CO2, produzido em maiores

quantidades, durante a fermentação alcoólica [Pizarro et al., 2007]. Quando se associa a

influência do glicerol no vinho, depreende-se que não está relacionada com o seu aroma,

uma vez que o glicerol não é volátil, mas participa em vários atributos sensoriais

importantes, tais como doçura (devido à natureza viscosa do glicerol), suavidade e corpo do

vinho [Prior & Hohmann, 1997; Scanes et al., 1998].

1.4. Fermentação vinária

O vinho é uma bebida alcoólica que resulta de fermentação do mosto de uva. A sua

história tem mais de 8000 anos, considerando-se o seu processo de produção como um dos

mais antigos processos biotecnológicos no mundo [Pretorius, 2000; This et al., 2006]. Do

ponto de vista bioquímico, o vinho pode ser definido como uma solução multi-componente

líquida, constituída principalmente por água, etanol, glicerol e ácidos orgânicos. Como

compostos minoritários (mas igualmente importantes) tem-se os componentes responsáveis

pelo flavour [Rossouw et al., 2008; Swiegers et al., 2009]. Alguns destes compostos podem

estar originalmente presentes nas uvas, ou podem ser sintetizados durante o processo de

vinificação [Pizarro et al., 2007].

INTRODUÇÃO GERAL

12

Saccharomyces assume um papel fundamental na transformação anaeróbica do mosto

de uva em vinho. O processo fermentativo pode ser conduzido por estirpes de leveduras

comerciais seleccionadas ou pode deixar-se o mosto fermentar com a flora nativa presente

na adega e nas uvas. Em ambos os casos, S. cerevisiae e S. bayanus são as espécies de

leveduras que conduzem a fermentação [Bisson, 2004] e as espécies predominantes ao

longo da maior parte do processo [Querol et al., 1994; Lopandic et al., 2008]

1.4.1. Factores físico-químicos que afectam as cinéticas de fermentação vinária

A fermentação vinária é um processo bioquímico e ecológico complexo que envolve uma

multiplicidade de factores de stresse que, de uma forma sinérgica, promovem o

desenvolvimento sequencial de diferentes espécies de leveduras [Fleet & Heard, 1993;

Bisson, 1999; Bauer & Pretorius, 2000; Fleet, 2003; Zott et al., 2008]. No início de

fermentação, o mosto constitui a primeira situação de stresse quer pela elevada

concentração de açúcares presentes (elevada pressão osmótica), quer pela presença de

compostos antimicrobianos (SO2 e resíduos de pesticidas) e presença de microrganismos

competidores (presença de factores killer e de moléculas quorum-sensing e influência da

densidade espacial) [Yap et al., 2000; Fleet, 2003; Nissen et al., 2003; Hogan, 2006; Perez-

Nevado et al., 2006]. À medida que a fermentação decorre, aumenta a concentração de

etanol e de CO2, sobe a temperatura (nos casos em que não é controlada), ocorre o

esgotamento de nutrientes e de O2.

1.4.1.1. Etanol

Nas décadas de 70/80, vários grupos de investigadores estudaram os efeitos negativos

que o aumento da concentração de etanol provocava na população de Saccharomyces

cerevisiae, durante o processo de fermentação alcoólica. Diversos mecanismos subjacentes

aos efeitos adversos deste composto foram igualmente descritos, nomeadamente a inibição

hiperbólica não-competitiva de enzimas glicoliticas [Nagodawithana et al., 1977], inibição do

crescimento [Jones et al., 1981; Ingram & Buttke, 1984; van Uden, 1985; Casey & Ingledew,

1986], diminuição da temperatura óptima e máxima de crescimento [van Uden & Duarte,

1981; Loureiro & van Uden, 1982], o estímulo de morte a baixa, média e alta temperatura

[van Uden, 1985; Sá-Correia & van Uden, 1986], inibição do sistema de transporte de

nutrientes, tais como glucose [Leão & van Uden, 1982a], frutose [Sá-Correia & van Uden,

1983], maltose [Loureiro-Dias & Peinado, 1982], amónia [Leão & van Uden, 1984b] e

aminoácidos [Leão & van Uden, 1984b], ocorrência de mutações do tipo petite [Cabeça-

Silva et al., 1982] e estímulo da difusão de espécies químicas não polares [Leão & van

Uden, 1984a].

INTRODUÇÃO GERAL

13

A membrana plasmática foi identificada como um dos principais alvos para a inibição

provocada pelo etanol no transporte de nutrientes. O etanol interage com as membranas

através da sua inserção no interior hidrofóbico, provocando um aumento da polaridade desta

região, enfraquecendo as interacções hidrofóbicas, a barreira hidrofóbica da membrana às

trocas livres de moléculas polares e afecta o posicionamento das proteínas na membrana

[Ingram & Buttke, 1984]. Para além disso, observa-se um aumento de fluidez, com

consequente aumento de permeabilidade passiva a iões e a pequenos metabolitos [Ingram

& Buttke, 1984; Quintas et al., 2000]. Como tal, a composição em ácidos gordos da

membrana lipídica demonstrou ser importante na tolerância ao etanol [Thomas & Rose,

1979; Mishra & Prasad, 1989], sendo este composto responsável por um aumento da

síntese de fosfolípidos membranares, nomeadamente da sua percentagem em ácidos

gordos insaturados (ácido oleico, na maioria). A perda da integridade membranar diminui a

capacidade da célula em manter um gradiente de concentração através da membrana

plasmática, afectando uma série de sistemas de transporte de solutos [Leão & van Uden,

1984a,b]. Por outro lado, foi demonstrado que, a partir de determinadas concentrações, o

etanol é capaz de promover a formação de um agregado fosfolipídico pouco usual,

designado por fase interdigitada, em suspensões de L-α-dipalmitoilfofastidilcolina [McIntosh

et al., 1983; Simon & McIntosh, 1984]. Na fase interdigitada as cadeias carbonadas dos

lípidos de monocamadas opostas interpenetram-se completamente, ficando expostos os

terminais metílicos. Resultados obtidos por Rowe (1987) em misturas de fosfatidilcolina e

fosfatidiletanolamina demonstraram que é possível coexistirem lípidos interdigitados e

lípidos não interdigitados numa membrana. Zonas onde os lípidos se encontrem

interdigitados podem contribuir para a ligação dos dois lados da bicamada e constituir zonas

mais permeáveis de forma a facilitar o acesso ou a libertação de moléculas, podendo

ocorrer naturalmente ou como resultado do efeito tóxico de qualquer tipo de substância

[Rowe, 1987]. Recentemente, Gurtovenko e Anwar (2009) demonstraram pela primeira vez

a formação de monocamadas lipídicas a partir de bicamadas fosfolipídicas, por exposição

das membranas a soluções aquosas de concentrações elevada de etanol (>12 mol%),

apresentando as estruturas em monocamada formadas semelhanças com micelas invertidas

ao possuírem forma irregular, pequena dimensão e carácter persistente [Gurtovenko &

Anwar, 2009]. Estes autores atribuíram igualmente um significado biológico a estas

estruturas em monocamada, postulando que o etanol promove a hemifusão das camadas

lipídicas adjacentes, através de rupturas provocadas nas mesmas, conduzindo

subsequentemente à formação de zonas permeáveis que podem actuar como sistemas de

libertação de moléculas polares, incluindo iões [Gurtovenko & Anwar, 2009].

O fluxo transmembranar de protões demonstrou ser sensível à presença de etanol,

conduzindo à diminuição da taxa de fermentação [Cartwright et al., 1986; Cartwright et al.,

INTRODUÇÃO GERAL

14

1987; Pascual et al., 1988]. A dissipação do gradiente de protões induzida pelo etanol

parece estar envolvida na inibição da actividade da H+-ATPase membranar [Cartwright et al.,

1987], no estímulo do influxo passivo de protões (devido ao aumento não especifico da

permeabilidade da membrana plasmática) [Leão & van Uden 1984a; van Uden, 1985;

Salgueiro et al., 1988], ou numa combinação de ambos [Rosa e Sá-Correia, 1991].

A discussão sobre o efeito do etanol no pH intracelular é controversa. Dombek e Ingram

(1987) detectaram apenas um ligeiro decréscimo nos valores de pH intracelular, durante as

fases finais de fermentação com elevada concentração de etanol [Dombek & Ingram, 1987].

Por outro lado, Cartwright e colaboradores (1986), através da medição do pH intracelular na

presença de etanol, detectaram uma acidificação significativa, mais pronunciada na

ausência de glucose. Os mesmos autores referiram que o gradiente de pH (∆pH) através da

membrana plasmática e o potencial de membrana (∆ψ) foram igualmente afectados,

interpretando os seus resultados como uma consequência do aumento do influxo passivo de

H+ e inibição da H+-ATPase membranar [Cartwright et al., 1986]. Os resultados obtidos por

Loureiro-Dias e Santos (1990) confirmaram o estudo efectuado por Cartwright e

colaboradores (1986), tendo descrito que, na ausência de etanol, se observa apenas uma

ligeira acidificação do citoplasma, sendo esta fortemente acelerada quando se adicionava

etanol ao processo fermentativo. Estes autores observaram igualmente o desaparecimento

rápido do ∆pH através da membrana do tonoplasto para elevadas concentrações de etanol

[Loureiro-Dias & Santos, 1990].

Outra explicação para a inibição da fermentação provocada pelo etanol diz respeito à sua

possível actuação sinérgica com o ácido acético nas fases finais de fermentação. Este ácido

encontra-se nas formas não ionizadas durante as fermentações vinárias onde, normalmente,

o pH externo é baixo. Como consequência, a forma dissociada do ácido acético é

acumulada no interior da célula [Pampulha & Loureiro-Dias, 1989]. Os resultados obtidos por

Loureiro-Dias & Santos (1990) revelaram um outro mecanismo de inibição provocado pelo

etanol que afecta a fase inicial de fermentação (fosforilação de açúcar). De acordo com

alguns autores, este mecanismo surge como consequência da acumulação de etanol no

interior da célula [Dombek & Ingram, 1988; Alterthum et al., 1989]. Segundo estes autores, a

inibição da fosforilação do açúcar deve-se à competição gerada entre o AMP e o ATP para o

local activo da enzima. De acordo com os mesmos autores, o aumento da concentração de

AMP intracelular resulta de um aumento do consumo de ATP devido à activação de H+-

ATPase membranar que ocorre como tentativa da célula combater a acidificação intracelular

em consequência do aumento da permeabilidade ao H+ na presença de etanol. Na mesma

linha de pensamento, os resultados de Loureiro-Dias e Santos (1990) indicaram que a

inibição da fosforilação por acumulação de AMP no interior da célula é estimulada pela

INTRODUÇÃO GERAL

15

produção e acumulação de ácido acético no citoplasma da célula de levedura [Loureiro-Dias

& Santos, 1990].

O efeito conjugado do etanol e da temperatura numa população de leveduras foi

inicialmente estudado por van Uden e Duarte que observaram o efeito directo do etanol na

modificação das temperaturas cardiais de crescimento de Saccharomyces cerevisiae

durante fermentações alcoólicas, uma vez que estas podiam terminar prematuramente

devido ao efeito conjugado do etanol e da temperatura (principalmente na produção de

vinhos tintos onde as temperaturas de fermentação são altas) [van Uden & Duarte, 1981;

van Uden, 1984]. Nesse sentido, os mesmos autores constataram que à medida que a

concentração de etanol aumentava, as três temperaturas cardiais (Top, Tmaxf e Tmaxi)

diminuíam e que, a partir de uma dada concentração crítica de etanol (dependente da

estirpe e da temperatura de fermentação), o valor de Top se aproximava do valor de Tmaxi, de

tal forma que qualquer aumento posterior da concentração de etanol, resultante da

continuidade do processo fermentativo, poderia conduzir a população a um segundo período

exponencial na gama das temperaturas supra-óptimas (Top < T < Tmaxf), durante o qual a

morte exponencial competia com o crescimento exponencial, mas com taxa específica de

crescimento superior à taxa específica de morte [van Uden & Duarte, 1981]. Tendo em conta

esta variação, com o aumento da concentração de etanol atingir-se-á uma situação em que

Tmaxf diminui para temperaturas inferiores à temperatura de fermentação. A partir do

momento em que se atingia esta concentração de etanol, a taxa de morte será superior à

taxa de crescimento, conduzindo à extinção da população viável [van Uden, 1984]. A

sequência de eventos descrita depende da tolerância da estirpe ao álcool, da concentração

final de etanol e da temperatura do processo [van Uden, 1984]. Investigadores do mesmo

grupo estudaram o efeito conjugado do etanol e outros álcoois e da temperatura numa

população de leveduras, tendo verificado que os alcanóis favoreciam a morte térmica [Leão

& van Uden, 1982b]. Estes mesmos autores postularam que os denominados alvos de morte

térmica de S. cerevisiae, cuja taxa de inactivação governa a cinética de morte térmica, estão

localizados na membrana plasmática e que a forma de acção do etanol no estímulo da

morte térmica não resulta de uma acção directa sobre alvos específicos, mas antes de um

efeito não-específico sobre os lípidos de membrana que se tornam os alvos mais sensíveis

à temperatura, sendo o mecanismo molecular de morte celular similar ou idêntico ao de

morte térmica. Esta hipótese baseou-se, por um lado, por se ter observado que o etanol

estimulou a morte térmica e diminuiu a temperatura máxima de crescimento de S.

cerevisiae, sem ter destruído o seu perfil associativo de temperatura e, por outro, pelo facto

dos álcoois testados não terem afectado a entalpia de activação de morte térmica (isto é, o

coeficiente de morte térmica foi o mesmo na presença ou na ausência de álcoois) [Leão &

van Uden, 1982b]. Com base nos resultados referidos, foi possível construir um modelo que

INTRODUÇÃO GERAL

16

relaciona a temperatura máxima de crescimento de S. cerevisiae em presença de etanol

com os parâmetros de morte térmica e os efeitos do etanol sobre estes parâmetros. Este

modelo foi testado com sucesso na previsão da temperatura máxima à qual é possível

prosseguir a fermentação em estirpes vínicas [Loureiro & van Uden, 1982].

A variação de tolerância ao etanol observada nas células em fase exponencial de

crescimento pode ser explicada através de vários factores, tais como: composição lipídica

da membrana plasmática [Jimenez & Benitez, 1987; Lloyd et al., 1993; Sajbidor, 1997; Chi &

Arneborg, 2000; You et al., 2003; Takagi et al., 2005], acumulação de trealose [Mansure et

al., 1994; Sharma, 1997; Lucero et al., 2000] ou da proteína de choque térmico Hsp104

[Sanchez et al., 1992; Piper, 1995], actividade da H+-ATPase membranar [Rosa & Sá-

Correia, 1991; Supply et al., 1995; Aguilera et al., 2006] e estabilidade mitocondrial [Aguilera

& Benitez, 1985; Ibeas & Jimenez, 1997]. O etanol é ainda referido na literatura como um

forte indutor de mutantes respiratórios de S. cerevisiae [Norton et al., 1995; Ibeas &

Jimenez, 1997].

Os ensaios electroquímicos de Wang e colaboradores (2007) demonstraram que o limite

máximo de tolerância ao etanol de S. cerevisiae é de 25% (v/v) etanol, coerente com os

resultados obtidos pelos mesmos autores através das medições convencionais da

capacidade fermentativa [Wang et al., 2007].

A capacidade de adaptação de estirpes de S. cerevisiae a ambientes enológicos está

dependente dos seus perfis específicos de expressão do genoma [Pérez-Ortín et al., 2002].

Estudos realizados no sentido de esclarecer quais os agentes/mecanismos intervenientes

na tolerância de estirpes de S. cerevisiae ao etanol revelaram que a superóxido dismutase

mitocondrial (MnSOD) codificada por SOD2 [Costa et al., 1993], a H+-ATPase membranar

[Aguilera et al., 2006; Lei et al., 2007], a biossíntese de ergosterol [Lei et al., 2007] e a

biossíntese de fosfolípidos [Chi et al., 1999] são essenciais para a aquisição de tolerância ao

etanol. No entanto, muito embora tenham sido realizados vários estudos de resposta a

estímulos extracelulares de estirpes laboratoriais é importante realçar que existem

diferenças substanciais na resposta ao stresse de estirpes industriais, uma vez que estas

crescem normalmente em ambientes mais complexos, para além de terem sido previamente

seleccionadas de acordo com uma resposta melhor e mais rápida a várias condições de

stresse, de forma a terem um melhor desempenho fermentativo [Pizarro et al., 2008]. Os

ensaios de DNA microarrays inicialmente realizados a estirpes de leveduras vínicas

revelaram níveis elevados de expressão de genes envolvidos na biossíntese de

aminoácidos e na biossíntese de porinas [Yang et al., 1994; Cavalieri et al., 2000; Backus et

al., 2001], muito embora a abordagem inicial dos DNA microarrays contemplasse apenas a

resposta das células perante situações de curta duração de stresse ao etanol [Alexandre et

al., 2001]. Recentemente, a análise de expressão global de genes e as análises proteómicas

INTRODUÇÃO GERAL

17

foram realizadas sob condições semelhantes às de fermentação vinária [Rossignol et al.,

2003; Varela et al., 2005; Wu et al., 2006; Marks et al., 2008; Pham & Wright, 2008],

considerando as dinâmicas de expressão génica e de biossíntese de proteínas na resposta

ao stresse. Varela e colaboradores (2005) analisaram o transcriptoma de uma estirpe vínica

de S. cerevisiae em 3 fases de crescimento definidas (meio da fase exponencial, início e

final da fase estacionária), tendo observado para todas as fases estudadas uma maior

expressão de genes relacionados com a produção de energia e com a resposta ao stresse

[Varela et al., 2005]. Estes autores postularam que mecanismos pós-transcricionais

poderiam ser os responsáveis pela regulação de proteínas correspondentes a genes

expressos numa determinada fase de crescimento, destacando a fase estacionária como a

fase onde as células sofrem as maiores alterações fisiológicas, que provavelmente são

provocadas pela elevada concentração de etanol existente no meio [Varela et al., 2005].

Rossignol e colaboradores (2009) revelaram a existência de alterações substanciais na

quantidade de proteína ao longo da fermentação alcoólica, sem estarem directamente

associadas a alterações nos níveis de transcrito, sugerindo que o mRNA é selectivamente

processado e/ou traduzido durante a fase estacionária [Rossignol et al., 2009]. Para além

dos mecanismos de defesa celular conhecidos em situações de stresse pelo etanol, tais

com a acumulação de proteínas de choque térmico [Varela et al., 2005; Pham et al., 2006;

Wu et al., 2006; Zuzuarregui et al., 2006], a acumulação de trealose [Varela et al., 2005; Wu

et al., 2006; Pham & Wright, 2008] e o rearranjo de esteróis membranares [Varela et al.,

2005; Wu et al., 2006], estudos paralelos revelaram a importância da função vacuolar [Marks

et al., 2008] e de proteínas envolvidas no transporte de electrões [Wu et al., 2006]. De um

modo geral, estes estudos moleculares demonstram a complexidade da resposta ao stresse

de células de leveduras, destacando a importância do seu estado fisiológico e do seu

background genético para uma eficiente resposta a factores de stresse, nomeadamente ao

etanol.

1.4.1.2. Temperatura

A temperatura é um dos parâmetros ambientais mais importantes para o desempenho

das leveduras durante o processo fermentativo [Fleet & Heard, 1993], influenciando o

crescimento de diferentes espécies [Torija et al., 2003b], a duração de fermentação [Torija et

al., 2001] e o metabolismo das leveduras, nomeadamente a formação de metabolitos

secundários (e.g. glicerol, ácido acético e ácido succínico) [Lafon-Lafourcade, 1983].

As fermentações vinárias realizadas a baixas temperaturas têm vindo a tornar-se uma

prática frequente em vinificação, uma vez que são responsáveis pela produção de vinhos

com um perfil aromático rico [Killian & Ough, 1979; Kunkee, 1984] e promovem uma maior

estabilidade do vinho, ao condicionarem fortemente o crescimento de bactérias lácticas e

INTRODUÇÃO GERAL

18

acéticas. No entanto, ao se baixar a temperatura de fermentação aumenta-se o risco de

ocorrer uma paragem prematura e amuo de fermentação [Torija et al., 2003b]. O estudo

realizado por Santos e colaboradores (2008) revelou como factores potencialmente

causadores de fermentações incompletas a limitação de nutrientes, as temperaturas de

fermentação excessivamente altas ou baixas, as más práticas enológicas, a ocorrência de

microrganismos contaminantes e a presença de compostos tóxicos, como os fungicidas e o

etanol [Santos et al., 2008].

Diversos estudos [Sherman, 1959; Chang & Matson, 1972] referem que S. cerevisiae,

uma levedura tipicamente mesófila, é capaz de crescer, sob determinadas condições, a

40ºC. Para além disso, esta espécie apresenta um perfil associativo de temperatura e é

caracterizada por uma elevada aptidão para fermentar a glucose e por um baixo grau de

insaturação de ácidos gordos na gama das temperaturas superiores à óptima de

crescimento [Sinigaglia et al., 1993].

As células em fase exponencial são muito mais termosensíveis do que em fase

estacionária [Rosenberg & Wood, 1957; Sherman, 1956, 1959], sendo a formação da

gémula o período mais sensível aos efeitos nefastos da temperatura elevada, uma vez que

corresponde ao momento em que se realiza a síntese de DNA nuclear [Williamson, 1965].

Parry e colaboradores (1976) confirmaram que as células em fase exponencial de

crescimento apresentaram uma resistência mínima ao choque térmico (52ºC, durante 30

minutos) comparativamente com as células em fase estacionária, confirmando a maior

termossensibilidade que já havia sido descrita pelos outros autores [Parry et al., 1976]. Para

além disso, trabalhos posteriores têm vindo também a confirmar este tipo de comportamento

[Piper, 1993; Werner-Washburne et al., 1993; Steels et al., 1994; Hallberg & Hallberg, 1996].

Vários autores referem as consequências ao nível celular da exposição de células de S.

cerevisiae em fase exponencial a temperaturas superiores à temperatura óptima de

crescimento: perda rápida de viabilidade [Schenberg-Fascino & Moustacchi, 1972; Sanchez

& Lindquist, 1990], indução de síntese de proteínas de choque térmico e transposição

gradual de células para a fase G1 do ciclo celular [Johnston & Singer, 1980], tornando-as

termotolerantes [Lindquist & Craig, 1988]. Células termotolerantes em fase estacionária

apresentam elevados níveis de proteínas de choque térmico [Boucherie, 1985; Petko &

Lindquist, 1986; Piper, 1993; Werner-Washburne et al., 1993; Steels et al., 1994; Hallberg &

Hallberg, 1996].

Hunter e Rose (1972) estudaram a composição lipídica de S. cerevisiae cultivada a 15ºC

e a 30ºC, tendo observado que a diminuição da temperatura de crescimento da cultura era

acompanhada por um aumento na composição total de lípidos, de ácidos gordos,

triacilgliceróis e de fosfolípidos (maioritariamente fosfatidilcolina), não alterando a

composição de diacilgliceróis, ácidos gordos livres, esteróis e ésteres de esteróis [Hunter &

INTRODUÇÃO GERAL

19

Rose, 1972]. Walton e Pringle (1980) postularam que as lesões na membrana plasmática

são os eventos letais primários provocados por altas temperaturas [Walton & Pringle, 1980].

O estudo realizado por Torija e colaboradores (2003) demonstrou que o grau de insaturação

dos lípidos da membrana plasmática de S. cerevisiae foi afectado pela temperatura de

crescimento [Torija et al., 2003a]. Para além disso, alguns autores verificaram que quanto

menor é a temperatura de crescimento, mais insaturados são os ácidos gordos da

membrana plasmática [Kates & Baxter, 1962; Arthur & Watson, 1976; Watson et al., 1976;

Watson & Rose, 1980; Watson, 1984]. S. cerevisiae, por exemplo, encurtou o comprimento

das cadeias de ácidos gordos, através do aumento da quantidade de ácido palmitoleico

comparativamente à quantidade de ácido oleico, ao se baixar a temperatura de crescimento

de 35ºC para 10ºC [Suutari et al., 1996]. Hilge-Rotmann e Rehm (1991) observaram que um

elevado grau de saturação dos ácidos gordos conferiu uma protecção elevada para a célula,

dada a correlação positiva entre a percentagem de saturação de ácidos gordos totais e taxa

de fermentação de células imobilizadas de S. cerevisiae [Hilge-Rotmann & Rehm, 1991].

Estudos realizados por Gorenstein e Warner (1976, 1977) demonstraram que a

exposição de células mutantes (sensíveis à temperatura) de S. cerevisiae a temperaturas

não toleradas (33 e 36ºC) provocou uma diminuição exponencial da síntese de mais de 40

proteínas ribossomais, para ≈ 10 - 20% dos níveis basais em células crescidas a 23ºC

[Gorenstein & Warner, 1976; Warner & Gorenstein, 1977]. A diminuição da síntese proteica

ribossomal observada no mutante resultou de uma redução dos níveis de transcrição

[Watson, 1987]. Miller (1970, 1982) e McAlister (1979), juntamente com os seus

colaboradores, observaram indução e repressão da síntese de numerosos polipéptidos após

um aumento da temperatura de 22-23ºC para 36-37ºC, levando à alteração gradual dos

padrões de síntese proteica com o aumento de temperatura [Miller et al., 1970; McAlister et

al., 1979; Miller et al., 1982].

A resposta ao choque térmico é um sistema protector das células que envolve várias vias

de regulação. Sob stresse térmico subletal, é induzida uma resposta altamente conservada

que provoca alterações marcadas na expressão génica, resultando na indução da síntese

de proteínas de choque térmico (HSPs) e na repressão da maioria das outras proteínas

produzidas previamente ao choque [Bond, 2006]. Paralelamente, nestas situações as

células acumulam uma grande quantidade de trealose que actua principalmente na

protecção da membrana e, em algumas situações específicas, pode servir como hidrato de

carbono de reserva [Van Laere, 1989; Wiemken, 1990]. O choque térmico provoca

igualmente um aumento do teor de glucose intracelular, com inibição parcial da glicólise

[Neves & Francois, 1992]. Como tal, a conversão da glucose em trealose pode ser ainda

uma das vias de protecção face aos níveis potenciais de toxicidade resultantes da

incompleta fosforilação da glucose em glucose-6-fosfato, que se realiza imediatamente após

INTRODUÇÃO GERAL

20

a entrada de glucose na célula. Outros autores referem ainda que nestas situações de

stresse térmico subletal se observa igualmente o estímulo da actividade da H+-ATPase

membranar e da via RAS-adenilato ciclase [Piper, 1993].

Relativamente ao efeito da temperatura sobre a dinâmica de populações de S. cerevisiae

ao longo de fermentação vinária, Torija e colaboradores (2003) observaram curvas de

crescimento com a sequência normal de fases (latência, exponencial, estacionária e

declínio) em fermentações conduzidas a 25 e 30ºC, enquanto a 35ºC observaram uma

elevada taxa de mortalidade de leveduras [Torija et al., 2003b]. Este fenómeno pode estar

na origem de uma fase estacionária mais curta e do amuo de fermentação num período em

que a concentração de açúcares residuais era ainda elevada. Estes resultados estão de

acordo com estudos feitos anteriormente que revelaram que a viabilidade das leveduras

diminuiu à medida que a temperatura de crescimento aumenta [Ough, 1966; Nagodawithana

et al., 1974; Casey et al., 1984], o que pode ser explicado com base na alteração da

estrutura da membrana plasmática [Lucero et al., 2000] e nos efeitos de uma elevada

acumulação de etanol no meio intracelular a elevadas temperaturas, produzindo toxicidade

celular [Nagodawithana et al., 1974]. A hipótese postulada por Nagodawithana e

colaboradores (1974) de uma possível acumulação de etanol no meio intracelular foi

refutada por estudos da década seguinte, na medida em que Loureiro e Ferreira (1983)

observaram uma elevada permeabilidade da membrana plasmática ao 14C-etanol adicionado

ao meio extracelular, indiciando uma baixa probabilidade deste composto se ligar a algum

componente da célula de forma a ficar retido [Loureiro & Ferreira, 1983]. Guijarro e Lagunas

(1984) afirmaram que o etanol atravessa a membrana plasmática por difusão simples,

suportando esta hipótese após terem verificado que, por um lado, a taxa de efluxo de etanol

era superior à capacidade de produção de etanol e, por outro, a concentração intracelular de

etanol determinada era similar à concentração do composto presente no meio extracelular

[Guijarro & Lagunas, 1984]. Suportados nestes resultados, Dombek e Ingram (1986),

confirmaram a elevada permeabilidade da célula ao etanol, fornecendo evidências da

existência de concentrações similares de etanol produzido na célula e no meio extracelular

[Dombek & Ingram, 1986]. Estudos recentes indicaram que a expressão do gene FPS1, que

codifica para uma aquagliceroporina que, por sua vez, medeia o efluxo de glicerol em

condições de stresse ao etanol, contribui para uma diminuição da acumulação de etanol no

interior de células de leveduras, sugerindo que Fps1p pode ser igualmente responsável pela

regulação dos níveis intracelulares de etanol durante os processos de fermentação [Teixeira

et al., 2009].

Para além do efeito da temperatura sobre a dinâmica de população, Torija e

colaboradores (2003) estudaram igualmente o efeito da temperatura de fermentação no

metabolismo das leveduras, na medida em que a temperatura determina a composição

química do vinho [Torija et al

concentração de álcool no meio diminuiu à m

aumenta, estando estes resultados de acordo com o decréscimo do rendimento de etanol e

com a redução da utilização de substrato, observadas por Casey

& Ingledew, 1986].

1.4.1.3. Disponibilidade de oxig

O oxigénio molecular (O2) é necessário para uma série de vias biossintéticas, tais como,

a síntese do grupo hemo [Snoek & Steensma, 2007], dos esteróis [Rosenfeld & Beauvoit,

2003], dos ácidos gordos insaturados [Snoek & Steensma, 2006], das pirimidi

al., 1992] e dos desoxirribonucleótidos [Chabes

Os esteróis são produzidos através de uma via dependente de O

Figura 4: Representação das etapas de consumo de OSnoek & Steensma, 2007).

Para a síntese de uma molécula de ergosterol, são necessárias 12 moléculas de O

molécula de O2 para a conversão de esqualeno a lanosterol, 9 moléculas de O

conversão de lanosterol a zimosterol e 2 moléculas de O

ergosterol [Rosenfeld & Beauvoit, 2003].

São conhecidas pelo menos 3 razões para as adaptações celulares necessárias para a

célula crescer em anaerobiose [Snoek & Steensma, 2007]: (1) baixo rendimento energético

em anaerobiose, (2) necessidade de O

fluxo de diferentes moléculas entre o interior e exterior da célula.

Em condições de anaerobiose, as células de leveduras são incapazes de completar a

biossíntese de ácidos gordos insaturad

intermediários do metabolismo dos lípidos [Bardi

al., 2004]. Se os nutrientes lipídicos não estão disponíveis em anaerobiose,

altera progressivamente a composi

superficial das membranas dos organelos), “diluindo

1982]. Isto faz com que se observe que em anaerobiose, a membrana plasmática contém

uma maior percentagem de ácido

totais, ergosterol e esqualeno [Nurminen

explicadas através da incapacidade da célula em sintetizar estes compostos na ausência de

O2. Os resultados obtidos por

et al., 2003a]. Nos ensaios realizados, verificou

concentração de álcool no meio diminuiu à medida que a temperatura de fermentação


com a redução da utilização de substrato, observadas por Casey e Ingledew (1986)

Disponibilidade de oxigénio

) é necessário para uma série de vias biossintéticas, tais como,


2003], dos ácidos gordos insaturados [Snoek & Steensma, 2006], das pirimidi

., 1992] e dos desoxirribonucleótidos [Chabes et al., 2000].

Os esteróis são produzidos através de uma via dependente de O2 (Figura

Representação das etapas de consumo de O2 na biossíntese de ergosterol (Adaptado de

Para a síntese de uma molécula de ergosterol, são necessárias 12 moléculas de O

para a conversão de esqualeno a lanosterol, 9 moléculas de O

conversão de lanosterol a zimosterol e 2 moléculas de O2 para a conversão de zimosterol a

ergosterol [Rosenfeld & Beauvoit, 2003].



cessidade de O2 de diversas vias metabólicas de biossíntese e (3)

fluxo de diferentes moléculas entre o interior e exterior da célula.


biossíntese de ácidos gordos insaturados (UFAs) e de ergosterol, e acumulam

intermediários do metabolismo dos lípidos [Bardi et al., 1998; Bardi et al

, 2004]. Se os nutrientes lipídicos não estão disponíveis em anaerobiose,

altera progressivamente a composição das suas fracções lipídicas (reduzindo a área

superficial das membranas dos organelos), “diluindo-a” até ao limite de viabilidade [Henry,


uma maior percentagem de ácidos gordos saturados e uma menor quantidade de esteróis

totais, ergosterol e esqualeno [Nurminen et al., 1975]. Estas diferenças podem ser


. Os resultados obtidos por Rosenfeld e colaboradores (2003) demonstraram que um

INTRODUÇÃO GERAL

21

verificou-se que a

edida que a temperatura de fermentação


Ingledew (1986) [Casey

) é necessário para uma série de vias biossintéticas, tais como,


2003], dos ácidos gordos insaturados [Snoek & Steensma, 2006], das pirimidinas [Nagy et

Figura 4).

na biossíntese de ergosterol (Adaptado de

Para a síntese de uma molécula de ergosterol, são necessárias 12 moléculas de O2: 1

para a conversão de esqualeno a lanosterol, 9 moléculas de O2 para a

rsão de zimosterol a



de diversas vias metabólicas de biossíntese e (3)


os (UFAs) e de ergosterol, e acumulam

et al., 1999; Belviso et

, 2004]. Se os nutrientes lipídicos não estão disponíveis em anaerobiose, S. cerevisiae

ção das suas fracções lipídicas (reduzindo a área

a” até ao limite de viabilidade [Henry,


uma menor quantidade de esteróis

., 1975]. Estas diferenças podem ser


Rosenfeld e colaboradores (2003) demonstraram que um

INTRODUÇÃO GERAL

22

pulso de O2 (1 a 10 mg.L-1) pode estimular a fermentação alcoólica em anaerobiose

[Rosenfeld et al., 2003]. Por esta razão, a adição de O2 durante as fermentações vinárias é

uma prática comum e legal. O O2 é utilizado para aumentar a taxa de fermentação em

fermentações amuadas [Sablayrolles et al., 1996], sendo que a sua adição (1,5 a 3,5mg

O2.g-1 p.s. células) é eficiente apenas se for feita no momento em que as células se

encontram no final da fase exponencial [Sablayrolles & Barre, 1986; Sablayrolles, 1990;

Blateyron et al., 1998].

A biossíntese de ergosterol parece ser essencial para a tolerância ao etanol,

particularmente durante a fermentação de mosto de uva, processo em que as leveduras

estão activas em condições de baixa oxigenação e crescentes concentrações de etanol

[Shobayashi et al., 2005]. De facto, a eficiência fermentativa e a resistência ao etanol estão

geralmente associadas a um aumento na razão ergosterol/fosfolípido e a um decréscimo do

índice de saturação de ácidos gordos nas células de levedura [Sajbidor et al., 1995; Chi &

Arneborg, 1999], podendo estar na origem da entrada em fase estacionária de crescimento.

Em condições de anaerobiose, as células não conseguem sintetizar esteróis, tendo

necessidade de os obter a partir do meio. O transporte de esteróis para o interior da célula é

pois essencial para a fisiologia da célula quando esta se encontra em condições de

anaerobiose [Wilcox et al., 2002]. Os níveis celulares de ergosterol e de oleato são

importantes para os processos de transferência de solutos entre os meios intra e

extracelular [Burke et al., 1997; Ness et al., 1998]. No crescimento celular, em condições de

ausência de O2, o oleato pode ser adicionado ao meio na forma de Tween 80, podendo ser

igualmente utilizado como fonte de ácidos gordos insaturados (UFAs).

O efeito de limitação de oxigénio sobre a biossíntese de lípidos é exercido quer de forma

directa, por bloqueio das enzimas dependentes de O2 (e.g. ∆9-dessaturase, esqualeno

epoxidase, complexo de desmetilação lanosterol) [Ratledge & Evans, 1989], quer

indirectamente, ao causar a acumulação de ácidos gordos saturados (SFAs) [Bloomfield &

Bloch, 1960] e percursores de ergosterol [Parks, 1978], que regulam negativamente a

expressão da acetil-CoA carboxilase e hidroximetilglutaril-CoA redutase, respectivamente

[Mannazzu et al., 2008].

1.4.2. Respostas ao stresse

São vários os tipos de resposta ao stresse que S. cerevisiae dispõe e que são

mencionados na literatura. Lindquist e Craig caracterizam a resposta das células de S.

cerevisiae através da aquisição de uma maior termotolerância resultante de síntese de

proteínas de choque térmico (HSPs) [Lindquist & Craig, 1988], que actuam como

chaperonas na tentativa de sequestro e remoção de proteínas danificadas ou

incorrectamente conformadas [Sanchez & Lindquist, 1990; Schlensinger, 1990]. Sob

INTRODUÇÃO GERAL

23

condições laboratoriais, a proteína de choque térmico Hsp104p demonstrou ser responsável

pela tolerância a uma série de condições de stresse (calor, etanol, arsenito e

armazenamento a baixa temperatura) [Sanchez et al., 1992] e a sua expressão demonstrou

ser suficiente para célula adquirir termotolerância [Lindquist & Kim, 1996]. Para além disso,

esta termotolerância pode também ser adquirida através de vários mecanismos fisiológicos:

produção de trealose [Wiemken, 1990], água celular não congelável [Komatsu et al., 1991],

retenção do ciclo celular na fase G0 [Plesset et al., 1987], fosforilação independente de

cAMP [Coote et al., 1992] e actividade da H+-ATPase membranar [Coote et al., 1991]. Em

2000, Sales e colaboradores demonstraram que Hsp12p desempenha funções protectoras

da membrana plasmática face ao stresse induzido pela desidratação e pelo etanol [Sales et

al., 2000].

Por outro lado, as modificações na actividade da H+-ATPase membranar de S. cerevisiae

vêm igualmente referidas como uma resposta da célula ao stresse. A enzima actua na

regulação da homeostase do pH durante situações de stresse letais, de forma a manter a

viabilidade celular. Experiências onde foram utilizados inibidores de H+-ATPase membranar

(dietilstilboestrol - DES) [Coote et al., 1991] e mutantes com actividade reduzida da H+-

ATPase [Panaretou & Piper, 1990] parecem suportar esta hipótese. Há evidências de que o

stresse térmico sub-letal resulta em 50% de redução dos níveis da enzima H+-ATPase

membranar e Panaretou (1993) demonstrou que os restantes 50% de enzima são

fosforilados, tornando-se a enzima duplamente activa [Panaretou, 1993]. Segundo Coote e

colaboradores (1994), a célula nestas condições de stresse térmico sub-letal reduz o seu

número de H+-ATPases na membrana, colocando-se a hipótese de que estas possam

constituir pontos fracos ou canais por onde se realiza uma grande parte do influxo de

protões para o interior da célula [Coote et al., 1994]. Relativamente ao stresse provocado

pelo etanol nas células de S. cerevisiae, os resultados obtidos por Rosa e Sá-Correia (1991)

revelaram que a activação da enzima H+-ATPase membranar constitui seguramente uma

resposta aos efeitos adversos deste álcool nas células (inibição da actividade da H+-ATPase

e aumento da permeabilidade da membrana ao influxo de protões) [Rosa & Sá-Correia,

1991].

Como tal, uma adaptação celular de sucesso a alterações de parâmetros extracelulares

que ocorrem durante a fermentação vinária requer a percepção (sensing) atempada de

factores ambientais químicos e físicos, seguidos de uma transmissão perfeita de informação

para os compartimentos relevantes da célula (Figura 5) [Pretorius, 2000].

Os sinais químicos que são emitidos durante a fermentação vinária incluem a

disponibilidade/concentração de certos nutrientes (açúcares fermentescíveis, azoto

assimilável, oxigénio, vitaminas, minerais, ergosterol e ácidos gordos insaturados) e a

presença de substâncias inibitórias (etanol, ácido acético, ácidos gordos, sulfitos, resídu

agroquímicos e toxinas killer

temperatura, a agitação e a pressão osmótica [Pretorius, 2000].

estão normalmente relacionadas com a m

do ciclo celular e a alteração dos padrões de gemulação e de crescimento polarizado

[Pretorius, 2000].

1.4.3. Biodiversidade

O conhecimento da biodiversidade de leveduras (associadas à uva e à produção de

vinho) tem sido proporcionado po

influência que este tema exerce na produção de vinhos de qualidade.

Numerosos géneros e espécies de leveduras são encontrados durante a produção de

vinho. As leveduras que influenciam a composição do v

e/ou da adega, podem ter sido disseminadas por insectos voadores (mosca da fruta,

abelhas e vespas) ou podem provir de inoculações efectuadas a partir de preparações

comerciais de levedura [Boulton

muitos géneros e espécies de leveduras no mosto, o género

principalmente as espécies

responsáveis pela fermentação alcoólica [Pretorius, 2000].

A diversidade de espécies de levedura nas uvas tem sido uma área de investigação

explorada por diversos autores [Fleet, 1993; Kunkee & Bisson, 1993; Martini

Fleet et al., 2002; Prakitchaiwattana

Renouf et al., 2007]. Alguns estudos sugerem que à superfície da uva se encontra uma

concentração de leveduras de 3

apontam para valores entre 10

Figura 5: transmissão datravés dumavias de transdução de numa célula de levedura (adaptado de Pretorius, 2000).


ibilidade/concentração de certos nutrientes (açúcares fermentescíveis, azoto


presença de substâncias inibitórias (etanol, ácido acético, ácidos gordos, sulfitos, resídu

killer) [Pretorius, 2000]. Os sinais de natureza física incluem a

temperatura, a agitação e a pressão osmótica [Pretorius, 2000]. As respostas adaptativas

estão normalmente relacionadas com a mudança dos padrões de transcrição

lteração dos padrões de gemulação e de crescimento polarizado

de leveduras


vinho) tem sido proporcionado por numerosos estudos que têm realçado a importância e a

influência que este tema exerce na produção de vinhos de qualidade.


vinho. As leveduras que influenciam a composição do vinho podem pertencer à flora da uva



comerciais de levedura [Boulton et al., 1996; Fleet et al., 2002]. Embora sejam encontrados

muitos géneros e espécies de leveduras no mosto, o género Saccharomyces

principalmente as espécies Saccharmomyces cerevisiae e S. bayanus

responsáveis pela fermentação alcoólica [Pretorius, 2000].

diversidade de espécies de levedura nas uvas tem sido uma área de investigação

explorada por diversos autores [Fleet, 1993; Kunkee & Bisson, 1993; Martini

., 2002; Prakitchaiwattana et al., 2004; Combina et al., 2005; Raspor

., 2007]. Alguns estudos sugerem que à superfície da uva se encontra uma

concentração de leveduras de 3x105 células.cm-2 [Rosini et al., 1982], enquanto outros

apontam para valores entre 104 e 106 células. cm-2 [Fleet et al., 2002]. Sã

INTRODUÇÃO GERAL

24

Representação da transmissão de sinais ambientais através duma rede interligada de vias de transdução de sinais numa célula de levedura (adaptado de Pretorius, 2000).


ibilidade/concentração de certos nutrientes (açúcares fermentescíveis, azoto


presença de substâncias inibitórias (etanol, ácido acético, ácidos gordos, sulfitos, resíduos

) [Pretorius, 2000]. Os sinais de natureza física incluem a

As respostas adaptativas

udança dos padrões de transcrição, a modificação

lteração dos padrões de gemulação e de crescimento polarizado


r numerosos estudos que têm realçado a importância e a


inho podem pertencer à flora da uva



., 2002]. Embora sejam encontrados

Saccharomyces, e,

S. bayanus são as grandes

diversidade de espécies de levedura nas uvas tem sido uma área de investigação

explorada por diversos autores [Fleet, 1993; Kunkee & Bisson, 1993; Martini et al., 1996;

., 2005; Raspor et al., 2006;

., 2007]. Alguns estudos sugerem que à superfície da uva se encontra uma

., 1982], enquanto outros

., 2002]. São 3 as espécies

INTRODUÇÃO GERAL

25

principais encontradas nas uvas: Hanseniaspora uvarum (forma anamórfica: Kloeckera

apiculata), Metschnikowia pulcherrima (forma anamórfica: Candida pulcherrima) e Candida

stellata. Segundo alguns autores, o género Hanseniaspora é normalmente o que domina a

superfície do bago de uva [Beltran et al., 2002; Combina et al., 2005; Hierro et al., 2006],

enquanto outros indicam que o género dominante é Candida [Torija et al., 2001; Clemente-

Jimenez et al., 2004]. O factor chave que determina as espécies presentes na superfície das

uvas parece ser o estado de sanidade com que se encontra a uva, nomeadamente a

ausência ou presença de lesões na película. No caso de ruptura da película do bago, quer

por lesões físicas (mediadas por insectos, aves ou espécies fúngicas invasivas), quer por

enrugamento (provocado pela desidratação do bago), pode ocorrer um enriquecimento em

leveduras ascomicetas (Hanseniaspora, Candida e Metschnikowia) [Parish & Carroll, 1985;

Fleet et al., 2002; Prakitchaiwattana et al., 2004], que vão dominar a flora superficial do bago

à medida que a uva amadurece [Rosini et al., 1982; Prakitchaiwattana et al., 2004]. Pode

ainda ocorrer a presença de outros géneros de leveduras, apesar de este tema não ser

consensual.

Durante o amadurecimento da uva ocorre uma modificação das espécies que estão

presentes na superfície das uvas, dominando, numa primeira fase, as leveduras

basidiomicetas (Aureobasidium, Cryptococcus, Rhodosporidium e Rhodotorula), enquanto

no final do amadurecimento as leveduras basidiomicetas são substituídas por ascomicetas

(Hanseniaspora, Candida e Metschnikowia) [Bisson & Joseph, 2009]. Nos diversos estudos

existentes em que as uvas foram colhidas de vinhas de diferentes regiões no mundo, as

diferenças observadas ao nível das espécies que dominam a superfície podem ser

atribuídas a factores como o clima, a altitude, os vectores existentes (e.g. insectos

voadores), a variedade da uva, a sanidade do bago e as práticas na vinha [Bisson & Joseph,

2009].

Um número reduzido de estudos tem sido dedicado à flora existente nas superfícies de

equipamentos e do material utilizado em adega. Foi demonstrado por alguns autores que a

flora de adega representa uma fonte significativa de inoculação do mosto e do vinho [Fleet &

Heard, 1993; Renouf et al., 2007]. O material utilizado e as práticas de sanificação e de

suplementação de nutrientes determinam a flora de adega. Dos estudos realizados às

superfícies dos barris, há a indicação da presença de uma elevada concentração de

Saccharomyces, enquanto Candida, Cryptococcus e Brettanomyces estão presentes em

concentração baixa [Renouf et al., 2006a, 2007]. As bactérias e bolores podem ser

igualmente encontrados à superfície do equipamento [Picco & Rodolf, 2004].

Os estudos realizados à flora existente durante a fermentação vinária permitiram dividir a

fermentação em: inoculada ou espontânea. A fermentação espontânea é a que é conduzida

pela flora indígena das uvas e da adega. Numerosos estudos têm sido dedicados à

INTRODUÇÃO GERAL

26

persistência da flora não-Saccharomyces durante as fermentações espontâneas [Torija et

al., 2001; Beltran et al., 2002; Hierro et al., 2006; Xufre et al., 2006] e o crescimento

significativo destas espécies durante as fermentações tem vindo a ser associado à produção

de vinhos de baixo carácter e resultantes de fermentações amuadas [Bisson, 1999]. Todos

estes estudos relativos à flora de não-Saccharomyces demonstraram um padrão

semelhante de evolução das espécies de fermentação. No início do processo, as espécies

presentes na superfície da uva (leveduras basidiomicetas e oxidativas ascomicetas)

parecem ser as que dominam a fermentação. À medida que a fermentação prossegue, os

níveis destas leveduras diminuem, ao passo que os níveis de Saccharomyces aumentam

[Fleet & Heard, 1993]. No final de fermentação, Saccharomyces é o principal género

encontrado e possivelmente o único capaz de ser isolado. A biodiversidade de estirpes

vínicas do género Saccharomyces durante a fermentação alcoólica resulta provavelmente

dos processos de selecção natural e de mutagénese aleatória [Bisson & Joseph, 2009].

A origem de S. cerevisiae é ainda objecto de alguma discussão, muito embora já se

tenha descoberto que esta espécie se encontra praticamente ausente do bago de uva e dos

solos da vinha [Martini & Vaughan-Martini, 1990]. Alguns autores propõem que S. cerevisiae

tenha como habitat “natural” as plantas produtoras de frutos [Mortimer & Polsinelli, 1999;

Sniegowski et al., 2002]. Por outro lado, existem outros autores que postulam que S.

cerevisiae é uma espécie domesticada originada a partir da espécie selvagem S. paradoxus

largamente disseminada pelo mundo, associada a insectos, exsudados de árvores e a

extractos de planta fermentescíveis [Naumov, 1996]. A ocorrência de S. cerevisiae na vinha

seria, portanto, o resultado de uma transferência espacial da adega para a vinha, via

insectos [Naumov, 1996].

Loureiro e Malfeito-Ferreira (2003) atribuíram uma classificação em grupos empíricos das

leveduras associadas ao vinho, de acordo com as suas propriedades tecnológicas [Loureiro

& Malfeito-Ferreira, 2003]. Leveduras oxidativas basidiomicetas, sem interesse ao nível

enológico, como Sporobolomyces, Cryptococus, Rhodotorula, Filobasidium spp. e

Aureobasidium pullulans, dominam o ambiente vínico (solo, madeira, folhas e bagos de

uvas) [Davenport, 1974; Sabate et al., 2002; Subden et al., 2003; Prakitchaiwattana et al.,

2004; Renouf et al., 2005]. Nas espécies pertencentes aos ascomicetas estão inseridas as

leveduras apiculadas fracamente fermentativas (Hanseniaspora e Kloeckera spp.) e as

leveduras oxidativas ascomicetas (principalmente Candida, Pichia e Metschnikowia spp.),

presentes em bagos maduros sãos [Davenport, 1974; Sabate et al., 2002; Jolly et al., 2003;

Subden et al., 2003; Prakitchaiwattana et al., 2004; Renouf et al., 2005]. O último grupo

inclui as espécies fermentativas contaminantes da uva, que podem representar uma ameaça

para a alteração do vinho, principalmente nas situações em que a película do bago da uva

está danificada, com saída de mosto para a superfície do bago [Mortimer & Polsinelli, 1999;

INTRODUÇÃO GERAL

27

Barata et al., 2008]. Neste grupo estão compreendidos Torulaspora spp.,

Zygosaccharomyces spp. e Dekkera spp. [Fleet et al., 2002].

1.5. Objectivos da dissertação

Este trabalho teve como objectivo geral avaliar, de uma forma integrada, parâmetros

fisiológicos determinantes na manutenção da viabilidade celular da estirpe Saccharomyces

cerevisiae ISA 1000, acompanhando a sua evolução ao longo do processo de fermentação

vinária a duas temperaturas (15ºC e 30ºC).

Especificamente avaliaram-se vários parâmetros relacionados com a homeostase de

protões em pontos definidos ao longo de fermentação de mosto de uva branca,

nomeadamente:

� pH intracelular;

� Efluxo de H+ através da membrana plasmática;

� Permeabilidade da membrana a H+.

Paralelamente comparou-se o comportamento de S. cerevisiae ISA 1000 com o da

mesma estirpe em plena fase exponencial de crescimento (D.O.640nm 1), cultivada em

condições laboratoriais comuns (meio mineral, 2% (p/v) glucose).

MATERIAL E MÉTODOS

28

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Microrganismo

O microrganismo utilizado neste estudo foi a estirpe ISA 1000 de Saccharomyces

cerevisiae, pertencente à Colecção de Leveduras do Instituto Superior de Agronomia. Esta

estirpe foi isolada a partir de uma preparação comercial de levedura seca activa para

vinificação, de origem francesa, designada comercialmente por FERMIVIN®.

Para a execução dos ensaios de determinação do pH intracelular foi ainda utilizada uma

segunda estirpe de S. cerevisiae W303-1A (MATa his3 leu2 trp1 ura3 ade2) [Wallis et al.,

1989].

2.2. Meios de cultura

Para a manutenção das culturas utilizou-se o meio YPD (“Yeast extract Peptone

Dextrose”), com a seguinte composição: glucose 2% (p/v), peptona 1% (p/v), extracto de

levedura 0,5% (p/v), agar 2% (p/v), em água desmineralizada pH 5,6. Este meio de cultura

foi igualmente utilizado para a contagem em placas das unidades formadoras de colónias

(UFC).

Durante o presente trabalho realizaram-se ensaios em paralelo com células cultivadas

em meio mineral K [van Uden, 1967] (Anexo III) e em mosto de uva branca proveniente das

vindimas de 2008 das vinhas do Instituto Superior de Agronomia.

Nos casos em que se cultivou a estirpe S. cerevisiae W-303, suplementou-se o meio K

com uracilo (0,08 g/L), adenina (0,08 g/L), histidina (0,08 g/L), triptofano (0,32 g/L) e leucina

(0,16 g/L), tendo em consideração as marcas auxotróficas da estirpe (Anexo III).

Relativamente ao mosto de uvas brancas, nas etapas preliminares de preparação foi-lhe

adicionado 50 mg/l de SO2 e 10 mg/l de enzima clarificante Novoclair® Speed. Foi,

igualmente, sujeito a um processo de decantação de 2 dias, a 5ºC, com o objectivo de lhe

serem removidos os sólidos de maiores dimensões.

O processo de conservação e esterilização do mosto teve como premissa a preservação

máxima das suas características originais, executando procedimentos que visassem a

minimização da alteração por factores de deterioração, nomeadamente, através da

minimização da exposição ao O2, à luz e a temperatura elevadas.

Foram-nos disponibilizados 100 L de mosto pelo Instituto Superior de Agronomia, que foi

dividido em alíquotas de aproximadamente 1 L, colocadas em sacos de plástico

devidamente selados, aos quais foi retirado o O2. Estes sacos foram colocados dentro de

outros, de forma a reforçar a barreira mosto/O2, bem como a evitar possíveis condensações

de água que alterassem a sua composição e foram congelados na câmara a -80ºC.

MATERIAL E MÉTODOS

29

Sempre que necessário procedeu-se à descongelação à temperatura ambiente, durante a

noite e ao abrigo da luz, da fracção de mosto a utilizar. Posteriormente procedeu-se à sua

esterilização, de acordo com a seguinte metodologia: centrifugação (Eppendorf 5810R

Centrifuge) a 12000 g, a 4ºC, com o objectivo de serem removidos, tanto quanto possível, os

sólidos de maiores dimensões presentes em suspensão, seguida de filtrações sucessivas

com membranas de poros progressivamente menores, começando por uma membrana de

1,2 µm (Whatman GF/C), passando para uma membrana de 0,45 µm (Millipore TYPE HA),

terminando numa filtração esterilizante com membrana de 0,22 µm (Millipore TYPE GSWP).

O mosto estéril foi conservado a 4ºC, protegido da luz.

2.3. Condições de crescimento e recolha de amostras

2.3.1. Manutenção das culturas

As estirpes foram repicadas para tubos com meio sólido inclinado (meio YPD, secção

2.2) e incubadas em estufa, durante 24 a 48h, a 28ºC, após o qual foram mantidas a 4ºC.

Executou-se este procedimento em todos os momentos que antecederam os ensaios, de

forma a manter a cultura fresca e/ou a obter suficiente biomassa para os inóculos

necessários.

2.3.2. Quantificação de biomassa

2.3.2.1. Acompanhamento das culturas

O acompanhamento do crescimento celular realizou-se através da leitura da densidade

óptica das culturas, a 640 nm (D.O.640nm), utilizando-se um espectrofotómetro Ultrospec 2100

pro (Amersham Biosciences®). As amostras foram retiradas em intervalos de tempo

adequados e diluídas com água desmineralizada sempre que a D.O.640nm excedeu o valor de

0,45, de forma a assegurar a proporcionalidade entre a D.O.640nm e a biomassa presente.

2.3.2.2. Peso seco

Para determinar a quantidade de biomassa presente nos ensaios de medição das

velocidades do efluxo protónico, permeabilidade aos H+ da membrana plasmática,

determinou-se o peso seco contido num volume de 100 µL de suspensão, utilizando

pequenas folhas de alumínio pré-pesadas. Estas foram colocadas numa estufa a 80ºC,

durante 24 horas. Após este período, foram colocadas num excicador e deixou-se arrefecer

até atingir a temperatura ambiente, pesando-se posteriormente numa balança analítica.

Nos ensaios de determinação do pH intracelular filtraram-se determinados volumes de

suspensão de células, utilizando membranas filtrantes Millipore TYPE GSWP de porosidade

0,22 µm, pré-taradas, de forma a obter um peso seco celular mínimo de 5 mg/membrana.

MATERIAL E MÉTODOS

30

2.3.3. Preparação do pré-inóculo

A preparação do pré-inóculo, foi realizada por transferência de uma ansada de biomassa

fresca (proveniente de um tubo com meio inclinado) para um balão de Erlenmeyer de 200

mL, contendo 100 mL de meio K ou de mosto estéril, conforme a experiência subsequente.

As culturas foram incubadas, com agitação orbital (Shel Lab SI Series), a 130 rpm, a 28ºC,

durante aproximadamente 24 horas, de modo a manter as células em fase exponencial no

momento da sua colheita. Preparou-se um pré-inóculo anteriormente a cada ensaio com o

objectivo de reavivar as células, diminuindo o choque que lhes é causado quando se

procede à sua transferência entre meios de cultura com estados físicos diferentes.

2.3.4. Ensaios em meio mineral

Nos ensaios em meio mineral, inoculou-se 200 mL de meio K em balões de Erlenmeyer

de 500 mL, a partir de uma cultura em crescimento exponencial (pré-inóculo). A quantidade

de células a inocular nestes balões foi controlada através da D.O.640nm, (D.O.640nm inicial

≈0,05). De seguida, incubaram-se as células com agitação magnética a 130 rpm, a 15ºC ou

30ºC (conforme o ensaio), até atingir D.O.640nm 1.

2.3.5. Ensaios em mosto estéril

No que respeita às inoculações em mosto estéril, as células foram contadas em

hemocitómetro (após crescimento do pré-inóculo até fase exponencial) e procedeu-se à

inoculação de 1 x 106 células/mL de mosto (concentração habitualmente utilizada nas

adegas a partir de inóculos comerciais), em 800 mL de mosto estéril, contidos num balão de

Erlenmeyer de 1000 mL, previamente termostatizado à temperatura do ensaio a realizar

(15ºC ou 30ºC). De seguida, incubou-se a cultura a 15ºC ou 30ºC, com agitação magnética

a 130 rpm e ausência de arejamento suplementar, durante todo o período de fermentação.

2.3.6. Pontos de amostragem

Ao longo dos vários ensaios realizados em mosto recolheram-se células nos seguintes

pontos de amostragem:

a. Para 15ºC colheram-se células em 6 pontos, correspondentes a 6 fases diferentes

de crescimento: início da fase exponencial (P1), meio da fase exponencial (P2),

final da fase de exponencial (P3), início da fase estacionária (P4), meio da fase

estacionária (P5) e final de fermentação (P6).

b. Para 30ºC, dado a quase ausência de fase de latência, colheram-se células em 5

pontos, correspondentes a 5 fases diferentes de crescimento: meio da fase

MATERIAL E MÉTODOS

31

exponencial (P1), final da fase de exponencial (P2), início da fase estacionária

(P3), meio da fase estacionária (P4) e final de fermentação (P5).

2.4. Ensaios preliminares de crescimento

Com vista à determinação da duração da fase de latência e do tempo de duplicação das

culturas em meio mineral e em mosto, bem como à determinação do período de

fermentação e à selecção dos pontos de amostragem para recolha de células usadas nos

restantes ensaios, realizaram-se ensaios preliminares de crescimento nos dois meios de

cultura utilizados ao longo do trabalho.

2.4.1. Ensaios preliminares em meio mineral

Os ensaios em meio mineral para as duas estirpes de S. cerevisiae (ISA 1000 e W-303)

foram executados conforme descrito na secção 2.3., tendo-se colhido amostras para

medição de absorvância a 640nm ao longo do tempo, como regra de hora a hora.

2.4.2. Ensaios preliminares em mosto

Nos ensaios de crescimento em mosto estéril, para além de se ter acompanhado a

evolução das D.O.640nm, retiraram-se amostras para medir igualmente a evolução de

parâmetros físico-químicos do mosto e de parâmetros de crescimento da estirpe S.

cerevisiae ISA 1000.

2.4.2.1. Determinação dos parâmetros físico-químicos

Relativamente aos parâmetros físico-químicos do mosto, foi medido o pH extracelular por

leitura directa de uma amostra no eléctrodo de pH (PHM220, Lab pH METER), a massa

volúmica do mosto (pesando-se, em duplicado, volumes rigorosamente conhecidos, 1000 µL

e 500 µL, de sobrenadante recolhido após centrifugação, 5 minutos a 14000 rpm, de

amostra numa centrífuga de bancada) e ºBrix por leitura directa, recorrendo a um

refractómetro (Portable Refractometer Brix/ATC).

O teor em glucose no mosto, durante o processo de fermentação, foi seguido

qualitativamente recorrendo às tiras-teste DIABUR-TEST® 5000 (para controlo da

fermentação, considerando-se que esta terminou quando se observou o esgotamento da

glucose). Para além disso, recolheram-se amostras de sobrenadante que, após terem sido

centrifugadas durante 5 minutos a 14000 rpm, foram utilizadas para determinação mais fina

das concentrações de glucose (g/L) e de etanol (g/L).

MATERIAL E MÉTODOS

32

2.4.2.2. Determinação dos parâmetros de crescimento

Paralelamente, determinou-se o peso seco de acordo com o descrito no ponto 2.3.2.2. e

o número de UFC/mL (determinado através do método de espalhamento em placa),

procedendo-se ao espalhamento de 100 µL de suspensão de células em placas de meio

YPD e incubação a 28ºC, durante 48 a 72 horas. Após este período contou-se o número de

colónias por placa. Sempre que necessário foram efectuadas diluições, de forma a garantir

que o número de colónias se situasse entre as 30 – 300 colónias / placa. As amostras foram

plaqueadas em triplicado.

2.5. Determinação do teor em glucose presente no mosto

2.5.1. Base do método

A determinação de glucose consumida ao longo das fermentações vinárias, conduzidas a

15ºC e 30ºC, foi realizada pelo método UV (BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM,

Roche, cat. 10.716.251.035).

Este método baseia-se num conjunto de duas reacções enzimáticas:

(a) Na primeira, a D-glucose é fosforilada, na presença da enzima hexocinase (HK) e

de adenosina-5’-trifosfato (ATP), a D-glucose-6-fosfato (G-6-P), com consequente

formação de adenosina-5’-difosfato (ADP).

(b) Na segunda, na presença da enzima glucose-6-fosfato desidrogenase (G6P-DH),

a glucose-6-fosfato é oxidada pelo dinucleotídeo fosfatado de nicotinamida –

adenina (NADP) a 6-fosfoglucono-∂-lactona, com formação de dinucleotídeo

reduzido de nicotinamida – adenina (NADPH).

A quantidade de NADPH formada na reacção (2) é estequiometricamente equivalente à

quantidade de D-glucose consumida na reacção (1). O aumento da quantidade de NADPH

formada é medido através da leitura de absorvância a 340nm.

2.5.2. Procedimento experimental

Durante o ensaio foram utilizadas as seguintes soluções:

Solução 1: 7,2g de mistura em pó (tampão trietanolamina, pH 7,6, NADP, 110mg; ATP, 260mg; sulfato de magnésio) com 45 mL de água redestilada. Solução 2: 1,1 mL de hexocinase, 320U; glucose-6-fosfato desidrogenase, 160U.

D-glucose + ATP G-6-P + ADP HK (1)

G-6-P + NADP+ 6-fosfoglucono-∂-lactona + NADPH + H+ G6P-DH

(2)

MATERIAL E MÉTODOS

33

(a)

Fase de crescimento Factor de diluição

Inocula ção 500

Início de exponencia l 500

Meio de exponencia l 500

Final de exponencia l 500

Início de esta cionária 500

Meio de estacionária 100

Final de fermentação 1

(b)


Inoculação 500


Fina l de exponencia l 500

Início de es tacionária 500

Meio de es tacionária 100

Fina l de fermentação 1

Foram pipetados 500µL da solução 1, 50µL da amostra, 950µL de água destilada para

uma cuvete e agitou-se. Após 3 minutos registou-se a absorvância a 340nm e adicionou-se

20µL da solução 2. Agitou-se novamente. Após 15 minutos leu-se novamente a absorvância.

Sempre que necessário diluiu-se a amostra, de forma a ficar dentro dos limites do método

(Tabela 3).

Tabela 3: Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC.

onde,

∆A – Variação de absorvância A1 – Primeiras absorvâncias lidas da amostra/branco A2 – Segundas absorvâncias lidas da amostra/branco

onde,

c – Concentração da amostra (g/L) V – Volume final: 1,520 mL MW – Massa molecular da glucose: 180,16g/mol ε – coeficiente de extinção do NADH: 6,3 L/(mmol.cm) ν – Volume da amostra: 0,05 mL

2.6. Determinação do teor em etanol presente no mosto


A determinação do etanol produzido ao longo das fermentações vinárias, conduzidas a

15ºC e 30ºC, foi realizada pelo método UV (BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM,

Roche, cat. 0.176.290).

Este método baseia-se num conjunto de duas reacções enzimáticas:

∆A = (A2 - A1)amostra – (A2 – A1)branco (3)

c = ε.ν.1000

V. MW . ∆A (4)

MATERIAL E MÉTODOS

34

(a)


Inocul ação 10

Iníci o de exponencia l 100


Fina l de exponencia l 1000

Iníci o de es taci onári a 5000

Meio da es taci onári a 5000


(b)


Inocul ação 10

Meio de exponenci al 1000

Fina l de exponenci al 1000

Iníci o de es tacionária 5000

Meio da estacionária 5000


(a) Na primeira, o etanol é oxidado a acetaldeído, através da acção do dinucleotídeo de

nicotinamida – adenina (NAD), na presença da enzima álcool desidrogenase (ADH).

O equilíbrio desta reacção tende naturalmente para o 1º membro (etanol e NAD). No

entanto, em condições alcalinas o equilíbrio pode ser completamente deslocado para o 2º

membro.

(b) Na segunda, o acetaldeído formado na reacção (6) é quantitativamente oxidado a

acido acético, na presença da enzima aldeído desidrogenase (Al-DH).

A quantidade de NADH formada na reacção (6) é estequiometricamente equivalente à

quantidade de etanol consumido na reacção (5). O aumento da quantidade de NADH

formado é medido através da leitura de absorvância a 340nm.


Durante o ensaio foram utilizadas as seguintes soluções:

Mistura 2: Pastilha (NAD, 4mg; aldeído desidrogenase, 0,8U) com 3mL de tampão disulfato de potássio a pH 9. Suspensão 3: ADH, 7000U.

Foram pipetados 1500µL da mistura 2 e 50µL de amostra para cuvetes, taparam-se com

parafilme e agitaram-se. Após 3 minutos registou-se a absorvância a 340nm e adicionaram-

se 25µL da suspensão 3, tapando e agitando novamente as cuvetes. Após 10 minutos leu-

se novamente a absorvância.

Sempre que necessário diluiu-se a amostra de modo a ficar dentro dos limites do método

(Tabela 4).

Tabela 4: Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC.

(5) Etanol + NAD+ Acetaldeído + NADH + H+ ADH

Ácido acético + NADH + H+ (6) Acetaldeído + NAD+ + H2O Al-DH

MATERIAL E MÉTODOS

35

Foram utilizadas as seguintes fórmulas:

onde,

∆A – Variação de absorvância A1 – Primeiras absorvâncias lidas da amostra/branco A2 – Segundas absorvâncias lidas da amostra/branco

onde,

c – Concentração da amostra (g/L) V – Volume final: 1,575 mL MW – Massa molecular do etanol: 46,07g/mol ε – coeficiente de extinção do NADH: 6,3 L/(mmol.cm) ν – Volume da amostra: 0,05 mL

2.7. Determinação do pH intracelular


O pH intracelular (pHin) foi determinado pelo método descrito por Rottenberg (1979) que

consiste na medição da distribuição relativa de um ácido orgânico fraco marcado

radioactivamente com 14C entre os meios intracelular e extracelular das células.

Este método baseia-se na utilização de ácidos ou bases cujas espécies neutras se

difundem através da membrana, sendo esta impermeável às respectivas formas iónicas.

Utilizam-se ácidos quando o pH intracelular é superior ao pH externo.

Sempre que um ácido (AH) atinge uma situação de equilíbrio no interior (in) e no exterior

(ex) da célula (AHin = AHex) e atendendo a que as suas moléculas se dissociam em ambos

os lados da membrana (assumindo que a constante de dissociação – Kd – não varia),

obtém-se:

no equilíbrio:

se o pH extracelular (pHex) > pK + 1, a maior parte do ácido está na forma ionizada nos dois

lados da membrana e a medida da razão da distribuição do ácido permite calcular o ∆pH, de

acordo com a equação anterior. Caso contrário, uma fracção significativa do ácido

∆A = (A2 - A1)amostra – (A2 – A1)branco (7)

c = ε . ν . 2 . 1000

V. MW . ∆A (8)

(10) pHin – pHex = ∆pH = log [A-]in

[A-]ex

(9) Kd = [H+]in [A

-]in

[AH]in

[H+]ex [A-]ex

[AH]ex =

MATERIAL E MÉTODOS

36

encontrar-se-á na forma não ionizada e, tendo em conta que a concentração total do ácido

(AT) é expressa por: AT = A- + AH, obtém-se, então, no equilíbrio:

onde, ATin e AT

ex são, respectivamente, as concentrações totais interna e externa do ácido

propiónico e Kd a sua constante de dissociação. Resolvendo a equação (11) em ordem ao

pH intracelular, vem:

a qual permite estimar o valor do pH intracelular.

2.7.2. Características das soluções utilizadas

Para a execução deste ensaio foram preparadas soluções radioactivas de [1– 14C] ácido

propiónico (NENTM) e de [7-14C] ácido benzóico (NENTM) (utilizado com a mesma

metodologia que o anterior), tendo por base as suas características iniciais:

(a) [1- 14C] ácido propiónico: quantidade de radioactivo presente em 0,25 mL de etanol - 9,25 MBq = 0,25 mCi ; actividade especifica - 2,0 GBq / mmol = 54,10 mCi / mmol.

(b) [7- 14C] ácido benzóico: quantidade de radioactivo presente no composto sólido - 18,5 MBq = 0,5 mCi ; actividade especifica - 588,3 MBq / mmol = 15,90 mCi / mmol.

Para a dissolução do [7 - 14C] ácido benzóico foi necessária a utilização de uma solução

de hidróxido de sódio (NaOH) 10 µM, uma vez que este composto radioactivo demonstrou

ser insolúvel a 25ºC em água.

Uma vez feitas as soluções radioactivas procedeu-se à contagem preliminar de CPM de 5

µL de cada uma das soluções em 5 mL de líquido de cintilação. O resultado foi de ≈ 7,0 x

106 CPM para o [1 - 14C] ácido propiónico e ≈ 1,0 x 107 CPM para o [7 - 14C] ácido benzóico.

Como tal, dadas as contagens preliminares terem sido elevadas, procedeu-se a uma

diluição de 1:3 (v/v) dos respectivos compostos, tendo sido estas as soluções utilizadas nos

ensaios.

(11) 1

1

ATin

=

1

[H+]in

+ Kd

[H+]ex

+ AT

ex 1

Kd

1

[H+]ex

1

Kd

ATin

ATex

1

Kd

(12) + - pHin = log

MATERIAL E MÉTODOS

37


O pH intracelular foi determinado nas culturas de células cultivadas às duas temperaturas

de estudo (15ºC e 30ºC), para os diferentes pontos correspondentes a diferentes fases de

crescimento (referidos na secção 2.3.6.).

2.7.3.1. Ensaios em meio mineral

Nos ensaios em meio mineral, cultivaram-se as células em 200 mL de meio K, em balões

de Erlenmeyer de 500mL, até se atingir uma D.O.640nm ≈ 1. Fez-se uma divisão equitativa da

cultura (100mL) para 2 balões de Erlenmeyer de 500mL. Procedeu-se à marcação

radioactiva de um dos balões (balão A) com 5 µL de composto radioactivo (Cf < 1µM),

mantendo-se o outro balão não marcado (balão B). Não foi necessário adicionar ácido não

radioactivo ao segundo balão (designado de balão “frio”), pois a concentração final da forma

dissociada no primeiro balão (designado de balão “quente”) era desprezável (Cf < 1µM), não

interferindo no valor de pH extracelular. Incubaram-se os dois balões nos banhos

termostatizados à temperatura de 15ºC ou de 30ºC, conforme a experiência, com agitação

magnética fraca (cerca de 130 rpm). O período de incubação máximo foi de 120 minutos a

30ºC e 210 minutos a 15ºC, com vista a garantir que se atingia o equilíbrio da forma não

dissociada do composto radioactivo entre os meios extracelular e intracelular. Recolheram-

se amostras ao fim de 60, 90 e 120 minutos a 30ºC e ao fim de 90, 120, 150, 180 e 210

minutos a 15ºC, dos dois balões:

Balão A – Determinação da concentração extracelular e intracelular de ácido fraco Balão B – Determinação do pH extracelular e do peso seco Este procedimento foi realizado paralelamente com [1 - 14C] ácido propiónico e [7 - 14C]

ácido benzóico para as estirpes S. cerevisiae ISA 1000 e W-303.

A cada tempo de incubação mencionado, recolheram-se células dos dois balões, para as

seguintes determinações:

Determinação do pH extracelular: do balão B recolheu-se um determinado volume calculado

de suspensão de células para um copo, medindo-se o pH extracelular directamente no

eléctrodo (PHM220, Lab pH METER) previamente calibrado.

Determinação do peso seco: filtrou-se um determinado volume de suspensão recolhido do

balão B, utilizando membranas Millipore TYPE GSWP, com poro de 0,22 µm e procedeu-se

conforme o descrito em 2.3.2.2.. O volume recolhido teve em conta o facto de se pretender

manter ≈ 5 mg de células em cada membrana pesada.

MATERIAL E MÉTODOS

38

Determinação da concentração total de ácido radioactivo no meio extracelular: do balão

marcado com ácido radioactivo (balão A) pipetou-se 500 µL da suspensão para dois tubos

(2 mL) eppendorf de rosca e centrifugou-se durante 5 minutos, a 14.000 rpm, numa

centrífuga de bancada. Recolheu-se 100 µL do sobrenadante para dois frascos com 5 mL de

líquido de cintilação Optiphase “HiSafe” 2 (Perkin Elmer).

Determinação da concentração total de ácido radioactivo no meio intracelular: foi realizada

através da determinação do número de CPM existente num volume de células conhecido

(Tabela 5), recolhido por filtração em membrana com pressão negativa. Lavou-se o sistema

de filtração (Figura 6) com água desmineralizada gelada, com o auxílio de uma membrana

GF/B (Whatman). De seguida, filtrou-se um determinado volume de suspensão de células

recolhidas do balão A, com o auxílio de uma membrana GF/C (Whatman), previamente

humedecida com água gelada. Após a filtração, lavou-se a membrana com 5 mL de água

gelada e recolheu-se a membrana para um tubo com 5 mL de líquido de cintilação

Optiphase “HiSafe” 2 (Perkin Elmer). Fizeram-se duplicados de todas as determinações.

A contagem da radioactividade das amostras foi efectuada num contador Beckman LS

6000 LL, programável para leituras de carbono, com erro inferior a 1%.

Figura 6: Sistema de filtração em vácuo utilizado na determinação da concentração de composto radioactivo presente no meio intracelular.

2.7.3.2. Ensaios em mosto

As determinações do pH intracelular para as várias fases de fermentação em mosto de

uva branca foram realizadas às 2 temperaturas e para a estirpe S. cerevisiae ISA 1000.

O procedimento utilizado foi semelhante ao descrito para os ensaios com células

cultivadas em meio K, com as seguintes modificações:

1) As células foram cultivadas em mosto, tendo-se recolhido amostras para a

determinação do pHin nos pontos de amostragem definidos (secção 2.3.6.).

MATERIAL E MÉTODOS

39

2) O volume de células recolhido a cada fase de fermentação foi calculado de forma a

utilizar em cada ensaio uma quantidade de biomassa seca aproximadamente igual

(≈5 mg/mL) (Tabela 5).

3) Utilizou-se apenas [7-14C] ácido benzóico, tendo-se adicionado ao balão A um

determinado volume de ácido marcado (Tabela 5). A Cf do [7-14C] ácido benzóico,

nestes casos, nem sempre foi inferior a 1µM, no entanto, não foi necessário adicionar

ao balão “frio” o mesmo volume de ácido benzóico (não radioactivo), uma vez que se

tiver em consideração que o pH do mosto é de ≈ 3 e o pKa do ácido benzóico é de ≈

4,2, a forma não dissociada estará em predominância, não influindo, portanto, no pH

extracelular.

4) Incubaram-se os balões A e B, por 120 minutos a 30ºC e 210 minutos a 15ºC. Nos

ensaios a 30ºC recolheram-se amostras ao fim de 60, 90 e 120 minutos, enquanto a

15ºC os tempos de amostragem foram 90, 120, 150, 180 e 210 minutos de forma a

garantir o estabelecimento do equilíbrio.

5) O volume filtrado dos balões A e B para determinação da quantidade de ácido

radioactivo e de peso seco, respectivamente, diferiu em função da D.O.640m da cultura

em mosto correspondente a cada fase de fermentação, muito embora se tenha

adoptado filtrar 1 mL para todos casos em que os volumes determinados tiveram um

valor inferior a 1mL (Tabela 5).

Tabela 5: Dados utilizados nos ensaios de pHin.

Fase de crescimentoVolume recolhido

(mL)

Volume balão A

(mL)

Volume de ác. benzóico*

adicionado (µL)

[ác. benzóico] no

balão A (µM)

Volume filtrado

(mL)

Início de exponencial 300 150 7,5 1,05 10,00

Meio de exponencial 150 75 15 4,19 2,50

Final de exponencial 111 56 20 7,55 1,00

Início de estacionária 107 53 20 7,86 1,00

Meio de estacionária 106 53 20 7,89 1,00

Final de fermentação 106 53 20 7,92 1,00

Fase de crescimentoVolume recolhido

(mL)

Volume balão A

(mL)

Volume de ác. benzóico*

adicionado (µL)

[ác. benzóico] no

balão A (µM)

Volume filtrado

(mL)

Meio de exponencial 220 110 5,5 1,05 10,00

Final de exponencial 130 65 13 4,19 2,50

Início de estacionária 105 53 20 7,95 1,00

Meio de estacionária 104 52 20 8,08 1,00

Final de fermentação 104 52 20 8,10 1,00

30ºC

15ºC

2.8. Avaliação do efeito do etanol sobre a


A permeabilidade passiva a protões mediu

suspensão de células, durante um determinado perí

apresentado um registo típico da variação do pH extracelular de uma suspensão

de levedura quando se adiciona um pulso de ácido.

A taxa específica de influxo foi calculada com base na variação da quantidade de H

unidade de tempo, tendo em consideração a velocidade do papel registador e os dados

obtidos para a calibração do sinal em cada ensaio e o peso seco correspondente ao volume

de células utilizado (determinado pelo método descrito em 2.3.2.2.)

Estas experiências foram realizadas na presença de 2

antimicina (0,4 mg/mL) para minimizar os movimentos de protões resultantes da actividade

da H+-ATPase membranar.


A medição do movimento de protões

Figura 8, constituído por um eléctrodo de pH de vidro combinado

um potenciómetro PHM82, Radiometer. Este, por sua vez, estava ligado a um registador

linear BBC SE 460, Goerz Metrawatt. Entre o potenciómetro e o registador, foi incorporado

um dispositivo de amplificação de sinal, construído nas oficinas do Instituto Gulbenkian de

Ciência. Este dispositivo permitiu efectuar um ajuste do potencial basal, o que p

realizar, no registador, a medição da variação da concentração de protões, com elevada

sensibilidade.

MATERIAL E MÉTODOS

Avaliação do efeito do etanol sobre a permeabilidade da membrana

Base do método

A permeabilidade passiva a protões mediu-se com base no registo do pH de uma

las, durante um determinado período de tempo.

apresentado um registo típico da variação do pH extracelular de uma suspensão

de levedura quando se adiciona um pulso de ácido.

A taxa específica de influxo foi calculada com base na variação da quantidade de H


ção do sinal em cada ensaio e o peso seco correspondente ao volume

de células utilizado (determinado pelo método descrito em 2.3.2.2.).

Figura 7: Variação de pH de uma suspensão aquosa de cerevisiae ISA 1000 (100 mg/mL) após uma acidificação rápida de pH 5 para pH 4.

Estas experiências foram realizadas na presença de 2-desoxi-D-glucose (

) para minimizar os movimentos de protões resultantes da actividade

Procedimento experimental

ovimento de protões foi efectuada através do dispositivo representado na

, constituído por um eléctrodo de pH de vidro combinado (Mettler Toledo


BBC SE 460, Goerz Metrawatt. Entre o potenciómetro e o registador, foi incorporado


Ciência. Este dispositivo permitiu efectuar um ajuste do potencial basal, o que p


Figura 8: Representação do equipamento utilizado na medição da velocidade do movimento de Hatravés da membrana plasmática de cerevisiae

MATERIAL E MÉTODOS

40

rana a H+

se com base no registo do pH de uma

odo de tempo. Na Figura 7 é

apresentado um registo típico da variação do pH extracelular de uma suspensão de células

A taxa específica de influxo foi calculada com base na variação da quantidade de H+ por


ção do sinal em cada ensaio e o peso seco correspondente ao volume

Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. ISA 1000 (100 mg/mL) após uma acidificação

glucose (0,2 M) e

) para minimizar os movimentos de protões resultantes da actividade

foi efectuada através do dispositivo representado na

Mettler Toledo), ligado a


BBC SE 460, Goerz Metrawatt. Entre o potenciómetro e o registador, foi incorporado


Ciência. Este dispositivo permitiu efectuar um ajuste do potencial basal, o que possibilitou


Figura 8: Representação do equipamento utilizado na medição da

locidade do movimento de H+ através da membrana plasmática de S.

cerevisiae ISA 1000.

MATERIAL E MÉTODOS

41

2.8.2.1. Preparação das suspensões de células

Para cada ensaio realizado para avaliação do influxo de protões através da membrana

plasmática foram utilizadas suspensões concentradas de células em água, preparadas de

forma a obter ≈ 100 mg p.s. / mL.

Para cada situação (pontos de amostragem de crescimento em mosto e D.O.640nm 1 no

crescimento em meio K) recolheu-se um volume apropriado de células em função do peso

seco calculado com base no ensaio preliminar realizado (secção 2.4.). As células foram

centrifugadas a 12.000 rpm, durante 4 minutos a 4ºC, numa centrífuga (Eppendorf centrifuge

5810R).

A suspensão de células obtida foi mantida em gelo, pelo menos 1 hora antes do início do

ensaio, bem como durante a execução do mesmo.

2.8.2.2. Ensaios com células ressuspendidas em água desmineralizada

O eléctrodo de pH foi colocado num reactor com 2 mL de capacidade, termostatizado a

15ºC ou a 30ºC (conforme o ensaio) e munido de agitação magnética. Neste reactor

colocou-se 800 µL de água desmineralizada ou de soluções previamente termostatizadas a

15ºC ou a 30ºC, com diferentes concentrações de etanol (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20%

(v/v)). De seguida, adicionou-se 200 µL de suspensão de células (100 mg p.s./mL), 5 µL de

antimicina 0,4 mg/mL e 5 µL de 2-desoxi-D-glucose 0,2 M. Ajustou-se a pH 4 com uma

solução de HCl (10 mM ou 100 mM), conforme a situação e registou-se as alterações de pH,

durante um periodo de tempo variável, dependente da temperatura a que se realizou o

ensaio, da fase de crescimento das células e da concentração de etanol testada. Após a

obtenção da curva pretendida (Figura 9), calibrou-se o sinal utilizando um volume conhecido

de HCl (10 mM ou 100 mM).

Figura 9: Curva típica obtida nos ensaios de permeabilidade da membrana plasmática a H+, onde é possível observar uma alcalinização do meio extracelular. A calibração foi feita com soluções de HCl.

Calibração

X nmol H+

pH

Velocidade do papel (cm.min-1)

Alcalinização do meio extracelular

2.8.2.3. Ensaios com células ressuspendidas

No caso das células recolhidas nos últimos 2 pontos de amostragem

fermentação (meio da estacionária e final de fermentação)

células ressuspendidas em água desmineralizada, foram ainda

equivalentes em que se prepararam suspensões de células (100 mg/mL) ressuspendidas

em tampão Tris-citrato (10mM Tris, pH 5) e T

concentrações finais de etanol de 0, 6, 10, 16 e 20% (v/v).

2.9. Avaliação do efeito do etanol sobre

plasmática


A avaliação do efeito do etanol sobre o efluxo de protões através da membrana

plasmática tem por base o registo dos valores de pH ao longo do tempo, após um pulso d

glucose, de uma suspensão concentrada de células em água desmineralizada

velocidade de movimento de H

variações de pH com quantidades conhecidas de base adicionada ao sistema [

1977].

Figura ISA 1000 (100 mg/mL) após um pulso de glucose.

2.9.2. Procedimento experimenta

O sistema utilizado durante os ensaios

foi similar ao utilizado para medição das velocidades de influxo de H

2.9.2.1. Preparação de suspensões de células

Os ensaios foram realizados a partir de suspensões de células preparadas de acordo

com o descrito em 2.8.2.1.

2.9.2.2. Ensaio experimental a diferent

O eléctrodo foi colocado num reactor com 2 mL de capacidade, munido de agitação

magnética e termostatizado (a 15ºC ou a 30ºC, conforme o ensaio). No reactor colocou

800 µL de água desmineralizada ou de soluções com diferentes concentraçõ

MATERIAL E MÉTODOS

Ensaios com células ressuspendidas a diferentes pH extracelulares

No caso das células recolhidas nos últimos 2 pontos de amostragem

(meio da estacionária e final de fermentação), para além dos ensaios com

células ressuspendidas em água desmineralizada, foram ainda realizados ensaios


citrato (10mM Tris, pH 5) e Tris-citrato (10mM Tris, pH 6,3), testando

concentrações finais de etanol de 0, 6, 10, 16 e 20% (v/v).

ção do efeito do etanol sobre o efluxo de H+ através da membrana

Base do método

o efeito do etanol sobre o efluxo de protões através da membrana

por base o registo dos valores de pH ao longo do tempo, após um pulso d

glucose, de uma suspensão concentrada de células em água desmineralizada

velocidade de movimento de H+ é calculada através de uma calibração que relaciona

variações de pH com quantidades conhecidas de base adicionada ao sistema [

Figura 10: Variação de pH de uma suspensão aquosa de ISA 1000 (100 mg/mL) após um pulso de glucose.

experimental

O sistema utilizado durante os ensaios de medição das velocidades de efluxo protónico

utilizado para medição das velocidades de influxo de H+, descrito na Figura 9.

paração de suspensões de células


Ensaio experimental a diferentes temperaturas


magnética e termostatizado (a 15ºC ou a 30ºC, conforme o ensaio). No reactor colocou

800 µL de água desmineralizada ou de soluções com diferentes concentraçõ

MATERIAL E MÉTODOS

42

a diferentes pH extracelulares

No caso das células recolhidas nos últimos 2 pontos de amostragem do período de

, para além dos ensaios com

realizados ensaios


citrato (10mM Tris, pH 6,3), testando

através da membrana

o efeito do etanol sobre o efluxo de protões através da membrana

por base o registo dos valores de pH ao longo do tempo, após um pulso de

glucose, de uma suspensão concentrada de células em água desmineralizada (Figura 10). A

através de uma calibração que relaciona

variações de pH com quantidades conhecidas de base adicionada ao sistema [Serrano,

Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. cerevisiae

de medição das velocidades de efluxo protónico

descrito na Figura 9.



magnética e termostatizado (a 15ºC ou a 30ºC, conforme o ensaio). No reactor colocou-se

800 µL de água desmineralizada ou de soluções com diferentes concentrações de etanol

MATERIAL E MÉTODOS

43

(previamente termostatizadas a 15ºC ou a 30ºC), de forma a obter durante o ensaio uma

concentração final de 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% e 25%. De

seguida, adicionou-se 100 µL de suspensão de células (100 mg p.s./mL). Ajustou-se o pH a

5 com uma solução de HCl (10 mM ou 100 mM) ou NaOH (10 mM ou 100 mM), conforme a

situação e registou-se durante aproximadamente 1 minuto, de forma a obter a linha de base.

Ao fim desse tempo adicionou-se 100 µL de uma solução de glucose 20% (p/v) (Cfinal 2%)

e registou-se o pH durante um período de tempo (Figura 11) que se revelou novamente

dependente da temperatura a que se realizou o ensaio, da fase de crescimento das células

e da concentração de etanol testada.

A taxa específica de efluxo de protões foi calculada com base na variação da quantidade

de H+ por unidade de tempo, tendo em conta a velocidade do papel registador e os dados

obtidos para a calibração do sinal em cada ensaio e o peso seco correspondente ao volume

de células utilizado.

Figura 11: Curva típica obtida nos ensaios de efluxo protónico, onde se pode verificar uma acidificação do meio extracelular após a adição de 100 µL de glucose (Cf = 2% (p/v)). A calibração foi feita com soluções de NaOH.

Linha de base

100 µL glucose 20% (p/v)

X nmol OH-

Calibração

Acidificação do meio extracelular

pH

Velocidade do papel

(cm.min-1)

RESULTADOS E DISCUSSÃO

44

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O trabalho apresentado surge no seguimento de um projecto anterior, em que os ensaios

foram realizados a 25ºC, onde se estudaram vários parâmetros fisiológicos e bioenergéticos

de forma a avaliar o desempenho de uma estirpe vínica de Saccharomyces cerevisiae (ISA

1000) ao longo de fermentação vinária. No presente estudo pretendeu-se avaliar parâmetros

relacionados com a homeostase protónica de células ao longo de fermentação, quando

cultivadas em mosto de uva a temperaturas às quais se realizam fermentações vínicas para

produção de vinho branco e tinto. Num cômputo geral, procurou-se reproduzir em

laboratório, tanto quanto possível, a situação real em que são efectuadas estas

fermentações, com o objectivo final de uma possível transposição dos resultados obtidos

para os resultados numa situação real em adega, com vista a melhorar a produção de vinho

nos aspectos que dependem do desempenho da levedura.

Com este objectivo, cultivou-se uma estirpe vínica de S. cerevisiae, isolada a partir de um

fermento comercial liofilizado (FERMIVIN®) e seleccionada pela sua elevada capacidade

fermentativa, em mosto estéril de uva branca, a duas temperaturas (15ºC e 30ºC usadas na

produção de vinhos branco e tinto, respectivamente). O mosto utilizado sofreu os

tratamentos comuns em adega, tais como clarificação com 10 mg/L de enzima e adição de

enxofre, de forma a garantir 50 ppm de sulfitos livres para estabilização, sendo

posteriormente esterilizado por filtrações sucessivas em membranas (com pressão

negativa). A fermentação decorreu em balões de Erlenmeyer de 1000mL, preenchidos com

800mL de mosto, incubados em banhos termostatizados a 15ºC ou a 30ºC, com agitação

magnética fraca e sem arejamento suplementar, durante todo o período de fermentação. O

final de fermentação foi estabelecido como o ponto a partir do qual não se detectou a

presença de açúcares através dos métodos comuns em adega.

Com vista a possibilitar a comparação entre os resultados obtidos em células recolhidas

ao longo de fermentação de mosto de uva branca e células cultivadas em condições

laboratoriais (para as quais o número de dados existentes na literatura é muito superior),

realizaram-se paralelamente ensaios com a mesma estirpe cultivada em meio mineral (meio

K) e recolhidas em plena fase exponencial de crescimento (D.O.640nm ≈ 1).

Ao longo do trabalho, para a apresentação dos valores relativos aos vários parâmetros

determinados, foi realizada na maior parte dos casos, pelo menos uma repetição, garantindo

a reprodutibilidade dos mesmos.

3.1. Ensaios preliminares

Com o intuito de se avaliar o desempenho fermentativo de Saccharomyces cerevisiae

ISA 1000 a 15ºC e a 30ºC, e, de definir os pontos de amostragem para os ensaios

posteriores, foi necessário realizar

uma destas temperaturas. Procedeu

estudo conforme o descrito em 2.3.5.,

mosto estéril, em balões de Erlenmeyer de 1000 mL

temperatura do ensaio, com fraca

suplementar, durante todo o período

colhidas amostras, de acordo com o descrito

verificar a evolução de parâmetros físico

extracelular e teor de glucose

(D.O.640nm, peso seco e UFC/mL).

3.1.1. Ensaio preliminar de

3.1.1.1. Avaliação dos par

O crescimento da estirpe S

através da determinação da D.O.

com a do peso seco e UFC/mL (

T4

T3 T2

T1

(a)

(b)


realizar ensaios preliminares de crescimento da

Procedeu-se ao crescimento de células às duas temperaturas de

conforme o descrito em 2.3.5., com inoculação de 1 x 106 células/mL

mosto estéril, em balões de Erlenmeyer de 1000 mL previamente termost

fraca agitação magnética (130 rpm) e ausência de arejamento

suplementar, durante todo o período de fermentação. Ao longo da fermentação foram

colhidas amostras, de acordo com o descrito em 2.3.6. Os ensaios preliminares

e parâmetros físico-químicos do mosto (massa volúmica,

teor de glucose) e a evolução de parâmetros de crescimento

peso seco e UFC/mL).

Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 15ºC

Avaliação dos parâmetros de crescimento da estirpe

S. cerevisiae ISA 1000 em mosto estéril a 15ºC

da D.O.640nm (descrito em 2.3.2.1.), comparando

e UFC/mL (Figura 12)

Figura crescimento de cerevisiaefermentação de mosto a 15ºC. peso secoD.O.gráfico assinalados os pontos de amostragem escolhidos (círculo laranja)

T5 T6


45

ensaios preliminares de crescimento da estirpe a cada

se ao crescimento de células às duas temperaturas de

células/mL em 800 mL de

previamente termostatizados à

agitação magnética (130 rpm) e ausência de arejamento

de fermentação. Ao longo da fermentação foram

preliminares permitiram

químicos do mosto (massa volúmica, pH

de crescimento da estirpe

a 15ºC

da estirpe

a 15ºC foi monitorizado

comparando-se a sua evolução

Figura 12: Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a 15ºC. (a) D.O.640nm e peso seco e (b) D.O.640nm e UFC/mL. No gráfico (a) estão assinalados os pontos de amostragem escolhidos (círculo laranja).


46

O ensaio foi iniciado por inoculação de ≈ 1x106 células/mL a partir de um pré-inóculo em

fase exponencial, preparado em mosto a 28ºC.

Através da observação da curva de crescimento obtida a 15ºC (Figura 12a), foi possível

verificar que, de acordo com as determinações de D.O.640nm, a cultura apresentou uma fase

de latência de ≈13 horas, seguida de uma fase exponencial que se prologou por ≈ 41 horas

(com um tempo de duplicação de ≈ 6h 30m). Ao fim de 87 horas, a cultura entrou em fase

estacionária, terminando a fermentação às 304 horas, altura em que se verificou um

esgotamento total da glucose (Anexo IV).

A partir da curva de crescimento obtida a 15ºC definiram-se 6 pontos de amostragem

(Tabela 6), atendendo ao comportamento de estirpes vínicas comerciais sujeitas a

variações, descritas na literatura, ao longo do processo de fermentação e à monitorização

do trancriptoma de uma estirpe comercial de S. cerevisiae em mosto sintético [Querol et al.,

2003; Rossignol et al., 2003].

Tabela 6: Pontos de amostragem definidos para o crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentações conduzidas a 15ºC.

Pontos de amostragem Tempo de recolha das células (h)

Início da exponencial (T1) ≈24

Meio da exponencial (T2) ≈36

Final da exponencial (T3) ≈65

Início da estacionária (T4) ≈87

Meio da estacionária (T5) ≈202

Final da fermentação (T6) ≈304

A fase de latência observada nas fermentações a 15ºC caracterizou-se essencialmente

por um período em que as células se adaptaram ao stresse térmico imposto, uma vez que a

passagem de 28ºC (do pré-inóculo) para 15ºC possivelmente abrandou o metabolismo

celular.

Ao se observar a evolução do peso seco durante a fermentação a 15ºC (Figura 12a),

verificou-se que, tal com esperado, este acompanhou a evolução da D.O.640nm, uma vez que

ambos os parâmetros têm em consideração todo o tipo de células, independentemente da

sua capacidade metabólica e de multiplicação. A partir de um determinado peso seco de

células foi possível calcular o volume de colheita necessário para cada ponto de

amostragem.

Se tivermos em consideração a Figura 12b que relaciona a evolução do crescimento de

S. cerevisiae ISA 1000 e o número de células viáveis (com capacidade de multiplicação

activa, expresso em UFC/mL), constata-se que a população inicial sofreu inicialmente um

decréscimo atingindo um mínimo ao fim de 12-13h. Este decréscimo foi observado quer ao

nível de D.O.640nm (para as primeiras 2h), quer ao nível de células viáveis, correspondendo a

uma redução efectiva da população

crescimento [Pham et al., 2006]

as células foram inoculadas,

ensaio, mas a 28ºC, a explicação

D.O.640nm e no número de células viáveis

sofrido pela passagem de 28ºC para 15ºC

proveniente do pré-inóculo. Após o período inicia

crescimento prosseguiu, constatando

exponencial de crescimento, atingindo uma

12b). Por outro lado, é perceptível na

curva de crescimento de S. cerevisiae

indicia que as células permanece

3.1.1.2. Avaliação dos parâmetros físico

Para além dos parâmetros de crescimento

volúmica, do ºBrix e do teor de glucose

longo da fermentação a 15ºC.

Através da observação dos gráficos da

do mosto manteve-se relativamente constante ao longo do processo de fermentação

oscilando entre 3,04 (pHinoculação

volúmica decresceu ao longo da

até atingir ≈990 mg/mL no final de fermentação;

solúveis no mosto) diminuiu ao longo da fermentação,

só começou a diminuir quando a cultura termin

fase estacionária.

(a)

(c)


população, igualmente observada por alguns autores

., 2006]. Tendo em consideração que o pré-inóculo

, foi preparado em mosto exactamente igual ao utilizado no

explicação mais plausível para a redução observada

no número de células viáveis poderá estar relacionada com

pela passagem de 28ºC para 15ºC e com a diluição efectuada à população

. Após o período inicial de decréscimo de população,

, constatando-se que ocorreram 6 a 7 duplicações

atingindo uma D.O.640nm de ≈ 8 no final da mesma fase (

Por outro lado, é perceptível na Figura 12b que a curva de UFC/mL acompanh

cerevisiae ISA 1000, ao longo da fermentação a 15ºC, o que

indicia que as células permaneceram viáveis até ao final de fermentação.

Avaliação dos parâmetros físico-químicos do mosto

dos parâmetros de crescimento, foi observada a evolução do pH, da massa

volúmica, do ºBrix e do teor de glucose e de etanol do mosto, com colheita de amostras ao

longo da fermentação a 15ºC.

rvação dos gráficos da Figura 13, foi possível constatar

se relativamente constante ao longo do processo de fermentação

inoculação), 2,87 (pHinício estacionária) e 3,02 (pHfinal fermentação

ao longo da fermentação, partindo de um valor inicial de

990 mg/mL no final de fermentação; (c) o ºBrix (que quantifica os

ao longo da fermentação, no entanto foi possível

ir quando a cultura terminou a fase exponencial e começ

Figura 13: Evolução do (a)

(b) massa volúmica (mg/mL)

mosto, ao longo de fermentação de

ISA 1000 em mosto de uva branca a 15ºC.

(b)


47

alguns autores nesta fase de

inóculo, a partir do qual

igual ao utilizado no

redução observada nas leituras de

poderá estar relacionada com o choque térmico

e com a diluição efectuada à população

l de decréscimo de população, o

duplicações durante a fase

no final da mesma fase (Figura

que a curva de UFC/mL acompanhou a

ISA 1000, ao longo da fermentação a 15ºC, o que

, foi observada a evolução do pH, da massa

do mosto, com colheita de amostras ao

el constatar-se que: (a) o pH

se relativamente constante ao longo do processo de fermentação (pH≈3),

final fermentação); (b) a massa

fermentação, partindo de um valor inicial de ≈1074 mg/mL

) o ºBrix (que quantifica os açúcares

possível constatar que

a fase exponencial e começou a entrar em

(a) pH extracelular, da

massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do

ao longo de fermentação de S. cerevisiae

branca a 15ºC.


48

Os resultados relativos à variação do pH do mosto ao longo da fermentação a 15ºC

permitiram concluir que o mosto pode ser considerado um meio com uma capacidade

tampão considerável, uma vez que manteve o seu pH relativamente constante durante o

processo fermentativo (pH≈3).

No que respeita à massa volúmica, foi possível constatar que houve uma grande variação

nos resultados obtidos para este parâmetro, que pode estar relacionada com o facto do

método utilizado para a sua determinação ter inerente um grau elevado de erro, uma vez

que a avaliação deste parâmetro apenas teve como objectivo monitorizar qualitativamente a

fermentação vinária a 15ºC. No entanto, o valor de massa volúmica correspondente ao final

de fermentação (990 mg/mL) está próximo da gama de valores admissíveis (991-996

mg/mL) para esta fase [Ribéreau-Gayon et al., 2006]. A medição da massa volúmica,

segundo estes autores, deixa de ser precisa na monitorização da fermentação a partir do

momento em que este parâmetro diminui para valores inferiores a 1000 mg/mL [Ribéreau-

Gayon et al., 2006], o que pode explicar a grande variabilidade dos valores registados

inferiores a 1000 mg/mL.

A avaliação do ºBrix das várias amostras colhidas ao longo da fermentação permitiu

monitorizar qualitativamente igualmente os teores de glucose e frutose ao longo do

processo. A razão pela qual se observou uma diminuição deste parâmetro a partir do

momento em que as células terminaram a fase exponencial e iniciaram a fase estacionária

(Figura 13c), poderá ter como possível explicação o facto de a sua determinação avaliar

simultaneamente o consumo de glucose e frutose que, a par da baixa sensibilidade do

método, não permitiu detectar pequenas quantidades de glucose consumidas no início de

fermentação, onde existe uma quantidade elevada de açúcares (≈200 g/L).

Relativamente à concentração de glucose (Tabela 7, Figura 14), doseada pelo método

descrito em 2.5., constata-se que o teor de açúcares (glucose e frutose) presente no mosto

de uva branca utilizado no presente trabalho (≈193 g/L) esteve de acordo com a gama

normal de valores de açúcares totais (160-300 g/L) [Fleet & Heard, 1993] admitindo que as

uvas e consequentemente o mosto contêm quantidades semelhantes de frutose e de

glucose, apesar de alguns autores referirem que as alterações ambientais recentes têm

vindo a aumentar a proporção de frutose comparativamente à de glucose nas uvas [Jones et

al., 2005]. Por outro lado, a observação da Figura 14 permite afirmar que ≈24% de glucose

foi consumida entre o momento da inoculação (T0) e o final de fase exponencial (T3), ≈23%

foi consumida entre o final de fase exponencial (T3) e o início de fase estacionária (T4) e

mais de 50% de glucose foi consumida após a cultura entrar em fase estacionária (T4),

vindo ao encontro das observações de Rossignol e colaboradores (2003), que verificaram

que a maior parte do açúcar é fermentado por resting cells [Rossignol et al., 2003]. No final

de fermentação (T6), as células praticamente esgotaram a glucose presente no meio,


49

considerando-se terminada a fermentação. Outro facto interessante foi o baixo consumo de

glucose observado em células compreendidas entre as fases meio de estacionária e final de

fermentação (Figura 14), estando de acordo com os resultados obtidos no estudo a 25ºC

onde foi possível constatar uma elevada actividade dos transportadores de hexoses de

baixa afinidade nas fases iniciais de fermentação, ao passo que a actividade observada no

final de fermentação, para além de ter sido baixa, foi essencialmente devida aos

transportadores de alta afinidade [C. Prista, comunicação pessoal]. Estas observações do

estudo a 15ºC e a 25ºC demonstraram ser coerentes com os estudos de alguns autores, na

medida em que Brejning e colaboradores (2003) observaram a existência de elevada

indução de HXT1, HXT2 e HXT3 (genes de transportadores de hexoses de baixa afinidade)

nos primeiros 20 minutos após se ter efectuado a inoculação [Brejning et al., 2003]. Perez e

colaboradores (2005) ao analisarem a expressão dos transportadores de hexoses de S.

cerevisiae ao longo da fermentação de mosto sintético, verificaram que HXT1 foi expresso

apenas no início de fermentação (não tendo qualquer função na fase estacionária), HXT3 foi

expresso ao longo do processo fermentativo, no entanto, a quantidade de Hxt3p diminuiu a

partir da fase estacionária de crescimento [Perez et al., 2005]. Estes autores constataram

que Hxt2p foi o único transportador que só foi expresso durante a fase de latência

(sugerindo que este transportador tem uma função importante no arranque do crescimento),

ao passo que Hxt6p e Hxt7p, com perfis de expressão semelhantes, foram expressos a

partir do início de fase estacionária [Perez et al., 2005].

Quando se comparam os gráficos da evolução do ºBrix (Figura 13c) e do consumo de

glucose (Figura 14) observa-se que o valor do ºBrix que se atingiu no final de fermentação

não foi próximo do nulo, tal como aconteceu face ao teor de glucose quantificado no final de

fermentação (Figura 14), na medida em que o ºBrix quantifica, embora de uma forma menos

sensível, teores de glucose e frutose, indicando que o seu valor no final de fermentação

poderá estar relacionado com a presença de frutose no final de fermentação como açúcar

residual, uma vez que S. cerevisiae tem preferência para o consumo de glucose, dando

origem a uma discrepância de consumo destas duas hexoses ao longo da fermentação

[Berthels et al., 2004]. É precisamente esta a causa, segundo alguns autores, da ocorrência

de doçura indesejável no final de fermentação, uma vez que a frutose tem um carácter mais

edulcorante do que a glucose [Lee, 1987; Boulton et al., 1996]. Para além disso, esta

discrepância no consumo de glucose e de frutose provoca baixos rendimentos de produção

de etanol e aumenta os riscos de contaminação do vinho resultante [Berthels et al., 2004;

Gafner & Schütz, 1996].

No que diz respeito ao etanol produzido durante a fermentação a 15ºC (Tabela 7, Figura

14), verificou-se que ≈21% foi produzido entre o momento da inoculação (T0) e o final de

fase exponencial (T3), ≈27% foi produzido entre o final de fase exponencial (T3) e o início de

fase estacionária (T4) e mais de 50% de etanol foi produzido

estacionária (T4), coincidindo com a fase de mai

Tabela 7: Teor de glucose e de etanolamostragem escolhidos.

Fase de crescimento

Inoculação

Início da exponencial

Meio da exponencial

Final de exponencial

Início de estacionária

Meio da estacionária

Final de fermentação

Figura 14: Consumo de glucose e produção de etanol efermentações de mosto a 15ºC.

Em teoria, se partíssemos do pressuposto de que tod

convertidas em etanol durante a fermentação

≈12,4% (v/v) de etanol. No nosso estudo, o teor volúmico em etanol obtido a 15ºC foi de

9,4% (v/v), que possivelmente pode ficar a dever

do consumo de glucose para a produção de metabolitos secundários (e.g. glicero

acético) e, por outro, à possível

fermentação, tal como anteriormente se referiu.

nossos ensaios a 15ºC está

respeita ao título alcoométrico volúmico total dos v.q.p.r.d.

Anexo VI-F-nº5) que não pode ser inferior a 9% (v/v)

volúmico mínimo total seja de 8,5% (v/v)

de uma lista a aprovar, que não tenham s


fase estacionária (T4) e mais de 50% de etanol foi produzido após a cultura entrar em fase

, coincidindo com a fase de maior consumo de glucose.

e de etanol em fermentações conduzidas a 15ºC, para os 6 pontos de

[glucose]

(g/L)

% consumo

glucose

[etanol]

(g/L)

% etanol

(v/v)

96,50 0,00 0,20 0,03

89,54 7,21 1,51 0,19

81,72 15,32 10,02 1,27

73,46 23,87 16,01 2,03

51,73 46,40 35,70 4,52

2,87 97,03 51,25 6,49

0,03 99,97 74,29 9,41

Consumo de glucose e produção de etanol em S. cerevisiae ISA 1000

Em teoria, se partíssemos do pressuposto de que toda a glucose

em etanol durante a fermentação teríamos um valor volúmico

No nosso estudo, o teor volúmico em etanol obtido a 15ºC foi de

9,4% (v/v), que possivelmente pode ficar a dever-se, por um lado, à ocorrência de desvios

para a produção de metabolitos secundários (e.g. glicero

por outro, à possível existência de quantidades residuais de frutose no final de

, tal como anteriormente se referiu. No entanto, o teor final em etanol obtido nos

de acordo com os valores mencionados no

o título alcoométrico volúmico total dos v.q.p.r.d. (descrito no REG (CE) nº1493/99

não pode ser inferior a 9% (v/v), muito embora, o título alcoométrico

volúmico mínimo total seja de 8,5% (v/v) para determinados v.q.p.r.d. brancos

de uma lista a aprovar, que não tenham sofrido qualquer enriquecimento.


50

após a cultura entrar em fase

das a 15ºC, para os 6 pontos de

% produção

etanol

0,27

2,03

13,49

21,55

48,06

68,99

100,00

ISA 1000 ao longo de

glucose e frutose seriam

valor volúmico final teórico de

No nosso estudo, o teor volúmico em etanol obtido a 15ºC foi de

à ocorrência de desvios

para a produção de metabolitos secundários (e.g. glicerol e ácido

ncia de quantidades residuais de frutose no final de

No entanto, o teor final em etanol obtido nos

o Anexo II, no que

REG (CE) nº1493/99

, muito embora, o título alcoométrico

eterminados v.q.p.r.d. brancos, constantes

Atendendo à metodologia de determinação do etanol (

as várias manipulações e os tempos de espera

(considerando inclusivamente o momento da sua colheita) tenham conduzido a uma

evaporação parcial do etanol presente na amostra

3.1.2. Ensaio preliminar de

3.1.2.1. Avaliação de parâmetros

Após monitorização do crescimento através d

ao longo da fermentação, obteve

30ºC (Figura 15a), determinando

expresso em UFC/mL (Figura

Figura 15: Curva de crescimento de D.O.640nm e peso seco e (b) D.O.amostragem escolhidos (círculo laranja).

Nas fermentações a 30ºC,

latência da cultura, notando-

T2

T1

(a)

(b)


Atendendo à metodologia de determinação do etanol (descrita em 2.6.

e os tempos de espera a que as amostras foram sujeitas


etanol presente na amostra.

Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 30ºC

Avaliação de parâmetros de crescimento

pós monitorização do crescimento através de leitura da D.O.640nm de

ao longo da fermentação, obteve-se a curva de crescimento de S. cerevisiae

determinando-se igualmente o peso seco e o número de células viáv

Figura 15)

Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a D.O.640nm e UFC/mL. No gráfico (a) estão assinalados os pontos de

hidos (círculo laranja).

, as leituras de D.O.640nm não permitiram identificar

-se, por outro lado, uma fase de aceleração

T5 T4 T3


51

descrita em 2.6.), é provável que

mostras foram sujeitas


ISA 1000 a 30ºC

de amostras colhidas

cerevisiae ISA 1000 a

o número de células viáveis,

ISA 1000 em fermentação de mosto a 30ºC. (a) estão assinalados os pontos de

identificar uma fase de

se, por outro lado, uma fase de aceleração nas primeiras 2


52

horas após a inoculação. No entanto, nesta fase compreendida entre o momento de

inoculação e o início de exponencial, quando se compara a leitura de D.O.640nm à de

UFC/mL, é possível verificar uma diminuição do número de células viáveis, que reduz a

população para 1/10 da população inicial, apesar do aumento observado de D.O.640nm.

Constatou-se, portanto, que ocorreu uma perda de viabilidade inicial que poderá ser

possivelmente explicada, por um lado, pela modificação da temperatura de crescimento

(28ºC no pré-inóculo) para uma temperatura ligeiramente superior (30ºC na fermentação).

Por outro lado, se atendermos ao facto de que a D.O.640nm contabiliza células totais (mortas

e vivas) existentes numa suspensão, enquanto a contagem do número de UFC/mL

contabiliza apenas células com capacidade de se multiplicar e formar colónias

individualizadas, é possível inferir que o aumento observado da D.O.640nm possa ter sido o

resultado da cultura ter começado a multiplicar-se no início de fermentação, não permitindo

a separação das gémulas e células adultas, traduzindo-se num menor número de colónias

e, consequentemente, numa contagem inferior de UFC/mL comparativamente à D.O.640nm

lida. Após ultrapassar este período inicial de fermentação, a cultura entrou em fase

estacionária ao fim de 24 horas, dando-se o final de fermentação às 71 horas, altura em que

se verificou um esgotamento total da glucose (Anexo II).

A partir da curva de crescimento obtida a 30ºC e atendendo às razões similares às

referidas para a fermentação a 15ºC, definiram-se 5 pontos de amostragem que englobaram

o meio da fase exponencial (T1, às ≈5 horas), o final da fase exponencial (T2, às ≈9 horas),

o início da fase estacionária (T3, às ≈24 horas), meio da estacionária (T4, às ≈48 horas) e o

final da fermentação (T5, às ≈71 horas).

O peso seco acompanhou tal como esperado a D.O.640nm durante a fermentação a 30ºC

(Figura 15a), uma vez que ambos os métodos contabilizam o número total de células.

Constatou-se que a população inicial que cresceu a 30ºC sofreu 3 a 4 duplicações

durante a fase exponencial de crescimento, atingindo uma D.O.640nm de ≈ 2,5 no final da

mesma fase (Figura 15b). Quando se compara o número de duplicações obtido a 15ºC e a

30ºC, durante a mesma fase de crescimento, constata-se que as 3 a 4 duplicações que as

células a 30ºC sofreram repercutiram-se numa fase exponencial de crescimento mais curta,

entrando no período de desaceleração mais cedo, comparativamente a 15ºC, onde a fase

exponencial foi mais longa, permitindo à população sofrer 6 a 7 duplicações.

3.1.2.2. Avaliação dos parâmetros físico-químicos

À semelhança do que foi efectuado a 15ºC, ao longo da fermentação a 30ºC observaram-

se as variações do pH, da massa volúmica, do ºBrix e do teor de glucose e de etanol no

mosto.

A partir dos dados obtidos (

se relativamente constante ao longo do pro

apenas durante a fase exponencial, o seu valor inicial de 3,0 para 2,8

(mg/mL) do mosto decresceu ao longo da fermentação, partindo de um valor de

mg/mL até atingir ≈948 mg/mL, no final de fermentaçã

fermentação, mais significativamente

começou a desacelerar para entrar em fase estacionária.

Os resultados obtidos a 30ºC no que respeita ao pH extracelular confirmam o que fora

referido a 15ºC relativamente ao

considerável, que mantém o seu

fermentativo (pH≈3).

Relativamente à variação da massa volúmica, foi interessante verificar que apenas se

notou o decréscimo deste parâmetro durante a mesma fase de crescimento para a qual se

notou o maior decréscimo no ºBrix, isto é, durante a transição entre o final da

exponencial e o início da fase

situação a 15ºC e ao facto da massa volúmica

ocorre ao nível do consumo de glucose e consequente formação de etanol e

diminuição da massa volúmica

explicação a evaporação do CO

deste método utilizado ter inerente um grau elevado de erro

de massa volúmica correspondente ao final de fermentação

próximo da gama de valores admissíveis (991

(a)

(c)


A partir dos dados obtidos (Figura 16) foi possível observar: (a) o pH do mosto manteve

te constante ao longo do processo fermentativo, decrescendo ligeiramente,

durante a fase exponencial, o seu valor inicial de 3,0 para 2,8; (b) a massa volúmica

(mg/mL) do mosto decresceu ao longo da fermentação, partindo de um valor de

948 mg/mL, no final de fermentação; (c) o ºBrix diminui

mais significativamente quando a cultura terminou a fase exponencial e

a desacelerar para entrar em fase estacionária.

Figura 16: Evolução do (a)(b) massa volúmica (mg/mL) e mosto, ao longo de fermentação de ISA 1000 em mosto de uva branca a 30ºC.


do a 15ºC relativamente ao mosto ser um meio com uma capacidade tampão

mantém o seu pH relativamente constante durante o processo



notou o maior decréscimo no ºBrix, isto é, durante a transição entre o final da

exponencial e o início da fase estacionária. Atendendo ao que foi mencionado para

da massa volúmica poder essencialmente reflectir

ocorre ao nível do consumo de glucose e consequente formação de etanol e

a massa volúmica obervada ao longo da fermentação poderá ter como

explicação a evaporação do CO2. Tal como acontecera a 15ºC e tendo em conta o facto

deste método utilizado ter inerente um grau elevado de erro, foi curioso verificar

de massa volúmica correspondente ao final de fermentação a 30ºC (9

a de valores admissíveis (991-996 mg/mL) [Ribéreau-Gayon

(b)


53

(a) o pH do mosto manteve-

cesso fermentativo, decrescendo ligeiramente,

; (b) a massa volúmica

(mg/mL) do mosto decresceu ao longo da fermentação, partindo de um valor de ≈1058

o; (c) o ºBrix diminuiu ao longo da

a fase exponencial e

(a) pH extracelular, da massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do

ao longo de fermentação de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 30ºC.


com uma capacidade tampão

pH relativamente constante durante o processo



notou o maior decréscimo no ºBrix, isto é, durante a transição entre o final da fase

Atendendo ao que foi mencionado para mesma

reflectir a variação que

ocorre ao nível do consumo de glucose e consequente formação de etanol e de CO2, a

ao longo da fermentação poderá ter como

tendo em conta o facto

foi curioso verificar que o valor

(948 mg/mL) esteve

Gayon et al., 2006].


54

Relativamente aos teores de glucose determinados nas fermentações a 30ºC (Tabela 8,

Figura 17), é possível afirmar que ≈20% do seu teor foi consumido entre o momento da

inoculação (T0) e o final de fase exponencial (T2), ≈40% foi consumido entre o final da fase

exponencial (T2) e o início da fase estacionária (T3) e ≈40% foi consumido a partir do início

da fase estacionária (T3). No último ponto de amostragem (T5), as células praticamente

esgotaram a glucose presente no meio, considerando-se terminada a fermentação. Tal

como se verificou a 15ºC e a 25ºC, a partir de meio da fase estacionária verificou-se um

baixo consumo de glucose por parte das células, constatando-se novamente uma possível

discrepância entre o consumo de glucose e de frutose, por comparação das Figuras 16c e

17, indicando a possível presença de quantidades residuais de frutose no final de

fermentação.

No que diz respeito ao etanol produzido durante a fermentação a 30ºC (Tabela 8, Figura

17), verificou-se que ≈11% foi produzido entre o momento da inoculação (T0) e o final de

fase exponencial (T2), ≈58% foi produzido entre o final de fase exponencial (T2) e o início de

fase estacionária (T3) e ≈31% de etanol foi produzido após a cultura entrar em fase

estacionária (T3).

A transição entre o final da fase exponencial e o início da fase estacionária a 30ºC foi o

período de fermentação onde ocorreu uma grande parte do consumo de glucose (≈40%) e a

maior parte da produção de etanol (≈58%), ao invés do que acontecera a 15ºC, onde estes

acontecimentos ocorreram a partir da fase estacionária de crescimento.

Tabela 8: Teor de glucose e de etanol em fermentações conduzidas a 30ºC, para os 6 pontos de amostragem escolhidos.

Fase de crescimento [glucose]

(g/L)

% consumo

glucose

[etanol]

(g/L)

% etanol

(v/v)

% produção

etanol

Inoculação 96,50 0,00 0,20 0,03 0,35

Meio da exponencial 83,89 13,06 1,84 0,23 3,27

Final de exponencial 80,41 16,67 6,45 0,82 11,43

Início de estacionária 40,42 45,59 39,16 4,96 69,39

Meio da estacionária 4,26 87,21 43,19 5,47 76,53

Final de fermentação 0,05 93,82 56,44 7,15 100,00

Figura 17: Consumo de glucose e produção de etanfermentações de mosto a 30ºC.

Os resultados referentes

15ºC e 30ºC permitiram constatar que

30ºC entrou em fase de crescimento desacelerado (i.e.,

fases exponencial e estacionária de crescimento)

exponencial) à concentração

lidar na fase correspondente.

demasiado baixas para serem responsáveis

Tal como aconteceu a 15ºC,

concentração de etanol que se obteve nos diversos ensaios

de determinação do etanol utilizada e a provável ocorrência

etanol para a produção de metabolitos

rendimento etanol/glucose observado durante a fase estacionária, bem como o

final em etanol obtido na fermentação a 30ºC (

3.2. Avaliação de parâmetros fisiológicos

Existem vários estudos,

diferenças fisiológicas significativas entre as células nas várias fases do processo

fermentativo, nomeadamente entre as células em crescimento exponencial (primeiras horas

de fermentação) e células em fase estacionária [

Rossignol et al., 2009], estando estas diferenças relacionadas com a sobrevivência das

células em condições de concentrações elevadas de etanol e esgotamento de nutrientes

como as que se observam a partir de um determinado ponto de fe

Heard, 1993; Bisson, 1999, Querol


Consumo de glucose e produção de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de

Os resultados referentes ao etanol produzido durante as fermentações conduzidas a

15ºC e 30ºC permitiram constatar que a concentração de etanol para a qual a população a

fase de crescimento desacelerado (i.e., no período de transição entre as

e estacionária de crescimento) foi inferior (6,45g/L de etanol no final de

exponencial) à concentração de etanol (16g/L de etanol) que as células a

. No entanto, é importante referir que estas concentrações são

demasiado baixas para serem responsáveis per si pela paragem do crescimento.

15ºC, é provável que a 30ºC tenha sido subestimado

que se obteve nos diversos ensaios, tendo em conta a

utilizada e a provável ocorrência de desvio

metabolitos secundários. Estes desvios podem explicar o

observado durante a fase estacionária, bem como o

na fermentação a 30ºC (≈7,15% (v/v)).

parâmetros fisiológicos

Existem vários estudos, antigos e recentes, que apontam no sentido d



e células em fase estacionária [Rossignol et al., 2003; Varela

, estando estas diferenças relacionadas com a sobrevivência das


como as que se observam a partir de um determinado ponto de fermentação vinária

, Querol et al., 2003; Zuzuarregui et al., 2006].


55

ISA 1000 ao longo de

etanol produzido durante as fermentações conduzidas a

a concentração de etanol para a qual a população a

período de transição entre as

inferior (6,45g/L de etanol no final de

(16g/L de etanol) que as células a 15ºC tiveram que

estas concentrações são

pela paragem do crescimento.

tenha sido subestimado o valor de

, tendo em conta a metodologia

desvios da produção de

podem explicar o menor

observado durante a fase estacionária, bem como o baixo teor

recentes, que apontam no sentido de existirem



Varela et al., 2005;

, estando estas diferenças relacionadas com a sobrevivência das


rmentação vinária [Fleet &


56

Os resultados obtidos nos ensaios preliminares realizados a 15ºC e a 30ºC, em paralelo

com os resultados previamente obtidos a 25ºC, apontaram no sentido da manutenção de

viabilidade das células nas etapas finais de fermentação, levando a postular a existência de

diferenças significativas no comportamento de células ao longo da fermentação, à

semelhança do que fora descrito pelos autores acima referidos.

Atendendo a este facto, procurou-se estudar o comportamento das células nos vários

estádios de fermentação centrando a atenção em aspectos tais como: pH intracelular,

capacidade de expulsar H+ e permeabilidade passiva aos H+, uma vez que estes aspectos

permitem avaliar a capacidade de homeostase protónica da célula, como indicador do seu

estado fisiológico e capacidade de sobrevivência nas situações de stresse encontradas.

3.2.1. pH intracelular

Com o intuito de se observar o efeito das alterações que ocorrem ao longo da

fermentação vinária no pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000 nas várias fases do

processo, procedeu-se à determinação deste parâmetro pelo método descrito por

Rottenberg (1979) (secção 2.7.), para células cultivadas a 15ºC e a 30ºC.

3.2.1.1. Em meio K

Tendo em conta que a maioria dos ensaios descritos na literatura para avaliação do pHin

foram realizados em condições standard, a 25ºC com estirpes laboratoriais, foi necessário

realizar um ensaio preliminar em meio mineral às duas temperaturas. Estes ensaios tiveram

como finalidade avaliar o período de incubação mínimo ao fim do qual a forma não

dissociada do ácido fraco marcado atingia o equilíbrio, uma vez que as velocidades de

difusão passiva do ácido marcado estão directamente dependentes da fluidez de

membrana, da constante de difusão da forma não dissociada através da bicamada lipídica e

consequentemente da temperatura. Os resultados de estudos prévios realizados a 25ºC

com esta estirpe indicaram que, após 90 minutos de incubação, o equilíbrio estabeleceu-se

[C. Prista, comunicação pessoal]. Atendendo a estas condicionantes, estabeleceu-se como

tempos de incubação:

� 150 minutos a 15ºC;

� 90 minutos a 30ºC.

Considerou-se que se atingiu o valor de pH intracelular assim que se verificou um

equilíbrio do composto radioactivo nos meios intracelular e extracelular, que correspondeu a

uma estabilização dos valores de pH intracelular nos gráficos que o relacionaram com o

tempo de incubação do composto radioactivo.

O método padrão descrito por Rosenberg (1979) utiliza14C] ácido propiónico. Quando se realizaram ensaios preliminares com células de

cerevisiae ISA 1000, cultivadas em meio K, utilizando ácido propiónico

recolheram células ao longo do tempo durante os períodos

a 15ºC não foi possível atingir

propiónico não dissociado (AH) no exterior e no interior da célula, isto é, AH

todos os tempos em que se recolheram células,

significativamente alargado de 350 minutos (

observar que ocorreu uma alcalinização

constante ao longo do tempo.

O valor de pH intracelular

após 350 minutos de incubação com [1

aos valores de pHin normalme

et al., 2008]).

Como tal, após a análise destes resultados,

mesmos, foi testada a utilização de [1

pH intracelular (utilizando a mesma metodologia, a 15ºC e a 30ºC) para a estirpe auxotrófica

W-303 de S. cerevisiae, com o objec

da estirpe ISA 1000 ou se, por outro lado, uma estirpe haplóide de referência (W

comummente utilizada em ensaios laboratoriais, exibia ou não o mesmo comportamento.

Tal como se pode observar

possível estabelecer-se um equilíbrio

do [1-14C] ácido propiónico nos meios intracelular e extracelular de

cultivada em meio K, a 15ºC. No entanto,

observada foi menos acentuada do que a

mesmas condições (Figura 19

benzóico obteve-se uma maior estabilização do

inferiores, mais próximos d

[Kresnowati et al., 2008].


O método padrão descrito por Rosenberg (1979) utiliza como ácido fraco marcado o

. Quando se realizaram ensaios preliminares com células de

, cultivadas em meio K, utilizando ácido propiónico

recolheram células ao longo do tempo durante os períodos estabelecidos, observou

atingir uma condição de equilíbrio entre a quantidade de ácido

propiónico não dissociado (AH) no exterior e no interior da célula, isto é, AH

todos os tempos em que se recolheram células, inclusive para um perí

significativamente alargado de 350 minutos (Figura 18). Nestas situações

uma alcalinização aparente do meio intracelular relativa

.

Figura 18: Valores medidos para de S. cerevisiae ISA 1000, a 15ºC, meio K, utilizando [1-14C] ácido propiónico.

de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada a 15ºC em

minutos de incubação com [1-14C] ácido propiónico, foi de de 7,

normalmente referenciados na literatura (entre 5,50 e 6,50

Como tal, após a análise destes resultados, e dado o carácter surpreendente dos

mesmos, foi testada a utilização de [1-14C] ácido propiónico nos ensaios de determinação do


, com o objectivo de se averiguar se tal comportamento era exclusivo

da estirpe ISA 1000 ou se, por outro lado, uma estirpe haplóide de referência (W


Tal como se pode observar através da Figura 19, ao fim de 210 minutos

um equilíbrio, para estirpes laboratoriais, da forma não dissociada

C] ácido propiónico nos meios intracelular e extracelular de S.

K, a 15ºC. No entanto, a alcalinização aparente do meio

menos acentuada do que a observada para S. cerevisiae

19). Substituindo o [1-14C] ácido propiónico pelo [7

se uma maior estabilização do pHin ao longo do tempo,

mais próximos da gama de valores de pHin normalmente referenciados


57

como ácido fraco marcado o [1 -

. Quando se realizaram ensaios preliminares com células de S.

, cultivadas em meio K, utilizando ácido propiónico marcado e se

estabelecidos, observou-se que

entre a quantidade de ácido

propiónico não dissociado (AH) no exterior e no interior da célula, isto é, AHex ≠ AHin para

inclusive para um período de tempo

Nestas situações foi possível

do meio intracelular relativamente

Valores medidos para pH intracelular a 15ºC, cultivada em

C] ácido propiónico.

ISA 1000, cultivada a 15ºC em meio mineral,

de 7,38, sendo superior

entre 5,50 e 6,50 [Kresnowati

e dado o carácter surpreendente dos

C] ácido propiónico nos ensaios de determinação do


tivo de se averiguar se tal comportamento era exclusivo

da estirpe ISA 1000 ou se, por outro lado, uma estirpe haplóide de referência (W-303),


ao fim de 210 minutos também não foi

da forma não dissociada

cerevisiae W-303,

do meio intracelular

S. cerevisiae ISA 1000, nas

C] ácido propiónico pelo [7-14C] ácido

ao longo do tempo, obtendo-se valores

normalmente referenciados

A 30ºC foi possível determinar

propiónico, podendo afirmar-se que se estabeleceu o equilíbrio ao fim de

20). O valor de pHin determinado

se próximo da gama de valores de

al., 2008], no entanto a utilização de

dentro do intervalo referido (pH

Perante as evidências de, por um lado, não ter sido possível obter uma es

pH intracelular, por impossibilidade de estabelecimento de

dissociada do composto radioactivo nos me

ácido propiónico nas determinações

outro, o pHin determinado com [1

referidos na literatura, colocou

ácido propiónico na célula, o que levaria a um aumento de quantidade de ácido

determinado nas células filtradas

da forma dissociada retida em consequência do desvio do equilíbrio

ser mais alcalino, conduzindo

poderá contribuir para a hipótese

membranas incide no facto de se ter obtido uma

intensa durante o ensaio em meio mineral

comparativamente à acidificação extracelular observada

Anexo VI). A maior intensidade com que se deu a

estar relacionada com uma menor dissociação do ácido fraco no interior da célula,


Figura 19: pH intracelular de 303, cultivada em meio K a 14C] ácido propiónico ou [7-Estão igualmente representados os valores de pHin de S. cerevisiae ISA 1000 cultivada nas mesmas condições.

A 30ºC foi possível determinar-se o pHin de S. cerevisiae W-303 utilizando

se que se estabeleceu o equilíbrio ao fim de

determinado com este composto (pHin 6,75 após 90 minutos) encontra

valores de pHin normalmente referidos na literatura

utilização de [7-14C] ácido benzóico permitiu obter um valor de pH

pHin 6,14 após 90 minutos).

Figura 20: pH intracelular de

303, cultivada em meio K a 3014C] ácido propiónico ou [7-14

, por um lado, não ter sido possível obter uma es

pH intracelular, por impossibilidade de estabelecimento de equilíbrio entre a forma não

do composto radioactivo nos meios extracelular e intracelular,

nas determinações realizadas a 15ºC para ambas as estirpes

determinado com [1-14C] ácido propiónico ter sido muito superior

referidos na literatura, colocou-se a hipótese de estar a ocorrer a 15ºC uma incorporação do

ácido propiónico na célula, o que levaria a um aumento de quantidade de ácido

nas células filtradas, sem que tal correspondesse efectivamente

retida em consequência do desvio do equilíbrio por

conduzindo a uma sobrestimação do valor de pHin

hipótese de incorporação da forma não dissociada do ácido

incide no facto de se ter obtido uma alcalinização intracelular

urante o ensaio em meio mineral a 15ºC, onde foi utilizado [1-14C] ácido propiónico,

comparativamente à acidificação extracelular observada nessas condições

A maior intensidade com que se deu a alcalinização intracelular

uma menor dissociação do ácido fraco no interior da célula,


58

pH intracelular de S. cerevisiae W-em meio K a 15ºC, utilizando [1 -

-14C] ácido benzóico. Estão igualmente representados os valores de

ISA 1000 cultivada nas

303 utilizando [1-14C] ácido

se que se estabeleceu o equilíbrio ao fim de 90 minutos (Figura

6,75 após 90 minutos) encontra-

literatura [Kresnowati et

permitiu obter um valor de pHin

pH intracelular de S. cerevisiae W-

em meio K a 30ºC, utilizando [1-14C] ácido benzóico.

, por um lado, não ter sido possível obter uma estabilização do

equilíbrio entre a forma não

ios extracelular e intracelular, utilizando [1-14C]

realizadas a 15ºC para ambas as estirpes e de, por

superior aos valores

uma incorporação do

ácido propiónico na célula, o que levaria a um aumento de quantidade de ácido fraco

sem que tal correspondesse efectivamente a um aumento

o meio intracelular

in. Outro factor que

ociada do ácido em

alcalinização intracelular aparente mais

C] ácido propiónico,

nessas condições (Tabela 16,

alcalinização intracelular aparente poderá

uma menor dissociação do ácido fraco no interior da célula,

resultando numa menor acumulação de H

acidificaria o meio intracelular ou

acidificação do meio extracelular.

superior ao pH extracelular

lipossolúvel do ácido. Esta poderá ser, igualmente, outra

extracelular não ocorreu devid

somente garantindo a predominância da forma n

método descrito por Rottenberg

intracelular mais intensa do que a aci

um argumento a favor da ocorrência d

propiónico para a sua incorporação

Com vista a testar se se tratava de um artefacto, realizaram

condições, substituindo o ácido propiónico

existia a certeza de não ser

comunicação pessoal], utilizando a estirpe laboratorial como termo de validação dos

resultados.

Os resultados obtidos p

representados nas Figuras 19

equilíbrio ao fim de 150 minutos a 15ºC e 90 minutos a 30ºC.

Atendendo a estes resultados optou

do pHin em células recolhidas nas várias fases ao longo de fermentação, utilizando

ácido benzóico em substituição do

longo do tempo de forma a garantir uma situação de eq

deste ácido entre os meios intra

Na Figura 21 está descrito o comportamento de

K, a 15ºC e a 30ºC, relativamente a

fim de 150 minutos) e a 30ºC (ao fim de 90 minutos) foram, respectivamente, 6,48 e 6,60.


resultando numa menor acumulação de H+ no meio intracelular que

intracelular ou provocaria a expulsão de H+, com consequente

acidificação do meio extracelular. Garantindo que o pKa do ácido propiónico utilizado era

superior ao pH extracelular, assegurou-se a predominância da forma não dissociada

poderá ser, igualmente, outra das razões pela

devido à dissociação do ácido no meio extracelular

a predominância da forma não dissociada do ácido é

Rottenberg. A observação da ocorrência de uma

intracelular mais intensa do que a acidificação extracelular, poderá, portanto,

um argumento a favor da ocorrência de um desvio da forma não dissociada do

para a sua incorporação em membranas de células incubadas a 15ºC.

Com vista a testar se se tratava de um artefacto, realizaram-se ensaios nas mesmas

condições, substituindo o ácido propiónico marcado por ácido benzóico marcado para a qual

existia a certeza de não ser incorporado em experiências anteriores [M. C. Loureiro

utilizando a estirpe laboratorial como termo de validação dos

Os resultados obtidos para pHin determinado por este método encontram

19 e 20, onde se pode verificar que foi possível atingir o

150 minutos a 15ºC e 90 minutos a 30ºC.

endo a estes resultados optou por se realizar todos os ensaios para determinação

em células recolhidas nas várias fases ao longo de fermentação, utilizando

ácido benzóico em substituição do [1-14C] ácido propiónico, recolhendo

longo do tempo de forma a garantir uma situação de equilíbrio da forma não dissociada

intracelular e extracelular.

está descrito o comportamento de S. cerevisiae ISA 1000 cultivada em meio

K, a 15ºC e a 30ºC, relativamente ao pH intracelular. Os valores de pHin


Figura 21: pH intracelular de 1000, cultivada em meio K, a 15ºC (curva a 30ºC (curva vermelha), utilizando [7benzóico. Em abcissa representaincorporação do [7-14C] ácido benzóico no ensaio.


59

que, caso ocorresse,

, com consequente

Garantindo que o pKa do ácido propiónico utilizado era

da forma não dissociada

qual a acidificação

o do ácido no meio extracelular. Por outro lado,

é que seria válido o

a ocorrência de uma alcalinização

, portanto, contituir mais

desvio da forma não dissociada do [1-14C] ácido

células incubadas a 15ºC.

se ensaios nas mesmas

marcado por ácido benzóico marcado para a qual

em experiências anteriores [M. C. Loureiro-Dias,

utilizando a estirpe laboratorial como termo de validação dos

determinado por este método encontram-se

oi possível atingir o

ensaios para determinação

em células recolhidas nas várias fases ao longo de fermentação, utilizando [7-14C]

ácido propiónico, recolhendo-se amostras ao

uilíbrio da forma não dissociada

ISA 1000 cultivada em meio

obtidos a 15ºC (ao


de S. cerevisiae ISA em meio K, a 15ºC (curva azul) e

a 30ºC (curva vermelha), utilizando [7-14C] ácido Em abcissa representa-se o tempo de

C] ácido benzóico no

3.2.1.2. Em mosto estéril

Os resultados obtidos para o pH

e a 30ºC encontram-se descritos

Tal como foi possível observar, verific

1) Quer a 15ºC, quer a 30ºC

medida que a fermentação

dois últimos pontos de

2) O pHin das células recolhidas nas primeiras fases de fermentação é semelhante para

ambas as temperaturas;

3) A 15ºC existiram dois comportamentos nitidamente distintos con

fermentação nas quais as células foram recolhidas, sendo o pH

mais ácido para as células recolhidas em plena fase estacionária do que o observado

para células recolhidas até à entrada

4) A 30ºC não foi possível observar os dois comportamentos mencionados para o caso

das células cultivadas

processo fermentativo

moderada do que a 15ºC. Para além disso, o valor de pH

de final de fermentação a 30ºC foi

de crescimento a 15ºC.

Figura 22: Determinação do pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de ISA 1000 em mosto estéril, a 15ºC, utilizando [7tempo de incorporação do [7-14C] ácido benzóico no ensaio.


osto estéril

Os resultados obtidos para o pHin de células recolhidas ao longo de fermentação a 15ºC

se descritos na Tabela 9 e nas Figuras 22 e 23.

possível observar, verificou-se que:

Quer a 15ºC, quer a 30ºC ocorreu uma nítida acidificação do meio intracelular à

medida que a fermentação foi decorrendo, com maior expressão

dois últimos pontos de amostragem a 15ºC;

das células recolhidas nas primeiras fases de fermentação é semelhante para

ambas as temperaturas;

dois comportamentos nitidamente distintos con

fermentação nas quais as células foram recolhidas, sendo o pHin


para células recolhidas até à entrada desta fase.

não foi possível observar os dois comportamentos mencionados para o caso

das células cultivadas a 15ºC, uma vez que a acidificação intracelular

processo fermentativo de células cultivadas a 30ºC decorreu de uma forma mais

moderada do que a 15ºC. Para além disso, o valor de pHin observado para as células

de final de fermentação a 30ºC foi superior ao atingido pelas células na mesma fase

de crescimento a 15ºC.

Determinação do pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de ISA 1000 em mosto estéril, a 15ºC, utilizando [7-14C] ácido benzóico. Em abcissa representa

C] ácido benzóico no ensaio.


60

de células recolhidas ao longo de fermentação a 15ºC

uma nítida acidificação do meio intracelular à

principalmente nos

das células recolhidas nas primeiras fases de fermentação é semelhante para

dois comportamentos nitidamente distintos conforme as fases de

in significativamente


não foi possível observar os dois comportamentos mencionados para o caso

a 15ºC, uma vez que a acidificação intracelular ao longo do

células cultivadas a 30ºC decorreu de uma forma mais

observado para as células

superior ao atingido pelas células na mesma fase

Determinação do pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae bcissa representa-se o

Figura 23: pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de mosto estéril, a 30ºC, utilizando [7incorporação do [7-14C] ácido benzóico no ensaio.

Tabela 9: Valores de pH intracelular de diferentes fases de crescimento em mosto estéril, a 15ºC e a 30ºC.

Fase

Início de aceleração

Meio da exponencial

Final de exponencial

Início de estacionária

Meio da estacionária

Final de fermentação

Em meio mineral, o efeito d

de S. cerevisiae, cultivada a 25ºC,

estudo, estes autores observaram a ocorrência de

citoplasmático após a adição de etanol a uma suspensão de células

desenergizadas.

As temperaturas elevadas, em paralelo com outras formas de stresse (ex: etanol),

identificadas por Piper (1993)

membranar a H+, provocando um decréscimo do pH

se observou ao longo das fermentações a 15ºC e a 30ºC

aumento do influxo de H+, muitas das vezes associado à perturbação provocada pelo etanol

na membrana plasmática [Gurtovenko & Anwar, 2009]

ATPase membranar, resultando num aumento da expulsão de protões para o exterior das

células, como tentativa destas


pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiaemosto estéril, a 30ºC, utilizando [7-14C] ácido benzóico. Em abcissa representa

C] ácido benzóico no ensaio.

Valores de pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000 obtidos nos ensaios, para as diferentes fases de crescimento em mosto estéril, a 15ºC e a 30ºC.

Fase de crescimento Temperaturas

15ºC 30ºC

Início de aceleração 6,44 -

xponencial 6,30 6,42

Final de exponencial 6,09 6,22

Início de estacionária 6,09 5,95

Meio da estacionária 5,16 5,94

Final de fermentação 5,02 5,84

efeito do etanol no pH intracelular de uma estirpe mutante respiratória

, cultivada a 25ºC, foi estudado por Loureiro-Dias e Santos (1990). Neste

observaram a ocorrência de uma forte acidificação do compartimento

o após a adição de etanol a uma suspensão de células

As temperaturas elevadas, em paralelo com outras formas de stresse (ex: etanol),

por Piper (1993) como indutoras de um aumento da permeabilidade

, provocando um decréscimo do pHin [Piper, 1993]. O declínio do pH

das fermentações a 15ºC e a 30ºC, em consonância com

muitas das vezes associado à perturbação provocada pelo etanol

membrana plasmática [Gurtovenko & Anwar, 2009], pode estimular a actividade da H


stas reagirem face à descida do pHin [Piper, 1993]


61

cerevisiae ISA 1000 em sa representa-se o tempo de

ISA 1000 obtidos nos ensaios, para as

Temperaturas

30ºC

-

6,42

6,22

5,95

94

5,84

o etanol no pH intracelular de uma estirpe mutante respiratória

Dias e Santos (1990). Neste

uma forte acidificação do compartimento

o após a adição de etanol a uma suspensão de células energizadas e

As temperaturas elevadas, em paralelo com outras formas de stresse (ex: etanol), foram

um aumento da permeabilidade

declínio do pHin que

em consonância com o possível

muitas das vezes associado à perturbação provocada pelo etanol

a actividade da H+-


[Piper, 1993].


62

Com o objectivo de se tentar perceber de que forma é que as células incubadas a 15ºC

exibiram no final de fermentação um pHin tão baixo (pHin≈5) e mesmo assim se mantiveram

metabolicamente activas, procedeu-se à avaliação das velocidades de efluxo e de influxo de

H+ através da membrana plasmática.

3.2.2. Efluxo de H+ através da membrana plasmática

A membrana plasmática é um dos principais alvos do etanol nas leveduras (van Uden,

1985). Estudos prévios de alguns autores indicaram que o etanol inibe processos de

transporte mediado [Loureiro-Dias & Peinado, 1982; Leão & van Uden, 1984b; Sousa et al.,

1996] e estimula os processos de difusão simples [Leão & van Uden, 1984a; Casal et al.,

1998; Salgueiro et al., 1988]. Estas alterações na permeabilidade da membrana plasmática

podem ser prejudiciais para as células uma vez que limitam a entrada de nutrientes

essenciais e promovem a perda de constituintes intracelulares ou a entrada de substâncias

extracelulares as quais alteram a composição do citoplasma e, consequentemente, a

homeostasia celular.

Os protões estão usualmente em concentrações muito elevadas no meio extracelular e

as células, nomeadamente as células de levedura, possuem H+-ATPases que mantêm os

valores de pH intracelular a níveis compatíveis com a actividade fisiológica e geram força

protomotriz através da membrana plasmática. Em 3.2.1. observou-se que o comportamento

das células de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000, a 15ºC e 30ºC, ao nível do pH

intracelular, pode ser influenciado pelo etanol, uma vez que células colhidas nas fases finais

de fermentação apresentaram um pHin inferior ao pHin de células de início de fermentação.

De forma a serem observadas as alterações que ocorrem ao nível da capacidade de

expulsão de H+ através da membrana em células colhidas ao longo da fermentação vinária

em S. cerevisiae ISA 1000, principalmente por intermédio da actividade da H+-ATPase

membranar, procedeu-se à determinação deste parâmetro através da metodologia descrita

na secção 2.9. Sucintamente observou-se o movimento de protões, nas diferentes fases de

crescimento, às duas temperaturas testadas (15ºC e 30ºC), através do registo do pH ao

longo do tempo de uma suspensão de células desenergizadas, após adição de um pulso de

glucose que permitiu verificar uma acidificação do meio extracelular. Iniciou-se o registo a

pH 5, constatando-se que a acidificação extracelular ocorreu em todos os casos após a

adição de glucose e resultou do balaço da actividade de transportadores de H+

(principalmente da H+-ATPase membranar) e do influxo de protões (por difusão passiva de

H+ através da membrana plasmática em função do ∆pH existente).

Para o cálculo da velocidade de expulsão de protões traçou-se a tangente de cada curva

de acidificação (posterior à adição de glucose) e registou-se o declive que, associado a uma

calibração (com adição de X nmol de OH-) relaciona variações de pH com quantidades de

base adicionadas ao sistema, num determinado instante.

gráficos das velocidades de efluxo de H

ensaio original e na sua repetição.

3.2.2.1. Em meio K

Para a execução do primeiro ensaio

protónico de S. cerevisiae ISA 1000 foram

na secção 2.3..

Na Figura 24 estão represent

H+.g-1.h-1) a 15ºC e 30ºC, para

concentrações crescentes de etanol

efluxo de H+ obtida a 15ºC foi

observações de diversos autores

elevadas de efluxo observadas

reagirem face à dissipação da força protomotriz

A 15ºC a velocidade de expulsão de protões é muito baixa (valores compreendidos entre

0,17 e 0,57 mmol H+.g-1.h-1) e é

etanol no meio extracelular.

A 30ºC observou-se que um aumen

diminuição da velocidade de efluxo de protões

16% (v/v) de etanol (0,63 mmol H

de etanol (0,57 mmol H+.g-1.h

desde concentrações muito baixas

cultivadas a 30ºC, na medida em que 2% (v/v) de etanol provocou um decréscimo

acentuado de 3,81 mmol H+

etanol), continuando a velocidade de efluxo de protões

com o aumento da concentração de etanol.

Apesar de se ter constatado que

sempre superiores aos observados a 15ºC,


dicionadas ao sistema, num determinado instante. Cada ponto representado nos

gráficos das velocidades de efluxo de H+ constitui a média das velocidade

repetição.

eio K

a a execução do primeiro ensaio em meio K, de determinação da velocidade de efluxo

ISA 1000 foram utilizadas as condições experimentais

estão representadas as velocidades de efluxo de H+ (expressas em mmol

para S. cerevisiae ISA 1000 cultivada em meio K,

concentrações crescentes de etanol entre 0% e 20% (v/v). Verificou-se que

foi muito menor do que a obtida 30ºC, estando de acordo com as

diversos autores [Ahlers, 1981; Viegas et al., 1995]. As velocidades mais

as a 30ºC poderiam, em parte, indicar uma tentativa

issipação da força protomotriz.


) e é praticamente insensível a concentrações crescentes de

que um aumento da concentração de etanol

velocidade de efluxo de protões, de tal forma que o valor obtido

(0,63 mmol H+.g-1.h-1) é muito próximo do valor obtido a 15ºC para 0%

.h-1). Para além disso, foi possível constatar que o etanol

desde concentrações muito baixas na diminuição da velocidade de efluxo de células

cultivadas a 30ºC, na medida em que 2% (v/v) de etanol provocou um decréscimo +.g-1.h-1 (0% (v/v) etanol) para 1,98 mmol H

velocidade de efluxo de protões a diminuir de uma forma progressiva,

com o aumento da concentração de etanol.

Figura 24: Efluxo de protões atrmembrana plasmática de S. em meio K, a 15ºC (pontos azuis(pontos vermelhos), utilizando diferentconcentrações de etanol no me

e ter constatado que os valores de velocidade de efluxo de

sempre superiores aos observados a 15ºC, foi possível constatar uma relativa


63

Cada ponto representado nos

velocidades registadas no

velocidade de efluxo

as condições experimentais descritas

(expressas em mmol

em meio K, utilizando

que a velocidade de

, estando de acordo com as

As velocidades mais

uma tentativa das células


insensível a concentrações crescentes de

de etanol provocou uma

valor obtido a 30ºC para

) é muito próximo do valor obtido a 15ºC para 0%

Para além disso, foi possível constatar que o etanol actuou

na diminuição da velocidade de efluxo de células

cultivadas a 30ºC, na medida em que 2% (v/v) de etanol provocou um decréscimo

mmol H+.g-1.h-1 (2% (v/v)

diminuir de uma forma progressiva,

Efluxo de protões através da cerevisiae ISA 1000,

pontos azuis) e a 30ºC , utilizando diferentes

concentrações de etanol no meio extracelular.

os valores de velocidade de efluxo de H+ a 30ºC foram

relativa aproximação

dos valores obtidos às duas temperaturas para

H+.g-1.h-1 a 30ºC) e 16% (v/v)

etanol, uma vez que a 30ºC já não foi possível determinar o efluxo protónico a

etanol, na medida em que o valor de influxo

uma acidificação extracelular após pulso de glucose.


No caso das velocidades de efluxo de

a 15ºC para as diferentes fases de crescimento

concentração de etanol, em cada fase de cr

25).

Figura 25: Efluxo de protões através da membrana plasmática de diferentes fases de crescimento meio extracelular.

Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 15ºC

possível fazer as seguintes observações

1) De uma forma geral, as células em fermentações conduzidas a 15ºC expulsa

protões a uma baixa velocidade (V

fase exponencial, na ausência de etanol).

2) O perfil de velocidades de efluxo protónico em f

observado no início da fase exponencial demonstrou semelhanças

velocidades de células colhidas a partir da fase

início da fase exponencial,

mmol.g-1.h-1, quer por est

com o aumento da concentração de etanol


dos valores obtidos às duas temperaturas para 14% (0,49 mmol H+.g-1.h-1

16% (v/v) (0,30 mmol H+.g-1.h-1 a 15ºC, 0,63 mmol H

a 30ºC já não foi possível determinar o efluxo protónico a

que o valor de influxo foi superior para este caso, não

r após pulso de glucose.

osto estéril

das velocidades de efluxo de protões obtidas nos diferentes ensaios realizados

para as diferentes fases de crescimento em mosto, avaliou-se

em cada fase de crescimento, neste parâmetro fisiológico

Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiaediferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no

Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 15ºC

fazer as seguintes observações (Figura 25; Anexo VII):

De uma forma geral, as células em fermentações conduzidas a 15ºC expulsa

ixa velocidade (Vmáx registada = 0,73 mmol H+.g-

exponencial, na ausência de etanol).

O perfil de velocidades de efluxo protónico em função da concentração de etanol

observado no início da fase exponencial demonstrou semelhanças

células colhidas a partir da fase estacionária, quer

início da fase exponencial, velocidades de efluxo relativamente próximas de 0

por estas velocidades não terem sofrido oscilações

com o aumento da concentração de etanol (Vmédia ≈ 0,20 mmol H+.g


64

a 15ºC, 0,90 mmol

mmol H+.g-1.h-1 a 30ºC) de

a 30ºC já não foi possível determinar o efluxo protónico a 20% (v/v) de

não se observando

obtidas nos diferentes ensaios realizados

se a influência da

neste parâmetro fisiológico (Figura

cerevisiae ISA 1000, para as , utilizando diferentes concentrações de etanol no

Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 15ºC, foi

De uma forma geral, as células em fermentações conduzidas a 15ºC expulsaram -1.h-1 para o final da

unção da concentração de etanol

observado no início da fase exponencial demonstrou semelhanças com o perfil de

, quer por apresentar, no

relativamente próximas de 0

oscilações pronunciadas

.g-1.h-1).


65

3) O perfil de velocidades de efluxo de H+ para as fases meio e final de exponencial foi

algo irregular, no entanto foi possível observar que as velocidades permaneceram

relativamente constantes até aos 8% (v/v) (na fase meio da exponencial) e 10% (v/v)

(na fase final de exponencial) de etanol, notando-se em ambas as fases um aumento

da velocidade de efluxo protónico para a gama de concentrações de etanol de 10% a

12% (v/v). A partir de 14%, igualmente para as duas fases de crescimento, registou-

se um decréscimo das velocidades de efluxo protónico. A velocidade máxima de

efluxo de H+ a 15ºC registou-se para as células em fase final de exponencial, na

ausência de etanol (Vmáx = 0,73 mmol H+.g-1.h-1). Outro facto observado foi o de as

velocidades de efluxo protónico destas duas fases terem sido superiores em valor

absoluto às velocidades de células colhidas noutros pontos de amostragem pré-

definidos. Por outro lado, quando se comparam velocidades de expulsão de H+ de

células em plena fase exponencial, cultivadas em meio mineral e em mosto,

constata-se que em mosto as velocidades são menores do que em meio K a partir de

14% (v/v) de etanol (inclusive), muito embora não tenham sido registadas as

velocidades de efluxo de H+ de células cultivadas em meio K, para a gama de 2% a

6% (v/v) de etanol, não sendo possível portanto concluir se as velocidades de efluxo

protónico nessa gama de concentrações de etanol continuariam a ser superiores em

mosto.

4) No início da fase estacionária as velocidades de efluxo de H+ decaíram para valores

muito próximos de 0 (zero) mmol H+.g-1.h-1, registando-se uma baixa variação de

velocidades com o aumento da concentração de etanol.

5) As velocidades de efluxo protónico para as fases finais de fermentação (meio da

estacionária e final de fermentação) são as que apresentaram uma menor variação

com o aumento da concentração de etanol e as que tiveram um valor inferior ao da

velocidade de difusão de H+ para o interior da célula.

O etanol apenas teve influência nas velocidades de efluxo protónico das fases meio e

final da fase exponencial, observando-se nestas mesmas fases uma diminuição inicial da

taxa de efluxo de H+ para concentrações baixas de etanol (i.e., para 2% (v/v) etanol) e uma

diminuição mais significativa para concentrações superiores a 10% (v/v), muito próximas das

concentrações habitualmente encontradas no vinho. A situação observada no final de

fermentação, a 15ºC, de velocidades de difusão superiores às de efluxo de H+ origina

questões acerca de qual (ou quais) o(s) mecanismo(s) fisiológico(s) que está(ão) implícito(s)

na perda da capacidade da célula expulsar os protões, mantendo ainda assim a capacidade

metabólica.

Nas condições experimentais testadas

de efluxo protónico a 16% (v/v) de etanol para células recolhidas nas fases início e meio de

exponencial, uma vez que as

de efluxo, não tendo sido possível observar uma acidificação extracelular após pulso de

glucose.

Figura 26: Efluxo de protões através da membrana plasmática de diferentes fases de crescimento em mosto a 30meio extracelular.

Relativamente às células recolhidas ao longo de


1) Para as fases iniciais de fermentação,

exponencial, o perfil de velocidades de efluxo de H

que sofreu variações ascendentes e descendentes relativamente pronunciadas com

o aumento da concentração de etanol, não obstante terem sido superiores em valor

absoluto às velocidades de efluxo protónico de células a partir de meio da fase

estacionária de crescimento;

2) Por oposição, e tal como se havia constatado a 15ºC, a variação de velocidades de

efluxo protónico é menor para as fases de crescimento a partir d

estacionária;

3) A velocidade máxima de efluxo protónico foi obtida

exponencial de crescimento (2,58 mmol.g

crescimento, a adição de concentrações baixas deste composto

provocou uma diminuição da velocidade até 1,17 mmol.g

mínimo para esta fase

velocidade de efluxo protónico até 1,81 mmol.g

pequena a variação de velocidades, indiciando uma relativa estabilização das


Nas condições experimentais testadas a 15ºC não foi possível determinar as velocidades


as velocidades de influxo neste caso foram muito

possível observar uma acidificação extracelular após pulso de

Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiaediferentes fases de crescimento em mosto a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no

s células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 30ºC

fazer as seguintes observações (Figura 26; Anexo VII):

Para as fases iniciais de fermentação, que engloba o meio e

exponencial, o perfil de velocidades de efluxo de H+ foi algo irregular, na medida em




estacionária de crescimento;

Por oposição, e tal como se havia constatado a 15ºC, a variação de velocidades de

efluxo protónico é menor para as fases de crescimento a partir d

A velocidade máxima de efluxo protónico foi obtida para célula

exponencial de crescimento (2,58 mmol.g-1.h-1), na ausência de etanol. Nesta fase de

crescimento, a adição de concentrações baixas deste composto

provocou uma diminuição da velocidade até 1,17 mmol.g-1.h-1,

mínimo para esta fase. A adição de 8% (v/v) de etanol provocou

velocidade de efluxo protónico até 1,81 mmol.g-1.h-1. De 8% a 14% (v/v) de etanol, foi

a a variação de velocidades, indiciando uma relativa estabilização das


66

ão foi possível determinar as velocidades


muito superiores às

possível observar uma acidificação extracelular após pulso de

S. cerevisiae ISA 1000, para as ncentrações de etanol no

fermentações conduzidas a 30ºC foi

engloba o meio e o final de fase

foi algo irregular, na medida em




Por oposição, e tal como se havia constatado a 15ºC, a variação de velocidades de

efluxo protónico é menor para as fases de crescimento a partir de meio de

células em plena fase

), na ausência de etanol. Nesta fase de

crescimento, a adição de concentrações baixas deste composto (até 4% (v/v))

, atingindo o valor

8% (v/v) de etanol provocou um aumento da

. De 8% a 14% (v/v) de etanol, foi

a a variação de velocidades, indiciando uma relativa estabilização das


67

velocidades para esta gama de concentrações de etanol. Não foi possível obter

velocidades para concentrações superiores a 14% (v/v) de etanol, pois observou-se

durante a execução destes ensaios que as velocidades de influxo passivo de protões

foram superiores às de efluxo de H+. Comparativamente às velocidades de expulsão

de H+ de células na mesma fase de crescimento, mas cultivadas em meio mineral,

constata-se que as células cultivadas em meio K até 6% (v/v) (inclusive) de etanol

expulsaram H+ a uma velocidade superior relativamente às cultivadas em mosto. A

partir de 8% aconteceu precisamente o inverso, pertencendo as velocidades

superiores de efluxo de H+ às células cultivadas em mosto.

4) As velocidades de efluxo protónico de células em fase final de exponencial foram as

que variaram mais o seu perfil com o aumento da concentração de etanol. Tal como

o observado para a fase anterior, a adição de concentrações baixas de etanol (até

4% (v/v) inclusive) diminuiu a velocidade de efluxo até 0,72 mmol.g-1.h-1, atingindo

novamente o seu valor mínimo para esta fase de crescimento. A adição de 8% (v/v)

de etanol provocou um aumento pronunciado da velocidade de efluxo protónico para

2,25 mmol.g-1.h-1 sendo que, para concentrações superiores de etanol (i.e., de 8% a

16% (v/v)), observou-se uma diminuição relativamente constante das velocidades de

efluxo atingindo um valor de 0,68 mmol.g-1.h-1, para 16% (v/v) de etanol. Novamente

não foi possível obter velocidades para concentrações superiores a 16% (v/v) de

etanol pelas mesmas razões acima referidas.

5) Para células em início de fase estacionária a adição de 4% de etanol provocou um

ligeiro aumento da velocidade de efluxo, comparativamente com a velocidade obtida

na ausência de etanol, atingindo o valor 1,64 mmol.g-1.h-1 que foi máximo para esta

fase. A adição de 6% (v/v) de etanol provocou um decréscimo da velocidade de

efluxo, sendo que para a gama de concentrações de 8% a 16% (v/v) (inclusive) de

etanol foi possível observar uma relativa estabilização das velocidades de efluxo de

H+ (Vmédia ≈ 0,72 mmol.g-1.h-1).

6) As velocidades de efluxo protónico para as fases finais de fermentação (meio da

estacionária e final de fermentação) são as que apresentaram os valores mais

baixos, comparativamente com as outras fases, e são as que tiveram uma menor

variação com o aumento da concentração de etanol. Apesar disso, foi possível

constatar que a adição de 2% e de 4% (v/v) provocou um ligeiro aumento da

velocidade de efluxo protónico para as células em plena fase estacionária. A partir de

6% até 20% a velocidade de efluxo protónico de células em plena fase estacionária

estabilizou-se nos ≈0,50 mmol.g-1.h-1. Para células em final de fermentação, a

velocidade de efluxo protónico foi praticamente constante (≈0,45 mmol.g-1.h-1) para

todas as concentrações de etanol testadas.

3.2.3. Permeabilidade da membrana ao influxo de protões

Paralelamente às determinações das velocidades de efluxo protónico, foram realizados

ensaios com o intuito de se observarem as alterações que ocorrem ao nível da

permeabilidade da membrana plasmática

processo de fermentação vinári

os diferentes pontos de amostragem

30ºC), bem como foi estudada

etanol na permeabilidade da membrana.

2.8, no entanto é importante referir que se procedeu ao registo do pH a partir de pH 4. À

semelhança do que aconteceu nos ensaios de efluxo de H

gráficos de permeabilidade de H

original e na sua repetição.

3.2.3.1. Em meio K

A observação da Figura 2

células a 30ºC são superiores

todas as concentrações de etanol testada

em que é conhecida a relação

bicamada lipídica e é conhecido o efeito

[Jiménez & van Uden, 1985].

diferente as velocidades de influxo protónico conforme o crescimento

30ºC. A 15ºC, embora a variação de velocidade

geral tenha sido baixa, é notório

aumento da concentração de etanol

de H+ para as mesmas condições


Permeabilidade da membrana ao influxo de protões

terminações das velocidades de efluxo protónico, foram realizados


permeabilidade da membrana plasmática relativamente aos H+, em célula

processo de fermentação vinária. Foram determinadas as velocidades de influxo de

os diferentes pontos de amostragem (definidos em 2.3.6.), às duas temperaturas (15ºC e

foi estudada em simultâneo a influência de diferentes concentrações de

e da membrana. A metodologia utilizada está descrita na secção

, no entanto é importante referir que se procedeu ao registo do pH a partir de pH 4. À

semelhança do que aconteceu nos ensaios de efluxo de H+, cada ponto representado nos

bilidade de H+ constitui a média das velocidades registadas

eio K

Figura 27: Influxo de protões através da membrana plasmática de S. em meio K a 15ºC (pontos azuis)(pontos vermelhos), utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.

27 permite constatar que as velocidades de

são superiores comparativamente a 15ºC. Este resultado é observável

de etanol testadas, estando de acordo com o esperado, na medida

é conhecida a relação entre a temperatura e a difusão passiva

é conhecido o efeito do etanol no estímulo do influxo

. Por outro lado, verifica-se que o etanol influenci

diferente as velocidades de influxo protónico conforme o crescimento tenha sido

30ºC. A 15ºC, embora a variação de velocidade em função da concentração de etano

baixa, é notório que houve um ligeiro estímulo de entrada de H

aumento da concentração de etanol, enquanto a 30ºC se verificou uma diminui

para as mesmas condições.


68

terminações das velocidades de efluxo protónico, foram realizados


em células ao longo do

. Foram determinadas as velocidades de influxo de H+ para

às duas temperaturas (15ºC e

a influência de diferentes concentrações de

utilizada está descrita na secção

, no entanto é importante referir que se procedeu ao registo do pH a partir de pH 4. À

, cada ponto representado nos

constitui a média das velocidades registadas no ensaio

nfluxo de protões através da cerevisiae ISA 1000,

(pontos azuis) e a 30ºC , utilizando diferentes

concentrações de etanol no meio extracelular.

as velocidades de influxo de H+ nas

Este resultado é observável para

, estando de acordo com o esperado, na medida

passiva de H+ através da

influxo passivo de H+

que o etanol influenciou de forma

tenha sido a 15ºC ou a

em função da concentração de etanol no

um ligeiro estímulo de entrada de H+ com o

diminuição do influxo


3.2.3.2.1. Células suspensas

Nas Figuras 28 e 29 estão representadas as velocidades de influxo de protões através da

membrana plasmática, para diferentes fases de crescimento de

fermentações vinárias conduzidas a 15ºC

Figura 28: Influxo de protões através da membrana plasmática de diferentes fases de crescimento em meio extracelular.

Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a


1) Para as fases iniciais de fermentação, incluindo o final d

de velocidades de influxo

adicionada à suspensão de células

de influxo de H+ foram

de meio da fase estacionária de crescimento;

2) As fases início e meio de exponencial demonstraram ter um

semelhante, no entanto é possível afirmar que, apesar das pequenas oscilações

observadas em função da concentração de etanol no meio extracelular, se verificou

uma relativa estabiliza

Vmédia ≈ 0,24 mmol.g-1.h

influxo aumentou substancialmente

3) A fase final de exponencial

velocidades de influxo de H

extracelular, muito embora estas oscilações tenham demonstrado no geral uma

tendência de aumento da

concentração de etanol;


osto estéril

Células suspensas e incubadas em água desmineralizada

estão representadas as velocidades de influxo de protões através da

membrana plasmática, para diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae

fermentações vinárias conduzidas a 15ºC e a 30ºC, respectivamente.

nfluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiaediferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no

células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a

fazer as seguintes observações (Figura 28; Anexo VIII):

Para as fases iniciais de fermentação, incluindo o final da fase exponencial, o perfil

influxo de H+ variou consoante a concentração de etanol

adicionada à suspensão de células, no entanto, de uma forma geral

foram superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir

de meio da fase estacionária de crescimento;

início e meio de exponencial demonstraram ter um perfil de velocidades

no entanto é possível afirmar que, apesar das pequenas oscilações


uma relativa estabilização do influxo protónico no início da fase exponencial a uma

.h-1, enquanto no caso das células em plena fase exponencial o

aumentou substancialmente a 20% (v/v) de etanol;

exponencial foi a que demonstrou sofrer maiores oscilações

velocidades de influxo de H+ perante concentrações crescentes

, muito embora estas oscilações tenham demonstrado no geral uma

tendência de aumento da velocidade de influxo de H+, com o aumento da

concentração de etanol;


69

desmineralizada

estão representadas as velocidades de influxo de protões através da

cerevisiae ISA 1000 em


células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 15ºC foi

fase exponencial, o perfil

consoante a concentração de etanol

de uma forma geral as velocidades

superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir

perfil de velocidades

no entanto é possível afirmar que, apesar das pequenas oscilações


ção do influxo protónico no início da fase exponencial a uma

, enquanto no caso das células em plena fase exponencial o

foi a que demonstrou sofrer maiores oscilações nas

de etanol no meio

, muito embora estas oscilações tenham demonstrado no geral uma

, com o aumento da

4) As velocidades de influxo protónico de células e

muito próximas de 0 (zero) mmol.g


5) Nas fases finais de fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) as

velocidades de influxo protónic

de etanol testadas.

Figura 29: Influxo de protões através da membrana plasmática de diferentes fases de crescimento meio extracelular.

Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 30ºC foi


1) Durante a fase exponencial e o início de fase estacionária de crescimento

velocidades de influxo de H

etanol adicionada à suspensão de células, no entanto,

foram superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir de meio da

fase estacionária de crescimento;

2) Relativamente à fase exponencial, foi possível observar que as células em plena fase

exponencial mantiveram relativamente constantes as suas velocidades até à

concentração de 16% (v/v) de etanol

velocidade de influxo para concentrações superiores deste composto. Por

comparação, as células nas fases final de exponencial e início de estacionária viram

aumentadas as suas velocidades de influxo protónico para concent

a 14% e 18% (v/v) de etanol

de uma forma geral, demonstrou ter velocidades de influxo protónico superiores às

das restantes fases;


velocidades de influxo protónico de células em início de fase estacionária

muito próximas de 0 (zero) mmol.g-1.h-1, independentemente da concentração de


Nas fases finais de fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) as

velocidades de influxo protónico medidas foram nulas para todas as concentrações

nfluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiaediferentes fases de crescimento em mosto a 30ºC, utilizando diferentes concentraçõe


fazer as seguintes observações (Figura 29; Anexo VIII):

Durante a fase exponencial e o início de fase estacionária de crescimento

velocidades de influxo de H+ sofreram oscilações consoante a concentração de

etanol adicionada à suspensão de células, no entanto, foi possível constatar que

superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir de meio da

ria de crescimento;

Relativamente à fase exponencial, foi possível observar que as células em plena fase


concentração de 16% (v/v) de etanol (Vmédia ≈ 0,55 mmol.g-1.h



aumentadas as suas velocidades de influxo protónico para concent

(v/v) de etanol, respectivamente. A fase final de exponencial foi a que,



70

m início de fase estacionária foram

, independentemente da concentração de

Nas fases finais de fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) as

o medidas foram nulas para todas as concentrações



Durante a fase exponencial e o início de fase estacionária de crescimento as

consoante a concentração de

foi possível constatar que

superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir de meio da

Relativamente à fase exponencial, foi possível observar que as células em plena fase


.h-1), aumentando a



aumentadas as suas velocidades de influxo protónico para concentrações superiores

A fase final de exponencial foi a que,



71

3) As velocidades de influxo protónico de células colhidas das fases finais de

fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) foram muito próximas de

0 (zero) mmol.g-1.h-1, independentemente da concentração de etanol no meio

extracelular.

3.2.3.2.2. Células suspensas e incubadas em tampões

As constatações retiradas dos ensaios de efluxo de H+, onde especificamente foi possível

verificar que S. cerevisiae ISA 1000 apresentou velocidades de efluxo muito próximas de

zero em todas as fases de crescimento a 15ºC (onde inclusivamente a partir de meio da fase

estacionária as velocidades de efluxo de H+ observadas foram inferiores às de influxo -

Figura 25) e dos ensaios de influxo de H+ a 15ºC, onde as velocidades obtidas para as

células colhidas e ressuspendidas em água desmineralizada a partir de fase estacionária

foram nulas (Figura 28), independentemente da concentração de etanol adicionada ao meio

extracelular, despoletou a necessidade de se procurar entender este comportamento

peculiar das células, uma vez que todas estas observações indiciaram uma possível

impermeabilização da membrana plasmática das células nas fases finais de fermentação a

15ºC e a 30ºC.

A hipótese do pH interno de células colhidas a partir de meio da fase estacionária a 15ºC

ser inferior ao pH extracelular poderia justificar as baixas velocidades de efluxo e a baixa

permeabilidade observadas nesta fase por distúrbios que o pH interno estivesse a provocar

nas componentes da força protomotriz (∆pH e ∆ψ).

Houve, então, a necessidade de se proceder a novas determinações de velocidades de

influxo protónico, neste caso utilizando soluções tamponizadas (Tris 10mM citrato) a pH 5

(valor de pH que já garantia um ∆pH) e a pH 6,3 (valor de pH de células “saudáveis” no vaso

reactor do ensaio) como meio de suspensão e de incubação das células, de forma a garantir

que a causa da ocorrência de velocidades muito baixas de efluxo e de influxo protónico de

células colhidas a partir de meio da fase estacionária não seria devido à ausência de ∆pH,

mas à possibilidade de impermeabilização das células nesta fase de crescimento.

Perante os resultados evidenciados através das Figuras 30 e 31 foi possível confirmar

que as baixas velocidades de influxo protónico corresponderam efectivamente a uma

permeabilidade a H+ extremamente baixa de células em plena fase estacionária, cultivadas

a 15ºC e a 30ºC, muito embora se tenha observado através da Figura 30 que as células a

15ºC evidenciaram uma permeabilidade que demonstrou ser ainda inferior (quase nula) à de

células cultivadas a 30ºC (Figura 31).

Figura 30: Influxo de protões através da membrana plasmática de fermentações de mosto a 15ºC, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água (pontos azuis), Tris 10mM citrato pH diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases final de fermentação.

Figura 31: Influxo de protões através da membrana plasmática de fermentações de mosto a 30ºC, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água (pontos azuis), Tris 10mM citrato pHdiferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases final de fermentação.

3.3. Discussão Geral

Foi pretendido com este trabalho estudar o efeito conjugado do etanol e da temperatura

nos aspectos relacionados com a homeostase protónica de células ao longo

vinária realizada a 15ºC e a 30ºC

Ao contrário da maioria dos estudos realizados ant

se com este trabalho aproximar

condições em que normalmente são realizad

simular esta situação em laboratório atendendo às diferenças descritas por vários autores

entre: 1) estirpes industriais vs estirpes laboratoriais

laboratoriais vs condições de a

vínica de S. cerevisiae, isolada a partir de um fermento comercial liofilizado (FERMIVIN

mosto de uva branca, que

condições de fraca agitação e

tintos (30ºC) e os vinhos brancos (15ºC).

condições de estudo das condições de adega, onde normalmente são utilizadas cubas sem

(a)

(a)


nfluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água

os azuis), Tris 10mM citrato pH 5 (pontos vermelhos) e Tris 10mM citrato pH diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da estacionária e

nfluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água

(pontos azuis), Tris 10mM citrato pH 5 (pontos vermelhos) e Tris 10mM citrato pHdiferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da est

trabalho estudar o efeito conjugado do etanol e da temperatura

s aspectos relacionados com a homeostase protónica de células ao longo

e a 30ºC por Saccharomyces cerevisiae ISA 1000

contrário da maioria dos estudos realizados anteriormente sobre este tema

aproximar tanto quanto possível as condições de estudo das

condições em que normalmente são realizadas as fermentações em adega,

esta situação em laboratório atendendo às diferenças descritas por vários autores

entre: 1) estirpes industriais vs estirpes laboratoriais [Pizarro et al., 2007

laboratoriais vs condições de adega [Pretorius, 2000]. Para tal, utilizou-

, isolada a partir de um fermento comercial liofilizado (FERMIVIN

sofreu previamente os habituais tratamentos em adega,

a agitação e 4) temperaturas a que normalmente são produzido os vinhos

tintos (30ºC) e os vinhos brancos (15ºC). Estas condições descritas permitiram aproximar as


(b)

(b)


72

cerevisiae ISA 1000, em , após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água

rmelhos) e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando meio da estacionária e (b)

cerevisiae ISA 1000, em , após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água

5 (pontos vermelhos) e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando meio da estacionária e (b)

trabalho estudar o efeito conjugado do etanol e da temperatura

s aspectos relacionados com a homeostase protónica de células ao longo da fermentação

ISA 1000.

eriormente sobre este tema, procurou-

tanto quanto possível as condições de estudo das

as as fermentações em adega, procurando

esta situação em laboratório atendendo às diferenças descritas por vários autores

., 2007] e 2) condições

-se: 1) uma estirpe

, isolada a partir de um fermento comercial liofilizado (FERMIVIN®), 2)

os habituais tratamentos em adega, 3)

4) temperaturas a que normalmente são produzido os vinhos

Estas condições descritas permitiram aproximar as



73

agitação e sem arejamento (atingindo-se rapidamente condições de semi-anaerobiose) e

onde frequentemente se utilizam pré-inóculos de leveduras liofilizadas com 1x106 células/mL

de mosto.

O estabelecimento de pontos de amostragem às duas temperaturas de estudo, com base

nos pontos escolhidos a partir do estudo de Rossignol e colaboradores (2003), permitiu-nos

monitorizar de uma forma mais eficiente os diversos ensaios realizados a 15ºC e a 30ºC e

avaliar as diferenças de comportamento da estirpe em vários aspectos de homeostase

protónica.

Atendendo às curvas de crescimento obtidas a 15ºC e a 30ºC, facilmente se pôde

constatar que a temperatura demonstrou ser, de facto, um dos factores principais que

influenciam as fermentações vinárias, pois o seu efeito fez-se sentir nos diferentes aspectos

da fisiologia da levedura estudados.

A utilização de temperatura baixa de crescimento provocou, tal como esperado, a

diminuição da taxa específica de crescimento da estirpe e da taxa de fermentação,

aumentando a duração do período de fermentação do mosto de uva branca (≈304h),

comparativamente ao obtido a 30ºC (≈71h), à semelhança dos resultados obtidos por

diversos autores em fermentações realizadas em mosto sintético [Torija et al., 2003a; Torija

et al., 2003b, Novo et al., 2003]. O rendimento em biomassa (gbiomassa/molglucose) foi mais

elevado a 30ºC (≈114gbiomassa/molglucose) durante a fase exponencial de crescimento,

comparativamente a 15ºC (≈87gbiomassa/molglucose), podendo este resultado estar relacionado

com (1) uma maior taxa específica de transferência de glucose obtida a 30ºC

(≈5,24mmolglucose.g-1

biomassa.h-1), comparativamente à obtida a 15ºC (≈1,25mmolglucose.g

-

1biomassa.h

-1) durante a fase exponencial de crescimento, o que significa que a esta

temperatura houve uma maior quantidade de glucose mobilizada por quantidade de

biomassa formada durante a fase exponencial e com (2) a diminuição de expressão de

HXT1 (gene que codifica para transportador de hexoses de baixa afinidade, normalmente

expresso durante a fase exponencial de crescimento), observada por Pizarro e

colaboradores (2008) em fermentações de mosto sintético a 15ºC [Pizarro et al., 2008],

pressupondo que o mesmo se verifica em mosto real. A concentração final de etanol obtida

a 30ºC foi mais baixa comparativamente à concentração obtida a 15ºC, confirmando as

observações de diversos autores de ocorrência de uma menor produção de etanol para

temperaturas altas de fermentação [Casey & Ingledew, 1986]. A possível explicação para

este resultado poderá estar relacionada com o aumento da quantidade de produtos de

outras vias metabólicas (e.g. acido acético e glicerol), durante a fermentação a 30ºC, que

perturbam o metabolismo da levedura e conduzem a rendimentos mais baixos em etanol

[Torija et al., 2003a; Pizarro et al., 2008].


74

No período que comprende o final da fase exponencial e o início da fase estacionária de

fermentações conduzidas a 30ºC ocorreu um resultado interessante referente ao consumo

de glucose e produção de etanol. Durante este período foi consumido ≈40% da glucose e foi

produzido ≈58% do etanol, indiciando que a transição entre estas fases teve uma

importância acrescida nas fermentações a 30ºC. Até à data não são conhecidos estudos

que tenham referido este comportamento das células neste período de desaceleração entre

as fases final de exponencial e início de estacionária, deixando a questão em aberto.

Para além do efeito conjugado do etanol e da temperatura mais pronunciado em

fermentações conduzidas a 30ºC, existem outros factores que podem igualmente ter

actuado no aumento da sensibilidade de células de levedura que se encontraram à entrada

de fase estacionária, tais como: (1) baixa disponibilidade em O2 e consequente implicação

na biossíntese de ergosterol e (2) acção conjunta do etanol e ácidos fracos. A baixa

disponibilidade de O2 é particularmente relevante nas fermentações decorridas a 30ºC, uma

vez que a solubilidade do O2 é menor, quanto maior for a temperatura, razão pela qual a

condição de anaerobiose é atingida mais cedo nas fermentações a 30ºC. Uma vez atingida

esta condição, deixa de ocorrer a síntese de ergosterol, sendo comprometidas a biossíntese

de membranas e o processo de gemulação e as células iniciam o seu processo de entrada

em fase estacionária. Relativamente à acção conjunta do etanol e dos ácidos fracos, apesar

de não se ter efectuado a quantificação de ácido acético neste estudo, se tivermos em

consideração os resultados de Torija e colaboradores (2003b), onde foi referida uma maior

produção de ácido acético a temperaturas mais altas de fermentação, podemos pressupor

que a 30ºC o teor deste composto vai sendo superior ao longo das diferentes fases de

fermentação a esta temperatura, comparativamente a 15ºC, razão pela qual o efeito

sinérgico do etanol/ácido acético não poderá ser desprezado nas fermentações a 30ºC,

onde possivelmente poderá ocorrer a acumulação intracelular da forma dissociada do ácido,

perturbando o metabolismo e o crescimento das células em fase exponencial.

Neste trabalho foi utilizada uma metodologia de “reavivamento” das células (prévia à

inoculação) diferente da usual na indústria vínica, onde é feita comummente a rehidratação

das leveduras liofilizadas comerciais em água a ≈38ºC para se proceder posteriormente à

inoculação. O perfil de viabilidade (considerando apenas a leitura de UFC/mL) demonstrado

pelas células a 15ºC e a 30ºC permitiu destacar dois períodos críticos: o início e o final de

fermentação. No período inicial de fermentação constatou-se que houve um decréscimo da

população viável face à população inicialmente inoculada (i.e., 1x106 células/mL) para as

duas temperaturas de estudo. No entanto, esse decréscimo foi mais evidente a 30ºC, uma

vez que nas primeiras 2 horas de fermentação se observou uma redução de 1/10 da

população inicial. Se atendermos a que as células em plena fase exponencial, provenientes

de um pré-inóculo em mosto a 28ºC, foram inoculadas em 800 mL de mosto estéril a 30ºC,


75

temos pelo menos 3 factores que podem ter actuado de uma forma sinérgica na redução da

população viável inicial: (1) stresse provocado pela diluição efectuada à população

proveniente do pré-inóculo, (2) aumento, pequeno mas significativo, da temperatura de

crescimento, que possivelmente a aproximou da temperatura de morte térmica [van Uden,

1984] e (3) estado fisiológico das células no pré-inóculo, na medida em que as células em

fase exponencial, mais sensíveis ao stresse [Mager & Varela, 1993], encontravam-se na

presença de etanol quando foram colhidas. Como foi comprovado que qualquer aumento da

temperatura de crescimento, mesmo que seja de pequena amplitude, pode provocar um

distúrbio muito superior no crescimento das células, quando comparado com um

abaixamento da temperatura de crescimento [van Uden, 1984], este aspecto terá de ser tido

em consideração no procedimento de fermentação vinária em adega, uma vez que é

frequente nestes casos a subida de temperatura do mosto para valores acima dos 30ºC, o

que poderá conduzir a paragens prematuras de fermentação. Em condições de temperatura

controlada, como foi o caso dos ensaios apresentados, a temperatura não funcionou per si

na diminuição acentuada da população viável observada a 30ºC, uma vez que se observou

a manutenção da viabilidade celular durante todo o processo fermentativo. Outros factores,

tais como o efeito de diluição, a maior sensibilidade das células em fase exponencial de

crescimento, o baixo pH extracelular e a presença de SO2 e de resíduos de pesticidas

[Querol et al., 2003; Zuzuarregui & del Olmo, 2004], têm de ser igualmente tidos em

consideração, pois provavelmente actuaram, de uma forma sinérgica, na criação de um

ambiente inicial mais adverso para a população que provinha do pré-inoculo a 28ºC. No final

de fermentação, quer a 15ºC, quer a 30ºC, foi possível constatar que a população viável

acompanhou as leituras de D.O.640nm, indicando que as células se mantiveram viáveis até

esgotarem a glucose. As temperaturas 15ºC e 30ºC de crescimento não demonstraram ser

suficientemente nefastas para, em paralelo com outros os factores anteriormente

mencionados presentes no final de fermentação, serem capazes de criar um meio inóspito

para a manutenção da população viável até ao final de fermentação.

Ensaios realizados em paralelo, para os quais foi prolongado o período de recolha de

pontos para além do final de fermentação, possibilitaram a observação de diminuição da

viabilidade quer a 15ºC, quer a 30ºC [V. Salvador, comunicação pessoal]. O estudo de

Pizarro e colaboradores (2008) revelou que os factores maioritariamente afectados pelas

temperaturas sub-óptimas de crescimento são o processamento de RNA, o metabolismo da

trealose e a resposta ao stresse [Pizarro et al., 2008]. Por outro lado, a perda de viabilidade

a 30ºC poderá estar relacionada com as perturbações celulares provocadas pelo efeito

conjunto do etanol e da temperatura [van Uden, 1984; Casey et al., 1984]: (1) alteração da

estrutura da membrana plasmática [Walton & Pringle, 1980; Lucero et al., 2000] e

consequente aumento de fluidez da membrana [Ingram & Buttke, 1984], perda de


76

integridade membranar (que afecta uma série de sistemas de transporte de solutos [Leão &

van Uden, 1984a,b]) e aumento de permeabilidade passiva a iões e a pequenos metabolitos

[Quintas et al., 2000], (2) diminuição da síntese proteica [Warner & Gorenstein, 1977;

Hinnebusch, 2005], (3) formação de uma fase interdigitada na camada lipídica, criando

zonas mais permeáveis a moléculas polares e a iões [Gurtovenko & Anwar, 2009], (4)

dissipação do gradiente de protões, repercutindo-se na inibição da actividade da H+-ATPase

membranar [Cartwright et al., 1987] e no estímulo de influxo passivo de H+ [Salgueiro et al.,

1988; van Uden, 1985] e (5) actuação sinérgica do etanol e do ácido acético [Pampulha &

Loureiro-Dias, 1989].

Como o intuito de avaliar a capacidade de homeostase protónica das células e inferir

sobre o seu estado fisiológico e a sua capacidade de sobrevivência nas diferentes situações

de stresse ao longo da fermentação, centrou-se o estudo nos seguintes aspectos: pH

intracelular, efluxo de H+ e permeabilidade passiva a H+.

Os resultados obtidos a partir dos ensaios preliminares de determinação do pHin de S.

cerevisiae ISA 1000 e de S. cerevisiae W-303, em meio mineral a 15ºC, com utilização de

[1-14C] ácido propiónico, permitiram colocar a hipótese de estar a ocorrer uma incorporação

da forma não dissociada do ácido fraco na membrana plasmática da célula a esta

temperatura de crescimento. Se atendermos a que, por um lado, os ácidos gordos

constituintes da membrana plasmática se tornam mais insaturados à medida que a

temperatura de crescimento diminui [Watson, 1987] e por outro, os ácidos gordos de cadeia

curta têm um efeito similar, em termos físicos, na membrana plasmática ao de uma dupla

ligação de um ácido gordo de cadeia longa [Quinn & Chapman, 1980], a hipótese colocada

de incorporação de ácido propiónico poderá fazer sentido numa perspectiva da célula

aumentar a fluidez da sua membrana plasmática, permitindo a manutenção da actividade

das proteínas constituintes da membrana, assim como os transportes membranares

associados. Verificou-se igualmente, a partir das determinações do pHin, a ocorrência de

acidificação intracelular ao longo das fermentações conduzidas a ambas as temperaturas,

estando de acordo com as observações de alguns autores, que constataram que o etanol

aumenta a permeabilidade da membrana plasmática ao influxo passivo de protões [Leão &

van Uden, 1984a; Salgueiro et al., 1988; van Uden, 1985] e pode inibir a actividade da H+-

ATPase membranar [Cartwright et al., 1987], resultando num aumento da concentração de

protões no citoplasma. No entanto, é importante ressalvar que, no caso específico das

determinações de pHin efectuadas neste trabalho, os ensaios foram realizados com células

recolhidas directamente do mosto e sujeitas a situações de stresse inerentes ao próprio

mosto. Como tal, o stresse provocado pelo etanol aplica-se, neste caso, à quantidade de

composto formado durante a fermentação. Foi curioso ter observado a 15ºC que as células

colhidas a meio da fase estacionária e no final de fermentação se mantiveram viáveis e


77

metabolicamente activas, apresentando valores de pHin muito baixos (pHin≈5,00). Até à data,

não se encontraram estudos que expliquem este comportamento das células observado no

final de fermentação, apenas se pode acrescentar que a manutenção da viabilidade não

está relacionada com a substituição de células mortas por novas células, uma vez que a

observação ao microscópio confirmou que as células não se encontram a gemular nesta

fase de fermentação.

Como o pHin está associado à concentração de H+ no citoplasma, era importante verificar

os fluxos membranares, avaliando o efluxo e o influxo de H+ nas diferentes fases de

fermentação a 15ºC e a 30ºC.

Os resultados referentes ao efluxo de H+ demonstraram que a 30ºC a expulsão de

protões foi superior à de 15ºC em todas as fases de fermentação, tanto em meio mineral,

como em mosto, estando de acordo com as observações de vários autores [Ahlers, 1981;

Viegas et al., 1995]. Este resultado poderá constituir uma explicação para o pHin obtido no

final de fermentação a 30ºC ter sido mais alto ao homólogo obtido a 15ºC, garantindo a 30ºC

uma menor acumulação de H+ no citoplasma. Constatou-se igualmente que baixas

concentrações de etanol tiveram efeito na redução do efluxo a 30ºC, o que possivelmente

poderá estar relacionado com a ocorrência de inibição, a 30ºC, da actividade da H+-ATPase

membranar promovida pelo etanol [Cartwright et al., 1987]. Por outro lado, foi possível

observar, tanto a 15ºC, como a 30ºC, que as velocidades máximas de efluxo protónico

foram atingidas em células colhidas durante a fase exponencial, que se encontram

metabolicamente mais activas.

Os resultados obtidos em meio mineral e em mosto, referentes à medição da

permeabilidade a H+ da membrana plasmática, revelaram a ocorrência de um maior influxo

de H+ a 30ºC, estando de acordo com os estudos de diversos autores, que explicaram a

ocorrência de maior permebilidade da membrana plasmática, com base no efeito sinérgico

do etanol e da temperatura [Ingram & Buttke, 1984; Quintas et al., 2000].

A constatação da ocorrência de velocidades muito baixas de influxo e de efluxo de H+, a

15ºC e a 30ºC, obtidas em células no final de fermentação, levou a colocar a hipótese de o

pH interno ser inferior ao pH externo de células lavadas e ressuspendidas em água

desmineralizada, no período que precede este tipo de ensaios. O possível distúrbio nas

componentes da força protomotriz que o pH interno estivesse a provocar, justificaria as

velocidades baixas de efluxo e de influxo obtidas. No entanto, os resultados obtidos nos

ensaios posteriores de determinação do influxo protónico, onde foram utilizadas duas

soluções tampão, a pH’s que garantissem a existência de ∆pH, permitiram concluir que as

baixas velocidades de influxo protónico obtidas em células nas fases finais de fermentação

corresponderam a uma permeabilidade extremamente baixa a H+.


78

O presente trabalho cumpriu com os objectivos propostos permitindo, por um lado,

sustentar a hipótese defendida por vários autores de que existem diferenças significativas

nos resultados obtidos quando se utilizam (1) condições laboratoriais e condições de adega

e (2) estirpes laboratoriais e estirpes industriais. Por outro lado, este trabalho permitiu

constatar que as células nas fases finais de fermentação a 15ºC são fisiologicamente

diferentes das células presentes noutras fases, pois permanecem metabolicamente activas

e viáveis até à conclusão do processo fermentativo por esgotamento da glucose, apesar de

apresentarem baixo pHin, baixo efluxo de H+ e permeabilidade a H+ muito baixa.

CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTUTRAS

79

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS

Durante a fermentação vinária, as leveduras são submetidas a uma diversidade de

situações de stresse. O estado fisiológico das células sofre alterações significativas,

tornando as células em fase estacionária fisiologicamente muito diferentes das células nas

primeiras fases de fermentação.

Diversos autores têm referido que o etanol afecta aspectos chave da fisiologia de

leveduras comprometendo, em condições laboratoriais, os principais sistemas de transporte

membranar [van de Mortel et al., 1988], reduzindo a actividade metabólica [Martini et al.,

2004] e induzindo mecanismos apoptóticos e de morte celular [Kitagakia et al., 2007].

Apesar do mecanismo de toxicidade do etanol ser complexo, tudo indica que o principal alvo

deste tipo de stresse seja a membrana plasmática [D’Amore et al., 1990]. Como

consequência desta situação tem-se um aumento da fluidez da membrana e um decréscimo

na integridade da sua estrutura [Gurtovenko & Anwar, 2009], acompanhado de um aumento

da permeabilidade [Leão & van Uden, 1984a] e dos processos de difusão não-mediada

[Henriques et al., 1997].

Recentemente têm sido feitos esforços no sentido de identificar genes específicos

responsáveis pela tolerância ao etanol e a outros factores de stresse existentes nas

fermentações vinárias [Dinh et al., 2009; Zhao & Bai, 2009]. Alguns autores têm referido que

a expressão mais elevada ou mais reduzida de diversos genes pode possivelmente estar

relacionada com: (1) diversas vias regulatórias (e.g. HOG e TOR) [Hayashi & Maeda, 2006;

Rossignol et al., 2003], (2) função e transporte vacuolar [Teixeira et al., 2009], (3)

biossíntese da membrana plasmática e da parede celular [Lei et al., 2007] e (4) homeostase

iónica [Alexandre et al., 2001]. Apesar do carácter extensivo das análises genómicas, os

seus resultados normalmente põem em evidência a complexidade da resposta celular ao

stresse [Marks et al., 2008; Garay-Arroyo et al., 2004], originando novas linhas de

investigação para estudos mais aprofundados do seu significado fisiológico.

Embora tenham sido realizados alguns estudos relacionando o etanol e outros factores

de stresse, onde foi destacada a importância do estado fisiológico da célula [Loureiro & van

Uden, 1986], a maioria dos estudos têm sido realizados com utilização de células em fase

exponencial de crescimento, não existindo até à data estudos suficientes dedicados às

células em fase estacionária [Yoshikawa et al., 2009].

Nesse sentido, este trabalho realizado no âmbito da dissertação de Mestrado permitiu

constatar que as células de S. cerevisiae que se encontravam nas fases finais de

fermentação exibiram um comportamento fisiológico peculiar, pois não só foram capazes de

manter a sua actividade metabólica, como apresentaram igualmente capacidade de

sobreviver face às condições de stresse existentes e características dessas fases.

CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTUTRAS

80

No entanto, certamente que muitas questões ficaram por esclarecer. Numa primeira

análise, ficou por se determinar e identificar os lípidos de membrana, com o objectivo de

testar a validade da hipótese de incorporação de [1-14C] ácido propiónico em membranas,

bem como, noutra perspectiva, os níveis de oxigénio e azoto e controlar a produção de

metabolitos secundários nos diferentes pontos de amostragem ao longo da fermentação. A

médio/longo prazo seria particularmente importante “descodificar” os mecanismos

responsáveis pela sobrevivência e manutenção da capacidade fermentativa de células nas

fases finais de fermentação e atribuir-se uma função às vias regulatórias responsáveis pela

aquisição deste carácter resistente das células. Como forma de atingir este objectivo,

poderia começar por se fazer uma selecção de estirpes com mutações em determinados

genes que estivessem envolvidos em diversas vias celulares (e.g. vias HOG e TOR,

biossíntese de membrana e de parede celular, homeostase protónica), avaliando a

capacidade das estirpes conduzirem a fermentação e permanecerem viáveis até ao final de

fermentação de mosto sintético a 25ºC. Com estas estirpes seleccionadas, sob condições

que simulassem tanto quanto possível as fermentações vinárias, proceder-se-ia a uma

caracterização fisiológica e bioenergética, avaliando a tolerância ao etanol, o desempenho

fermentativo (sob diferentes concentrações de etanol, de H+ e de ácido acético), o teor em

ATP, trealose e glicogénio, o pH intracelular, a capacidade tampão do meio intracelular e o

pKa intracelular de populações de células e de células individualizadas, o efluxo e o influxo

de protões, a viabilidade (incluindo medições dos indicadores de apoptose e de necrose) e a

actividade metabólica. Posteriormente, poder-se-ia construir e caracterizar um número

reduzido de estirpes que seriam seleccionadas para sobre-expressar genes específicos. As

que apresentassem o melhor desempenho fermentativo iriam, por fim, ser testadas em

mosto de uva, simulando as condições reais de adega.

O conhecimento dos mecanismos moleculares de sobrevivência responsáveis pela

homeostase protónica, durante as fases finais de fermentação, contribuiria para o

desenvolvimento de estirpes vínicas mais robustas que tornariam o processo fermentativo

mais eficiente, diminuindo o tempo de fermentação e a ocorrência de fermentações

amuadas, melhorando consequentemente a qualidade do vinho.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

81

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

99

ANEXO I

.

Tabela 10: Características técnicas da preparação comercial de levedura seca activa para vinificação

FERMIVIN®

Aplicação FERMIVIN® é uma preparação comercial de levedura que se

responsabiliza pelo processo de fermentação de qualquer tipo de vinho.

Qualidades do

starter para

vinificação

Cinéticas de

fermentação Curta fase de latência e crescimento rápido.

Rendimento

açúcar/álcool 16,5 g de açúcar para 1% álcool.

Características

técnicas

Temperaturas óptimas: 15 – 35ºC

Tolerância ao álcool: 14% em condições standard e

16% na presença de nutrientes (incluindo azoto).

Resistência ao SO2 livre: 50 mg/L.

Baixa produção de espuma.

Características

metabólicas

Média de produção de glicerol: 6 – 8 g/L.

Baixa produção de acidez volátil (< 0,15 g/L).

Baixa produção de acetaldeído (< 20 mg/L).

Baixa produção de H2S.

Baixa produção de SO2 (< 10 mg/L).

Outras

características

Baixa produção de álcoois superiores.

Degrada parcialmente o ácido málico (20 a 30%),

estimulando o arranque da “fermentação”

maloláctica.

Boa capacidade de fermentar mosto clarificado.

Fenótipo: neutro ao factor killer.

ANEXOS

100

ANEXO II

Tabela 11: Títulos alcoométricos de vinhos, expressos em % (v/v) (informação recolhida a partir de uma página web do Instituto da Vinha e do Vinho - http://www.ivv.min-agricultura.pt/np4/89, 07/10/09)

Bebida alcoólica Título alcoométrico %(v/v)

Referências

Vinhos adquirido vinhos de mesa > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº13

vinhos espumantes > 9,5 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo V-H-nº11 c)

v.e.q. do tipo aromático > 6 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo V-I-nº3 d)

v.e.q.p.r.d. do tipo aromático > 6 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-K-nº10 d)

v.e.q.p.r.d. > 10 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-K-nº4

vinhos licorosos > 15 e < 22 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº14-A

v.l.q.p.r.d. > 15 e < 22 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-L-nº3 b)

vinhos frisantes > 7 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº17

vinho frisante gaseificado > 7 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº18

vinhos aguardentados > 18 e < 24 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº23

vinhos de uvas sobreamadurecidas > 12 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº24

total

vinho de mesa < 15 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº13

v.q.p.r.d., v.e.q.p.r.d. > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-F-nº5

v.l.q.p.r.d. > 17,5 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-L-nº3 c)

vinho frisante > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº17

vinho frisante gaseificado > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº18

vinho de uvas sobreamadurecidas > 16 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº24

Bebidas espirituosas

aguardente vínica > 37,5 REG (CEE) Nº 1576/89 Artº 3-nº1

aguardente bagaceira > 37,5 REG (CEE) Nº 1576/89 Artº 3-nº1

brandy > 36,0 REG (CEE) Nº 1576/89 Artº 3-nº1

ANEXOS

101

ANEXO III

Para a preparação do meio K, descrito por van Uden (1967), utilizaram-se as seguintes

soluções:

(a) Meio base:

(NH4)2SO4 0,50% (p/v)

KH2PO4 0,50% (p/v)

MgSO4.7H2O 0,05% (p/v)

CaCl2.2H2O 0,015% (p/v)

em 900 mL de água desmineralizada

Acertou-se o pH do meio a 4,5, utilizando pastilhas de NaOH. Esterilizou-se por

autoclavagem (121ºC, 20 minutos, 1 atm).

(b) Solução de oligoelementos A (Cfinal 0,5 g/L):

H3BO3 0,18% (p/v)

KI 0,02% (p/v)

NaMoO4.2H2O 0,04% (p/v)

(c) Solução de oligoelementos B (Cfinal 0,5 g/L), pH 3,5:

CuSO4.5H2O 0,08% (p/v)

FeCl3.6H2O 0,04% (p/v)

MnSO4.H2O 0,08% (p/v)

ZnSO4.7H2O 0,08% (p/v)

Água desmineralizada q.b.

(d) Solução de vitaminas (Cfinal 0,5 g/L):

Biotina 0,001% (p/v)

Pantotenato de cálcio 0,08% (p/v)

Mio-inositol 4,00% (p/v)

Niacina 0,16% (p/v)

Piridoxina (HCl) 0,16% (p/v)

Tiamina (HCl) 0,16% (p/v)


ANEXOS

102

(e) Fonte de carbono e energia (Cfinal 20 g/L):

D(+)-Glucose 20% (p/v)


A solução de glucose foi preparada numa concentração 10 vezes superior à

concentração final pretendida no meio de cultura (2%).

As soluções referidas (solução de glucose, soluções de oligoelementos A e B, solução de

vitaminas) foram esterilizadas por filtração a vácuo com membranas Millipore TYPE GSWP

de porosidade 0,22 µm.

As várias soluções foram misturadas assepticamente para a obtenção do meio completo,

constituído por 2% (p/v) glucose, 0,05% (v/v) de oligoelementos A e B e 0,05% (v/v) de

vitaminas.

Para a preparação do meio necessário ao crescimento da estirpe auxotrófica

Saccharomyces cerevisiae W-303 foi utilizado meio K indicado anteriormente, suplementado

com os seguintes compostos (de acordo com as marcas auxotróficas da estirpe):

Histidina 0,08 g/L

Adenina 0,08 g/L

Uracilo 0,08 g/L

Leucina 0,16 g/L

Triptofano 0,32 g/L

Os produtos químicos utilizados pertencem às marcas BDH®, Merck® e Sigma®.

ANEXOS

103

ANEXO IV

Parâmetros físico-químicos do mosto

Tabela 12: Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 15ºC.

Fase de crescimento pH Massa volúmica (g/mL) Glucose (g/L) Etanol (g/L)

Início de fermentação (T0) 3,04 1,074 96,50 0,20

Início de exponencial (T1) 2,88 1,061 89,54 1,51

Meio de exponencial (T2) 2,87 1,037 81,72 10,02

Final de exponencial (T3) 2,80 1,033 73,46 16,01

Início de estacionária (T4) 2,87 1,036 51,73 35,70

Meio de estacionária (T5) 2,97 0,996 2,87 51,25

Final de fermentação (T6) 2,93 0,980 0,03 74,29

Tabela 13: Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 30ºC.

Fase de crescimento pH Massa volúmica (g/mL) Glucose (g/L) Etanol (g/L)

Início de fermentação (T0) 2,91 1,056 96,50 0,20

Meio de exponencial (T1) 2,87 1,060 83,89 1,84

Final de exponencial (T2) 2,79 1,054 80,41 6,45

Início de estacionária (T3) 2,70 1,018 40,42 39,16

Meio de estacionária (T4) 2,75 - 4,26 43,19

Final de fermentação (T5) 2,74 0,995 0,05 56,44

ANEXOS

104

Fase de

crescimento

Tempo

(h)

D.O.

640nm

UFC/ mL

(x106)

Peso Seco

(mg/mL)

Iníc. ferm. 0,0 0,066 0,70 0,25

2,0 0,057 0,69 -

7,0 0,069 - -

10,0 0,086 0,48 0,35

13,0 0,098 0,40 0,25

17,0 0,103 - -

21,3 0,265 - 0,26

Iníc. exp. 24,0 0,366 2,97 -

25,0 0,346 2,17 -

27,0 0,470 8,78 -

30,0 0,875 8,53 0,52

33,3 1,255 2,80 -

36,0 1,505 3,03 0,85

37,3 1,330 2,30 0,61

Meio expo. 41,0 2,360 6,27 -

45,3 3,340 2,94 1,26

48,3 4,960 6,60 2,00

49,0 5,300 - -

51,0 5,940 11,00 -

54,3 6,040 44,80 2,53

59,0 8,600 42,00 2,98

61,0 - 32,60 -

Final exp. 65,0 8,100 45,75 -

69,0 12,000 65,00 3,18

72,0 11,000 99,38 3,18

73,0 9,400 67,47 -

75,0 13,000 126,83 -

78,2 13,900 - 4,55

81,3 12,400 138,33 -

84,0 17,800 143,83 5,08

Iníc. est. 87,0 16,300 94,40 4,95

93,0 14,700 366,05 -

97,0 15,400 - 5,45

98,0 17,700 108,33 6,03

104,0 16,900 152,25 -

(…)

Fase de

crescimento

Tempo

(h)

D.O.

640nm

UFC/ mL

(x106)

Peso Seco

(mg/mL)

(…)

108,0 18,200 161,45 6,53

111,0 15,500 108,15 5,20

119,4 15,900 113,00 5,33

122,0 19,200 124,40 5,83

130,4 19,400 149,33 5,90

134,8 21,300 117,92 5,95

143,8 21,500 126,13 5,58

145,8 - - 6,40

154,8 20,200 128,50 5,65

165,0 - 151,38 -

176,0 20,000 144,00 5,60

184,0 18,400 112,50 4,93

191,0 18,800 104,53 5,50

195,0 18,000 145,20 5,13

Meio est. 202,0 20,100 117,67 5,50

208,8 16,900 - 5,70

215,1 15,800 107,70 5,90

219,8 17,500 109,05 5,80

226,1 17,300 125,92 6,40

232,4 17,200 103,92 6,60

239,1 18,300 129,13 5,85

243,4 18,200 117,45 6,50

250,1 - - 6,05

256,3 16,900 112,78 6,40

263,0 17,100 118,45 -

267,3 18,000 107,00 5,80

274,0 17,600 119,00 5,85

280,0 16,700 - 6,20

287,3 18,100 106,93 5,50

291,0 17,400 102,60 6,00

299,0 16,900 - 5,50

Final ferm. 304,0 17,300 146,50 6,00

311,0 24,300 100,10 5,60

315,0 17,400 129,07 5,90

322,0 17,300 124,33 5,05

ANEXO V

Tabela 14: Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária a 15ºC.

ANEXOS

105

Fase de

crescimento

Tempo

(h)

D.O.

640nm

UFC/ mL

(x106)

Peso Seco

(mg/mL)

(…)

23,0 9,400 103,57 -

Iníc. est. 24,0 11,100 95,07 4,38

26,0 11,000 75,55 -

28,0 11,500 107,68 4,35

31,0 12,900 93,70 -

33,0 12,800 107,33 5,43

35,0 11,900 106,60 5,28

38,2 15,700 126,48 4,50

41,0 14,400 124,18 -

42,0 15,600 - -

44,0 15,200 107,70 -

Meio est. 48,0 15,200 99,27 4,80

49,2 17,200 126,62 5,63

52,0 15,600 97,28 -

56,0 16,000 129,53 -

59,0 15,100 100,27 5,55

62,0 15,000 93,42 5,45

65,0 16,100 81,73 -

68,0 16,400 96,22 -

Final ferm. 71,0 17,700 116,67 5,60

73,0 14,700 85,20 5,50

79,0 15,200 67,00 -

88,4 17,000 72,07 5,08

99,4 15,400 87,80 4,88

Fase de

crescimento

Tempo

(h)

D.O.

640nm

UFC/ mL

(x106)

Peso Seco

(mg/mL)

Iníc. ferm. 0,0 0,044 1,02 0,18

1,0 - 1,49 -

2,0 0,059 0,23 0,22

2,1 0,085 0,12 -

3,0 0,123 0,38 0,22

4,0 0,181 1,89 -

Meio expo. 5,3 0,307 2,29 0,39

6,0 0,660 2,07 -

7,0 1,110 6,50 0,77

8,0 1,670 9,73 -

Final exp. 9,1 2,510 14,53 1,47

10,0 - 17,30 -

11,0 - 16,40 2,06

12,0 - 25,00 -

13,0 4,550 23,26 1,95

14,0 4,030 - -

15,0 5,600 - 1,92

16,1 5,600 38,04 -

17,0 6,500 39,90 2,65

18,0 7,300 60,88 -

20,0 8,000 65,33 3,53

21,0 8,300 82,47 -

22,0 9,100 87,45 3,48

(…)

Tabela 15: Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária a 30ºC.

ANEXOS

106

pH

ex

pH

inp

He

xp

Hin

pH

ex

pH

inp

He

xp

Hin

pH

ex

pH

inp

He

xp

Hin

pH

ex

pH

inp

He

xp

Hin

90

--

3,0

96,

42

2,9

36

,34

2,8

66

,24

2,8

35

,87

2,8

16

,10

2,8

85

,17

2,9

05,

06

10

03

,20

7,0

4-

--

--

--

--

--

--

-

12

0-

-3

,06

6,4

92

,90

6,4

12

,85

6,3

22

,80

5,9

92

,81

6,2

12

,89

5,1

32

,90

5,2

3

15

03

,16

7,1

93

,04

6,4

82

,87

6,4

42

,86

6,3

02

,80

6,0

92

,80

6,0

92

,89

5,1

62

,91

5,0

2

18

0-

-3

,02

6,4

92

,89

6,2

92

,83

6,2

42

,79

6,0

62

,80

6,0

52

,89

5,2

32

,90

5,2

3

20

03

,11

7,2

8-

--

--

--

--

--

--

-

21

0-

-3

,01

6,4

12

,89

6,1

92

,83

6,1

92

,80

6,2

72

,80

5,9

72

,88

5,1

82

,91

5,2

5

25

03

,07

7,3

2-

--

--

--

--

--

--

-

30

03

,04

7,3

5-

--

--

--

--

--

--

-

35

02

,98

7,3

8-

--

--

--

--

--

--

-

Fin

al

exp

on

enci

alm

ost

o

[7-14

C]

ác.

be

nzó

ico

Fin

al

ferm

enta

ção

Mei

o

esta

cio

ná

ria

Iníc

io

esta

cio

ná

ria

Te

mp

o d

e

incu

ba

ção

(min

)

me

io K

Me

io e

xpo

ne

nci

al

[7-14

C]

ác.

be

nzó

ico

[1-1

4 C]

ác.

pro

pió

nic

o

Iníc

io

exp

on

en

cia

l

Mei

o

exp

on

enci

al

ANEXO VI

Tab

ela

16:

pHin d

e S

. cere

vis

iae IS

A 1

000,

cul

tivad

a a

15ºC

em

mei

o m

iner

al e

em

mos

to e

stér

il.

ANEXOS

107

pH

exp

Hin

pH

ex

pH

inp

Hex

pH

inp

Hex

pH

in

60

--

--

3,5

76,

733,

57

6,1

3

90

3,3

06

,86

3,3

05,

973

,49

6,75

3,4

96

,14

120

3,2

86

,90

3,2

85,

873

,40

6,76

3,4

06

,13

150

3,2

56

,93

3,2

55,

90-

--

-

180

3,2

37

,09

3,2

35,

87-

--

-

210

3,2

27

,04

3,2

25,

83-

--

-

Te

mp

o d

e

incu

ba

ção

(min

)

15

ºC

30

ºC

[1-14

C] á

c.

pro

pió

nic

o

[7-1

4 C]

ác.

be

nzó

ico

[7-14

C] á

c.

be

nzó

ico

Me

io e

xpo

ne

nci

al

Me

io e

xpo

ne

nci

al

[1-1

4 C]

ác.

pro

pió

nic

o

Outros dados:

Constante de dissociação (kd) do ácido propiónico = 1,35 x10-5 mol

Constante de dissociação (kd) do ácido benzóico = 6,4 x10-5 mol

Volume intracelular de S. cerevisiae = 1,9 µL / mg (p.s.)

pH

exp

Hin

pH

exp

Hin

pH

exp

Hin

pH

exp

Hin

pH

exp

Hin

pH

exp

Hin

pH

exp

Hin

60-

-3,

196,

412,

826,

592,

926,

362,

706,

022,

755,

822,

955,

81

903,

187,

233,

076,

602,

796,

422,

766,

222,

705,

952,

745,

942,

955,

84

120

--

3,00

6,59

2,78

6,21

2,72

6,12

2,69

6,16

2,75

5,89

2,97

5,76

me

io K

Me

io e

xpo

ne

nci

al

Fin

al

exp

on

en

cia

l

Iníc

io

est

aci

on

ári

a

Me

io

est

aci

on

ári

a

Fin

al

ferm

en

taçã

o

[7-14

C] á

c. b

en

zóic

o

mo

sto

Te

mp

o d

e

incu

ba

ção

(min

)

[1-14

C] á

c.

pro

pió

nic

o

Me

io

exp

on

en

cia

l

[7-14

C] á

c.

be

nzó

ico

Tab

ela

17:

pHin d

e S

. cere

vis

iae IS

A 1

000,

cul

tivad

a a

30ºC

em

mei

o m

iner

al e

em

mos

to e

stér

il.

Tab

ela

18:

pHin d

e S

. cere

vis

iae W

-303

, cul

tivad

a a

15ºC

e a

30º

C e

m m

eio

min

eral

.

ANEXOS

108

00,

440,

570,

140,

240,

310,

440,

550,

730,

380,

180,

29-0

,03

0,20

-0,0

2

2-

-0,

130,

050,

290,

380,

480,

540,

350,

160,

39-0

,06

0,21

-0,0

2

4-

-0,

260,

210,

190,

290,

450,

550,

270,

020,

28-0

,10

0,17

-0,0

8

6-

-0,

240,

190,

300,

420,

370,

510,

240,

110,

25-0

,14

0,15

-0,0

7

80,

280,

300,

20-

0,24

0,38

0,31

0,50

0,17

0,06

0,23

-0,1

40,

14-0

,03

100,

180,

200,

160,

210,

270,

510,

310,

530,

160,

020,

14-0

,10

0,09

-0,0

3

120,

160,

250,

150,

230,

220,

570,

190,

710,

110,

050,

17-0

,04

0,08

-0,0

2

140,

220,

490,

130,

250,

140,

380,

150,

430,

090,

080,

14-0

,03

0,08

-0,0

4

160,

100,

300,

060,

180,

070,

240,

070,

260,

060,

050,

14-0

,04

0,07

-0,0

3

18-

--

--

-0,

030,

280,

060,

040,

12-0

,05

0,06

-0,0

2

200,

030,

17-

--

--

-0,

060,

100,

12-0

,03

0,05

-0,0

3

mei

o K

Ve

loci

da

de

s d

e e

flu

xo

de

pro

tõe

s (m

mo

l.g-1

.h-1

)

mo

sto

Fin

al

ferm

en

taçã

o

Com

lin

ha

de

ba

se

Sem

lin

ha

de

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se

Com

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ha

de

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se

Sem

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ha

de

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se

Iníc

io e

xpo

ne

nci

al

% [

eta

no

l]

(v/

v)

Sem

lin

ha

de

ba

se

Me

io e

sta

cio

ná

ria

Iníc

io e

sta

cio

ná

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Com

lin

ha

de

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se

Sem

lin

ha

de

ba

se

Com

lin

ha

de

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se

Sem

lin

ha

de

ba

se

Com

lin

ha

de

ba

se

Sem

lin

ha

de

ba

se

Com

lin

ha

de

ba

se

Sem

lin

ha

de

ba

se

Com

lin

ha

de

ba

se

Fin

al

exp

on

en

cia

lM

eio

exp

on

en

cia

lM

eio

exp

on

en

cia

l

ANEXO VII

Tab

ela

19:

Vel

ocid

ades

de

eflu

xo d

e H

+ (

mm

ol.g

-1.h

-1)

de S

. cere

vis

iae I

SA

100

0, c

ultiv

ada

em m

eio

K (

fase

exp

onen

cial

, ape

nas)

e

em m

osto

(pa

ra d

ifere

ntes

fase

s de

cre

scim

ento

), a

15º

C.

ANEXOS

109

Tab

ela

20:

Vel

ocid

ades

de

eflu

xo d

e H

+ (

mm

ol.g

-1.h

-1)

de S

. cere

vis

iae

ISA

100

0, c

ultiv

ada

em m

eio

K (

fase

exp

onen

cial

, ape

nas)

e

em m

osto

(pa

ra d

ifere

ntes

fase

s de

cre

scim

ento

), a

30º

C.

01,

743,

812,

092,

58

1,59

1,70

1,85

1,59

1,14

0,6

90,

550,

36

21,

541,

981,

301,

56

0,95

1,16

2,24

1,60

1,70

1,0

40,

660,

53

41,

082,

001,

001,

17

0,50

0,72

2,12

1,64

1,37

1,0

30,

560,

47

61,

342,

181,

081,

40

1,90

2,25

1,66

1,21

0,92

0,6

30,

420,

25

80,

851,

541,

341,

81

1,33

1,77

0,98

0,83

0,79

0,6

10,

560,

43

10

0,76

1,29

0,93

1,5

31,

191,

540,

340,

580,

700

,61

0,28

0,42

12

0,71

1,35

0,80

1,5

00,

771,

370,

420,

630,

330

,39

0,27

0,52

14

0,36

0,90

0,49

1,7

90,

521,

300,

310,

720,

270

,40

0,23

0,50

16

0,07

0,63

--

0,04

0,68

0,36

0,83

0,15

0,2

90,

160,

48

18

--

--

--

--

0,13

0,4

30,

66-

20

--

--

--

--

0,10

0,6

60,

080,

47

Ve

loci

da

de

s d

e e

flu

xo

de

pro

tõe

s (m

mo

l.g

-1.h

-1)

Sem

lin

ha

de

ba

se

Com

lin

ha

de

ba

se

Sem

lin

ha

de

ba

se

Co

m l

inh

a

de

ba

se

Sem

lin

ha

de

ba

se

Com

lin

ha

de

ba

se

Sem

lin

ha

de

ba

se

Com

lin

ha

de

ba

se

Sem

lin

ha

de

ba

se

Fin

al

ferm

en

taçã

oM

eio

est

aci

on

ári

aIn

ício

est

aci

on

ári

aM

eio

exp

on

en

cia

l

mo

sto

mei

o K

Com

lin

ha

de

ba

se

Sem

lin

ha

de

ba

se

Com

lin

ha

de

ba

se

Me

io e

xpo

ne

nci

al

Fin

al

exp

on

en

cia

l%

[e

tan

ol]

(v/

v)

ANEXOS

110

mei

o K

00,

200,

270,

10

0,1

90

,00

0,0

00,

00

0,0

00,

000,

00

0,00

2-

--

0,3

9-

--

--

--

40,

17-

-0

,31

--

--

--

-

60,

130,

240,

14

0,2

80

,04

0,0

00,

00

0,0

40,

000,

00

0,00

80,

19-

-0

,25

--

--

--

-

100,

150,

160,

13

0,3

90

,00

0,0

00,

00

0,0

30,

000,

00

0,04

120,

20-

-0

,43

--

--

--

-

140,

160,

23-

0,4

1-

--

--

--

160,

20-

0,1

80

,45

0,0

30,

00

0,0

40

,03

0,00

0,0

00,

03

180,

330,

29-

0,4

0-

--

--

--

200,

230,

270,

31

0,5

10

,02

0,0

00,

01

0,0

40,

000,

01

0,02

Ve

loci

dad

es

de

in

flu

xo d

e p

rotõ

es

(mm

ol.g

-1.h

-1)

Fin

al

ferm

en

taçã

oM

eio

es

taci

on

ári

aIn

ício

est

aci

on

ári

a

Fin

al

exp

on

en

cia

l

Tris

10m

M

citr

ato

pH

=6,3

Tri

s 10

mM

citr

ato

pH

=5,0

Tris

10m

M

citr

ato

pH

=5,0

Tris

10m

M

citr

ato

pH

=6,3

águ

a d

esm

in.

% [

eta

no

l]

(v/

v)

Me

io

exp

on

en

cia

l

águ

a d

esm

in.

Iníc

io

exp

on

en

cia

l

Me

io

exp

on

en

cia

l

mo

sto

águ

a d

esm

in.

ág

ua

de

smin

.á

gua

de

sm

in.

águ

a d

esm

in.

ág

ua

de

smin

.

ANEXO VIII

T

abel

a 21

: V

eloc

idad

es d

e in

fluxo

de

H+ (

mm

ol.g

-1.h

-1)

de S

. cere

vis

iae IS

A 1

000,

cul

tivad

a em

mei

o K

(fa

se e

xpon

enci

al, a

pena

s) e

em

mos

to (

para

dife

rent

es fa

ses

de c

resc

imen

to),

a 1

5ºC

.

ANEXOS

111

mei

o K

00

,67

0,6

00,

68

0,3

50

,06

0,0

70

,17

0,0

40

,03

0,0

7

20

,85

0,5

20,

71

0,3

2-

--

--

-

40

,73

0,4

20,

82

0,3

0-

--

--

-

60

,70

0,4

60,

64

0,2

80

,11

0,0

90

,18

0,0

50

,07

0,1

1

80

,61

0,6

20,

79

0,2

9-

--

--

-

10

0,6

10

,66

0,9

00

,43

0,1

00

,12

0,1

80

,08

0,0

90,

11

12

0,6

00

,71

0,8

60

,38

--

--

--

14

0,5

70

,49

0,9

00

,26

--

--

--

16

0,4

20

,46

1,1

30

,31

0,1

20

,10

0,2

00

,08

0,0

80,

13

18

--

1,2

90

,40

--

--

--

20

-1

,15

1,6

00

,74

0,2

60

,13

0,4

80

,15

0,1

50,

19

Ve

loci

dad

es

de

in

flu

xo

de

pro

tõe

s (m

mo

l.g

-1.h

-1)

Tri

s 1

0m

M

citr

ato

pH

=6

,3

Tri

s 1

0m

M

citr

ato

pH

=5

,0á

gu

a d

es

min

.á

gu

a d

es

min

.

mo

sto

Fin

al

ferm

en

taçã

oM

eio

es

taci

on

ári

aIn

ício

es

taci

on

ári

a

Fin

al

exp

on

en

cia

l

ág

ua

de

sm

in.

[eta

no

l]

(v/

v)

ág

ua

de

sm

in.

Me

io

exp

on

en

cia

l

Me

io

exp

on

en

cia

l

ág

ua

de

sm

in.

Tri

s 1

0m

M

citr

ato

pH

=5

,0

Tri

s 1

0m

M

citr

ato

pH

=6

,3á

gu

a d

es

min

.

Tab

ela

22:

Vel

ocid

ades

de

influ

xo d

e H

+ (

mm

ol.g

-1.h

-1)

de S

. cere

vis

iae IS

A 1

000,

cul

tivad

a em

mei

o K

(fa

se e

xpon

enci

al, a

pena

s) e

em

mos

to (

para

dife

rent

es fa

ses

de c

resc

imen

to),

a 3

0ºC

.

Caracterização bioenergética de Saccharomyces cerevisiae em ...

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